معلومة

لماذا يوجد تكرار معكوس في عناصر الاستجابة؟


توضح الصورة التالية تسلسل تكرار معكوس في عنصر استجابة. تظهر تسلسلات عنصر الاستجابة للجلوكوكورتيكويدات والإستروجين وهرمون الغدة الدرقية أنها تحتوي جميعها على تكرارات عكسية. لماذا توجد هذه التكرارات المقلوبة في العديد من تسلسلات الاستجابة؟ بمعنى آخر ، ما هي الميزة التي يقدمونها لوظيفة عنصر الاستجابة؟


بدءًا من عوامل النسخ بدائية النواة (أي البكتيرية) - والتي كانت أول من تميز بعمق ، لوحظ هذا النوع من الأنماط. حتى بالنسبة للنويدات الداخلية التقييدية "الكلاسيكية" من النوع الثاني المستخدمة في الاستنساخ الجزيئي لها تسلسلات تمييز متناظرة. في جميع الحالات الثلاث ، تكون الإجابة هي أن بروتين ربط الحمض النووي الخاص بالتسلسل يترابط على هيئة ثنائيات ، وبالتالي يتعرف كل مونومر على "نصف موقع" (أحد التسلسلات المقلوبة).


يؤدي الانتقال المتكرر لشريط الجينات إلى دوران الكروموسوم الجنسي في الفراولة

تمثل تحولات أنظمة تحديد الجنس قوى متنوعة مهمة عبر حقيقيات النوى. إن التحولات في الكروموسومات الجنسية - ولكن الحفاظ على الجينات الرئيسية المحددة للجنس - تميز السلالات الحيوانية ذات الصلة البعيدة. ومع ذلك ، في النباتات ، التي تطورت فيها الأجناس المنفصلة بشكل متكرر وكانت الكروموسومات الجنسية متماثلة الشكل ، لا نعرف ما إذا كانت مثل هذه الانتقالات تؤدي إلى تحولات الكروموسومات الجنسية ضمن مجموعات تصنيفية وثيقة الصلة. لا يمكن إثبات هذه الظاهرة إلا من خلال تحديد متواليات النوكليوتيدات المرتبطة بالجنس ، والتي لا تزال غير معروفة إلى حد كبير في النباتات. الفراولة البرية في أمريكا الشمالية الأخطبوطية (فراجاريا) تُظهر جنسين منفصلين (ثنائي الجنس) مع ميراث متماثل الشكل ، أنثى غير متجانسة (ZW) ، ومع ذلك خرائط جنسية لثلاثة كروموسومات مختلفة في أصناف مختلفة. لتمييز هذه التحولات ، حددنا التسلسلات الفريدة للإناث وقمنا بتجميع قراءاتهم في contigs. بالنسبة لمعظم الاخطبوط فراجاريا الأصناف ، لوحظ تسلسل قصير (13 كيلو بايت) في جميع الإناث وليس في الذكور أبدًا ، مما يشير إلى أنها المنطقة المحددة للجنس (SDR). تحتوي "كاسيت SDR" الخاصة بالنساء على جين له دور معروف في إنتاج الفاكهة وحبوب اللقاح ورجعي جديد غائب عن الكروموسومات Z والكروموسومات الجسدية. كشفت المقارنة التطورية لأشرطة SDR عن ثلاث طبقات وتاريخ من النقل المتكرر. بشكل ملحوظ ، يمكن طلب عمليات النقل مؤقتًا بسبب التقاط التسلسل المجاور مع كل حركة متتالية. كان من الممكن أن يكون تراكم تسلسل "التذكار" - وما نتج عنه من توسع SDR الناجم عن ذلك مع مرور الوقت - متكيفًا عن طريق ربط الجينات بالجنس. تشير التكرارات الطرفية المقلوبة عند حدود الإدخال إلى وسيلة للحركة. على حد علمنا ، هذا هو أول مصنع SDR يظهر أنه تم نقله ، وهو يقترح آلية جديدة ("نمو قفل الحركة") لتوسيع وتنويع الكروموسومات الجنسية الأولية.


خلفية

يُظهر الجينوم البشري نمطًا معقدًا من الازدواج القطاعي المتطابق للغاية والمتناثر (SDs) [1 ، 2] على عكس مجموعات SD الترادفية والمقلوبة التي تسود في معظم سلالات الثدييات الأخرى. هذه المنظمة تهيئ نوعنا لإعادة ترتيب على نطاق واسع بسبب العبور غير المتكافئ الذي يؤدي إلى عدم الاستقرار الجيني المرتبط بشكل خاص بالتأخر في النمو العصبي والتوحد. من المفارقات أن هذه القابلية لنسخ الاختلاف في العدد والمرض يبدو أنه تم تعويضها تطوريًا بظهور جينات ونصوص جديدة خاصة بالبشر [3] والتي ارتبطت بتوسع قشرة الفص الجبهي ، واستدامة اليرقية العصبية الممتدة ، وزيادة التوصيل المتشابك ، والتكيفات البشرية الأخرى التي يحتمل أن تكون فريدة من نوعها [4 ، 5 ، 6 ، 7]. لطالما كانت الطبيعة غير المكتملة والمتناثرة لبطاقات SD مفتاحًا لابتكارها السريع لأن النسخ المكررة غالبًا ما تكون موجودة في سياقات جينومية جديدة. في معظم الحالات ، تم العثور عليها جنبًا إلى جنب مع SDs الأخرى ذات الأصل التطوري المتنوع والتي تحمل عناصر وظيفية مختلفة ، مما يخلق إمكانية التنظيم التفاضلي ودمج الجينات المضاعفة [8]. الأساس الجزيئي لهذا التنظيم المعياري بين سلالة الرئيسيات غير معروف إلى حد كبير.

يتم تنظيم SDs البشرية في ما يقدر بـ 435 كتلة ازدواجية تتراوح في الحجم من 50 كيلو بايت إلى عدة ميغا بايت في الطول. كشفت إعادة بناء أجدادهم عن منظمة غير عشوائية إلى حد كبير فيما يتعلق بكل من توزيع الكروموسومات وهيكلها. يمكن تجميع كتل الازدواجية البالغ عددها 435 في 24 مجموعة / مجموعة متميزة ، والتي يتم تنظيمها بشكل أكبر حول مجموعة مكونة من 14 مجموعة مكررة "أساسية" أو أولية تم تمثيلها بشكل زائد [9]. تمثل النوى نقاط محورية للتوسع والانتقال المزدوج للـ SDs بين جينومات الرئيسيات. ومن المثير للاهتمام ، أن النسخ المزدوجة الأساسية نشطة نسبيًا ، وتشفر عائلات الجينات التي تُعتبر عمومًا على أنها قرد عظيم محددة أو موسعة ، وغالبًا ما تُظهر تواقيع الاختيار الإيجابي. تشير البيانات الناشئة إلى أن النوى قد خضعت لتوسع مستقل ومتكرر في العديد من سلالات الرئيسيات ، وفي بعض الحالات ، يتم تعيين الحدود عند نقاط توقف أحداث الحذف الصغير المتكررة الكبيرة / المضاعفات الدقيقة المرتبطة بالتأخر في النمو العصبي [10 ، 11].

يتم إثراء الكروموسوم البشري 16 بشكل خاص في كتل مضاعفة متناثرة. في الواقع ، ما يقرب من 10٪ من التسلسل المتساوي اللون للذراع القصير للكروموسوم 16 يتكون من SDs يشار إليها باسم LCR16 (تكرار نسخة منخفضة في chr16) والتي تطورت على مدى آخر 25 مليون سنة [12]. لقد حددنا سابقًا نسخة نواة 20 كيلو بايت (LCR16a) بالاشتراك مع جميع SDs المتناثرة تقريبًا على طول chr16p. جزء لا يتجزأ من LCR16a هو عائلة جينية تم تحديدها على أنها بروتين تفاعلي معقد المسام النووي (NPIP) (الملقب ب مورفيوس). ال NPIP تعتبر عائلة الجينات رائعة لأنها توضح بعضًا من أكثر الأمثلة تطرفًا على الاختيار الإيجابي المسجل [13]. علاوة على ذلك ، تتخلل معظم النسخ (على عكس المجموعات العنقودية) ، وقد أظهر تحليل مقارن للجينوم البشري وجينوم إنسان الغاب أن التوسع قد حدث بشكل مستقل في كلا السلالتين ، بما في ذلك التوسع إلى الكروموسومات غير المتجانسة [14]. ومع ذلك ، فقد تم إعاقة توصيف LCR16a بين الرئيسيات بسبب ارتباطه بمناطق مكررة كبيرة ، والتي نادرًا ما يتم تجميعها في معظم مسودة الجينوم المرجعي الرئيسي.

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق بشكل منهجي في تنظيم LCR16a على نطاق أوسع عبر سلالة الرئيسيات باستخدام تهجين المكتبات الجينومية لاكتشاف وتمييز المواقع الجينومية الغائبة إلى حد كبير أو المنهارة داخل التجمعات المرجعية الحالية. نجد توسعات مستقلة لـ LCR16a إلى مناطق صبغية جديدة مصحوبة بتراكم التسلسل المحيط ، بما في ذلك الأنواع الرئيسية ذات الصلة البعيدة ، مثل القرد. يُظهر تحليل النسخ المستهدف في الأنواع المختلفة دورانًا سريعًا في بنية الجينات مع فقدان واكتساب exons كامل وانصهار جيني خاص بكل سلالة. تدعم نتائجنا بقوة نموذجًا حيث قاد LCR16a بشكل مستقل تراكم SDs الرئيسيات المتناثرة جنبًا إلى جنب مع تطور عائلة الجينات المنسوخة التي تمر بتطور تكيفي قوي مع وظيفة بيولوجية غير معروفة حتى الآن.


تغيير التاريخ

Roulois، D. et al. تستهدف عوامل إزالة ميثيل الحمض النووي خلايا سرطان القولون والمستقيم عن طريق إحداث محاكاة فيروسية بواسطة النصوص الذاتية. زنزانة 162, 961–973 (2015).

شيابينيلي ، ك.ب.وآخرون. يؤدي تثبيط مثيلة الحمض النووي إلى استجابة مضاد للفيروسات في السرطان عبر الرنا المزدوج الجديلة (dsRNA) بما في ذلك الفيروسات القهقرية الذاتية. زنزانة 162, 974–986 (2015).

جويل ، إس وآخرون. يؤدي تثبيط CDK4 / 6 إلى تحفيز المناعة ضد الأورام. طبيعة سجية 548, 471–475 (2017).

شنغ ، دبليو وآخرون. يحفز استئصال LSD1 المناعة ضد الورم ويسمح بإغلاق نقاط التفتيش. زنزانة 174, 549–563 (2018).

كويلار ، ت.ل وآخرون. إسكات الينقولات العكسية بواسطة SETDB1 يثبط استجابة الإنترفيرون في ابيضاض الدم النخاعي الحاد. J. خلية بيول. 216, 3535–3549 (2017).

جولر ، جي دي وآخرون. يحمي قمع تعبير LINE-1 الناجم عن الإجهاد المجموعات السكانية الفرعية للخلايا السرطانية من التعرض للعقاقير المميتة. الخلايا السرطانية 32, 221–237 (2017).

Loo Yau، H.، Ettayebi، I. & amp De Carvalho، D.D The السرطان epigenome: استغلال نقاط الضعف في العلاج المناعي. اتجاهات خلية بيول. 29, 31–43 (2019).

جونز ، ب أ ، أووتاني ، هـ ، تشاكرافارثي ، أ. & أمبير دي كارفالو ، د. العلاج الوراثي في ​​علم الأورام المناعي. نات. القس السرطان 19, 151–161 (2019).

Deaton، A. M. & amp Bird، A. CpG Islands وتنظيم النسخ. تطوير الجينات. 25, 1010–1022 (2011).

ليفانون ، إي واي وآخرون. تحديد منهجي لمواقع تحرير A-to-I الوفيرة في النسخة البشرية. نات. التكنولوجيا الحيوية. 22, 1001–1005 (2004).

Liddicoat ، B. J. وآخرون. يمنع تحرير الحمض النووي الريبي بواسطة ADAR1 استشعار MDA5 للـ dsRNA الداخلي باعتباره غير ذاتي. علم 349, 1115–1120 (2015).

ليروست ، إيه وآخرون. تكشف الخلايا التائية المتوسعة نسليًا عن استمناع الأورام الخبيثة. الخلايا السرطانية 36, 597–612 (2019).

كروغ ، ب. وآخرون. يؤدي الأستلة H3K27 المنتشر إلى التعبير عن ERV والضعف العلاجي في الأورام الدبقية H3K27M. الخلايا السرطانية 35, 782–797 (2019).

أحمد ، س وآخرون. إن خرق التسامح الذاتي مع Alu duplex RNA يكمن وراء التهاب MDA5 بوساطة. زنزانة 172, 797–810 (2018).

تشونج ، هـ وآخرون. يمنع ADAR1 البشري الحمض النووي الريبي الداخلي من إطلاق إيقاف الترجمة. زنزانة 172, 811–824 (2018).

عناصر Deininger ، P. Alu: تعرف على SINEs. جينوم بيول. 12, 236 (2011).

يوريو ، إف وآخرون. منظر طبيعي للتفاعلات الدوائية الجينية في السرطان. زنزانة 166, 740–754 (2016).

Skene، P. J. & amp Henikoff، S. استراتيجية نوكلياز مستهدفة فعالة لرسم خرائط عالية الدقة لمواقع ربط الحمض النووي. eLife 6، e21856 (2017).

جروبر ، أ.جيه وآخرون. يكشف التحليل الشامل لمجموعات بيانات التسلسل ثلاثية الأطراف عن إشارات جديدة لعديد الأدينيل والدور القمعي للبروتين النووي الريبي غير المتجانس C في الانقسام وبولي أدينيل. الدقة الجينوم. 26, 1145–1159 (2016).

صموئيل ، سي إي أدينوزين ديميناسز التي تعمل على الحمض النووي الريبي (ADARs) كلاهما مضاد للفيروسات ومضاد للفيروسات. علم الفيروسات 411, 180–193 (2011).

هوو وآخرون. تشكل MAVS مجاميع وظيفية تشبه البريون لتنشيط ونشر الاستجابة المناعية الفطرية المضادة للفيروسات. زنزانة 146, 448–461 (2011).

Issa، J.P & amp Kantarjian، H. M. استهداف مثيلة الحمض النووي. كلين. الدقة السرطان. 15, 3938–3946 (2009).

إيشيزوكا ، جيه جيه وآخرون. يتغلب فقدان ADAR1 في الأورام على مقاومة الحصار المناعي. طبيعة سجية 565, 43–48 (2019).

جانون ، إتش إس وآخرون. تحديد اعتماد ADAR1 على أدينوزين ديميناز في مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية. نات. كومون. 9, 5450 (2018).

كريسو ، إيه وآخرون. التجديد الذاتي كهدف علاجي في سرطان القولون والمستقيم البشري. نات. ميد. 20, 29–36 (2014).

سايتو ، واي وآخرون. يؤدي تثبيط مثيلة الحمض النووي إلى تثبيط أشباه الأورام المعوية عن طريق إحداث استجابة مضادة للفيروسات. علوم. اعادة عد. 6, 25311 (2016).

ليما فرنانديز ، إي وآخرون. استهداف ثنائية التكافؤ يزيل قمع القنفذ الهندي ويمنع التجديد الذاتي للخلايا المسببة لسرطان القولون والمستقيم. نات. كومون 10, 1436 (2019).

دوبين ، إيه وآخرون. STAR: تقويم RNA-seq الشامل فائق السرعة. المعلوماتية الحيوية 29, 15–21 (2013).

لي ، هـ وآخرون. تنسيق تسلسل محاذاة / خريطة و SAMtools. المعلوماتية الحيوية 25, 2078–2079 (2009).

Liao، Y.، Smyth، G. K. & amp Shi، W. featureCounts: برنامج فعال للأغراض العامة لتعيين تسلسل يقرأ إلى السمات الجينية. المعلوماتية الحيوية 30, 923–930 (2014).

بيرتيا ، إم وآخرون. يتيح StringTie إعادة بناء محسّن للنسخة من قراءات RNA-seq. نات. التكنولوجيا الحيوية. 33, 290–295 (2015).

Jun، G.، Wing، M.K، Abecasis، G.R & amp Kang، H. M. إطار تحليل فعال وقابل للتطوير لاستخراج متغير وصقل من بيانات تسلسل الحمض النووي على نطاق السكان. الدقة الجينوم. 25, 918–925 (2015).

Narasimhan، V. et al. BCFtools / RoH: نهج نموذج ماركوف المخفي لاكتشاف الزيجوت الذاتي من بيانات التسلسل من الجيل التالي. المعلوماتية الحيوية 32, 1749–1751 (2016).

Quinlan، A.R & amp Hall، I.M BEDTools: مجموعة مرنة من الأدوات المساعدة لمقارنة الميزات الجينية. المعلوماتية الحيوية 26, 841–842 (2010).

Chen ، S. ، Zhou ، Y. ، Chen ، Y. & amp Gu ، J. fastp: معالج مسبق سريع الكل في واحد FASTQ. المعلوماتية الحيوية 34، i884 – i890 (2018).

Skene ، P. J. ، Henikoff ، J.G & amp Henikoff ، S. تستهدف التنميط الجينوم على نطاق الموقع في الموقع بكفاءة عالية لأعداد الخلايا المنخفضة. نات. بروتوك. 13, 1006–1019 (2018).

تشانغ ، واي وآخرون. التحليل القائم على النموذج لـ ChIP-Seq (MACS). جينوم بيول. 9، R137 (2008).

راميريز ، إف وآخرون. deepTools2: خادم ويب من الجيل التالي لتحليل بيانات التسلسل العميق. الدقة الأحماض النووية. 44، W160 – W165 ، (2016).

Kwon، M. & amp Firestein، B. L. تعداء الحمض النووي: طريقة فوسفات الكالسيوم. طرق مول. بيول. 1018, 107–110 (2013).

Halfmann، R. & amp Lindquist، S. فحص لتراكم الأميلويد عن طريق الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز بالمنظفات. J. فيس. إكسب. 17، e838 (2008).

Ettayebi، I.، Yau، H. L. & amp De Carvalho، D. D. طرق للكشف عن الاستقراء والتعرف على الحمض الريبي النووي النقال الداخلي. طرق الانزيم. 629, 35–51 (2019).

Teissandier، A.، Servant، N.، Barillot، E. & amp Bourc’his، D. الأدوات وأفضل الممارسات لتحليل retrotransposon باستخدام بيانات التسلسل عالية الإنتاجية. تجمهر. الحمض النووي 10, 52 (2019).

Sergushichev ، A. A. خوارزمية لتحليل إثراء مجموعة الجينات سريع التقريب باستخدام الحساب الإحصائي التراكمي. اطبع مسبقًا على https://doi.org/10.1101/060012 (2016).

Hu، Y. & amp Smyth، G. K. ELDA: تحليل التخفيف المحدود للغاية لمقارنة المجموعات السكانية المستنفدة والمخصبة في فحوصات الخلايا الجذعية وغيرها. J. إمونول. أساليب 347, 70–78 (2009).


نتائج

يظهر النظام الجيني الذي قادنا إلى اكتشاف الانصهار المتكرر المقلوب في الشكل 1 أ (كارسون وهارتويل 1985 Admire et al.2006). باختصار ، قمنا ببناء سلالة خميرة أحادية الصيغة الصبغية تحتوي على نسخة إضافية من ChrVII (سلالة ذرية). يجب ألا تؤثر أي تغييرات على هذا الكروموسوم الإضافي على قابلية الخلية للحياة في حد ذاتها. ال يمكن 1 الجين ، الذي يتم إدخاله بالقرب من التيلومير الأيسر للكروموسوم الإضافي ، يوفر وسيلة لتحديد الخلايا ذات التغيرات الصبغية. يمكن 1 يشفر نفاذ الأرجينين الذي يستورد الأرجينين وكذلك الخلايا الكانافانين التناظرية السامة فقط التي تفقد يمكن 1 يمكن أن ينمو الجين في وسط يحتوي على الكانافانين (مكونًا مستعمرات Can R). باستخدام علامات وراثية متعددة ، اكتشفنا ثلاثة أنواع من التغيرات في الكروموسومات في مستعمرات Can R: فقدان الكروموسوم الكامل ، وإعادة التركيب الأليلي الطبيعي ، وإعادة الترتيب المعقدة الأخرى التي تؤدي إلى ظهور مستعمرات ذات مظهر مقطعي (والذي نشير إليه بـ & # x0201cm مستعمرات مختلطة & # x0201d) (الشكل 1 أ). (الطفرات النقطية في يمكن 1 نادرًا ما تحدث [Weinert and Hartwell 1990.]) تحتوي مستعمرات Can R المختلطة على خلايا من أنماط وراثية متعددة ، بينما تحتوي مستعمرات Can R الطبيعية على خلايا من نمط وراثي واحد (انظر المواد والطرق). في السابق ، كنا قادرين على استنتاج أن مستعمرة مختلطة تنشأ من خلية ذات كروموسوم غير مستقر ، بينما تنشأ مستعمرة طبيعية من خلية بها كروموسوم مستقر (Admire et al. 2006).

التركيز الأولي لهذه الدراسة هو تحديد طبيعة الكروموسوم غير المستقر الذي يشكل مستعمرات مختلطة. كنا راد 9 المتحولات هنا فقط كأداة لدراسة الكروموسومات غير المستقرة ، لأن الكروموسومات غير المستقرة تتشكل بشكل متكرر أكثر في راد 9 المسوخات من الخلايا البرية (Rad +) (Admire et al. 2006 هذه الدراسة). نؤكد أن الكروموسومات غير المستقرة تتشكل في طفرات أخرى أيضًا (بعضها بتردد أعلى من في راد 9 المسوخ) (انظر أدناه).

جاء الدليل الرئيسي لحل بنية الكروموسوم غير المستقر من بنية الانتقال المحدد (انتقال & # x0201cDelta 7 / Delta 11 & # x0201d [D7 / D11]) الموجود فقط في المستعمرات المختلطة (الشكل 1 ب). اقترحت تحليلاتنا السابقة أن هذا الانتقال ربما ينشأ عن أحداث الحذف والاندماج المتعددة المتمركزة في موقع 403 كيلو بايت من الطرف الأيسر (الشكل 1B Admire وآخرون 2006). يحتوي موقع ChrVII 403 هذا على متواليات التكرار الطرفي الطويلة (LTR) بالإضافة إلى جينات الحمض الريبي النووي النقال التي يبدو أنها تساهم في عدم الاستقرار (Admire et al. 2006 H Jones and T Weiner، unpubl.). مشتق LTRs من الينقولات الرجعية (Kim et al. 1998) وهي موجودة في مئات النسخ في جينوم الخميرة. (مكررات Sigma 2 [S2] و Sigma 3 [S3] مشتقة من عناصر Ty3 ، بطول 278 و 245 قاعدة ، وتشترك في هوية 82٪ ، وتفصل بينهما 3.3 كيلوبايت ، بينما D7 و D11 من Ty1 ، وكلاهما 331 قاعدة ، ومشاركة الهوية بنسبة 97 ٪ ، وبصرف النظر عن بعضهما بمقدار 133 كيلو بايت.) بالنظر إلى بنية النقل D7 / D11 ، نقترح نموذجًا بسيطًا نسبيًا يدمج فيه حدث واحد التكرارات المقلوبة S2 و S3 لتوليد كروموسوم ثنائي المركز ، كما هو موضح في الشكل 1 ب ، وحدث ثاني يندمج D7 و D11 يتكرر بشكل مباشر لحل ثنائي المركز وتشكيل الانتقال. نختبر أولاً الفرضية القائلة بأن الوسيط ثنائي المركز متورط في عدم استقرار ChrVII.

يوجد ثنائي المركز محدد في الخلايا التي تشكل مستعمرات مختلطة

استخدمنا اختبار PCR لاختبار وجود ثنائيات المركز المحددة (الشكل 2 أ). لقد استنتجنا أن ثنائي المركز ، إذا تم تشكيله ، قد يكون موجودًا بكمية منخفضة ولكن يمكن اكتشافها في ثقافة الخلايا ، وقد تتنبأ كمية ثنائي المركز بتكرار مستعمرات Can R المختلطة الناشئة عن تلك الثقافة. لذلك نمت (في الوسائط الغنية) كل 10 فردية راد 9 الخلايا (التي تحتوي مبدئيًا على ChrVII غير مرتب) في 10 مزارع مستقلة (أولاً إلى المستعمرات على الأطباق ، ثم كل منها في الثقافة السائلة). ثم أجرينا اختبارين على كل من هذه الثقافات العشر. عزلنا الحمض النووي الجينومي من كل مزرعة وأخضعناه للتضخيم باستخدام بادئات يجب أن تكتشف الكروموسوم ثنائي المركز المحدد (الشكل 2 أ). لقد اكتشفنا ، في الواقع ، جزءًا معينًا من PCR بالحجم والتسلسل الصحيحين إذا تم دمج التكرارات المقلوبة S2 و S3 لتشكيل ثنائي المركز (انظر الشكل التكميلي S1 للتسلسل). فشلت تفاعلات التحكم في تفاعل البوليميراز المتسلسل في تضخيم نفس جزء الحمض النووي من تسلسل موقع ChrVII 403 الأصلي (تم إجراء التسلسلات الأصلية بواسطة تضخيم PCR لموقع ChrVII 403) (البيانات غير معروضة). (نلاحظ أن بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه ستضخم نفس جزء الحمض النووي إذا نشأ عن طريق حدث انعكاس ، وهو احتمال رسمي نتخلص منه عن طريق الاختبارات الجينية والجزيئية [الشكل التكميلي S2 ، انظر أدناه]).

يولد الاندماج المتكرر المعكوس ثنائيات القسيم المركزي التي تسبب المزيد من عدم استقرار الكروموسوم. (أ) المبينة هي هياكل ChrVII العادية وثنائية المركز المفترضة مع مواضع البادئات PCR 1 و 2 المستخدمة للكشف عن وجود ثنائي المركز. (ب) الحمض النووي الجيني من ثقافات غير منتقاة من Rad + ، راد 9، و راد 51 تم تعريضهم لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات 1 و 2. تظهر المواد الهلامية نتائج PCR نوعية. ال راد 9 كما تم تحليل الثقافات لمعرفة تردداتها في المستعمرات المختلطة و PCR الكمي لتحديد كمية ثنائي المركز. تم إجراء اختبار ارتباط سبيرمان لربط عدم الاستقرار وثنائي القسيم المركزي. معامل ارتباط رتبة سبيرمان (& # x003c1) هو 0.973 ص-القيمة ، & # x0003c0.0001. (حارات 4,8,9) ثلاثة من مزارع Rad + موجبة بشكل ضعيف للجزء ثنائي المركز. الاشعال ل RSP5 تم استخدامها كعناصر تحكم PCR.

قمنا بعد ذلك باختبار ما إذا كانت كمية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ترتبط بتكرار المستعمرات المختلطة في الثقافات العشر. إذا كان الأمر كذلك ، فإن الثقافات التي تحتوي على كمية أكبر من منتج PCR يجب أن تؤدي إلى المزيد من المستعمرات المختلطة.لقد حددنا كمية ثنائيات القسيم المركزي بواسطة PCR الكمي ، وتكرار المستعمرات المختلطة عن طريق الفحص الجيني الكمي (انظر المواد والطرق). لقد وجدنا ، في الواقع ، أن الثقافات التي تحتوي على ثنائيات قسيمية أكثر أدت إلى تواتر أعلى بشكل عام من المستعمرات المختلطة (معامل الارتباط 0.97 ص & # x0003c 0.001) (الشكل 2 ب). تباين تركيز ثنائيات القسيم المركزي بين الثقافات ، بمتوسط ​​حوالي واحد في عام 2000 راد 9 خلايا (وواحدة من كل 100000 خلية في خلايا Rad +) (الشكل التكميلي S3).

قمنا أيضًا باختبار العلاقة بين كمية منتج PCR وعدم الاستقرار من خلال دراسة السلالات ذات عدم الاستقرار المنخفض (خلايا Rad + ، من النوع البري) وعدم الاستقرار العالي (راد 51 المسوخ مع خلل في إعادة التركيب المتماثل [HR]) (الشكل 2 ب نوقشت بمزيد من التفصيل أدناه). مرة أخرى ، وجدنا المزيد من منتج PCR ثنائي المركز في راد 51 المسوخات ذات عدم الاستقرار العالي مقارنة بسلالات Rad + ذات عدم الاستقرار المنخفض (الشكل 2 ب). نلاحظ هذا الارتباط في المسوخات الأخرى أيضًا (انظر أدناه). نستنتج أن dicentric المحدد الموضح في الشكلين 1B و & # x200B و 2A 2A هو على الأرجح وسيط رئيسي لعدم الاستقرار وتشكيل إزاحة D7 / D11 المحددة الموضحة في الشكل 1B.

يؤكد الاختبار الجيني أن ثنائيات القسيم المركزي تسبب عدم الاستقرار في المستعمرات المختلطة

على الرغم من أن نتائج اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الموصوف أعلاه تجادل بقوة بأن ثنائيات المركز محددة تسبب عدم الاستقرار ، لا يمكننا الكشف مباشرة عن الكروموسومات ثنائيات المركز السليمة (بسبب هشاشتها وانخفاض وفرتها). لذلك لجأنا إلى نهج وراثي لاختبار ما إذا كانت ثنائيات القسيم المركزي هي في الواقع وسيط في عدم الاستقرار.

يستخدم اختبارنا الجيني متحولة حساسة لدرجة الحرارة لبروتين kinetochore ، كتف 13 - 30، يعمل بشكل صحيح عند 23 & # x000b0C ولكن ليس عند 36 & # x000b0C (Doheny et al. 1993). يربط Ctf13 الأنابيب الدقيقة بالحركية. فكرة استخدام هذا المسوخ هي كما يلي: عندما يخضع ثنائي المركز لفصل الكروموسوم أثناء الانقسام ويكون Ctf13 نشطًا ، فإن الحمض النووي سينكسر ، ولكن إذا كان Ctf13 غير نشط ، فإن الأنبوب الدقيق & # x02013kinetochore سينقطع بدلاً من الحمض النووي (الشكل 3 أ) . (مطلوب كسر الحمض النووي لتشكيل مستعمرات مختلطة ، نظرًا لأن المستعمرات المختلطة تحتوي على خلايا من طرز وراثية متعددة.) لذلك توقعنا أن حالة Ctf13 ستؤثر على تواتر المستعمرات المختلطة إذا كانت ثنائيات القسيم المركزي وسيطة ، في حين أن حالة Ctf13 لن تؤثر على تواتر المستعمرات المختلطة إذا ثنائيات القسيم المركزي ليست وسيطة. لاختبار هذا التوقع ، كبرنا راد 9 و rad9 ctf13-30 الخلايا عند درجة الحرارة المسموح بها (23 & # x000b0C) أو درجة الحرارة المقيدة (36 & # x000b0C) ، وحدد مستوى ثنائيات القسيم المركزي بواسطة PCR الكمي ومستوى عدم الاستقرار من تواتر المستعمرات المختلطة (الشكل 3 ب). (وجدنا أن حالة Ctf13 لم تؤثر بشكل كبير على كمية ثنائيات القسيم المركزي المتكونة ، كما تم قياسها بواسطة PCR الكمي ، فهناك زيادة بمقدار أربعة أضعاف في ثنائيات القسيم المركزي في الخلايا المعيبة لـ Ctf13.) وجدنا أن حالة Ctf13 قد أثرت في الواقع على عدم الاستقرار. rad9 ctf13-30 كان للطفرات تكرار أقل بثمانية أضعاف من المستعمرات المختلطة عند نموها في درجة حرارة مقيدة مقارنة بدرجة الحرارة المسموح بها ، ومقارنتها مع rad9 CTF13 + سلالات نمت في أي درجة حرارة. وبالتالي ، فإن كمية ثنائيات المركز المتكونة كانت مستقلة إلى حد كبير عن نشاط Ctf13 (يوجد في الواقع أكثر ثنائيات المركز في الخلايا المعيبة لـ Ctf13) ، ولكن قدر من ثنائيات القسيم المركزي كان يعتمد على حالة Ctf13 (عدد أقل من المستعمرات المختلطة في الخلايا المعيبة لـ Ctf13). تتوافق نتيجة Ctf13 هذه مع الفرضية القائلة بأن ثنائيات المركز المحددة التي اكتشفها تفاعل البوليميراز المتسلسل هي وسيط لعدم الاستقرار.

يتأثر عدم الاستقرار ببروتين Ctf13 ، مما يشير إلى أن ثنائيات القسيم المركزي هي وسيط في عدم الاستقرار. (أ) نموذج لكيفية تأثير وظيفة Ctf13 على مصير كروموسوم ثنائي المركز. رؤية النص للمناقشة. (ب) راد 9 و rad9 ctf13-30 نمت السلالات في درجات حرارة متساهلة (23 & # x000b0C) أو مقيدة (36 & # x000b0C) ، ثم تم تحليلها لأحداث عدم الاستقرار ، والانتقالات ، وتكرار ثنائيات القسيم المركزي بواسطة PCR الكمي كما هو موضح في المواد والطرق.

لاحظنا ذلك rad9 ctf13-30 تتمتع الخلايا بتواتر أعلى لفقدان الكروموسوم وإعادة التركيب الأليلي عند نموها في درجة حرارة مقيدة مقارنة بدرجة الحرارة المسموح بها ، كما ورد سابقًا (الشكل 3 ب دوهيني وآخرون 1993). كان من المتوقع حدوث زيادة في فقد الكروموسوم من عدم الفصل في نموذج ثنائيات القسيم المركزي وتضيع عندما ينقطع اتصال Ctf13 kinetochore. ارتفاع معدل إعادة التركيب الأليلي في كتف 13- تم الإبلاغ عن وجود خلايا معيبة للكروموسومات أحادية المركز في كليهما كتف 13- الخلايا المعيبة (Doheny et al. 1993) وللخلايا المعالجة بمانع الأنابيب الدقيقة benomyl (Wood and Hartwell 1982). سبب زيادة إعادة التركيب الأليلي في أي من هذه الدراسات غير معروف ، ولكن من غير المحتمل أن يكون ذلك بسبب السلوك ثنائي المركز (انظر المناقشة التكميلية الشكل S4).

باختصار ، نستنتج أن التكرارات المقلوبة في فتيل موقع ChrVII 403 لتشكيل ثنائي المركز يتسبب في عدم الاستقرار الواضح في المستعمرات المختلطة. نظهر بعد ذلك أن اندماج التكرارات المقلوبة القريبة هي ظاهرة عامة في جينوم الخميرة.

الاندماج الزوجي للعديد من التكرارات المقلوبة القريبة في جينوم الخميرة

لاختبار ما إذا كان الاندماج المتكرر المقلوب عامًا ، استخدمنا مرة أخرى اختبارًا قائمًا على تفاعل البوليميراز المتسلسل. من خلال فحص جينوم الخميرة ، وجدنا أن هناك & # x0223c15 مواقع في الخميرة في مهدها تحتوي على تكرارات LTR مقلوبة محاطة بجينات الحمض الريبي النووي النقال ، وهي هندسة مشابهة لتلك الموجودة في موقع ChrVII 403 غير المستقر (الشكل 4 أ). اخترنا خمسة من هذه المواقع لاختبار اندماج التكرارات المقلوبة. عزلنا الحمض النووي الجيني من الخلايا وأخضعناه لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المناسبة (كما في الشكل 2 أ). لقد طورنا مجموعات منفصلة من البادئات التي يمكن أن تكتشف إما acentrics أو ثنائيات القسيم المركزي ، نظرًا لأن أي منهما ممكن نظريًا بنفس القدر (انظر الشكل 4 د). اكتشفنا شظايا الحمض النووي المشخصة للكروموسومات اللامركزية و / أو ثنائية المركز في جميع المواقع الجينومية الخمسة المختبرة (الشكل 4 ب). للحصول على فكرة عن مدى تكرار فتيل التكرار المقلوب القريب ، أجرينا PCR الكمي على موقعين إضافيين (ChrVI 160 و ChrX 542 ، بالإضافة إلى ChrVII 403) ، ووجدنا أن تكرار أحداث الاندماج في سلالات Rad + في كانت جميع المواقع الثلاثة قابلة للمقارنة (1.5 & # x000d7 10 & # x022125 و 4.7 & # x000d7 10 & # x022125 و 8.1 & # x000d7 10 & # x022125 للمواقع الثلاثة ، على التوالي) (انظر الشكل التكميلي S5I).

يتكرر المقلوب في خمسة مواقع في تندمج جينوم الخميرة لتشكيل ثنائيات القسيم المركزي و / أو اللامركزية. (أ) تحتوي المواقع التي تم فحصها للاندماج على جينات الحمض الريبي النووي النقال (خماسيات) ، متواليات متكررة (الأسهم الرمادية والبنية متورطة في تفاعل الاندماج ، في حين أن السهام الصافية ليست كذلك) ، وفي حالة واحدة ، أصل (مربع). يتشكل الاندماج المتكرر المقلوب إما شظايا ثنائية المركز أو لا مركزية باستخدام مواد أولية في المخططات الموضحة في ج. (ب) يتم الكشف عن شظايا الحمض النووي في جميع المواقع الخمسة المختبرة ، باستخدام مواد أولية مناسبة محددة لكل موقع. توجد تسلسلات التمهيدي في الشكل التكميلي S9. أسفر تحليل ثلاثة مواقع عن شظايا لا مركزية وثنائية المركز. تشير العلامات النجمية إلى المكان الذي ينبغي أن تظهر فيه شظايا الحمض النووي ، إذا تشكلت. تم تأكيد تسلسل الحمض النووي لجميع أجزاء الحمض النووي (الشكل التكميلي S5). (ج) إذا كانت تقاطعات الاندماج للكروموسومات اللامركزية وثنائية المركز متطابقة ، فمن الممكن أن تكون قد نشأت عن طريق آلية متناظرة. يمكن النظر إلى هذه الآلية من الناحية المفاهيمية على أنها تقاطع موصوف هنا يولد حدث واحد كلاً من أقطاب القلب وثنائي القسيم المركزي. (لا يظهر هنا شوكات متوقفة كوسائط وسيطة هذا المخطط يهدف إلى نقل فكرة الحدث المتماثل فقط.) (د) من ناحية أخرى ، إذا كانت الوصلات الاندماجية للكروموسومات اللامركزية وثنائية المركز غير متطابقة ، فإننا نستنتج أنه يجب أن يتم تشكيل اللامركزية وثنائي القسيم المركزي بأحداث منفصلة. في هذه الحالة ، فإن بوليميراز الحمض النووي هو & # x0201c يقفز & # x0201d بين متواليات مختلفة لتشكيل acentrics أكثر مما تفعله لتشكيل ثنائيات القسيم المركزي. لاحظ أنه يمكن أيضًا تشكيل المفاصل المتماثلة بواسطة آلية غير متناظرة ، إذا كانت بوليميرات الحمض النووي لللامركزية وثنائية المركز & # x0201cjump & # x0201d بين متواليات متطابقة.

من خلال فحص تسلسل الحمض النووي للأزواج المنصهرة من التكرارات المقلوبة ، يمكننا استنتاج بعض ميزات آلية (آليات) الاندماج. أولاً ، وجدنا أن الاندماج يتضمن دائمًا بعض اندماج التماثل المتسلسل يمكن أن يحدث بين تسلسلين يشتركان في أقل من 20 زوجًا أساسيًا (bp) من التماثل مع عدم تطابق 1 bp (موقع ChrV 137a) (الشكل التكميلي S5D) ، أو نفس القدر 148 قاعدة للتماثل الدقيق (ChrVII 403 ثنائي المركز) (تم تلخيصها في الشكل التكميلي S5H). تتوافق الاختبارات الجينية الموضحة أدناه مع مشاركة التماثل المحدود فقط في تفاعلات الاندماج.

ثانيًا ، وجدنا أن اندماج التكرارات المقلوبة يمكن أن يحدث بين التكرارات التي تصل إلى 5.4 كيلو بايت بعيدًا عن بعضها البعض (موقع ChrX 542) (الشكل التكميلي S5H). نظرًا لأن هذا الموقع يحتوي على أكبر مسافة بين التكررين ، ولا يزال يتشكل بسهولة من الكروموسومات ثنائية المركز والكروموسومات اللامركزية ، فمن المحتمل أن تكون المسافة القصوى للاندماج أكبر (الشكل التكميلي S5I). ستكون متطلبات المسافة للاندماج محور دراسة مستقبلية.

ثالثًا ، وجدنا دليلًا على أن له علاقة بمسألة ما إذا كان حدث ما يولد كلاً من الكروموسوم اللامركزي وثنائي المركز (الشكل 4 ج) ، أو ما إذا كان حدث ما يولد إما كروموسوم لامركزي أو ثنائي المركز ولكن ليس كلاهما (الشكل 4 د). نحن نطلق على هذين الخيارين & # x0201csymmetric & # x0201d و & # x0201casymmetric & # x0201d الأحداث ، على التوالي. يأتي الدليل على هذا السؤال من تسلسل تقاطعات الاندماج للمواقع التي يتكون فيها كل من الكروموسومات اللامركزية وثنائية المركز. بشكل مثير للدهشة ، وجدنا أنه بالنسبة لاثنين منهم (ChrVII 403 و ChrV 137b) ، كان تقاطع الانصهار في المنتج اللامركزي مختلفًا عن المنتج ثنائي المركز (باستخدام قواعد مختلفة داخل التكرارات كما هو موضح في الشكل 4 د المتواليات الفعلية في التين التكميلي. S1 ، S5). بالنسبة لموقع ChrVII 403 ، وجدنا أن 16 من أصل 16 acentrics تستخدم نفس التسلسل (ضمن 8 قواعد للتماثل بين S2 و S3) ، في حين أن 13 من 13 ثنائي القسيم المركزي تم تحليلها استخدمت تسلسلًا مختلفًا (ضمن 150 أساسًا من التماثل بين S2 و S3) . بالنسبة للموقع الثالث (ChrX 542) ، يحدث الاندماج لتشكيل acentrics وثنائيات القسيم المركزي بنفس التسلسل (كما في الشكل 4C) ، لذلك هناك احتمال رسمي ، بالنسبة لهذا الموقع ، يتم إنشاء كل من acentrics و dicentrics بواسطة a حدث مفرد. تشكيل الكروموسومات اللامركزية وثنائية المركز بواسطة حدث غير متماثل له آثار ميكانيكية يتم تناولها في المناقشة.

تندمج التكرارات الاصطناعية المقلوبة أيضًا لتشكيل ثنائيات قسيمية مرتبطة بعدم الاستقرار

لمزيد من اختبار عمومية تفاعل الاندماج ، أنشأنا تكرارًا مقلوبًا اصطناعيًا يتكون من متواليات غير LTR (تحتوي جميع الأحداث التي تم تحليلها حتى الآن على متواليات LTR). لا يحتوي هذا التكرار الاصطناعي المقلوب أيضًا على أي جينات من الحمض النووي الريبي (tRNA) التي من المحتمل أن تسهم في عدم الاستقرار. قسمنا URA3 الجين إلى ثلاثة أجزاء ، مع مشاركة كل زوج من الأجزاء المتتالية & # x0223c200 bp من تجانس التسلسل (المعين بـ & # x0201cUR ، & # x0201d & # x0201cRA ، & # x0201d و & # x0201cA3 & # x0201d) (الشكل 5A الشكل التكميلي. S6). أدخلنا أولاً ملف URA3 وحدات في مواقع ChrVII التي تشكل إزفاء ثنائي المركز و D7 / D11 (مواقع 403 و 535 ، على التوالي) (انظر الأشكال 1 ب ، & # x200 ب ، 5 أ). 5 أ). لقد سمحنا بحدوث عدم استقرار هذه الخلايا المعدلة وراثيًا ، وحددنا المستعمرات المختلطة عن طريق اختيار Can R ، وقمنا بتحليل الخلايا في المستعمرات المختلطة من أجل URA3أحداث بوساطة. بشكل عام ، وجدنا أن ملف URA3كانت الأحداث التي تتم بوساطة مماثلة تقريبًا للأحداث التي تتم بوساطة LTR. أولاً ، وجدنا أن ملف URA3 شكلت التكرارات المقلوبة المحتوية على تسلسل كروموسومات ثنائيات المركز ، تمامًا كما كان لتسلسل LTR S2 و S3 (الشكل 5 ب). ثانياً ، URA3 تم حل الوسيط ثنائي المركز بشكل متكرر لتشكيل إزاحة (الشكل التكميلي S7) ، تمامًا كما هو الحال مع ثنائي المركز الذي يحتوي على LTR. كما نوقش بمزيد من التفصيل أدناه ، وجدنا أيضًا أن المتطلبات الجينية لدمج URA3التكرارات المقلوبة المستندة إلى نفس الشيء بالنسبة لدمج التكرارات S2 و S3 (لا يتطلب أي رد فعل RAD52 أو RAD59 الجينات) (الشكل 5 ب انظر أدناه).

تكرارات التكرارات الاصطناعية المقلوبة لتشكيل ثنائيات القسيم المركزي ، ثم إعادة تجميعها لتشكيل انتقالات. (أ) ثلاث شرائح من URA3 تم استنساخ الجين في وحدتين (انظر الشكل التكميلي S6 للحصول على تفاصيل حول بناء الوحدة وإدخال الكروموسوم). ثم تم إدخال الوحدتين في مواقع محددة في الفصل السابع كما هو محدد. إعادة التركيب المقلوب ينضم إلى وحدات UR إلى RA عبر إعادة تركيب التسلسلات المشتركة & # x0201cR & # x0201d لتشكيل ثنائي المركز. ينضم حدث إعادة التركيب الثاني & # x0201cA & # x0201d إلى & # x0201cA3 & # x0201d لتشكيل حالة سليمة URA3 الجين ، مما يجعل الخلايا Ura +. (ب) كل راد 9 تحتوي السلالة على وحدة UR أو RA في واحد من ثلاثة مواقع على الذراع الأيسر لـ ChrVII ، وتحتوي جميع السلالات على وحدة A3 في موقع واحد على الذراع الأيمن. تختلف وحدات UR في مقدار تجانس التسلسل المشترك مع وحدة RA (حجم & # x0201cR & # x0201d هو 200 أو 60 أو 20 أو 0 نقطة أساس من التماثل ، كما هو موضح). كل تعديل راد 9 تم تحليل السلالة لوجود تشخيص محدد لجزء PCR لكروموسوم ثنائي المركز ، في أربع ثقافات مستقلة ، باستخدام بادئات URA ثنائية المركز (الشكل التكميلي S9). تم إنشاء مستعمرات Can R المختلطة من كل منها راد 9 تم تحديد السلالة ، وتكرار خلايا Ura + في الخلايا من المستعمرات المختلطة (انظر المواد والطرق). (**) يظهر تواتر مستعمرات Ura + في خلايا Can s في الشكل التكميلي S8.

استخدمنا أيضًا وحدة التكرار المقلوبة الاصطناعية لاختبار ما إذا كان الاندماج مقيدًا لسبب ما في موقع ChrVII 403. أدخلنا وحدة التكرار المقلوبة الاصطناعية في موقعين إضافيين من مواقع ChrVII (مواقع ChrVII 110 و ChrVII 461) التي لا تحتوي على أجزاء LTR ، ولا تحتوي على جينات الحمض الريبي النووي النقال ، وتقع في مناطق مختلفة تمامًا من الكروموسوم (واحد 110 كيلو بايت من التيلومير ، والآخر 37 كيلو بايت من السنترومير). كنا قادرين على تحديد URA3- تحتوي على ثنائيات قسيمية تشكلت في كلا الموقعين (الشكل 5 ب) ، مما يؤكد أن الاندماج المتكرر المقلوب القريب هو ظاهرة عامة. تظهر هذه الدراسات أن اندماج التكرارات المقلوبة القريبة لا يقتصر على أنواع متواليات الحمض النووي ، أو التسلسلات القريبة من جينات الحمض النووي الريبي ، أو مناطق محددة من الكروموسوم. (حددنا أيضًا عمليات نقل Ura + ، التي تم تشكيلها بقرار ثنائي المركز ، من وحدات Ura المُدرجة في موقع ChrVII 461 ولكن ليس موقع ChrVII 110 ، وهي نتيجة ليس لدينا تفسير لها).

أخيرًا ، استخدمنا وحدة التكرار المقلوبة الاصطناعية لإعادة فحص مقدار التماثل المتسلسل المطلوب لتشكيل ثنائيات القسيم المركزي. وجدنا أن 60 قاعدة من التماثل ، ولكن ليس 20 أو 0 ، تسمح بتكوين ثنائيات المركز (الشكل 5 ب). باختصار ، تتوافق أطوال التماثل المتضمنة في الانصهار المتكرر المقلوب LTR و URA3 مع التماثلات المكونة من 60 قاعدة وأكبر ، وفي بعض الحالات ، ما لا يقل عن 20 نقطة أساس تخضع للاندماج.


نتائج

توصيف التسلسلات المتكررة في جينوم نوستوك

كوستا وآخرون. (2002) عن تسلسل intron لـ tRNA Leu (UAA) من 54 عزلة من نوستوك. من بين هؤلاء ، تمتلك ثمانية مقاطع تقطع منطقة من الهبتاميرات المتكررة بالترادف ، وستة منها فريدة من نوعها. تم العثور على مطابقات لخمسة من الأجزاء الفريدة في جينوم N. Punctiforme ، لا شيء في intron. لم يتم العثور على تطابق الجزء السادس الفريد ، 42 nt في intron of نوستوك سلالة Nos20 ، ولم يتم النظر فيها أكثر في هذه الدراسة. تتم مناقشة نتائج عمليات البحث هذه أدناه وتلخيصها في الشكل 1 والأرقام التكميلية 1 & # x020138. تم تقديم تمثيلات رسومية للمطابقات كشعارات متسلسلة في الشكل التكميلي 9.

الأمثلة الشائعة لعناصر حقوق السحب الخاصة. العائلات: يتم عرض الأمثلة الأكثر تمثيلا لأفراد العائلات المختلفة لعناصر حقوق السحب الخاصة وعائلاتهم الفرعية. جميع العائلات التي لها أربعة تكرارات على الأقل في جينوم Nostoc Punctiforme ، جنبًا إلى جنب مع أمثلة من كل جينوم بكتيري سيانوي تم النظر فيه (مدرج في الشكل 5) والذي لوحظ فيه مثيل لعنصر SDR (انظر الملفات التكميلية 1 & # x020138 للحصول على قوائم أكثر اكتمالاً). يتبع اسم كل كائن حي جزء يتكون من عدد مثيلات عنصر SDR في الكروموسوم مقسومًا على العدد الإجمالي للمثيلات. يتم إعطاء الإجمالي فقط للكائنات التي لم يتم تحديد تسلسل جينومها بالكامل. تم تحديد عناصر SDR في مسح intron tRNA Leu (UAA) المختلفة نوستوك سلالات (كوستا وآخرون 2002) تظهر أيضا. اصطلاحات الألوان: يتم تمييز كل عنصر من عناصر SDR بلون مميز ، يُستخدم في أشكال أخرى أيضًا. تظهر الانحرافات عن التسلسل المرجعي للمجموعة من خلال تمييز باللون الرمادي. يتم أيضًا تمييز عناصر SDR القريبة بلونها المميز. بالنسبة لهذه العناصر ، يتم استخدام خط أخضر أو ​​أسود إذا كان اتجاه العنصر هو نفسه العنصر المركزي ، وإلا فسيتم استخدام خط أحمر أو مائل. المتواليات المكتوبة بخط أحمر مائل هي أجزاء من الينقولات الصغرى المفترضة. الكتل الموجودة خارج العنصر المركزي والمظللة باللون الرمادي هي تسلسلات غير مسماة تم العثور عليها عدة مرات في الجينوم. يتم تلوين التتابعات المتكررة بشكل مترادف المجاورة وبخط عريض ، ويتم فصل الوحدات المكررة بأشرطة عمودية. تشير الأشرطة العمودية أيضًا إلى نهاية عناصر SDR. يتكرر الترادف مع الخطوط التي تمر عبرها هو انعكاس التكرارات التي يمثلها نفس اللون. التكرارات المعكوسة: تشير الشُرط السفلية إلى المناطق التي يُحتمل أن تشارك في الاقتران بالقاعدة الذاتية ، والأسهم الممتدة في أعلى من التجميع يشير إلى ما إذا كان الاقتران مدعومًا بقوة بواسطة طفرة تعويضية (أسهم صلبة) أم لا (أسهم مكسورة).

توصيف SDR1

بحث فضفاض من N. Punctiforme بدأ الجينوم بأجزاء متطابقة تقاطع إنترونات الحمض الريبي النووي الريبي (UAA) لـ نوستوك سلط Nos30 و Nos54 الضوء على عائلة كبيرة ومتنوعة من متواليات 24-nt تسمى SDR1 (بالنسبة للمراكز التجارية المنفصلة ، انظر المناقشة). يظهر في الشكل 1 أكثر أفراد الأسرة شيوعًا. وأدى البحث الأولي ، استنادًا إلى النسبة المئوية للهوية (انظر الطرق) ، إلى تلك العائلات الفرعية المتسلسلة المسمى SDR1.1 إلى SDR1.6 ، والتي تحدث في نوستوك الجينوم ما يصل إلى 10 مرات. يتم توفير قائمة أكثر شمولاً في الشكل التكميلي 1.

تشترك العائلات الستة الفرعية في لب محفوظ مكون من تسعة نيوكليوتيدات أو 10 (GAGCG.AG.CGA) ، إذا تم استبعاد SDR1.3.يحيط بهذا النواة تكرار مقلوب 4-nt ، باستثناء SDR1.3 مرة أخرى ، مدعومًا بنمط من الطفرات التعويضية في الموضع 5 & # x020139 و 21 & # x0201324. لتقييم أهمية التكرار المقلوب ، بحثنا في الجينوم لجميع حالات النمط الأساسي 10-nt وفحصنا التسلسلات المرافقة (الجدول 1). تم العثور على أمثلة أكثر بكثير من النمط الأساسي عن طريق الصدفة ، وفي الحالات الجديدة ، كان 77 ٪ محاطًا بتكرار مقلوب 4-nt من متواليات متنوعة. لن يُتوقع أي شيء بالصدفة ، ونأخذ هذه النتائج ، جنبًا إلى جنب مع التحيز الملحوظ تجاه الاستبدالات المقترنة بـ GT على الاستبدالات المزدوجة AC للإشارة إلى أن الاختيار يعمل على بولي نيوكليوتيد أحادي الجديلة ، ويفترض أن الحمض النووي الريبي نسخ من SDR1 ، قادر على الاقتران الداخلي الأساسي. مع إعادة تعريف SDR1 على أنه يمتلك النواة 10-nt والتكرارات المقلوبة المرافقة ، وجدنا 11 عائلة فرعية بها أربعة أعضاء على الأقل (الشكل 1). التعريف يستثني SDR1.3. هذه وغيرها من الحالات الخاصة سيتم مناقشتها في وقت لاحق.

الجدول 1.

تم العثور على أزواج متناظرة داخل مثيلات SDR1 حسب النمط

a تسلسل تم العثور عليه بواسطة النمط. . . . (....) GCGAG.AG.CGA (....) ، حيث يتم إرضاء الفترة بأي نيوكليوتيد ، يتم حسابها على أنها & # x0201c زوجي & # x0201d إذا كان بإمكان رباعي النوكليوتيدات داخل الأقواس أن يتزاوج مع بعضهما البعض إما باستخدام اقتران القاعدة التقليدي أو السماح بإقران جي تي أو التيار المتردد. لا يوجد مثيل مع GT أو AC الاقتران به أكثر من زوج واحد من هذا القبيل.

ب العدد المتوقع هو: الطول (س 7 ث 3) أين الطول هو طول N. Punctiforme الجينوم (9.1 ميجابايت) ، س هو جزء G وجزء C في الجينوم (0.21) ، و ث هو كسر A وكسر T (0.29). احتمال أن يقترن رباعي رباعي عشوائي تمامًا مع رباعي رباعي عشوائي آخر هو 0.4 ٪. نفس الاحتمال الذي يسمح بإقران GT في أي مركز أو AT pairi006Eg في أي موضع هو 2.0٪.

ج تم تقسيم مثيلات SDR1 التي تم العثور عليها بواسطة النموذج إلى مجموعتين: (1) تلك التي تم العثور عليها سابقًا من خلال التشابه الكلي ، كما هو موضح في قسم الأساليب ، و (2) تلك التي لم يتم العثور عليها بهذه الوسيلة.

هناك حالات نادرة حيث يتم تمديد التكرار المقلوب 4-nt بشكل كبير. في Crocosphaera watsonii، ست حالات من SDR1 لها تكرار مقلوب 4-nt مددت تسعة نيوكليوتيدات تكميلية إضافية في كل اتجاه ، وهو استنتاج مدعوم بطفرات تعويضية (الشكل التكميلي 1). يمكن رؤية الامتدادات المماثلة مع مثيلات SDR1 بتنسيق أنابينا PCC 7120 و Nodularia CCY9414 ، لكننا لم نر مثل هذه الامتدادات في العديد من مثيلات SDR1 في نوستوك.

توصيف SDR2

تسلسل متطابق من نوستوك تم استخدام Nos37 و Nos38 اللذين يقطعان إنترونات tRNA Leu الخاصة بهما للبحث في نوستوك الجينوم ، ينتج عنه عائلة من المتواليات ، تسمى SDR2 ، والتي تقع في مجموعتين فرعيتين وثيقتي الصلة ، SDR2a (24 nt) و SDR2b (25 nt). تشترك المجموعتان الفرعيتان في نفس النواة المتناظرة 20-nt ، باستثناء الإدراج / الحذف (الشكل 1). على الرغم من أن نمط الطفرات الفردية داخل المتماثل متحيز للغاية تجاه أولئك الذين يحافظون على الاقتران الأساسي من خلال تفاعل GU (AC على الشريط التكميلي) ، فإن الأدلة على أساس الطفرات التعويضية للهيكل الثانوي لـ SDR2a و SDR2b التي يتم الحفاظ عليها عن طريق الاختيار طفيفة (الجدول) 2 الأشكال التكميلية. 2 أ ، 2 ب). ومع ذلك ، فإن المتغيرات الأكثر شيوعًا لـ SDR2 تختلف فقط في النيوكليوتيدات المركزية (الشكل التكميلي 9C) ، تلك التي لا يُتوقع أن تشارك في الاقتران الأساسي إذا كان التناظر مطويًا على نفسه. يُحاط العنصر أحيانًا على اليمين بأربعة نيوكليوتيدات (غالبًا CTAC) قادرة على تمديد التناظر إلى 28 nt (الأشكال التكميلية 2 أ ، 10).

الجدول 2.

تحليل الطفرات داخل مناطق البنية الثانوية المفترضة

(أ) تم النظر في تسلسل واحد من كل عائلة فرعية ، باستثناء تلك التسلسلات مع عمليات الإدراج أو الحذف. على وجه الخصوص ، تم استبعاد العناصر ذات الإدخالات المعروفة لعناصر SDR (مثل SDR1.3). في حالة SDR1 ، تم النظر فقط في الحالات التي تم اكتشافها وفقًا لعدد حالات عدم التطابق.

ب تم النظر في جميع أزواج المواضع في مجموعة التسلسلات المحاذية ، كلما كان أحد النوكليوتيدات من الزوج هو G والآخر كان C أو أحدهما A والآخر T. اختلف زوج قيد النظر عن النيوكليوتيدات في نفس المواضع في التسلسل القانوني لعائلة SDR. تم تعريف الطفرات الفردية على أنها تلك التي يختلف فيها واحد فقط من النيوكليوتيدات عن التسلسل القانوني.

ج تعتبر أزواج النيوكليوتيدات هيكلية إذا كانت تتوافق مع زوج محدد في الشكل 1 على أنه من المحتمل أن يشارك في الاقتران الأساسي. خلاف ذلك ، تم اعتبار الزوج غير هيكلي.

د تم اعتبار الطفرات المزدوجة تعويضية إذا كان الزوج الناتج يتكون من G و C أو A و T. تم حساب الأزواج التي تعاني من طفرات مفردة على أنها تؤدي إما إلى زوج GT أو زوج AC أو جميع الأزواج الأخرى. العد الفعلي هو عدد حالات نوع الطفرة قيد الدراسة والتي لوحظت في الأزواج الهيكلية. العدد المتوقع هو الرقم المحسوب للأزواج الهيكلية باستخدام ترددات فئة الطفرات في الأزواج غير التركيبية. تم استخدام اختبار A & # x003c7 2 لتقييم الأهمية. تشير العلامة النجمية والعلامة النجمية إلى أهمية لـ ص & # x0003c 0.05 و ص & # x0003c 0.01 على التوالي. الاختلافات الجوهرية هي جميع الزيادات (موضحة بخط عريض) ما لم تتم الإشارة إلى ذلك.

توصيف SDR3

الانقطاع في intron من نوستوك تم استخدام رقم 51 للبحث في N. Punctiforme عائلة صغيرة من المتواليات ، SDR3 (الشكل 1 التكميلي الشكل 3). لا يوجد تباين كاف في المجموعة للسماح بتحديد المناطق التكميلية المحفوظة.

توصيف SDR4

لا يوجد تسلسل في ملف N. Punctiforme يطابق الجينوم المدى الكامل للانقطاع 45-nt من نوستوك رقم 33. ومع ذلك ، كان المقطع الداخلي 25-nt مشابهًا لأكبر عائلة من العناصر المتكررة الصغيرة التي وجدناها ، SDR4 (الشكل 1 التكميلي الشكل 4). يحتوي العنصر على زوجين من الأجزاء التكميلية ، تم تأكيدهما من خلال طفرات تعويضية متعددة تحافظ على الاقتران الأساسي (الجدول 2 الشكل التكميلي 4). لاحظ ، مع ذلك ، أن اختيار الخصلة الموضحة في الشكل 1 تعسفي إلى حد ما. لا يمكننا استبعاد احتمال أن يكون الشريط التكميلي مهمًا وظيفيًا. الجزء المتبقي من التسلسل من نوستوك Nos33 مطابق لـ SDR1.21 (الشكل التكميلي 1). وبالتالي ، فإن التسلسل الأصلي 45-nt عبارة عن اندماج عنصرين من عناصر SDR ، وهي مسألة سيتم استكشافها بشكل كامل أدناه.

توصيف SDR5 من خلال SDR8

في توصيف هذه العائلات من العناصر المتكررة المتعلقة بالاستيفاء المعروف داخل الإنترونات الزرقاء ، واجهنا عناصر متكررة أخرى متجاورة (الشكل 1 الأشكال التكميلية 5 & # x020138) ، والتي أطلقنا عليها SDR5 من خلال SDR8. يمتلك SDR5 ، مثل SDR4 ، مناطق أكدتها الطفرات التعويضية (الجدول 2 الشكل التكميلي 5) التي قد تحدد العناصر & # x02019 الهياكل الثانوية. يحتوي SDR6 على مناطق متشابهة ، على الرغم من عدم وجود تنوع كافٍ لاختبار أهمية الاقتران الأساسي المحتمل. تشترك هذه العائلات الثلاث من التسلسلات المتكررة في تسلسل مشترك قليلًا ، لكن هياكلها الثانوية المتوقعة & # x02014in لكل حالة حلقتان GyA مثبتتان في مكانهما بواسطة سيقان غنية بالـ GC & # x02014 تُظهر تشابهًا مذهلاً (الشكل 2 أ و # x02013C). قد يمتلك SDR8 أيضًا حلقة GyA محاطة بجذع غني بالـ GC.

الهياكل الثانوية المقترحة لعناصر حقوق السحب الخاصة. يتم إعطاء حلقات العناصر كشعارات متسلسلة ، حيث يتناسب ارتفاع الأحرف المكدسة في موضع معين مع محتوى المعلومات في هذا الموضع ويتم تحديد التردد النسبي لكل نيوكليوتيد من خلال الارتفاع النسبي للحرف. يتم تمثيل النيوكليوتيدات الإجماعية إما بأحرف أو دوائر مملوءة (A ، أخضر C ، أزرق G ، أصفر T ، أحمر). يتم فصل التسلسلات المستهدفة المقترحة عن عناصر SDR بواسطة أشرطة سميكة. (أ & # x02013C) عناصر SDR كاملة SDR4 و SDR5 و SDR6 (د) متغير الحلقة اليسرى لـ SDR4 (هاء ، واو) الحلقة اليمنى المتغيرة لـ SDR4. تحدد الأسهم امتدادًا للجذع الأيمن.

SDR4.12 (الشكل 1) أكبر بمقدار 3 nt من متواليات SDR التقليدية بسبب الحلقة اليمنى التي لا تتناسب مع النمط المعتاد. دفعتنا هذه الاكتشافات وغيرها من الاكتشافات إلى البحث بشكل منهجي عن حالات SDR4 التي تحتوي على ما يصل إلى ثلاثة نيوكليوتيدات إضافية في الحلقة اليمنى. تم العثور على ما مجموعه 33 حالة من هذا القبيل (الشكل 2E ، F الشكل التكميلي 4) ، في جميع الحالات التي تم فيها العثور على نوكليوتيد إضافي واحد ، كانت الحلقة تمتلك بيريميدين مركزي إضافي. في جميع الحالات التي تم فيها العثور على ثلاثة نيوكليوتيدات إضافية ، تتزاوج النيوكليوتيدات المتطرفة مع بعضها البعض وتتبع الأربعة الداخلية نفس النمط ، GTTA ، كما هو الحال مع نوكليوتيد إضافي واحد. نادراً ما تتجاوز الحلقة اليسرى 3 نت في حالات SDR4 بوصة N. Punctiforme. ومع ذلك ، فإن مثل هذه الامتدادات أكثر شيوعًا في متواليات SDR4 في البكتيريا الزرقاء الأخرى ذات الصلة ، مع تسلسلها مشابه لتسلسل الحلقات اليمنى (الشكل 2 د). لم نتمكن من العثور على مثيلات SDR5 مع امتدادات الحلقة.

يحتوي SDR7 ، مثل SDR2a ، على تسلسل متناظر طويل مثالي ، لا يتم دعم الاقتران الذاتي بشكل كبير من خلال تحليل الطفرات داخل التناظر (الجدول 2 الشكل التكميلي 7).

هيكل ثانوي ممكن في عناصر حقوق السحب الخاصة

تمتلك جميع عائلات SDR مناطق متناظرة قادرة على الاقتران الداخلي للقاعدة ، ولكن تُستخدم أيضًا متجانسات الحمض النووي بشكل شائع كمواقع ربط بواسطة بروتينات ثنائية الأبعاد. لتقييم ما إذا كانت هذه المناطق تلعب دورًا في البنية الثانوية ، قمنا بتحليل حدوث الطفرات التعويضية ، والمؤشرات المهمة لتفاعلات النيوكليوتيدات و # x02013 تفاعلات النوكليوتيدات (روسيت وآخرون 1991 ريفاس وإدي 2001). تمت مقارنة عدد الطفرات التعويضية في أزواج النوكليوتيدات المفترض أنها مهمة في البنية (كما هو موضح في الشكل 1) مع العدد من جميع الأزواج المحتملة الأخرى (الجدول 2). في حالات SDR1 و SDR4 و SDR5 ، تجاوز عدد الطفرات التعويضية في المواضع الهيكلية بشكل كبير العدد المتوقع من الاقتران التعسفي ، وفي حالة SDR2a ، كان الفائض مهمًا بشكل ضعيف.

قد يعمل الاقتران الأساسي بين G و T (أو U في RNA) أيضًا على الحفاظ على البنية الثانوية أو قد يكون حالة وسيطة في الطريق إلى الطفرات التعويضية الكاملة (روسيت وآخرون 1991). يتوافق التغيير الذي ينتج عن توليفة التيار المتردد مع اقتران جي تي من النيوكليوتيدات على الشريط المعاكس. ومن المثير للاهتمام ، أن عدد الطفرات الفردية التي تسمح بإقران GT في المواضع الهيكلية تجاوز التوقعات بشكل كبير في حالات SDR1 و SDR5 ، في حين أن عدد أزواج GT في المواضع الهيكلية على كلا الخيوط تجاوز التوقعات بشكل كبير في حالة العنصر المتماثل SDR2a. من الغريب أن العنصر غير المتماثل SDR4 قد زاد أيضًا بشكل كبير من إمكانية أزواج GT على كلا الخيوط في المواضع الهيكلية.

بحث شامل عن عناصر SDR في جينوم نوستوك

كنا قلقين من أنه باتباع الاستيفاءات في نوستوك الإنترونات ، ربما تجاهلنا التسلسلات المتكررة ذات الأهمية الكمية الأكبر. لمعالجة هذه المشكلة ، أجرينا بحثًا غير متحيز وشامل عن عناصر لا تقل عن 24 نانومتر تحدث في نسخ متعددة في جينوم N. Punctiforme، وللمقارنة ، طبق التحليل نفسه على جينومات بكتيريا أخرى: البكتيريا الزرقاء ذات الصلة البعيدة ، متزامن PCC 6803 و الإشريكية القولونية ( الجدول 3 ).

الجدول 3.

العديد من المتواليات 24-nt في N. Punctiforme

(أ) عناصر حقوق السحب الخاصة الموصوفة في هذا العمل موضحة بالخط العريض.

(ب) الطول المعطى لعناصر SDR هو طول العنصر بالإضافة إلى التسلسل المستهدف المقترح.

ج الإحداثيات كروموسومية ما لم يذكر خلاف ذلك.

تتصدر قائمة التسلسلات المتكررة في N. Punctiforme هما اثنان من عمر 24 عامًا تم احتوائهما في العديد من عائلات CRISPR الموصوفة سابقًا (Godde and Bickerton 2006) في نوستوك الجينوم. التكرارات السباعية والثمانية الترادفية وتسلسلات الإدراج (بالحجم الكامل والمصغر) موجودة أيضًا في القائمة ، ولكن غالبية التسلسلات المتكررة الشائعة في نوستوك هي جزء من عناصر حقوق السحب الخاصة الموضحة في القسم السابق. الاستثناء الوحيد هو جزء من متناظر طويل غير كامل ذي طول متغير ، يسمى SDRQ ، والذي يذكرنا بتسلسلات BoxC من بكتريا قولونية (Bachellier et al. 1999) ، حيث ينشأ المتناظر من منطقة غنية بالبيورين جنباً إلى جنب مع منطقة غنية بالبيريميدين. هناك ما لا يقل عن 14 نسخة من هذا العنصر & # x0003e100 nt والعديد من العشرات من الحالات الأخرى الأصغر أو المتباعدة جدًا بحيث لا يمكن اكتشافها بواسطة BLAST إلى أقصى حد. يكمن التوصيف الأكثر اكتمالا لهذا العنصر (والعناصر الأخرى ذات النسخة الأقل) خارج نطاق هذا التقرير.

متزامن PCC 6803 و بكتريا قولونية لها أنماط مختلفة تمامًا من التسلسلات المتكررة (الجدول 3). مجموعة المتواليات المتكررة من متزامن تهيمن عليه تسلسلات الإدخال ، بينما تقريبًا جميع التسلسلات المتكررة في بكتريا قولونية مع رقم النسخة & # x0003e10 تندرج في عائلة واحدة موصوفة سابقًا ، PU / REP (Bachellier et al. 1999). يختلف أعضاء هذه العائلة عن بعضهم البعض فقط من خلال عدد قليل من النيوكليوتيدات ، ومثل العديد من عناصر SDR ، تحتوي عناصر PU / REP على تسلسلات تفترض بنية ثانوية ، كما تؤكده الطفرات التعويضية (الشكل التكميلي 11).

نظرًا لأن SDR2a و SDR7 يحتويان على متناظرات مثالية طويلة ، فقد بحثنا أيضًا في الجينوم عن جميع التسلسلات المتجانسة المثالية بطول يساوي أو أكبر من 2 & # x000d7 10 nt (الشكل التكميلي 10). من بين 124 متناظرًا تم العثور عليه ، تم احتساب 55 بواسطة تسلسل SDR2a و SDR7 ، ولم يحدث أي من الباقي مع رقم نسخة أكبر من 2.

وبالتالي ، فإن تسلسلات SDR في الشكل 1 هي الأكثر عددًا من جميع التكرارات والمتناظرات غير المميزة في جينوم N. Punctiforme، ولكن هذا النوع من التكرار لا يوجد بشكل عام في الجينوم البكتيري. يمثل العدد الإجمالي للتكرارات المشار إليها في الشكل 1 حوالي 0.3 ٪ من إجمالي جينوم N. Punctiforme وحوالي 1.5٪ من تسلسلها الجيني.

مواقع عناصر حقوق السحب الخاصة

سيكون من المهم معرفة مدى سرعة حدوث عمليات إدخال جديدة في الجينوم في زمن التطور. أحد محددات الوقت المفيدة هو معدل العبور النموذجي للبلازميدات. إذا حدث الإدراج بسرعة فيما يتعلق بمعدل كسب وخسارة البلازميد ، عندها يتوقع المرء أن تجد عناصر SDR تظهر في الكروموسوم وفي البلازميدات بدرجة تتناسب مع أحجامها المستهدفة. يمكن تقدير نسبة حجم الهدف الكروموسومي إلى الحجم المستهدف للبلازميد كنسبة أطوالهم ، وهي 10: 1 في حالة N. Punctiforme. ربما يكون هذا تقديرًا مبالغًا فيه ، حيث أن شكل البلازميدات يحتوي على نسبة مئوية أعلى من الجينات غير الخاضعة للاختيار داخلها نوستوك. يتم توزيع إدخال SDR5 بين الكروموسومات والبلازميدات ، بنسبة 5٪ في الأخير (تسعة من 166 شكل 1). في البكتيريا الزرقاء ذات الصلة أنابينا PCC 7120 و أنابينا فريبليس، ستة من 16 إدخالًا لـ SDR5 في البلازميدات ، خمسة منها في بلازميد واحد ، pAlpha. ومع ذلك ، فإن تسلسل عائلات SDR المتبقية موجود بشكل كبير في الكروموسوم ، 1001 حالة مقارنة بـ 17 في حالات البلازميدات (بنسبة 60: 1). إذا تمكنت عناصر SDR من التحرك بين جزيئات متميزة ، فإنها تتحرك بشكل أبطأ بكثير من معدل فقد البلازميد واكتسابه ، باستثناء SDR5.

كما يتوقع المرء ، هناك تحيز قوي ضد إدخال عناصر SDR داخل الجينات (الجدول 4). يكون هذا التحيز أكثر وضوحًا عندما لا يكون طول العنصر مضاعفًا لثلاثة (الجدول 4 ، راجع جزء SDR1 و SDR2a و SDR3 و SDR4 و SDR5 في الجينات التي لها نفس الجزء من إدخالات SDR2b و SDR7).

الجدول 4.

سياق العناصر المتكررة في جينوم N. Punctiforme و بكتريا قولونية

(أ) يُعطى الطول على أنه عدد النيوكليوتيدات المُدخلة ضمن هدف ذي تسلسل معروف (إما جين محفوظ أو تسلسل متكرر). في حالة SDR3 ، يتم إدخال 25 nt على ما يبدو مع فقدان 1 nt من الهدف. قد يختلف طول SDR7. قد يكون التسلسل 24-nt المقدم لـ SDR8 جزءًا من عنصر أكبر ، كما تمت مناقشته في النص. يشير الرقم الذي يلي علامة الجمع (عند وجوده) إلى طول الهدف المفضل. تشير علامة الاستفهام إلى أن القيمة تستند إلى أدلة محدودة.

ب العدد الإجمالي للمثيلات (كما هو محدد في الطرق) والعدد الإجمالي حيث يكون عدد نسخ التسلسلات المتطابقة 3 على الأقل ، كما هو مأخوذ من الجداول التكميلية 1 & # x020138.

ج سياق الإدخالات: على الأقل جزئيًا داخل الجين أو بين الجينات. إذا كانت متداخلة بين الجينات ، ثم بين الجينات على التوازي (P) ، أو المتقاربة (C) ، أو التباعد (D). النسبة المئوية الأولى نسبة إلى جميع عمليات الإدخال للعنصر المحدد ، والثانية مرتبطة بتلك الإدخالات في المناطق الجينية. تشير العلامة النجمية والعلامة النجمية إلى الأهمية كما هو محدد بواسطة اختبار & # x003c7 2 في ص & # x0003c 0.01 أو ص & # x0003c 0.001 على التوالي. يشير السهم إلى اتجاه الانحراف عن التوقع.

د فقط عناصر PU التي تحتوي على نسخة عالية 24-mers (الجدول 4 الجدول الإضافي 10) التي تم العثور عليها من خلال البحث الموصوف في النص يتم النظر فيها هنا.

يبدو أن موقع العناصر المتناظرة SDR2a و SDR2b و SDR7 منحازًا نحو التسلسلات النهائية من جينين (الجدول 4). قد يكون جزء من التحيز ناتجًا عن النسبة المئوية الأكبر من الفضاء داخل الجينات المتقاربة التي لا تخضع لضغط انتقائي قوي ، ولكن إذا كان الأمر كذلك ، فإن التحيز يكون أقل بكثير مع عناصر SDR غير المتجانسة. يظهر مثل هذا التحيز مع متواليات متناظرة من مجموعة واسعة من البكتيريا eubacteria (Petrillo et al. 2006) ، وعلى وجه الخصوص ، مع عناصر PU / REP الخاصة بـ بكتريا قولونية (الجدول 4). تذهب عناصر SDR2a إلى أبعد من ذلك ، وتميل إلى الاقتراب من نهايات الجينات. تم العثور على ما مجموعه 31 ٪ في غضون 30 nt من نهاية الجين 3 & # x02032 ، ضعف إلى ثلاثة أضعاف القيمة النموذجية لعناصر SDR. يتم حساب هذه الخاصية من خلال مجموعة فرعية من عناصر SDR2a ، تلك المحاطة بتكرار سباعي ، كما هو موضح في القسم التالي.

عادةً ما تتكون متواليات إنهاء النسخ المستقلة Rh من متناظر طويل في اتجاه مجرى الجين ، متبوعًا بسلسلة من بقايا الثيميدين (Yarnell and Roberts 1999). نادراً ما يتم ملاحظة المناطق الطويلة الغنية بالثيميدين (كما تم تحديدها سابقًا بواسطة de Hoon et al.2005) بجوار عناصر SDR المتناظرة (الأشكال التكميلية.2A ، 2B ، 7) أو عناصر PU / REP (الشكل التكميلي 11) ، ولكن الامتدادات القصيرة (أربعة ثيميدينات على الأقل) شائعة 3 & # x02032 إلى متواليات SDR7 ، توجد ضمن 10 nt من 39 ٪ من متواليات SDR7 ، بالمقارنة مع 3٪ متوقع من ترددات أحادي النوكليوتيد. من الغريب أنه في 82٪ من هذه الحالات ، يسبق الثيميدينات على الفور أحد أكواد الإنهاء الثلاثة ، على الرغم من أن الكودون ليس جزءًا من إطار قراءة مفتوح.

التسلسلات المرافقة لعناصر SDR

هل تشكل عناصر حقوق السحب الخاصة كما تم تعريفها وحدات متنقلة؟ إذا كان عنصر ما مشتتًا كوحدة مستقلة ، فلن يتوقع المرء أن يرى أي ارتباط بين الاختلافات في التسلسلات المرافقة والاختلافات الطفيفة داخل التسلسل المتداخل نفسه (باستثناء ما تحدده تفضيلات الهدف). من ناحية أخرى ، إذا كان التسلسل المتداخل مشتتًا في الجينوم من خلال آلية تعتمد على التسلسلات المرافقة ، فيجب عندئذٍ تجميع عناصر SDR حسب تباينها الداخلي في وقت واحد تجميع المقاطع حسب تسلسلها المرافقة.

في بعض الحالات ، هناك علاقة قوية بين عائلة حقوق السحب الخاصة وتسلسل متكرر محدد. ما مجموعه 68٪ من حالات SDR2a التي تحدث في نسخة عالية (ثلاث نسخ أو أكثر) يحيط بها تباين يمكن التعرف عليه من STRR8 (Meeks وآخرون 2001) ، التكرار السباعي [AACTCCT]ن (34 من 50 حالة) (الشكل 1 الشكل التكميلي 2A). إجمالي 92٪ من مثيلات SDR3 عالية النسخ محاطة بمتغير [AGTGC TG]ن (12 من 13 حالة). في حالات أخرى ، يرتبط التكرار الهبتاميري المحيط بعائلة فرعية واحدة وتكرار مختلف مع عائلة فرعية مختلفة ، على سبيل المثال ، في حالات SDR1.2 و SDR1.3 المرتبطة بـ STRR1 (Mazel et al. 1990 Meeks et al. 2001) ) ، [TGGGGAA]نو (11 من 15 حالة) و SDR1.15 المرتبط بـ [GAGCAGG]ن (10 من 10 حالات).

يتم تضمين بعض عناصر SDR في كيانات أكبر تحمل السمات المميزة للعناصر القابلة للنقل (الشكل 3). غالبًا ما يقع SDR2b ضمن تسلسل محفوظ نسبيًا أكبر ، وعادة ما يكون طوله 101 نيوكليوتيد ، ولكن يصل إلى 134 نيوكليوتيد (الشكل التكميلي 2 ب). تحتوي الوحدات الأكبر على نسخة ثانية مقلوبة من SDR2b. ترتبط الوحدات بتكرار ثابت 18-nt معكوس ومحاطة بتكرار مباشر 10 nt يختلف تسلسله من حالة إلى أخرى. يمكن العثور على نهاية واحدة على الأقل يمكن التعرف عليها بجوار 72 من 84 مثيل SDR2b. نظرًا لأن التكرارات المقلوبة التي تحيط بها التكرارات المباشرة هي علامة شائعة على الينقولات ، فقد قمنا بفحص الجينوم بحثًا عن حالات أخرى من تسلسل التكرار المعكوس. وجدنا أربعة أضعاف الوحدات مع هذه الأطراف المقلوبة بجانب تلك التي تحتوي على SDR2b. ما مجموعه 90٪ من هذه كانت أصغر من 160 nt ، لكن اثنين من متواليات الإدراج بالحجم الكامل تحتوي على نسخة من الترانسبوزيز المشفرة بواسطة npr1652. بالإضافة إلى ذلك ، هناك 14 نسخة كاملة من SDR8 و 14 نسخة كاملة من SDR4 داخل npr1652- ترانسبوزونات صغيرة ذات صلة (الشكل 3 أ الشكل التكميلي 8). من الواضح أن minitransposon ذات الصلة بالتي تحتوي على npr1652 يضم العديد من عناصر حقوق السحب الخاصة. تم الإبلاغ عن minitransposon مؤخرًا في نوستوك والبكتيريا الأخرى (Zhou وآخرون 2008).

Minitransposons تحمل عناصر SDR. يتم عرض أمثلة تمثيلية لأربع عائلات (A & # x02013D) من minitransposons. عندما يتم تحديد الينقولات الكاملة الأصل ، يكون تسلسلها باللون الأحمر بالإضافة إلى التسلسلات المتطابقة في مشتقات الينقولات الصغيرة. عندما لا يتم تحديد الينقولات الكاملة ، تظهر فقط التكرارات المقلوبة لليقولات الصغيرة المقترحة باللون الأحمر. تتم الإشارة إلى التكرارات المقلوبة بواسطة أسهم حمراء (صلبة من أجل الينقولات الصغيرة ، منقطة على الينقولات الكاملة). يُشار إلى التكرارات المباشرة المرافقة ، عند وجودها ، بأسهم سوداء وتظهر باللون الأسود ، تحتها خط. يتم تمييز عناصر SDR وفقًا لاتفاقيات الشكل 1. تشير الشُرط السفلية داخل الينقولات الكاملة إلى إطارات قراءة مفتوحة. الإحداثيات ذات الترتيب المنخفض لكل مثال ، كلها من كروموسوم N. Punctiforme ما لم يذكر خلاف ذلك: (A1) 263683، (A2) 670380B، (A3) 3371581B، (A4) 2032965B، (B1) 697575B، (B2) 1598337B، (C1) 2898180B، (C2) 75121B in Nodularia CCY9414 كونتيج 003 ، (D1) 7174915B ، (D2) 6179713F في كروموسوم أنابينا فريبليس، (D3) 5233271F في كروموسوم أنابينا PCC 7120 و (D4) 114174B في pAvaC البلازميد أ. فريبليس. يشير الحرف بعد الإحداثي إلى أن التسلسل الموضح يقع على الشريط الأمامي (F) أو الخلف (B).

SDR4 ، وخاصة SDR8 ، هم سكان شائعون ل minitransposons الأخرى. تم العثور على إحدى عشرة حالة كاملة من SDR8 وستة مثيلات كاملة من SDR4 (جميعها متاخمة لـ SDR8) داخل minitransposon الذي لا يُعرف عن ترانسبوزون كامل ، وتم العثور على خمس حالات أخرى من SDR8 داخل ترانسبوسون صغير ظاهر ثالث (الشكل 3 ب التكميلي الشكل. 8). تم العثور على هذين الينقولات الصغيرة أيضًا يحتويان على SDR8 داخل بكتيريا زرقاء غير متجانسة أخرى ، Nodularia CCY9414. اللافت للنظر أن جميع مثيلات SDR8 وبعض SDR4 في minitransposons تكمن في نفس التسلسل 33-nt. يحدث هذا التسلسل دون انقطاع ثماني مرات في نوستوك الجينوم: ثلاث مرات داخل npr1652-النقل الصغير ذو الصلة وخمس مرات في أي مكان آخر في الكروموسوم. في جميع الحالات ، يحيط به في النهاية 3 & # x02032 منطقة غنية بالبيورين ، تمامًا كما هو الحال في minitransposons الثلاثة. من المتصور أن هذه المنطقة كانت مفيدة في الأحداث التي أدت إلى إدخال عناصر SDR في minitransposons. تم العثور على العديد من مثيلات minitransposon الموضحة في الشكل 3 ب في الاثنين أنابينا الجينوم ، ولكن لم يتم العثور على التسلسل المحفوظ 33-nt ولا SDR8 داخلها (البيانات غير معروضة).

أربع مثيلات فقط من SDR2a بتنسيق N. Punctiforme تقع داخل minitransposon الكامل الموضح في الشكل 3C ، لكن البكتيريا الزرقاء ذات الصلة بها العديد من النسخ (كما هو موضح لاحقًا) ، بما في ذلك نسخة من الينقولات الكاملة على ما يبدو. توجد خمس مثيلات من SDR5.3 داخل الينقولات كاملة الطول (بيانات الشكل 1 غير معروضة).

ترتبط التسلسلات المحيطة بعناصر SDR2a ارتباطًا وثيقًا بخصائصها الموضعية. يتم احتساب انحياز عناصر SDR2a للمواقف المتتالية مباشرة من الجينات الموصوفة في القسم السابق بالكامل من خلال المجموعة الفرعية المحاطة بتكرار سباعي. في هذه الفئة الفرعية ، يقع 57٪ من عناصر SDR2a في نطاق 30 نانومتر من نهاية الجين 3 & # x02032 ، والأهم من ذلك ، في جميع الحالات الأربعين باستثناء واحدة ، يقع الجين على اليمين ، وفقًا للاتجاه الموضح في الشكل 1 والشكل 6 ج (أدناه) (انظر الشكل التكميلي 2 أ لحالات النسخ المتعددة).

مقارنات التسلسل بين البكتيريا الزرقاء. يتم عرض تسلسل الجينات المتعامدة أو المناطق المجاورة للجينات المتعامدة حيث يحمل واحد على الأقل من التسلسلات عنصر SDR. تم توضيح اصطلاحات الألوان كما هو موضح في الشكل 1. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض تسلسل الجينات بخط مائل وفي اللون السماوي الغامق (للأمام) أو الأرجواني (للخلف) ، ويشار إلى مدى إطار القراءة بواسطة الأسهم. التسلسلات مأخوذة من N. Punctiforme (الجينات npr0867 ، npf3461 ، npr5797 ، pnpbr028 ، و 278), أنابينا PCC 7120 (الجينات alr0534، all1327، alr1612، all2013، alr2719، و alr3810), أنابينا فريبليس (الجينات ava0005 ، ava2936 ، و افا 3794)، و Nodularia CCY9414 (الجينات n9414؟ 03688، n9414؟ 12753، و n9414؟ 13260). تشير العلامات النجمية إلى مواقع الحفظ بين جميع التسلسلات المعطاة.

من المهم ملاحظة أن عناصر حقوق السحب الخاصة تختلف بشكل عام عن الوحدات التي تحتوي عليها. على سبيل المثال ، غالبًا ما يتم العثور على SDR4 خارج minitransposons الموصوفة أعلاه ، وعادة ما يتم العثور على minitransposons بدون عناصر SDR. تم العثور على تكرار heptameric في نوستوك الجينوم بشكل أكثر تكرارًا بدون عناصر SDR.

التسلسلات المرافقة لبعض عناصر SDR متغيرة للغاية (الأشكال التكميلية. 1 & # x020138). باستثناء SDR5.3 المحمولة بواسطة ترانسبوزون ، لا تشترك عناصر SDR5 عمومًا في التسلسلات المرافقة ، وينطبق الشيء نفسه مع SDR7. في الطرف الآخر توجد عناصر SDR3 و SDR8 ، وكلها تقريبًا محاطة بنفس التكرارات الترادفية (SDR3) أو التسلسل المحفوظ الأكبر (SDR8). يقع SDR4 بين هذين النقيضين ، حيث يشترك أعضاء العائلات الفرعية ضمن SDR4 في التسلسلات المرافقة ، ولكن هناك قدرًا كبيرًا من التباين في التسلسلات المرافقة لعائلات فرعية مختلفة وغالبًا ما تكون ضمن عائلات فرعية.

يعد SDR1.17 (الشكل 1) واحدًا من العديد من العائلات الفرعية التي يمتلك أعضاؤها متواليات محاطة متطابقة تقريبًا لا يمكن تفسيرها من خلال جذب التكرارات السباعية أو العناصر القابلة للنقل. وتناقش هذه في المقطع التالي.

عناصر SDR المتداخلة

جميع عناصر SDR المميزة في هذه الدراسة أصغر من 30 nt ، لكن التسلسل محرف في إنترونات الحمض الريبي النووي الريبي لـ نوستوك يبلغ طول الرقمين 41 ورقم 33 48 و 45 nt ، على التوالي (الشكل 1 ، تحت SDR1 و SDR4). ومع ذلك ، يمكن النظر إلى كلاهما كعنصر SDR مدرج في عنصر آخر: عنصر SDR1 غير مسمى تم إدراجه في مثيل SDR1.21 في الحالة الأولى و SDR4.4 في SDR1.21 في الحالة الثانية. تكشف الدراسة المتأنية للتسلسلات المرافقة لعناصر SDR أن عناصر SDR المتداخلة شائعة للغاية في N. Punctiforme.

يوضح الشكل 4 أ SDR متداخلاً نموذجيًا وكيف يمكن أن يكون قد نشأ عن طريق الإدخالات المتتالية لـ SDR4 في نفسه ، واستهداف تسلسل CGAAG. يوضح الشكل 4 ب مثالًا أكثر تطرفًا ، مع ستة إدخالات مختلفة لـ SDR1 في عنصر مفترض قابل للتحويل ، ويوفر تسلسلًا معقولًا للأحداث التي كان من الممكن أن تؤدي إلى 11 مشتقًا صغيرًا مرتبطًا على ما يبدو والتي لوحظت في الجينوم الحالي لـ N. Punctiforme. توضح هذه التسلسلات ليس فقط قدرة SDR1 على الإدراج في مواقع جديدة ، ولكن أيضًا قدرة القوى المتدهورة & # x02014deletion and mutation & # x02014 لاستعادة مساحة الجينوم المأخوذة من التسلسلات المتكررة. يبدو من العدل أن نستنتج أنه باستثناء تلك الحالات التي توفر فيها التسلسلات المتكررة ميزة انتقائية ، فإننا نرى فقط تلك الحالات التي ظهرت مؤخرًا نسبيًا في زمن التطور.

عناصر SDR المتداخلة. (أ) بنية متداخلة تتكون من عدة عناصر SDR4 باستخدام اصطلاحات الألوان الموضحة في الشكل 1. العنصر المتداخل (السطر 4) ، الموجود في كروموسوم N. Punctiforme من 671،496 إلى 671،583 (مقلوب) ، قد نشأ ، كما هو موضح ، عن طريق إدخال SDR4.5 (السطرين 1 و 2) ، متبوعًا بإدخال عنصر SDR4 غير مسمى في الاتجاه المعاكس (الخطان 2 و 3) ، و أخيرًا عن طريق إدخال SDR4.3 (السطران 3 و 4). تسلسل الوسيط المقترح الموضح في السطر 3 موجود بالفعل في أي مكان آخر في الكروموسوم ، بين الإحداثيات 3،226،461 و 3،226،527 (مقلوب). الوسيطات المقترحة 1 و 2 هي افتراضية. (ب) الهياكل المتداخلة المستمدة من عمليات الإدراج الواضحة المتعددة لعناصر SDR1 ، مظللة باللون الأصفر. تظهر عناصر SDR1 في الاتجاه الأمامي بأحرف سوداء أو خضراء. يتم إعطاء الأحرف الموجودة في الاتجاه العكسي بأحرف حمراء. التسلسلات بالأحرف الحمراء التي تحيط بالعناصر المتداخلة هي التكرارات الطرفية المقلوبة لـ minitransposon المفترض الذي يتم تضمين العناصر المتداخلة فيه. يتم الاحتفاظ بالتسلسلات المميزة باللون الرمادي ولكنها غير مميزة. الإحداثيات ذات الترتيب المنخفض للتسلسلات الموضحة هي (B1) 3368609F ، (B2) 2564863B ، (B3) 1746187F ، (B4) 8086669B ، (B5) 633195F ، (B6) 50757F ، (B7) 8020729F ، (B8) 6448446F ، (B9) 1811789b ، (B10) 7091736B ، و (B11) 2217329F ، حيث يشير F و B إلى الأمام والخلف (معكوس) على التوالي. ال أقحم في أعلى يقدم سلسلة من الأحداث المعقولة التي ربما أدت إلى ظهور التسلسلات المرصودة. تشير الأرقام الموجودة في الدوائر إلى الخطوط الموجودة في المحاذاة. الدوائر الرمادية هي وسيطة افتراضية. (ج) العناصر المركبة ذات الصلة الظاهرة المكونة من SDR1 و SDR4 و SDR6. يتم تنظيم التسلسلات أولاً بواسطة العناصر الخارجية ، فئتان فرعيتان غير مسماة لـ SDR1. ثم يتم تقسيم كل مجموعة وفقًا لما إذا كان SDR4.11 أو SDR4.12 قد تم إدراجه في عنصر SDR1. الإحداثيات ذات الترتيب المنخفض للتسلسلات الموضحة هي (D1) 3134527B ، (D2) 2144806F ، (D3) 4962007F ، (D4) 3363464F ، (D5) 5179224F ، (D6) 8021963F ، (D7) 6220474F ، (D8) 733274B ، (D9) 187174B ، (D10) 676346B ، (D11) 5070575B ، (D12) 7201684F ، (D13) 6371472B ، (D14) 5596457F ، و (D15) 3424319B.

لا يمكن تفسير جميع العناصر المتداخلة بسلسلة متفرعة من عمليات الإدراج والطفرات. يوضح الشكل 4 ج مجموعة من المتواليات ذات الصلة التي لا يمكن تفسيرها على هذا النحو ، دون اللجوء إلى المصادفات غير المحتملة ، على سبيل المثال ، إدخال نفس SDR4 / 6 في نفس الموضع داخل مثيلين مختلفين من SDR1. تشير التسلسلات إلى آلية لنشر طفرة في موقع ما إلى تسلسلات أخرى مماثلة ، ربما عن طريق إعادة التركيب بين النسخ الصبغية أو عن طريق التحويل الجيني.

نظرًا لتعقيد العناصر المتداخلة الموضحة في الشكل 4 ، من الواضح أنه من الصعب أتمتة تحديد هويتها وبالتالي ، لا نعرف المدى الكامل الذي تحدث فيه العناصر المتداخلة في الجينوم. للحصول على فكرة ، أجرينا بحثًا شاملاً عن عناصر SDR1 المحددة بالنمط & # x0201c. . .. (& # x0003c & # x0003c & # x0003c & # x0003c) GAGCG.AG.CGA (& # x0003e & # x0003e & # x0003e & # x0003e) & # x0201d (where & # x0003c & # x0003c & # x0003c & # x0003e & #3e يشير # x0003e إلى تكرارات مقلوبة 4-nt) ومقسمة بإدخال من 21 إلى 28 نيوكليوتيد. تم العثور على ما مجموعه 72 حالة من هذا القبيل في N. Punctiforme الجينوم (45٪ من عدد حالات SDR1 غير المنقسمة) ، منها 37٪ تمت مقاطعتها بإدخال SDR1 و 43٪ بواسطة SDR4. بالنظر إلى الأمر من الداخل إلى الخارج ، من أمثلة SDR4 في العائلات الفرعية مع ثلاث نسخ أو أكثر ، 54٪ تقع ضمن SDR1 أو SDR4. في حالات SDR1 ، يقع 27٪ ضمن SDR1. يشير الشكل 1 إلى بعض تنوع هذه العناصر المتداخلة (يوضح الشكلان التكميليان 1 و 4 جميع الحالات التي تحتوي على عائلات فرعية عالية النسخ).

في المقابل ، يعتبر SDR6 جزءًا مما يبدو أنه عنصر واحد مدمج مع SDR4. ما مجموعه 87٪ من جميع مثيلات SDR6 مسبوقة بـ SDR4 (أو بقاياها) في نفس الموضع ونفس الاتجاه المقلوب ، وينطبق الشيء نفسه على الحالات الموجودة في البكتيريا الزرقاء ذات الصلة (الشكل التكميلي 6) ، مما يشير إلى أصل واحد . لا يوجد دليل واضح على وجود مستقل لحقوق السحب الخاصة 6. تقع وحدة SDR4 / SDR6 في عدة سياقات مختلفة ، بما يتفق مع فكرة أن الوحدة المدمجة متحركة. من الواضح أن إحدى عمليات الإدراج حدثت داخل SDR1.2 لتشكيل SDR1.3 الشاذ في البداية ، المذكور سابقًا.

يشير إدخال SDR4 في SDR1 إلى أن SDR1 كان موجودًا في الجينوم في وقت كان SDR4 متحركًا. لقد بحثنا عن علاقات أخرى من هذا القبيل ووجدنا إدخالات SDR4 في SDR5 وعنصر SDR4 / SDR6 وكذلك في نفسه (الشكل التكميلي 4) ، SDR1 في SDR5 وكذلك في نفسه (الشكل التكميلي 1) ، و SDR4 / عنصر SDR6 في SDR1 وكذلك في نفسه (الأشكال التكميلية 4 ، 6). لم نعثر على أمثلة لعناصر حقوق السحب الخاصة الأخرى المشاركة في التداخل. قد يستمد المرء من هذا ترتيب ظهور SDR5 ، ثم SDR1 ، ثم SDR4 / SDR6 ، وأخيرًا SDR4 ، لكن التسلسل الحقيقي للأحداث هو بلا شك أكثر تعقيدًا ، كما سيتم مناقشته.

عناصر حقوق السحب الخاصة في البكتيريا الزرقاء الأخرى

من أجل ربط وجود عناصر SDR بتطور الكائنات الحية ، أخذنا في الاعتبار جينومات البكتيريا الزرقاء الموضحة في الشكل 5. باستثناء SDR1 و SDR7 ، اقتصرت عناصر SDR على فئة متماسكة ، وهي البكتيريا الزرقاء غير المتجانسة ، التي يمثلها N. Punctiforme, أنابينا PCC 7120 ، أ. فريبليس ATCC 29،413 و Nodularia CCY9414. تم العثور على حالات قليلة من SDR7 أيضًا في سلالات ضمن فئة أكبر ، وهي البكتيريا الزرقاء الخيطية ، والتي تعد البكتيريا الزرقاء غير المتجانسة جزءًا منها ، وسلالة وحيدة الخلية ، جيم واتسوني، ذات الصلة بالبكتيريا الزرقاء الخيطية ، تمتلك العديد من عناصر SDR1. عناصر SDR الأصلية في intron tRNA من سلالات مختلفة من نوستوك في خمس من ست حالات تطابق تمامًا تسلسل عنصر SDR من N. Punctiforme، وفي أربع من تلك الحالات ، تتطابق التسلسلات المحيطة أيضًا.

الكائنات الحية المستخدمة في المقارنات بين الأنواع لعناصر حقوق السحب الخاصة. شجرة النشوء والتطور إلى اليسار من أسماء الكائنات الحية مشتق من مقارنة تسلسل الرنا الريباسي 16S الزرقاء البكتيريا. تشير الأسهم إلى العقد التي تحدد البكتيريا الزرقاء غير المتجانسة (التركيز الرئيسي لهذا العمل ، الموضح في الجدول) والكتلة الأكثر شمولاً من البكتيريا الزرقاء الخيطية. جميع الجينومات باستثناء تلك الموجودة في لينجبيا و كروكوسفيرا تم تسلسلها بالكامل. تم أخذ التسلسلات من معهد الجينوم المشترك (http://genome.jgi-psf.org/mic_home.html) أو CyanoBase / Kazusa (http://bacteria.kazusa.or.jp/cyano/cyanobase/) أو المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). في الحالة الأخيرة ، يتم إعطاء رقم انضمام GenBank. البلازميد الصغير ، pANS ، من المكورات المتزامنة تم أخذ PCC 7942 أيضًا من GenBank ، الانضمام GI: 247785. ال Nostoc Punctiforme تم إيداع الجينوم مؤخرًا في GenBank (رقم الانضمام <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NC_010628" ، "term_id": "186680550" ، "term_text": "NC_010628" >> NC_010628) ، مع وجود اختلافات طفيفة فقط في التعليق التوضيحي بالنسبة للإصدار المستخدم في هذه الدراسة. يتم عرض معدل حدوث كل من عائلة SDR (SDR1 حتى SDR8) لكل جينوم ، ويمثلها علامة زائد (10 مرات على الأقل) ، أو علامة تلدة (مرة واحدة على الأقل ، ولكن أقل من 10 مرات) ، أو لا شيء (0 تكرارات). الأوصاف المنشورة للجينوم: (أ) بالنيك وآخرون. 2003 ، (ب) روكاب وآخرون. 2003 ، (ج) دوفرسن وآخرون. 2003 ، (د) هولتمان وآخرون. 2005 ، (ه) ناكامورا وآخرون. 2003 ، (F) ناكامورا وآخرون. 2002 ، (جي) كانيكو وآخرون. 2001 ، (ح) ميكس وآخرون. 2001 ، (أنا) كانيكو وآخرون. 1996 ، (ي) بلاتنر وآخرون. 1997).

من المهم بوضوح ما إذا كانت عمليات الإدخال الظاهرة لعناصر حقوق السحب الخاصة من أصل قديم أو حديث. إذا كان الأول ، فيمكن حفظ مواقع الإدراج بين الكائنات الحية ذات الصلة. قمنا بمحاذاة وفحص التسلسلات في جميع المواقع الإعلامية لكل عنصر ، وهو موقع إعلامي محدد على أنه واحد يحدث داخل جين محفوظ (جين له أطباء تقويم في كلا الحيضين قيد الدراسة) أو بين نفس الجينين المحفوظين. تم تلخيص نتائج هذا التحليل في الجدول 5 ومناقشتها أدناه.

الجدول 5.

عناصر حقوق السحب الخاصة في المواقع المحفوظة

الرقم المكتوب بالخط العريض هو عدد الحالات التي تم فيها العثور على عنصر SDR المحدد في كل من الكائنات الحية المشار إليها في نفس الموقع الإعلامي ، كما هو محدد إما داخل الجين المحفوظ أو بين نفس الجينين المحفوظين. تعتبر الجينات محفوظة إذا كانوا أخصائيي تقويم العظام كما هو موضح في الطرق. الرقمان الأول والثاني بين قوسين هما العدد الإجمالي للحالات الإعلامية لعنصر SDR المحدد في الكائن الأول والكائن الثاني ، على التوالي.

SDR2a و SDR4 هما أكثر العناصر شيوعًا بين البكتيريا الزرقاء غير المتجانسة ، مع عشرات الحالات في جميع الجينومات الأربعة المتسلسلة (الشكل 1 التين التكميلي 2 أ ، 4) ، لكنهما مختلفان تمامًا في الدرجة التي توجد بها مواقع الإدراج. المشتركة بين الجينوم. تحدث مثيلات SDR4 بشكل عام في مواقع لا علاقة لها من كائن حي إلى آخر. من بين 108 حالة من SDR4 بوصة N. Punctiforme مفيدة ، ولا يتم مشاركة أي منها أنابينا يحتوي PCC 7120 ومثيلات SDR4 في كل كائن حي على مجموعات مختلفة من التسلسلات المرافقة المميزة. أكثر دلالة ، من بين 69 حدثًا إعلاميًا في أنابينا PCC 7120 ، يتم مشاركة ثلاثة فقط مع سلالة وثيقة الصلة أ. فريبليس. من الواضح أن معظم مواقع SDR4 ظهرت أو اختفت مؤخرًا أكثر من الاختلاف بين نوعي أنابينا.

في المقابل ، غالبًا ما تحدث حالات SDR2a في نفس المواقع من كائن حي إلى آخر ، مما يشير إلى أصل أقدم من تباعد الكائن الحي. من بين 38 حدثًا إعلاميًا في أنابينا PCC 7120 ، 35 يتم مشاركتها مع أ. فريبليس، ويتم أيضًا مشاركة أربعة منها مع N. Punctiforme (على سبيل المثال ، انظر الشكل 6 أ). تلك التي تتم مشاركتها لها نفس تسلسل SDR2a بالضبط 48٪ من الوقت ، أكثر بكثير مما يمكن تفسيره بالصدفة. أ. فريبليس يحتوي على 150٪ من حالات SDR2a أكثر من أنابينا PCC 7120. ليس من الواضح سبب ذلك. صحيح أن هذا فقط أ. فريبليس يحتوي على ترانسبوزيز نشط على ما يبدو لـ Minitransposon المرتبط بـ SDR2a (الشكل ثلاثي الأبعاد) ، ولكن أكثر من نصف مواقع SDR2a الموجودة في أ. فريبليس ولكن ليس في أنابينا من الواضح أن PCC 7120 غير مرتبط بعنصر أو مشتق قابل للتبديل. علاوة على ذلك ، لا يوجد فرق واضح بين عناصر SDR2a المحفوظة وغير المحفوظة في أ. فريبليس فيما يتعلق بأي من الموضعين (كما هو موضح في الجدول 4) أو التسلسلات المرافقة.

عناصر SDR2a في كليهما Anabaenas غالبًا ما يحيط بها تكرار سباعي مشابه لـ STRR2 (Mazel et al. 1990 Meeks et al. 2001) (GACAACT). من الغريب أنه في الحالات القليلة التي يتم فيها حفظ مثيل SDR2a بين أنابينا و نوستوك، ال أنابينا عنصر محاط بتسلسل STRR2 ، النموذجي لـ أنابينا SDR2a ، بينما نوستوك عنصر محاط بتسلسل STRR8 ، النموذجي لـ نوستوك عناصر SDR2a (انظر الشكل 6 ج). إذا كانت عناصر SDR2a في هذه المواقع ، كما هو مرجح ، تشترك في أصل مشترك ، فيجب أن تكون التسلسلات المرافقة قد تغيرت بطريقة ما لتتوافق مع ميول الجينوم ككل.

تتبع مثيلات SDR1 و SDR4 / SDR6 نموذج SDR4 ، ولا تكمن في المواضع المحفوظة في الكائنات الحية التي توجد بها. نادرًا ما تكون مثيلات SDR1 محاطة بنفس التسلسلات الموجودة بجوار عناصر SDR1 من نوستوك. ثمانية عناصر SDR1 من Nodularia وثمانية من كروكوسفيرا تعتبر استثنائية من حيث أن تسلسلاتها المرافقة تتطابق مع التكرارات السباعية التي تم العثور عليها بجوار العنصر المماثل SDR1.7 من نوستوك. تم العثور على مثيلات عناصر SDR1 المتداخلة في كليهما Nodularia و أ. فريبليس. وينطبق هذا أيضًا على SDR4 / SDR6.

يتبع SDR3 نموذج SDR2a. جميع الأمثلة الإعلامية الخمس لـ SDR3 بتنسيق أنابينا يتم مشاركة PCC 7120 مع ملفات أ. فريبليس، بينما لا يتم مشاركة أي منها مع نوستوك. تُحاط جميع التسلسلات تقريبًا ببقايا يمكن التعرف عليها على الأقل من نفس التكرار السباعي الذي يحيط بـ SDR3 في نوستوك. يبدو أن إدخاله يسبق تباعد الاثنين Anabaenas. يبدو أن الجدول 5 يشير إلى الأصل القديم لإدخالات SDR5 أيضًا. في الواقع ، تم العثور على إدخال واحد محفوظًا في تقويم العظام لـ NpF5954 بين جميع البكتيريا الزرقاء غير المتجانسة الأربعة (الشكل التكميلي 12).

يتم تمثيل SDR2b بمثيل واحد فقط في كلا سلالتي أنابينا، في موقع محفوظ بين الاثنين ، ولكن ليس مع نوستوك. لا أحد من الحالات القليلة من SDR7 و SDR8 في البكتيريا الزرقاء بجانب نوستوك كانوا في مناصب محفوظة.

أطوال الوحدات والتفضيلات المستهدفة لعناصر حقوق السحب الخاصة

قمنا بمقارنة المواقع المحفوظة التي تحتوي على عناصر SDR في جينوم واحد ولكن ليس في جينوم آخر ، على أمل تحديد حدودها واستنتاج ميزات التسلسل التي تجذب عمليات إدخال جديدة. تم العثور على سبعة من هذه الإدخالات من SDR4 داخل المناطق المحفوظة ، كما هو محدد سابقًا (الشكل 6F التكميلي الشكل 12). في خمس من هذه الحالات ، كان الإدراج متزامنًا مع الطول المقترح لعنصر حقوق السحب الخاصة. تكون المحاذاة المرصودة أكثر اتساقًا مع عمليات الإدخال بدلاً من الحذف ، كما هو الحال في جميع الحالات الثلاث حيث تم العثور على إدخال واضح لـ SDR4 داخل جين مع أخصائي تقويم العظام في البكتيريا الزرقاء الأخرى ، تظهر محاذاة أخصائيي تقويم العظام فجوات حيث يجب أن يظهر SDR4. في جميع الحالات ، كانت التسلسلات المحيطة بإدخال SDR4 متسقة (ثلاث هويات على الأقل) مع التسلسل المستهدف 5-nt ، CG | AAG ، المستخلص من تحليل العناصر المتداخلة (انظر أعلاه).

من بين 12 حالة إعلامية وقابلة للتفسير لعناصر SDR1 (الشكل التكميلي 12) ، يمكن تفسير معظمها عن طريق إعادة التركيب ، باستخدام التكرارات الهبتامريكية المرافقة (على سبيل المثال ، الشكل 6 أ) ، ولكن يبدو أن أربعة منها عبارة عن إدخالات لـ SDR1 أو نسخة متداخلة من SDR1 (على سبيل المثال. ، الشكل 6 ب). في كل هذه الحالات ، تكون وحدة الإدراج الظاهرة 24 nt (أو مضاعفات 24 في حالة العناصر المتداخلة). لا يوجد تسلسل الهدف واضح.

يُظهر SDR5 تفضيلًا أقوى للتسلسل المستهدف. من بين 31 إدخالًا لـ SDR5 في المناطق المحفوظة من الجينات مع أخصائي تقويم العظام في كائنين من الكائنات الحية التي فحصناها ، أظهر 29 إدخالًا بمقدار 21 نانومتر ، وهو الطول المقترح لـ SDR5 (الشكل التكميلي 6G الشكل 12). من اللافت للنظر أن الموقع المستهدف الواضح لـ SDR5 هو GCG | ATCGC ، وهو تسلسل (يسمى HIP1) يتم تمثيله بشكل كبير في العديد من البكتيريا الزرقاء (Robinson et al. 1995) وربما يشارك في إعادة التركيب (Robinson et al. 1997). كما هو الحال مع SDR4 ، يجب تفسير الأحداث التي أدت إلى وجود أو عدم وجود SDR5 على أنها عمليات إدخال ، وليس عمليات حذف ، لأن تقويم الجينات التي تحمل SDR5 في البكتيريا الزرقاء غير المتجانسة تفتقر إلى الملحق. من بين 67 حالة لعناصر SDR5 في N. Punctiforme مع نسخة رقم ثلاثة أو أكبر ، 82 ٪ تقع داخل مواقع HIP1 بين الموضعين الثالث والرابع ، وجميع العناصر المتبقية محاطة بموقع يشبه HIP1 (الشكل 1 التكميلي الشكل 5). بصرف النظر عن التفضيل شبه المطلق لـ A و T والموضعين 3 و 4 ، على التوالي ، فإن الانحرافات عن تسلسل HIP1 المتعارف عليه تكون محتملة بشكل متساوٍ في جميع المواضع (البيانات غير معروضة). ولذلك ، فإن SDR5 له تفضيل شديد لمواقع HIP1 ، وهو موقع لا يقل قوة مع وجود حالات في البكتيريا الزرقاء غير المتجانسة الأخرى. وهذا يكفي لتفسير عدم إدراج SDR5 في عناصر SDR الأخرى ، كما هو مذكور أعلاه ، نظرًا لأن مواقع HIP1 لا تظهر في عناصر SDR الأخرى.

يقدم SDR2a صورة مختلفة تمامًا. هناك 64 حالة أ. فريبليس لديه نسخة من SDR2a بين جينين محفوظين ، ولكن أنابينا PCC 7120 ليس في الموضع المقابل (لا تظهر بيانات الشكل التكميلي 12). تم فحص محاذاة هذه المناطق بعناية ، ولم يتم العثور على مثيل يظهر دليلًا واضحًا على إدخال جديد. بدلاً من ذلك ، ظهرت 35 ٪ من الحالات بوساطة تبديل الترانسبوزون الصغير الذي يحتوي على SDR2a.5 (الشكل التكميلي ثلاثي الأبعاد الشكل 2 أ). يبدو أن ما مجموعه 49 ٪ قد نشأ من خلال إعادة التركيب في التسلسلات التي تحيط بعنصر SDR & # x02014 باستخدام الاختلافات على AACAACT المتكرر بالترادف ، بما في ذلك 10 أحداث يبدو أنها ازدواجية لـ SDR2a على مسافة قصيرة من المثال الأول (الشكل 6 د). من بين الحالات المتبقية ، كان لدى 6 ٪ حالات ترادفية من AACAACT تحيط بعنصر SDRa ولكن لا يوجد heptamer واضح في PCC 7120 ، ولا يمكن تفسير الباقي ، بشكل عام لأن المنطقة الجينية قد تباعدت بشكل لا يمكن التعرف عليه. لا يوجد في أي حال من الأحوال دليل واضح على الإدراج إلا من خلال عمليات معروفة.

لا يوجد سوى عدد قليل من حالات SDR3 داخل نوستوك الجينات في المناطق المحفوظة بشكل كافٍ للسماح بالمقارنة مع الجينات المتعامدة في أنابينا أو العكس (الشكل التكميلي 6E الشكل 12). يمكن تفسير جميع الحالات التي يمكن تفسيرها حيث كان SDR3 موجودًا في جينوم واحد ولكن ليس الآخر من خلال إعادة التركيب بين مناطق التكرارات الترادفية. لم نعثر على حالات SDR2b أو SDR6 أو SDR7 أو SDR8 داخل المناطق المحفوظة بشكل كافٍ للسماح بمقارنة الموقع بين الجينومات.


شكر وتقدير

نشكر K. Rajashankar و S. Banerjee في مجموعة Northeastern Collaborative Access Team للمساعدة أثناء جمع البيانات و G.L Conn و M.A Schureck على المناقشات المفيدة طوال المشروع والقراءة النقدية للمخطوطة. يعتمد هذا العمل على بحث تم إجراؤه في مصدر الفوتون المتقدم في خطوط حزم فريق الوصول التعاوني في جامعة نورث إيسترن ، ومنح المعاهد الوطنية للصحة RR-15301 من NCRR ، وفي خط حزم الأشعة SER-CAT. تم دعم استخدام مصدر الفوتون المتقدم ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم يعمل لصالح مكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة الأمريكية بواسطة مختبر أرغون الوطني ، من قبل وزارة الطاقة الأمريكية بموجب العقد DE-AC02-06CH11357.

* تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية جائزة CAREER MCB 0953714 (إلى C.M. D.).

تحتوي هذه المقالة على جدول S1 ومراجع إضافية.


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


Z-DNA البيولوجيا الجديدة: البعد الثالث لعلاجات السرطان

يعد التركيب الفريد للحلزون المزدوج للحمض النووي أحد أكثر الصور شهرة في علم الأحياء. يأخذ معظم الحمض النووي في خلايانا شكل B-DNA. يُعرف الحمض النووي B المألوف أيضًا باسم الحمض النووي الأيمن لأن خيوط الحمض النووي تتجه إلى اليمين. اكتشف واطسون وكريك البنية الحلزونية المزدوجة لـ B-DNA في عام 1953. ولكن الأقل شهرة هو نوع مختلف من الحمض النووي: الحمض النووي Z-DNA الأيسر. تم اكتشاف Z-DNA بالصدفة ، وحتى وقت قريب ، ظل دوره - أو حتى ما إذا كان له أي غرض على الإطلاق - لغزا. Z-DNA ليس صورة معكوسة لـ B-DNA ، ولكن له شكله الفريد ، وهي ميزة تستفيد منها الطبيعة.

كشف سر Z-DNA
جاءت خطوة مهمة نحو فك شفرة دور هذا الشكل غير المعتاد من الحمض النووي من إنزيم تحرير الحمض النووي الريبي يسمى ADAR. الإنزيمات هي بروتينات حيوية تسرع التفاعلات الكيميائية في الخلية من خلال جزء من بنيتها يسمى المجال التحفيزي. بدون الإنزيمات ، قد يستغرق رد فعل واحد ساعات حتى يكتمل.

عندما تصنع الخلية البروتينات ، يتكون الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي) من جين - قطعة من الحمض النووي. يحمل الحمض النووي الريبي رمز البروتين المعين الذي سيتم تصنيعه. في الأساس ، يمتلك إنزيم ADAR القدرة على إعادة تشفير رسائل RNA التي تصنعها الجينات قبل ترجمة معلومات RNA إلى تسلسل البروتين. تُعرف إعادة الترميز التي يقوم بها ADAR باسم تحرير RNA. في هذه العملية ، يقوم ADAR بتغيير إحدى لبنات بناء الحمض النووي الريبي إلى شيء آخر - مما يعني أن الحمض النووي الريبي يحمل الآن معلومات مختلفة. ثم يوجه الحمض النووي الريبي المعدل إنتاج البروتين الذي يعمل بشكل مختلف عن النسخة غير المعدلة. وبالتالي ، فإن تحرير الحمض النووي الريبي يسمح لجين واحد بإنتاج عدد من البروتينات المختلفة ، ولكل منها خصائص فريدة.

HandMadeFont.com/Shutterstock.com

ADAR والسرطان
بشكل ملحوظ ، يمكن للخلايا السرطانية استخدام تحرير ADAR و RNA لصنع بروتينات تمنحها ميزة البقاء على قيد الحياة. في أحيان أخرى ، يمكن للخلايا السرطانية استخدام تحرير ADAR و RNA لتجنب الإنهاء ، خاصةً عندما تنتج كميات مفرطة من الحمض النووي الريبي من الجينات. أجهزة استشعار مدمجة داخل إشارة الخلية عند حدوث مثل هذه المشكلة. يؤدي إطلاق الإنذار إلى رد فعل مضاد سريع يمكن أن يتسبب في موت الخلية السرطانية ، إما لأنها تغلق آلية نمو الخلية أو لأنها تحفز جهاز المناعة على قتل الخلية. تشبه الاستجابة المناعية التي تولدها الخلايا السرطانية غير الطبيعية تلك التي تنتجها الفيروسات ، والتي تنتج أيضًا كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي الخاص بها من أجل التكاثر.

للهروب من الموت ، يجب أن تجد الخلايا السرطانية طريقة لإيقاف الحمض النووي الريبي الزائد الذي تخلقه من إثارة استجابة مناعية. تقوم الخلايا السرطانية بذلك عن طريق تجنيد ADAR لأغراضها الخاصة. تعمل قدرة تحرير RNA في ADAR على إزالة الكثير من RNA الذي ينبه مستشعرات الإنذار بالخلية. في الواقع ، لا يمكن للعديد من الخلايا السرطانية البقاء على قيد الحياة إلا من خلال الإفراط في إنتاج ADAR نفسها. إذا لم يعد ADAR قادرًا على العمل ، فإنهم يموتون بسبب خللهم الوظيفي.

تغير Flipons كيفية صنع رسائل RNA ، وتغير الكودونات كيفية صنع البروتينات.

غالبًا ما ينشأ الحمض النووي الريبي الزائد في الخلايا السرطانية من أجزاء من الجينوم لا تصنع عادةً الحمض النووي الريبي. العديد من سلاسل الحمض النووي الريبي هذه لا ترمز للبروتين وغالبًا ما تنشأ من مناطق الحمض النووي حيث توجد تسلسلات معينة تتكرر عدة مرات. تُعرف فئة واحدة شائعة من هذه التسلسلات المتكررة باسم تكرارات ALU. إجمالاً ، تشكل عمليات تكرار ALU حوالي 11٪ من الجينوم البشري. يخضعون لتحرير مكثف بواسطة ADAR.

عادة ، الحمض النووي الريبي هو واحد تقطعت بهم السبل. ومع ذلك ، عندما يكون تكراران ALU قريبين من بعضهما البعض ، ولكن في اتجاهات معاكسة ، فإنهما يشكلان بشكل طبيعي RNA مزدوج الشريطة. عندما يحدث هذا ، يتم وصف نسختين من ALU على أنهما تكرار معكوس. عندما يتم نسخ تكرار معكوس إلى RNA ، فإن نسختين ALU تطوىان على بعضهما البعض لتكوين RNA مزدوج الشريطة. يقوم إنزيم ADAR بتحرير الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة فقط.

تصنع الخلايا السرطانية ADAR أكثر من الخلايا الطبيعية لمنع تكرار الحمض النووي الريبي المعكوس من تحفيز استجابة الإنترفيرون. هذا يسمح للخلايا السرطانية بتجنب الاستجابة المناعية والبقاء على قيد الحياة. لذلك ، فإن تثبيط ADAR هو وسيلة فعالة للغاية لمنع النمو غير المنضبط للخلايا السرطانية. على وجه التحديد ، يمنع منع ارتباط Z-DNA الخلايا السرطانية من استخدام ADAR لإيقاف استجابة الإنترفيرون. أثبت حل لغز تكوين Z-DNA ووظيفته أن له قيمة عملية محتملة هائلة في البحث عن استراتيجيات جديدة لمكافحة السرطان.

السر الذي فتحه Z-DNA: Flipons
في InsideOutBio Inc. ، قطع الدكتور آلان هربرت خطوات كبيرة في إطلاق إمكانات Z-DNA في علاج السرطان. حدد الدكتور هربرت لأول مرة ADAR كبروتين رابط لـ Z-DNA. ثم تمكن من إظهار كيف أن ارتباط Z-DNA بواسطة ADAR يوقف الاستجابة المناعية. قام بتحليل العائلات التي لديها تعديلات في مجال ربط Z-DNA التي تمنع الارتباط بـ Z-DNA. لم يعد بإمكان الأفراد المتأثرين إيقاف إنتاج الإنترفيرون ، وهي خطوة مهمة في تنظيم الاستجابات المناعية. أجهزة المناعة لديهم تعمل دائمًا ، مما يؤدي إلى الإصابة بأمراض التهابية.

اقترح الدكتور هربرت مصطلح "flipons" لوصف التسلسلات في الجينوم البشري التي يمكن أن تتبنى إما مطابقة الحمض النووي لليد اليمنى أو اليسرى في ظل الظروف العادية. إلى حد كبير ، تتمتع flipons بالقدرة على تغيير ناتج RNA من الجين. في بعض الحالات ، قد تعمل flipons كمفتاح "تشغيل / إيقاف" للجين - "تشغيل" بتشكيل واحد ، و "إيقاف" مع الآخر. في حالات أخرى ، قد يؤدي الانقلاب إلى تعديلات مختلفة في رسالة الحمض النووي الريبي ، مما يتسبب في إنتاج متغيرات بروتينية مختلفة. بشكل حاسم ، كل هذا يحدث دون أي تغيير في تسلسل الحمض النووي. يتيح هذا الانقلاب استجابة سريعة من الخلايا للتحديات البيئية المختلفة.

تستخدم الخلايا السرطانية تحرير ADAR و RNA لصنع بروتينات تمنحها ميزة البقاء على قيد الحياة.

تثير هذه القدرات بشكل طبيعي السؤال: ما الذي يتحكم في ما إذا كانت flipons هي اليد اليمنى أو اليسرى؟ يتطلب الانقلاب من الحمض النووي من اليمين إلى اليسار طاقة. أحد المصادر المحتملة لهذه الطاقة هو تلك التي تولدها الإنزيمات التي تنسخ الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي. عندما يقوم الجين بصنع الحمض النووي الريبي بشكل نشط ، فمن المرجح أن يتم دفع flipons إلى التشكل الأيسر. يُفضل التقليب في مناطق الجينات (المعروفة باسم المحفزات) حيث يبدأ نسخ الحمض النووي الريبي. في الواقع ، تكون تسلسلات flipon أكثر شيوعًا في المحفزات ، مما يعني أنها غالبًا ما توجد في مناطق يمكنها فيها تنظيم نشاط الجينات.

ماذا يمكن أن تفعل flipons؟
في بعض الأحيان ، يتلف الحمض النووي (على سبيل المثال ، من خلال التعرض للإشعاع أو المواد التي تسبب الطفرات). في هذه الظروف ، وبسبب الطريقة التي يتم بها تعديل قواعد الحمض النووي ، هناك حاجة إلى طاقة أقل لدفع flipons إلى Z-DNA. هذا يسمح لل flipons بالعمل كمستشعرات تلف الحمض النووي. "الانقلاب" يمكّن الخلية من الاستجابة للتحدي وإصلاح الضرر. يقوم flipon بذلك عن طريق تغيير الحمض النووي الريبي الذي تصنعه الخلية ، مما يؤدي بشكل فعال إلى تشغيل مجموعة مختلفة من البرامج الجينية.

Flipons ديناميكية للغاية. يقومون باستمرار بتبديل أجزاء معينة من الجينوم وإيقاف تشغيلها استجابة للتغيرات في البيئة. باستخدام flipons لتغيير قراءة RNA ، يمكن للحمض النووي تخزين مجموعات مختلفة من المعلومات باستخدام نفس تسلسل القاعدة الجينومية.

كما هو الحال مع أي اختلاف جيني آخر ، فإن flipons عرضة للتغيير التطوري. قد يتم إدخالها أو حذفها أو فقد قدرتها على تبني تشابه Z-DNA. نتيجة لذلك ، تظهر برامج وراثية جديدة ويعمل البعض الآخر بشكل مختلف. تلك التي توفر ميزة تطورية تنتقل إلى الجيل التالي. تحتوي تكرارات ALU على تسلسلات flipon التي تشكل Z-DNA. إنها تنقلب في شكل Z-DNA كلما تم تكوين الحمض النووي الريبي من عنصر تكرار ALU. يسمح Z-DNA بتوطين ADAR للتكرارات من خلال جزء معين من الإنزيم ، يسمى مجال Zα. عندما يتم نسخ ALU flipons إلى مواقع أخرى في الجينوم ، فإنها تغير RNAs المصنوعة هناك. تخلق هذه العملية برامج وراثية جديدة لكي يعمل الانتقاء الطبيعي عليها.

في بعض الحالات ، قد تكون flipons بمثابة تشغيل / إيقاف
التبديل للجين.

تسبب طفرات ADAR أمراضًا وراثية وراثية
كان التحدي الأساسي في حل لغز Z-DNA هو إظهار أن لها وظيفة بيولوجية. ثبت أن القيام بذلك أمر صعب ، لأن تكوين Z-DNA ديناميكي للغاية - يمكن أن يحدث ، على سبيل المثال ، بسبب الظروف المستخدمة في تجربة معينة. هذا لا يعني بالضرورة أن Z-DNA تتشكل بهذه الطريقة في الطبيعة.

طريقة واحدة لمعالجة هذه المشكلة هي مراقبة الجينات البشرية. في هذه الدراسات ، لا يوجد تدخل تجريبي ، لذلك يمكن افتراض أن أي Z-DNA قد تشكل بشكل طبيعي. ومع ذلك ، فإن التحدي يكمن في إيجاد نمط ظاهري (أو خاصية يمكن ملاحظتها) توفر المعلومات الضرورية. وجد الدكتور هربرت حلاً في شكل طفرات الحمض النووي التي تعطل مجال Zα من ADAR. أظهر تحليل الدكتور هربرت أن الطفرات التي منعت ADAR من الارتباط بـ Z-DNA مسؤولة عن مرضين بشريين موروثين وراثيًا: متلازمة إيكاردي جوتيير (AGS) والنخر الخطي الثنائي / خلل التوتر العضلي (BSD). ترتبط هذه الشروط ارتباطًا وثيقًا: كلاهما يسبب قصورًا في تنظيم الإنترفيرون. يؤثر AGS على الدماغ والجلد ، مما يسبب مشاكل فكرية وجسدية كبيرة ، بينما يؤثر BSD على الحركة والرؤية. توفر هذه الظروف الوراثية المنهكة دليلاً لا لبس فيه على الدور البيولوجي لـ Z-DNA.

Flipons ديناميكية للغاية. يقومون باستمرار بتبديل أجزاء معينة من الجينوم وإيقاف تشغيلها استجابة للتغيرات في البيئة.

استهداف ADAR في السرطان
تم العثور على الإفراط في التعبير عن ADAR في العديد من أنواع السرطان ، بما في ذلك سرطان الثدي والرئة. في زراعة الخلايا ، يعتمد أكثر من 40٪ من السرطانات على ADAR للبقاء على قيد الحياة. في الفئران ، هناك بعض الأدلة التجريبية على أن التخلص من ADAR يحسن الاستجابة للعلاج المناعي ، خاصة عندما يقترن بمثبطات نقاط التفتيش (الأدوية التي تساعد الجهاز المناعي على محاربة السرطان). يعد استهداف المسارات التي تنظمها flipons ، بدلاً من مجرد الطفرات الجينية في الحمض النووي ، طريقة جديدة تمامًا لعلاج السرطان.

هناك علاجات أخرى قيد التطوير تستخدم تحرير الحمض النووي الريبي (RNA) لعلاج الأمراض الوراثية. هنا ، يعيد ADAR ترميز RNAs التي لها طفرات تؤدي إلى المرض. الجهود جارية لتحسين كفاءة التحرير من خلال استهداف مجالات Zα في ADAR. يتجنب النهج التغييرات الدائمة في الحمض النووي التي يتم إجراؤها باستخدام إنزيمات مثل CRISPR مع هذه الإنزيمات ، ويمكن أن يؤدي التغيير غير المقصود إلى نتائج سلبية.

مستقبل مثير
يُظهر الاكتشاف الأخير للـ flipons أن حمضنا النووي يحمل العديد من الأسرار التي يمكن أن تستغرق الكثير من العمل لاكتشافها. يُظهر لنا بحث الدكتور هربرت الثاقب حول Z-DNA - وهو شكل من أشكال الحمض النووي الذي لم يكن مفهومًا حتى وقت قريب - مقدار ما لا يزال يتعين علينا تعلمه عن حمضنا النووي. من الواضح أن التحول من B- إلى Z-DNA الذي ينتج عنه flipons يمكن أن يكون له تأثير كبير على الطريقة التي تستجيب بها خلايانا لبيئتها ولأمراض مثل السرطان. يوفر هذا الفهم الجديد الأمل في علاجات فردية جديدة وهادفة في الطب الحديث ، مما يجعلنا نقترب خطوة واحدة من الطب الشخصي الحقيقي.

استجابة شخصية

ما الاتجاه الذي يجب أن يتخذه البحث المستقبلي في flipons

مع التقدم في الفحص المجهري ، سنكون قادرين على رؤية flipons يغير التشكل في الوقت الفعلي. ستمكننا هذه الدراسات من فهم أسباب تقلبها والعواقب التي تلي ذلك. إن تطوير جزيئات صغيرة محددة تمنع ADAR من الارتباط بالتشكل Z سيزيد أيضًا من فهم العمليات البيولوجية التي تنظمها flipons. مجتمعة ، ستفتح المقاربتان المجهرية والجزيئية الصغيرة نافذة جديدة في بيولوجيا الخلايا وتوفر رؤى جديدة حول كيفية تطور الخلايا ، والمسارات التي تؤدي إلى المرض وكيف تتطور الحياة من الفوضى.


Akgün، E.، Zahn، J.، Baumes، S.، Brown، G.، Liang، F.، Romanienko، P.J.، Lewis، S. and Jasin، M. 1997. تحليل Palindrome وإعادة التركيب في خط جرثومة الثدييات. مول. زنزانة. بيول. 17: 5559-5570.

أنجيل ، إس إم. و Baulcombe، D.C. 1997. إسكات الجينات المتسق في النباتات المعدلة وراثيا التي تعبر عن فيروس البطاطس المتكرر X RNA. EMBO J. 16: 3675–3684.

أسعد ، ف.ف. ، تاكر ، ك. and Signer، E.R. 1993. إسكات الجينات المتكررة الوراثية (RIGS) في أرابيدوبسيس. مصنع مول. بيول. 22: 1067-1085.

Baulcombe، DC and English ، J.J. 1996. الاقتران خارج الرحم من الحمض النووي المتماثل وإسكات ما بعد النسخ في النباتات المعدلة وراثيا. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 7: 173-180.

بندر ، ج. 1998. مثيلة السيتوزين للتسلسلات المتكررة في حقيقيات النوى: دور اقتران الحمض النووي. اتجاهات Biochem. علوم. 23: 252-256.

بندر ، جيه وفينك ، ج. 1995. تم الكشف عن التحكم الوراثي فوق الجيني لعائلة الجينات الذاتية من خلال متحولة فلورية زرقاء جديدة أرابيدوبسيس. الخلية 83: 725-734.

بيستور ، T.H. 1987. خصوصية تسلسل ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي المعتمد على الالتواء الفائق للثدييات. نوكل. الدقة الأحماض. 15: 3835–3843.

بيستور ، T.H. and Coxon، A. 1993. مثيلة السيتوزين: إيجابيات وسلبيات مثيلة الحمض النووي. بالعملة. بيول. 3: 384-386.

Bi، X. and Liu، LF 1996. إعادة ترتيب الحمض النووي بوساطة التكرارات المقلوبة. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 93: 819-823.

Bird، A.P. and Wolffe، A.P. 1999. القمع الناجم عن المثيلة: الأحزمة والأقواس والكروماتين. الخلية 99: 451-454.

Blaho، AJ.، Larson، J.E.، McLean، M.J. and Wells، R.D. 1988. تراكيب ثانوية متعددة للحمض النووي في إدخالات متكررة مقلوبة بشكل مثالي في البلازميدات. J. بيول. تشيم. 263: 14446-14455.

بولمان ، ج. ، كاربنتر ، ر. وكوين ، إ. 1991. التفاعلات الأليلية في نيفيا موضع زهرة الخطم نبات. الخلية النباتية 3: 1327-1336.

كريستو ، ب. 1992. التحول الجيني لنباتات المحاصيل باستخدام القصف الدقيق. مصنع ياء 2: 275-281.

Cluster، P.، O'Dell، M.، Metzlaff، M. and Flavell، R.B. 1996. تفاصيل التنظيم الهيكلي لـ T-DNA من عامل وراثي البطونية السكان يظهرون قمعًا مشتركًا. مصنع مول. بيول. 32: 1197 - 1203.

كوين ، إ. و Carpenter ، R. 1988. أليل شبه مهيمن ، نيف-525 ، أعمال في العابرة لمنع التعبير عن متماثله من النوع البري في Antirrhinum majus. EMBO J. 7: 877-883.

Cogoni، C. and Macino، G. 1999. إسكات الجين المعتمد على التنادد في النباتات والفطريات: عدد من الاختلافات حول نفس الموضوع. بالعملة. رأي. ميكروبيول. 2: 657-662.

Collick، A.، Drew، J.، Penberth، J.، Bois، P.، Luckett، J.، Scaerou، F.، Jeffreys، A. and Reik، W. 1996. عدم استقرار التكرارات المقلوبة الطويلة داخل الجينات المحورة للفأر. EMBO J. 15: 1163-1171.

Collins، J. 1980. عدم استقرار الحمض النووي المتناوب في الإشريكية القولونية. كولد سبرينج هاربور سيمب. كمية. بيول. 45: 409-416.

Collins، J.، Volkaert، G. and Nevers، P. 1982. استئصال دقيق وشبه دقيق للتكرارات المقلوبة المتماثلة لسمات Tn5 المشتركة لـ recAأحداث الحذف المستقلة في الإشريكية القولونية. جين 19: 139-146.

Colot، V.، Maloisel، L. and Rossignol، J.L. 1996. الانتقال بين الصبغيات للحالات اللاجينية في أسكوبولس: يرتبط نقل مثيلة الحمض النووي ميكانيكيًا بإعادة التركيب المتماثل. الخلية 86: 855-864.

DasGupta ، U. ، Weston-Hafer ، K. and Berg ، D.E. 1987. التحكم في تسلسل الحمض النووي المحلي لتشكيل الحذف في الإشريكية القولونية البلازميد pBR322. علم الوراثة 115: 41-49.

Dehio، C. and Schell، J. 1994. تحديد المواقع الوراثية النباتية المشاركة في آلية ما بعد النسخ لإسكات الجينات المعدلة القابلة للانعكاس. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 91: 5538-5542.

De Neve، M.، De Buck، S.، Jacobs، A.، Van Montagu، M. and Depicker، A. 1997. تشير أنماط تكامل T-DNA في الخلايا النباتية المحولة معًا إلى أن تكرارات T-DNA تنشأ من التكامل المشترك بين فصل T-DNAs. مصنع ياء 11: 15-29.

Depicker ، A. ، Ingelbrecht ، I. ، Van Houdt ، H. ، De Loose ، M. and Van Montagu ، M. 1996. مراسل ما بعد النسخ ، إسكات التحوير الجيني في التبغ المعدّل وراثيًا. في: D. Grierson، GW. ليسيت وج. تاكر جي إيه (محرران) آليات وتطبيقات إسكات الجينات ، مطبعة جامعة نوتنغهام ، نوتنغهام ، المملكة المتحدة ، الصفحات 71-84.

دورر ، د. 1997. هل تشكل مصفوفات الجينات المعدلة كروماتين متغاير في الفقاريات؟ المعدلة وراثيا. الدقة. 6: 3-10.

دورر ، د. and Henikoff، S. 1994. التوسعات في تكرار الجينات المحورة تسبب تكوين الكروماتين المغاير وإسكات الجين في ذبابة الفاكهة. الخلية 77: 993-1002.

دورر ، د. and Henikoff، S. 1997. تتفاعل مصفوفات تكرار التحوير الجيني مع الهيتروكروماتين البعيدة وتسبب إسكات في بلدان رابطة الدول المستقلة والعابرة. علم الوراثة 147: 1181-1190.

إرليش ، س. 1989. إعادة التركيب غير الشرعي في البكتيريا. في: D.E. بيرج وم. Howe (Eds.) Mobile DNA، American Society for Microbiology، Washington، D.C.، pp.799–832.

Elmayan، T. and Vaucheret، H. 1996. يخضع التحوير الموجه بقوة 35S إلى إسكات ما بعد النسخ في جميع محولات التبغ بغض النظر عن رقم النسخة. مصنع J. 9: 787-797.

English، J.J.، Mueller، E. and Baulcombe، D.C. 1996. قمع تراكم الفيروس في النباتات المحورة جينيا التي تظهر إسكات الجينات النووية. الخلية النباتية 8: 179-188.

English، J.J.، Davenport، G.F.، Elmayan، T.، Vaucheret، H. and Baulcombe، DC 1997. عبر-تعطيل. مصنع J.12: 597-603.

فوجيرون. G. ، Rhounim ، L. and Rossignol ، J.-L. 1990. كيف تحسب الخلية عدد النسخ المنتبذة للجين في عملية التعطيل السابق للحيوية التي تعمل في أسكوبولوس إمرسوس. علم الوراثة 135: 357–366.

النار ، أ. 1999. إسكات الجينات التي تسببها الحمض النووي الريبي. اتجاهات الجينات. 15: 358–363.

Fire، A.، Xu، S.Q.، Montgomery، M.K.، Kostas، SA، Driver، S.E. وميلو ، سي. 1998. تدخل وراثي قوي ومحدد بواسطة RNA مزدوج الشريطة في أنواع معينة انيقة. Nature 391: 806-811.

جاريك ، دي ، فيرينج ، إس ، مارتن ، دي. and Whitelaw، E. 1998. إسكات الجينات الذي يسببه التكرار في الثدييات. طبيعة الجينات. 18: 56-59.

Goodwin، J.، Chapman، K.، Swaney، S.، Parks، T.D.، Wernsman، E.A. ودوجيرتي ، دبليو جي 1996. التشريح الجيني والكيميائي الحيوي لمقاومة الفيروسات المعدلة وراثيًا بواسطة الحمض النووي الريبي. الخلية النباتية 8: 95-105.

Gordenin، D.A.، Lobachev، K.S.، Degtyareva، N.P.، Malkova، A.L.، Perkins، E. and Resnick، MA 1993. DNA يتكرر: مصدر عدم استقرار جينومي حقيقي النواة. مول. زنزانة. بيول. 13: 5315-5322.

جويون ، سي ، نوغيرا ​​، تي آي في. and Faugeron، G. 1994. استمرار مثيلة السيتوزين في أسكوبولوس إمرسوس يعني نوعًا جديدًا من ميثيلاز الصيانة. جيه مول. بيول. 240: 42-51.

هاملتون ، A.J. ، براون ، S. ، Han ، Y.H. ، Ishizuka ، M. ، Lowe ، A. ، Solis ، A.G.A. and Grierson، D. 1998. يتسبب التحول الجيني مع الحمض النووي المتكرر في قمع عالي التردد بعد النسخ للتعبير الجيني ACCoxidase في الطماطم. مصنع J. 15: 737-746.

Hanke، JH، Hambor، J.E. and Kavathas، P. 1995. Repetitive ألو تشكل العناصر بنية صليبية الشكل تنظم وظيفة المحسن الخاص بخلايا CD8a T البشرية. جيه مول. بيول. 246: 63-73.

Henikoff، S. and Comai، L. 1998. تأثيرات الاستشعار عبر الاستشعار: صعود وهبوط التواجد معًا. الخلية 93: 329-332.

Hobbs، S.L.A.، Kpodar، P. and Delong، C.M.O. 1990. تأثير رقم نسخة T-DNA وموضعها ومثيلتها على التعبير الجيني المراسل في محولات التبغ. مصنع مول. بيول. 15: 851–864.

Hobbs، S.L.A.، Warkentin، T.D. and Delong، C.M.O. 1993. يمكن أن يرتبط رقم النسخة المعدلة وراثيًا بشكل إيجابي أو سلبي بتعبير الجينات المحورة. مصنع مول. بيول. 21: 17-26.

Hollick ، ​​JB ، Dorweiler ، J.E. and Chandler ، V.L. 1997. باراموتيشن والتفاعلات الأليلية ذات الصلة. اتجاهات الجينات. 13: 302-308.

Ingelbrecht، I. 1993. تحليل 30 إشارة معالجة ودراسة إسكات الجينات المحورة في نيكوتيانا تاباكوم. دكتوراه. أطروحة ، جامعة جنت ، جنت ، بلجيكا.

Jakowitsch ، J. ، Papp ، I. ، Moscone ، E.A. ، vanderWinden ، J. ، Matzke ، M. and Matzke ، A.J.M. 1999. التوصيف الجزيئي والخلوي الخلوي لموضع الجينات المحورة الذي يؤدي إلى إسكات وميثيل المحفزات المتجانسة في الترانس. مصنع J. 17: 131-140.

جدلوه ، ج.أ. ، ستوكس ، T.L. وريتشاردز ، إي. 1999. تتطلب صيانة المثيلة الجينومية وجود بروتين شبيه بـ SWI2 / SNF2. طبيعة الجينات. 22: 94-96.

جونز ، أل ، توماس ، سي إل ومول ، إيه. 1998. مثيلة De novo والقمع المشترك الناجم عن فيروس RNA للنباتات المتكاثر سيتوبلازمي. EMBO J. 17: 6385-6393.

Jorgensen ، R. ، Snyder ، C. and Jones ، J.D.G. 1987. يتم تنظيم T-DNA بشكل أساسي في هياكل متكررة مقلوبة في النباتات المحولة مع أغروباكتريوم توميفاسيانز مشتقات C58. مول. الجنرال جينيه. 207: 471-477.

Jorgensen، R.، Cluster، P.، Que، Q.، English، J. and Napoli، C. 1996. الأنماط الظاهرية لكابث تشالكون سينثيز في أزهار البطونية: مقارنة التراكيب الحسية مقابل التراكيب المضادة للحساسية ونسخة واحدة مقابل T-DNA المعقدة التسلسلات. مصنع مول. بيول. 31: 957-973.

Kennerdell، J.R. and Carthew، R.W. 1998. استخدام التداخل الجيني بوساطة dsRNA لإثبات ذلك مجعد و مجعد 2 ـ التصرف في المسار غير المجنح. الخلية 95: 1017-1026.

Ketting ، R.F. ، Haverkamp ، T.H.A. ، van Luenen ، H.G.A.M. و Plasterk ، R.H.A. 1999. mut-7 من C. ايليجانس، المطلوب لإسكات الينقولات وتداخل الحمض النووي الريبي ، هو متماثل لمتلازمة ويرنر هيليكاز و RNaseD. الخلية 99: 133-141.

Konokov، M.، Bassuner، B. and Gelvin، S. 1997. تكامل متواليات العمود الفقري الثنائي T-DNA في جينوم التبغ: دليل على أنماط معقدة متعددة من التكامل. مصنع ي. 11: 945-957.

Kooter، J.M.، Matzke، M. اتجاهات نباتية. 4: 340–347.

Kumagai ، M.H. ، Donson ، J. ، Dellacioppa ، G. ، Harvey ، D. ، Hanley ، K. and Grill ، L.K. 1995. تثبيط السيتوبلازم للتخليق الحيوي كاروتينويد مع الحمض النووي الريبي المشتق من الفيروس. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 92: 1679-1683.

ليتش ، د. 1994. المتناظرة الطويلة ، الهياكل الصليبية ، عدم الاستقرار الوراثي وإصلاح البنية الثانوية. BioEssays 16: 893-900.

ليتش ، د. and Stahl، F.W. 1983. قابلية بقاء لاقمات لامدا تحمل تناظرًا مثاليًا في غياب نوكليازات إعادة التركيب. طبيعة 305: 448-451.

ليلي ، د. 1981. في الجسم الحي عواقب طوبولوجيا البلازميد. طبيعة 292: 380-382.

Lindbo ، J.A. ، Silva-Rosales ، L. ، Proebsting ، W.M. and Dougherty، W.G. 1993. تحريض حالة عالية النوعية من مضادات الفيروسات في النباتات المحورة جينيا: الآثار المترتبة على تنظيم التعبير الجيني ومقاومة الفيروسات. الخلية النباتية 5: 1749-1759.

Lobachev، K.S.، Shor، BM، Tran، HT، Taylor، W.، Keen، J.D.، Resnick، MA and Gordenin، D.A. 1998. العوامل التي تؤثر على تكرار التحفيز المقلوب لإعادة التركيب والحذف في خميرة الخميرة. علم الوراثة 148: 1507-1524.

لويد ، R.G. and Buckman، C. 1985. تحديد وتحليل وراثي sbcC الطفرات شائعة الاستخدام recBC sbcB سلالات الإشريكية القولونية K-12. J. باكت. 164: 836-844.

Luff، B.، Pawlowski، L. and Bender، J. 1999. يؤدي التكرار المقلوب إلى تحفيز مثيلة السيتوزين للتسلسلات المتطابقة في أرابيدوبسيس. مول. الخلية 3: 505-511.

Martienssen، R. 1996. الظواهر فوق الجينية: حدس وإسكات الجينات في النباتات. بالعملة. بيول. 6: 810 - 813.

ماتزكي ، ماجستير وماتزكي ، A.J.M. 1998. إسكات جيني للجينات المحورة للنبات نتيجة لاستجابات دفاعية خلوية متنوعة. زنزانة. مول. علوم الحياة. 54: 94-103.

Matzke ، AJM ، Neuhuber ، F. ، Park ، Y.D. ، Ambros ، P.F. and Matzke، MA 1994. إسكات الجين المعتمد على التنادد في النباتات المعدلة وراثيًا: يحتوي موقع الإسكات المعرفي على نسخ متعددة من الجينات المحورة الميثيل. مول. الجنرال جينيه. 244: 219 - 229.

ماتزكي ، ماجستير ، ماتزكي ، إيه. و Eggelston ، W.B. 1996. الاختلال وإسكات الجينات المحورة: استجابة مشتركة للحمض النووي الغازي؟ اتجاهات نباتية. 1: 382-388.

Mette ، M.F. ، van der Winden ، J. ، Matzke ، MA و Matzke ، A.J.M. 1999. إنتاج نصوص المروج الشاذة يساهم في المثيلة وإسكات المروجين المتماثل غير المرتبط في العابرة. EMBO J. 18: 241–248.

Meyer، P.، Heidmann، I. and Niedenhof، I. 1993. ترتبط الاختلافات في مثيلة الحمض النووي بظاهرة حدودية في البطونية المعدلة وراثيًا. مصنع ياء 4: 89-100.

Meyer، P.، Niedenhof، I. and ten Lohuis، M. 1994. دليل على مثيلة السيتوزين للتسلسلات غير المتماثلة في الجينات المعدلة وراثيا هجين البطونية. EMBO J. 13: 2084-2088.

Meyer، P. and Saedler، H. 1996. إسكات الجينات المعتمدة على التنادد في النباتات. Annu. القس فيزيول النبات. مصنع مول. بيول. 47: 23-48.

مونتغمري ، عضو الكنيست ، شو ، S.Q. and Fire، A. 1998. RNA كهدف للتدخل الجيني بوساطة RNA مزدوج الشريطة في أنواع معينة انيقة. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة 95: 15502-15507.

Nan ، X.S. ، Ng ، H.H. ، Johnson ، CA ، Laherty ، CD ، Turner ، BM ، Eisenman ، R.N. and Bird، A. 1998. القمع النسخي بواسطة بروتين ربط الميثيل- CpG MeCP2 يتضمن مركب هيستون ديستيلاز. Nature 393: 386-389.

Ngô، H.، Tschudi، C.، Gull، K. and Ullu، E. 1998. Double-stranded RNA يستحث تحلل الرنا المرسال في المثقبية البروسية. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 95: 14687-14692.

Palauqui، J.C. and Balzergue، S. 1999. تفعيل الإسكات الجهازي المكتسب عن طريق الإدخال الموضعي للحمض النووي. بالعملة. بيول. 9: 59-66.

Park ، Y-D. ، Papp ، I. ، Moscone ، E.A. ، Iglesias ، V.A. ، Vaucheret ، H. ، Matzke ، A.J.M. و Matzke، M. مصنع ياء 9: 183–194.

Pawlowski ، W.P. وسومرز ، د. 1998. الدنا المعدّل وراثيًا المدمج في جينوم الشوفان كثيرًا ما يتخلله دنا العائل. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 95: 12106-12110.

Pélissier، T.، Thalmeir، S.، Kempe، D.، Sanger، H.L. and Wassenegger، M. 1999. Heavy من جديد المثيلة في المواقع المتناظرة وغير المتماثلة هي السمة المميزة لميثيل الحمض النووي الريبي الموجه. نوكل. الدقة الأحماض. 27: 1625 - 1634.

Que، Q.D.، Wang، H.Y.، English، J.J. وجورجنسن ، R.A. 1997.يعتمد تواتر ودرجة التثبيط عن طريق الجينات المحورة من سينسيز chalcone على قوة محفز التحوير ويتم تقليله بواسطة أكواد غير منطقية سابقة لأوانها في تسلسل تشفير الجينات المحورة. الخلية النباتية 9: 1357-1368.

Rossignol، J.L. and Faugeron، G. 1995. MIP: عملية إسكات الجينات اللاجينية في أسكوبولوس إمرسوس. في: P. Meyer (محرر) إسكات الجينات في النباتات العليا والظواهر ذات الصلة في حقيقيات النوى الأخرى ، Springer-Verlag ، برلين ، ص 179 - 191.

Ruiz، M.T.، Voinnet، O. and Baulcombe، D.C. 1998. بدء وصيانة إسكات الجينات التي يسببها الفيروس. الخلية النباتية 10: 937-946.

Saedler، H. and Nevers، P. 1985. التحويل في النباتات: نموذج جزيئي. EMBO J. 4: 585-590.

سانشيز ألفاردو ، A. and Newmark ، P.A. 1999. RNA مزدوج الشريطة يعطل على وجه التحديد التعبير الجيني أثناء التجديد المستوي. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 96: 5049-5054.

سيلكر ، الاتحاد الأوروبي. 1993. السيطرة على مثيلة الحمض النووي في الفطريات. في: J.P. Jost و H.P. سالوز (محرران) مثيلة الحمض النووي: البيولوجيا الجزيئية والأهمية البيولوجية ، Birkhäuser Verlag ، بازل ، ص 212-217.

سيلكر ، الاتحاد الأوروبي. 1998. يتسبب Trichostatin A في فقدان انتقائي لمثيل الحمض النووي في نيوروسبورا. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 95: 9430-9535.

سيلكر ، الاتحاد الأوروبي. 1999. إسكات الجينات: يكرر هذا العدد. الخلية 97: 157-160.

سنجر ، إم جي وسيلكر ، الاتحاد الأوروبي. 1995. التعطيل الوراثي والجيني للتسلسلات المتكررة في نيوروسبورا كراسا: RIP ، مثيلة الحمض النووي ، والقمع. في: P. Meyer (محرر) إسكات الجينات في النباتات العليا وظواهر أخرى في حقيقيات النوى الأخرى ، Springer-Verlag ، برلين ، ص 165 - 178.

Sijen، T. and Kooter، J.M. 2000. إسكات ما بعد النسخ: RNAs في الهجوم أم في موقع دفاعي؟ BioEssays ، في الصحافة.

Sijen، T.، Wellink، J.، Hiriart، J.B. and van Kammen، A. 1996. RNA بوساطة مقاومة الفيروسات: دور الجينات المحورة المتكررة وتحديد المناطق المستهدفة. الخلية النباتية 8: 2277-2294.

Stam، M.، de Bruin، R.، Kenter، S.، van der Hoorn، R.A.L.، van Blokland، R.، Mol، J.N.M. and Kooter ، J.M. 1997. إسكات ما بعد النسخ من سينسيز chalcone in البطونية عن طريق تكرار الجينات المقلوبة. مصنع J.12: 63-82.

ستام ، إم ، فيتربو ، إيه ، مول ، جي إن إم. and Kooter ، JM 1998. مثيلة تعتمد على الموضع وإسكات نسخ الجينات المحورة في تكرارات T-DNA المقلوبة: الآثار المترتبة على إسكات الجينات المضيفة المتماثلة في النباتات بعد النسخ. مول. زنزانة. بيول. 18: 6165-6177.

Stam، M.، de Bruin، R.، van Blokland، R.، ten Hoorn، R.A.L.، Mol، J.N.M. و Kooter ، J.M. 2000. السمات المميزة لإسكات الجينات بعد النسخ بواسطة الجينات المحورة المضادة للحساسية في نسخة واحدة ومواضع تكرار T-DNA المقلوبة. مصنع ياء 21: 27-42.

ستينارد ، بي إس ، روبرتسون ، دي إس وشنابل ، بي إس. 1993. العزلة الجينية ، والاستنساخ ، وتحليل مضاد التشكل السائد الناجم عن الطفرات في الذرة موسع الأميلوز 1 المكان. الخلية النباتية 5: 1555-1566.

Tabara، H.، Sarkissian، M.، Kelly، W.G.، Fleenor، J.، Grishok، A.، Timmons، L.، Fire، A. and Mello، C.C. 1999. الجين rde-1 ، تدخل الحمض النووي الريبي ، وإسكات الينقولات في C. ايليجانس. الخلية 99: 123-132.

تينلاند ، ب. 1996. دمج T-DNA في جينومات النبات. اتجاهات نباتية. 1: 178–184.

تود ، ج. وفودكين ، L.O. 1996. الازدواجية التي تقمع والحذف التي تعيد التعبير من عائلة chalcone synthase متعددة الجينات. الخلية النباتية 8: 687-699.

تران ، هـ ، ديجياريفا ، إن ، جوردنين ، د. وريسنيك ، ماجستير 1997. يؤدي التكرار المتغير والتكرار المقلوب إلى إعادة التركيب المستقل بين الحمض النووي شديد التباين في الخميرة. مول. زنزانة. بيول. 17: 1027-1036.

ترينه ، T.Q. and Sinden، R.R. 1991. الطفرات التفضيلية للبنية الثانوية للحمض النووي في الخيط المتأخر لتكرار الحمض النووي في بكتريا قولونية. الطبيعة 352: 544-547.

فان بلوكلاند ، R. ، فان دير جيست ، N. ، Mol ، J.N.M. and Kooter ، J.M. 1994. قمع بوساطة الجينات لتعبير سينسيز chalcone in هجين البطونية ينتج عن زيادة معدل دوران الحمض النووي الريبي. مصنع J. 6: 861-877.

Van Houdt، H.، Ingelbrecht، I.، Van Montagu، M. and Depicker، A. 1997. يرتبط إسكات ما بعد النسخ لجين نيوميسين فوسفوتانسفيراز II بتراكم الحمض النووي الريبي غير المنتج وزيادة مثيلة السيتوزين. مصنع J.12: 379-392.

Vaucheret، H. 1993. تحديد كاتم الصوت العام لمروجي 19S و 35S في نبات تبغ معدل وراثيًا: 90 نقطة أساس من التماثل في تسلسل المحفز كافية لتعطيل الترانس. سي آر أكاد. علوم. [III] 316: 1471–1483.

Vaucheret، H.، Elmayan، T.، Mourrain، P. and Palauqui، J-C. 1996. تحليل موضع الجينات المعدلة للتبغ الذي يؤدي إلى إسكات نسخي وما بعد النسخ. في: روسو ، في إي ، مارتينسن ، R.A. and Riggs، A.D (Eds.) الآليات اللاجينية لتنظيم الجينات ، مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور ، كولد سبرينغ هاربور ، نيويورك ، ص 403-414.

Vaucheret، H.، Béclin، C.، Elmayan، T.، Feuerbach، F.، Godon، C.، Morel، J-B.، Mourrain، P.، Palauqui، J-C. and Vernhettes، S. 1998. إسكات الجينات المستحثة عبر الجينات في النباتات. مصنع J.16: 651-659.

Vaucheret، H.، Nussaume، L.، Palauqui، J-C.، Quillere، I. and Elmayan، T. 1997. مطلوب حالة نشطة نسبيًا لإسكات ما بعد النسخ (كبت جماعي) لجينات مضيف اختزال النترات والجينات المنقولة. الخلية النباتية 9: 1495-1504.

Voinnet، O.، Vain، P.، Angell، S. and Baulcombe، D.C. 1998. بدأ الانتشار الجهازي لتدهور الحمض النووي الريبي المحور الخاص بالتسلسل في النباتات عن طريق الإدخال الموضعي للحمض النووي خارج الرحم. الخلية 95: 177-187.

Wade، PA، Gegonne، A.، Jones، PL، Ballestar، E.، Aubry، F. and Wolffe، A.P. 1999. يتزاوج مركب Mi-2 مع مثيلة الحمض النووي لإعادة تشكيل الكروماتين وإزالة هيستون. طبيعة الجينات. 23: 1-5.

Wassenegger، M. and Pélissier، T. 1998. نموذج لإسكات الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي في النباتات العليا. مصنع مول. بيول. 37: 349-362.

Wassenegger، M.، Heimes، S.، Riedel، L. and Sänger، HL 1994. توجيه RNA من جديد مثيلة للتسلسل الجينومي في النباتات. الخلية 76: 567-576.

ووترهاوس ، ب.م. ، جراهام ، هـ. ووانغ ، م. 1998. يمكن أن تحدث مقاومة الفيروسات وإسكات الجينات في النباتات عن طريق التعبير المتزامن للحس والحمض النووي الريبي المضاد للحساسية. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 95: 13959-13964.

ووترهاوس ، بي إم ، سميث ، إن إيه ، وانج ، إم بي. 1999. مقاومة الفيروسات وإسكات الجينات: قتل الرسول. اتجاهات نباتية. 4: 452-457.

Wenck، A.، Czako، M.، Kanevski، I. and Marton، L. 1997. النقل المتكرر الطويل الخطي للحمض النووي بما في ذلك الناقل الثنائي بأكمله أثناء الأجرعيةبوساطة التحول. مصنع مول. بيول. 34: 913-922.


شاهد الفيديو: الدكتور عدنان إبراهيم l التكرار في القرآن الكريم (كانون الثاني 2022).