معلومة

7.23E: بروتينات ومنتجات الثدييات - علم الأحياء


تمكن الهندسة الوراثية العلماء من تكوين النباتات والحيوانات والكائنات الحية الدقيقة عن طريق التلاعب بالجينات.

أهداف التعلم

  • اشرح مزايا وعيوب إنتاج البروتينات المعدلة وراثيًا في البكتيريا

النقاط الرئيسية

  • تشمل الأنظمة المستخدمة للإنتاج الضخم للبروتينات البشرية المؤتلفة البكتيريا والفيروسات وخلايا الثدييات والحيوانات والنباتات.
  • تأتي معظم العمليات مع مزايا وعيوب ، غالبًا ما تكون منخفضة التكلفة. ومع ذلك ، فإن بروتينات ومنتجات الثدييات التي تنتجها الحيوانات لا تنطوي على قضايا أخلاقية.
  • يتم تصنيع عدد كبير من بروتينات الثدييات من قبل شركات الأدوية لاستخدامها في علاج الأمراض التي تصيب الإنسان.

الشروط الاساسية

  • المفاعلات الحيوية: جهاز يدعم بيئة نشطة بيولوجيا.

كانت أولى المنتجات الناجحة للهندسة الوراثية هي الأدوية البروتينية مثل الأنسولين الذي يستخدم لعلاج مرض السكري وهرمون النمو سوماتوتروبين. تصنع هذه البروتينات بكميات كبيرة بواسطة بكتيريا معدلة وراثيًا أو خميرة في "مفاعلات حيوية كبيرة". تصنع بعض الأدوية أيضًا في نباتات معدلة وراثيًا ، مثل التبغ. تتطلب البروتينات البشرية الأخرى التي تستخدم كأدوية تعديلات بيولوجية لا يمكن أن توفرها إلا خلايا الثدييات ، مثل الأبقار والماعز والأغنام. بالنسبة لهذه الأدوية ، يعد الإنتاج في الحيوانات المعدلة وراثيًا خيارًا جيدًا. استخدام حيوانات المزرعة لإنتاج الأدوية له العديد من المزايا لأنها قابلة للتكاثر ، ولديها إنتاج مرن ، ويمكن صيانتها بسهولة ، ولها طريقة توصيل رائعة (مثل الحليب).

لا تسمح تقنية الحمض النووي المؤتلف فقط بإنتاج البروتينات العلاجية على نطاق واسع ولكن باستخدام نفس المنهجية يمكن تصميم جزيئات البروتين بشكل هادف. تتمتع التعديلات الجينية التي يتم إدخالها على البروتين بالعديد من المزايا مقارنة بالتعديلات الكيميائية. الكيانات المعدلة وراثيا متوافقة حيويا وقابلة للتحلل. يتم إدخال التغييرات في 100٪ من الجزيئات مع استبعاد الأخطاء النادرة في النسخ الجيني أو الترجمة. لا تحتوي المستحضرات على كميات متبقية من المواد الكيميائية القاسية المستخدمة في عملية الاقتران. غالبًا ما تكون أنظمة التعبير البكتيرية ، بسبب بساطتها ، غير قادرة على إنتاج بروتين بشري مؤتلف مطابق للنوع البري الذي يحدث بشكل طبيعي. لم تطور البكتيريا آليات معقدة لإجراء تعديلات ما بعد الترجمة الموجودة في الكائنات الحية الأعلى. نتيجة لذلك ، يتم التعبير عن عدد متزايد من العلاجات البروتينية في خلايا الثدييات. ومع ذلك ، فإن التكلفة المنخفضة والبساطة في زراعة البكتيريا هي ميزة لا تقبل المنافسة على أي نظام تعبير آخر ، وبالتالي فإن الإشريكية القولونية هي دائمًا الخيار المفضل على مستوى المختبر وفي الصناعة.

يتم إنتاج العديد من بروتينات الثدييات عن طريق الهندسة الوراثية. وتشمل هذه ، على وجه الخصوص ، مجموعة متنوعة من الهرمونات والبروتينات لتخثر الدم وعمليات الدم الأخرى. على سبيل المثال ، منشط البلازمينوجين النسيجي (TPA) هو بروتين في الدم ينقب ويذوب جلطات الدم التي قد تتشكل في المراحل الأخيرة من عملية الشفاء. يستخدم TPA بشكل أساسي في مرضى القلب أو غيرهم ممن يعانون من ضعف الدورة الدموية لمنع تطور الجلطات التي يمكن أن تكون مهددة للحياة. تعتبر أمراض القلب سببًا رئيسيًا للوفاة في العديد من البلدان المتقدمة ، خاصة في الولايات المتحدة ، لذلك هناك طلب كبير على TPA المنتج ميكروبيًا. على عكس TPA ، فإن عوامل تخثر الدم السابع والثامن والتاسع لها أهمية حاسمة في تكوين جلطات الدم. يعاني المصابون بالهيموفيليا من نقص واحد أو أكثر من عوامل التجلط وبالتالي يمكن علاجهم بعوامل التخثر الميكروبية. في الماضي ، كان المصابون بالهيموفيليا يعالجون بمستخلصات عامل التخثر من دم الإنسان المجمع ، وبعضها كان ملوثًا بفيروسات مثل فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد سي ، مما يعرض المصابين بالهيموفيليا لخطر الإصابة بهذه الأمراض. عوامل التخثر المؤتلفة قضت على هذه المشكلة.


إنتاج البروتين المؤتلف في الخمائر

إنتاج البروتين المؤتلف هو سوق بمليارات الدولارات. يبدأ تطوير منتج جديد باختيار مضيف الإنتاج. على الرغم من عدم وجود مضيف واحد مثالي لكل بروتين ، فقد تم إنشاء العديد من أنظمة التعبير التي تتراوح من مضيفات بكتيرية إلى خلايا الثدييات. من بينها ، تجمع مصانع خلايا الخميرة بين مزايا كونها خلايا مفردة ، مثل النمو السريع والتلاعب الجيني السهل ، بالإضافة إلى ميزات حقيقية النواة بما في ذلك المسار الإفرازي الذي يؤدي إلى معالجة البروتين الصحيحة والتعديلات اللاحقة للترجمة. في هذا الصدد ، تعتبر هندسة الخميرة بالجليكوزيل لإنتاج البروتينات السكرية من هياكل جليكان الشبيهة بالبشر ذات أهمية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم محاولات مختلفة للهندسة الخلوية بالإضافة إلى تصميم عمليات الإنتاج المختلفة التي تؤدي إلى تحسين الإنتاجية. مع ظهور تقنيات تسلسل الجيل التالي الأرخص ثمناً ، ستعمل مناهج التكنولوجيا الحيوية للأنظمة التي تركز على تحليلات مقياس الجينوم على تطوير وتسريع مصانع خلايا الخميرة وبالتالي عمليات إنتاج البروتين المؤتلف في المستقبل القريب. في هذه المراجعة ، نلخص مزايا وقيود مضيفات الخميرة الرئيسية والواعدة ، بما في ذلك Saccharomyces cerevisiae و Pichia pastoris و Hansenula polymorpha كتلك المستخدمة حاليًا في إنتاج البروتينات غير المتجانسة على نطاق واسع.


تزداد الحاجة إلى الأدوية

Tamas Bartfai PhD ، Graham V Lees PhD ، في مستقبل اكتشاف الأدوية ، 2013

البروتينات المؤتلفة كعلاجات

تعمل البروتينات المؤتلفة على توسيع السوق ، وبكونها باهظة الثمن ، فإنها تزيد من أرباح شركات الأدوية.

تستغرق البروتينات المؤتلفة ، المعروفة باسم الأدوية عالية الفعالية والآمنة من الآثار الجانبية غير المستهدفة ، وقتًا أقصر للتطور من الجزيئات الصغيرة. نظرًا لكونها عقاقير ذات إمكانات عالية للدخل ، فإنها تبعث برسالة مهمة لشركات الأدوية للنظر فيها ، ويبدو أنها فهمت الرسالة. تقوم جميع شركات الأدوية الكبرى الآن بتطوير وبيع البروتينات المؤتلفة كأدوية. أدت القدرة على تطوير بروتينات مؤتلفة جديدة في مؤشرات جديدة إلى تطور كبير في شركات الأدوية الكبرى. Pfizer و AstraZeneca و Roche و Novartis و Merck ، وهي الشركات ذاتها التي كانت تراهن حتى عام 2005 على معرفتها الفائقة في الكيمياء الطبية ، لديها الآن ، من خلال عمليات استحواذ متعددة ، أذرع بروتينية كاملة المؤتلف. ينبغي للمرء أن يضيف أن العديد من الأدوية الكبيرة ، مثل GlaxoSmithKline (GSK) ، و Merck ، و Sanofi-Pasteur-Merieux ، و Pfizer-Wyeth ، كانت تمتلك بالفعل خبرة في الإنتاج البيولوجي من خلال إنتاج اللقاح ، ولكن إنتاج اللقاح وتطويره كان له كانت دائمًا جزءًا منعزلاً من هذه التكتلات لأن اللقاحات يتم اختبارها وتوزيعها وتسعيرها بشكل مختلف عن البيولوجيا الأخرى.


نظرة عامة على تعبير البروتين

يتم تصنيع البروتينات وتنظيمها حسب الحاجة الوظيفية في الخلية. يتم تخزين المخططات الخاصة بالبروتينات في الحمض النووي وفك تشفيرها عن طريق عمليات نسخ منظمة للغاية لإنتاج مرسال الحمض النووي الريبي (مرنا). ثم تُترجم الرسالة المشفرة بواسطة mRNA إلى بروتين. النسخ هو نقل المعلومات من DNA إلى mRNA ، والترجمة هي تخليق البروتين بناءً على تسلسل محدد بواسطة mRNA.

رسم تخطيطي بسيط للنسخ والترجمة. يصف هذا التدفق العام للمعلومات من تسلسل زوج قاعدة الحمض النووي (الجين) إلى تسلسل متعدد الببتيد الأحماض الأمينية (البروتين).

في بدائيات النوى ، تحدث عملية النسخ والترجمة في وقت واحد. تبدأ ترجمة الرنا المرسال حتى قبل أن يتم تصنيع نسخة كاملة من الرنا المرسال الناضج. يسمى هذا النسخ والترجمة المتزامنة للجين بالنسخ المقترن والترجمة. في حقيقيات النوى ، يتم فصل العمليات مكانيًا وتحدث بالتتابع مع حدوث النسخ في النواة والترجمة ، أو تخليق البروتين ، الذي يحدث في السيتوبلازم.

مقارنة النسخ والترجمة في بدائيات النوى مقابل حقيقيات النوى.

يوفر هذا الكتيب المكون من 118 صفحة معلومات شاملة حول تعبير البروتين وسيساعدك على اختيار نظام التعبير الصحيح وتقنيات التنقية لتطبيقك واحتياجاتك المحددة. احصل على النصائح والحيل عند بدء التجربة ، واعثر على إجابات للمشكلات اليومية المتعلقة بتعبير البروتين.

يحدث النسخ في ثلاث خطوات في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى: البدء والاستطالة والإنهاء. يبدأ النسخ عندما يتم فك الحمض النووي مزدوج الشريطة للسماح بربط بوليميراز الحمض النووي الريبي. بمجرد بدء النسخ ، يتم تحرير بوليميراز الحمض النووي الريبي من الحمض النووي. يتم تنظيم النسخ على مستويات مختلفة بواسطة المنشطات والمثبطات وأيضًا عن طريق بنية الكروماتين في حقيقيات النوى. في بدائيات النوى ، لا يلزم إجراء تعديل خاص على mRNA وتبدأ ترجمة الرسالة حتى قبل اكتمال النسخ. ومع ذلك ، في حقيقيات النوى ، تتم معالجة الرنا المرسال بشكل أكبر لإزالة الإنترونات (الربط) ، إضافة غطاء في نهاية 5´ وأدينينات متعددة في نهاية mRNA 3´ لتوليد ذيل بولي أ. ثم يتم تصدير mRNA المعدل إلى السيتوبلازم حيث يتم ترجمته.

الترجمة أو تخليق البروتين هي عملية متعددة الخطوات تتطلب جزيئات كبيرة مثل الريبوسومات ونقل الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي) وعوامل الرنا المرسال والبروتين بالإضافة إلى الجزيئات الصغيرة مثل الأحماض الأمينية و ATP و GTP والعوامل المساعدة الأخرى. هناك عوامل بروتينية محددة لكل خطوة من خطوات الترجمة (انظر الجدول أدناه). العملية الكلية متشابهة في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى ، على الرغم من وجود اختلافات معينة.

أثناء البدء ، تقوم الوحدة الفرعية الصغيرة للريبوسوم المرتبط بالبادئ t-RNA بمسح الحمض النووي الريبي الذي يبدأ في الخامس من أجل تحديد وربط كودون البدء (AUG). تنضم الوحدة الفرعية الكبيرة للريبوسوم إلى الوحدة الفرعية الريبوسومية الصغيرة لتوليد مجمع البدء في كودون البدء. تشارك عوامل البروتين وكذلك التسلسلات في mRNA في التعرف على كودون البدء وتشكيل مجمع البدء. أثناء الاستطالة ، ترتبط الحمض النووي الريبي بالأحماض الأمينية المحددة (المعروفة باسم شحن الحمض النووي الريبي) وتنقلها إلى الريبوسوم حيث يتم بلمرتها لتشكيل ببتيد. يعتمد تسلسل الأحماض الأمينية المضافة إلى الببتيد المتنامي على تسلسل الرنا المرسال للنسخة. أخيرًا ، يتم تحرير البولي ببتيد الناشئ في خطوة الإنهاء عندما يصل الريبوسوم إلى كود الإنهاء. في هذه المرحلة ، يتم تحرير الريبوسوم من الرنا المرسال ويكون جاهزًا لبدء جولة أخرى من الترجمة.


محتويات

ابتكرها ستانلي فيلدز وأوك كيو سونغ في عام 1989 ، وقد تم تصميم هذه التقنية في الأصل لاكتشاف تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام منشط Gal4 النسخي للخميرة خميرة الخميرة. ينشط بروتين Gal4 النسخ الجيني المشارك في استخدام الجالاكتوز ، والذي شكل أساس الاختيار. [4] منذ ذلك الحين ، تم تكييف نفس المبدأ لوصف العديد من الطرق البديلة ، بما في ذلك بعض التي تكتشف تفاعلات البروتين والحمض النووي أو تفاعلات الحمض النووي والحمض النووي ، بالإضافة إلى الطرق التي تستخدم كائنات مضيفة مختلفة مثل الإشريكية القولونية أو خلايا الثدييات بدلاً من الخميرة. [3] [5]

مفتاح الشاشة ثنائية الهجين هو أنه في معظم عوامل النسخ حقيقية النواة ، تكون مجالات التنشيط والربط معيارية ويمكن أن تعمل بالقرب من بعضها البعض دون ارتباط مباشر. [6] هذا يعني أنه على الرغم من تقسيم عامل النسخ إلى جزأين ، إلا أنه لا يزال بإمكانه تنشيط النسخ عندما يتم توصيل الجزأين بشكل غير مباشر.

أسلوب الفحص الأكثر شيوعًا هو اختبار الخميرة ثنائي الهجين. في هذا النهج ، يعرف الباحث مكان وجود كل فريسة على الوسط المستخدم (ألواح أجار). تم فحص الملايين من التفاعلات المحتملة في العديد من الكائنات الحية في العقد الأخير باستخدام أنظمة فحص عالية الإنتاجية (غالبًا باستخدام الروبوتات) وتم اكتشاف أكثر من آلاف التفاعلات وتصنيفها في قواعد البيانات على أنها BioGRID. [7] [8] غالبًا ما يستخدم هذا النظام سلالة من الخميرة المعدلة وراثيًا والتي تفتقر إلى التخليق الحيوي لبعض العناصر الغذائية (عادةً الأحماض الأمينية أو الأحماض النووية). عندما تنمو على وسائط تفتقر إلى هذه العناصر الغذائية ، تفشل الخميرة في البقاء على قيد الحياة. يمكن تصنيع سلالة الخميرة الطافرة هذه لدمج الحمض النووي الغريب في شكل بلازميدات. في فحص الخميرة ثنائي الهجين ، يتم إدخال بلازميدات منفصلة للطعم والفريسة في وقت واحد في سلالة الخميرة الطافرة أو يتم استخدام استراتيجية التزاوج للحصول على كلا البلازميدات في خلية مضيفة واحدة. [9]

الطريقة الثانية عالية الإنتاجية هي نهج فحص المكتبة. في هذا الإعداد ، يتم تزاوج الخلايا التي تأوي الطعم والفريسة بترتيب عشوائي. بعد التزاوج واختيار الخلايا الباقية على وسيط انتقائي ، سيقوم العالم بتسلسل البلازميدات المعزولة لمعرفة الفريسة (تسلسل الحمض النووي) التي تتفاعل مع الطعم المستخدم. هذا النهج لديه معدل أقل من التكاثر ويميل إلى إنتاج كميات أعلى من الإيجابيات الكاذبة مقارنة بنهج المصفوفة. [9]

يتم هندسة البلازميدات لإنتاج منتج بروتيني يتم فيه دمج جزء مجال ربط الحمض النووي (BD) على بروتين بينما يتم تصميم بلازميد آخر لإنتاج منتج بروتيني يتم فيه دمج جزء مجال التنشيط (AD) على بروتين آخر. قد يُشار إلى البروتين المندمج في BD باسم بروتين الطعم ، وعادةً ما يكون بروتينًا معروفًا يستخدمه المحقق لتحديد شركاء ربط جدد. قد يُشار إلى البروتين المندمج في AD على أنه بروتين الفريسة ويمكن أن يكون إما بروتينًا واحدًا معروفًا أو مكتبة من البروتينات المعروفة أو غير المعروفة. في هذا السياق ، قد تتكون المكتبة من مجموعة من تسلسلات ترميز البروتين التي تمثل جميع البروتينات المعبر عنها في كائن أو نسيج معين ، أو قد يتم إنشاؤها عن طريق توليف تسلسلات DNA عشوائية. [3] بغض النظر عن المصدر ، يتم دمجها لاحقًا في تسلسل تشفير البروتين للبلازميد ، والذي يتم نقله بعد ذلك إلى الخلايا المختارة لطريقة الفحص. [3] عند استخدام المكتبة ، تفترض هذه التقنية أن كل خلية مصابة بالعدوى بما لا يزيد عن بلازميد واحد ، وبالتالي ، لا تعبر كل خلية في النهاية عن أكثر من عضو واحد من مكتبة البروتين.

إذا تفاعلت بروتينات الطعم والفريسة (أي الارتباط) ، فإن AD و BD لعامل النسخ مرتبطان بشكل غير مباشر ، مما يجعل AD قريبًا من موقع بدء النسخ ويمكن أن يحدث نسخ جين (جينات) المراسل. إذا لم يتفاعل البروتينان ، فلا يوجد نسخ للجين المراسل. بهذه الطريقة ، يرتبط التفاعل الناجح بين البروتين المنصهر بالتغيير في النمط الظاهري للخلية. [1]

يتم تناول التحدي المتمثل في فصل الخلايا التي تعبر عن البروتينات التي تتفاعل مع بروتينات الاندماج النظيرة عن تلك التي لا تقوم بذلك ، في القسم التالي.

في أي دراسة ، ستتنوع بعض مجالات البروتين ، التي تخضع للتحقيق ، وفقًا لأهداف الدراسة ، بينما تظل المجالات الأخرى ، تلك التي لم يتم التحقيق فيها هي نفسها ، ثابتة. على سبيل المثال ، في دراسة ثنائية الهجينة لتحديد مجالات ربط الحمض النووي ، سيتنوع مجال ربط الحمض النووي ، BD ، بينما يجب أن يظل البروتينان المتفاعلان ، الطعم والفريسة ، ثابتًا للحفاظ على ارتباط قوي بين BD. و م. هناك عدد من المجالات التي يمكن من خلالها اختيار BD والطعم والفريسة و AD ، إذا كانت ستبقى ثابتة. في تحقيقات التفاعل بين البروتين والبروتين ، يمكن اختيار BD من أي من العديد من مجالات ربط الحمض النووي القوية مثل Zif268. [2] الاختيار المتكرر لنطاقات الطُعم والفرائس هو البقايا 263-352 من الخميرة Gal11P مع طفرة N342V [2] والمخلفات 58-97 من الخميرة Gal4 ، [2] على التوالي. يمكن استخدام هذه المجالات في كل من تقنيات الانتقاء المعتمدة على الخميرة والبكتيريا ومن المعروف أنها ترتبط ببعضها البعض بقوة. [1] [2]

يجب أن يكون AD المختار قادرًا على تنشيط نسخ الجين المراسل ، باستخدام آلية النسخ الخاصة بالخلية. وبالتالي ، فإن مجموعة متنوعة من الإعلانات المتاحة للاستخدام في التقنيات القائمة على الخميرة قد لا تكون مناسبة للاستخدام في نظائرها القائمة على البكتيريا. تم استخدام AD و VP16 والخميرة Gal4 AD المشتق من فيروس الهربس البسيط بنجاح في الخميرة [1] بينما تم استخدام جزء من الوحدة الفرعية α من بكتريا قولونية تم استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي في بكتريا قولونيةالطرق المستندة. [2] [3]

في حين أن التنشيط القوي للمجالات قد يسمح بمزيد من الحساسية تجاه التفاعلات الأضعف ، على العكس من ذلك ، قد يوفر AD الأضعف تشددًا أكبر.

يجب دمج عدد من التسلسلات الجينية المهندسة في الخلية المضيفة لإجراء تحليل ثنائي الهجين أو أحد تقنياتها المشتقة. تختلف الاعتبارات والطرق المستخدمة في بناء وتسليم هذه التسلسلات وفقًا لاحتياجات الفحص والكائن الحي الذي تم اختياره كخلفية تجريبية.

هناك فئتان عريضتان من المكتبات المختلطة: المكتبات العشوائية والمكتبات القائمة على cDNA. يتم تكوين مكتبة (كدنا) بواسطة (كدنا) المنتجة من خلال النسخ العكسي للـ mRNA التي تم جمعها من خلايا معينة من أنواع الخلايا. يمكن ربط هذه المكتبة ببناء بحيث يتم إرفاقها بـ BD أو AD المستخدم في الفحص. [1] تستخدم المكتبة العشوائية أطوال الحمض النووي للتسلسل العشوائي بدلاً من أقسام (كدنا) هذه. يوجد عدد من الطرق لإنتاج هذه التسلسلات العشوائية ، بما في ذلك طفرات الكاسيت. [2] بغض النظر عن مصدر مكتبة الحمض النووي ، يتم ربطها بالمكان المناسب في البلازميد / الفجميد ذي الصلة باستخدام نوكليازات التقييد المناسبة. [2]

بكتريا قولونية- اعتبارات محددة تحرير

عن طريق وضع البروتينات الهجينة تحت سيطرة IPTG-inducible لاك المروجين ، يتم التعبير عنها فقط على الوسائط المكملة بـ IPTG. علاوة على ذلك ، من خلال تضمين جينات مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية في كل بنية وراثية ، يمكن بسهولة منع نمو الخلايا غير المحولة من خلال الثقافة على الوسائط التي تحتوي على المضادات الحيوية المقابلة. هذا مهم بشكل خاص لطرق الاختيار المضاد حيث أ قلة من التفاعل ضروري لبقاء الخلية. [2]

قد يتم إدخال الجين المراسل في بكتريا قولونية الجينوم عن طريق إدخاله أولاً في episome ، وهو نوع من البلازميد مع القدرة على الاندماج في جينوم الخلية البكتيرية [2] مع عدد نسخ واحد تقريبًا لكل خلية. [10]

يمكن أن يتم electroporated في phagemids التعبير الهجين بكتريا قولونية الخلايا الزرقاء XL-1 والتي بعد التضخيم والعدوى بالعاثية المساعدة VCS-M13 ، ستنتج مخزونًا من فجوة المكتبة. سيحتوي كل من هذه العاثيات على عضو واحد تقطعت به السبل في مكتبة phagemid. [2]

بمجرد إجراء الاختيار ، يجب تحديد الهيكل الأساسي للبروتينات التي تعرض الخصائص المناسبة. يتم تحقيق ذلك عن طريق استرجاع تسلسل تشفير البروتين (كما تم إدخاله في الأصل) من الخلايا التي تظهر النمط الظاهري المناسب.

بكتريا قولونية يحرر

يستخدم phagemid للتحويل بكتريا قولونية يمكن "إنقاذ" الخلايا من الخلايا المختارة عن طريق إصابتها بالعاثة المساعدة VCS-M13. تحتوي جزيئات الملتهمة الناتجة التي يتم إنتاجها على فاجيميدات أحادية السلسلة وتستخدم لإصابة الخلايا الزرقاء XL-1.[2] يتم جمع فاجيميدات مزدوجة الشريطة لاحقًا من هذه الخلايا الزرقاء XL-1 ، مما يعكس بشكل أساسي العملية المستخدمة لإنتاج فجوة المكتبة الأصلية. أخيرًا ، يتم تحديد تسلسل الحمض النووي من خلال تسلسل ثنائي أكسيد. [2]

ال الإشريكية القولونيةيمكن استخدام مثبط Tet-R المشتق بما يتماشى مع جين المراسل التقليدي ويمكن التحكم فيه عن طريق التتراسيكلين أو الدوكسيسيكلين (مثبطات Tet-R). وبالتالي ، يتم التحكم في التعبير عن Tet-R بواسطة النظام القياسي ثنائي الهجين ولكن Tet-R بدوره يتحكم (يقمع) تعبير المراسل المذكور سابقًا مثل HIS3، من خلال مروجها Tet-R. يمكن بعد ذلك استخدام التتراسيكلين أو مشتقاته لتنظيم حساسية نظام يستخدم Tet-R. [1]

يمكن أيضًا التحكم في الحساسية عن طريق تغيير اعتماد الخلايا على جينات المراسل. على سبيل المثال ، قد يتأثر ذلك بتغيير تركيز الهيستيدين في وسط النمو لـ له 3- الخلايا المعتمدة وتغيير تركيز الستربتومايسين اعدا الخلايا التابعة. [2] [3] يمكن أيضًا التحكم في الاعتماد على الانتقاء الجيني عن طريق تطبيق مثبط لجين الانتقاء بتركيز مناسب. 3-Amino-1،2،4-triazole (3-AT) على سبيل المثال ، هو مثبط تنافسي لـ HIS3-Gene ويمكن استخدامه لمعايرة المستوى الأدنى من HIS3 التعبير المطلوب للنمو على الوسائط التي تعاني من نقص الهيستيدين. [2]

يمكن أيضًا تعديل الحساسية عن طريق تغيير عدد تسلسلات المشغل في DNA المُراسل.

يمكن التعبير عن بروتين ثالث غير مندمجي معًا باستخدام بروتينين مندمجين. اعتمادًا على الاستقصاء ، قد يعدل البروتين الثالث أحد بروتينات الاندماج أو يتوسط أو يتداخل مع تفاعلها. [1]

قد يكون التعبير المشترك عن البروتين الثالث ضروريًا لتعديل أو تنشيط أحد بروتينات الاندماج أو كليهما. على سبيل المثال، S. cerevisiae لا يمتلك كيناز التيروزين الداخلي. إذا اشتمل التحقيق على بروتين يتطلب فسفرة التيروزين ، فيجب توفير كيناز في شكل جين التيروزين كيناز. [1]

قد يتوسط البروتين غير الاندماجي في التفاعل عن طريق ربط كل من بروتينات الاندماج في وقت واحد ، كما في حالة ثنائيات مستقبلات الارتباط المعتمدة على الترابط. [1]

بالنسبة لبروتين مع شريك متفاعل ، يمكن تقييم تماثله الوظيفي مع البروتينات الأخرى من خلال توفير البروتين الثالث في شكل غير اندماج ، والذي قد يتنافس أو لا يتنافس مع بروتين الاندماج لشريكه الملزم. سيؤدي الارتباط بين البروتين الثالث وبروتين الاندماج الآخر إلى مقاطعة تكوين معقد تنشيط تعبير المراسل وبالتالي تقليل تعبير المراسل ، مما يؤدي إلى التغيير المميز في النمط الظاهري. [1]

يتمثل أحد قيود شاشات الخميرة الكلاسيكية ثنائية الهجين في أنها تقتصر على البروتينات القابلة للذوبان. لذلك من المستحيل استخدامها لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين بين بروتينات الغشاء المتكاملة غير القابلة للذوبان. يوفر نظام Split-ubiquitin طريقة للتغلب على هذا القيد. [11] في نظام يوبيكويتين المنفصل ، يتم دمج بروتينين غشاءين متكاملين ليتم دراستهما في شقين مختلفين من يوبيكويتين: جزء يوبيكويتين C- طرفي ("مكعب" ، المخلفات 35–76) وشريحة يوبيكويتين الطرفية N (" Nub "، المخلفات 1 - 34). تسمى هذه البروتينات المندمجة بالطعم والفريسة على التوالي. بالإضافة إلى اندماجها في بروتين غشائي متكامل ، يتم أيضًا دمج الجزء المكعب في عامل النسخ (TF) الذي يمكن أن ينشطر بواسطة البروتياز الخاص باليوبيكويتين. عند التفاعل بين الطعم والفريسة ، تتجمع شقوق Nub و Cub ، مما يعيد تكوين الانقسام اليوبيكويتين. يتم التعرف على جزيء يوبيكويتين المعاد تكوينه بواسطة البروتياز الخاص باليوبيكويتين ، والذي ينفصل عن عامل النسخ ، مما يسمح له بالحث على نسخ جينات المراسل. [12]

قدم Zolghadr وزملاؤه نظامًا فلوريًا ثنائي الهجين يستخدم بروتينين هجينين مدمجين في بروتينات فلورية مختلفة بالإضافة إلى LacI ، مثبط lac. تبدو بنية بروتينات الاندماج كما يلي: FP2-LacI-bait و FP1-prey حيث تتفاعل بروتينات الطعم والفريسة وتجلب البروتينات الفلورية (FP1 = GFP ، FP2 = mCherry) على مقربة من موقع الربط لـ LacI البروتين في جينوم الخلية المضيفة. [13] يمكن أيضًا استخدام النظام للكشف عن مثبطات تفاعلات البروتين والبروتين. [14]

بينما استخدم نظام Y2H الأصلي عامل نسخ معاد تكوينه ، فإن الأنظمة الأخرى تخلق أنشطة إنزيمية لاكتشاف مثبطات مضخة البروتون. على سبيل المثال ، مستشعر الركيزة KInase ("KISS") ، هو نهج ثنائي الهجين للثدييات تم تصميمه لرسم خرائط لمؤشرات PPI داخل الخلايا. هنا ، يتم دمج بروتين الطُعم في جزء يحتوي على كيناز من TYK2 وتقترن الفريسة بجزء مستقبل السيتوكين gp130. عندما يتفاعل الطعم والفريسة ، فإن TYK2 فسفوريلات STAT3 مواقع الالتحام على الفريسة الوهمي ، مما يؤدي في النهاية إلى تنشيط جين المراسل. [15]

تحرير هجين واحد

تم تصميم التباين الهجين الواحد لهذه التقنية للتحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي واستخدام بروتين اندماج واحد يرتبط فيه AD مباشرة بمجال الربط. ومع ذلك ، فإن مجال الربط في هذه الحالة ليس بالضرورة متسلسلًا ثابتًا كما هو الحال في تحليل البروتين والبروتين ثنائي الهجين ولكن يمكن تكوينه بواسطة مكتبة. يمكن اختيار هذه المكتبة مقابل التسلسل المستهدف المطلوب ، والذي يتم إدراجه في منطقة المروج لتركيب جين المراسل. في نظام الاختيار الإيجابي ، يتم تحديد مجال ملزم يربط بنجاح UAS ويسمح بالنسخ. [1]

لاحظ أن اختيار مجالات ربط الحمض النووي لا يتم بالضرورة باستخدام نظام هجين واحد ، ولكن يمكن أيضًا إجراؤه باستخدام نظام هجينين يتنوع فيه مجال الربط ويتم الاحتفاظ ببروتينات الطعم والفريسة ثابتة. [2] [3]

ثلاثة هجين تحرير

تم التحقيق في تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي (RNA) من خلال تباين ثلاثي الهجين لتقنية الهجينين. في هذه الحالة ، يعمل جزيء الحمض النووي الريبي الهجين على ربط مجالات اندماج البروتين معًا - والتي لا تهدف إلى التفاعل مع بعضها البعض ولكن بالأحرى جزيء الحمض النووي الريبي الوسيط (من خلال مجالات ربط الحمض النووي الريبي). [1] يمكن أيضًا الإشارة إلى التقنيات التي تتضمن بروتينات غير اندماجية تؤدي وظيفة مماثلة ، كما هو موضح في قسم "البروتينات غير الاندماجية" أعلاه ، بالطرق ثلاثية الهجينة.

واحد - اثنان - هجين تحرير

يُعرف الاستخدام المتزامن للطريقتين الهجينتين (أي التفاعل المتزامن بين البروتين والبروتين والبروتين والحمض النووي) بالنهج الهجين واحد أو اثنين ومن المتوقع أن يزيد من صرامة الشاشة. [1]

على الرغم من أنه من الناحية النظرية ، يمكن استخدام أي خلية حية كخلفية لتحليل ثنائي الهجين ، إلا أن هناك اعتبارات عملية تملي الاختيار. يجب أن يكون خط الخلية المختار رخيصًا نسبيًا وسهل الاستزراع وقويًا بما يكفي لتحمل تطبيق طرق التحقيق والكواشف. [1] هذا الأخير مهم بشكل خاص لإجراء دراسات عالية الإنتاجية. لذلك الخميرة S. cerevisiae كان الكائن الحي الرئيسي المضيف لدراستين هجينين. ومع ذلك ، فإنه ليس دائمًا النظام المثالي لدراسة البروتينات المتفاعلة من الكائنات الحية الأخرى. [16] لا تحتوي خلايا الخميرة غالبًا على نفس التعديلات اللاحقة للترجمة ، أو لها استخدام كودون مختلف أو تفتقر إلى بروتينات معينة مهمة للتعبير الصحيح للبروتينات. للتعامل مع هذه المشاكل ، تم تطوير العديد من الأنظمة الجديدة ثنائية الهجين. اعتمادًا على النظام المستخدم ، يتم استخدام لوحات أجار أو وسط نمو معين لتنمية الخلايا والسماح باختيار التفاعل. الطريقة الأكثر شيوعًا هي طريقة طلاء الأجار حيث يتم طلاء الخلايا على وسط انتقائي لمعرفة حدوث التفاعل. يجب ألا تعيش الخلايا التي لا تحتوي على بروتينات تفاعلية على هذا الوسط الانتقائي. [7] [17]

S. cerevisiae (خميرة) تحرير

الخميرة S. cerevisiae كان الكائن الحي النموذجي المستخدم خلال بداية تقنية الهجينين. ومن المعروف عادة باسم نظام Y2H. له العديد من الخصائص التي تجعله كائنًا حيويًا قويًا لاستضافة التفاعل ، بما في ذلك القدرة على تكوين هياكل بروتينية ثلاثية ، ودرجة حموضة داخلية محايدة ، وقدرة معززة على تكوين روابط ثاني كبريتيد والجلوتاثيون منخفض الحالة من بين عوامل عازلة خلوية أخرى ، للحفاظ على مضياف داخلي بيئة. [1] يمكن التلاعب بنموذج الخميرة من خلال تقنيات غير جزيئية ويُعرف تسلسل الجينوم الكامل الخاص به. [1] أنظمة الخميرة تتحمل ظروف الاستزراع المتنوعة والمواد الكيميائية القاسية التي لا يمكن تطبيقها على مزارع أنسجة الثدييات. [1]

تم إنشاء عدد من سلالات الخميرة خصيصًا لشاشات Y2H ، على سبيل المثال Y187 [18] و AH109 ، [19] كلاهما من إنتاج Clontech. كما تم استخدام سلالات الخميرة R2HMet و BK100. [20]

المبيضات البيض يحرر

C. البيض هي خميرة بميزة معينة: فهي تترجم كودون CUG إلى سيرين بدلاً من لوسين. بسبب استخدام الكودون المختلف هذا ، من الصعب استخدام نظام النموذج S. cerevisiae باعتباره Y2H للتحقق من تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام C. البيض الجينات. لتوفير بيئة أكثر أصالة أ C. البيض تم تطوير نظام ثنائي الهجين (C2H). مع هذا النظام يمكن دراسة تفاعلات البروتين والبروتين في C. البيض بحد ذاتها. [21] [22] ومن الإضافات الحديثة إنشاء نظام عالي الإنتاجية. [23] [24] [25]

بكتريا قولونية يحرر

عادة ما يتم تنفيذ طريقتين هجينتين بكتيريتين (B2H أو BTH) في بكتريا قولونية ولديها بعض المزايا مقارنة بالنظم المعتمدة على الخميرة. على سبيل المثال ، زيادة كفاءة التحويل ومعدل نمو أسرع للإقراض بكتريا قولونية لاستخدام مكتبات أكبر (ما يزيد عن 10 8). [2] قد يكون عدم وجود متطلبات لإشارة التوطين النووي التي سيتم تضمينها في تسلسل البروتين والقدرة على دراسة البروتينات التي قد تكون سامة للخميرة من العوامل الرئيسية التي يجب مراعاتها عند اختيار كائن الخلفية التجريبية. [2]

نشاط مثيلة معين بكتريا قولونية قد تتداخل بروتينات ميثيل ترانسفيراز الدنا مع بعض اختيارات البروتين المرتبطة بالحمض النووي. إذا كان هذا متوقعًا ، فإن استخدام ملف بكتريا قولونية قد تكون السلالة المعيبة بالنسبة إلى ميثيل ترانسفيراز معين حلاً واضحًا. [2] قد لا يكون B2H مثاليًا عند دراسة تفاعلات البروتين البروتين حقيقية النواة (مثل البروتينات البشرية) حيث قد لا تنثني البروتينات كما هو الحال في الخلايا حقيقية النواة أو قد تفتقر إلى المعالجة الأخرى.

تحرير خلايا الثدييات

في السنوات الأخيرة ، تم تصميم نظام هجين للثدييات (M2H) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في الثدييات في بيئة خلوية تحاكي عن كثب بيئة البروتين الأصلي. [26] تُستخدم خلايا الثدييات المنقولة بشكل عابر في هذا النظام لإيجاد تفاعلات البروتين والبروتين. [27] [28] يعطي استخدام خط خلية الثدييات لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في الثدييات ميزة العمل في سياق أصلي أكثر. [5] التعديلات اللاحقة للترجمة ، الفسفرة ، الأسيلة والجليكوزيل متشابهة. كما أن توطين البروتينات داخل الخلايا أكثر صحة مقارنة باستخدام نظام هجين من الخميرة. [29] [30] من الممكن أيضًا في نظام الثدييات ثنائي الهجين دراسة مدخلات الإشارة. [31] ميزة كبيرة أخرى هي أنه يمكن الحصول على النتائج في غضون 48 ساعة بعد تعداء الدم. [5]

نبات الأرابيدوبسيس thaliana يحرر

في عام 2005 تم تطوير نظام هجينين في النباتات. باستخدام البروتوبلاست A. thaliana يمكن دراسة تفاعلات البروتين البروتين في النباتات. بهذه الطريقة يمكن دراسة التفاعلات في سياقها الأصلي. في هذا النظام ، يخضع كل من GAL4 AD و BD لسيطرة مروج 35S القوي. يتم قياس التفاعل باستخدام مراسل GUS. من أجل تمكين فحص عالي الإنتاجية ، تم جعل المتجهات متوافقة مع البوابة. يُعرف النظام باسم نظام البروتوبلاست الهجين (P2H). [32]

أبليسيا كاليفورنيكا يحرر

أرنب البحر كاليفورنيكا هو كائن حي نموذجي في علم الأعصاب لدراسة الآليات الجزيئية للذاكرة طويلة المدى من بين أمور أخرى. لدراسة التفاعلات ، وهو أمر مهم في علم الأعصاب ، في بيئة أكثر أصالة ، تم تطوير نظام ثنائي الهجين كاليفورنيكا الخلايا العصبية. يتم استخدام GAL4 AD و BD في هذا النظام. [33] [34]

بومبيكس موري يحرر

تم تطوير نظام حشري ثنائي الهجين (I2H) في خط خلية دودة القز من يرقة أو كاتربيلر لعثة الحرير المستأنسة ، بومبيكس موري (خلايا BmN4). يستخدم هذا النظام GAL4 BD ومجال تنشيط الماوس NF-κB P65. كلاهما تحت سيطرة مروج OpIE2. [35]

تحديد التسلسلات الحاسمة للتفاعل التحرير

عن طريق تغيير الأحماض الأمينية المحددة عن طريق تحور أزواج قواعد الحمض النووي المقابلة في البلازميدات المستخدمة ، يمكن تحديد أهمية بقايا الأحماض الأمينية في الحفاظ على التفاعل. [1]

بعد استخدام الطريقة القائمة على الخلايا البكتيرية لاختيار البروتينات المرتبطة بالحمض النووي ، من الضروري التحقق من خصوصية هذه المجالات حيث يوجد حد لمدى قدرة جينوم الخلية البكتيرية على العمل كمغسلة للمجالات التي لها صلة بالآخر. متواليات (أو في الواقع ، تقارب عام للحمض النووي). [2]

تحرير اكتشاف الأدوية والسموم

تشكل تفاعلات إشارات البروتين والبروتين أهدافًا علاجية مناسبة نظرًا لخصوصيتها وانتشارها. يستخدم نهج الاكتشاف العشوائي للعقاقير بنوكًا مركبة تتكون من هياكل كيميائية عشوائية ، وتتطلب طريقة عالية الإنتاجية لاختبار هذه الهياكل في هدفها المقصود. [1] [17]

يمكن تصميم الخلية المختارة للتحقيق بشكل خاص لتعكس الجانب الجزيئي الذي ينوي المحقق دراسته ثم استخدامها لتحديد علاجات بشرية أو حيوانية جديدة أو عوامل مضادة للآفات. [1] [17]

تحديد وظيفة البروتين تحرير

من خلال تحديد شركاء التفاعل لبروتينات غير معروفة ، يمكن استنتاج الوظائف المحتملة لهذه البروتينات الجديدة. [1] يمكن القيام بذلك باستخدام بروتين واحد معروف مقابل مكتبة من البروتينات غير المعروفة أو العكس ، عن طريق الاختيار من مكتبة البروتينات المعروفة باستخدام بروتين واحد غير معروف الوظيفة. [1]

تحرير اختيار بروتين إصبع الزنك

لاختيار بروتينات إصبع الزنك (ZFPs) لهندسة البروتين ، تم استخدام الطرق التي تم تكييفها من تقنية الفحص الهجين الثنائي بنجاح. [2] [3] A ZFP هو في حد ذاته بروتين مرتبط بالحمض النووي يُستخدم في بناء مجالات ربط الحمض النووي المخصصة التي ترتبط بتسلسل DNA المطلوب. [36]

باستخدام جين اختيار مع التسلسل المستهدف المطلوب المتضمن في UAS ، وعشوائية تسلسل الأحماض الأمينية ذات الصلة لإنتاج مكتبة ZFP ، يمكن اختيار الخلايا التي تستضيف تفاعل DNA-ZFP مع الخصائص المطلوبة. يتعرف كل ZFP عادةً على 3 إلى 4 أزواج أساسية فقط ، لذلك لمنع التعرف على المواقع خارج UAS ، يتم تصميم ZFP العشوائي في "سقالة" تتكون من وحدتي ZFP آخرتين من التسلسل الثابت. وهكذا تم تصميم UAS ليشمل التسلسل المستهدف للسقالة الثابتة بالإضافة إلى التسلسل الذي يتم اختيار ZFP من أجله. [2] [3]

يمكن أيضًا فحص عدد من مجالات ربط الحمض النووي الأخرى باستخدام هذا النظام. [2]

  • شاشتان هجينة ذات تقنية منخفضة ويمكن تنفيذها في أي معمل بدون معدات متطورة.
  • يمكن أن توفر شاشتان هجينة تلميحًا أوليًا مهمًا لتحديد شركاء التفاعل.
  • الفحص قابل للتطوير ، مما يجعل من الممكن فحص التفاعلات بين العديد من البروتينات. علاوة على ذلك ، يمكن أتمتة ذلك ، وباستخدام الروبوتات ، يمكن فحص العديد من البروتينات ضد آلاف البروتينات التي يحتمل تفاعلها في وقت قصير نسبيًا. يتم استخدام نوعين من الشاشات الكبيرة: نهج المكتبة ونهج المصفوفة.
  • يمكن أن تكون بيانات الخميرة ثنائية الهجين ذات جودة مماثلة للبيانات الناتجة عن النهج البديل لتنقية التقارب متبوعًا بقياس الطيف الكتلي (AP / MS). [37] [9]
  • يتمثل النقد الرئيسي المطبق على شاشة الخميرة ثنائية الهجين لتفاعلات البروتين والبروتين في احتمال وجود عدد كبير من التعريفات الإيجابية الزائفة (والسلبية الكاذبة). المعدل الدقيق للنتائج الإيجابية الكاذبة غير معروف ، لكن التقديرات السابقة كانت تصل إلى 70٪. هذا أيضًا ، جزئيًا ، يفسر التداخل الصغير جدًا الذي غالبًا ما يتم العثور عليه في النتائج عند استخدام الفرز ثنائي الهجين (الإنتاجية العالية) ، خاصة عند استخدام أنظمة تجريبية مختلفة. [9] [28]

يكمن سبب ارتفاع معدل الخطأ في خصائص الشاشة:

  • تفرط بعض متغيرات الفحص في التعبير عن بروتينات الاندماج التي قد تسبب تركيزات غير طبيعية للبروتين تؤدي إلى نتائج إيجابية غير محددة (خاطئة).
  • البروتينات الهجينة عبارة عن بروتينات اندماجية ، أي أن الأجزاء المندمجة قد تمنع تفاعلات معينة ، خاصة إذا حدث تفاعل عند الطرف N لبروتين اختبار (حيث يتم إرفاق مجال ربط أو تنشيط الحمض النووي عادةً).
  • قد لا يحدث تفاعل في الخميرة ، الكائن المضيف النموذجي لـ Y2H. على سبيل المثال ، إذا تم اختبار بروتين بكتيري في الخميرة ، فقد يفتقر إلى مساعد لطي مناسب موجود فقط في مضيفه البكتيري. علاوة على ذلك ، في بعض الأحيان لا يتم تعديل بروتين الثدييات بشكل صحيح في الخميرة (على سبيل المثال ، الفسفرة المفقودة) ، مما قد يؤدي أيضًا إلى نتائج خاطئة.
  • يحدث Y2H في النواة. إذا لم يتم توطين بروتينات الاختبار في النواة (لأن لها إشارات توطين أخرى) ، فيمكن العثور على بروتينين متفاعلين غير متفاعلين.
  • قد تتفاعل بعض البروتينات على وجه التحديد عندما يتم التعبير عنها بشكل مشترك في الخميرة ، على الرغم من أنها في الواقع لا توجد أبدًا في نفس الخلية في نفس الوقت. ومع ذلك ، في معظم الحالات لا يمكن استبعاد أن مثل هذه البروتينات يتم التعبير عنها بالفعل في خلايا معينة أو في ظل ظروف معينة.

كل من هذه النقاط وحدها يمكن أن تؤدي إلى نتائج خاطئة. نظرًا للتأثيرات المشتركة لجميع مصادر الخطأ ، يجب تفسير الخميرة ثنائية الهجين بحذر. يعني احتمال توليد إيجابيات خاطئة أنه يجب تأكيد جميع التفاعلات من خلال مقايسة عالية الثقة ، على سبيل المثال الترسيب المناعي المشترك للبروتينات الداخلية ، وهو أمر صعب بالنسبة لبيانات تفاعل البروتين والبروتين على نطاق واسع. بدلاً من ذلك ، يمكن التحقق من بيانات Y2H باستخدام متغيرات Y2H متعددة [38] أو تقنيات المعلوماتية الحيوية. الاختبار الأخير ما إذا كان يتم التعبير عن البروتينات المتفاعلة في نفس الوقت ، أو تشترك في بعض الميزات المشتركة (مثل التعليقات التوضيحية لعلم الجينات أو بعض طوبولوجيا الشبكة) ، لها تفاعلات متماثلة في الأنواع الأخرى. [39]


خطوط الخلايا لتعبير البروتين المؤتلف

نظرًا لقدراتها على تخليق البروتين ، أصبحت خطوط الخلايا حقيقية النواة ضرورية لعملية إنتاج البروتينات المؤتلفة. قدرتها على مساعدة التعديلات المعقدة بعد الترجمة (الارتباط بالجليكوزيل ، الفسفرة) ، طي البروتين ، والتجميع الجزيئي تفوق الأنظمة الأخرى. يبدأ إنتاج البروتين المؤتلف بهندسة ناقلات التعبير وترنسفكأيشن في النظام المضيف ، ويتبع ذلك اختيار الخلية والاستنساخ والفحص والتقييم. من أجل تلبية متطلبات الجودة وقابلية التوسع ، يحتاج الباحثون الذين ينتجون بروتينًا مؤتلفًا إلى مضيفات تعبير فعالة من حيث التكلفة وفعالة

خلايا الثديات

يجب استخدام خلايا الثدييات في كثير من الأحيان لإنتاج البروتينات المؤتلفة مع التعديلات الصحيحة اللاحقة للترجمة.وجدت البروتينات المؤتلفة من خلايا الثدييات استخدامها في علاجات الأمراض من مرض السكري إلى السرطان ، مما يغير مشهد الرعاية الصحية. أدت هذه الإمكانات الهائلة إلى استكشاف أنظمة الثدييات المختلفة لاستضافة وإفراز البروتينات المؤتلفة. حاليًا ، تُستخدم خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) وخلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK 293) بشكل تفضيلي للأسباب التالية:

  • كثافة خلايا عالية في المزرعة المعلقة وإنتاج عائد بروتين عالي
  • تعداء أكثر نجاحًا
  • البقاء على قيد الحياة في وسائل الإعلام الخالية من المصل
  • سلالات مختلفة متاحة للتكامل المستهدف للجينات المحورة
  • تقليل خطر الإصابة بعدوى فيروسية

يتم اختيار خطوط خلايا الثدييات المثلى من خلال النظر في الإنتاجية والنشاط الحيوي والغرض والخصائص الفيزيائية والكيميائية للبروتين محل الاهتمام. تدعم خطوط خلايا الثدييات الخاصة بنا فحص الإنشاءات على نطاق صغير ، فضلاً عن الإنتاج السريع للبروتين بمقياس مليغرام.

خلايا الحشرات

تُستخدم منصات التعبير عن الحشرات على نطاق واسع لإنتاج البروتينات المؤتلفة للدراسات الهيكلية ، وهي غير مكلفة وقابلة للتطوير وأقل تطلبًا من خلايا الثدييات. يمكن زراعة هذه الخلايا في قوارير دوارة أو شاكر ولا تتطلب ثاني أكسيد الكربون2- أجواء ثرية. قد تنتج خطوط الخلايا الحشرية الراسخة بروتينات مؤتلفة ذات عوائد عالية وتتطلب أحجام استنبات أصغر.

الميزات الرئيسية لمنصات التعبير عن الحشرات

  • تشقق الببتيدات الإشارة كما هو الحال في أنظمة الثدييات
  • تشكلت روابط ثاني كبريتيد في الشبكة الإندوبلازمية
  • إنزيمات تحويل البروتين المتاحة للمعالجة المحللة للبروتين
  • تكوين غشاء مشابه لأنظمة الثدييات

وسائل الإعلام الحرة المكونة للحيوان

تتطلب تقنيات زراعة الخلايا التقليدية مصل حيواني بتركيزات تصل إلى 20٪ من إجمالي حجم المزرعة. بناءً على المخاوف المتعلقة بالعوامل العرضية التي توجد أحيانًا في المصل المشتق من الحيوانات ، أصبحت الوسائط الخالية من المصل مفضلة في إنتاج البروتين المؤتلف للاستخدام العلاجي. يتضمن عرضنا لخطوط خلايا الثدييات تلك التي يمكن تربيتها في وسائط خالية من المكونات الحيوانية.


الأسس العلمية للتكنولوجيا الحيوية

الملخص

يتم استغلال زراعة خلايا الثدييات على نطاق واسع لإنتاج البروتين المؤتلف (rP) ، وقد تم التركيز بشكل كبير على تعزيز الإنتاجية الخاصة بالخلية وبالتالي إنتاجية البروتين من أنظمة التعبير هذه. ضمن مسار التعبير الجيني المؤتلف ، تعد ترجمة الرنا الرسول (mRNA) نقطة تحكم رئيسية. تعد ترجمة mRNA إلى بروتين عملية معقدة متعددة الخطوات ضرورية لبقاء الخلية ووظيفتها. يتم الحفاظ على دقة الترجمة من خلال العديد من المسارات المنظمة بإحكام ، مما يسمح بالتعبير العالمي للبروتين ونمو الخلايا في ظل ظروف مواتية ويمنع إنتاج البروتينات غير الضرورية للاستجابة الخلوية عند مواجهة ظروف الإجهاد. خلال الثقافة ، تتعرض الخلايا المنتجة لـ rP لمجموعة متنوعة من الضغوط مع القدرة على الحد من ترجمة mRNA وبالتالي إنتاج البروتين النهائي. تم التحقيق في عدد من الأساليب بهدف زيادة الإنتاجية الحجمية ، وكثير منها ، عن قصد أو عن غير قصد ، يقوم في النهاية بتعديل الترجمة. هنا ، نلخص تنظيم ومعالجة ترجمة mRNA والآلية الانتقالية في خلايا الثدييات بالمعنى التكنولوجي الحيوي ووصف الآثار المترتبة على rP.


أنظمة التعبير الحر للخلايا

في أنظمة التعبير الخالية من الخلايا ، يتم تجميع البروتينات في المختبر باستخدام المكونات النقية لآلات النسخ والترجمة. وتشمل هذه الريبوسومات ، RNA polymerase ، tRNAs ، ribonucleotides والأحماض الأمينية. تعتبر أنظمة التعبير الخالية من الخلايا مثالية للتجميع السريع لأكثر من بروتين واحد في تفاعل واحد. الميزة الرئيسية لنظام هذه الأنظمة هي قدرتها على تجميع البروتينات مع الأحماض الأمينية الموصوفة أو المعدلة والتي تكون مفيدة في تطبيقات المصب المختلفة. ومع ذلك ، فإن أنظمة التعبير الخالية من الخلايا باهظة الثمن وصعبة للغاية من الناحية الفنية في الاستخدام.

أليسا دي سيتشيتيللي عالمة في Addgene. حصلت على درجة الدكتوراه من جامعة نورث إيسترن وهي مهتمة بشكل خاص بالإشارات الخلوية والتواصل. تحب أن تكون قادرة على مساعدة المجتمع العلمي في مشاركة اللازميدات.


علامات التقارب لتنقية البروتين

تتمثل إحدى طرق عزل بروتين معين أو شل حركته في استخدام علامات التقارب. تم تطوير العديد من علامات التقارب المختلفة (Terpe ، 2002). علامات الانصهار هي عديد ببتيدات أو بروتينات صغيرة أو إنزيمات مضافة إلى الطرف N أو C للبروتين المؤتلف.

بولي هيستيدين

الوسم الأكثر شيوعًا هو علامة polyhistidine (Yip et al. 1989). تنقية البروتين باستخدام علامة polyhistidine تعتمد على تقارب بقايا الهيستيدين للمعدن الثابت مثل النيكل (Yip et al. 1989 Hutchens and Yip ، 1990). يُعتقد أن تفاعل التقارب هذا ناتج عن تنسيق النيتروجين على جزء إيميدازول من متعدد الهيستيدين مع موقع تنسيق شاغر على المعدن. يتم تثبيت المعدن إلى دعامة من خلال تشكيل معقد مع مخلّب يتم ربطه تساهميًا بالدعم.

توفر علامات Polyhistidine العديد من المزايا لتنقية البروتين. الحجم الصغير لعلامة polyhistidine يجعلها أقل مناعة من العلامات الأكبر الأخرى. لذلك ، لا يلزم عادةً إزالة العلامة للتطبيقات النهائية بعد التنقية. يمكن وضع علامة متعدد الهيستيدين على الطرف N أو C للبروتين محل الاهتمام. أخيرًا ، لا يعتمد تفاعل علامة polyhistidine مع المعدن على البنية الثلاثية للعلامة ، مما يجعل من الممكن تنقية البروتينات غير القابلة للذوبان بطريقة أخرى باستخدام ظروف تغيير الطبيعة.

الجلوتاثيون- S- ترانسفيراز

يعتمد استخدام علامة التقارب الجلوتاثيون- S- ترانسفيراز (GST) على التقارب القوي لـ GST للمصفوفات المغطاة بالجلوتاثيون المعطلة (سميث وجونسون ، 1988). الجلوتاثيون- S- ترانسالات هي عائلة من البروتينات الخلوية متعددة الوظائف الموجودة في الكائنات حقيقية النواة (Mannervik and Danielson، 1988 Armstrong، 1997). لا توجد الأشكال الإسوية لـ GST بشكل طبيعي في البكتيريا وبالتالي لا تتنافس البروتينات البكتيرية الذاتية مع بروتينات الانصهار GST للارتباط براتنج التنقية. تعزز علامة التقارب 26kDa GST قابلية ذوبان العديد من البروتينات حقيقية النواة التي يتم التعبير عنها في البكتيريا.

علامة HaloTag & Reg Protein

تُستخدم علامات اندماج البروتين للمساعدة في التعبير عن المستويات المناسبة من البروتين القابل للذوبان وكذلك التنقية. تم تصميم علامة البروتين الفريدة ، بروتين HaloTag & reg ، لتعزيز التعبير وقابلية الذوبان للبروتينات المؤتلفة في بكتريا قولونية. علامة بروتين HaloTag & reg هي علامة بروتين أحادية 34kDa معدلة من رودوكوكس رودوكروس ديهالوجيناز.

تم تصميم بروتين HaloTag® للارتباط السريع والمساهمي برابط اصطناعي فريد لتحقيق ارتباط لا رجوع فيه. يمكن ربط الرابط الاصطناعي بمجموعة متنوعة من الكيانات مثل الأصباغ الفلورية والدعامات الصلبة للسماح بوضع العلامات على بروتينات الاندماج في محللات الخلية لفحص التعبير والتقاط بروتينات الاندماج على راتينج التنقية.

تتوافق تقنية HaloTag® مع العديد من أنظمة التعبير عن البروتين ويمكن تطبيقها على البروتينات المعبر عنها بـ بكتريا قولونيةوخلايا الثدييات والأنظمة الخالية من الخلايا.

تقنية HaloTag®

HaloTag هي تقنية قوية لها تطبيقات لتنقية البروتين ، وتوطين البروتين ، والاتجار به ودورانه بالإضافة إلى تفاعلات البروتين والفحص المجهري فائق الدقة.

يقلل عدم وجود مكافئ داخلي لبروتين HaloTag® في خلايا الثدييات من فرص اكتشاف الإيجابيات الزائفة أو التفاعلات غير المحددة. يتغلب الجمع بين الالتقاط التساهمي وحركية الربط السريع على القيود القائمة على التوازن المرتبطة بعلامات التقارب التقليدية ويتيح الالتقاط الفعال حتى عند مستويات التعبير المنخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح بروتين HaloTag® عالي الاستقرار: تفاعل الترابط بغليان مركب البروتين في المخزن المؤقت لعينة SDS قبل تحليل SDS-PAGE.

الشكل 1. وظيفة قابلة للتبديل لعلامة بروتين HaloTag®. تتشكل الرابطة التساهمية بين بروتين الانصهار HaloTag® والرابط التفاعلي HaloTag® Ligand في ظل الظروف الفسيولوجية العامة. هذا التفاعل محدد للغاية ولا رجوع فيه. تتوفر روابط HaloTag® Ligands المختلفة بوظائف مختلفة للتخلص من الحاجة إلى تصميم وإنشاء بنية تعبيرية جديدة.


وضع التكنولوجيا الحيوية في العمل: هندسة العمليات الحيوية (1992)

يمكن تصنيف المنتجات والخدمات التي تعتمد على المعالجة الحيوية على نطاق واسع في

المستحضرات الصيدلانية الحيوية. البروتينات العلاجية والسكريات المتعددة واللقاحات والتشخيصات.

المنتجات المتخصصة والكيماويات الصناعية. المضادات الحيوية والمنتجات الغذائية والزراعية ذات القيمة المضافة والوقود والمواد الكيميائية والألياف من الموارد المتجددة.

مساعدات الإدارة البيئية. منتجات وخدمات المعالجة الحيوية المستخدمة للتحكم في النفايات السامة أو معالجتها.

يستعرض هذا الفصل حالة المعالجة الحيوية لتصنيع المنتجات في فئات ذات صلة بالسنوات العشر القادمة. الكثير من الخلفية ذات الصلة مستمدة من تقرير مكتب تقييم التكنولوجيا التكنولوجيا الحيوية في الاقتصاد العالمي (أوتا ، 1991).

4.1 المستحضرات الصيدلانية الحيوية

يظهر نجاح التكنولوجيا الحيوية في تأثير المنتجات والعمليات الجديدة. تشمل المنتجات العلاجات الحيوية والمواد الكيميائية المتخصصة والكواشف. مثل التشخيصات والكيماويات الحيوية للأبحاث والإنزيمات للأغذية وأسواق المستهلكين. الغرض من هذا القسم هو فحص حالة المعالجة الحيوية للمستحضرات الصيدلانية الحيوية ، بما في ذلك حالة البحث الحالي والاحتياجات والفرص التي تشكل الابتكار في المعالجة الحيوية لتصنيع منتجات العلاج الحيوي. العلاجات الحيوية تشمل البروتينات العلاجية واللقاحات والسكريات العلاجية والتشخيصات والمواد الكيميائية الصيدلانية منخفضة الوزن الجزيئي.

أحدث تطوير تقنيات الحمض النووي المؤتلف والورم الهجين ثورة في مجموعة المنتجات الصيدلانية المتاحة. على عكس العلاجات التقليدية ، فإن المستحضرات الصيدلانية التي تنتجها التقنيات الجديدة هي في الأساس منتجات بروتينية تشمل الأنسولين وهرمون النمو و ampx97-interferon والجسم المضاد أحادي النسيلة OKT-3 ومنشط البلازمينوجين النسيجي ولقاح التهاب الكبد والإريثروبويتين. مع توفر كميات كبيرة من هذه المنتجات ، يتم اكتشاف تطبيقات سريرية جديدة. على سبيل المثال ، تم اكتشاف أن هرمون النمو فعال في التئام الجروح ، بالإضافة إلى علاج التقزم النخامي.

على الرغم من أن المتطلبات التنظيمية للسلامة والفعالية تؤدي إلى تأخيرات طويلة في الموافقة على بيع منتجات العلاج الحيوي ، فقد تمت الموافقة على 15 منتجًا في الولايات المتحدة بحلول نهاية عام 1991 (الجدول 4.1). تتراوح تقديرات المبيعات السنوية من 3 إلى 5 مليار دولار أمريكي لعام 1991 وتشكل حوالي 7 & ndash10٪ من إجمالي مبيعات الأدوية الأمريكية. ومن الجدير بالذكر الزيادة التي تزيد عن 10٪ في المبيعات السنوية للمعالجات الحيوية الموجودة والعدد الكبير (158) من المنتجات قيد التجارب السريرية (الجدولان 4.2 و 4.3) مع توقع الموافقة على عدد كبير للاستخدام العلاجي . من الواضح أن العلاجات الحيوية لها دور مهم في تحسين الرعاية الصحية للإنسان. السؤال المهم الذي يجب تناوله هنا هو: ما هي الاحتياجات التكنولوجية في العقد القادم المتعلقة بتسهيل تصنيع وتسويق المنتجات الناشئة عن التكنولوجيا الحيوية؟ لمعالجة هذا السؤال ، نحتاج أولاً إلى فحص وفهم الحالة الحالية للمعالجة الحيوية.

4.1.1 البروتينات من الكائنات الدقيقة المؤتلفة

أسفرت الأبحاث المكثفة حول التعبير الجيني حقيقيات النوى في البكتيريا والخمائر والنباتات والحشرات والثدييات عن العديد من الخيارات لإنتاج البروتينات في العوائل المؤتلفة. على الرغم من الخيارات العديدة ، فإن معظم المنتجات المصنعة اليوم مصنوعة إما في المؤتلف بكتريا قولونية أو في الخلايا الحيوانية ، أي خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) أو خلايا الورم الهجين.

بكتريا قولونية هو النظام الجرثومي المفضل للتعبير عن البروتينات غير المتجانسة. لا يتم استخدام أي كائن حي دقيق آخر لإنتاج عدد كبير جدًا من المنتجات على مستوى عالٍ. تمثل المستويات النموذجية للبروتين الأجنبي المعبر عنها 10 & ndash30٪ من إجمالي البروتين الخلوي. تقدم سريع في تطوير بكتريا قولونية كمضيف للتعبير الجيني الأجنبي يرجع بشكل أساسي إلى بكتريا قولونيةلقد كان محور الدراسة المكثفة على مدى السنوات الخمسين الماضية في المختبرات الأكاديمية. لقد سهلت مجموعة المعرفة التي تراكمت من تكيف هذه البكتيريا للتعبير عن البروتين الأجنبي. كانت نواقل الاستنساخ المتطورة ، وأدوات التعبير الجيني المنظم ، والمعرفة حول عملية إفراز البروتين وفسيولوجيا النمو متاحة في بكتريا قولونية، وأصبح الخيار المنطقي للتعبير الجيني غير المتجانسة.

الجدول 4.1 الأدوية واللقاحات المعتمدة في مجال التكنولوجيا الحيوية

نيوبوجين ب عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة G-CSF

هوماتروب وريج ب أصل Somatotropin rDNA للحقن

إيلي ليلي إنديانابوليس ، إن

نقص هرمون النمو البشري عند الأطفال

Humulin & reg هو الأنسولين البشري rDNA

إيلي ليلي إنديانابوليس ، إن

Actimmune ب انترفيرون جاما 1-ب

جينينتيك سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا

العدوى / مرض الورم الحبيبي المزمن

Activase & reg Alteplase ، أصل rDNA

جينينتيك سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا

فشل قلبي حاد

بروتروبين وريج ب سوماتريم للحقن

جينينتيك سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا

نقص هرمون النمو البشري عند الأطفال

روفيرون وريج أ ب إنترفيرون ألفا -2 أ (مؤتلف / روش)

هوفمان لاروش نوتلي ، نيوجيرسي

سرطان الدم مشعر الخلايا ساركوما كابوزي المرتبطة بالإيدز

ليوكين ب عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الضامة المحببة GM-CSF

العدوى المرتبطة بزراعة نخاع العظام

لقاح Recombivax HB & reg لالتهاب الكبد B (المؤتلف MSD)

Orthoclone OKT & reg 3 Muromonab CD3

رفض زرع الكلى

فقر الدم المرتبط بالإيدز فقر الدم قبل غسيل الكلى

لقاح Hib Titer TM Haemophilus B المتقارن

براكسيس بيولوجيكس روتشستر ، نيويورك

المستدمية نوع ب

Intron & reg أ ب الانترفيرون alpha2b

شيرينغ بلو ماديسون ، نيوجيرسي

الثآليل التناسلية ساركوما كابوزي المرتبطة بالإيدز

لقاح Energix-B Hepatitis B (المؤتلف)

سميث كلاين بيتشام فيلادلفيا ، بنسلفانيا

أ الإيرادات الأمريكية المقدرة بملايين الدولارات.

ب يتيم المخدرات. NA = لا ينطبق.

الجدول 4.2 الشروط الخاصة بالأدوية المشتقة من التكنولوجيا الحيوية قيد التطوير

مجمع الإيدز والإيدز (ARC)

إصابة ضخه المرتبطة باحتشاء عضلة القلب وزرع الكلى

فقر الدم الثانوي لأمراض الكلى ، الإيدز ، الخدج ، العلاج الكيميائي ، التهاب المفاصل الروماتويدي

تقرحات الأنسجة الرخوة المزمنة

اضطرابات التغذية والنمو

التهاب الكبد B ، التهاب الكبد non-A و non-B

رفض زراعة القلب والكبد

الحاجة إلى إنضاج عنق الرحم لتسهيل الولادة

الجدول 4.3 مؤشرات إضافية للأدوية المعتمدة

فقر الدم الناتج عن غسيل الكلى وفقر الدم المرتبط بالإيدز

نقل الدم الذاتي ، الخداج ، التهاب المفاصل الروماتويدي ، العلاج الكيميائي

منشط الأنسجة البلازمينوجين

فشل قلبي حاد

تجلط الأوردة العميقة ، السكتة الدماغية الحادة ، الانسداد الرئوي

ابيضاض الدم مشعر الخلايا ، ساركوما كابوزي المرتبطة بالإيدز ، التهاب الكبد سي

السرطان ، والأمراض المعدية ، والهربس التناسلي ، وسرطان القولون والمستقيم ، والتهاب الكبد المزمن والحاد B ، وسرطان الدم النقوي المزمن ، والأورام الخبيثة في المعدة ، و ARC إيجابي فيروس نقص المناعة البشرية ، والإيدز

ابيضاض الدم مشعر الخلايا ، الثآليل التناسلية ، ساركوما كابوزي المرتبطة بالإيدز

الهربس التناسلي ، وسرطان المثانة السطحي ، وسرطان الخلايا القاعدية ، والتهاب الكبد المزمن والحاد B ، والتهاب الكبد non-A non-B ، والتهاب الكبد دلتا ، وسرطان الدم النقوي المزمن ، وفيروس نقص المناعة البشرية

التعبير في بكتريا قولونية يمكن تصميمه الآن إما من أجل التراكم داخل الخلايا للبروتين غير المتجانسة في الفضاء السيتوبلازمي أو نقل البروتين عبر الغشاء السيتوبلازمي من الفضاء السيتوبلازمي إلى الفضاء المحيط بالبروتين. بعد الانتقال ، يمكن للبروتين أن يتراكم داخل الحيز المحيط أو قد يتم إطلاقه إلى الوسط المحيط. إذا تم إفراز البروتين وتراكمه داخل الفضاء السيتوبلازمي ، فإنه يتجمع عادة في أجسام تضمين كبيرة مرئية بواسطة مجهر ضوئي. يجب عزلها وذوبانها وطيها للحصول على جزيء نشط. يعتبر العزل والذوبان أمرًا روتينيًا ، ولكن الطي إلى شكل نشط أمر صعب مع التكنولوجيا الحالية. غالبًا ما يكون للتراكم داخل الخلايا عيب إضافي يتمثل في إنتاج مادة تحتوي على حمض أميني إضافي على الطرف N للبروتين.

تتوفر الآن العديد من تسلسلات الإشارات لدفع إفراز البروتينات حقيقية النواة عبر الغشاء السيتوبلازمي البكتيري. في بعض الأحيان ، ينتج عن ذلك تكوين بروتينات نشطة بيولوجيًا مطوية بشكل صحيح. ومع ذلك ، في كثير من الأحيان ، تتراكم البروتينات المفرزة أيضًا في شكل تكتلات

الفضاء المحيطي مرة أخرى ، من الضروري عزل البروتينات وحلها وطيها لتكوينها الصحيح. ربما يكون التطبيق الأكثر إثارة لإفراز البروتينات من بكتريا قولونية لقد أثبتت القدرة على إنتاج شظايا فاب نشطة (الجزء المرتبط من الأجسام المضادة) مباشرة سيكون لها مجموعة متنوعة من الاستخدامات مثل كواشف الفحص ، وروابط الانجذاب المناعي ، والعلاجات.

لكل من البروتينات حقيقية النواة داخل الخلايا والمفرزة ، التحلل البروتيني في بكتريا قولونية انها مشكله. تم اتباع العديد من الأساليب لتقليل تحلل البروتينات غير المرغوب فيها ، بما في ذلك التعبير عن بروتينات الاندماج والقضاء على بروتياز معين عن طريق طفرة الخلية المضيفة. كان النهج الأخير مفيدًا ، ولكن من المتوقع أن يؤثر الإزالة المستمرة للبروتياز على التمثيل الغذائي الخلوي العام بشكل سلبي. كانت الترجمة الخاطئة أيضًا مشكلة عرضية ، لكن التكنولوجيا المنشورة موجودة الآن لتقليلها.

في تلخيص، بكتريا قولونية كان التعبير عن البروتينات حقيقية النواة بمثابة "العمود الفقري" الهام لإنتاج بروتينات rDNA. تنمو الخلايا وتعبر عن بروتينات rDNA بسرعة وبكميات عالية. كما يتم تعديلها بسهولة وراثيًا وتتطلب عمومًا وسائط نمو غير مكلفة. ومع ذلك ، غالبًا ما يكون النظام مقيدًا بسبب عدم قدرته على إنتاج بروتينات سليمة ومطوية بشكل صحيح وقدرته المحدودة على إنتاج تعديلات ما بعد الترجمة ، مثل الارتباط بالجليكوزيل وتعديل التحلل المحدد للبروتين. ومع ذلك ، فقد مكّن النظام من تسويق منتجات مثل الأنسولين البشري وهرمون النمو البشري والإنسولين وألفا إنترفيرون والإنسولين وجاما إنترفيرون.

4.1.2 الهيئات إدراج

تم الحصول على مستويات عالية من تخليق البروتين مع العديد من أنظمة التعبير داخل الخلايا ، لا سيما في بكتريا قولونية. ارتفاع التعبير عن بروتين غريب في سيتوبلازم بكتريا قولونية غالبًا ما يؤدي إلى تراكم مجاميع غير محلية تسمى هيئات التضمين. أصبح عزل الأجسام المتضمنة عن طريق الطرد المركزي خطوة أولى مهمة في تنقية واستعادة البروتينات المؤتلفة.

كشفت دراسات كيمياء البروتين المكثفة عن معلومات أساسية جوهرية حول آلية تكوين الجسم الشامل. تم تحديد العديد من عوامل الذوبان (Chaotropes القوية ، والمنظفات ، والمذيبات العضوية) لاستخدامها في استعادة البروتينات النشطة ، تتطلب العملية كشف البروتين بمواد مبطنة قوية وإعادة الطي إلى مونومر نشط.

تشير الدراسات التي أجريت على إعادة تشكيل البروتينات المشوهة في المختبر وفي الجسم الحي إلى أن الركام مشتق من مواد وسيطة محددة مطوية جزئيًا وليس من بروتينات أصلية ناضجة أو بروتينات مكشوفة بالكامل (Mitraki and King ، 1989). ركزت تلك الاكتشافات الانتباه على خصائص وسيطة-

ates (متميزًا عن الحالات الأصلية) والعوامل التي تتفاعل معها ، مثل البيئة السيتوبلازمية داخل الخلايا ، والعوامل المساعدة ، والمرافقين الجزيئي.

تم التعرف على المرافقات الجزيئية لأول مرة على أنها بروتينات مضيفة ضرورية لتشكل الملتهمة وتم تحديدها مؤخرًا على أنها بروتينات صدمة حرارية (Goloubinoff et al. ، 1989). في مراجعة حديثة (بيلهام ، 1986) ، تم اقتراح أن بروتينات الصدمة الحرارية يمكن أن تعمل كمرافق جزيئية وتمنع التجميع عن طريق الارتباط بمناطق كارهة للماء لسلاسل متعددة الببتيد غير مطوية جزئيًا. على أساس هذه الاكتشافات الأساسية ، تجري الدراسات لتقليد آليات تخليق البروتين في الثدييات (التجزء ، تفاعلات البروتينات ، والتعديلات اللاحقة للترجمة) في البكتيريا. مع الاختيار العقلاني للخصائص اللازمة للنضج الصحيح ، قد يكون من الممكن توجيه مصير الوسطاء نحو التشكل الأصلي. بدلاً من ذلك ، قد يكون من الممكن استخدام المرافق الجزيئية لإصلاح وتفكيك البروتينات خارج الخلية قبل إطلاقها لإعادة تشكيلها إلى المونومر النشط.

4.1.3

أنظمة مضيف الثدييات

عادةً ما يستخدم إنتاج البروتينات غير المتجانسة بواسطة خلايا الثدييات خلايا CHO أو خلايا الورم الهجين. في البداية ، كانت خلايا الورم الهجين هي المضيف الوحيد المستخدم لإنتاج الأجسام المضادة. في الآونة الأخيرة ، تم أيضًا استخدام خلايا CHO وخلايا المايلوما الفأرية. بشكل عام ، تكون خلايا CHO قادرة على إنتاج بروتينات ثدييات نشطة بيولوجيًا يتم معالجتها بالجليكوزيلات ومطوية بشكل صحيح. حتى الآن ، غالبًا ما يكون النظام غير قادر على إحداث نضج محدد للبروتين ، باستثناء إزالة تسلسل إشارة الإفراز.

على الرغم من أن الجزيئات النشطة بيولوجيًا تتشكل عادةً بواسطة خلايا C H O ، فإن المنتج عبارة عن مزيج من العديد من الأشكال الفرعية التي تختلف في درجة الارتباط بالجليكوزيل والشحنة الكهروستاتيكية ووجود مقاطع التحلل البروتيني والتعديلات الأخرى الممكنة. لا تؤثر التعديلات بالضرورة على فاعلية المنتج أو سلامته ، ولكن من الضروري أن يتم التحكم في العملية بعناية لضمان إنتاج نفس المتغيرات الجزيئية من كل دفعة.

تتميز خلايا الثدييات بقدرتها على إنتاج جزيئات معقدة نشطة بيولوجيًا. ومع ذلك ، فإنهم ينمون ويعبرون عن البروتينات بمعدل واحد على عشرين تقريبًا بكتريا قولونية. هذا له تأثير في زيادة تكاليف رأس المال والعمالة لإنتاج البروتين. تتطلب الخلايا أيضًا وسائط باهظة الثمن (على الرغم من الجهود الجارية لتقليل هذه التكاليف) ولديها مخاوف إضافية ، على الرغم من إمكانية تتبعها ، والتنظيم والسلامة ، مثل القلق بشأن التلوث الفيروسي غير المكتشف. على الرغم من هذه القيود ، فإن إنتاج خلايا CHO للمستحضرات الصيدلانية الحيوية هو تقنية راسخة وهامة مكنت من تقديم علاجات مهمة مثل منشط البلازمينوجين النسيجي والإريثروبويتين.

4.1.4 مضيفات أخرى للتعبير الجيني غير المتماثل

العديد من الأنظمة الجديدة لإنتاج البروتينات غير المتجانسة قيد التطوير. وهي تشمل أنظمة بكتيرية جديدة مثل عصية و ستربتوميسيس، الفطريات الخيطية ، خطوط خلايا الحشرات ذبابة الفاكهة والأنظمة التي تعتمد على نظام التعبير عن الفيروسات الباكية ، Xenopus oo-cytesوالخميرة. على الرغم من أنه لم يتم تطوير أي منها أو تمت دراستها على نطاق واسع بكتريا قولونية، لكل منها مزاياه وعيوبه. في عصية، على سبيل المثال ، تم توليد السلالات التي تفتقر إلى معظم البروتياز المعتاد. ستربتوميسيس لا تنافس بكتريا قولونية في مستوى التعبير ، ولكنه مفيد في صنع كميات صغيرة من المنتج المطابق للطبيعة القابل للذوبان. الفطريات الخيطية ، مثل نيوروسبورا كراسا و نيدولانس الرشاشياتيمكن أن تفرز كميات وفيرة من البروتين وتستخدم منذ فترة طويلة في صناعة الأدوية لصنع منتجات طبيعية. تم استخدام الخميرة لإنتاج بروتينات rDNA ، مثل IGF-1 وألبومين المصل البشري على الرغم من الجهود الكبيرة ، إلا أنها لم تستخدم على نطاق واسع مثل بكتريا قولونية أو خلايا CHO.

4.1.5 العزلة والتنقية

تشير العزلة عمومًا إلى فصل المنتج عن الجزء الأكبر من الكائن الحي المنتج. يؤثر التصرف وحالة البروتين المعبر في إجراء العزل. لخلايا الثدييات وبعضها الإشريكية القولونية ، العقدية ، العصوية، ومنتجات الخميرة ، يتم إطلاق البروتين من الخلية إلى الوسط المحيط ، ويتأثر العزل بخطوة فصل المواد الصلبة والسائلة ، وعادة ما تكون بالطرد المركزي أو الترشيح الدقيق أو الترشيح الفائق. إذا تم تجميع المنتج إما في الفضاء السيتوبلازمي أو المحيط ، فإن العزلة تكون أكثر تعقيدًا. بشكل عام ، يتم فصل الخلية أولاً عن طريق المعالجة الميكانيكية أو الكيميائية أو الأنزيمية (أو مجموعة). في بعض الحالات ، يمكن فصل الركام الأكثر كثافة عن طريق الطرد المركزي عن معظم مكونات الخلية القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في حالات أخرى ، يتم إذابة الركام أولاً بينما لا يزال في خليط البروتين القابل للذوبان.

تعد تنقية البروتين جزءًا مهمًا وغالبًا ما يكون مكلفًا من العملية. قد يمثل 50٪ أو أكثر من إجمالي تكلفة الإنتاج. للتنقية عدة أهداف: لإزالة المكونات الملوثة من الكائن الحي المضيف ، أي البروتينات الأخرى ، والحمض النووي ، والدهون لفصل البروتين المطلوب (أو عائلة البروتينات) عن المتغيرات غير المرغوب فيها للبروتين المرغوب لإزالة وتجنب إدخال الذيفان الداخلي إلى تعطيل الفيروسات للحصول على الغلات المطلوبة بتكلفة مقبولة لتجنب التعديل الكيميائي أو الكيميائي الحيوي للبروتين ولجعل العملية متسقة وموثوقة. في بعض الحالات ، يكون الهدف الأول والإضافي هو طي البروتين بالشكل المطلوب.

الكثير من المعرفة المتراكمة حول تنقية البروتين هي

ممتلكات الشركات الفردية. ومع ذلك ، تشير المعلومات المتاحة إلى اتساق عام في نوع وترتيب خطوات العملية. العمليات الفردية الأكثر شيوعًا هي الطرد المركزي ، والترشيح ، وفصل الغشاء ، وفصل الامتزاز ، والكروماتوغرافيا.

تضافرت مخاوف التنظيم والسلامة مع الرغبة في تركيبات سائلة مستقرة لتحفيز إزالة بروتينات الكائن الحي المضيف إلى أقصى درجة. يتطلب قياس هذه الملوثات فحوصات معقدة قادرة على اكتشاف طيف من الملوثات المحتملة عند أجزاء قليلة من كل مليون من بروتين المنتج. حفز وجود متغيرات غير مرغوبة من البروتين المستهدف على تطوير تقنيات لاكتشاف وفصل (على نطاق واسع) البروتينات المعدلة في واحد من عدة مئات من الأحماض الأمينية.

غالبًا ما يمكن تقليل صعوبة الفصل عن طريق تغيير ظروف الكائن الحي أو المزرعة لإنتاج بروتين أكثر تناسقًا. ومع ذلك ، لا يزال من الضروري الجمع بين سلسلة من خطوات التنقية التي يفصل كل منها وفقًا لمبدأ مختلف. غالبًا ما تُستخدم خطوات الترشيح الفائق بين خطوات الفصل لتركيز محلول البروتين أو لجعل محلول المخزن المؤقت متوافقًا مع خطوة الفصل التالية. تم تصميم الخطوات النهائية لوضع البروتين المنقى في المحلول المستخدم لشكل المنتج.

يترجم تعقيد خطوات التنقية الفردية والحاجة إلى القدرة على دمجها في نظام التصنيع إلى فرصة كبيرة لهندسة المعالجة الحيوية حيث تنتقل العملية من المنضدة إلى المصنع. سيستمر البحث والتطوير في التنقية وتكامل النطاق وتصميم النظام في الحصول على أولوية عالية.

4.1.6 هندسة البروتين

أتاح التقدم في علم الأحياء الجزيئي للباحثين الفرصة لتطوير مناهج عقلانية بشكل متزايد لتصميم الأدوية العلاجية. تسمى هذه التقنية ، عند استخدامها مع النمذجة الجزيئية بمساعدة الكمبيوتر هندسة البروتين. تجمع هندسة البروتين بين العديد من التقنيات ، بما في ذلك استنساخ الجينات ، والطفرات الموجهة للموقع ، وتعبير البروتين ، والتوصيف الهيكلي للمنتج ، وتحليلات النشاط الحيوي ، ويمكن استخدامها لتعديل التسلسل الأساسي للبروتين في مواقع محددة لتحسين الاستقرار ، والحركية الدوائية ، والنشاط الحيوي ، ونصف عمر المصل.

التطبيق الثاني لهندسة البروتين هو تصميم البروتينات الهجينة التي تحتوي على مناطق تساعد على الفصل والتنقية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إدخال ، بجانب الجين الهيكلي للمنتج المطلوب ، تسلسل DNA الذي يشفر "ذيل" متعدد الببتيد محدد. يمكن إدخال ذيول عند الطرف N أو C للبروتين لإنتاج بروتين اندماج بخصائص خاصة تسهل الفصل. هذه التعديلات الجينية

يمكن تصميمها للاستفادة من التقارب ، والتبادل الأيوني ، والطارد للماء ، والمخلبات المعدنية ، والفصل التساهمي. يتم إعطاء أمثلة على ذيول التقارب والروابط المقابلة في الجدول 4.4. تسمح الخصائص الخاصة لبروتينات الاندماج بمرور المستخلصات الميكروبية الخام فوق مادة ماصة ترتبط على وجه التحديد بالذيل ، بحيث يتم الاحتفاظ بالمنتج المطلوب وتمر الملوثات من خلاله. بعد الشطف والمعالجة لإزالة الذيل ، تتم تنقية المنتج بشكل أكبر بالطرق القياسية ، مثل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء (HPLC).

4.1.7 علم الجليكوبيولوجيا

أدت الدراسات الحديثة لبيولوجيا المستقبلات إلى اكتشافات أساسية حول دور السكريات قليلة السكاريد المعقدة في المرض ، وفي تعديل وظيفة البروتين ، وكمثبتات للبروتينات السكرية الغشائية المتكاملة. مع تحديد البروتينات السكرية الإضافية واستنساخها ، هناك حاجة متزايدة لطرق كروماتوغرافية أكثر فعالية ، وأنظمة إنتاج تحاكي أنماط الارتباط بالجليكوزيل في الثدييات ، وطرق تحليلية سريعة وقابلة للتكرار لتقليل التجانس الدقيق أثناء التصنيع.

تم العثور على التباين في التخليق الحيوي قليل السكاريد كمصدر مهم لعدم التجانس للبروتينات السكرية التي تنتجها الخلايا حقيقية النواة (مارينو ، 1989). ترتبط سكريات قليلة السكريات ببروتين سكري تساهميًا بالبروتينات من خلال حمض أميني سيرين (مرتبط بـ O) أو أسباراجين (مرتبط بـ N). إذا كان نوع الكربوهيدرات المحدد والموقع مطلوبين للنشاط الحيوي لبروتين سكري مرشح ، فيجب اختيار نظام التعبير بعناية.

الجدول 4.4 أمثلة على ذيول التقارب

الكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز

المصدر: مقتبس من Hammond et al. ، 1991.

لا يمكن للأنظمة البكتيرية أن تستخدم الجليكوزيلات ، وقد ثبت أن العديد من أنواع الخميرة مفرط الجليكوزيلات ، والجليكوزيل في خلايا الثدييات خاصان بنوع الأنسجة والخلية.

التحديات المستقبلية في تطوير العمليات الحيوية سوف توازي البحث في كيمياء البروتين السكري. إن تطوير ضوابط العملية المناسبة ، والطرق التحليلية ، ومواصفات مراقبة الجودة للتحكم في تناسق الدفعة إلى الكمية ، سيكون معقدًا بسبب التجانس الجزئي المتأصل في البروتينات السكرية.

4.1.8 هندسة التمثيل الغذائي

نهج جديد قوي لتطوير المنتجات هو التطبيق الإبداعي لتكنولوجيا التخمير والبيولوجيا الجزيئية من أجل "هندسة التمثيل الغذائي". تتضمن أمثلة الهندسة الأيضية لإنتاج البروتينات غير المتجانسة حذف البروتياز الذي يقضي على المنتج وإنتاج العوامل التي تسهل نضج المنتج وإفرازه. بالنسبة لإنتاج البروتين على نطاق صناعي ، يمكن أن تكون الهندسة الأيضية مفيدة في تحويل التدفق الأيضي نحو المنتج المطلوب ، وإنشاء مصفوفات من الأنشطة الأنزيمية لتركيب هياكل جديدة ، وتسريع خطوات تحديد المعدل (بيلي ، 1991). تم استخدام الهندسة الأيضية مؤخرًا لزيادة كفاءة استيعاب العناصر الغذائية (زيادة معدل النمو) ، وتحسين كفاءة إنتاج ATP (تقليل متطلبات العناصر الغذائية) ، وتقليل إنتاج المنتجات النهائية المثبطة (زيادة كثافة الخلايا النهائية).

يعد تطوير نواقل جديدة وإجراءات تحويل وأدوات أخرى للبيولوجيا الجزيئية أمرًا أساسيًا في التعديل الجزيئي للمسارات متعددة الجينات ، مثل تلك التي تشارك في إنتاج المضادات الحيوية. اكتشاف مهم آخر في الهندسة الأيضية هو عزل جينات التحكم الإيجابي التي تنظم إنتاج المستقلبات الثانوية. تم العثور على منظمات إيجابية في مجموعات الجينات التخليقية الحيوية للأكتينورودين ، والبيالوفوس ، والستربتومايسين ، واندسيلبروديجيوسين ، وكلها ستربتوميسيس المنتجات (بيلي ، 1991).

مثال على جدوى إدخال قدرات تخليق حيوي جديدة في الكائنات الحية الدقيقة الصناعية من خلال الجمع بين الجينات الفطرية والبكتيرية قدمه Isogai et al. (1991). تم استنساخ الجينات التي تشفر الإنزيمات المحولة D-amino acid oxidase و cephalosporin acylase من الفيوزاريوم و الزائفة، على التوالي ، في الفطر أكريمونيوم كريسوجينوم. تم تأكيد التعبير عن مسار التخليق الحيوي "الاصطناعي" للمضادات الحيوية من خلال تحليل المحولات التي صنعت وأفرزت كميات قابلة للكشف من حمض 7-aminocephalosporanic.

بالإضافة إلى الطفرة الكلاسيكية ، أصبحت أدوات جديدة متاحة للتلاعب الجيني لمنتجين مهمين للمنتجات الطبيعية ، مثل ستربتوميسيس. القدرة على استنساخ الجينات التخليقية الحيوية ومعالجتها لإنتاج المضادات الحيوية ، والجينات التنظيمية لتحسين التوليف ، والجينات

من مسارات التمثيل الغذائي الأولية التي تساهم في مسارات التخليق الحيوي الثانوية يمكن أن تسهل بناء السلالات التي تغيرت خصائص التمثيل الغذائي بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استنساخ الجينات غير المتجانسة في مضيفات بكتيرية قد ولّد سلالات يمكن أن تنتج مركبات غريبة وحتى ضارة بفسيولوجيا الخلية.

4.1.9 تفاعل البلمرة المتسلسل

خلال السنوات الخمس الماضية ، أدى تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) إلى تغيير طريقة إجراء تحليل الحمض النووي. لقد سهلت القدرة على تضخيم ، وكذلك تعديل ، تسلسل محدد من الحمض النووي المستهدف باستخدام قالب في إجراء آلي بسيط العديد من المهام في علم الأحياء الجزيئي (مثل الاستنساخ والتسلسل) وفتح مجالات جديدة للدراسة.

تم توسيع فائدة أجهزة PCR بشكل كبير مع اكتشاف طق بوليميراز الدنا ، بوليميراز قابل للحرارة من ثيرموس أكواتيكوس (إرليش وآخرون ، 1991). سمح استخدام الإنزيم بتطوير جهاز تدوير حراري آلي لتنفيذ تفاعل التضخيم في أنبوب واحد.

تم أيضًا تطوير مناهج جديدة لتحسين الخصوصية باستخدام نهج يسمى البداية الساخنة. يمكن تقليل تضخيم التسلسلات غير المستهدفة عن طريق إضافة كاشف أساسي يدويًا (مثل بوليميريز الحمض النووي أو البادئات) إلى أنبوب التفاعل بمجرد وصوله إلى درجة حرارة عالية.

مع استمرار التطورات في الكواشف والإجراءات ، سيطبق الباحثون تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على عدد متزايد من المشاكل في تحليل الحمض النووي.

4.1.10 الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وهندسة الأجسام المضادة

أتاح استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الوصول العام إلى الأجسام المضادة المتجانسة ذات الخصوصية الموصوفة. أحدثت التطورات الحديثة تغييرات جذرية في العلاج بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة. تشمل التطورات تحديد هياكل سطح الخلية على الخلايا غير الطبيعية كأهداف ، وتطوير أساليب الهندسة الوراثية لخلق عوامل أكثر فاعلية ، وتطوير تقنيات لتسليح الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بالنويدات المشعة أو السموم أو الأدوية السامة للخلايا لزيادة وظيفة المستجيب (والدمان ، 1991).

التعبير عن شظايا الجسم المضاد في بكتريا قولونية يجلب ترسانة تقنيات تكنولوجيا الجينات البكتيرية إلى الأجسام المضادة. من خلال تغيير الخصائص التجريبية بشكل منهجي ، نجح Buchner and Rudolph (1991) في إنتاج شظايا Fab بعوائد تصل إلى 40 ٪ من البروتين المؤتلف. وبالمثل ، ديفيس وآخرون. (1991) قام مؤخرًا ببناء تشفير جيني لجسم مضاد وحيد السلسلة وعبر عن بروتينات وظيفية مرتبطة بمولد الضد في الخلايا حقيقية النواة. هذه التطورات مهمة لتطوير الأجسام المضادة كمنتجات علاجية وككواشف.

4.1.11 الحيوانات المعدلة وراثيا

يتم تطوير الحيوانات المعدلة وراثيا لمجموعة متنوعة من التطبيقات. في المستقبل القريب ، سيتم استخدام الحيوانات المعدلة وراثيًا بشكل متزايد في تقييم سلامة الأدوية الجديدة وتسريع الموافقة التنظيمية عليها.

تم إثبات جدوى إنتاج البروتينات الصيدلانية البشرية في حليب الماشية المحورة جينيا. كبديل لأنظمة زراعة الخلايا ، يبدو أن مثل هذه الماشية جذابة بسبب الإنتاجية الحجمية العالية ، وتكاليف التشغيل المنخفضة ، والقدرة على تعديل البروتينات بعد الترجمة ، وإمكانية التوسع في الكائن الحي المنتج. يواجه مهندسو العمليات الحيوية العديد من التحديات التقنية في تحويل نظام الغدة الثديية المعدلة وراثيًا إلى نموذج أولي تجاري للتصنيع على نطاق واسع للبروتينات ذات الحجم الكبير في السوق ، بما في ذلك

تقنيات التنقية للحصول على بروتينات عالية النقاء يجب استعادتها وتجزئتها من خليط معقد من الدهون والبروتينات والسكريات والأيونات ، بعضها في شكل غرواني (انظر Ruettimann and Ladisch ، 1987).

تحسين استقرار المنتج أثناء الاسترداد.

أجهزة لوصف تعديلات ما بعد الترجمة التي أجرتها الغدة الثديية "مفاعل حيوي".

تطوير أجهزة استشعار على الإنترنت لمراقبة التغيرات في النشاط الحيوي للمنتجات أثناء التنقية.

الفصل الحيوي لبروتينات الحليب.

على المدى الطويل ، قد توفر الحيوانات المحورة جينيا مصدرًا للأنسجة والأعضاء لاستخدامها في مرضى الزرع. ستكون هناك حاجة إلى هندسة العمليات الحيوية لتصميم معدات جديدة للحفاظ على الأنسجة الحية وتنقيتها وتخزينها دون التأثير على قابلية البقاء أو استجابة الكسب غير المشروع.

إن العقبات التي يجب التغلب عليها في تطوير الأدوات الجينية اللازمة لهندسة المسارات المنهجية كبيرة ، لكن الأبحاث الأساسية على المستوى الجزيئي ستستمر في توفير سلالات إنتاج محسنة ومنتجات جديدة ، وسيساعد الاهتمام المستمر بأساسيات المعالجة الحيوية للحليب على تحديد استراتيجيات الفصل لهذا السائل البيولوجي المعقد.

4.1.12 صياغة المنتج

تعد صياغة المنتج جزءًا مهمًا وغالبًا ما يتم تجاهله في تطوير العمليات الحيوية. يجب أن يكون بروتين المنتج في شكل مستقر ومناسب للاستخدام ويسمح بتوصيل الدواء بالطريقة المرغوبة. كانت العديد من منتجات rDNA الأولية في شكل مجفف بالتجميد ، وهو مستقر نسبيًا ، ولكنه غير مريح. أحدث المستحضرات الصيدلانية الحيوية في شكل سائل.

بالنسبة للبروتينات المجففة بالتجميد ، من الضروري تطوير بروتين يتم التحكم فيه بعناية

إجراء التجميد والتجفيف والسد. تم تصميم الجهاز واختباره لتوفير ظروف موحدة في جميع أنحاء غرفة التجفيد. بالنسبة للتركيبات السائلة ، يتم تبسيط الإنتاج ، لكن اختيار مكونات المحلول أكثر صعوبة. أولاً ، يجب تحديد التفاعلات العكسية لكل منتج بروتيني. يجب بعد ذلك تطوير الاختبارات بحساسية عالية ودقة لاكتشاف منتجات التحلل. أخيرًا ، يجب فحص الظروف للعثور على تلك التي تسمح بعمر افتراضي ثابت لمدة عام على الأقل. قد تشير نتائج الاستقرار إلى أن البروتين يحتاج إلى مزيد من التنقية قبل الصياغة ، على سبيل المثال ، لإزالة مشكلة البروتياز بشكل كامل.

4.1.13 احتياجات البحث

تغطي تكنولوجيا العمليات الحيوية في تصنيع المستحضرات الصيدلانية الحيوية مجموعة واسعة من التخصصات البيولوجية والكيميائية والهندسية.هناك العديد من فرص البحث ضمن هذا النطاق ، ويتم سرد أهم الاحتياجات الصناعية الحالية أدناه. توصي اللجنة بتخصيص تمويل بحثي للمواضيع المدرجة هنا من خلال برنامج المنح التنافسية. نعتقد أن هيكلة البحث بطريقة تتطلب تفاعلًا بين الصناعة والجامعة أو الصناعة والحكومة من شأنه أن يحفز المزيد من البحث ويساعد على تعزيز الأساليب ذات الصلة بالبحث العام واحتياجات التوظيف المستقبلية للصناعات النامية. بالإضافة إلى تعزيز تطوير قاعدة المعرفة الهندسية الأساسية والتكنولوجيا الجديدة الموجهة لتصنيع العمليات الحيوية ، سيساعد البرنامج في تدريب المهندسين الذين سيكونون على دراية بالمعالجة الحيوية فيما يتعلق بالمستحضرات الصيدلانية الحيوية وبالتالي يكونون متاحين لتوظيف كل من الوكالات التنظيمية والصناعية خدمات.

الأدوات البيولوجية والكيميائية الحيوية هناك حاجة إليها وسوف تتطلب البحث

تطوير أدوات للتعبير عن البروتينات غير المتجانسة وتعديلها وإفرازها من الخلايا بدائية النواة وخلايا حقيقية النواة. يتضمن ذلك دراسة انتقال البروتين والطي بكتريا قولونية ، والإدخال المستقر للجينات الأجنبية في خلايا الثدييات ، والقضاء على إنتاج الأنزيم البروتيني ، وتطوير أدوات لاستخدام الكائنات الحية الجديدة للتعبير الجيني غير المتجانسة.

تعديل البروتينات في الجسم الحي من خلال هندسة البروتين. يتضمن ذلك دراسة الآليات الكيميائية والتأثيرات البيئية التي تؤثر على تعديل البروتينات وطرق فحص متغيرات البروتين التي لها أنشطة بيولوجية مختلفة.

معالجة المنبع سوف تتطلب البحث ل

تطوير أجهزة وإجراءات محسنة لفحص البيولوجيا

أنشطة البروتينات الجديدة أو المركبات الأخرى. قد يشمل ذلك المزارع الأولية المطولة للكائنات الحية أو الأنسجة أو مجموعات الخلايا أو خطوط الخلايا الفردية والإجراءات المخبرية باستخدام الأجزاء ذات الصلة من الجهاز المناعي لتقييم استمناع المركبات الجديدة أو المعدلة.

تطوير تقنية تعمل على تحسين استقرار البروتينات والخلايا التي تتعرض لواجهات ديناميكية بين الغاز والسائل.

تطوير تقنية الفحص عبر الإنترنت التي تتعرف على جودة وكمية البروتينات المؤتلفة.

أنظمة احتواء المهندس لاستخدامها في التصنيع.

تصميم قدرة ضخ معقمة ومنخفضة القص لمفاعلات إعادة التدوير واسعة النطاق.

تطوير نماذج تنبؤية لتوسيع نطاق الخزان المقلوب ومفاعلات الرفع الجوي التي تأخذ في الاعتبار التحولات المحتملة من الحركية إلى قيود النقل عند التوسع.

التحديات في معالجة المصب هي

تطوير تقنيات تنقية البروتين عالية الدقة التي توفر درجة الدقة التي يوفرها HPLC للطور العكسي ، ولكنها قابلة للتطوير بسهولة ولا تتطلب مذيبات باهظة الثمن ويصعب التخلص منها.

تحسين تقنيات فصل البروتين بناءً على الحجم الجزيئي. يجب أن توفر التقنيات دقة جيدة وتشغيلًا غير مكلف (أي ذات معدلات إنتاجية محددة عالية).

تطوير قدرات الفحص السريع عبر الإنترنت وخارج الخط لتقييم البروتينات المضيفة الملوثة والحمض النووي بتركيزات أجزاء لكل مليون ، ومتغيرات بروتين المنتج ، والنشاط البيولوجي النسبي.

ادمج المراقبة السريعة ، واكتشاف المنتجات الحيوية عبر الإنترنت ، وتسلسلات التنقية متعددة الخطوات للحصول على أنظمة تنقية آلية.

تطوير خوارزميات متكاملة لتصميم الكمبيوتر لتحسين تسلسل التنقية المستند إلى الكمبيوتر.

تقنيات أخرى التي تحتاج إلى تطوير تشمل أساليب

تركيبة سائلة مستقرة للمستحضرات الصيدلانية البروتينية.

تعديلات دقيقة على البروتينات لإنتاج بروتينات معقدة معدلة بشكل متجانس مع تأثيرات بيولوجية دقيقة.

قد تستفيد أيضًا الإدارة غير الوريدية للمستحضرات الصيدلانية البروتينية ، بما في ذلك القدرة على الإطلاق المستمر ، من قابلية التسليم بطريقة نابضة.

توصيف التكاليف التشغيلية والرأسمالية للسماح بتقدير دقيق وسريع لتكلفة العملية الإجمالية.

يتم الآن تنفيذ معظم عمليات التصنيع البيولوجية (على الأقل من المنتجات عالية القيمة) بكميات صغيرة. مع نمو المستحضرات الصيدلانية الحيوية من حيث الحجم والحجم ومع ازدياد أهمية التكلفة في الربحية على المدى الطويل ، فإن تطوير-

ستكون منة أنظمة التصنيع الفعالة والمتكاملة أكثر أهمية في هندسة العمليات الحيوية. ستصبح جميع القضايا التي نوقشت الآن في أنواع أخرى من التصنيع و mdashdesign للتصنيع ، وقابلية التصنيع الجوهرية ، والأنظمة المتكاملة لأجهزة الاستشعار والضوابط ، وأنظمة معالجة المعلومات المتكاملة للتصنيع و [مدش] ذات صلة بالمعالجة الحيوية. ربما يكون تطوير أنظمة حساسة مناسبة هو العنصر الأساسي في المراحل الأولى لأنظمة التصنيع البيولوجي الفعالة التي يديرها الكمبيوتر.

4.2 المنتجات الحيوية المتخصصة والكيماويات الصناعية

المنتجات المتخصصة هي المواد الكيميائية والبروتينات والمواد الميكروبية وغيرها من المواد المشتقة بيولوجيًا التي يتم قياس حجم الاستخدام المحلي أو العالمي السنوي بالأطنان. تميل المنتجات المتخصصة إلى الحصول على أسعار بيع أقل من 3 أضعاف تكاليف التصنيع. في المقابل ، تمتلك العلاجات البشرية أسعار بيع 10 و - 12 ضعفًا لتكاليف التصنيع وكميات سنوية للاستخدام تقاس بالكيلوغرام إلى مئات الكيلوجرامات.

يتم تعريف المواد الكيميائية والبيولوجية المتخصصة بشكل أكبر لتشمل المنتجات الغذائية والمضادات الحيوية والمواد المضافة ومعالجة المواد الكيميائية المؤكسجة والمواد المضافة للوقود والعوامل البيولوجية المستخدمة في التطبيقات الزراعية والبيئية والمنتجات ذات القيمة المضافة المشتقة من السلع الزراعية والموارد المتجددة الأخرى والمنتجات ذات الصلة بالطاقة (OTA ، 1991). ستؤثر التكنولوجيا الحيوية على صياغة المنتجات في الزراعة والطاقة والبيئة وصحة الإنسان ولديها القدرة على تجاوز صناعة الكمبيوتر من حيث الحجم والأهمية ، بسبب الدور الواسع للمواد المنتجة بيولوجيًا في الحياة اليومية (مجلس التنافسية ، 1991) . تعد هندسة العمليات الحيوية مكونًا أساسيًا للانتقال السريع للمنتجات الحيوية من المختبر إلى نطاق تصنيع قادر على توفير فوائد التكنولوجيا الحيوية على نطاق واسع بتكلفة معقولة.

فرص منتجات التكنولوجيا الحيوية للتأثير على الصناعة الكيميائية الأمريكية كبيرة. في عام 1990 ، قدرت الشحنات الكيميائية بحوالي 300 مليار دولار ، ووظفت الصناعة الكيميائية مليون شخص وأنتجت أكثر من 50000 مادة كيميائية وتركيبات (OTA ، 1991). وفقًا لمكتب تقييم التكنولوجيا (OTA) ، من المحتمل أن تُستخدم التكنولوجيا الحيوية في الصناعة الكيميائية في إنتاج المواد الكيميائية المشتقة من التخمير وتوليف المواد الكيميائية المعقدة. من المتصور أن تحسين عمليات الإنتاج التي تستخدمها الشركات الكيميائية الكبرى "سيتم إدخاله دون الضجة التي صاحبت تطورات التكنولوجيا الحيوية الأخرى." على سبيل المثال ، تُستخدم الإنزيمات لتحل محل الخطوات الصعبة أو المكلفة في التخليق الكيميائي (OTA ، 1991).

4.2.1 تقنية الإنزيم والمنتجات الحيوية المتخصصة

تتراوح المنتجات المتخصصة المشتقة من معالجة التكنولوجيا الحيوية من المواد السلعية منخفضة القيمة ، مثل وقود الإيثانول ، إلى الإنزيمات المحفزة المشتقة من المؤتلف عصية الأنواع المستخدمة في المنظفات. يقدر سوق الإنزيمات في جميع أنحاء العالم بحوالي 650 مليون دولار ، يُعزى 50٪ منها إلى الإنزيمات المستخدمة في صناعة المنظفات (لايمان ، 1992). هذه المجموعة من المنتجات حساسة لتكاليف المعالجة ، ويتم التصنيع على نطاق تكون فيه هندسة العمليات الحيوية مكونًا مهمًا للتكنولوجيا والتصميم. تشمل المنتجات المتخصصة أيضًا معززات النكهة ، مثل الغلوتامات أحادية الصوديوم والأحماض الأمينية. في بعض الحالات ، تم استخدام التكنولوجيا المؤتلفة لتحسين إنتاجية الكائنات الحية الدقيقة فيما يعد فنًا ناضجًا لصناعة التخمير.

4.2.2 المبيدات الحيوية

سيؤثر البحث عن مبيدات الآفات القابلة للتحلل البيولوجي والمتوافقة مع البيئة على الأسواق التي تهيمن عليها المبيدات الحشرية الاصطناعية ، والتي تُباع منها 2 مليار دولار سنويًا في الولايات المتحدة. الأمثلة الأخيرة Bacillus thuringiensis (BT) سموم الحشرات (التي تنتجها شركة فايزر لمنتجات إيكوجين للمبيدات الحيوية) وأزاديراشتين مشتق من زيت بذور تسعة شجرة (مجهول ، 1992 ستون ، 1992). تتمثل الإستراتيجيات البديلة لسموم BT في إدخال جينات السموم (البروتينات) في الكائنات الحية الدقيقة الأخرى الموجودة في أجزاء من النباتات التي تهاجمها الآفات وإدخال جين مقاوم للحشرات مباشرةً في النبات (OTA ، 1991 كروفورد ، 1988). نمت مبيعات منتجات BT من 2.4 مليون دولار في عام 1980 إلى 10.7 مليون دولار في عام 1989 ومن المتوقع أن تنمو بنسبة 11٪ سنويًا (Feitelson et al.، 1992). هناك مبيد حيوي آخر مهم سينتج عن استخدام فيروسات باكولوفيروس لم تتحقق هذه التقنية ، لكنها باتت وشيكة (انظر الفصل 6).

4.2.3 الطحالب الدقيقة والمواد الكيميائية الجديدة

على الرغم من وجود أكثر من 50000 نوع من الطحالب الدقيقة معروفة ، تمت دراسة أقل من 10 منها بشكل مكثف أو تم استغلالها تجاريًا (Behrens and Delente ، 1991). أسفرت الجهود الأخيرة لزراعة الطحالب الدقيقة الموجهة ضوئيًا في مفاعلات حيوية ضوئية على نطاق واسع وعلى نطاق تجريبي عن مجموعة جديدة مثيرة من الكائنات الحية للكشف عن كيانات كيميائية جديدة. منح المعهد الوطني للسرطان عقود فحص للبكتيريا الزرقاء والطحالب الدقيقة الأولية ، وقد أظهرت أكثر من 5٪ من سلالات الطحالب الدقيقة نشاطًا أوليًا في الشاشات الأولية. تعتبر الطحالب الدقيقة مصدرًا غير مستغل للمواد الكيميائية الجديدة ، وستستخدم بالتأكيد في عمليات التصنيع المستقبلية.

4.2.4 زراعة أنسجة الخلايا النباتية

تُستخدم زراعة أنسجة الخلايا النباتية تجاريًا في اليابان لإنتاج صبغة شيكونين والجينسنغ كغذاء صحي. في ألمانيا ، تم بناء منشأة سعتها 75000 لتر واستخدامها لإنتاج عديد السكاريد المناعي ، على الرغم من أنها ليست عملية تجارية. في إسرائيل ، تشكل المفاعلات الحيوية جزءًا لا يتجزأ من عملية التكاثر الدقيق المستخدمة في الإنتاج التجاري لـ 14 نوعًا نباتيًا. في الولايات المتحدة ، لا توجد عمليات زراعة الخلايا النباتية التجارية (Payne et al. ، 1991). ومع ذلك ، فإن إنتاج تاكسول ، وهو علاج كيميائي ، عن طريق زراعة الخلايا النباتية يتم متابعته بنشاط من قبل شركتين على الأقل. يخضع تاكسول لتجارب سريرية ضد مجموعة واسعة من أنواع السرطان. تاكسول نادر للغاية ، لأن المصدر الحالي هو لحاء شجرة الطقسوس في المحيط الهادئ - وهي شجرة غير شائعة وبطيئة النمو. المصادر البديلة ضرورية ، وزراعة الخلايا النباتية هي أحد الحلول المحتملة لمشكلة التوريد.

4.2.5 احتياجات وفرص البحث

توضح أمثلة تكنولوجيا التصنيع الحالية للمنتجات الحيوية التي تم الاستشهاد بها للتو مجموعة واسعة من خطوات المعالجة التي ينطوي عليها تصنيعها. تنعكس اقتصاديات الخطوات الفردية في جودة المنتج والتكلفة والتطبيق النهائي. هناك حاجة إلى مجموعة واسعة من العلوم الحيوية لتطوير كائنات دقيقة محولة ، ومحفزات حيوية جديدة ، وفهم أساسي لتفاعلات البروتينات مع بيئاتها ، تدخل جميعها في التجميع النهائي للأفكار والتقنيات لإنتاج جزيئات جديدة أو لطرق جديدة لإنتاج المنتجات الحيوية الموجودة . غالبًا ما يتم تجاهل تنوع مهارات هندسة العمليات الحيوية التي يجب تطبيقها على مثل هذه المجموعة الواسعة من المنتجات الحيوية. تشمل التحديات التي تواجه هندسة العمليات الحيوية تصميم المعدات المتخصصة الذي يلبي القيود التنظيمية والبيولوجية والاقتصادية ، دمج عمليات التصنيع في مفاهيم عملية مقبولة بيئيًا وذات جدوى اقتصادية والتنقية السريعة لعمليات التنقية ومراقبتها للحصول على جودة عالية ونقاوة عالية ومخرجات متسقة .

يتم الحصول على العديد من المنتجات المتخصصة من خلال التخمير في محلول مخفف. هناك فرصة مهمة لتحسين اقتصاديات إنتاجها من خلال تحسين كفاءة الطاقة وانتقائية إزالة المياه. هناك حاجة إلى طرق موفرة للطاقة لاستعادة هذه المنتجات من المحاليل المائية المخففة لتقليل تكلفة تركيبها ومعالجتها وحجم المعالجة النهائية.

هناك حاجة أيضًا إلى تحسينات في تصميم المفاعلات الحيوية وفي ظروف زراعة الكائنات الحية الدقيقة والحصول على المنتجات. تقدم كل من عمليات التخمير ذات الركيزة الصلبة والمغمورة فرصًا كبيرة للتصنيع الحيوي والتحسين من خلال هندسة العمليات الحيوية. في ال

في حالة تخمير الركيزة الصلبة ، فإن تطبيق الإنزيمات مثل التي يمكن استخدامها في biopulping يتطلب ملامسة فعالة للسائل الصلبة والسائلة. هناك حاجة إلى حلول هندسة العمليات الحيوية لتمكين تغلغل محاليل الإنزيم أو التلقيح الميكروبي في المواد الصلبة ، والتي يجب معالجتها بسرعة على نطاق واسع نسبيًا. بالنسبة للتخمير المغمور ، يمثل تثبيط المنتج تحديًا مهمًا لمهندسي العمليات الحيوية ، لأنه يحد من معدل ومدى تكوين المنتج. يمكن للتصميمات الجديدة للمفاعلات الحيوية ، وتقنيات فصل الأغشية ، ومساعدات المعالجة أن تحسن اقتصاديات إنتاج المنتجات الحيوية المتخصصة. نهج آخر من خلال هندسة الخلايا لتغيير الفسيولوجيا الأساسية للأغشية الميكروبية وتخفيف آثار منتجات التخمير خارج الخلية السامة.

تتشابه تحديات وفرص تكنولوجيا المعالجة الحيوية لتصنيع المنتجات الحيوية المتخصصة مع تلك المتعلقة بالمستحضرات الصيدلانية الحيوية ، باستثناء الأخطار الخاصة لمسببات الأمراض والتركيز على المنتجات المتخصصة على اقتصاديات الإنتاج ، وكلما انخفضت قيمة المنتج ، زادت كثافة الاقتصاد. التركيز.

4.3 التطبيقات البيئية

يشمل تطبيق التكنولوجيا الحيوية على نطاق بيئي مواضيع تتراوح من مكافحة التلوث والمعالجة الحيوية إلى التعدين. يجري البحث عن طرق غير مكلفة لكنها فعالة لتنظيف النفايات الخطرة وغيرها من الملوثات. التقنيات الحالية المستخدمة هي ردم الأرض والحرق ، ولكن هذه التقنيات أصبحت لا تحظى بشعبية على نحو متزايد ، وباهظة الثمن ، ويصعب تأسيسها ، بسبب اللوائح الأكثر صرامة والاعتراضات العامة. يظهر حجم المشكلة في حجم النفقات الوطنية لتنظيف البيئة ، والتي قُدرت بمبلغ 115 مليار دولار لعام 1990 (كارلين ، 1990). التوقعات للمستقبل أعلى من ذلك. هناك حاجة لتكنولوجيا أكثر فعالية تستخدم كائنات حية مثل البكتيريا أو مكونات مثل الإنزيمات (Hinchee and Olfenbuttel، 1991 a، b). لقد تم استخدام النظم البيولوجية لتحليل أو تحويل المواد الكيميائية والمواد غير المرغوب فيها إلى مواد أكثر حميدة من الناحية البيئية لسنوات على نطاق واسع للغاية. على سبيل المثال ، تستخدم محطات معالجة مياه الصرف الصحي البلدية اليوم مبادئ هندسة العمليات الحيوية للتخلص من مياه الصرف الصحي وتوفير مياه شرب نظيفة وآمنة. يعتبر التسميد من الممارسات المعروفة للكثيرين ، بما في ذلك البستانيين في عطلة نهاية الأسبوع ، وهو استخدام للكائنات الدقيقة لتقويض البستنة والنفايات الأخرى. ركز الاهتمام الأخير بالبيئة بعض تقنيات المعالجة الحيوية على تحويل النفايات الخطرة واستخدام العمليات البيولوجية التي تنتج المنتجات المرغوبة ولكن القليل من المخلفات الثانوية أو لا تنتج على الإطلاق.

يمكن تجميع المنتجات الحيوية الحالية ذات الأسواق ذات الأهمية البيئية في كواشف لمكافحة التلوث والزراعة والتعدين والنفط

التعافي. تم العثور على ملخص ممتاز في تقرير OTA الأخير التكنولوجيا الحيوية في الاقتصاد العالمي (OTA ، 1991) ، ونقتبس من تلك الوثيقة لاحقًا.

4.3.1 المعالجة الحيوية

المعالجة الحيوية يشير إلى استخدام كائنات كاملة (معظمها كائنات دقيقة في التربة) أو مكونات مختارة من الخلايا الميكروبية (معظمها من الإنزيمات) للتحولات الكيميائية. تحول المعالجة البيولوجية مادة سامة إلى مادة غير ضارة أو مادة أقل سمية. من الناحية المثالية ، يتم تحويل المادة السامة إلى ثاني أكسيد الكربون والماء. إذا كانت المادة السامة تحتوي على معدن أو هالوجين ، مثل الكلور أو الفلور ، فستكون هناك منتجات جانبية إضافية (ربما الذرة المعدنية الحرة أو أيونها أو أيون الهاليد). تمعدن هو المصطلح المستخدم لوصف التحلل الكامل لمادة كيميائية إلى ماء وثاني أكسيد الكربون. الزيادة الحيوية، مصطلح آخر يستخدم بشكل متكرر ، يتضمن الإضافة المتعمدة للكائنات الحية الدقيقة التي تم تربيتها وتكييفها وتحسينها لملوثات وظروف معينة في الموقع. الكائنات الدقيقة المستخدمة في المعالجة الحيوية تشمل الهوائية (التي تستخدم الأكسجين الحر) واللاهوائية (التي تعيش فقط في غياب الأكسجين الحر). كانت الميكروبات الهوائية هي الكائنات الحية المختارة لتدمير النفايات الخطرة.

تمارس المعالجة البيولوجية في وضعين و mdashin في الموقع وخارجه. تتضمن المعالجة الحيوية في الموقع استخدام الكائنات الدقيقة لتحلل النفايات في الموقع (سواء فوق السطح أو تحته) وتجنب حفر التربة الملوثة ونقلها إلى مواقع مختلفة. تُستخدم معالجة السطح لمعالجة الأجزاء العلوية من التربة من خلال التهوية عن طريق إضافة الكائنات الحية الدقيقة والمغذيات والماء. تستخدم المعالجة البيولوجية الجوفية الكائنات الحية الدقيقة الموجودة بالفعل في التربة والمياه الجوفية وتضيف الأكسجين والمغذيات. تتضمن المعالجة خارج الموقع حفر التربة الملوثة ونقلها إلى مواقع المعالجة المناسبة ، أي المفاعلات الحيوية. يتم تهوية التربة الملوثة ومعالجتها بالمغذيات لتوفير بيئة نشطة للكائنات الحية الدقيقة المختارة. يستمر العلاج حتى تصبح التربة نظيفة بدرجة كافية ويمكن إعادتها إلى الموقع. تتنوع التقنيات خارج الموقع ولكنها يمكن أن تشمل معالجات في مرحلة الملاط تجمع بين التربة الملوثة أو الحمأة في المفاعلات الحيوية أو معالجات المرحلة الصلبة التي تتضمن وضع التربة الملوثة في أحواض معالجة مبطنة. تشمل المعالجة الحيوية للماء أو المادة المرتشحة المعالجة بمفاعلات حيوية خاصة أو مرشحات تحتوي على غشاء نشط من الكائنات الحية الدقيقة. يتضمن اختيار الطريقة العديد من العوامل ، بما في ذلك الملوث والموقع والتكاليف التي يمكن تحملها. عادة ما تكون المعالجة خارج الموقع مكلفة للغاية (على سبيل المثال ، 100 دولار و 1000 دولار لكل متر مكعب من التربة).

في أغلب الأحيان ، من المتوقع أن تتكاثر الكائنات الحية الدقيقة في الموقع. يعد تشجيع التكاثر في الموقع من التحديات التي تتم معالجتها في تجارب صغيرة. كانت المحاولات الرئيسية الوحيدة هي الانسكابات النفطية ، ولا سيما-

ularly اختبارات وكالة حماية البيئة-إكسون المشتركة مع الأسمدة في برينس ويليام ساوند لتنظيف الشواطئ من انسكاب النفط في فالديز. كانت النتائج مشجعة ، وإن لم تكن مذهلة (أوتا ، 1991 ، ص 134). ويخلص تقرير OTA (ص 140):

على الرغم من أن المعالجة الحيوية توفر العديد من المزايا مقارنة بتقنيات معالجة النفايات التقليدية ، إلا أن العديد من العوامل تعيق الاستخدام الواسع النطاق للتكنولوجيا الحيوية لتنظيف النفايات. لا يُعرف سوى القليل نسبيًا عن التأثيرات العلمية للكائنات الدقيقة في النظم البيئية المختلفة. لا يتم نشر بيانات البحث وكذلك مع البحوث التي تؤثر على القطاعات الصناعية الأخرى. يحدث هذا بسبب التمويل الفيدرالي المحدود للبحوث الأساسية وطبيعة الملكية لعلاقات العمل التي يتم بموجبها عادةً استخدام المعالجة البيولوجية. توفر اللوائح سوقًا للمعالجة الحيوية من خلال إملاء ما يجب تنظيفه ، ومدى نظافته ، وطرق التنظيف التي يمكن استخدامها ، ولكن اللوائح تعيق أيضًا التطوير التجاري نظرًا لحجمها الهائل وعدم وجود معايير لمعالجة النفايات البيولوجية.

على الرغم من إجراء بعض الأبحاث حول استخدام الكائنات المعدلة وراثيًا لاستخدامها في المعالجة الحيوية ، فإن قطاع المعالجة البيولوجية اليوم يعتمد على الكائنات الحية الدقيقة التي تحدث بشكل طبيعي.لا تزال قيود الإدراك العلمية والاقتصادية والتنظيمية والعامة التي كان يُنظر إليها على أنها حواجز أمام تطوير المعالجة الحيوية قبل عقد من الزمن موجودة. وبالتالي ، فإن الاستخدام التجاري للكائنات الدقيقة المهندسة بيولوجيًا لتنظيف البيئة غير مرجح في المستقبل القريب.

يلخص التقرير أيضًا الآفاق الحالية للكائنات الدقيقة المعدلة وراثيًا في المعالجة البيولوجية (OTA ، 1991 ، ص 139):

بعض الأبحاث الأساسية جارية حول استخدام الميكروبات المعدلة وراثيًا لتنظيف النفايات. سيتم تنفيذ أول التطبيقات خارج المختبر للميكروبات المعدلة وراثيًا لتنظيف النفايات في المفاعلات الحيوية ، لأن ظروف بقاء الميكروبات ومراقبتها يسهل التحكم فيها في نظام مغلق مقارنةً بالحقل المفتوح. يواصل قطاع المعالجة الحيوية اليوم الاعتماد على الكائنات الحية الدقيقة التي تحدث بشكل طبيعي. نظرًا لأسباب علمية واقتصادية وتنظيمية وإدراك عام ، فمن غير المحتمل أن يحدث الاستخدام الوشيك للكائنات الدقيقة المهندسة بيولوجيًا لتنظيف البيئة في المستقبل القريب. هناك حاجة إلى تعلم المزيد عن الميكروبات التي تحدث بشكل طبيعي و mdash أقل بكثير من تلك المهندسة وراثيًا. إن الافتقار إلى بنية تحتية بحثية قوية ، وهيمنة الشركات الصغيرة ، والافتقار إلى مشاركة البيانات ، ووجود عقبات تنظيمية ، كلها بمثابة حواجز مهيمنة أمام الاستخدام التجاري للكائنات الحية المعدلة وراثيًا.

تعد المعالجة البيولوجية بتكاليف أقل من الأنواع الأخرى من التكنولوجيا لتنظيف البيئة. لا توجد وكالة أكاديمية أو تنظيمية لديها