معلومة

7.23 د: التعبير الجيني للثدييات في البكتيريا - علم الأحياء


يمكن التلاعب بالجينات البكتيرية للسماح بأنظمة التعبير الجيني للثدييات الموجودة في البكتيريا.

أهداف التعلم

  • وصف تسلسل الأحداث في نظام التعبير المهندسة وراثيا

النقاط الرئيسية

  • تسمح الأساليب المحسّنة مؤخرًا للتخليق الكيميائي للحمض النووي ، جنبًا إلى جنب مع تقنية الحمض النووي المؤتلف ، بالتصميم والتوليف السريع نسبيًا للجينات ذات الحجم المتواضع التي يمكن دمجها في الخلايا بدائية النواة للتعبير الجيني باستخدام الهندسة الوراثية.
  • تم توضيح جدوى هذا النهج العام لأول مرة من خلال تخليق والتعبير عن سوماتوستاتين الببتيد في الثدييات في الإشريكية القولونية.
  • يمكن تحقيق التعبير الجيني للثدييات في العديد من مضيفات التعبير عن طريق استخدام آلية المضيف التي تحدث بشكل طبيعي.

الشروط الاساسية

  • الريبوزيم: جزء من الحمض النووي الريبي يمكن أن يعمل كإنزيم.
  • بلازميد: دائرة مكونة من DNA مزدوج الشريطة منفصلة عن الكروموسومات الموجودة في البكتيريا والأوليات.

التعبير الجيني هو العملية التي يتم من خلالها استخدام المعلومات من الجين في تخليق منتج جيني وظيفي. غالبًا ما تكون هذه المنتجات بروتينات ويتم إنتاجها بعد عملية الترجمة. نظام التعبير المصنف كمنتج هندسة وراثية هو نظام مصمم خصيصًا لإنتاج منتج جيني مفضل. عادة ما يكون هذا بروتينًا ، على الرغم من أنه قد يكون أيضًا من الحمض النووي الريبي ، مثل الحمض الريبي النووي النقال أو الريبوزيم.

يحتوي نظام التعبير المعدّل وراثيًا على تسلسل الحمض النووي المناسب للجين المختار الذي يتم هندسته في بلازميد يتم إدخاله في مضيف البكتيريا. تُشتق الآلية الجزيئية المطلوبة لنسخ الحمض النووي من الآلية الفطرية التي تحدث بشكل طبيعي في المضيف. ثم يُنسخ الحمض النووي إلى mRNA ثم يُترجم إلى منتجات بروتينية.

في نظام معدّل وراثيًا ، قد يتم تحفيز هذه العملية الكاملة للتعبير الجيني اعتمادًا على البلازميد المستخدم. بالمعنى الأوسع ، يشمل التعبير الجيني للثدييات كل خلية حية ولكن المصطلح يستخدم بشكل أكثر شيوعًا للإشارة إلى التعبير كأداة معملية. لذلك ، غالبًا ما يكون نظام التعبير مصطنعًا بطريقة ما. تعد الفيروسات والبكتيريا مثالًا ممتازًا لأنظمة التعبير.

أقدم أنظمة التعبير وأكثرها استخدامًا هي أنظمة تعتمد على الخلايا. غالبًا ما يتم التعبير على مستوى عالٍ جدًا وبالتالي يشار إليه باسم الإفراط في التعبير. هناك العديد من الطرق لإدخال DNA غريب إلى خلية للتعبير ، وهناك العديد من الخلايا المضيفة المختلفة التي يمكن استخدامها للتعبير. كل نظام تعبير له مزايا وخصوم مميزة.

عادةً ما يُشار إلى أنظمة التعبير من قبل المضيف ومصدر الحمض النووي أو آلية توصيل المادة الجينية. على سبيل المثال ، العوائل البكتيرية الشائعة هي الإشريكية القولونية والبروسيلا الرقيقة. مع الإشريكية القولونية ، يتم إدخال الحمض النووي بشكل طبيعي في ناقل التعبير البلازميدي. تعمل تقنيات الإفراط في التعبير في الإشريكية القولونية عن طريق زيادة عدد نسخ الجين أو زيادة قوة الارتباط لمنطقة المحفز للمساعدة في النسخ.


التحكم الشرطي في التعبير الجيني للثدييات بواسطة ريبوزيمات رأس المطرقة المعتمدة على التتراسيكلين

الأجهزة الاصطناعية القوية ضرورية لبناء الدوائر الوراثية الاصطناعية والأدوات العلمية والتكنولوجية الهامة للتحكم في العمليات الخلوية. قمنا بتطوير الريبوزيمات المعتمدة على التتراسيكلين ، والتي يمكنها تشغيل التعبير الجيني حتى 8.7 أضعاف عند إضافة التتراسيكلين. تم تطعيم aptamer tetracycline على ribozyme ribozyme بطريقة تجعل ارتباط ligand مع aptamers يدمر تفاعل حلقة الحلقة داخل الريبوزيم وبالتالي تثبيط انقسام الريبوزيم والسماح بالتعبير الجيني. تتمثل ميزة النظام التنظيمي المقدم في استقلاله عن أي بروتينات تنظيمية. يشير التكامل المستقر للريبوزيم في جينوم خلايا هيلا إلى نشاط منخفض في الخلفية في غياب الترابط. علاوة على ذلك ، فإن تركيز الترابط المطلوب لقلب المفتاح بقوة لا يؤثر على قابلية الخلية للحياة ، وبالتالي يسمح بتطبيق طويل الأمد للنظام. تعمل هذه الخصائص على تحويل الريبوزيمات المعتمدة على التتراسيكلين إلى أداة واعدة جدًا للتعبير الجيني الشرطي في خلايا الثدييات.

الكلمات الدالة: خلايا هيلا aptamer المهندسة riboswitch ribozyme biology التتراسيكلين.


2 إجابات 2

المبدأ العام لنظام التعبير بسيط: إنه آلة بيولوجية تستخدم الوسائط الخلوية كمدخلاتها (أي مرق من العناصر الغذائية البسيطة ، بما في ذلك اللبنات الأساسية للبروتين) لتوليد ناتجها ، وهو بروتين معين مهم ، وفقًا له. & quotsettings & quot ، إذا صح التعبير ، وهو بلازميد الحمض النووي الذي يصف البروتين الذي سيتم تصنيعه. إن التروس الموجودة في الآلة عبارة عن خلايا ثديية مصممة بعناية والتي تخلق البروتين من العناصر الغذائية ، وتتكاثر نفسها لزيادة الطاقة الإنتاجية.

في نظام التعبير المثالي ، لن تكون هناك حاجة لمعرفة البيولوجيا الأساسية للنظام: فقط قم بتزويد المرق المحدد ببلازميد DNA المنسق بشكل صحيح ، واتركه ينضج لمدة محددة عند درجة حرارة معينة ، و هاهو!

إن عرض القيمة لنظام تجاري لمستخدميه هو أقرب ما يمكن إلى هذا النظام المثالي ، أي عدم الاضطرار إلى & الاقتباس الخاص بك & quot من المبدأ الأول (بعد كل شيء ، العمليات العامة الكامنة وراء تعبير البروتين مغطاة في تعليم علم الأحياء الجامعي) والذي سوف يستلزم قدرًا كبيرًا من الجهد والنفقات. بطريقة ما ، هذا مشابه لنموذج الأعمال لموفري الخدمات السحابية مثل AWS: قم بتجريد العناصر من نوع مسؤول النظام منخفض المستوى لتوفير نظام أساسي موثوق للتطبيقات.

يعد هذا مفيدًا في كل من سياق البحث والتطوير (يمكنك التكرار على البروتين وخطوات العملية المحددة لمنتجك ، وليس في نظام التعبير) وسياق الإنتاج (لديك نظام تعبير موثوق به ، يتوافق مع المتطلبات التنظيمية ، مع تقنية البائع الدعم).

ومع ذلك ، حتى البائعين لم يستخلصوا بالكامل بيولوجيا التعبير البروتيني ، والعمل المحدد للنظام هو جزء من السمات المميزة لمنتج تجاري معين مقابل المنتجات الأخرى في نفس السطر ، والحلول المنافسة من البائعين الآخرين. لقد طلبت توضيح بعض المصطلحات الفنية:


مقدمة

تعد الإشارات بين الخلايا عملية حيوية لتنسيق وظائف الخلايا في جميع الكائنات متعددة الخلايا. كشف اكتشاف ظاهرة استشعار النصاب (QS) أن البكتيريا ، على الرغم من كونها كائنات وحيدة الخلية ، يمكنها أيضًا التواصل عبر جزيئات إشارات شبيهة بالهرمونات. QS هي آلية إشارات تعتمد على كثافة الخلية تستخدمها العديد من أنواع البكتيريا لتنسيق التعبير الجيني داخل مجموعة سكانية (1). تقوم أنواع عديدة من البكتيريا سالبة الجرام بتوليفها نلاكتونات أسيل-هوموسيرين ، وتسمى أيضًا المحرضات الذاتية ، والتي تعمل كجزيئات إشارة لـ QS. تم اكتشاف أول نظام QS من خلال دراسة تنظيم التلألؤ الحيوي في البكتيريا البحرية سالبة الجرام. فيبريو فيشيري (2). في هذا النظام ، يحفز البروتين المحفز ، LuxI ، تخليق جزيء المحرض الذاتي الذي يرتبط ببروتين المستقبل ، LuxR. عند ارتباطه بجزيء المحرض الذاتي الخاص به ، يقوم LuxR بتقليص وترتبط بـ 20 زوجًا أساسيًا متكررًا مقلوبًا ، وهو صندوق Lux ، الموجود في منطقة المروج للجينات المستهدفة ، وينشط نسخ الجينات الخاضعة للتنظيم QS. تم تحديد العديد من متماثلات LuxR في العديد من الأنواع الأخرى من البكتيريا وتشترك في التشابه في مجالات ربط الحمض النووي للطرف C (3 ، 4).

الزائفة الزنجارية هو أحد مسببات الأمراض الانتهازية سالبة الجرام التي تستخدم QS لإحداث العدوى (5 ، 6) ، تمت مراجعتها في (7). في P. الزنجارية يوجد على الأقل نظامان كاملان من أنظمة QS يسمى Las و Rhl sytems (7). في هذه الأنظمة ، يتم تخليق بروتينات LasI و RhlI ن-3-أوكسوديكانويل-لاكتون هوموسيرين (3O-C12-HSL) و ن-بوتريل-هوموسرين لاكتون (سي4-HSL) ، على التوالي. 3O-C12- HSL و C.4- يرتبط HSL بمستقبلات كل منهما ، LasR و RhlR ، وهما أعضاء في عائلة LuxR لعوامل النسخ الحلزونية الدورانية الحلزونية (4). عند الارتباط بالمحرك الذاتي ، يمكن أن يرتبط LasR و RhlR بتسلسلات DNA محددة ، تسمى لاس المربعات الموجودة في منطقة المروج للجينات المستهدفة. العديد من الجينات التي يتحكم فيها LasR و RhlR تشفر عوامل الضراوة والبروتينات المشاركة في التسبب في المرض (7). أثبت العديد من المحققين أن 3O-C12- لا يتحكم HSL في التعبير الجيني في الخلايا البكتيرية فحسب ، بل قد يعدل أيضًا الاستجابات المناعية للمضيف على حد سواء في المختبر و في الجسم الحي، على ما يبدو من خلال التفاعل مع بروتينات مستقبلات معينة للثدييات (8-11). وبالتالي ، فإن توضيح الآليات التي تتلاعب بها المحرضات الذاتية البكتيرية في التعبير الجيني في خلايا الثدييات قد ينتج عنه أساليب علاجية جديدة لإلغاء العدوى البكتيرية.

كخطوة أولى نحو تحديد بروتينات مستقبلات المحرض الذاتي للثدييات ، اختبرنا مؤخرًا ما إذا كانت المحرضات الذاتية التي تم توليفها بواسطة P. الزنجارية يمكن أن تدخل خلايا الثدييات. للقيام بذلك ، قمنا بتصميم نظام استشعار المحرض الذاتي داخل الخلايا حقيقية النواة (12). كانت استراتيجيتنا هي تعديل البروتينات من نوع LuxR LasR و RhlR بحيث يمكن أن تعمل كعوامل نسخ منشطّة ذاتيًا في خلايا الثدييات. لقد أثبتنا أن وظيفة البروتينات الكيميرية القائمة على LasR كانت تعتمد على وجود المحرض الذاتي المشابه لها في وسط الثقافة. لذلك أكدت هذه البيانات أن P. الزنجارية يمكن أن ينتشر المحرض الذاتي الذي يُظهر أقوى التأثيرات على التعبير الجيني للثدييات عبر غشاء الخلية ويقترح أن مستقبلات المحرض الذاتي للثدييات قد تتواجد في السيتوبلازم و / أو نواة خلايا الثدييات. ومع ذلك ، فإن نظام الاستشعار هذا يحتوي على العديد من التطبيقات المحتملة الإضافية بما في ذلك فحص الخلايا الثديية والنباتية لإنتاج محاكيات أو مضادات ذاتية التحفيز ، وتحديد الأنشطة المهينة للمحفزات الذاتية في مستخلصات الخلايا. نصف هنا تصميم وتوصيف أنظمة الاستشعار على أساس ثلاثة أعضاء من عائلة LuxR من P. الزنجاريةو LasR و RhlR و QscR الذي تم تحديده مؤخرًا (13). نتوقع أن يكون هذا النظام ذا فائدة كبيرة للآخرين الذين يرغبون في تمييز أنظمة QS والأجزاء المكونة لها في الأنواع البكتيرية الأخرى ، خاصة تلك التي يصعب الحفاظ عليها في المختبر.


شكر وتقدير

نشكر R. Arguello و F. Lamanna و I. Sarropoulos و M. Sepp وأعضاء مجموعة Kaessmann للمناقشة. جمع عينات الفئران S. Nef للمساعدة في جمع عينات الغدد التناسلية ، مرفق لوزان لتكنولوجيا الجينوم من أجل التسلسل عالي الإنتاجية لمورد بيولوجيا التنمية البشرية / مركز ويلكوم المشترك (MR / R006237 / 1) ، ومركز جمع الدماغ في ماريلاند والدماغ الصيني مركز البنك لتقديم عينات بشرية ومركز سوتشو التجريبي للحيوانات لتوفير عينات مكاك ريسوس. تم إجراء الحسابات في مركز Vital-IT التابع لمعهد SIB السويسري للمعلوماتية الحيوية وفي bwForCluster من مركز الحاسبات بجامعة هايدلبرغ (بدعم من ولاية بادن فورتمبيرغ من خلال bwHPC ومؤسسة الأبحاث الألمانية - INST 35 / 1134-1 FUGG ). م. كانت مدعومة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (HD020676) P.J. من قبل مجلس البحوث الأوروبي (322206 ، Genewell) Y.E.Z. من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (31771410 ، 91731302) M. بواسطة Fundação para a Ciência e Tecnologia من خلال أموال POPH-QREN من الصندوق الاجتماعي الأوروبي و MCTES البرتغالي (IF / 00283/2014 / CP1256 / CT0012) S. Anders بواسطة مؤسسة الأبحاث الألمانية (SFB 1036). تم دعم هذا البحث بمنح من مجلس البحوث الأوروبي (615253 ، OntoTransEvol) والمؤسسة السويسرية الوطنية للعلوم (146474) إلى H.K. وبواسطة Marie Curie FP7-PEOPLE-2012-IIF إلى M.C.-M. (329902).

معلومات مراجعة الأقران

طبيعة سجية أشكر Pavel Tomancak والمراجع (المراجعين) المجهولين الآخرين على مساهمتهم في مراجعة النظراء لهذا العمل.


القياس الكمي العالمي للتحكم في التعبير الجيني للثدييات

التعبير الجيني هو عملية متعددة الخطوات تتضمن نسخ وترجمة ودوران الرنا المرسال والبروتينات. على الرغم من أنها واحدة من أكثر العمليات الأساسية للحياة ، إلا أن السلسلة بأكملها لم يتم تحديدها كميًا على نطاق الجينوم. هنا قمنا في وقت واحد بقياس mRNA المطلق ووفرة البروتين ودورانه عن طريق وضع العلامات على النبض الأيضي الموازي لأكثر من 5000 جين في خلايا الثدييات. في حين أن مستويات الرنا المرسال والبروتين كانت مرتبطة بشكل أفضل مما كان يعتقد سابقًا ، لم تظهر فترات نصف العمر المقابلة أي ارتباط. باستخدام نموذج كمي ، حصلنا على أول تنبؤ على نطاق الجينوم لمعدلات تخليق mRNAs والبروتينات. نجد أن وفرة البروتينات الخلوية يتم التحكم فيها في الغالب على مستوى الترجمة. تشترك الجينات ذات التوليفات المماثلة من mRNA واستقرار البروتين في الخصائص الوظيفية ، مما يشير إلى أن نصف العمر تطورت في ظل قيود نشطة وديناميكية. توفر المعلومات الكمية حول جميع مراحل التعبير الجيني مورداً ثرياً وتساعد على توفير فهم أكبر لمبادئ التصميم الأساسية.


Exon BioSystems هي شركة لخدمات البحث والإنتاج الخاصة بعقود البروتين متخصصة في التعبير عن البروتين المؤتلف وتنقية البروتين وتوصيف البروتين.

نظام التعبير البكتيري

المضيف البكتيري هو نظام التعبير الأكثر استخدامًا بسبب إجرائه البسيط والتكلفة المنخفضة. يوفر exonbio التعبير البكتيري بالميزة التالية:

  • التسوق الشامل من التخليق الجيني أو استنساخ الجينات والتعبير والتنقية
  • تعبير محسن مع المحفز ودرجة الحرارة ودورة الوقت.
  • توافق عالي الإنتاجية

على الرغم من أن نظام التعبير البكتيري هو الأكثر شيوعًا للتعبير عن البروتين ، إلا أن هذا النظام به بعض العيوب الجوهرية. لا يتم طي العديد من البروتينات المعبر عنها حقيقية النواة بشكل صحيح وتميل إلى التجمع في أجسام متضمنة. تمت دراسة طي البروتين وتكشفه على نطاق واسع ولكن البيانات حول كفاءة الطي في المختبر محدودة نوعًا ما. إذا تم تجميع البروتين المعبر في أجسام متضمنة ، فيرجى التفكير في استخدام أنظمة تعبير بديلة ، مثل أنظمة الحشرات أو الثدييات.

ميزة مقابل عيوب نظام التعبير البكتيري

ميزة الخلايا البكتيرية

  • فسيولوجيا بسيطة
  • أوقات الجيل القصير ، حيث تنمو البكتيريا وتتكاثر بسرعة
  • إنتاجية عالية للمنتج - ما يصل إلى 10٪ من الكتلة (تكلفة منخفضة)

مع B. subtilis وبعض الأنواع الأخرى ، من الممكن تحفيز إفراز منتج جيني في الوسط المحيط. تستخدم هذه الطريقة في صناعة الأدوية في إنتاج الهرمونات مثل الأنسولين وهرمون النمو البشري.

مساوئ الخلايا البكتيرية

  • نشاط. غالبًا ما لا يتم طي البروتينات المعبر عنها بشكل صحيح وبالتالي فهي غير نشطة بيولوجيًا.
  • تسمم. غالبًا ما تكون البروتينات المُصنَّعة سامة للبكتيريا مما يمنع مزارع الخلايا من الوصول إلى كثافة عالية. يتمثل أحد الحلول لهذه المشكلة في دمج محفز محفز ، والذي يمكن تشغيله لنسخ الجين المُدخَل بعد نمو الثقافة. نقص الإنزيمات المسؤولة عن التعديلات اللاحقة للترجمة (التأثير على وظيفة البروتينات) ، على سبيل المثال: هو بروتين سكري ، ولا يوجد جهاز في البكتيريا لربط بقايا السكر الضرورية. في هذه الحالة ، يعتبر نظام التعبير عن خلايا الثدييات هو الخيار الأفضل.

المروجين

نظرة عامة على أنظمة محفز الإشريكية القولونية المفيدة لإنتاج البروتين غير المتجانسة
المروجين مستوى التعبير (مغو) دلائل الميزات
لاك المروجين مستوى منخفض يصل إلى متوسط ​​(IPTG) ضعيف ، منظم ومناسب للمنتجات الجينية على مستوى منخفض للغاية داخل الخلايا.
الحث باهظ الثمن نسبيا.
trc و تاك المروجين مرتفع نسبيًا (IPTG) عالي المستوى ولكن أقل من نظام T7. لا يزال التعبير المنظم ممكنًا.
الحث باهظ الثمن نسبيا. مستوى قاعدي مرتفع.
T7 بوليميراز الحمض النووي الريبي عالية جدا (IPTG) يستخدم بوليميراز T7 RNA. محفز عالي المستوى على التعبير.
T7لاك نظام للتحكم الدقيق في الحث اللازم لمزيد من الحيوانات المستنسخة السامة.
الحث مكلفة للغاية. يعتمد المستوى القاعدي على السلالة المستخدمة (pLys).
المروج Phage pL ارتفاع معتدل (تغير درجة الحرارة) مطلوب مضيف حساس لدرجة الحرارة. احتمالية أقل للتعبير غير المستحث & quot؛ التسريب & quot. مستوى قاعدي مرتفع مستوى قاعدي بدرجات حرارة أقل من 30 درجة مئوية. لا محفز.
رباعي المروج / المشغل متغير من المستوى المتوسط ​​إلى المستوى العالي (أنهيدروتتراسيكلين) تنظيم صارم. مستقل عن حالة التمثيل الغذائي. مستقل عن بكتريا قولونية أضنى.
محفز غير مكلف نسبيا. مستوى قاعدي منخفض.
مروج PPBAD متغير من مستوى منخفض إلى مرتفع
(L- أرابينوز)
يمكن ضبط مستويات التعبير بطريقة تعتمد على الجرعة. تنظيم محكم ممكن. مستوى قاعدي منخفض. محفز غير مكلف.
مروج PBAD متغير من مستوى منخفض إلى مرتفع تنظيم صارم. نشاط قاعدي منخفض. محفز مكلف نسبيا.

السلالات البكتيرية لتعبير البروتين


سلالة بكتيرية أصل سمات متطلبات النمو
BL21 (DE3) 6EMD يحتوي ليسوجين DE3 على T7 بوليميراز عند تحريض IPTG. هذه السلالة هي معامل البروتين lon و omp-t وبالتالي فهي مناسبة للتعبير عن الجينات غير السامة. لا توجد سيطرة محكمة على التعبير.
BL21 (DE3) -pLysS EMD يعبر DE3 ليسوجين عن بوليميراز T7 عند تحريض IPTG. ينتج بلازميد pLysS الليزوزيم T7 لتقليل التعبير الأساسي للجين المعني. وبالتالي فهي مناسبة للتعبير عن الجينات السامة. كلورامفينيكول 34 ميكروغرام / مل
BL21-AI إنفيتروجين تم إنشاء BL21-AI عن طريق إدخال نسخة كروموسومية من جين بوليميريز T7 RNA تحت سيطرة صارمة من محفز araBAD الذي يحفز الأرابينوز. تتراسيكلين 12.5 ميكروغرام / مل تحريض التعبير عن طريق الأرابينوز.
موالف نوفاجين يحتوي على طفرة في جين lac permease (lacZY). يتيح ذلك إمكانية تعديل مستويات التعبير البروتيني في جميع الخلايا في مزرعة ما. لا أحد
فن قص وتشكيل الورق نوفاجين سلالات مضيف الأوريجامي هي مشتقات K-12 التي لها طفرات في كل من جينات اختزال الثيوردوكسين (trxB) واختزال الجلوتاثيون (gor) ، مما يعزز بشكل كبير تكوين رابطة ثاني كبريتيد في السيتوبلازم. كاناميسين 15 مجم / مل تتراسيكلين 12.5 مجم / مل
رشيد نوفاجين توفر هذه السلالات tRNAs للكودونات AUA و AGG و AGA و CUA و CCC و GGA على بلازميد متوافق مع الكلورامفينيكول. كلورامفينيكول 34 ميكروغرام / مل
BL21 كودون بلس أجيلينت BL21-CodonPlus-ريل تحمل الخلايا المختصة كيميائيًا نسخًا إضافية من جينات argU و ileY و leuW tRNA. تتعرف tRNAs المشفرة بواسطة هذه الجينات على AGA / AGG (أرجينين) ، AUA (آيزوليوسين)، و CUA (لوسين) الكودونات ، على التوالي. تتراسيكلين 12.5 مجم / مل كلورامفينيكول 34 مجم / مل
BL21trxB نوفاجين تمتلك سلالات BL21trxB نفس طفرة اختزال thioredoxin (trxB) مثل سلالات AD494 في خلفية BL21 التي تعاني من نقص الأنزيم البروتيني. تمكّن طفرة trxB من تكوين رابطة ثاني كبريتيد السيتوبلازم. كاناميسين 15 ميكروغرام / مل
C41 (DE3) لوسيجن تم اشتقاق السلالة C41 (DE3) من BL21 (DE3). تحتوي هذه السلالة على نوع واحد على الأقل ، وقد تم اشتقاق السلالة C41 (DE3) من BL21 (DE3). تحتوي هذه السلالة على طفرة واحدة غير مميزة على الأقل تمنع موت الخلايا المرتبط بالتعبير عن العديد من البروتينات المؤتلفة السامة. فعال في التعبير عن البروتينات السامة والغشائية من جميع فئات الكائنات الحية ، بما في ذلك الفيروسات ، البكتيريا ، العتائق ، الخمائر ، النباتات ، الحشرات ، والثدييات.

تحسين كودون

يوصى بمقارنة استخدام الكودون للمضيف البكتيري والبروتين محل الاهتمام: قد تكون الكودونات النادرة مثل AGG و AGA و CUA و AUA و CCC و GGA مشكلة في بكتريا قولونية. يمكن ترميز الأحماض الأمينية بأكثر من كودون واحد ، ويحمل كل كائن حي تحيزه الخاص في استخدام أكواد الأحماض الأمينية الـ 61 المتاحة. في كل خلية ، يعكس السكان الحمض النووي الريبي (tRNA) عن كثب تحيز كودون mRNA. إذا كان المقصود من الرنا المرسال للجينات المستهدفة غير المتجانسة أن يتم التعبير عنها بشكل مفرط في بكتريا قولونية، يمكن أن تعيق الاختلافات في استخدام الكودون الترجمة بسبب الطلب على واحد أو أكثر من tRNAs التي قد تكون نادرة أو غير موجودة في المضيف. يمكن أن تؤدي تجمعات الحمض النووي الريبي غير الكافية إلى توقف الترجمة ، وإنهاء الترجمة المبكر ، وتغيير إطار الترجمة ، وإساءة دمج الأحماض الأمينية. قد يؤدي تحسين استخدام الكودون والتركيب الجيني إلى تحسين الوضع. الجينات الاصطناعية متاحة بأقل من دولار واحد لكل قاعدة الآن. يوفر أنسب التقنيات لتحسين الكودون.

أمثلية كودون مقابل سلالة كودون بلس؟

بجانب تحسين الكودون ، يعد استخدام سلالات الكودون بالإضافة إلى طريقة أخرى لتحسين استخدام الكودون في البكتيريا. يتم تحويل سلالات Codon plus لجين أو اثنين من الجينات النادرة من الحمض الريبي النووي النقال. ومع ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن هذه الجينات عادة ما يكون ضعيفًا وبالتالي يقلل من قدرة إنتاج البروتين المستهدف.

في الختام ، الجين الاصطناعي بتقنية تحسين الكودون يحسن بشكل كبير من تعبير البروتين في E. Coli دون أي آثار جانبية.

شروط الاستقراء

يتم تحفيز تعبير البروتين عن طريق إضافة المحفز المناسب أو عن طريق تغيير ظروف النمو. من هذه النقطة فصاعدًا ، ستستخدم الخلايا معظم مواردها لإنتاج البروتين المستهدف ولن تنمو أكثر من ذلك بكثير.

  • يتم سرد شروط تحريض المروجين الأكثر استخدامًا أدناه.
  • بعد التحريض ، يتم تحضين الثقافات من 3 ساعات إلى بين عشية وضحاها اعتمادًا على درجة حرارة الاستقراء.

الذوبان وإعادة الطي

في الإشريكية القولونية ، تتراكم البروتينات المؤتلفة عادةً في السيتوبلازم ، ويمكن العثور على أمثلة حيث يشكل البروتين المؤتلف ما يصل إلى 30 بالمائة من إجمالي البروتين الخلوي في الأدبيات. ومع ذلك ، فإن الإنتاج المفرط لا يخلو من العيوب ، حيث أن البروتين المؤتلف سوف يخطئ في بعض الأحيان ويتجمع في ما يسمى بأجسام التضمين. في حين أن تكوين الجسم المشتمل قد يكون مفيدًا في بعض الحالات بسبب مقاومة التحلل البروتيني ، فإن الذوبان اللاحق وإعادة تشكيل الأجسام المتضمنة يكون مكلفًا ويؤدي إلى انخفاض العائد.

انخفاض الذوبان والأجسام المتضمنة هي المشاكل الرئيسية عندما يتم التعبير عن البروتينات في السيتوبلازم. للتحايل عليها ، يمكنك خفض درجة الحرارة ، واستبدال الأحماض الأمينية ، والمرافقين في التعبير المشترك ، واستخدام شريك اندماج كبير محب للماء (مثل GST) ، وتغيير ظروف الثقافة ، على سبيل المثال درجة الحموضة ، أو تغيير السلالة البكتيرية. من كل هذه الأساليب الممكنة ، يتم استخدام انخفاض درجة الحرارة من 37 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية أو حتى 16 درجة مئوية وتقليل محفز IPTG من 1 ملم إلى 0.05 ملم كبروتوكول روتيني في Exon BioSystems. بدلاً من ذلك ، يمكن إذابة هيئات التضمين وإعادة طيّها للحصول على وظائف ومنتجات نشطة. تحريض وتنقية الجسم الدمج له بعض المزايا ، مثل مستوى تحريض البروتين العالي والتنقية الأفضل وتقليل تدهور البروتين. الجانب السلبي هو صعوبة إعادة طي البروتين. غالبًا ما يتم إعادة طي البروتين بشكل غير فعال ، وسيتم تجميع معظم البروتين. في الوقت نفسه ، سيكون للبروتين المطوي نشاط منخفض أو لن يكون له أي نشاط على الإطلاق.

اقتراح: تجنب انكسار البروتين إن أمكن.

تعديل البروتين

ربما يكون الارتباط بالجليكوزيل هو أكثر تعديلات ما بعد الترجمة شيوعًا وتنوعًا للبروتينات. تشير التقديرات إلى أن أكثر من نصف بروتينات الثدييات هي جليكوزيلاتي. تميل أدوار البروتين جليكانات ، سواء كانت الأشكال المرتبطة بـ N أو O إلى التباين. مطلوب Glycan للوظيفة البيولوجية لبعض البروتينات ، مثل ،

  • وظيفة المستجيب Fc للغلوبولين المناعي G (IgG).
  • التصفية المنظمة لهرمون الجليكوهورمون لوتروبين (LH) ،
  • استهداف الإنزيمات الليزوزومية و
  • التحكم في عمر الدورة الدموية لأدوية البروتين السكري.

يمكن أن يكون الجليكان أيضًا بمثابة:

  • أهداف التعرف على بروتيناتها الرابطة التكميلية ، الليكتينات.
  • تعمل كمواقع للتعلق بالميكروبات والسموم ، وغالبًا ما تشكل نقطة الاتصال الأولى بين العامل الممرض والمضيف.
  • حماية البروتينات من الإنزيمات المحللة للبروتين.
  • تعزيز طي البروتين إلى هيكل مناسب من الدرجة الثالثة والرباعية.
  • تعديل الأنشطة البيولوجية للبروتين.

ومن المثير للاهتمام ، أن مسار N-glycosylation للخلايا الحشرية المصابة بفيروس baculovirus يختلف عن المسار الموجود في حقيقيات النوى الأعلى ، كما يتضح من حقيقة أن البروتينات السكرية المنتجة في نظام baculovirus تفتقر عادةً إلى سلاسل جانبية معقدة من سكاريد قليل السكاريد مرتبطة بـ N والتي تحتوي على الجالاكتوز وبقايا حمض السياليك الطرفية جارفيس DL and Finn EE، Nature Biotechnology 1996).

لتعديل الارتباط بالجليكوزيل الأصلي ، توفر أنظمة التعبير عن الثدييات لدينا أفضل خيار لك.


شاهد الفيديو: Gene expression التعبير الجيني (كانون الثاني 2022).