معلومة

لماذا يكون التعبير النسبي في qPCR منخفضًا جدًا؟


عند تحليل الطفرات المختلفة من خلال qPCR ، وجدت قيمة $ 2 ^ {- Delta Delta ct} $ لكل طفرة. جميع الطفرات لها قيم متشابهة مقارنة بجين النوع البري ، ومع ذلك فإن إحدى الطفرات لها قيمة $ 2 ^ {- Delta Delta ct} دولار للغاية. بوجود دولار واحد لنوع wilde ، ومتوسط ​​0.9 دولار لبعض الجينات الطافرة ، فإن الحالة الاستثنائية لها قيمة 0.05 دولار.

أعتقد أنه يمكن للمرء أن يجادل في أن هذه الطفرة تحذف تسلسلًا من جين النوع البري ، لكنني أعتقد أنه يمكن اقتراح أشياء أخرى من هذا.


قد تكون طفرة معينة تؤثر على التعبير تمامًا. من خلال qPCR ، يمكنك معرفة الفرق النسبي في مستويات mRNA لجين معين بين WT والطفرة على سبيل المثال. قد تكون هذه الطفرة المعينة تدمر بعض التسلسل التنظيمي داخل جسم الجين (على سبيل المثال ، عنصر المروج النهائي) أو بعض التسلسل التنظيمي المنبع. بالنسبة لي ، هذا يشير إلى أنك تتعامل مع مثل هذه الحالة هنا. على أي حال ، ستحتاج إلى مزيد من البيانات لتخبرها على وجه اليقين. يجب أن يكون لديك مخطط الطفرة ، إذا لم تكن قد قمت بذلك بالفعل وتحقق مما إذا كانت البادئات التي استخدمتها على ما يرام. من الواضح أن هذه الطفرة تعيق التعبير ، طالما أن كل شيء على ما يرام مع الإجراء.


هل يمكن أن يكون qPCR مطلقًا أم أنه مجرد تقدير نسبي؟

أنا & # x27m ليس عالم أحياء ولكني & # x27m أعمل على بيانات من قطيرة رقمية PCR ، وأنا & # x27m أحاول فهم qPCR مقابل ddPCR.

تظل موارد ddPCR تخبرني أن إحدى الفوائد الرئيسية لـ ddPCR هي أنها توفر مطلق القياس الكمي ، في حين أن qPCR يمكن أن يعطي فقط نسبيا تحديد الكميات. (تقول الصفحة الرئيسية Bio-rad & # x27s لـ ddPCR ذلك). لكني & # x27ve قرأت أيضًا في الكثير من الأماكن حول qPCR ، ودائمًا ما تقول إن القياس الكمي المطلق ممكن إذا كنت تعرف التركيز الأولي للعينة المرجعية (أو أي شيء على هذا المنوال - ما زلت غير 100٪ على كل هذه المفاهيم والمصطلحات).

إذن ما هو؟ هل ddPCR يكذب علي لجعل صوت منتجهم أكثر جاذبية؟ أم أن التقدير & quotabsolute & quot المحقق باستخدام qPCR ليس مطلقًا مثل ddPCR؟

أعتقد أنك تخلط بين شيئين - يمكن أن يمنحك PCR الكمي في الوقت الفعلي (في وقت ما يختصر إلى qRT-PCR أو qPCR) إما مطلقًا أو نسبيًا ، اعتمادًا على كيفية تشغيل تجربتك ، في حين أن القطيرة الرقمية PCR هي تقنية يمكن استخدامها للتقدير المطلق. معظم الناس يقومون بعمل نسبي لأنه أسهل ومعرفة عدد جزيئات نسخة الجين بالضبط ليست أكثر إفادة بكثير من التعبير النسبي للنسخة مقابل عنصر تحكم.

بالنسبة لـ Absolute ، تقوم بعمل منحنى قياسي لمعايير تركيزات مختلفة. أنت تخفف مادة البداية (cDNA) بطريقة تصل إلى تضخيم نسخة واحدة / رد فعل. هذا هو المكان الذي يمكن أن يكون فيه PCR الرقمي (ddPCR) مفيدًا لأنه مجرد تضخيم لشريط واحد من الحمض النووي في قطيرة. ومع ذلك ، باستخدام منحنى قياسي ، يمكنك إجراء تقدير كمي مطلق دون إجراء ddPCR (فهما ليسا واحدًا ونفس الشيء).

بالنسبة إلى النسبي ، فأنت تقارن عينة بأخرى ، لذا لا تحتاج إلى منحنى قياسي ، لكنك تحتاج إلى جين التدبير المنزلي للتأكد من أن المدخلات الخاصة بك هي نفسها لكل عينة لأنها قد تختلف. على سبيل المثال. إذا وضعت 2x من عنصر التحكم في العينة التجريبية و 1x من العينة التجريبية ، فستخبرك البيانات أن لديك 50٪ أقل في المجموعة التجريبية مقابل المجموعة الضابطة بينما يجب أن تكون 1: 1 حقًا. يعمل جين التدبير المنزلي على تطبيع هذا التأثير.


ما هي فائدة ROX في QPCR؟

نظرًا لأن ROX عبارة عن صبغة فلورية سلبية ، فإن السبب الرئيسي لاستخدامها في qPCR هو تطبيع الإشارة. من خلال تطبيع إشارة الفلورسنت ، يمكن أن يقلل هذا التباين بين التكرارات التقنية.

يمكن أن تؤثر الاختلافات الطفيفة بين الآبار على إشارة الفلورسنت المتولدة في qPCR. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي الاختلافات في أحجام التفاعل بسبب أخطاء الماصات إلى تحيز النتائج. أيضًا ، يمكن أن تؤثر المشكلات المرتبطة بأداة qPCR ، مثل البصريات ، أيضًا على إشارة الفلورسنت المتولدة.

يمكنك التفكير في عملية التطبيع عند استخدام ROX كمفهوم مشابه لسبب استخدام الجينات المرجعية أثناء حسابات التعبير الجيني النسبي ، مثل طريقة Delta-Delta Ct. بدلاً من التحكم في مقدار القالب في العينة ، يعمل ROX على تطبيع سمات خليط qPCR ، مثل اختلافات الحجم ووجود الفقاعة وما إلى ذلك.


كيفية اختيار جهاز معايرة للتعبير الجيني النسبي في PCR في الوقت الحقيقي - أيضًا حول عدم التناسق حول ثلاث نسخ من PCR في الوقت الحقيقي (أغسطس / 25/2008)

مرحبا أعزائي جميعا ،
أقوم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي للتعبير النسبي عن السيتوكينات المنشطة للالتهابات استجابةً للعدوى. أستخدم برنامج SDS لنظام ABI و SYBR Green. تصميم expriment هو كالتالي: 0h (بدون عدوى) ، 3h (جمع RNA 3h بعد العدوى) ، 6h (جمع RNA 6h بعد العدوى). لدي عينات من ثلاث نسخ لكل نقطة زمنية. لذلك هناك 9 عينة 0h-1 ، 0h-2 ، 0h-3 3h-1 ، 3h-2 ، 3h-3 6h-1 ، 6h-2 ، 6h-3. أثناء تحليل البيانات ، لا بد لي من اختيار واحدة من عينة النقطة الزمنية الصفرية كمعاير ، وهذا يعني أنني قمت بتعيين قيمة هذه العينة على أنها 1. قمت بتعيين 0h-1 على 1 ، وقيمة 0h-2 هي 0.7 ، قيمة 0h-3 هي 1.3.
أتساءل عما إذا كنت قد قمت بتعيين 0h-2 كمعاير ، أي أن قيمة 0h-2 هي 1 ، وبالتالي فإن قيمة التعبير النسبي لكل العينة ستتغير وتزداد بمقدار 1 / 0.7 مرة. قم بتكوين عينة نقطة الصفر الثلاث ، أي منها يجب أن أختاره ليكون جهاز المعايرة؟ هل هناك أي قواعد لاختيار جهاز المعاير؟ لماذا يوجد فرق كبير جدًا لعينة نقطة الصفر الثلاثية التي لم تُصاب بالعدوى؟
شكرا لك مقدما

بالنظر إلى التباين الكبير في جهاز المعايرة (غير المعالج): أفترض أن التعبير الخلوي للخلايا غير المصابة منخفض جدًا بالقرب من حد الكشف (Cts حوالي 34 أو أكثر). علاوة على ذلك ، فإن استخدام هذا كمعيار سيؤدي إلى حدوث خطأ كبير في قياسات العينة الخاصة بك ، فكلما زاد الفرق في Cts بين جهاز المعايرة والعينة ، زادت الزيادة في الخطأ. أوصي بتجميع (كدنا) من مراحل العلاج المختلفة حتى تحصل على نوع من متوسط ​​مستوى التعبير واستخدامه كمعاير. يمكنك حتى حساب المتوسط ​​الحسابي لجميع نماذج Cts وأخذها كمعاير. قد تكون الأرقام مختلفة ولكن الكميات النسبية هي نفسها دائمًا.

راجع للشغل: يمكنك أن تأخذ المتوسط ​​الحسابي Ct لعيناتك الثلاث 0 ساعة كمعاير ، وليس واحدًا فقط

مرحبًا ، لقد واجهنا نفس المشكلة عند إجراء RT-qCR لتحليل تعبير سيتوكين ، وفي ذلك الوقت قررنا تجنب استخدام أداة المعايرة وحساب 2 ^ -ddCT التي عملناها مع ddCT بدلاً من ذلك ، وبهذه الطريقة نتائجنا كانت أكثر دقة نظرًا لأننا لم & # 39t في القلق بشأن الانحراف القياسي بين المعايرة التي تم أخذ عينات منها بسبب ارتفاع درجة التصوير المقطعي المحوسب. في الآونة الأخيرة ، نحن نعمل مع ELISA ، إنه أسهل بكثير وأكثر دقة إذا كنت بحاجة إلى معرفة ما إذا كان سيتوكين معين يرتفع مع مرور الوقت. حظا طيبا وفقك الله

بالنظر إلى التباين الكبير في جهاز المعايرة (غير المعالج): أفترض أن التعبير الخلوي للخلايا غير المصابة منخفض جدًا بالقرب من حد الكشف (Cts حوالي 34 أو أكثر). علاوة على ذلك ، فإن استخدام هذا كمعيار سيؤدي إلى حدوث خطأ كبير في قياسات العينة الخاصة بك ، فكلما زاد الفرق في Cts بين جهاز المعايرة والعينة ، زادت الزيادة في الخطأ. أوصي بتجميع (كدنا) من مراحل العلاج المختلفة حتى تحصل على نوع من متوسط ​​مستوى التعبير واستخدامه كمعاير. يمكنك حتى حساب المتوسط ​​الحسابي لجميع نماذج Cts وأخذها كمعاير. قد تكون الأرقام مختلفة ولكن الكميات النسبية هي نفسها دائمًا.

راجع للشغل: يمكنك أن تأخذ المتوسط ​​الحسابي Ct لعيناتك الثلاث على مدار الساعة كمعاير ، وليس واحدًا فقط

مرحباً نيد لاند ، شكراً جزيلاً على اقتراحاتكم الطيبة. هذه هي المرة الأولى التي أسمع فيها أن استخدام تجمع (كدنا) من مرحلة معالجة مختلفة كمعاير في qPCR. ومع ذلك ، فإنني أتساءل كيف أشرح التعبير النسبي لهذه المقارنة. لأن ما أريد معرفته هو معرفة ما إذا كان العلاج مثل العدوى يمكن أن يحفز أو يقلل من التعبير عن السيتوكين المحدد. لذلك أقوم بمقارنة مستوى التعبير للمجموعة المعالجة بالمجموعة غير المعالجة (هنا أشير إلى 0 ساعة) ، وأحصل على مستوى التعبير النسبي. إذن ، ما أهمية مقارنة مستوى التعبير للمجموعة المعالجة الخاصة مع تجمع (كدنا)؟ إذا كان مستوى التعبير للمجموعة المعالجة الخاصة أعلى من متوسط ​​مستوى التعبير ، فربما يمكننا القول أن العلاج يزيد من التعبير. ومع ذلك ، إذا كان مستوى التعبير عن المجموعة المعالجة النوعية أقل من متوسط ​​مستوى التعبير ، إذا لم يكن يعني ذلك أن العلاج يقلل من التعبير.

أعتقد أيضًا أنه سيكون من الأفضل أخذ المتوسط ​​الحسابي Ct لعينات 0 ساعة كمعاير ، أريد أن أعرف كيفية القيام بذلك في برنامج ABI SDS. يبدو أنه يمكن اختيار عينة واحدة فقط كمعاير في برنامج SDS.

مرحبًا ، أنا مندهش مما قلته أنك عملت مع ddCT بدلاً من ذلك. هل يمكنك إعطاء مزيد من التفاصيل حول كيفية تحليل بيانات التعبير النسبي. شكرا

هل يمكنك تقديم بعض المعلومات الإضافية؟ ما هي Cts الخاصة بك للنقاط الزمنية 0h ، 3h ، 6h؟

ومرة أخرى ، لا يؤدي اختيار أداة المعايرة إلى تغيير نتائج القياس الكمي النسبية. إنها أكثر عملية تجميلية.

في النهاية ، لا يهم العينة التي تأخذها كمعاير. يجب أن يتمتع جهاز المعايرة بالخصائص التالية فقط:
- يجب التعبير عن جميع الجينات ذات الأهمية في جهاز المعاير
- عينة كافية من مادة المعاير متاحة خلال الدراسة بأكملها

لذلك يمكنك أيضًا مزج جزء من جميع العينات واستخدامه كمعاير.


4 الإجراءات التجريبية

4.1 تربية البعوض

الزهره. مصرية سلالة ليفربول (هدية من E. Devaney ، جامعة غلاسكو ، المملكة المتحدة) تمت تربيتها عند 28 درجة مئوية و 80٪ رطوبة مع فترة ضوئية ضوئية تبلغ 12:12. تمت تربية اليرقات في الماء وتغذيتها على طعام القطط الجاف من اليرقات التي تفقس حتى طور العذراء. تم نقل البعوض الناشئ في أقفاص مع وصول غير محدود إلى 10٪ وزن / حجم محلول السكروز. تم تغذية إناث البعوض على دم أرنب مخصب (Orygen Antibodies Ltd) باستخدام نظام Hemotek (Hemotek Ltd ، المملكة المتحدة).

4.2 زراعة الخلايا

الزهره. مصرية- تم الحفاظ على خلايا Aag2 المشتقة (هدية لطيفة من P. Eggleston ، جامعة Keele ، المملكة المتحدة) في وسط Leibowitz L-15 المضاف إليه 10٪ مصل بقري جنيني (FBS ، Gibco) ، 10٪ مرق فوسفات التريبتوز (TPB ، Gibco) و البنسلين - الستربتومايسين (جيبكو). تم الحفاظ على خلايا البعوض عند 28 درجة مئوية.

4.3 تصميم dsRNA وتوليف وتنقية لحقن البعوض

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام TRIzol (Thermo Fisher Scientific) من NBF الكامل الزهره. مصرية الإناث وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة باستخدام 1-bromo-3-chloropropane (Sigma) بدلاً من الكلوروفورم بما في ذلك معالجة DNase (TURBO DNase ، Ambion). تم إنشاء (كدنا) من 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام MMLV-transcriptase الرجعية (Thermoscientific) و hexamers العشوائية pDN6 (Invitrogen). تم استخدام (كدنا) لإنتاج استهداف الرنا المزدوج الجديلة ص 400, E75 و قبل 2 الجينات وقالب البلازميد ذبابة الفاكهةتم استخدام act5C-βGal (رقم المخزون 1220 الذي تم الحصول عليه من DGRC) من أجل dsLacZ (يستخدم كعنصر تحكم dsRNA). تم إنتاج الحمض الريبي النووي النقال (dsRNA) كما هو موصوف سابقًا (McFarlane وآخرون. ، 2020) باستخدام الاشعال الخاصة بالجينات مع تسلسل مروج بوليميريز T7 RNA (الجدول S1). تم تصميم dsp400-1 و dsago2 و dsE75-1 و dsE75-2 (كلاهما يستهدف جميع الأشكال الإسوية E75) باستخدام خدمة الويب E-RNAi (https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/0) وتقريباً لها نفس الحجم لاستبعاد تأثير الحجم. تم تصميم dsp400-2 مسبقًا (McFarlane وآخرون., 2020 ).

4.4 تصميم وإنتاج وتحضير سيرنا

استهداف siRNA قبل 2 تم تصميم (siago2) بناءً على الدراسة السابقة في الزهره. مصرية- خط الخلية المشتق (Varjak وآخرون. ، 2017). تم تصميم استهداف siRNA βGal (siLacZ ، المستخدم كعنصر تحكم) بواسطة Dharmacon (# D-002000-01-20). يمكن العثور على تسلسل siRNAs في الجدول S2. تم إنتاج وتنقية siRNAs إما لمعيار أو في الجسم الحي تطبيق (دارماكون). تم توفير siRNA للتطبيق القياسي على شكل مزدوج محلى جاهز للاستخدام بعد إعادة التعليق. سيرنا لـ في الجسم الحي تمت معالجة التطبيق عن طريق تبادل الأيونات المضادة (Na +) ، وتحلية المياه ، وتصفيتها بشكل معقم واختبارها من أجل الذيفان الداخلي. تمت إعادة تعليق siRNAs في PBS أو الماء الخالي من نوكلياز باتباع تعليمات Dharmacon ، مقسمة وتخزينها عند -20 درجة مئوية.

4.5 التسلسل

للتحقق من تطابق تسلسل siago2 مع الزهره. مصرية سلالة ليفربول المستخدمة في هذه الدراسة ، cDNA من الكل الزهره. مصرية تم استخدام الإناث لتضخيم منطقة الجينات المقابلة بواسطة PCR باستخدام مزيج KOD HOT Start الرئيسي (Sigma) وأشعال محددة (الجدول S1). تم تنقية جزء PCR باستخدام مجموعة استخلاص هلام QIAquick (Qiagen) وتم ربطه في pJET plasmid (Thermo Scientific) وتحويله إلى بكتيريا JM109 المختصة (Promega). تمت زراعة البكتيريا المحولة بين عشية وضحاها في وسط LB مكمل بالأمبيسيلين. تم استخراج DNA البلازميد من المستعمرات باستخدام QIAquick miniprep kit (Qiagen). تم إجراء تسلسل الإدخال بواسطة Source Bioscience. تم تحليل مطابقة التسلسل مع تسلسل siRNA على برنامج Serial Cloner v2.6.1.

4.6 dsRNA و siRNA حقن في البعوض وأخذ العينات

بعد يوم إلى يومين من ظهور البعوض ، تم حقن إناث البعوض المخدرة بالبرودة (العدد = 15-20 لكل حالة وتكرارها) باستخدام حاقن النانو (Nanoject II ، Drummond Scientific). تم خلط كاشف تعداء Cellfectin® II (Thermofisher) أو DharmaFECT2 (Horizon Discovery) مع وسط S2 (تقنيات الحياة) (1: 1 ، المجلد: المجلد). بعد 5 دقائق من الحضانة ، تمت إضافة هذا المزيج إلى محلول dsRNA / siRNA (1: 1 ، المجلد: المجلد) الذي تم تعديله مسبقًا باستخدام وسط S2 لإعطاء الكمية المطلوبة من dsRNA / siRNA لكل أنثى / حجم الحقن. ثم تم تحضين محلول الحقن لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة قبل الحقن. للظروف التي لا تحتوي على كاشف تعداء ، تم تعديل محلول dsRNA مع وسط S2 لإعطاء الكمية المطلوبة من dsRNA / siRNA لكل أنثى / حجم الحقن. بعد الحقن ، ترك البعوض يتعافى في صناديق من الورق المقوى مع كرات قطنية مبللة بنسبة 10٪ سكروز. لتقليل مخاطر العدوى البكتيرية بعد الحقن ، تُرك البعوض المحقون عند 21 درجة مئوية و 80٪ من الرطوبة لمدة 24 ساعة ثم انتقل إلى 28 درجة مئوية و 80٪ من الرطوبة. بعد أربعة أيام من الحقن ، تم تجانس 10 بعوض في 1 مل من كاشف TRIzol (Thermo Fisher Scientific) مع حبات زجاجية باستخدام الخالط Precellys 24 (Bertin Instruments) قبل استخراج الحمض النووي الريبي.

4.7 تحليل بقاء البعوض

تمت دراسة تأثير الحقن بكواشف مختلفة على بقاء البعوض عن طريق حقن 40-50 بعوضة في كل حالة ثم تكرارها. تم حقن نفس الحجم النهائي (414 nl) لجميع الظروف. عند استخدام dsRNA أو siRNA ، تم أيضًا حقن نفس الكمية (2 ميكروغرام) لجميع الظروف. تمت مراقبة البقاء على قيد الحياة لمدة 3 أيام عن طريق العد وإزالة البعوض الميت بالشفط.

4.8 تعداء الخلايا وأخذ العينات

تم طلاء 1.7 × 10 5 خلايا Aag2 في 24 لوحة جيدة. الصباح التالي، لاكز و قبل 2 استهداف siRNAs (5 نانوغرام / ميكرولتر نهائيًا) تم نقلها إلى خلايا Aag2 باستخدام Dharmafect2 (Horizon Discovery) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم أخذ عينات من الخلايا المعالجة SiRNA بعد يوم واحد من تعداء. تم طرد الخلايا عند 4 درجات مئوية و 400 ×ز لمدة 10 دقائق. ثم تم استبدال الوسائط الخلوية بـ 1 مل من TRIzol (Thermo Fisher Scientific) لمزيد من استخراج الحمض النووي الريبي.

4.9 استخراج الحمض النووي الريبي والنسخ العكسي

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا المعالجة سيرنا والإناث الكاملة باستخدام TRIzol (Thermo Fisher Scientific) باتباع تعليمات الشركة الصانعة باستخدام 1-bromo-3-chloropropane (Sigma) بدلاً من الكلوروفورم وعلاج DNAse (TURBO DNase kit ، Ambion). تم إنشاء (كدنا) من 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي في 40 ميكرولتر من خلال النسخ العكسي (RT) باستخدام النسخ العكسي MMLV (Thermoscientific) والسداسيات العشوائية pDN6 (Invitrogen) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. لكل عينة ، تم تحضير 3 RTs مستقلة (مجمعة بشكل أكبر) و 1 تحكم في النسخ العكسي السلبي (NRT). يشمل العلاج ببدائل النيكوتين جميع الكواشف باستثناء النسخ العكسي الذي تم استبداله بالماء. تم تخزين (كدنا) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في 2.8 ميكرولتر قسامات لمزيد من تحليل qPCR.

4.10 تحليل qPCR

تم إجراء qPCR باستخدام 2.8 ميكرولتر من قسامات (كدنا) مع مزيج FAST SYBR Green الرئيسي (النظم البيولوجية التطبيقية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة وباستخدام 7500 Fast PCR Machine (النظم البيولوجية التطبيقية). تم تصميم الاشعال المستخدمة للتحقق من كفاءة الضربة لتكون خارج مناطق الرنا المزدوج الجديلة لتجنب تضخيم الرنا المزدوج الجديلة وهي مدرجة في الجدول S1. تمت معالجة النتائج باستخدام 7500 Software v2.0.6 وتحليلها كما هو موضح سابقًا (Taylor وآخرون. ، 2019). تم استخدام نسخة الريبوسوم S7 كمرجع لقيم التعبير المعياري ، وتم تعيين geomean لمجموعة التحكم dsLacZ عند 1. تم حساب الحد الأدنى والأقصى لـ RQ من geomean وعرضه كأشرطة خطأ. لكل تجربة ، تم الحصول على البيانات من 3 مكررات بيولوجية و 10 إناث تم تجميعها لكل حالة وتكرارها.

4.11 تحليل احصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج Graph Pad v7.02. أجريت تحليلات بقاء البعوض من خلال منحنى البقاء واختبار Mantel-Cox من رتبة لوغاريتم. تم إجراء تحليل بيانات qPCR باستخدام غير مزدوج والذيل ر-اختبارات على قيم تعبير Log2- طبيعية وفقًا لطريقة تايلور (Taylor وآخرون., 2019 ).


التقنيات المستخدمة لدراسات التعبير عن الحمض النووي الريبي

يعتمد تحديد سمات الحمض النووي الريبي (RNA) على عدد من الطرق ، بعضها بسيط نسبيًا في الأداء ، والبعض الآخر أكثر تعقيدًا ، وبعضها يقتصر على الإنتاجية المنخفضة والبعض الآخر يسمح بالمعالجة المتوازية للعديد من العينات.

  1. PCR هي تقنية تمكين لمعظم الطرق المستخدمة حاليًا ويستمر استخدام PCR لنقطة النهاية التي تم تحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ، على الرغم من قدرتها المحدودة على القياس الكمي. لقد كان الوعي بمشكلات التباين المرتبطة بـ PCR طويل الأمد ، حيث وصف التقرير الأول التناقضات مع العينات المكررة والمتسلسلة التي تم تقييمها داخل المختبرات وفيما بينها منذ عام 1992 53. كما تم إبراز الافتقار إلى الفهم النظري للعمليات الديناميكية التي تنطوي عليها عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، خاصة فيما يتعلق بتضخيم منتجات التضخيم غير القابلة للإنتاج و / أو غير المتوقعة ، منذ عقود 54. يتم تجاهل هذه الملاحظات والآثار المترتبة على ذلك إلى حد كبير.
  2. كانت qPCR و RT-qPCR هي الطرق الأولى التي تعد بتقدير سريع وسهل للأحماض النووية واستمرار استخدامها على نطاق واسع ، مع البحث في PubMed عن مصطلحات "النسخ العكسي في الوقت الحقيقي PCR أو RT-qPCR أو qRT-PCR" عائدًا تقريبًا 5400 تم التأكيد على الحاجة إلى تحسين خطوة PCR كشرط أساسي يؤثر على الطبيعة الكمية لـ PCR منذ البداية 55 ، ومع ذلك لا يزال يشار إلى qPCR على أنه `` المعيار الذهبي '' 56 ، 57 ولا يزال واسع الانتشار يُنظر إليه على أنه سهل الإعداد ، ومتساهل في التنفيذ ، مع تفسير النتائج بسهولة ، على الرغم من تحدي اعتماد هذا المصطلح منذ سنوات عديدة 58. في الواقع ، هناك العديد من القضايا الحاسمة في سير العمل التي يجب معالجتها قبل استخلاص استنتاجات ذات مغزى بيولوجي وجديرة بالثقة 46 وهناك العديد من المنشورات التي تشكك في إمكانية استنساخ الطريقة الحقيقية وموثوقيتها واتساقها (تمت مراجعتها في 13). ومع ذلك ، بعد 8 سنوات من نشر المبادئ التوجيهية MIQE ، لا تزال العديد من الأوراق التي تبلغ عن بيانات qPCR تتجاهل معظم المعلومات الأساسية ، كما هو موضح في الجدول 1 ومناقشته أدناه.
  3. تسمح المصفوفات الدقيقة بإنتاجية أعلى بكثير من RT-qPCR ، ولكن نظرًا للزيادة في التعقيد والوقت المطلوب لأداء البيانات وتحليلها ، فإن هذه الطريقة آخذة في الانخفاض في الشعبية ، مع البحث في PubMed عن مصطلح "ميكروأري" حوالي 1600 استشهاد في عام 2016 كما هو الحال مع RT-qPCR ، هناك دليل على نقص أولي في متانة البيانات ، مع التركيز المبكر على استكشاف الأخطاء وإصلاحها التقنية بدلاً من توليد بيانات موثوقة ذات أهمية علمية 59 وتوقيعات التعبير السريري التي تعتمد على أي بروتوكول للمعلومات الحيوية يتم تطبيقه 60. تم الإبلاغ عن التوافق المبكر عبر الأنظمة الأساسية على أنه ضعيف 61 ، على الرغم من أن هذا قد يكون انعكاسًا لبروتوكولات ومعايير متغيرة حيث أدى الالتزام الصارم مؤخرًا بإجراءات التشغيل المعيارية الخاضعة للرقابة إلى إمكانية استنساخ أعلى داخل المختبرات وفيما بينها. مرة أخرى ، ليس من المستغرب أن يكون هناك تركيز على الحاجة إلى بروتوكولات محسّنة 63 ، وتدابير مناسبة لمراقبة الجودة 64 جنبًا إلى جنب مع إنشاء إرشادات إجماع لاستخدامها في التشخيص السريري 65. نظرًا لظهور تسلسل بندقية النسخ بالكامل أو تسلسل RNA-seq ، فمن الممكن مناقشة مدى طول استخدام المصفوفات الدقيقة ، ولكنها تشكل موردًا محتملاً هائلاً للمعلومات وقدمت إرثًا من البيانات المنشورة ، مهما كانت موثوقة ، أو غير ذلك ، يمكن.
  4. يعد تسلسل بندقية النسخ بالكامل أو تسلسل RNA-seq الأكثر تعقيدًا من الناحية الفنية وتكلفة واستهلاكًا للوقت لجميع طرق تحديد سمات الحمض النووي الريبي ، مما يجعل إجراء النسخ المتماثل أو تكرار التجارب أقل جدوى. تم وصفها في البداية على أنها طريقة كان التباين التقني فيها مرتفعًا للغاية بحيث لا يمكن تجاهلها 66 ، إلا أنه لا يزال من غير الواضح مدى قوتها وموثوقيتها ، على الرغم من تزايد استخدامها ، وهو ما ينعكس في 2700 اقتباس سجلتها PubMed في عام 2016. ومع ذلك ، فإن الإجماع هو أن RNA-seq يقدم فوائد الحساسية الفائقة 67 وقابلية التكاثر العالية 68 ، جنبًا إلى جنب مع القدرة على تحديد ميزات النسخ الجديدة مع الاستخدام المحتمل في الإعدادات السريرية 69. وجد فحص متعدد المنصات لبيانات RNA-seq بواسطة مشروع التحكم في جودة التسلسل (SEQC) أنه يمكن قياس قياسات التعبير الجيني النسبية ، ولكن ليس المطلقة ، بدقة وموثوقية عبر المختبرات ومنصات RNA-seq 70 وأن RNA-seq و microarray- كانت النماذج المستندة إلى المقارنة في التنبؤ السريري لنقطة النهاية 71. ينصب التركيز الحالي على تحليل البيانات بشكل عام ، حيث تتراوح قابلية الاستنساخ في ظل ظروف خاضعة للرقابة من 60٪ إلى 93٪ 72. التطبيع هو جانب خاص حيث يمكن أن يؤدي تطبيق منهجيات مختلفة إلى نتائج متناقضة 73-77. هناك أيضًا جهود جارية لتوليد مبادئ توجيهية قابلة للمقارنة مع MIQE ، لكل مرحلة من مراحل سير عمل RNA-seq لحماية الأهمية السريرية للبيانات وبالتالي ضمان تنبؤات سريرية موثوقة وقوية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن موثوقية الكثير من بيانات التسلسل تعتمد على متانة خطوات RT و PCR.
  5. طريقتان إضافيتان لتوصيف الحمض النووي الريبي متوسط ​​الإنتاجية هما نظام تحليل nCounter من NanoString ونظام OpenArray من Thermo Fisher. تتميز الأولى بأنها لا تتطلب خطوة RT ، والأخيرة هي تقليل كمية معالجة العينة المطلوبة. وجدت مقارنة بين التنميط وفرة mRNA بواسطة كل من التقنيات و RT-qPCR أن النتائج كانت قابلة للمقارنة على نطاق واسع بين الطرق الثلاث. ومع ذلك ، في حين أن نتائج NanoString و OpenArray كانت مترابطة جيدًا (ص = 0 · 95) ، اختلفت بيانات RT-qPCR اختلافًا كبيرًا عن كليهما (ص = 0 · 48 مع OpenArray و ص = 0 · 55 مع NanoString) 79. يعزو المؤلفون هذا إلى التباين المتزايد في تحضير العينة الناتج عن الكمية الأكبر من ماصات الفني وإعداد اللوح المطلوب لـ RT-qPCR التقليدي. ومع ذلك ، توضح هذه النتائج أيضًا كيف يمكن أن تكون النتائج متعارضة على الرغم من تنفيذ التقنيات والتحليلات بطريقة مناسبة. كما أنه يترك الباب مفتوحًا أمام احتمال أن تكون نتائج RT-qPCR صحيحة وأن تلك التي تم الحصول عليها بالطريقتين الأخريين ليست كذلك. يُعد هذا المنشور أيضًا مثالًا ممتازًا لمقدار التفاصيل الفنية التي يجب تضمينها للعلم المراد تقييمه.

توضح هذه النظرة العامة الموجزة لطرق التنميط الرئيسية للحمض النووي الريبي المستخدمة حاليًا القضايا التي تحرك النقاش القوي حول الموثوقية والأهمية البيولوجية / السريرية للعديد من البيانات المنشورة باستخدام الأساليب القائمة على الحمض النووي الريبي ، وتلقي الضوء على الأسباب المتنوعة الكامنة وراء إدراك ذلك هذه النتائج غير موثوقة وبحاجة إلى مراجعة 9 ، 10 ، 16 ، 26 ، 80-87.

أعاقت الطبيعة القصصية للتقارير ونقص البيانات الكمية حول حالات الفشل المحددة في إعادة إنتاج البحوث الطبية الحيوية المنشورة تقييمًا دقيقًا لمدى وخطورة عدم إمكانية إعادة الإنتاج. أدى ذلك إلى إنشاء مشروع التكاثر: بيولوجيا السرطان. كان الهدف من هذا المشروع هو تكرار النتائج المختارة من أبحاث بيولوجيا السرطان قبل السريرية عالية المستوى 88. تم الإبلاغ للتو عن النتائج الأولية من خمس دراسات وتشير إلى أن دراستين يمكن أن تكرر النتائج الأساسية التي أبلغ عنها المؤلفون الأصليون ، واحدة لم تستطع واثنتان غير قابلتين للتفسير بسبب مشكلات فنية. ومن المثير للاهتمام ، أن إحدى النتائج المكررة 89 أكدت تقليل التنظيم الانتقائي لنسخ MYC عن طريق النسخ العكسي (RT) الكمي في الوقت الحقيقي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR). قارنت التجربة الأصلية مستويات MYC mRNA في خلايا التحكم والخلايا المعالجة لمدة 1 أو 8 ساعات باستخدام مثبط جزيء صغير وسجلت انخفاضًا في التنظيم في الخلايا المعالجة إلى 6 · 9 ٪ و 8 · 8 ٪ من الخلايا الضابطة. سجلت الدراسة المكررة انخفاضًا في التنظيم إلى 14.6٪ و 12.6٪ ، وهو أمر مشابه بالفعل ولكنه مع ذلك يمثل فرقًا مزدوجًا. هذا مهم لأن التغييرات في مستويات الحمض النووي الريبي التي أبلغت عنها العديد من المنشورات التي تستخدم بيانات RT-qPCR تميل إلى أن تكون في هذا النطاق ، عادةً بين 1-5 وخمسة أضعاف.

نتيجة للعملية البسيطة السطحية لسير عمل RT-qPCR هي أنه من ناحية ، اعتمد العديد من المشغلين غير المدربين وغير المهرة هذه التقنية. من ناحية أخرى ، فإن معرفة مكان البحث يسمح للقارئ المتمرس لمنشور ما بتحديد مجالات المشاكل والتأكد مما إذا كانت النتائج المبلغ عنها من المحتمل أن تكون حقيقية. فيما يلي ملخص للقضايا المنهجية التي تعيق التفسير المتسق للنتائج ، جنبًا إلى جنب مع أمثلة واضحة توضح بيانياً سبب عدم موثوقية النتائج المبلغ عنها في كثير من الأحيان.


ما هي قيمة Ct؟

يتم تعريف قيمة عتبة الدورة (Ct) للتفاعل على أنها رقم الدورة عندما يمكن اكتشاف مضان منتج PCR أعلى إشارة الخلفية. من أجل حساب قيمة Ct ، من الضروري رسم خط أفقي (عتبة) على مخطط التضخيم. غالبًا ما يتم تحديد موضع هذا الخط بواسطة برنامج qPCR ، ومع ذلك ، يمكن للمستخدمين وضع هذا الخط يدويًا. من الناحية المثالية ، يتم وضع العتبة عند النقطة التي يكون فيها التفاعل في المرحلة الأسية ، وبالتالي لن يتم الخلط بينه وبين إشارة الخلفية.

بالنظر إلى المثال أعلاه ، يمكن ملاحظة أن رقم الدورة عندما يتقاطع الحد مع مخطط التضخيم هو 19. لذلك ، ستكون قيمة Ct 19 في هذه الحالة.

ترتبط قيمة Ct بكمية منتج PCR في التفاعل. كلما انخفضت قيمة Ct ، زاد عدد منتج PCR الموجود. هذا لأنه يستغرق عددًا أقل من دورات PCR ليتم اكتشاف ذلك المنتج عبر إشارة الخلفية.


بعض الأسئلة qPCR (بما في ذلك الأسئلة الساذجة). - المزالق الأولى وما إلى ذلك. (17 نوفمبر 2005)

مرحبًا ، أنا أستخدم takara sybrgreen extaq kit على cycler mj opticon2.
لقد كنت أحاول إعداد تجاربي الأولى في qPCR وتعثرت في بعض الأسئلة / المشاكل ، وآمل أن يتمكن أحدهم من مساعدتي.

1. أنا أستخدم طريقة PFAFFL لتحديد التعبير الجيني النسبي.
عندما أريد تحديد النسبة بين عينتين ، في إحدى عيناتي
لن يظهر المنحنى أبدًا. هذا يعني أنني لن أتمكن أبدًا من تحديد عامل ، أو يجب أن أفعل ذلك
فقط اضبط قيمة ct على 50. لكن هذا يبدو غريباً بالنسبة لي ، لأن لدي فرقة باهتة
عندما أقوم بعمل RT PCR التقليدي.

2. لماذا يقول الناس أن العتبة يجب أن تكون متساوية للهدف والمرجع
الجين؟ لا أحصل على الأساس المنطقي وراء ذلك ، لا ينبغي أن يحدث فرقًا طالما أن الحد الأقصى يكمن في المرحلة الخطية للتضخيم ، أليس كذلك؟

3. لقد واجهت اختلافات كبيرة interassay في قيم ct. ماذا يمكن أن يكون السبب الرئيسي لذلك؟

4. عندما أقوم بتشغيل منتجات pcr الخاصة بي على الجل ، غالبًا ما أواجه تضخيمًا غير محدد في إحدى النسخ الثلاثية. لكن ما هو السبب الرئيسي لذلك؟ لقد قمت بتقطيعه في وقت واحد تقريبًا. هل يمكن أن يكون هو الاشعال ، أو القالب نفسه (ربما تدهورت جزئيا).

5. لقد واجهت قممًا إضافية في منحنيات الانصهار في كلتا الحالتين ، عندما يكون القالب شديد التركيز ، أو عندما يكون القالب مخففًا جدًا ، ولكن هذا لا يحدث أبدًا مع البادئات hprt1 التي أستخدمها ، والتي تعطي إشارة لطيفة أو لا تعطي إشارة .

6. هل سيتعين علي عمل منحنى قياسي جديد لحساب الكفاءة عندما أقوم بزيادة درجة حرارة خطوة التلدين للتفاعل ، لجعل الإشارة أكثر تحديدًا؟

7. كيف يمكن أن تكون كفاءة تفاعل pcr أكثر من 2. يمكنها أن تفعل أكثر من ضعف الحق؟
ربما شخص ما لديه شرح جيد لهذا.

8. ما هي أفضل طريقة لتخزين الحمض النووي المخفف الخاص بك؟ لقد استخدمت 20 و 4 درجات ، ما قد لا يكون الأفضل.

الكثير من الأسئلة ، آسف ، ولكن ربما يكون لدى شخص ما الوقت لإعطائي بعض الإجابات.

مرحبًا ، أليس لديك أي شخص إجابة على سؤال واحد على الأقل؟
. يمكن & # 39t يكون ممكنا ، أليس كذلك؟

سأكون ممتنًا حقًا لبعض الإجابات & # 33
في صحتك،
مارتن

حسنا
أنا & # 39m لا أتعامل بشكل منتظم مع QPCR لذا سأحاول الإجابة بشكل صحيح على الأسئلة.

يعتمد QPCR على المقارنة بين شرطين (المرجع والهدف). لذا فمن الصعب إعداد اختبار مقارن جيد.

هل أجريت هذه الاختبارات في نفس اليوم؟ (أعني فحصين بنفس العينة الأساسية أو هل أجريت هذين الفحصين في أيام مختلفة؟)

عندما تقول في نفس الوقت تقريبًا ، هل تعني أنك صنعت مزيجًا مقسمًا إلى ثلاثة؟ أم أنك ماصة ثلاث مرات؟ في الحالة الأخيرة تغيير في تركيبة الجلسرين النهائية. (أثناء سحب الأنزيم) يمكن أن يؤثر على الخصوصية العامة. لكنها مفاجأة للغاية.

إذا فهمت هذه النقطة جيدًا ، فأنت تقصد أنه بعد دورة واحدة ، قد يقود جزيء واحد إلى أكثر من جزيئين. كما أعلم أنه مستحيل نظريًا. وعادة ما تكون قريبة من 1.8

لم أقم بتخزين cDNA الخاص بي. ولكن إذا اضطررت إلى ذلك ، فسأقول أن -20 أفضل من 4 درجات.

نأمل أن يوضح ذلك قليلا.
فريد

كيف يمكن أن تكون كفاءة تفاعل pcr أكثر من 2. يمكنها أن تفعل أكثر من ضعف صحيح؟
ربما شخص ما لديه شرح جيد لهذا.

يبدو أنك & # 39 واجهتك مشكلة في أسلوب سحب العينة. يجب أن تكون الكفاءة

1. يعتمد هذا على المنحنى القياسي. تخميني هو أنك & # 39ve تعزو الكثير من cDNA في المعايير إلى المبلغ الذي كتبته لكل عينة. على سبيل المثال ، بالنسبة لعينة 1/10 ، قمت بالفعل بوضع 1/6. هذا من شأنه أن يغير ميل المنحنى القياسي الخاص بك ، وهو ما تستند إليه الكفاءة.

لقد واجهت اختلافات كبيرة interassay في قيم ct. ماذا يمكن أن يكون السبب الرئيسي لذلك؟

الأشياء تتغير. قد يختلف مقدار البادئات قليلاً ، وقد يختلف مقدار cDNA قليلاً. قد تكون الأنابيب مغبرة قليلاً ، أو زيتية ، أو من يدري ماذا. حاول الحفاظ على الأشياء كما هي تمامًا خلال كل جولة. هذا يجب أن يحد من التباين.

ما هي أفضل طريقة لتخزين الحمض النووي المخفف الخاص بك؟ لقد استخدمت 20 و 4 درجات ، ما قد لا يكون الأفضل.
-20 & # 96 ج. ضعه في قسامات ، وقم بتجميده. it'll go off otherwise.

will i have to make a new standard curve for efficiency calculation when i am increasing the annealing step temp of the reaction, to make the signal more specific?

fred was right, just reitterating it all for ya.

I am fairly new at qPCR, but I have the same problem, with excessively high efficiencies. I just watched a webcast ("How Reliable is Your qPCR Data?" presented by Drug Discovery and Development) in which that exact question was addressed.

The experts on the panel said that high efficiencies happen when the amount of template in your reaction is very low, resulting in high Ct's - so that at your high dilutions, the Ct's get "scrunched". They called this problem "saturation", but I don't understand exactly what they mean by that. does anyone else?

Anyway, they said that you need to throw out the "scrunched" Ct values at the end and only use the lower values to generate your efficiency curve.

(I tried to post the link to the on-demand webcast, but it would not show the whole link in the preview. ! Sorry.)

لا يمكن أن تكون. If you get it higher then 2 that means something is wrong with assay. Too much or too little template (optimize nucleic acid extraction and RT), Pipeting error (calibrate, lerger volumes), also they recommend to omit inhibited dilusions in validation test, in other word remove outliers.

Sorry I don't get the question "curve will never come up" .
7. how can the efficiency of a pcr reaction be more than 2. it can't do more than double right?
maybe someone has a nice explaination for this.

لا يمكن أن تكون. If you get it higher then 2 that means something is wrong with assay. Too much or too little template (optimize nucleic acid extraction and RT), Pipeting error (calibrate, lerger volumes), also they recommend to omit inhibited dilusions in validation test, in other word remove outliers.

hi thanks for your replies

with the curve will never come up, i mean that there is . soo little template?? that the curve will never cross the treshold line. if that happens, you set the ct to 50 or higher (i.e. such a high treshold would indicate that there is nothing in there. ) for calculations.

i don"t think that there is something wrong with the assay, if the efficiency gets higher than 2.
check this paper for reference:
pfaffl paper

Pfaffl paper link doesn't work. Maybe if elongation is too long or too much primers or template polymerase can copy more then once. Any way assay needs optimisation.

If there is no proper curve then any quantification would be impossible. Even when Ct values are above 35 quantification gets very dificult, becouse of efficiency problems.


شكر وتقدير

This study was supported by Fondazione Italiana per la Lotta al Neuroblastoma, Ministero dell'Università, Ricerca Scientifica e Tecnologica, and Ministero della Salute/Regione Liguria (project: "Identification of tumor biomarkers through a biology-driven integrated approach"). Authors are grateful to Federica Del Grosso (Translational Paediatric Oncology, IST, Genoa, Italy) for cell cultures and Silvia De Luca (Fondazione Italiana per la Lotta al Neuroblastoma, Genoa, Italy) for language revision. A special thank to Giorgio Canessa, Caterina Cremonesi and Carlo Costa (Eppendorf Italia, Milan, Italy) for technical assistance.


RNA-seq

In comparison to microarrays, RNA-sequencing (or RNA-seq for short) enables you to look at differential expressions at a much broader dynamic range, to examine DNA variations (SNPs, insertions, deletions) and even discover new genes or alternative splice variations using just one dataset. Bear in mind that RNA-seq is still more expensive than microarrays and presents a bigger challenge in the planning stage though.

Firstly, you’ll have to decide which technology to use (Illumina, Solid, IonTorrent, PacBio etc – or a combination of these), what kind of library preparation to go for (strand-specific or not, barcode or not, amplified by PCR or not, remove rRNA or use oligoT beads) and what kind of sequencing you want (read length, single or paired end). And it does not stop there – you have to decide how many reads you want to sequence. Is 100x transcriptome coverage enough? It may not be if you want to analyze weakly expressed genes.

When you finally get the data, you will have to decide how to analyze it – there are already some good practices available (Tuxedo protocol for RNA-seq and GATK for SNP calling), but since the so-called “wet lab” advanced rapidly the pipelines quickly become obsolete, slow, or just don’t work anymore.

Want to perform RNA-seq bioinformatics yourself and do not want to pay a pile of money for software suites such as CLC Genomics? Then prepare to say goodbye to nice graphical interfaces. It is all Linux-based software and scripts come in different programming languages, diverse file formats that will require more than a single tool to comprehend for complete analysis. Even when all you wish to obtain are fold-changes from a single RNA-seq, you’ll have to choose from many software options that each claim to perform best for each of the standard 5 steps (adapter trimming, filtering, alignment/mapping, counting, normalization and statistical analysis) – see the list of short read alignment programs. Based on the decisions you make, the fold changes and the number of DE genes will differ accordingly.

Hiring a bioinformatician or a statistician translates to more costs in addition to library prep and sequencing expenses. Also, consider that the files you get out of the sequencers are massive (few GB per sample), so be sure to check if you need more space and computing power.

RNA-seq makes sense if you want to find DE genes in a huge, non-sequenced genome. If you are working with small genomes like bacteria for example, sequence its genome first! Lack of a reference genome means you will have to assemble the transcriptome “de-novo”, for which you will need a lot of RAM and some serious computing power if you do not want to wait for ages.

Again, you will have at least 5 of “the best” programs or pipelines to do it. This means you can get several versions of the transcriptome assembly from which you have to choose the best reference. Some guidelines to assess transcriptome assembly quality already exist, but may not hold true for all organisms and datasets so be cautious. The problem is that no parameter really guarantees that the transcripts you are interested in are really assembled correctly. For proper interpretation of RNA-seq results, transcriptome assemblies lack the confidence you get with a good quality reference sequence. Although RNA-seq is an invaluable tool to study gene expression and variation, make sure you carefully plan your experiments and estimate the costs before diving into it.

Is there an off-the-bat answer to which assay you should choose for your next gene expression experiment?

Most likely not. But there are a couple of simple questions you can answer that will help steer you in the right direction, like “How many genes am I analyzing?” أو “What is my experiment budget?” او حتى “Am I properly trained to carry out this assay?” Answer as many of these questions and come back to this guide to find your ideal pick!


شاهد الفيديو: qPCR real-time PCR protocol explained (كانون الثاني 2022).