معلومة

3.4: الكشف الكمي عن البروتين (النشاط) - علم الأحياء


الخلفية التجريبية

مصل الأبقار الزلال (BSA) هو بروتين يدور في دم الأبقار. يمكن استخدام BSA المنقى مع محلول Biuret في التخفيفات التسلسلية لتوليد a المنحنى القياسي. سيوضح المنحنى القياسي العلاقة بين التركيز ( المتغير التابع) والامتصاصية عند 540 نانومتر ( مستقل عامل). يمكننا بعد ذلك استخدام هذا المنحنى لتقدير تركيز العينات غير المعروفة.

1. على الرسم البياني ، هل تتذكر أي محور تابع وأي متغير مستقل؟

2. في الجدول أدناه ، هل يمكنك تحديد العينات التي تحتوي على الضوابط السلبية والتي هي الضوابط الإيجابية?

3. ما هو التنبؤ بالامتصاصية أو كثافة اللون للأنابيب المختلفة؟

معايير BSA المخففة

  1. تسمية 9 أنابيب 1-9.
  2. اجمع بين مكونات الجدول أدناه لتوليد التركيز المناسب للحلول.

  1. ضع الأنبوب 1 (فارغ) في الكوفيت وقياس الامتصاصية (أ) في مقياس الطيف الضوئي عند 540 نانومتر.
  2. معايرة مقياس الطيف الضوئي لقراءة 0 في أ540 نانومتر.
  3. اقرأ كل عينة بالتسلسل في أ540 نانومتر وقم بتسجيل القيم في الجدول أدناه.

  1. ارسم كل إضعاف BSA في برنامج جداول بيانات مثل Excel على أنه مخطط مبعثر.
  2. قم بإنشاء أفضل خط ملائم لهذه المعايير باستخدام معادلة الخط.
  3. استخدم معادلة الخط لتقدير تركيز العينة غير المعروفة.

منحنى المناسب

قم بتشغيل المحاكاة أدناه لفهم كيف يمكنك استخدام سلسلة التخفيف القياسية لتقدير تركيزات العينة الخاصة بك.

انقر على الصورة أعلاه لبدء محاكاة تركيب المنحنى.

برنامج Scatterplot التعليمي

استخدم البرنامج التعليمي أدناه وشاهد عند 1.25X لرسم بياناتك الخاصة.


3.4: الكشف الكمي عن البروتين (النشاط) - علم الأحياء

مراجعة مقايسات كمية البروتين ومسح حول فحوصات البروتين بناءً على المنشورات الرسمية.

يعد القياس الدقيق للبروتين أمرًا ضروريًا لدراسات البروتين في العديد من موضوعات البحث. تم تطوير مجموعة واسعة من الطرق المختلفة لتقدير كل من الخلائط المعقدة من البروتينات وكذلك نوع واحد من البروتين. تشتمل طرق تقدير كمية البروتين الكلي على الطرق التقليدية مثل قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر ، وحمض بيسينشونينيك (BCA) ومقايسات برادفورد ، بالإضافة إلى طرق بديلة مثل فحوصات Lowry أو المقايسات الجديدة التي طورها الموردون التجاريون ، والتي غالبًا ما توفر تصميمًا جيدًا ، طقم مناسب لكل نوع من الفحص. تشمل طرق تقدير كمية البروتين الفردية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وتحليل اللطخة الغربية ، ومؤخراً ، قياس الطيف الكتلي ، من بين أمور أخرى. يعد القياس الدقيق للبروتين أمرًا ضروريًا لجميع التجارب المتعلقة بدراسات البروتينات في العديد من الموضوعات البحثية. مختلفة تم تطوير مجموعة واسعة من الطرق المختلفة لتقدير كل من خليط البروتينات المعقدة في اختبار معين لمحتوى البروتين الكلي وكذلك لنوع واحد من البروتين. تشتمل طرق تقدير كمية البروتين الكلي على طرق تقليدية مثل قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر ، وحمض بيسينشونينيك (BCA) ومقايسات برادفورد ، بالإضافة إلى طرق بديلة مثل Lowry أو المقايسات الجديدة التي طورها الموردون التجاريون. عادة الموردين التجاريين الذين يقدمون في كثير من الأحيان مجموعة ملائمة جيدة التصميم لكل نوع من أنواع المقايسات. تشمل طرق تقدير كمية البروتين الفردية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وتحليل اللطخة الغربية ، ومؤخراً ، قياس الطيف الكتلي ، من بين أمور أخرى. في بعض الحالات ، قد تتطلب لوائح أو قوانين المجموعة التجارية طرقًا محددة لتقدير كمية البروتين. على سبيل المثال ، توصي الرابطة الدولية لصناعة المصل (www.serumindustry.org) ، وهي مجموعة تجارية لموفري المصل ، بطريقة Biuret لتحديد محتويات البروتين في منتجات المصل.

نناقش هنا بعض الطرق الشائعة المستخدمة لتحديد تركيز البروتين في المحلول ، مع إبراز المرافق والقيود. من المهم أن نلاحظ أن أيا من فحوصات البروتين هذه ليست خاصة بالبروتينات ، مما يعني أن المكونات غير البروتينية قد تتداخل ، أو دقيقة بشكل موحد ومتوافقة مع جميع البروتينات. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتداخل تعديلات البروتين مع تقدير تركيز البروتين لبعض المقايسات عند مقارنتها بالبروتين غير المعدل [3 ، 4]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض المقايسات ، على سبيل المثال مقايسة 3- (4-carboxybenzoyl) quinoline-2-carboxaldehyde (CBQCA) تكون فعالة أيضًا عند استخدامها لقياس الببتيدات أو البروتينات المثبتة على السطح أو المغلفة [5].

يلخص الجدول 1 المقايسات الكمية الكلية للبروتين المشترك. الأقل شيوعًا ، مثل Pierce 660 من Thermo (كتالوج رقم 22660) [6] ، وكمية بروتين NanoOrange [7] ، ومقياس التألق Qubit [8] ، ومجموعة اختبار تخليق البروتين المستندة إلى O-proparyl-Puromycin للبروتينات الناشئة [9] ، لا تناقش. من المهم تقييم توافق كل اختبار مع أنواع العينات ، ونطاق الفحص ، وحجم العينة ، وتوافر مقياس طيف ضوئي مناسب ، بالإضافة إلى الوقت والتكلفة.

فحص استيعاب آلية حد الكشف مزايا سلبيات
امتصاص الأشعة فوق البنفسجية280 نانومترامتصاص التيروزين والتربتوفان0.1-100 ميكروغرام / ملحجم عينة صغير وسريع ومنخفض التكلفةغير متوافق مع المنظفات وعوامل تغيير التشبع ، تقلبات عالية
حمض بيسينشونينيك562 نانومتراختزال النحاس (Cu 2+ إلى Cu 1+) ، تفاعل BCA مع Cu 1+ 20-2000 ميكروغرام / ملمتوافق مع المنظفات وعوامل التحريف ، تقلب منخفضتوافق منخفض أو معدوم مع عوامل الاختزال
برادفورد أو كوماسي أزرق لامع470 نانومترتشكيل معقد بين صبغة كوماسي الزرقاء الرائعة والبروتينات20-2000 ميكروغرام / ملمتوافق مع عوامل الاختزال ، وسريعغير متوافق مع المنظفات
لوري750 نانومتراختزال النحاس بالبروتينات ، تقليل Folin-Ciocalteu بواسطة مركب البروتين النحاسي10-1000 ميكروغرام / ملحساسية عالية ودقةغير متوافق مع المنظفات وعوامل الاختزال ، إجراء طويل

تعطي الأحماض الأمينية العطرية التيروزين والتريبتوفان البروتينات الخاصة بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية (UV) عند 280 نانومتر ، والتي تستخدم بشكل روتيني لتقدير تركيز البروتين. تساهم روابط فينيل ألانين وثاني كبريتيد أيضًا في الامتصاص عند 280 نانومتر ، وإن كان ذلك بشكل طفيف. هذه الطريقة بسيطة ، ويمكن إجراؤها باستخدام حجم عينة صغير للغاية ، يصل إلى 0.5 ميكرولتر ، نظرًا لأن مقاييس الطيف الضوئي الجديدة تستخدم نظامًا للاحتفاظ بالعينة أثناء القياس. ومع ذلك ، يجب ألا تحتوي عينة البروتين على أي مكونات غير بروتينية ذات امتصاص كبير عند 280 نانومتر ، مثل ملوثات الأحماض النووية [10]. بالنسبة لعينات البروتين النقي ، يجب معرفة تسلسل الحمض الأميني الدقيق للبروتين الذي تم تحليله ويجب حساب معامل الامتصاص الخاص بالبروتين المعين قبل تحديد تركيز المحلول [11 ، 12]. هذه الطريقة هي الأسرع ، ولكنها عرضة للخطأ ولا تتوافق مع مجموعة واسعة من طرق استخراج البروتين التي تستخدم في كثير من الأحيان المنظفات وعوامل تغيير الصفات.

تم اختراع مقايسة حمض البيسينشونينيك (BCA) في عام 1985 بواسطة Paul K. Smith في شركة Pierce Chemical Company ، الموزع الرئيسي لهذا الاختبار [13]. تعتمد كل من مقايسات BCA و Lowry على تحويل Cu 2+ إلى Cu 1+ تحت الظروف القلوية. هذا التحويل يسمى تفاعل بيوريت (الشكل 1) ويتأثر بالعديد من بقايا الأحماض الأمينية (السيستين ، السيستين ، التيروزين ، والتربتوفان) والعمود الفقري الببتيد.

BCA هو كاشف كروموجيني محدد لـ Cu 1+ وفي الخطوة الثانية من التفاعل يتفاعل جزيءان من BCA مع أيون Cu 1+ واحد. كمية Cu 2+ المخفضة هي دالة لتركيز البروتين التي يمكن تحديدها بطريقة طيفية عن طريق تغيير لون محلول العينة من اللون الأزرق إلى اللون الأرجواني ، والذي يمتص الضوء عند 562 نانومتر. الامتصاص يتناسب طرديًا مع كمية البروتين الموجودة في المحلول ويمكن تقديره من خلال المقارنة بمعيار بروتين معروف ، مثل ألبومين المصل البقري (BSA) [10 ، 14 ، 15]. نظرًا لأن مساحة سطح الجسم والبروتين / الببتيد المقاس قد يكون لهما تطور مختلف للون ، يجب تعديل كمية البروتين / الببتيد. على سبيل المثال ، قام Nortley R وآخرون بمضاعفة التركيز المقاس لببتيدات أميلويد بيتا مع مجموعة اختبار بروتين بيرس BCA و BSA كمعيار بعامل 1.51 [16].

يعتبر اختبار BCA متسامحًا بشكل عام مع المنظفات الأيونية وغير الأيونية مثل NP-40 و Triton X-100 وعوامل تغيير التشبع مثل اليوريا وكلوريد الجوانيدينيوم التي تميل إلى التداخل مع فحوصات البروتين اللونية الأخرى مثل Lowry (الجدول 2) [15]. ومع ذلك ، فإن بعض الكواشف ، مثل حمض إيثيلين أمينيتتراسيتيك (EDTA) [17] ، الذي يقلل من السكريات [18 ، 19] والدهون [20] ، يمكن أن يتداخل مع اختبار BCA. يمكن تخفيف آثار مثل هذه التداخلات من خلال استراتيجيات مثل تقليل المواد المتداخلة من خلال غسيل الكلى أو ترشيح الهلام أو إذا كان تركيز البروتين مرتفعًا بدرجة كافية ، عن طريق تخفيف العينة. اقترح Reichelt et al تعديلات بسيطة على الطريقة التي يمكن أن تؤدي إلى تحسينات واضحة في دقة القياس ، خاصة بالنسبة للبروتين غير المنقى في الحلول المعقدة مثل وسائط المزرعة [21]. يستخدمون عامل التصحيح المعطى عن طريق قياس ارتفاع بروتين BSA الداخلي المضاف إلى كل عينة. بناءً على دراساتهم ، يمكن تحسين دقة القياس الكمي لبروتين BCA خمسة أضعاف ، مما يجعل دقة القياس الكمي لـ BCA قابلة للمقارنة مع الأساليب الأكثر تكلفة [21].

هناك عامل آخر يتعارض مع دقة مقايسة BCA وهو وجود بقايا معدلة كيميائيًا في البروتين. قام كل من برادي وماكنوتان بتقييم تأثير ميثيل ليسيل على مقايسات برادفورد و BCA ووجدوا أنه بالنسبة لمقايسة BCA ، تم المبالغة في تقدير تركيزات البروتين في عينات البروتين الميثلي [4].

NP-40السكروز
امولجينجليكاين ، درجة الحموضة 2.8
حبيسالجلوكوز
DTTEDTA
تريتون اكس 100كلوريد الصوديوم
اليورياهيدروكسيد الصوديوم
غوانيدين حمض الهيدروكلوريككبريتات الامونيوم
أسيتات الصوديوم ، درجة الحموضة 5.5SDS

تمتلك Thermo Fisher Pierce إصدارًا جديدًا من اختبار البروتين BCA ، يُدعى مجموعة فحص البروتين بيرس ™ BCA - متوافق مع عامل التخفيض ، والذي يتسامح مع ثنائي ثيوثريتول (DTT) و 2 مركابتوإيثانول (BME) و TCEP وعوامل اختزال ثاني كبريتيد أخرى [22].

يتميز اختبار BCA بالعديد من المزايا. مقارنة بالطرق الأخرى ، يعتبر اختبار BCA من أكثر الطرق حساسية (يمكنه اكتشاف البروتينات بتركيزات منخفضة تصل إلى 5 ميكروغرام / مل). لديها تقلبات أقل من غيرها (على سبيل المثال ، اختبار برادفورد) ، ويمكن استخدامها لقياس نطاق واسع من تركيز البروتين. علاوة على ذلك ، يمكن زيادة حساسيته عن طريق إجراء الفحص في وجود مستشعرات النانو البلازمية كما هو الحال في مقايسة SPR-BCA (رنين Plasmon السطحي - BCA) التي اقترحها Liu et al [23]. مع هذا الاختبار ، كان حد الكشف 3.4 نانوغرام / مل وكان نطاق العمل العام 0.5 إلى 1000 ميكروغرام / مل ، وبالتالي خفض تركيزات البروتين التي يمكن قياسها باستخدام اختبار BCA التقليدي.

يعتبر اختبار برادفورد ، الذي وصفه في الأصل الدكتور ماريون برادفورد في عام 1976 ، طريقة شائعة لتحديد تركيز البروتين. يعتمد على تكوين مركب بين صبغة كوماسي الزرقاء الرائعة G-250 والبروتينات في المحلول. توجد الصبغة الحرة في أربعة أشكال أيونية مختلفة. يرتبط الشكل الأزرق الأنيوني بالبروتينات وله امتصاص عند 595 نانومتر (الشكل 2). يتم تحديد تركيز البروتين بكمية الصبغة في الشكل الأيوني الأزرق المقاسة بامتصاص المحلول عند 595 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي [24]. ترتبط الصبغة في الغالب بمخلفات الأرجينين ، التربتوفان ، التيروزين ، الهيستيدين ، والفينيل ألانين [10].

يستخدم معظم الباحثين BSA كمعيار للبروتين لأنه غير مكلف ومتاح بسهولة ولكنه ليس مناسبًا دائمًا. في الواقع ، أحد عيوب استخدام مساحة سطح الجسم هو أنه يظهر استجابة صبغة قوية وقد يؤدي إلى التقليل من تقدير تركيزات البروتين في العينات. هذه ليست مشكلة إذا كانت هناك حاجة فقط لتركيزات نسبية من العينات. ومع ذلك ، إذا كان من الضروري إجراء قياس دقيق لتركيز البروتين ، فإن الغلوبولين المناعي G (IgG) ، أو الليزوزيم ، أو معايير البروتين الأخرى غالبًا ما تكون خيارات أفضل ، اعتمادًا على عينة البروتين [24].

من بين مزايا اختبار برادفورد التوافق مع عوامل الاختزال المستخدمة لتثبيت البروتينات في المحلول ، والتي لا تتوافق مع مقايسة Lowry وإلى حد ما غير متوافقة مع اختبار BCA. أيضًا ، نظرًا لأن الصبغة لا ترتبط بالببتيدات مع انخفاض ميغاواط ، يمكنك قياس تركيزات البروتينات عالية الوزن الجزيئي (MW) في وجود الببتيدات الملوثة [10 ، 24].

يتمثل القيد الرئيسي لمقايسة برادفورد في عدم توافقه مع معظم المنظفات ، والتي تُستخدم بشكل روتيني لإذابة بروتينات الغشاء. (من المثير للاهتمام ، مع ذلك ، أن المستويات المنخفضة جدًا من المنظفات غير الأيونية ، مثل Triton X-100 ، قد تحسن الحساسية والتنوع في اختبار برادفورد [25]). يمكن إزالة المنظفات عن طريق الترشيح الهلامي أو غسيل الكلى ، أو من خلال الترسيب بفوسفات الكالسيوم [24] أو الأسيتون. يمكن أن تؤدي هذه الطرق إلى تخفيف العينة أو فقد العينة ، مع استرداد 70٪ أو أقل من كمية البروتين الأولية. وصف Cheng et al ترسيب البروتين والطريقة القائمة على مقايسة برادفورد التي تسمح بتقدير كمية البروتين بسرعة ، حتى عندما يحتوي محلول البروتين على مواد متداخلة [26]. تحقق هذه الطريقة معدلًا محسنًا لاستعادة البروتين بعد مرور ساعة واحدة فقط على الترسيب مع الأسيتون بعد إضافة السكروز ، وهو مكون لا يتداخل مع اختبار برادفورد.

اختبار Lowry ، الذي اقترحه Oliver H. Lowry في عام 1951 ، يعتمد على تفاعلين كيميائيين (الشكل 3). التفاعل الأول هو اختزال أيونات النحاس في ظل الظروف القلوية ، والتي تشكل معقدًا مع روابط الببتيد (تفاعل Biuret الذي تمت مناقشته أعلاه). والثاني هو اختزال كاشف Folin-Ciocalteu بواسطة مركب رابطة النحاس الببتيد ، والذي يتسبب لاحقًا في تغيير لون المحلول إلى اللون الأزرق مع امتصاص في نطاق 650 إلى 750 نانومتر يمكن اكتشافه باستخدام مقياس الطيف الضوئي [10]. يمكن تقدير كمية البروتين في العينة باستخدام منحنى قياسي لمحلول بروتين معياري محدد مثل مساحة سطح الجسم.

تتمثل مزايا هذا الاختبار في حساسيته ، والأهم من ذلك ، دقته. ومع ذلك ، فإنه يتطلب وقتًا أطول من المقايسات الأخرى والعديد من المركبات المستخدمة بشكل شائع في المحاليل المنظمة لتحضير البروتين (مثل المنظفات والكربوهيدرات والجليسرول والتريسين و EDTA و Tris) تتداخل مع مقايسة Lowry وتشكيل الرواسب (الجدول 3) [10] . ومع ذلك ، يمكن تقليل تأثير هذه المواد عن طريق تخفيف العينة ، ولكن فقط إذا كان تركيز البروتين مرتفعًا بشكل كافٍ [27]. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أنه يمكن تقليل وقت إجراء هذا الاختبار من خلال رفع درجات الحرارة أو استخدام فرن الميكروويف [27].

منظفاتمركب ثنائي كبريتيد
الكربوهيدراتالفينول
الجلسرينحمض اليوريك
تريسينجوانين
EDTAزانثين
تريسالكالسيوم المغنيسيوم
مركبات البوتاسيوممركبات سلفهيدريل

3- (4-carboxybenzoyl) quinoline-2-carboxaldehyde (CBQCA) عبارة عن كاشف فلوروجيني حساس يستخدم للكشف عن الأمينات في البروتينات. نظرًا لأنه لا يكتشف سوى الأمينات التي يمكن الوصول إليها في البروتين الذي تم فحصه ، فإن هذه الطريقة لها نفس قيود طرق القياس الطيفي التي تعتمد النتيجة على عدد بعض الأحماض الأمينية في البروتين. ومع ذلك ، فإن CBQCA حساس للغاية ويمكنه اكتشاف 10 نانوغرام إلى 150 ميكروغرام من البروتين في حجم 100 ميكرولتر. على الجانب الإيجابي أيضًا ، يعمل كاشف CBQCA جيدًا في وجود المواد ، مثل الدهون ، المعروف بتدخله في العديد من طرق تحديد البروتين الأخرى [28] ، أو عند استخدامه لتحديد كمية الببتيدات أو البروتينات المثبتة على السطح أو المغلفة [5] .

تتمثل الخطوة الحاسمة في العديد من التجارب المعملية الطبية الحيوية في تحديد كمية بروتين معين في المحلول. تم استخدام العديد من التقنيات لتحقيق ذلك. الطرق الشائعة لطرق القياس الكمي هي ELISA ، وتحليل اللطخة الغربية ، وقياس الطيف الكتلي. تمت مناقشة ELISA و Western blot في تطبيقات الأجسام المضادة ، وتناقش مواصفات الكتلة هنا باختصار ، وتمت مناقشتها في مقالة مراجعة Labome التحليل البيولوجي الكمي للبروتينات بواسطة قياس الطيف الكتلي.

يعد قياس طيف كتلة البروتين طريقة جديدة نسبيًا ومتطورة لتقدير كمية البروتين. إلى جانب توصيف البروتين ، هناك خطوة مهمة في التحليل البروتيني وهي إمكانية تحديد بروتين معين. تم إدخال العديد من التقنيات وتنفيذها لتقدير كمية البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي. عندما يكون وضع العلامات على البروتين ممكنًا ، يتم تمييز عينة بروتين أو ببتيد بنظير أثقل مستقر (على سبيل المثال ، 13 درجة مئوية أو 15 نيوتن) بينما يتم تمييز العينة الثانية (المعيار الداخلي) بنظير أخف (على سبيل المثال ، 12 درجة مئوية أو 14 نيوتن) . يتم خلط العينات والاختلافات في الكتلة بسبب الملصقات تجعل من الممكن تحليل نسبة شدة الذروة للعينتين بواسطة محلل الكتلة ، والذي يتوافق مع نسبة الوفرة النسبية. تسمح الطرق البديلة بتقدير كمية البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي دون تسمية العينات [29].

المثير بشكل خاص هو القدرة على استخدام مقياس الطيف الكتلي كنهج عالمي لأداء كل من المقايسات الكمية والنوعية في قياس واحد. على سبيل المثال ، تم مؤخرًا نشر العديد من الأساليب القائمة على MS والتي تم تطويرها لتقدير بروتينات معينة في العينات البيولوجية. وتشمل هذه طريقة لتقدير عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 في مصل الدم [30] ، وطريقة لتقدير كمية الألبومين في البول [31] ، والأوبيكوينون في المصل / البلازما [32]. يمكن أيضًا العثور على طرق لتقدير البروتينات المستهدفة الأقل تحديدًا في الأدبيات الحديثة [33-35]. تم نشر إرشادات لقياسات مطياف الكتلة المستهدفة للببتيدات والبروتينات [36] لمحاولة ضمان طرق دقيقة وقابلة للمقارنة في هذا النهج سريع التطور. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة أدوات مكلفة لا تستطيع العديد من المعامل تحملها وهذا يحد من فائدة هذا النهج [14 ، 37].

من أجل القياس الكمي الطيفي للكتلة للبروتينات ، يمكن ربط معايير الببتيد الداخلية للعديد من البروتينات لتمكين التحليل المتعدد للبروتينات (بروتين QCAT) [38]. تم تطوير امتداد لهذه الطريقة حيث تضمنت هذه الببتيدات المتسلسلة حواتم مستضدية لأجسام مضادة متعددة. يمكن لبروتينات المعايرة المتسلسلة المسماة DOSCATs (conCATamers ذات المعيار المزدوج) أن تفي باحتياجات كل من مقياس الطيف الكتلي والبقعة الغربية [39].

يمكن مراقبة تعبير البروتين في الخلايا الحية عن طريق الربط الجيني لبروتين مهم ببروتين مراسل أو حلقمة ، مثل بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). إن ربط البروتين الذي يهم المراسل مع عنصر هيدرولاز معين يعمل باتحاد الدول المستقلة يسمى "مراسل كمية البروتين" (PQR) [1] يسمح بنسخ البروتين والمراسل معًا ولكن يتم ترجمته كبروتينات وظيفية منفصلة.هذا يمكن أن يضمن التعبير المتكافئ لكل من البروتين والمراسل وبالتالي ، يمكن استنتاج كمية البروتين من كثافة الفلورسنت (الشكل 4).

أدت قيود طرق القياس الكمي التي نوقشت أعلاه إلى تطوير استراتيجيات جديدة لتحديد تركيزات البروتين في حلول بسيطة ومعقدة. واحدة من أكثرها شيوعًا تستفيد من الخصائص البصرية للجسيمات النانوية [40]. باختصار ، فإن الطول الموجي الذي تمتص فيه جسيمات نانوية معينة تحولات الضوء بسبب ارتباط الجزيئات الأخرى أو التجمع [41]. نظرًا لأن نطاق امتصاص الضوء يقع في الطيف المرئي ، يُنظر إلى هذا التحول على أنه تغيير في اللون. تم استخدام الجسيمات النانوية حتى الآن بالاقتران مع الجزيئات الرابطة للبروتين ، على سبيل المثال ، الأجسام المضادة أو الببتيدات أو الأبتاميرات. اقترح روجوفسكي وزملاؤه نوعًا جديدًا من مستشعرات الجسيمات النانوية لاكتشاف وتقدير كمية البروتينات ، والتي أطلقوا عليها اسم "الأنف الكيميائي" [42]. يتكون جهاز الاستشعار الخاص بهم من مزيج من جزيئات الذهب النانوية بأشكال مختلفة تعرض التجميع التفاضلي عند التفاعل مع بروتينات مختلفة (الشكل 5). بناءً على أطياف امتصاص الضوء ، تسمح الجزيئات باكتشاف وتقدير البروتينات المنقاة في المحاليل المائية أو البروتينات غير المنقاة في المحاليل المعقدة.

طور كونغ وزملاؤه طريقة باستخدام جزيئات طويلة من الحمض النووي ومسام زجاجية صلبة النانو لقياس تركيز البروتينات في المحلول في النطاق النانوي [2]. في هذه الطريقة ، تنتقل الجزيئات الحاملة للحمض النووي ، القادرة على ربط البروتينات في مواقع محددة ، عبر المسام النانوية بمساعدة تيار كهربائي. عند النقل ، يتسبب الحمض النووي في إشارة السقوط الحالية. يتم تسجيل قطرة إضافية عند ربط البروتين بالحمض النووي. كلما زاد تركيز البروتين ، زاد "تحميل" الناقل. كما يزيد تواتر قمم الانخفاض الحالية الثانوية مع زيادة تركيز البروتين (الشكل 6).

قام Labome بمسح المنشورات التي تمت مراجعتها بشكل عشوائي والتي تمت مراجعتها من قبل الأقران والتي تشير إلى فحوصات البروتين الإجمالية. تم تحديد معامل Thermo Fisher Pierce و Bio-Rad كموردين رئيسيين لمجموعات فحص البروتين الكلية (الجدول 4). الطرق الأكثر استخدامًا هي BCA و Bradford.

فحصالموردرقممرجع عينة
BCA / على أساس النحاس
ثيرمو فيشر13023275 [43], 23225 [44]
ميليبور سيغما8
بيوتايم2
GE Healthcare1كمية 2-D [45]
برادفورد
بيو راد57 [46, 47], 5000006 [48]
ثيرمو فيشر بيرس11 [49], 23200 [50]
ميليبور سيغما1
اكسبديون1 [44]
كارل روث1روتي نانوكوانت [51]
Lowry / تعديل DC الفحص
بيو راد17 [52]
ميليبور سيغما1
كشف الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر
الحرارية العلمية (Nanodrop)3

تم تقديم جميع فحوصات بروتين BCA المذكورة في المجموعة التي شملتها الدراسة تقريبًا بواسطة بيرس ، حيث اخترع أحد العلماء المقايسة منذ عدة سنوات. اشترت Thermo Fisher شركة Pierce منذ عدة سنوات. تم استخدام مقايسات Thermo Fisher Pierce BCA لدراسة ، على سبيل المثال ، فصل طور البروتيازومات [53] ، ونمو السالمونيلا [54] ، وتعبير Cox-2 و mPGES-1 في الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع عظم الفأر [55] ، وتأثير أوليغومرات أميلويد بيتا على الحوائط والشعيرات الدموية [16] ، التنكس العصبي α-synuclein المرضي في مرض باركنسون [56] وغيره [57 ، 58]. تم استخدام مجموعات فحص البروتين Micro BCA الخاصة بها لقياس تاو المتحولة المؤتلفة المنقى [59].

كما تم الاستشهاد بكاشف MilliporeSigma BCA ومجموعة فحص بروتين Bio-Rad BCA.

تعد Thermo Fisher Pierce أيضًا أحد الموردين الرئيسيين لمجموعات اختبار Bradford. قام Kapogiannis D وآخرون بقياس محتويات البروتين في عينات الجسيمات الخارجية وعينات البلازما قبل لطخة غربية باستخدام اختبار برادفورد من Thermo Fisher (كتالوج: 23200) [50]. تم استخدام كواشف اختبار البروتين Bio-Rad Bradford لقياس محتوى البروتين في مستخلصات الهيستون الخام (كتالوج: 5000006) [60] ، محللات خلايا سرطان الثدي [47] ، ومحللات خلايا A549 [48].

كما قدم موردون آخرون مجموعات اختبار برادفورد ، على سبيل المثال ، كارل روث [51] وإكسبيدون [61].

تم استخدام مقايسة بيرس لوري (رقم الكتالوج 23240) في [62] وتم استخدام اختبار Lowry في مختبرات Bio-Rad في [63] و [64] لتقدير كمية البروتين. فحص البروتين Bio-Rad DC هو نسخة معدلة من مقايسة Lowry. إنه فحص بروتين شائع ، بسبب توافقه مع المنظفات. تم استخدام هذا الاختبار لتحديد تركيز البروتين لدراسة بنية ووظيفة بروتين غشاء التتراسبانين البشري CD81 [65] تأثير استئصال عضلات الهيكل العظمي النوعي لجاما (العصارة الخلوية) -اكتين على النمط الظاهري لأم دي إكس [62] ، من بين أمور أخرى [66] ، 67].

أفضل معيار لتقدير كمية البروتين هو نفس البروتين الذي يتم فحصه. ومع ذلك ، هذا عادة ما يكون غير ممكن. BSA (الزلال البقري) هو معيار البروتين الأكثر استخدامًا. لها حدود. إنه أكثر حساسية في اختبار برادفورد من البروتينات الأخرى ، وبالتالي من المحتمل أن يتم التقليل من تركيز عينة البروتين [68]. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تحضير / الحصول على BSA ، كبروتين مصل ، بنقاوة عالية جدًا ، لأنه يرتبط بالعديد من العوامل الأخرى. تم استخدام بروتينات أخرى ، مثل الغلوبولين المناعي G ، والليزوزيم كمعايير بروتين أيضًا. يمكن أن يختلف الخيار الأفضل في تجربة معينة اعتمادًا على كل من البروتينات التي تهمك وطريقة القياس التي تختارها.

لا. من المهم جدًا أن تقع نقاط بيانات العينة ضمن نطاق المنحنى القياسي لأن المنحنى قد يختلف بشكل غير متوقع عند التركيزات الأعلى أو الأقل. يجب تعديل تخفيف عيناتك و / أو معاييرك للحفاظ على عيناتك ضمن المنحنى القياسي.


خلفية

جبل بأكمله فى الموقع يستخدم التهجين (WISH) لدراسة نمط تعبير RNA للجينات في سياق الأنسجة التي تعمل فيها RNAs [1،2]. كروموجينيك فى الموقع تُستخدم تقنيات التهجين (ISH) بشكل شائع في الكائنات الحية النموذجية المختلفة لهذا الغرض وتستند إلى تفاعل إنزيمي يحول ركيزة عديمة اللون إلى راسب مرئي داكن. باستخدام ISH chromogenic ، يمكن اكتشاف ما يصل إلى ثلاثة mRNAs مختلفة في وقت واحد ذبابة الفاكهة الأجنة [3،4]. ومع ذلك ، فقد تم حتى الآن اكتشاف ما لا يزيد عن نسختين مختلفتين في أجنة الزرد باستخدام هذه الطريقة [4].

مقارنة بـ ISH الكروموجينيك ، الفلورسنت فى الموقع يوفر التهجين (FISH) دقة أعلى واكتشافًا محسنًا لأنماط التعبير الجيني المتداخلة في عينة واحدة [5-7]. يمكن أن يؤدي الجمع بين FISH مع الفحص المجهري متحد البؤر إلى توفير معلومات مكانية تتعلق بالتعبير عن الحمض النووي الريبي الذي تم فحصه ضمن عينات معقدة ثلاثية الأبعاد مثل الأجنة. تعتمد الإشارة المتولدة في FISH على ارتباط الجسم المضاد المقترن بفجل الحصان (HRP) بجسم الريبونوكليوتيدات المعدل للمسبار ، متبوعًا بتضخيم إشارة التيراميد (TSA) ، حيث يحول HRP التيراميد المترافق مع فلوروفور إلى وسيط فلوري متفاعل. التي ترتبط تساهميًا ببقايا الأحماض الأمينية القريبة ، عادةً التيروزين. في حين يمكن استخدام FISH متعدد الألوان للكشف عن النسخ المتعددة من خلال استخدام ركائز مختلفة من التيراميد الفلوري ، فإن الطريقة أقل كفاءة ، خاصة بالنسبة للحمض النووي الريبي المعبر عنه بمستويات منخفضة [6]. للتغلب على هذا العيب في الأسلوب ، تم طرح تعديلات على بروتوكول FISH الأصلي التي تعزز بشكل كبير حساسية الفحص [7،8]. ومع ذلك ، كطرق WISH الأخرى ، يعتمد هذا البروتوكول أيضًا على توليد منتجات قابلة للانتشار والتي من المحتمل أن تقلل من دقة توطين النسخ.

تم الإبلاغ عن طريقة بديلة مطورة حديثًا تسمح بوضع العلامات الفلورية المتزامنة لما يصل إلى خمسة نسخ من خلال استخدام تضخيم متعامد مع تفاعلات سلسلة التهجين (HCRs) [9]. في هذه الطريقة ، يتم استخدام مجموعة مسبار من واحد إلى تسعة أنواع من المسبار لاستهداف كل جزيء من جزيئات الرنا المرسال. بعد تهجين المسبار ، تتجمع دبابيس الشعر الفلورية RNA في بوليمرات تضخيم الفلورسنت [9]. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير تقنية جديدة تسمى RNAscope لاكتشاف الحمض النووي الريبي فى الموقع. تعتمد هذه الطريقة على تضخيم إشارة الفلورسنت عند تهجين مسبار الهدف [10] (الشكل 1) ، وعلى عكس طرق RNA ISH الأخرى بما في ذلك HCR ، فهو بروتوكول سريع يمكن إكماله في أقل من يومين. الأهم من ذلك ، نتيجة لتصميم المسبار المبتكر واستراتيجية الكشف التي تعتمد على المنتجات الفلورية غير القابلة للانتشار ، تسمح هذه الطريقة باكتشاف النصوص النادرة بدقة عالية ، مع توليد إشارة خلفية منخفضة [11-14]. في هذه الطريقة ، تم تصميم مجسات خاصة بحيث يتم تهجينها مع mRNA الهدف ، حيث يحتوي كل مسبار على تسلسل ذيل مختلف يوفر الأساس لتجميع سقالة تضخيم الإشارة. نظرًا لأن هذه السقالة سوف تتشكل فقط على زوج من المجسات المرافقة ، فإن خصوصية الإشارة تزداد بشكل كبير (الشكل 1). تسمح هذه الطريقة بالكشف المتزامن لما يصل إلى أربعة أنواع من الرنا المرسال في خطوط الخلايا السرطانية المضمنة بالبارافين المثبت بالفورمالين وأقسام الأنسجة الورمية باستخدام إما الكشف الفلوري أو الكهروموجيني [10]. حتى الآن ، تم استخدام RNAscope في البحث الطبي وللكشف عن المؤشرات الحيوية النسيجية المرضية في التشخيص السريري [11-15]. كمقايسة حساسة ومحددة مع قدرات تعدد الإرسال ، يسمح RNAscope بالقياسات الكمية لمستويات الحمض النووي الريبي في سياق الأنسجة [11] بالإضافة إلى الكشف الموثوق به عن جزيئات الحمض النووي الريبي منخفضة الوفرة عن طريق قياس التدفق الخلوي [16]. يمكن أن يساهم إدخال مجسات صغيرة نسبيًا قبل توليد منتجات التضخيم غير المتحرك في اختراق جيد للجنين ووضع علامات فعالة للنصوص النادرة.

مبدأ RNAscope. تهجين المجس المستهدف: تم تصميم مجموعات من مجسات قليل النوكليوتيد الخاصة بمختلف الرنا المرسال ، بحيث يتم تهجين كل زوج من مجسين على شكل حرف z (كل منهما 20 نقطة أساس) مع مرنا الهدف المحدد. في المجموع ، تم تصميم 20 زوجًا لكل RNA ذي أهمية. بالإضافة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي التكميلي ، يحتوي كل مسبار على فاصل ، بالإضافة إلى تسلسل الذيل الذي يرتبط به هيكل مكبر الصوت المسبق في الخطوة التالية. تضخيم الإشارة: نتيجة لتفاعل المضخم المسبق مع تسلسل الذيل ، يتم تشكيل سقالة شبيهة بالشجرة توفر مواقع ربط متعددة لملصقات الفلورسنت. وضع العلامات الفلورية: في وقت لاحق ، يتم إضافة ملصقات الفلورسنت المميزة في وقت واحد. معًا ، يوفر العدد الكبير من ملصقات الفلورسنت المرتبطة بكل زوج من المجسات المستهدفة إشارة قوية ، مما يسمح باكتشاف أنواع mRNA النادرة.

في حين تم استخدام RNAscope بنجاح للمواد المقطوعة ، فإن تحديد أنماط تعبير RNA في عينات بيولوجية أكبر ، مثل الأجنة السليمة ، سيكون مفيدًا للغاية في البحوث الطبية الحيوية وعلم الأحياء التطوري وعند تحليل العينات السريرية الكبيرة. إن تكييف هذه الطريقة للأجنة السليمة سيسمح بتحليل متزامن عالي الدقة للجينات المهمة من الناحية التنموية ويوفر معلومات كمية مفصلة تتعلق بأنماط التعبير ومستويات التعبير داخل الجنين والأنسجة النامية.

على أساس RNAscope ISH من حيث المبدأ ، نحن نقدم بروتوكولًا دقيقًا قمنا بتطويره لعينات الأنسجة الكبيرة ، كما هو موضح هنا باستخدام أجنة الزرد الكاملة. يتضمن البروتوكول المبتكر خطوات تعزز الحفظ الفعال لسلامة الجنين ، مع السماح بالاختراق الفعال للمسبارات ونسبة إشارة إلى ضوضاء ممتازة. إنه بروتوكول سريع وقوي يسهل الاكتشاف الكمي المتزامن للنصوص المتعددة داخل الجنين. الأهم من ذلك ، بالإضافة إلى الكشف عن التوزيع المكاني لجزيئات الحمض النووي الريبي ، يسمح البروتوكول بالتحديد المتزامن لأنماط التعبير البروتيني وتوطين البروتين الخلوي.


نتائج

تطوير الطريقة

تم رسم مبدأ الطريقة في الشكل 1. في البداية ، يرتبط C-P4H بالتقاط الأجسام المضادة المقترنة بالخرز المغناطيسي. تم اختيار الأجسام المضادة أحادية النسيلة ضد الوحدة الفرعية α (mab-α) لالتقاط البروتين لتجنب انسداد النظام بوحدات فرعية PDI / مجانية وفيرة. كمية الوحدات الفرعية PDI / المجانية في C-P4H المنتجة بكتريا قولونية تكون الخلايا عالية لأن الإنتاج يبدأ بتعبير الوحدات الفرعية PDI / للحفاظ على الوحدات الفرعية α المعبر عنها لاحقًا في شكل قابل للذوبان [14]. بعد خطوة الربط ، يتم غسل المعقد واحتضانه بأجسام مضادة للكشف. يضمن اكتشاف البروتين باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة مقابل وحدة فرعية C-P4H أخرى (PDI / β) أنه سيتم قياس البروتينات التي تحتوي على كل من الوحدات الفرعية α و PDI / فقط. الماعز المضاد للأرنب IgG المسمى بالفوسفاتيز القلوي (GAR-AP) يرتبط بالجسم المضاد للكشف ، ويحفز الفوسفاتاز القلوي تفاعلات تحول الركيزة مع توليد المنتجات الفلورية. تتناسب إشارة التألق مع تركيز C-P4H.

مبدأ ELISA القائم على حبة السندويتش لـ C-P4H. يتم التقاط رباعي C-P4H بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة مقابل الوحدة الفرعية α (mab-α) المقترنة بالخرز المغناطيسي. بعد خطوة الغسيل ، يرتبط الجسم المضاد متعدد النسيلة للأرنب ضد الوحدة الفرعية (pab-) بالبروتين. يستخدم الماعز المضاد للأرنب IgG المسمى بالفوسفاتيز القلوي (GAR-AP) للكشف المعقد. يحفز AP تفاعلات تحول الركيزة مع توليد إشارة مضان.

مرفق Mab-α بالخرز المغناطيسي

تم اختبار وضع العلامات mab-α مع جزيئات البيوتين ومرفقها على سطح حبة الستربتافيدين (الشكل 2A). لذلك تم تحضين الخرزات المغناطيسية المطلية بالستربتافيدين بكميات مختلفة من mab-α المعالج بيوتينيل. يرتبط الجسم المضاد بالخرز عبر تفاعل البيوتين - ستربتافيدين. تم غسل المركب المتكون واكتشافه باستخدام Goat Anti-Mouse IgG المسمى بالفوسفاتيز القلوي (GAM-AP).

إرفاق mab-α بالخرز المغناطيسي وتأثير التخفيفات mab-α و GAM-AP على إشارة الفلورسنت. (أ) مبدأ الاختبار. يرتبط mab-α بالخرز المغناطيسي عبر تفاعل البيوتين-ستربتافيدين. تم اكتشاف المعقد باستخدام Goat Anti-Mouse IgG المسمى بـ AP (GAM-AP). (ب) الإشارات المتولدة التي تم الحصول عليها عند استخدام تركيزات مختلفة من mab-α و GAM-AP. تظهر أشرطة الخطأ ± SD لثلاث تجارب متوازية.

تم استخدام تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة mab-α و GAM-AP في التجربة. أثبتت إشارات الفلورسنت المتولدة أنها قريبة من الحد الأقصى الذي تم ملاحظته على الإطلاق للمقايسة الفلورية القائمة على حبة بغض النظر عن تخفيفات الأجسام المضادة (البيانات غير معروضة). كان مضان الخلفية الذي تم الحصول عليه بدون إضافة mab-α أقل بمقدار 20-140 مرة مقارنة بإشارات محددة. تم تحقيق أفضل علاقة بين الإشارة والخلفية (نسبة إشارة / الخلفية FLU) باستخدام mab-α الأكثر تمييعًا (التخفيف 1/500) و GAM-AP (التخفيف 1/2500) (الشكل 2 ب) منذ نما مضان الخلفية مع زيادة تركيزات الأجسام المضادة. تقرر تحديد تركيزات الأجسام المضادة المثلى في شطيرة ELISA باستخدام رباعي C-P4H كهدف. تم اختيار التخفيف 1/500 من التخفيف mab-α و 1/2500 من الجسم المضاد للكشف الثانوي لإجراء مزيد من التجارب.

اختيار pab-الأمثل

تم اختبار أربعة أجسام مختلفة متعددة الأضداد ضد PDI البشري كجسم مضاد للكشف عن ELISA ساندويتش C-P4H (الشكل 3). تم استخدام 1 و 10 و 20 نانوغرام من C-P4H المنقى كهدف. كانت تخفيفات الأجسام المضادة على النحو التالي: 1/500 لـ mab-α ولكل pab-و 1/5000 لـ GAR-AP المستخدمة هنا كجسم مضاد ثانوي للكشف. تم اختيار تركيز الجسم المضاد الثانوي (GAR-AP) أقل من تركيز الأجسام المضادة لـ GAM-AP المستخدمة في التجربة السابقة حيث كان من المتوقع هنا كمية أقل من المجمعات القابلة للاكتشاف.

مقارنة بين الكشف عن الأجسام المضادة التي تنتجها الشركات المصنعة المختلفة. تم قياس C-P4H المنقى باستخدام ELISA السندويش باستخدام أجسام مضادة مختلفة لـ pab-: pab-A (Abcam) و pab-B (Calbiochem ، ألمانيا) و pab-C (Santa Cruz Biotechnology ، Inc.) و pab- β D (Stressgen Bioreagents). تظهر أشرطة الخطأ ± SD لثلاث تجارب متوازية.

تمت مقارنة نسب الإشارة / الخلفية لكل pab-. كانت هذه المعلمة أعلى بثلاث مرات تقريبًا عند استخدام pab-C لذلك تم اختيار هذا الجسم المضاد لمزيد من التجارب.

كان التباين الكبير الذي لوحظ في النتائج بسبب تكتل الخرزات في بعض التجارب. لتجنب هذا التأثير ، وزيادة كفاءة الغسيل وحساسية الفحص ، تم تحسين الطريقة في التجربة التالية.

تحسين الطريقة

تمت دراسة تأثير المعلمات المختلفة (وقت التهجين ، وتركيز الملح في المخزن المؤقت للغسيل ومعدل الاهتزاز) لتحسين حساسية ودقة واستنساخ المقايسة (الشكل 4). تم تقديم الردود كإشارة مطلقة ناقص إشارة الخلفية بدلاً من الإشارة إلى نسبة الخلفية المستخدمة سابقًا من أجل تصور تأثير المعلمات المتغيرة بشكل أفضل. تم الحصول على أعلى إشارة فلورية مقارنة بمستوى الخلفية وأدنى انحراف معياري عندما تم تحضين البروتين مع كل جسم مضاد لمدة ساعة واحدة. على الرغم من أن التهجين الأطول (أكثر من ساعة واحدة) يمكن أن يؤثر إيجابًا على الإشارة ، إلا أنه لم يتم اختباره ، لأنه سيزيد بشكل ملحوظ من إجمالي وقت الفحص. لم يؤثر معدل الاهتزاز أثناء خطوة التهجين بشكل كبير على النتائج (الشكل 4 أ) ، وتم اختيار معدل الاهتزاز 700 دورة في الدقيقة لأنه يمنع ترسيب الخرز. كان من المتوقع أن يؤدي التركيز المرتفع لكلوريد الصوديوم في المخزن المؤقت للغسيل إلى زيادة كفاءة الغسيل ، ولكن لم يكن له تأثير كبير على الإشارة (الشكل 4 ب). كان من الواضح أن الألواح يجب أن تهتز أثناء مراحل الغسيل بين خطوات التهجين. دون أن تهتز حبات متكتلة والغسيل لم يكن فعالاً بما فيه الكفاية مما تسبب في زيادة التباين بين التكرارات (الشكل 4 ب).

تحسين إجراءات التهجين والغسيل لشطيرة ELISA C-P4H. (أ) تحسين وقت التهجين. (ب) تحسين ظروف الغسيل (معدل الاهتزاز وتركيز كلوريد الصوديوم في المخزن المؤقت للغسيل). تم استخدام 1 نانوغرام من C-P4H المنقى كهدف. تظهر أشرطة الخطأ ± SD لثلاث تجارب متوازية.

تحسين تركيزات الجسم المضاد

تم تحسين تركيزات الأجسام المضادة المستخدمة في شطيرة ELISA باستخدام نهج التصميم التجريبي.

تم اختيار التصميم الشامل الكامل لمنهجية سطح الاستجابة (RSM) لاستكشاف المستوى الأمثل للأجسام المضادة الثلاثة (الجدول 1). تم قياس نسبة إشارة / الخلفية FLU باستخدام شطيرة ELISA لـ 1 و 20 و 50 نانوغرام من C-P4H واستخدمت كاستجابة (ملف إضافي 1 ، الجدول S1). تم تزويد البيانات بانحدار متعدد إلى معادلة نموذج متعدد الحدود من الدرجة الثانية باستخدام برنامج MODDE 8.

تم تطبيق تحليل التباين (ANOVA) لاختبار مدى ملاءمة المعادلة النموذجية. تم تقييم أهمية كل متغير وتفاعلاته باستخدام ص-القيم. ص- تشير القيم الأقل من 0.05 إلى أن مصطلحات النموذج مهمة (مستوى الأهمية 5٪). في حالة قياس 1 نانوغرام من C-P4H ، فإن القيم المشفرة لكل تخفيف للجسم المضاد والتفاعل بين التخفيفات mab-α و GAR-AP وقيمة pab-المشفرة التربيعية هي مصطلحات نموذجية مهمة (ملف إضافي 2 ، الجدول S2).تم فحص الدلالة الإحصائية للنموذج بواسطة اختبارات F (الملف الإضافي 3 ، الجدول S3). كان اختبار F الأول ، الذي يقارن التباين القابل للنموذج وغير القابل للتشكيل ، راضيًا منذ ذلك الحين ص- كانت القيمة & lt 0.05. الثاني، قلة اللياقة، اختبار ، مقارنة النموذج وتكرار الأخطاء مع بعضها البعض ، كان راضيا أيضا منذ ذلك الحين ص- كانت القيمة & gt 0.05. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم النموذج باستخدام معلمات إحصائية أخرى توضح أن النموذج جيد (ملف إضافي 3 ، الجدول S3).

النماذج التي تم إنشاؤها على أساس نسبة الإشارة / الخلفية لـ 20 و 50 نانوغرام من C-P4H لها معلمات مماثلة مع النموذج المقدم لـ 1 نانوغرام من C-P4H (البيانات غير معروضة).

باستخدام أداة مُحسِّن برنامج MODDE 8 ، تم اختيار أفضل تركيزات الأجسام المضادة (الجدول 2). يشير النموذج إلى أن تركيز الجسم المضاد mab-α هو العامل الأكثر أهمية ويجب ضبطه على أعلى مستوى. على الأرجح ، من الممكن الحصول على استجابة أفضل باستخدام جسم مضاد أقل تمييعًا ، لكن لم يتم ذلك لأن الجسم المضاد mab-α هو أغلى كاشف للمقايسة. لتقليل الطريقة بشكل كبير ، تم تضمين المعلمة الرابعة ، تكلفة الجسم المضاد mab-α ، في المحسن. بعد هذا التصحيح ، تم اختيار تخفيف الأجسام المضادة التالية: 1/500 لـ mab-α و 1/700 لـ pab-و 1/3000 لـ GAR-AP.

يوضح مخطط سطح الاستجابة الموضح في الشكل 5 تأثير المعلمات pab-و GAR-AP على نسبة الإشارة إلى الخلفية. تم الحصول على هذه المؤامرة للمعامل mab-α الذي تم إصلاحه عند التخفيف 1/500. أخيرًا تم إجراء الاختبار باستخدام تخفيفات الأجسام المضادة المحددة ، وأظهرت النتائج أنها قريبة من القيم المتوقعة لنسبة الإشارة إلى الخلفية (الشكل 6).

مخطط سطح الاستجابة يظهر آثار تركيزات pab-و GAR-AP. تم استخدام إشارة FLU إلى نسبة الخلفية كتركيز استجابة mab-α تم تعيينه عند مستوى 0 (التخفيف 1/500). تخفيفات الجسم المضاد معروضة بقيمها المشفرة (الجدول 1).

مقارنة الاستجابات التي تنبأ بها النموذج والتي تم الحصول عليها في التجربة. تم استخدام C-P4H المنقى كهدف. تخفيفات الجسم المضاد: mab-α 1/500 ، pab-1/700 ، GAR-AP 1/3000. تظهر أشرطة الخطأ ± SD لثلاث تجارب متوازية.

الحساسية والمدى

تم تحديد مستوى حساسية الفحص والمدى باستخدام 0-40 نانوغرام من رباعي C-P4H المنقى (الشكل 7). لمحاكاة الخلفية الطبيعية ، 1 ميكروغرام من بكتريا قولونية تمت إضافة مستخلص الخلية بالكامل إلى كل عينة. تم تقدير حد الكشف بـ 0.1 نانوغرام من C-P4H. يتوافق هذا الرقم مع الإشارة التي تكون أعلى من متوسط ​​إشارة الخلفية لثلاث مرات من الانحراف المعياري للإشارة الفارغة. يمكن استخدام الاعتماد الملاحظ بين كمية C-P4H وإشارة الفلورسنت لتقدير تركيز C-P4H في عينات حقيقية. تم تقديم الاستجابة كإشارة مطلقة مطروحًا منها إشارة الخلفية من أجل التمكن من تقدير كمية البروتين في العينات بشكل أكثر دقة.

المنحنى القياسي لساندويتش ELISA القائم على الخرز لـ C-P4H. تم استخدام 0-40 نانوغرام من C-P4H المنقى كهدف. تظهر أشرطة الخطأ ± SD لثلاث تجارب متوازية

تحليل تعبير C-P4H المؤتلف في الإشريكية القولونية

تمت دراسة تأثير المادة البيولوجية على إشارة الساندويتش ELISA عن طريق قياس كمية C-P4H في التخفيفات المختلفة لمستخلصات الخلايا من بكتريا قولونية الخلايا التي تعبر عن C-P4H (0.5 - 10 ميكروغرام من البروتينات الكلية). تم زراعة الخلايا التي تعبر عن C-P4H وتعطيلها كما هو موضح في الطرق ، وتم تخفيفها باستخدام المخزن المؤقت الرئيسي واستخدامها كهدف لساندويتش ELISA بكمية 10 ميكرولتر ، والتي تقابل 0.5 - 10 ميكروغرام من البروتينات الكلية. لوحظ تأثير التثبيط مع زيادة تركيز البروتينات الكلية في العينات (الشكل 8). لتقليل هذا التأثير ، يجب ألا تتجاوز كمية البروتينات الخلوية الكلية التي تم تحليلها بالمقايسة 1 ميكروغرام.

تأثير الخلية المحللة على إشارة اليزا الساندويتش. تم قياس كمية C-P4H في 0.5 - 10 ميكروغرام من مستخلص بكتريا قولونية الخلايا التي تعبر عن C-P4H. تظهر أشرطة الخطأ ± SD لثلاث تجارب متوازية.

تمت مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام ELISA السندويش لـ C-P4H مع اختبار النشاط بناءً على تكوين 4-هيدروكسي [14 درجة مئوية] برولين في ركيزة [14 درجة مئوية] مكونة من سلاسل بولي ببتيد البروكولاجين غير الهيدروكسيلية [17]. أنتج نشاط 10 عينات خام من C-P4H في بكتريا قولونية تم قياسه. تم تحليل نفس العينات باستخدام ELISA ساندويتش لـ C-P4H وقورنت النتائج كما هو موضح في الشكل 9. لوحظت دالة خطية ومعامل ارتباط R 2 = 0.986 مما يدل على وجود ارتباط كبير بين الطريقتين. الارتباط الملحوظ صالح فقط للتجارب التي تم إجراؤها ، لأن العلاقة بين نشاط معين وكمية الإنزيم قد تختلف في ظل ظروف مختلفة مثل مستويات التعبير أو تحلل الخلية أو ظروف الإنتاج.

الارتباط بين نشاط C-P4H المكتشف بالمقايسة المشعة وكمية C-P4H المقاسة بشطيرة ELISA المستندة إلى حبة. تم عرض الكميات المخططة من C-P4H ووحدات النشاط لكل 10 ميكروغرام من المجموع بكتريا قولونية بروتين.

تحسين عملية التخمير على دفعات التغذية لإنتاج C-P4H في الإشريكية القولونية

تم استخدام الطريقة المطورة في تحسين عملية التخمير المغذاة لإنتاج C-P4H المؤتلف بواسطة بكتريا قولونية. هدفت التجربة إلى تقييم تأثير معدل نقل الأكسجين المنخفض بعد الحث الأول (IPTG) وتأثير كثافة الخلية في وقت الحث الأول على كمية الإنزيم المنتج. تم اقتراح أن معدل نقل الأكسجين المنخفض قد يُظهر تأثيرًا إيجابيًا على تعبير C-P4H المؤتلف بواسطة بكتريا قولونية. على النقيض من مزارع القارورة المهزوزة حيث تسبب الأنهدروتتراسيكلين (aTc) في تحريض الوحدة الفرعية α على المدى الطويل ، كان تحريض aT مؤقتًا فقط في مزارع المفاعلات الحيوية ذات التهوية القوية ، ربما عن طريق الأكسدة وبالتالي تعطيل المحفز aTc [20]. علاوة على ذلك ، كان مضيف الإنتاج لـ C-P4H هو بكتريا قولونية اوريغامي ، متحولة مزدوجة (trxB gor) ، والتي قد تستفيد أيضًا من انخفاض أكسجة المزرعة. هذا المتحور منزعج بشدة في نظام الأكسدة السيتوبلازمي ولا ينمو بشكل معقول إلا إذا تم دمجه مع طفرة مثبطة في ahpC الجين. ومع ذلك ، تظهر هذه السلالات تعبيرًا تأسيسيًا عاليًا للمنظم النسخي لاستجابة الإجهاد التأكسدي ، OxyR [21]. لذلك ، بناءً على مقارنة النتائج السابقة لنمو الخلايا والإفراط في التعبير عن C-P4H في قوارير الاهتزاز وفي المفاعلات الحيوية ذات معدل نقل الأكسجين العالي جدًا ، فقد اقترحنا سابقًا أن مستوى الأكسجين المنخفض قد يقلل من الإجهاد التأكسدي [16].

من أجل تجنب الزراعة الشاقة في المفاعل الحيوي ، تم إجراء ظروف الدُفعة المغذية في قوارير الرج باستخدام نظام توصيل تلقائي للجلوكوز (EnBase ®) والذي يحاكي ظروف دفعة تغذية محدودة للجلوكوز مع معدل ثابت لإمداد الجلوكوز [22].

تم اختيار القيمة العالية لمعدل الاهتزاز لتكون 220 دورة في الدقيقة كما في التجارب السابقة. تم ضبط القيمة المنخفضة على 100 دورة في الدقيقة بعد الحث الأول من أجل إحداث تغيير كبير مقارنة بالقيمة العالية دون التسبب في حدوث تحول إلى التمثيل الغذائي اللاهوائي أو الصدمة بسبب الحد الشديد من الأكسجين. تم الحفاظ على معدل الاهتزاز قبل التحريض عند 220 دورة في الدقيقة في كل تجربة.

تم إجراء الحث مع IPTG إما في OD600 حوالي 3 أو في OD600 = 10. يلخص الجدول 3. ظروف الزراعة للتجارب. تم تكرار كل مجموعة من قيم المعلمات مرة واحدة.

يظهر نمو الخلايا في المزارع في الشكل 10. أدى نقل الأكسجين العالي إلى إطالة المرحلة الأسية التي أعقبها انخفاض مؤقت في النمو. التعريفي في OD600 = 10 أدت إلى كثافة الخلايا النهائية التي كانت في المتوسط ​​أعلى بنسبة 40 ٪ من القيم التي تم تحقيقها عن طريق الحث السابق.

النمو ل بكتريا قولونية أنتجت C-P4H المؤتلف تحت ظروف زراعة مختلفة. تمت زراعة الخلايا باستخدام تقنية ®EnBase ، وتفاوت معدل الاهتزاز ووقت الاستقراء. تشير الأسهم إلى تحريض تعبير الوحدات الفرعية PDI / β و α مع IPTG و aTc ، على التوالي

تمت مراقبة إنتاج C-P4H في 5.5 و 12.5 و 24.5 ساعة بعد الحث الأول باستخدام ELISA المطور (الشكل 11). أظهرت التجارب ذات معدل الاهتزاز العالي والحث المبكر أقل إنتاجية للمنتج ، تزداد بشكل طفيف بمرور الوقت (القضبان السوداء). التعريفي مع IPTG في OD600 من 10 بدلاً من 3 زاد إنتاج البروتين بشكل كبير (أشرطة رمادية داكنة). مع هذا المزيج من المعلمات (معدل اهتزاز مرتفع وتحريض متأخر) ، تم تحقيق أعلى القيم بعد 12.5 ساعة فيما يتعلق بحجم الثقافة (الجزء السفلي من الشكل 11). الزراعة ذات معدل الاهتزاز المنخفض بعد إجراء الحث الأول عند OD600 أدى = 3 إلى أعلى إنتاج إجمالي للمنتج يتعلق بكمية بروتين الخلية الإجمالية (أشرطة رمادية فاتحة ، الجزء العلوي من الشكل 11). عندما تم إجراء الحث الأول على مستوى عالٍ (OD600 = 10) وانخفض معدل الاهتزاز إلى 100 دورة في الدقيقة لاحقًا ، وتم الحصول على ثاني أقل إنتاجية مقارنة بالتجارب الأخرى (القضبان البيضاء). كانت هناك زيادة خطية في تعبير C-P4H لكل بروتين إجمالي خلال وقت الزراعة.

إنتاج C-P4H بواسطة بكتريا قولونية تمت زراعتها باستخدام EnBase ® التكنولوجيا ومعدل الاهتزاز المتفاوت ووقت الاستقراء. يتم تقديم التجارب ذات الشروط المتطابقة على أنها قيم متوسطة مع أشرطة خطأ تشير إلى قيمتين فعالتين من التحليل. الجزء العلوي: كمية C-P4H (نانوغرام) تقاس بـ 1 ميكروغرام من بروتين الخلية الكلي. الجزء السفلي: تركيز C-P4H (مجم لكل لتر من وسط الزراعة).

تم تقييم أهمية العوامل (معدل الاهتزاز ووقت الاستقراء) إحصائيًا باستخدام برنامج MODDE 8 (الجدول 4). يعني تأثير العامل الإيجابي أن تغيير قيمة العامل يؤدي إلى تغييرات كبيرة في الاستجابة. من الواضح أن العوامل كانت تعتمد على بعضها البعض حيث كان هناك دائمًا تفاعل بين المتغيرات. علاوة على ذلك ، كان لمعدل الاهتزاز المستمر البالغ 220 دورة في الدقيقة تأثير سلبي على إنتاج البروتين لكل خلية في جميع أوقات أخذ العينات. لم يكن وقت تحريض التأثير واضحًا في معظم الحالات.


تصميم تجربة لطخة غربية كمية

النشاف الغربي هو تقنية كانت في الممارسة العملية لأكثر من ثلاثة عقود بدأت كوسيلة لاكتشاف هدف البروتين في عينة معقدة. على الرغم من حدوث تقدم كبير في كل من تقنيات التصوير والكواشف لتحسين الحساسية ، والنطاق الديناميكي للكشف ، وإمكانية تطبيق اكتشاف الهدف متعدد الإرسال ، إلا أن التقنية الأساسية ظلت دون تغيير جوهريًا. في الماضي ، تم استخدام النشاف الغربي ببساطة لاكتشاف بروتين مستهدف محدد في خليط معقد ، ولكن الآن يطلب محررو المجلات والمراجعون التفسير الكمي لبيانات اللطخة الغربية من حيث التغييرات الطية في تعبير البروتين بين العينات. تستند الحسابات إلى قياس الكثافة التفاضلي للإشارات المتوهجة و / أو الفلورية المصاحبة من البقع ، وهذا يتطلب الآن تحولًا أساسيًا في المنهجية التجريبية واكتساب وتفسير البيانات. لقد نشرنا مؤخرًا نهجًا محدثًا لإنتاج بيانات قياس الكثافة الكمية من البقع الغربية (Taylor et al. ، 2013) ، وهنا نلخص سير عمل اللطخة الغربية الكاملة مع التركيز على إعداد العينة وتحليل البيانات من أجل النشاف الغربي الكمي.

1 المقدمة

تعد التقنيات البروتينية مثل الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد وقياس الطيف الكتلي أدوات قيمة في دراسات التنميط شبه الكمي للبروتين من أجل تحديد أنماط التعبير العريض التي تتيح فهمًا أفضل للأحداث الجزيئية ، ومسارات الإشارات والآليات [1]. يتم تأكيد البيانات الناتجة عادةً بطريقة ثانية مستقلة مثل النشاف الغربي. تم تقديم النشاف الغربي بواسطة Towbin et al. [2] في عام 1979 ومنذ ذلك الحين أصبح أسلوبًا شائعًا يستخدم في مختبرات الأبحاث على مستوى العالم للكشف المناعي وتحديد كمية بروتينات معينة في متجانسات الخلايا المعقدة. على مدى العقود الثلاثة الماضية ، زادت حساسية وقوة ومرونة أنظمة المؤشرات المقابلة بشكل ملحوظ [3 ، 4]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التطوير المستمر لوسائط الكشف والكواشف قد زود المجتمع العلمي بأنظمة تصوير فائقة الحساسية توفر نطاقًا ديناميكيًا واسعًا من الاكتشاف ، مما يتيح تحديدًا دقيقًا ودقيقًا للإشارات من كلٍ من البروتينات ذات التعبير المنخفض والعالي من نفس اللطخة. على الرغم من أن المختبرات كانت سريعة في شراء أحدث تقنيات الكشف والكواشف من أجل النشاف الغربي ، إلا أن التقنيات المرتبطة المستخدمة لإنتاج بيانات قياس الكثافة لم تتطور مما أدى إلى نشر البيانات التي يصعب أو يستحيل تفسيرها أو إعادة إنتاجها [5-7].

من أجل الحصول على بيانات كمية من اللطخات الغربية ، يجب استخدام منهجية صارمة كما هو موضح سابقًا [8]. باختصار ، يعد التحقق من صحة الأجسام المضادة (Ab) أمرًا بالغ الأهمية للتأكد من أن تفاعل Ab / مستضد محدد وصحيح ولتحديد عامل التخفيف للعينات المطلوبة لتحميل البروتين في النطاق الديناميكي الخطي الكمي لكل جسم مضاد. علاوة على ذلك ، يجب مراعاة الاختيار المناسب لطريقة التطبيع (استنادًا إلى الإشارات المرجعية التي تم الحصول عليها إما عن طريق بروتينات التدبير المنزلي (HKPs) بعد التلوين الكيميائي المناعي أو شدة البروتين الكلي (TP) على أغشية التنشيف بعد تلطيخ البروتين الكلي) للتأكد من أن التغييرات الطية المبلغ عنها في البروتين المستهدف ليس قطعة أثرية للإشارة المرجعية. وبالتالي ، يعد تطبيع البيانات أمرًا حاسمًا لتحديد الأخطاء التجريبية وتصحيحها حيث يصبح عدم الاستقرار المرجعي ذا أهمية متزايدة مع قياس الاختلافات الأصغر في تعبير البروتين المستهدف بين العينات [9]. يتضح التأثير المباشر للتطبيع السيئ عند تحميل العينة فوق 10 ميكرومترمطلوب g من محللة البروتين الكلية لكل ممر لأن التحميل التقليدي HKPs مثل GAPDH و actin و tubulin يتم تحميله بشكل زائد بشكل كبير وبالتالي لا يخدم الغرض من تطبيع البيانات [8 ، 9]. أيضًا ، يمكن أن تتأثر HKPs بالظروف العلاجية للتجربة مما يعطي نتائج منحرفة للتعبير البروتيني المستهدف الذي لا يعكس بيولوجيا العينات المختبرة [10-15]. بدلاً من ذلك ، أظهر التطبيع حسب البروتين الكلي المنقول بالبقع مؤخرًا أنه يعطي بيانات ممتازة عن بروتين محلولات البروتين الكلي النموذجي [16].

هنا ، نصف بعض التقنيات العامة لإنتاج عينات بروتين جيدة النوعية مع الحد الأدنى من التدهور لتحسين القدرة على التكاثر بين التجارب. كما تم تلخيص الخطوات الأساسية للنشاف الغربي الكمي ونهج موحد لحساب بيانات قياس الكثافة المرتبطة من بقع متعددة.

2. ينتج عن التصميم التجريبي الدقيق بيانات موثوقة وقابلة للتكرار

على عكس المقايسات القائمة على الحمض النووي التي تقيس نوعًا يمكن التنبؤ به من الجزيء يكون مستقرًا عادةً في مجموعة متنوعة من الظروف ، يمكن أن تختلف البروتينات بشكل كبير في تعبيرها واستقرارها وتشكلها ونشاطها في ظل ظروف عازلة وتجريبية مختلفة. علاوة على ذلك ، فإن وجود البروتينات الملوثة في المجانسة يمكن أن يؤثر بشكل كبير على سلامة ونشاط البروتينات المستهدفة [17]. لذلك يجب توخي الحذر عند تصميم أي مقايسة قائمة على البروتين للتأكد من أن الاختلافات الواضحة بين عينات الحالة وعينات التحكم ليست نتيجة للظروف التجريبية أو معالجة العينة. تشمل العوامل التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على البروتين وقت الحضانة ودرجة الحرارة ، بالإضافة إلى معلمات معالجة العينات مثل مقدار الوقت بين جمع الأنسجة والتجميد اللاحق أو حتى شروط وتوقيت إذابة الأنسجة أو كريات الخلايا (الجدول) 1).

إجراء التجربةمجموعات المراقبةيتكررشروط التجربةالتعامل مع عينة
مجموعات المرض أو العلاجدراسة الدورة الزمنية (أي ،

3. تحضير العينة

هناك العديد من المزالق المرتبطة بتحضير العينة والتي يمكن أن تؤثر بشكل مباشر على كثافة العصابات الموجودة على لطخة غربية بما في ذلك: (1) المعالجة غير السليمة للعينات من الأنسجة أو الخلايا مما يؤدي إلى تدهور متغير و / أو التعبير عن البروتينات بين العينات ، (2) المنظفات غير الكافية والأملاح ومثبطات الأنزيم البروتيني في محلول التحلل ، (3) تقنية التجانس الضعيفة.

نظرًا لأن محلولات البروتين شديدة التعقيد مع الملوثات مثل الحطام الخلوي أو الأنسجة والدهون وتجمعات البروتين الكارهة للماء والأحماض النووية والبروتياز التي يمكن أن تؤثر بشكل مباشر وسلبي على نتائج البقع الغربية ، فمن المهم استخدام محاليل تحلل الخلايا وتقنيات التجانس التي القضاء على آثارها [17]. بشكل عام ، تكون محاليل التجانس التي تحتوي على المنظفات غير الأيونية مثل NP-40 و Triton X-100 أقل قسوة من المنظفات الأيونية ، مثل SDS و deoxycholate الصوديوم. عادةً ما تضاف الأملاح مثل NaCl أو KCl إلى تركيز 100 إلى 150 ملي مولار لمنع تراكم البروتين. عازلة RIPA (1٪ NP-40 أو Triton X-100 ، 1٪ ديوكسيكولات الصوديوم ، 0.1٪ SDS ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 50 ملي مولار Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 7.8 ، 1 مم EDTA) وأقراص كوكتيل صغيرة كاملة مثبطات الأنزيم البروتيني (تطبيق روش العلم) بالاقتران مع أدوات التجانس الميكانيكية أو اليدوية لإنتاج متجانسات تعطي بيانات صلبة لفحوصات اللطخة الغربية.

يعد الاختيار المناسب لتقنية تجانس الأنسجة شرطًا أساسيًا لإجراء اختبار لطخة غربية ناجحة وتعتمد الطريقة المستخدمة كليًا على نوع العينة (أي الدماغ مقابل الأنسجة العضلية مقابل أنسجة الكبد على عكس الخلايا المطلية أو المعلقة) [18 ، 19]. مثال جيد لبروتوكول تحلل الأنسجة هو كما يلي: (1) التقط تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل ثم أنسجة النرد إلى قطع 1 مم مع مشرط في ملاط ​​على الجليد الجاف. تأكد من أن المبضع أو المطحنة مجمدة أيضًا على الثلج الجاف للحفاظ على النسيج المقطوع أو المطحون قريبًا من درجة حرارة الثلج الجاف طوال الإجراء. (2) أضف الأنسجة المقطعة / المطحونة إلى المخزن المؤقت RIPA المثلج. (3) انقل تحضير الأنسجة إلى مجانس نسيج Dounce المثلج (Wheaton) و Dounce 25x على الجليد. (4) Sonicate (Tekmar Sonic Disrupter) النسيج المتجانس Dounce على الجليد لـ

ثواني عند 50٪ قوة وقم بتنظيف المقتطفات بالطرد المركزي عند 34000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. (5) نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وإجراء فحص البروتين (انظر أدناه). (6) قم بتخزين المواد الطافية عند درجة حرارة -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.

لتحلل الخلية ، أضف الخلايا الحبيبية (في حالة تعليق الخلية) إلى المخزن المؤقت RIPA المثلج أو للخلايا المطلية ، أضف المخزن المؤقت RIPA المثلج مباشرةً إلى اللوحة بعد غسل الخلايا ، وكشط الخلايا وماصها. وأسفل. تابع مع الخطوة (3) أعلاه.

يجب قياس تركيز البروتين الكلي للمتجانسة من أي خلية أو محللة أنسجة باستخدام مقايسة بروتين متوافقة مع المنظفات مثل اختبار بروتين RC DC من Bio-Rad.من الناحية المثالية ، سيتم تخفيف المتجانسات إلى تركيز لا يقل عن 2 مجم / مل مما يسمح بالتحميل بين 10 ميكرومترز و 80 ميكرومترg لكل ممر من بولي أكريلاميد SDS-gel صغير بسمك 1 مم.

4. تحديد المدى الديناميكي الخطي لتحميل البروتين

تقوم معظم المعامل بتحميل كمية عشوائية من البروتين في كل ممر من مادة الهلام من أجل النشاف الغربي والتي تكون عادةً ما بين 10 ميكرومترز و 100 ميكرومترg من إجمالي lysate ولا يوجد عادة أي أساس علمي لاختيار هذا المبلغ. يؤدي هذا غالبًا إلى التحميل الزائد للبروتينات المستهدفة المعبر عنها بدرجة عالية وخاصة عناصر التحكم في التحميل المستخدمة لتطبيع البيانات. يعطي هذا عادةً كثافة شريطية منتظمة بين الممرات لبروتينات التدبير المنزلي والتي لا تنتج عن تحميل البروتين المتسق ولكن بدلاً من التحميل الزائد على الغشاء بالبروتين المستهدف (الشكل 1). للتخفيف من تأثير تشبع الغشاء ، يجب إنتاج منحنى معياري لحمل البروتين مقابل كثافة النطاق لكل بروتين مستهدف. يمكن تحقيق ذلك عن طريق عمل سلسلة تخفيف 1/2 لعينة مجمعة من جميع المحللين في مجموعة الدراسة بدءًا من 100 ميكرومترحمولة البروتين بالجرام تزيد عن 12 تخفيفًا على الأقل على جل SDS الخالي من البقع TGX (Bio-Rad). يمكن استخدام الكشف الخالي من البقع على نظام الكاميرا ChemiDoc MP (Bio-Rad) للتحقق من التحميل والجودة والفصل للجانسة متبوعًا بالنقل إلى غشاء PVDF منخفض الفلورسنت باستخدام بروتين Trans Blot Turbo (Bio-Rad) نظام النقل [8].


لا يمكن إنشاء بيانات لطخة غربية موثوقة إلا عند استخدام كمية العينة المناسبة من البروتين. يؤدي تحميل الكثير من البروتين إلى تشبع الإشارة في البقع الغربية ، إلا أن القليل جدًا منها ينتج عنه إشارات ضعيفة. بمجرد إنشاء الإعداد والظروف التجريبية للمقايسة ، لا تقم بتغيير حمل العينة أو طريقة النقل أو وقت النقل أو تخفيف الجسم المضاد أو وقت حضانة الجسم المضاد أو درجة الحرارة في التجارب اللاحقة لأن هذه العوامل قد تغير بشكل كبير إشارات الكشف.

تتبع منهجية نموذجية لتحديد التحميل المناسب لعينات البروتين: (1) نقل وصمة وفقًا لذلك عن طريق احتضان الجسم المضاد الأولي للبروتين المستهدف والثانوي المرتبط بكل لطخة بأربع خطوات غسيل على الأقل لمدة 3 دقائق بين كل حضانة. (2) أضف ركيزة تلألؤ كيميائي متوافقة مع التصوير مثل Clarity (Bio-Rad) لتطوير الإشارة الكيميائية المناعية والتقاط الإشارة باستخدام مصور قائم على كاميرا CCD مثل ChemiDoc MP (Bio-Rad). (3) قم بتصوير البقع باستخدام برنامج يوفر أدوات قياس كثافة دقيقة مطروحة من الخلفية مثل Image Lab (Bio-Rad) وإنتاج مخطط للكثافة النسبية مقابل تخفيف الطي لكل جسم مضاد أولي. (4) تحقق من صحة الأجسام المضادة عن طريق تحديد نطاقها الديناميكي الخطي (أي النطاق الذي يتم فيه الحصول على انخفاض ثابت ، 1/2 في الكثافة). (5) حدد حمل البروتين لكل جسم مضاد يتوافق مع منتصف النطاق الديناميكي الخطي.

قد يعني تخفيف العينات الفردية في مجموعة الدراسة إلى النقطة الوسطى في النطاق الديناميكي الخطي للعينة المجمعة لكل جسم مضاد أن عينات البروتين الفردية تتطلب تخفيفات مختلفة على نطاق واسع لكل جسم مضاد. سيؤكد هذا أن بيانات قياس الكثافة لكل بروتين مستهدف ستكون ضمن النطاق الديناميكي الخطي (الكمي) لإعطاء نتائج دقيقة وقابلة للتكرار تعكس البيولوجيا الحقيقية بين العينات في مجموعة الدراسة (الشكل 2). قد يؤدي التحميل غير المناسب للعينات إلى عدم وجود فرق قابل للقياس الكمي بين العينات لهدف معين لمجرد زيادة التحميل على الغشاء.


(من [9] بإذن من المؤلفين و Bio-Rad.) مقارنة خطية لقياس البروتين الكلي الخالي من البقع والكشف المناعي لثلاثة بروتينات منزلية في 10-50 ميكرومترg من محللة خلية هيلا. على اليسار توجد صور تمثيلية لـ (أ) ، لطخة خالية من البقع والبقع الكيميائية لـ (ب) ، β-اكتين (ج) ، β- التوبولين و (د) ، جابده. تتوافق ملصقات الممرات مع الحمل الكلي للبروتين (ميكرومترز). على الرغم من أن إشارات الأكتين والتوبيولين تبدو خطية ، إلا أن نسبة قياس الكثافة كانت أقل بكثير من "الاستجابة الكمية" المتوقعة للتحميل الفعلي بينما ترتبط الإشارة الخالية من البقع بالنتيجة المتوقعة (هـ).

5. تحديد الإشارة المرجعية المناسبة لمطابقة البيانات

الإشارة المرجعية الجيدة أو "التحكم في التحميل" هي تلك التي يتم التعبير عنها مع البروتين المستهدف داخل نفس العينة ويتم التعبير عنها باستمرار بين العينات. HKPs مثل توبولين ، βيعمل -actin و GAPDH تقليديًا كعناصر تحكم في التحميل ، ولكن هناك ثلاثة عيوب محتملة لاستخدام مثل هذه الضوابط. (1) قد لا يتم التعبير عن HKPs بطريقة موحدة بين الظروف التجريبية والتي ستؤدي إلى نتائج خاطئة [10-15]. تم العثور على نفس المشكلة مع الجينات المرجعية المستخدمة في qPCR حيث أدى اختيار الأهداف غير المستقرة إلى نتائج معاكسة عند مقارنتها بالأهداف الثابتة [20 ، 21]. (2) HKPs وفيرة للغاية في lysates وتشبع الغشاء عادة للعينات المحملة بما يزيد عن حوالي 4 ميكرومترg لكل حارة (انظر القسم السابق) (الشكل 2). وهذا من شأنه أن يعطي هذه البروتينات "مظهر" ضوابط التطبيع الجيدة لأن كثافات النطاقات المصاحبة ستكون جميعها متشابهة بين الممرات كـ "قطعة أثرية" من تشبع الغشاء. (3) تطبيع البيانات باستخدام HKPs يعتمد فقط على نقطة بيانات واحدة ويوفر انعكاسًا سيئًا للتناقضات المحتملة في العملية.

نظرًا للمشكلات التي تنشأ مع ضوابط HKP ، تم البحث عن طرق بديلة للتطبيع من قبل المجتمع العلمي ونقترح أن يفي التحكم في التحميل الممتاز (LC) بالمعايير التالية. (1) لديه استجابة جيدة (1: 1) للتغيرات في كمية البروتين الإجمالية للعينات الفردية. (2) إنه غير حساس لتأثير مختلف الظروف والمعالجات الفسيولوجية ، وبالتالي يجب قياسه من الغشاء نفسه لمراعاة تأثير كفاءة النقل [22 ، 23]. (3) سيكون الحصول على LC ممكنًا بشكل مثالي في جميع مراحل عملية اللطخة الغربية (أي تصور البروتين على ممرات هلام ما قبل النقل ، وصمة ما بعد النقل ، وممرات هلام ما بعد النقل) وبالتالي تمكين التحكم المتسق في العملية. (4) يجب أن يكون الحصول على خطاب الاعتماد سريعًا وسهلاً وقابلاً للتكرار بدرجة كبيرة. (5) لا ينبغي أن تكون هناك حاجة لعملية طويلة لتحسين وإنشاء LC. (6) يجب أن تكون طريقة الكشف عن LC متوافقة مع التلوين الكيميائي المناعي.

لمعالجة هذه القضايا ، يتبنى المجتمع العلمي الآن استخدام الكثافة الكلية للممر من البروتين المنقولة بالبقع كوسيلة لتطبيع البيانات [24-26]. هناك عدد من البقع التي يمكن استخدامها لتصور ، وتصوير ، وتحديد كمية البروتين المنقول على البقعة بما في ذلك Ponceau S و Coomassie R-350 و Amido Black و MemCode و Deep Purple. ومع ذلك ، فإن كل من هذه البقع لها مشاكل فردية تتمثل في كونها ضعيفة التكاثر على أساس يومي ، ونطاق ديناميكي محدود ، وتوافق محدود مع أغشية النشاف والتلطيخ الكيميائي المناعي [25]. تم مؤخرًا تقديم تقنية خالية من البقع (Bio-Rad) [24-26] وتفي بجميع المعايير الستة المذكورة أعلاه للحصول على LC جيد بنطاق ديناميكي خطي يتراوح بين حوالي 10 و 80 ميكرومترغرام من إجمالي حمل البروتين من خلية نموذجية أو محلول نسيج [8 ، 9]. يسمح هذا باستخدام كثافة الممر الإجمالية من البقعة الخالية من البقع للتطبيع بين الممرات لمعظم دراسات اللطخة الغربية.

تم وصف تقنية تطبيع المسار الكلي باستخدام تقنية الفحص الخالي من البقع جيدًا ولكن باختصار كما يلي: (أ) يمكن التحقق من جودة الفصل الكهربي في غضون دقيقتين. بعد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية ، تظهر أشرطة البروتين في الهلام ويمكن تسجيلها باستخدام نظام الكاميرا. تظل إشارة الفلورسنت المتولدة مستقرة على مدار ساعتين. (ب) يتم تصوير اللطخة مباشرة بعد النقل للتحقق من نقل البروتين من كل حارة. (ج) يتم تسجيل بيانات الصورة من الكثافة الإجمالية لجميع نطاقات البروتين المنقولة بالبقع لكل حارة باستخدام برنامج Image Lab عن طريق تحديد نطاق واحد في كل حارة وتمديد عرض النطاق لتغطية جميع قمم الحجم في ملف تعريف الممر . (د) يتم ضبط قرص التدوير في الخلفية على قيمة منخفضة (بين 1 و 5) لجميع الممرات للتأكد من أنه يتم الحصول على كثافة الخلفية الإجمالية المطروحة فقط من مجموع جميع النطاقات في كل حارة للتطبيع.

بالإضافة إلى ذلك ، تتوافق تقنية Stain-Free مع كل من أغشية النيتروسليلوز و PVDF ، كما أن تطبيع البيانات باستخدام صور لطخة SF يعتمد على العديد من نقاط البيانات التي تتفوق على HKPs.

6. تحليل البيانات: خلفية مشكلة الطرح

يعتبر طرح الخلفية سببًا شائعًا للحصول على بيانات متغيرة أو غير صحيحة من اللطخات الغربية [27]. باستخدام طرق تحليل قياس الكثافة التقليدية مثل تحليل الحجم من النطاقات المعبأة والخلفية ، يمكن أن تظهر الاختلافات في البيانات التي تم طرحها في الخلفية نظرًا لعدم طرح الخلفية من نفس المربع الذي توجد فيه النطاق. علاوة على ذلك ، فإن المربع الذي يتم فيه اختيار النطاق يحتوي دائمًا على كثافة من كل من النطاق والخلفية المرتبطة به والتي تصبح أكثر انتشارًا مع النطاقات منخفضة الكثافة [8]. يمكن أن يؤدي الجمع بين هذه العوامل إلى بيانات شديدة التباين عند اختبار العينات باستخدام بروتين مستهدف معبر تفاضليًا باستخدام جسم مضاد غير محدد مع خلفية عالية. بديل جيد لتحليل الحجم باستخدام المربعات هو خوارزمية طرح خلفية القرص المتداول إلى جانب أداة ملف تعريف الممر (الشكل 3). تم تصميم برنامج Image Lab مع كل من هاتين الأداتين التي يمكن استخدامها في وقت واحد لضمان تحديد عرض النطاق المناسب وخلفية الممر لكل حارة (الشكل 3).


(من [8] بإذن من المؤلفين و Bio-Rad.) الحصول على الصور وتحليل قياس الكثافة. تم استخدام برنامج Image Lab الإصدار 5.0 (Bio-Rad) لاكتساب الصور وتحليل قياس الكثافة للمواد الهلامية والبقع والفيلم في هذه الدراسة. يفسر البرنامج البيانات الأولية في ثلاثة أبعاد بطول وعرض النطاق المحدد بواسطة أداة "Lanes and Bands" بالتنسيق مع أداة "Lane Profile" بحيث يتم تسجيل إشارة الإشعاع الكيميائي المنبعثة من البقعة في البعد الثالث كقمة ترتفع من سطح البقعة. تم قياس كثافة نطاق معين على أنها الحجم الإجمالي تحت الذروة ثلاثية الأبعاد ، والتي يمكن عرضها في بعدين باستخدام أداة "ملف تعريف المسار" لضبط العرض الدقيق للنطاق لحساب المنطقة الواقعة أسفل الذروة المظللة من اهتمام. تم تعيين طرح الخلفية باستخدام إعداد القرص المتداول في أداة "Lanes". تم تعيين قيم القرص المتداول بحيث تم طرح الخلفية تحت النطاق (أي الذروة) ذات الأهمية بطريقة موحدة بين ممرات لطخة معينة. في هذه الحالة ، تم ضبط قرص التدحرج للمسارين اللذين تم تحليلهما على 18 و 25 ، على التوالي ، بحيث تم قطع قمم الاهتمام عند مستوى ثابت بين العلامات الموضحة بعلامة "X".

7. التحليل الحسابي لبيانات قياس الكثافة

هناك العديد من العمليات الحسابية من بيانات قياس الكثافة باستخدام الصيغ المدفونة في جداول بيانات EXCEL التي تغطي أوراق عمل وملفات متعددة للحصول على بيانات كمية من اللطخات الغربية. غالبًا ما يكون من الصعب اتباع أساس الحسابات ووجدنا أنه عندما يواجه أعضاء المختبر السؤال المباشر حول كيفية العمل على البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من اللطخات الغربية إلى النتائج القابلة للنشر ، غالبًا ما يكون هناك ارتباك. يمكن إجراء تحليل بيانات اللطخة الغربية باستخدام منهجية مشابهة جدًا لـ qPCR من خلال حساب التعبير النسبي للبروتين الطبيعي كما هو موضح في الخطوات التالية (الجدولان 2 و 3). (1) لكل بقعة ، اضرب كثافة الخلفية المطروحة (الحجم في برنامج Image Lab) للبروتين المستهدف (TP) في كل حارة بنسبة كثافة التحكم في التحميل (LC) (إما بروتين التدبير المنزلي أو الكثافة الكلية للممر) من عينة تحكم تم تحميلها في الممر 1 من جميع لطخات الدراسة إلى الممرات الأخرى في الجل. سيعطي هذا الكثافة الطبيعية للتحكم في التحميل (NDL) (الجدول 2). عادةً ما تكون عينة التحكم عبارة عن متجانسة مجمعة من جميع العينات في دراسة معينة مقسمة إلى أنابيب متعددة للسماح بتحميل عينة تحكم جديدة في الممر 1 من كل لطخة دراسة. (2) احسب فرق الطية (FD) لكل تكرار بيولوجي / تقني عن طريق قسمة NDL من كل حارة بواسطة NDL من عينة التحكم في الممر 1 (الجدول 2). (3) تحديد متوسط ​​FD وما يرتبط بها

قيم التكرارات البيولوجية عن طريق استيراد FD من الخطوة (2) أعلاه إلى حزمة برمجيات التحليل الإحصائي مثل PRISM أو تحليل تكنولوجيا المعلومات (الجدول 3).


الملخص

دهون فوسفاتيديلينوسيتول متعدد الفوسفات ، مثل فوسفاتيديلينوسيتول 3،4،5-تريسفوسفات [PI (3،4،5) P3] ، تنظم العمليات البيولوجية الحرجة ، وكثير منها شاذ في المرض. غالبًا ما تعمل هذه الدهون كروابط خاصة بالموقع في التفاعلات التي تفرض ارتباطًا غشائيًا لشركاء ربط البروتين. هنا ، نصف تطوير مجسات النشاط ثنائي الوظيفة المقابلة لمجموعة رأس PI (3،4،5) P3 فعالة في تحديد وتوصيف شركاء ربط البروتين من العينات المعقدة ، أي مستخلصات الخلايا السرطانية. تحتوي هذه المجسات على كلٍ من علامة الانجذاب الضوئي للوسم التساهمي للبروتينات المستهدفة ومقبض ثانوي للكشف اللاحق أو التلاعب بالبروتينات المصنفة. تم استغلال مجسات تحمل علامات ثانوية مختلفة ، إما عن طريق التعلق المباشر بصبغة الفلورسنت للكشف البصري أو باستخدام ألكين يمكن اشتقاقه بعد وسم البروتين عبر كيمياء النقر. أولاً ، نصف التصميم والاستراتيجية التركيبية المعيارية المستخدمة لإنشاء تحقيقات متعددة بعلامات مراسلة مختلفة للاستخدام لتوصيف البروتينات التي تحمل علامة المسبار. بعد ذلك ، نُبلغ عن دراسات وضع العلامات الأولية باستخدام البروتين المنقى ، وهو مجال PH الخاص بـ Akt ، حيث تم العثور على تحقيقات لتسمية هذا الهدف ، كما تم الحكم عليه من خلال اكتشاف الهلام. علاوة على ذلك ، تم إلغاء وضع العلامات على البروتين من خلال الضوابط بما في ذلك المنافسة مع PI غير المصنف (3،4،5) P3 مجموعة الرأس التناظرية وكذلك من خلال تمسخ البروتين ، مما يشير إلى وضع العلامات المحددة. بالإضافة إلى ذلك ، تتميز المجسات بروابط ذات أطوال مختلفة بين PI (3،4،5) P3 أدت مجموعة الرأس وعلامة الانجذاب الضوئي إلى اختلافات في تصنيف البروتين ، مما يشير إلى أن الرابط الأقصر كان أكثر فعالية في هذه الحالة. أخيرًا ، تم إجراء دراسات وضع العلامات البروتينية باستخدام مستخلصات الخلايا المسمى البروتينات التي لوحظت عن طريق الكشف عن الهلام وتم تمييزها باستخدام اللصق اللاحق للبيوتين ، وكروماتوجرافيا التقارب ، والتعرف عن طريق قياس الطيف الكتلي الترادفي. أسفرت هذه الدراسات عن إجمالي 265 بروتينًا ، بما في ذلك كل من المرشح المعروف والجديد PI (3،4،5) P3بروتينات ملزمة.


التفاعلات الجينية في التطور

ملخص

يعد التفاعل الجيني ، أو الهيمنة الفسيولوجية والإبستاس ، شرطًا أساسيًا ضروريًا ، ولكنه غير كافٍ ، للتفاعلات الجينية الإحصائية. التأثيرات الجينية الإحصائية هي مكونات تباين تُعزى إلى التأثيرات الجينية الفسيولوجية الأساسية. نظرًا لأن الاختيار يتطلب التباين الوراثي ليكون فعالًا ، فإن التأثيرات الجينية الإحصائية وليست الفسيولوجية هي المهمة في التطور. يعتبر التباين الوراثي الإضافي ذا أهمية أساسية في التغيير التطوري ، ومع ذلك ، فإن مكونات التباين الإحصائي بسبب الهيمنة والرأس مهمة لأنها يمكن أن تساهم في التباين الوراثي الإضافي ، وتتغير هذه المساهمة مع تغير ترددات الأليل. بين demes ، ترتبط هذه الزيادة في التباين الجيني الإضافي بتحول متوسط ​​التأثيرات المحلية للأليلات ، مما يتسبب في تباعد السكان لتأثيرهم على الأليلات ، بحيث يكون أداء الأليل الجيد في مجتمع ما ضعيفًا في مجتمع آخر.


الاختبارات النوعية والكمية للأحماض الأمينية والبروتينات

هناك ستة اختبارات للكشف عن المجموعات الوظيفية في الأحماض الأمينية والبروتينات. الاختبارات الستة هي: (1) اختبار النينهيدرين (2) اختبار Biuret (3) اختبار Xanthoproteic (4) اختبار Millon & # 8217s (5) اختبار هوبكنز كول و (6) اختبار نيتروبروسيد.

نقسم الطعام الذي نستهلكه إلى ثلاث فئات رئيسية: الكربوهيدرات ، ودهون مصدر الطاقة في الجسم والأكثر سهولة في الحصول عليها ، واحتياطي الطاقة الرئيسي في الجسم والبروتينات ، والجسم ومصدر # 8217s للطاقة للنمو والحفاظ على الخلايا.

تشكل البروتينات أيضًا ثاني أكبر جزء من الخلايا بعد الماء. إنها مركبات بوليمرية كبيرة تصنعها الخلايا من لبنات بناء مختلفة تسمى الأحماض الأمينية.

يظهر الهيكل العام للحمض الأميني في الشكل التالي:

لاحظ أن جميع الأحماض الأمينية تحتوي على مجموعات الأحماض الكربوكسيلية (—COOH) ، والمجموعات الأمينية (—NH2) ، وسلاسل جانبية بديلة أو قابلة للاستبدال (—R). تستخدم الخلايا البشرية عشرين نوعًا من الأحماض الأمينية المختلفة ، والتي تختلف فقط في هياكل سلاسلها الجانبية ، لبناء البروتينات. تحدد بنية السلسلة الجانبية فئة الحمض الأميني: غير قطبي أو محايد أو قاعدي أو حمضي.

يمكن للخلايا البشرية تصنيع معظم الأحماض الأمينية التي يحتاجونها لبناء البروتينات. ومع ذلك ، لا يمكن تصنيع حوالي 8 أحماض أمينية تسمى الأحماض الأمينية الأساسية بواسطة الخلايا البشرية ويجب الحصول عليها من الطعام. ترتبط الأحماض الأمينية المدمجة في البروتينات تساهميًا بواسطة روابط الببتيد. روابط الببتيد هي روابط أميدية تتكون بين مجموعة حمض الكربوكسيل لحمض أميني واحد والمجموعة الأمينية لحمض أميني ثان.

توضح المعادلة 1 أدناه تكوين ارتباط الببتيد بين اثنين من الأحماض الأمينية:

يشار إلى رابطة الببتيد. لاحظ أنه نظرًا لأن كل حمض أميني يحتوي على مجموعة أمينية واحدة على الأقل ومجموعة حمض كربوكسيل واحدة ، فمن الممكن أن تتكون رابطة الببتيد بطريقتين مختلفتين. على سبيل المثال ، مع الجلايسين والفالين ، من الممكن أيضًا أن تتشكل رابطة الببتيد بين مجموعة حمض الكربوكسيل من حمض الفالين والمجموعة الأمينية من الجلايسين ، مما يؤدي إلى إنتاج فاليل جليسين.

تتكون البروتينات من مئات الأحماض الأمينية المرتبطة بروابط الببتيد ، وتشكل سلسلة الببتيد. نحدد الاتجاه الذي ترتبط فيه الأحماض الأمينية بالإشارة إلى طرفي السلسلة على أنهما الطرف N والنهاية C. إن الطرف N هو الحمض الأميني النهائي في السلسلة التي تحتوي على المجموعة الأمينية الوحيدة التي لا تشكل جزءًا من رابطة الببتيد.

الطرف C هو الحمض الأميني الطرفي الآخر في السلسلة ، والذي يحتوي على مجموعة الأحماض الكربوكسيلية الوحيدة التي ليست جزءًا من رابطة الببتيد. لاحظ أن الطرف N والنهاية C لا يتم تحديدهما بواسطة السلاسل الجانبية. يُشار إلى عدد الأحماض الأمينية المكونة والترتيب الذي ترتبط به بدءًا من الطرف N بالبروتين & # 8217s الهيكل الأساسي.

ذوبان الأحماض الأمينية والبروتين:

الخواص الفيزيائية للأحماض الأمينية والبروتينات هي أساسًا نتيجة لبنيتها ، سواء في الحالة الصلبة أو في المحاليل المختلفة. في هذا الجزء من التجربة ، ستتحقق من قابلية ذوبان الأحماض الأمينية والبروتينات المختارة في محاليل مختلفة. باستخدام بياناتك ، ستقارن الخصائص الهيكلية للأحماض الأمينية والبروتينات.

الذوبان كدالة في محلول الأس الهيدروجيني:

يتيح وجود مجموعات الأحماض الأمينية والكربوكسيلية للأحماض الأمينية قبول البروتونات من محلول مائي والتبرع بها ، وبالتالي العمل كأحماض وقواعد. نظرًا لأن البروتينات تحتوي على سلاسل جانبية حمضية وأساسية ، فيمكنها أيضًا التبرع بالبروتونات أو قبولها. يُعرف الجزيء الذي يعمل في وقت واحد كحمض وقاعدة باسم جزيء مذبذب.

في المحاليل المائية المحايدة ، تعمل الأحماض الأمينية كجزيئات مذبذبة. على سبيل المثال ، يحتوي الحمض الأميني ذو السلسلة الجانبية المحايدة على شحنتين: واحدة موجبة ، بسبب بروتون المجموعة الأمينية ، والأخرى سلبية ، بسبب تفكك بروتون حمض الكربوكسيل. هذا الشكل الأيوني المزدوج للحمض الأميني هو الشكل zwitterionic. يوضح الشكل التالي حمض أميني في شكل zwitterionic.

الأحماض الأمينية في شكل zwitterionic لها العديد من الخصائص الفيزيائية التي ترتبط أيضًا بالأملاح الأيونية. على سبيل المثال ، الأحماض الأمينية zwitterionic هي مواد صلبة بلورية عديمة اللون وغير متطايرة مع نقاط انصهار أعلى من 200 درجة مئوية ، وعادة ما تذوب مع التحلل. وهي قابلة للذوبان في الماء ولكن ليس في المذيبات العضوية غير القطبية مثل الهكسان الحلقي.

بالمقارنة مع الأمينات العضوية والأحماض الكربوكسيلية ذات الوزن الجزيئي المماثل ، فإن الأحماض الأمينية لها نقاط انصهار أقل بكثير وقابلة للذوبان بدرجة عالية في المذيبات العضوية القطبية ، ولكنها قابلة للذوبان بشكل طفيف فقط في الماء. تسمح مجموعات الأحماض الأمينية والكربوكسيلية للأحماض الأمينية المكونة ، بالإضافة إلى طبيعة السلاسل الجانبية المختلفة ، للبروتينات بامتلاك بعض هذه الخصائص نفسها. ومع ذلك ، هناك العديد من العوامل الأخرى التي يجب مراعاتها عند مناقشة قابلية ذوبان البروتين.

قابلية ذوبان الأحماض الأمينية والبروتينات تعتمد إلى حد كبير على درجة الحموضة في المحلول. التغييرات الهيكلية في الأحماض الأمينية أو البروتينات التي تحدث عند قيم الأس الهيدروجيني المختلفة تغير الذوبان النسبي للجزيء. في المحاليل الحمضية ، يتم بروتون كل من المجموعات الأمينية والكربوكسيلية. في الحلول الأساسية ، كلا المجموعتين غير بروتونات. يوضح الشكل التالي حمض أميني في المحاليل الحمضية والمحايدة والأساسية.

قيمة الأس الهيدروجيني التي تتساوى عندها تركيزات المجموعات الأنيونية والكاتيونية هي النقطة الكهربية لهذا الحمض الأميني أو البروتين. الأحماض الأمينية والبروتينات هي الأقل قابلية للذوبان عند نقاط تساوي الكهرباء. تحتوي معظم البروتينات الموجودة في الأنسجة والسوائل البشرية على نقاط متساوية كهربية أقل من درجة الحموضة 7.0 (أقل من الرقم الهيدروجيني لجسم الإنسان) ، وبالتالي ، توجد في الغالب في أشكالها الأنيونية.

II. التفاعلات الكيميائية للأحماض الأمينية ومجموعات البروتين الوظيفية:

يمكن أن تتفاعل مجموعات وظيفية معينة في الأحماض الأمينية والبروتينات لإنتاج منتجات ملونة مميزة. تختلف شدة اللون للمنتج الذي تشكله مجموعة معينة بين البروتينات بما يتناسب مع عدد المجموعات الوظيفية أو الحرة المتفاعلة الموجودة وإمكانية وصولها إلى الكاشف. سنناقش الآن العديد من الكواشف المنتجة للألوان (الأصباغ) للكشف نوعيًا عن وجود مجموعات وظيفية معينة في الأحماض الأمينية والبروتينات.

اختبار النينهيدرين:

تحتوي الأحماض الأمينية على مجموعة أمينية حرة ومجموعة أحماض كربوكسيلية حرة تتفاعل مع النينهيدرين لإنتاج منتج ملون. عندما يتم إرفاق مجموعة أمينية بالكربون الأول ، أو ألفا ، على سلسلة الكربون الأحماض الأمينية & # 8217s ، فإن المجموعة الأمينية & # 8217s ذرة النيتروجين هي جزء من منتج أزرق أرجواني ، كما هو موضح في المعادلة 2. تحتوي البروتينات أيضًا على أمينو حرة مجموعات على كربون ألفا ويمكن أن تتفاعل مع النينهيدرين لإنتاج منتج أزرق أرجواني.

تتفاعل الأحماض الأمينية التي تحتوي على ملحقات المجموعة الأمينية الثانوية أيضًا مع النينهيدرين. ومع ذلك ، عندما تكون المجموعة الأمينية ثانوية ، يكون ناتج التكثيف أصفر. على سبيل المثال ، يتفاعل برولين الأحماض الأمينية ، الذي يحتوي على مجموعة أمينية ثانوية ، مع النينهيدرين ، كما هو موضح في المعادلة 3. منتجات التفاعل الأزرق البنفسجي والأصفر تحدد بشكل إيجابي المجموعات الأمينية الحرة على الأحماض الأمينية والبروتينات.

اختبار Biuret:

يحدد اختبار biuret للبروتينات بشكل إيجابي وجود البروتينات في محلول بلون بنفسجي عميق. بيوريت ، هـ2NCONHCONH2، يتفاعل مع أيونات النحاس (II) في محلول أساسي لتشكيل مركب بنفسجي عميق. تشبه روابط الببتيد الموجودة في البروتينات تلك الموجودة في البيوريت وتشكل أيضًا مجمعات بنفسجية عميقة مع أيونات النحاس الأساسية (II) في المحلول. يظهر المعقد العام أو المركب البيوريت المتكون بين روابط البروتين والأيون النحاسي (II) لاختبار biuret في الشكل التالي.

اختبار Xanthoproteic:

تحتوي بعض الأحماض الأمينية على مجموعات عطرية من مشتقات البنزين. يمكن أن تخضع هذه المجموعات العطرية لتفاعلات مميزة لمشتقات البنزين والبنزين. أحد هذه التفاعلات هو نترات حلقة البنزين بحمض النيتريك. تحتوي الأحماض الأمينية مثل التيروزين والتريبتوفان على حلقات بنزين نشطة وتخضع بسهولة للنترة.

يحتوي الحمض الأميني فينيل ألانين أيضًا على حلقة بنزين ، لكن الحلقة لا يتم تنشيطها ، وبالتالي لا تخضع للنترة بسهولة. يُعرف تفاعل النترات هذا ، عند استخدامه لتحديد وجود حلقة بنزين نشطة ، باسم اختبار البروتينات الزانثوبروتيكية ، لأن المنتج أصفر.

يأتي Xanthoproteic من الكلمة اليونانية xanthos ، والتي تعني الأصفر. تتعمق شدة اللون الأصفر عندما يحدث التفاعل في المحلول الأساسي. هذا التفاعل هو أحد التفاعلات التي تحدث إذا انسكبت محلول مركز من حمض النيتريك على جلدك. تحتوي البروتينات الموجودة في الجلد على التيروزين والتريبتوفان ، والتي تصبح نترات وتتحول إلى اللون الأصفر.

اختبار Millon & # 8217s:

يعد اختبار Millon & # 8217s اختبارًا خاصًا بالتيروزين ، وهو الحمض الأميني الوحيد الذي يحتوي على مجموعة الفينول ، وهي مجموعة هيدروكسيل متصلة بحلقة بنزين. في اختبار Millon & # 8217s ، يتم نترات مجموعة الفينول من التيروزين أولاً بواسطة حمض النيتريك في محلول الاختبار. ثم يتم ترك مركبات التيروزين النيترة أيونات الزئبق (I) والزئبق (II) في المحلول لتشكيل راسب أحمر أو محلول أحمر ، وكلاهما نتائج إيجابية. وبالتالي ، فإن البروتينات التي تحتوي على التيروزين ستعطي نتيجة إيجابية.

ومع ذلك ، فإن بعض البروتينات التي تحتوي على التيروزين تشكل في البداية راسبًا أبيض يتحول إلى اللون الأحمر عند تسخينه ، بينما يشكل البعض الآخر محلولًا أحمر على الفور. تعتبر كلتا النتيجتين إيجابيتين. لاحظ أن أي مركب مع مجموعة الفينول سوف ينتج عنه اختبار إيجابي ، لذلك يجب أن يكون المرء على يقين من أن العينة التي سيتم اختبارها لا تحتوي على أي فينولات غير تلك الموجودة في التيروزين.

اختبار هوبكنز كول:

اختبار هوبكنز كول خاص بالتريبتوفان ، وهو الحمض الأميني الوحيد الذي يحتوي على مجموعة الإندول. تتفاعل حلقة الإندول مع حمض الجليوكسيليك في وجود حمض قوي لتشكيل منتج دوري بنفسجي. يتفاعل كاشف هوبكنز كول فقط مع البروتينات التي تحتوي على التربتوفان. يتم تحلل محلول البروتين بواسطة حمض الكبريتيك المركز في واجهة المحلول. بمجرد أن يتحرر التربتوفان ، فإنه يتفاعل مع حمض الجليوكسيليك لتكوين المنتج البنفسجي.

اختبار نيتروبروسيد:

اختبار النيتروبروسيد خاص بالسيستين ، وهو الحمض الأميني الوحيد الذي يحتوي على مجموعة سلفهيدريل (–SH). تتفاعل المجموعة مع النيتروبروسيد في محلول قلوي لإنتاج مركب أحمر.


استكشاف الأخطاء وإصلاحها

تعمل شروط & # x0201cpilot & # x0201d الموضحة أعلاه بشكل جيد للعديد من بروتينات الربط. ومع ذلك ، إذا لم يتم اكتشاف الربط ، فقد يتطلب البروتوكول تعديلًا. المبينة في الجدول 3 هي بعض المشاكل والتفسيرات والحلول الشائعة.

توقيت

الخطوات 1 & ​​# x020133تحضير الجل: أقل من 3 ساعات

الخطوات 4 & # x020136، الرحلان الكهربي: 30 دقيقة. إلى 1 ساعة

الخطوة 7، تحضير العينة والموازنة: من 1 إلى 1.5 ساعة. يمكن بدء هذه الخطوة خلال مرحلة ما قبل الكهربائي (الخطوات 4 & # x020136).

الخطوة 8، الرحلان الكهربي: 30 دقيقة إلى 5 ساعات. سيختلف الوقت المطلوب اعتمادًا على التجربة.

الخطوات 9 & # x0201312، الكشف عن النطاقات الكهربي: عادة 30 دقيقة. لعدة أيام. سيعتمد وقت التعرض للتصوير الشعاعي الذاتي على تركيز الحمض النووي ونشاطه الإشعاعي المحدد.


بيولوجيا الخلية الأفقية: مراقبة التغيرات العالمية لحالات تفاعل البروتين باستخدام اختبار التحول الحراري الخلوي على مستوى البروتيوم (CETSA)

فحص التحول الحراري الخلوي (CETSA) هو تقنية فيزيائية حيوية تسمح بإجراء دراسات مباشرة لربط الترابط بالبروتينات في الخلايا والأنسجة. تم الآن تطبيق تطبيق CETSA على مستوى البروتين مع الكشف عن مقياس الطيف الكتلي (MS-CETSA) بنجاح لاكتشاف أهداف للأدوية السريرية اليتيمة والنتائج من شاشات النمط الظاهري ، لتحديد الأهداف غير المستهدفة ، وشرح علم الأدوية المتعددة وسمية الأدوية. يمكن الآن لتطبيقات MS-CETSA متعددة الأبعاد شديدة الحساسية الوصول أيضًا إلى ارتباط الروابط الفسيولوجية بالبروتينات ، مثل المستقلبات والأحماض النووية والبروتينات الأخرى. وبالتالي يمكن لـ MS-CETSA توفير معلومات شاملة عن تعديلات حالات تفاعل البروتين في العمليات الخلوية ، بما في ذلك التأثيرات النهائية للأدوية والتحولات بين حالات الخلايا الفسيولوجية المختلفة. هذه المعلومات الأفقية حول التشكيل الترابطي في الخلايا متعامدة إلى حد كبير مع المعلومات الرأسية حول مستويات البروتينات المختلفة ، وبالتالي تفتح فرصًا جديدة لفهم الجوانب التشغيلية للبروتينات الخلوية.

الكلمات الدالة: مقايسة التحول الحراري الخلوي تطوير الأدوية الميكانيكية الحيوية تفاعل البروتين حالة البروتينات الكمية الهدف المشاركة.


شاهد الفيديو: وظائف البروتينات المتعددة (كانون الثاني 2022).