معلومة

إسكات الجينات: العدد النسبي أو المطلق لمواقع CpG الميثيل؟


يختلف محتوى CpG كثيرًا عبر الجينوم البشري. ما الذي يحدد المحفز الذي سيتم إسكاته من خلال مثيلة الحمض النووي: جزء مواقع CpG التي تمت ميثليتها أو العدد الإجمالي لمواقع CpG الميثيلية؟ أي إشارة؟


بشكل عام ، يتطلب الإسكات القوي بواسطة مثيلة الحمض النووي أن يتم ميثلة جميع مواقع CG أو معظمها وأن هناك عددًا جيدًا من مواقع CG للميثيل. (يرتبط "العدد الجيد" بكل نوع اعتمادًا على محتوى CG للجينوم المعني.)

من غير المحتمل أن يتم إسكات المروج الذي يحتوي على حوالي 10 ٪ من مواقع CG الميثلة. ومع ذلك ، فإن التحذير من هذا هو أن CG الميثلي واحد في مكان جيد يمكن أن يتسبب في إسكات أو على الأقل تقليل كفاءة المروج. أيضًا ، يتم استنفاد العديد من المروجين لـ CG ، مما يعني أنه يمكن ميثليتها بالكامل ، ولكن لا يزال لديها الكثير من المثيلة المطلقة. يمكن أن تكون هذه المحفزات نشطة على الرغم من "فرط الميثيل" الظاهر في سياق CG. أيضًا ، التحذير من هذا هو أنه يمكن إسكات المروجين مع عدم وجود مثيلة ، حتى لو كان لديهم مواقع CG. بشكل أساسي ، إذا كانت مثيلة CG مهمة في تنظيم الجين ، فسيكون لها مواقع CG في أجزاء مهمة وظيفيًا من المروج. سيتم ميثلة المحفز جيدًا عندما يتم إسكات الجين ، ولكن نظرًا لأن وضع مثيلة de novo CG ليس مثاليًا تمامًا ، فهناك احتمال كبير بأن يكون هناك مثيلة أكثر مما هو مطلوب لتحقيق إسكات. نوع من النمط الظاهري المبالغة.

تعد هذه الورقة من مختبر Schubeler غزوة لطيفة في مروجي الثدييات ، والتي تم تقسيمها إلى 3 مجموعات مختلفة اعتمادًا على محتوى CpG ، ثم تحليل كل مجموعة من أجل ملفات تعريف مثيلة CG.


المروج (علم الوراثة)

في علم الوراثة ، أ المروجين هو تسلسل من الحمض النووي الذي ترتبط به البروتينات ويبدأ نسخ RNA واحد من الحمض النووي في اتجاه مجرى النهر. قد يقوم هذا الحمض النووي الريبي بتشفير البروتين ، أو يمكن أن يكون له وظيفة في حد ذاته ، مثل الحمض الريبي النووي النقال ، أو الرنا المرسال ، أو الرنا الريباسي. توجد المحفزات بالقرب من مواقع بدء النسخ للجينات ، في أعلى الدنا (نحو المنطقة 5 'من حبلا الإحساس). يمكن أن يكون طول المروجين حوالي 100-1000 زوج قاعدي ، ويعتمد تسلسلها بشكل كبير على الجين ومنتج النسخ ، ونوع أو صنف بوليميريز الحمض النووي الريبي المعين في الموقع وأنواع الكائن الحي. [1]

1: RNA بوليميريز ، 2: كاظمة، 3: المروجين، 4: المشغل أو العامل، 5: اللاكتوز ، 6: lacZ، 7: lacY، 8: lacA.

قمة: تم إيقاف نسخ الجين. لا يوجد اللاكتوز لتثبيط القامع ، لذلك يرتبط القامع بالمشغل ، مما يعيق بوليميريز الحمض النووي الريبي من الارتباط بالمحفز ويجعل الرنا المرسال يشفر جين اللاكتيز.

قاع: الجين قيد التشغيل. يثبط اللاكتوز المثبط ، مما يسمح لبوليميراز الحمض النووي الريبي بالارتباط بالمحفز والتعبير عن الجينات التي تصنع اللاكتاز. في النهاية ، سوف يهضم اللاكتاز كل اللاكتوز ، حتى لا يكون هناك ما يربطه بالقمع. ثم يلتزم المكثف بالمشغل ، ويوقف تصنيع اللاكتيز.


خلفية

تشكل مثيلة بقايا السيتوزين في CpG ثنائي النوكليوتيدات للحمض النووي أساس التحكم اللاجيني للتعبير الجيني في الحيوانات الفقارية [1 ، 2]. تعتبر أنماط المثيلة الجينومية ذات أهمية حاسمة في العمليات البيولوجية المختلفة مثل إسكات العناصر الطفيلية ، والتطور ، وتكوين الأورام والطبع الجيني [3-5]. في الجينوم ، لا يتم توزيع CpGs بشكل موحد: المستوى المتوسط ​​هو 1٪ فقط وهناك حوالي 30000 منطقة قصيرة غنية بـ CpGs [6]. في كثير من الأحيان ، يتم تضمين مروجي الجينات المعبر عنها على نطاق واسع في جزيرة CpG بينما لا يتم تضمين مروجي الجينات المعبر عنها بدقة بشكل عام [7]. في الثدييات ، يتم إنشاء أنماط مثيلة الحمض النووي بواسطة نوعين مميزين من ناقلات ميثيل السيتوزين DNA ، Dnmt3a و Dnmt3b ، أثناء التطور بعد الزرع [8]. ثم يتم الحفاظ على مثيلة الحمض النووي بواسطة ميثيل ترانسفيراز آخر ، Dnmt1 [9]. تظل جزر CpG غير ميثلة ينتج عنها مثيلة شاذة في إسكات تعبيرها. لا تؤدي مثيلة المحفزات إلى نسخ صامت حتى يتم تجنيد بروتينات الكروماتين في المنطقة [10]. تشارك بروتينات ربط الميثيل السيتوزين (MBPs) ، المرتبطة بـ 5meCpG وأيضًا جزء من المجمعات التي تحتوي على هيستون ديستيلازس (HDACs) ، في الإسكات. ترتبط Dnmts أيضًا بـ HDAc وكذلك مع HP1 [11]. يتم حزم الحمض النووي لهذه المناطق الصامتة في نيوكليوسومات تحتوي على هيستون منزوع الأسيتيل H3 [2 ، 12].

التأثيرات التي تنتشر في رابطة الدول المستقلة تم عرضها على مستويين في هذه العملية. من جديد يمكن أن تنتشر المثيلة من المناطق التي تعمل في البؤر [13]. يمكن أن تؤدي مثيلة التسلسل غير المحفز إلى إسكات نسخ الجين المراسل [10 ، 14]. انتشار إسكات الجينات ينطوي على نزع هيستون وكذلك الأنشطة الهيكلية وإعادة تشكيل الكروماتين [15]. الآليات الكامنة وراء هذه التأثيرات في رابطة الدول المستقلة ليست مفهومة. إذا كان كل من المثيلة وتأثيرات المثيلة يمكن أن تنتشر في رابطة الدول المستقلة، الأسئلة المتعلقة بكيفية إفلات جزر CpG من المثيلة عندما تكون المتواليات المجاورة مفرطة الميثيل ، وكيف يفلت المروج المقيم من الإسكات ، يتم طرحها بوضوح. يمكن أن تكون عناصر الحدود هي التي تحدد المجالات مما يسمح لها بالحفاظ على حالات مختلفة [16]. وبدلاً من ذلك ، فإن البروتينات مثل البروتينات المرتبطة بـ CpG [17] ، والتي تربط الحمض النووي غير الميثيل ، هي مرشحة محتملة للحفاظ على Hypomethylation لـ CpG.

هذه القضايا مهمة لفهم التنظيم الوظيفي للجينوم. كما أنها مهمة عند تصميم جينات اصطناعية من تسلسلات من أصل بعيد. في الواقع ، من اللافت للنظر أن التسلسلات البكتيرية الغنية بـ CpG المرتبطة بعناصر التحكم حقيقية النواة تعمل. ومع ذلك ، هناك حالات لا يتم فيها استنساخ التعبير بأمانة. هذا هو الحال دائمًا تقريبًا مع ارتباط التسلسلات البكتيرية بمحفزات الجينات المعبر عنها على نطاق واسع [18-22]. قد يكون هذا بسبب عدم وجود معززات مطلوبة أو عناصر منطقة التحكم في Locus (LCR) أو ارتباطها بالتسلسلات البكتيرية. في إحدى الحالات ، تبين أن إعادة كتابة تسلسل الجين البكتيري كانت مفيدة لتعبيرها في الفئران المعدلة وراثيًا [23].

لتقييم أهمية محتوى CpG العالمي في الضوابط اللاجينية ، قمنا ببناء لاكز الجينات تختلف فقط في محتواها من CpG ، من كثافة عالية إلى خالية [24]. تم دمج هذه الجزيئات مع محفزات الجينات المعبر عنها على نطاق واسع - المحفزات التي لا تقوم عمومًا بإعادة إنتاج نمط تعبير واسع الانتشار عند استخدامها في عملية التكوُّن. نظهر أن القمع الكامل لأثرياء CpG لاكز لوحظ التحوير حتى عند نسخة واحدة في جميع الأنسجة الجسدية بينما يتم الحصول على تعبير واسع الانتشار باستخدام لاكز الجينات المعدلة وراثيا تفتقر إلى CpG. تشير دراسات المثيلة إلى أن الآلية التي يتم من خلالها التوسط في هذا التأثير تتضمن تداخلًا بين حماية جزيرة CpG من من جديد مثيلة و من جديد مثيلة المتواليات المجاورة أثناء التطوير.


نتائج

ال ALDH1L1 يحتوي الجين على جزيرة CpG بالقرب من موقع بدء النسخ

أظهرت دراساتنا السابقة أن FDH منظم بقوة وبشكل واسع في خطوط الخلايا السرطانية والأورام البشرية على كل من مستويات الرنا المرسال والبروتين. غالبًا ما ترتبط هذه الظاهرة بزيادة مثيلة الجينات بالقرب من مناطق المروج. تحليل ALDH1L1 كشف الجين (بالقرب من موقع بدء النسخ) باستخدام CpG Island Searcher 18 (www.cpgislands.com) عن وجود جزيرة CpG يبلغ مجموعها 96 زوجًا من CpG وتمتد على مساحة 1443 نقطة أساس (& # x02013525 إلى +918). تغطي جزيرة CpG هذه المنطقة الواقعة في بداية بداية النسخ ، وأول exon (وهو غير قابل للترجمة) ، وجزء من الإنترون الأول المجاور لـ exon 1 (الشكل 1). تحليل هذه المنطقة التي يبلغ حجمها 1،443 نقطة أساس باستخدام Proscan (www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan) ، برنامج تحديد المروج ، 19 أبرز جزء التسلسل من & # x0201310 إلى & # x02013260 (نسبة إلى النسخ موقع البدء) باعتباره المروج المفترض. يفتقر مروج ALDH1L1 إلى صناديق TATA أو CCAAT المتعارف عليها والتي توجد غالبًا داخل أول مائة نيوكليوتيدات في بداية عملية النسخ. بدلاً من ذلك ، تم التنبؤ بالعديد من مواقع ربط عامل نسخ SP1 ، وهي ميزة شائعة للمروجين الأقل من TATA. 20 من الجدير بالذكر أن المروج المفترض يحتوي على عدد كبير من CpGs (21 ثنائي نيوكليوتيد) ويقع في وسط جزيرة CpG.

حالة مثيلة من ALDH1L1 جزيرة CpG في خطوط الخلايا.

لقد درسنا مدى مثيلة جزيرة CpG في خطوط الخلايا A549 و HepG2 و HCT116 التي تعاني من نقص FDH باستخدام نهج تسلسل بيسلفيت. 21 في جميع خطوط الخلايا التي تم فحصها ، فإن ALDH1L1 تم ميثلة جزيرة CpG على نطاق واسع (الشكل 2): من إجمالي 96 CpGs ، تم ميثلة 74 في خلايا A549 (77٪) ، و 91 في خلايا HCT116 (95٪) ، و 56 في خلايا HepG2 (58٪). في خلايا HepG2 ، تم تعريف 17 CpGs إضافية (17.5 ٪ من جميع CpGs في المنطقة) على أنها ميثلة جزئيًا: في كل حالة ، أظهر 50 ٪ فقط من الحيوانات المستنسخة التي تم تحليلها مثيلة في موقع معين (الجدول 1 من الملحق. المواد). في خلايا HEK293 ، التي تعبر عن مستويات قابلة للاكتشاف من FDH ، ظل المروج القريب وأول إكسون غير ميثيل تمامًا ، بينما شوهد بعض المثيلة (5 CpGs) في intron. ومن المثير للاهتمام ، في هذا الخط الخلوي ، أن المثيلة الجزئية (50٪ من الحيوانات المستنسخة التي تم تحليلها أظهرت مثيلة في كل موقع محدد) شوهدت في المروج البعيد (الشكل 2). يبدو أن هذه المثيلة الجزئية لا تؤثر على قدرة خلايا HEK293 على التعبير عن FDH.

أنماط الميثلة من ALDH1L1 جزيرة CpG في الأنسجة البشرية وخطوط الخلايا. ثنائي النوكليوتيدات الفردية CpG (يتم وضعها بالتتابع) هي كما يلي: الدوائر المفتوحة = الدوائر المغلقة غير الميثيلية = الدوائر الرمادية الميثيلية = الميثيل في أحد الأليلات (تم تحليل 10 إلى 15 استنساخًا لكل جزء). يسمح التخطيط في الأسفل بتعيين CpGs إلى 1 من 3 مناطق ALDH1L1 (المروج ، exon 1 ، أو intron 1).

حالة المثيلة من ALDH1L1 جزيرة CpG في الأنسجة البشرية الطبيعية

حقيقة هذا التعبير عن ALDH1L1 في البشر هو أنسجة محددة للغاية مما يشير إلى تنظيم جيني محكم. 5 في العديد من الأنسجة ، يوجد FDH بمستويات عالية جدًا ، بينما توجد أنسجة بمستويات لا يمكن اكتشافها من FDH mRNA. 5 لدراسة ما إذا كان الاختلاف في ALDH1L1 تساهم الميثلة في التعبير الخاص بالأنسجة ، قمنا بتحليل حالة المثيلة لثنائي النوكليوتيدات CpG الفردية في الكبد والطحال البشريين ، وهي أعضاء ذات مستويات عالية جدًا أو لا يمكن اكتشافها من FDH ، على التوالي. تم تحليل ثلاث عينات مختلفة من الحمض النووي الجينومي المتاحة تجارياً لكل من الأنسجة. كشفت هذه التجارب عن عدم وجود CpGs الميثيل في ALDH1L1 منطقة الجزيرة في DNA الكبد (الشكل 2). على عكس عينات الكبد ، لاحظنا مثيلة لأزواج CpG في الجزء البعيد من ALDH1L1 محفز في عينات الحمض النووي من الطحال (الشكل 2). ومع ذلك ، فإن المروج القريب وكذلك exon 1 والتسلسل intronic في اتجاه المصب يظلان غير ميثلين تمامًا.

استعادة تعبير FDH في خلايا A549

في كثير من الحالات ، يمكن إعادة تنشيط الجينات التي يتم إسكاتها بواسطة فرط الميثيل عن طريق العلاج باستخدام 5-aza-2 & # x02032-deoxycytidine (5-aza-dC) ، وهو مثبط قوي ومحدد لميثيل ترانسفيرازات الحمض النووي. 22 في الخلية ، يتم دمج هذا العامل في DNA وعند الارتباط يصبح مرتبطًا تساهميًا بـ DNA methyltransferases ، وبالتالي يعيق نشاطها. 22 ينتج عن هذا أيضًا خسارة كبيرة في مثيلة CpG بعد النسخ المتماثل. بعد علاج خلايا A549 أو HepG2 أو HCT116 مع 1 & # x000b5M 5-aza-dC لمدة 96 ساعة ، لاحظنا ظهور FDH mRNA وكذلك البروتين (الشكل 3). تتوافق هذه النتائج مع الدراسات التي أظهرت انخفاض مثيلة الحمض النووي وزيادة التعبير عن بعض البروتينات في الخلايا المعالجة 5-aza-dC & # x02013 ، 23-28 وتشير إلى ذلك ALDH1L1 مثيلة المروج هي آلية إسكات هذا الجين في الأورام.

عكس ALDH1L1 إسكات بواسطة 5-aza-DC. مستويات ALDH1L1 mRNA (أ) والبروتين (ب) قبل (التحكم) وبعد العلاج بـ 5-aza-dC (1 & # x000b5M). تم قياس مستويات mRNA بواسطة PCR في الوقت الفعلي (تم تطبيعه إلى & # x003b2-actin mRNA وعرضه بالنسبة إلى عنصر التحكم غير المعالج). تم قياس مستويات البروتين من مقايسات اللطخة الغربية (داخلي) وتم تطبيعها إلى مستويات & # x003b2-actin كعنصر تحكم في التحميل. يتم عرض متوسط ​​& # x000b1 SD من 3 تجارب مستقلة. AU = وحدات عشوائية.

تحديد النواة ALDH1L1 المروجين

فحصنا ALDH1L1 المروج باستخدام تحليل الحذف ومقايسات مراسل لوسيفيراز. تم إنشاء أحد عشر تركيبًا مختلفًا واختبارها للقدرة على إحداث تعبير لوسيفيراز (الشكل 4 أ). إجمالي 5 ALDH1L1 تم تحليل متواليات المحفز ذات الأطوال المختلفة (من المنطقة الواقعة أعلى موقع بدء النسخ) (التركيبات II و IV و VI و VIII و X) (الشكل 4 أ). كشفت هذه التجارب أن ALDH1L1 المروج نفسه ضعيف: لم يلاحظ أي تنشيط لتعبير luciferase فوق المستويات القاعدية (تم الحصول عليه باستخدام ناقل غير محفز) (الشكل 4C). اختبرنا أيضًا تأثير exon 1 على نشاط ALDH1L1 المروجين. في هذه التجارب ، تمت إضافة تسلسل exon 1 بأكمله إلى نفس تركيبات المروج الأساسية (الشكل 4 أ). ومن المثير للاهتمام ، أن إدراج exon في التركيبات عزز بشكل كبير نشاط المروج ، وحدث هذا التحسين مع جميع التركيبات المختبرة (الشكل 4C). بالاتفاق مع تحليلنا الحسابي للمروج ، أشار فحص التركيبات المحتوية على exon إلى أن النواة ALDH1L1 المروج يقع داخل حوالي 300 نيوكليوتيد في بداية موقع بدء النسخ.

تأثير في المختبر مثيلة على نشاط ALDH1L1 المروج (فحوصات لوسيفيراز). (أ) تمثيل تخطيطي للتركيبات المستخدمة في اختبار لوسيفيراز (في كل بناء ، يظهر المروج كشريط مظلل ، يظهر جين لوسيفيراز كرأس سهم أبيض ، ويشار إلى موقع بدء النسخ بواسطة الأسهم). موقف ALDH1L1 يشار إلى جزيرة CpG (الرسم البياني العلوي). (ب) تحليل مثيلة من بنيات المراسل. اللوحة العلوية: عرض تخطيطي للبلازميدات الميثلة وغير الميثلة. اللوحة السفلية: الاغاروز الكهربائي للهلام الميثلي (Sssأنا +) وغير ميثيل (SssI & # x02013) البلازميدات المراسل هضمها مع نوكليازات تقييد حساسة للميثيل ، هباالثاني و هههأنا (كلا الإنزيمين لا يقطعان الحمض النووي الميثليلي). (ج) نشاط نسخ ALDH1L1 يبني المروج منقولة بشكل عابر إلى خلايا A549: أشرطة مغلقة = بنيات غير ميثيلية أشرطة مفتوحة = بنيات ميثيلية. تم عرض نشاط Luciferase (& # x000b1SD) لـ 3 تجارب مستقلة. PLV = ناقل غير محفز (pGL-basic plasmid).

تثبيط نشاط النسخ لمروج ALDH1L1 عن طريق المثيلة في المختبر

درسنا كذلك تأثير في المختبر الميثيل لمحفز ALDH1L1 / لوسيفيراز يبني على تعبير البروتين في خلايا A549. لتأكيد اكتمال في المختبر مثيلة ، خضعت تركيبات البلازميد للعلاج مع نوكليازات داخلية تقييد حساسة للميثيل ، هباالثاني و ههه1. أشار عدم وجود شظايا مشقوق أن المثيلة كاملة (الشكل 4 ب). في هذه التجارب ، لوحظ انخفاض قوي في نشاط اللوسيفيراز عند المثيلة مقارنة بالنشاط في خلايا التحكم المنقولة بالبلازميد غير الميثيلي (الشكل 4 ج). في الواقع ، عطل الميثيل تمامًا قدرة المروج & # x02019 على توجيه التعبير الجيني للمراسل. ومن المثير للاهتمام ، أن هذه التجارب كشفت أن مثيلة التراكيب ، والتي تشمل إكسون 1 ، ألغت التأثير المعزز الذي لوحظ سابقًا على النسخ. تشير هذه النتيجة بقوة إلى أن الميثيل داخل إكسون 1 متورط في تنظيم ALDH1L1 التعبير.

ALDH1L1 يرتبط مثيلة جزيرة CpG بمستويات FDH في الأورام الغدية في الرئة

درسنا ما إذا كان ALDH1L1 تلعب مثيلة جزيرة CpG دورًا في إسكات البروتين في الأورام البشرية. أظهرت تجاربنا الأولية مع عينات من أنسجة الكبد مثيلة قوية لمنطقة المروج ALDH1L1 في سرطان الخلايا الكبدية (الشكل 2). دعما لدور المثيلة في ALDH1L1 إسكات ، المحفز غير ميثيل تماما في الكبد الطبيعي (الشكل 2). ومن المثير للاهتمام أن تحليل ALDH1L1 المحفز في ورم وعائي حميد في الكبد كشف أيضًا عن نقص المثيلة (الشكل 2). لمزيد من تقييم دور ALDH1L1 المثيلة في إسكات الجينات ، قمنا بفحص عينات من الأورام الغدية في الرئة وعينات من أنسجة الرئة الطبيعية لنفس الأفراد. تم تحليل ما مجموعه 10 أزواج متطابقة (الشكل 5). كشفت جميع العينات المأخوذة من أنسجة الرئة الطبيعية عن نقص تام في المثيلة في أي من ثنائي النوكليوتيدات 96 CpG في ALDH1L1 جزيرة CpG. وفقًا لذلك ، احتوت هذه الأنسجة على ALDH1L1 mRNA والبروتين (الشكل 5). في المقابل ، لوحظت درجة متغيرة من المثيلة في جميع عينات الورم. أظهرت عينة واحدة (# 1262) مثيلة جزئية في CpG واحد في منطقة intron (في 5 من 11 استنساخًا تم تحليله ، تمت ميثلة هذا الموقع) (الجدول 3 من مادة الملحق) (الشكل 5). لم ينتج عن هذا المثيلة الضعيف انخفاض في ALDH1L1 mRNA أو مستويات البروتين (الشكل 5). وبالمثل ، لم تظهر عينة أخرى تحتوي على مثيلة جزئية فقط لـ 4 CpGs (# 3549) انخفاضًا في مستويات الرنا المرسال أو البروتين (الشكل 5). على العكس من ذلك ، أظهرت 8 عينات مع مثيلة أكثر شمولاً للجزيرة انخفاضًا قويًا في مستويات الرنا المرسال والبروتين ، مع 4 عينات يبدو أنها أسكت ALDH1L1 تمامًا (الشكل 5). وتجدر الإشارة إلى أن هذه العينات الأربع (# 1258 ، و # 1245 ، و # 1261 ، و # 3905) كانت تلك التي تحتوي على مثيلة أكثر شمولاً داخل exon 1 (الشكل 5). يقترن ر أظهر تحليل الاختبار للأنسجة الطبيعية والأورام الغدية أن الاختلافات في مثيلة جزيرة CpG ومستويات بروتين ALDH1L1 كانت ذات دلالة إحصائية عالية (ص = 0.0001) (الشكل 5).

ALDH1L1 تم إسكاته في الأورام السرطانية في الرئة البشرية عن طريق المثيلة داخل جزيرة CpG. أنماط مثيلة جزيرة CpG (أ) والتغيرات في مستويات الرنا المرسال والبروتين (ب) من ALDH1L1 في المرضى الذين يعانون من أورام الغدة الرئوية. دائرة مفتوحة = دائرة مغلقة CpG غير ميثيلية = دوائر رمادية ميثيلية CpG = ميثيل CpG في أحد الأليلات (تم تحليل 8 إلى 14 نسخة لكل جزء). رسم تخطيطي يصور موقف CpGs في الداخل ALDH1L1 المروج ، exon 1 ، أو intron 1. تم قياس مستويات mRNA بواسطة PCR في الوقت الحقيقي وتم تقديمها في وحدات عشوائية (الرسم البياني الشريطي العلوي). يتم عرض متوسط ​​& # x000b1 SD من 3 تجارب مستقلة. تم تقييم مستويات البروتين من خلال مستويات مقايسات اللطخة الغربية لـ & # x003b2-actin تظهر كعناصر تحكم في التحميل (اللوحة الوسطى). الرسم البياني الشريطي السفلي: القياس الكمي للبقع الغربية المقيسة بمستويات الأكتين. (ج) يقترن ر تحليل اختبار مثيلة جزيرة CpG (اللوحة العلوية) ومستويات البروتين ALDH1L1 (اللوحة السفلية) في مطابقة عينات الأنسجة الطبيعية والسرطانية الغدية. يشار إلى الفروق ذات الدلالة الإحصائية بعلامة النجمة. يُظهر المحور Y في اللوحة العلوية عدد CpGs الميثيل (تم تعيين المواقع الميثيلية جزئيًا بقيمة 0.5 في جميع الحالات ، وكانت المثيلة الجزئية 50 ٪ إذا تم تحليل عدد زوجي من الحيوانات المستنسخة وقريبًا من هذه القيمة إذا كان عدد فردي من تم تحليل الحيوانات المستنسخة) (الجدول 3 من ملحق المواد).


قم بتنزيل وطباعة هذه المقالة لاستخداماتك العلمية والبحثية والتعليمية الشخصية.

شراء عدد واحد من علم مقابل 15 دولارًا أمريكيًا فقط.

أدوات المادة

الرجاء تسجيل الدخول لإضافة تنبيه لهذه المقالة.

بقلم لوسيا إيتشينو ، براندون أ.بون ، لوك ستراسكولاج ، سي جيك هاريس ، جونديب كور ، ماثيو أ.غلادستون ، مافريك تان ، سوهوا فينج ، ياسامان جامي الأحمدي ، ساشا إتش دتك ، جيمس إيه وولشليغيل ، شياودونج تشينج ، سي ردينغ ، ستيفن إي جاكوبسن

تم النشر على الإنترنت في 03 يونيو 2021


شكر وتقدير

نشكر S. Cross و A. Bird لتوفير استنساخ البلازميد pET6HMBD وللحصول على مشورة مفيدة. نشكر أيضًا J. Graff لتوفير بيانات تسلسل النيوكليوتيدات غير المنشورة للإنسان CDH1 الجين. تم توفير خط الخلية MKN1 من قبل Y. Kanai و S. Hirohashi. تم الحصول على خطوط الخلايا الأخرى المستخدمة في هذه الدراسة من بنك موارد أبحاث العلوم الصحية (أوساكا) وبنك خلية ريكين (تسوكوبا). تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال منحة مساعدة من وزارة التعليم والعلوم والرياضة والثقافة في اليابان ومنحة مساعدة لأبحاث السرطان من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية في اليابان (إلى MS) ومن خلال منحة مساعدة من وزارة الصحة والرفاهية في اليابان للاستراتيجية العشرية الشاملة للسيطرة على السرطان لمدة 10 سنوات ، ومنحة بحثية حول الجينوم البشري والعلاج الجيني من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية ، اليابان ( إلى TS) YHC كان زميلًا باحثًا بمساعدة برنامج اليابان لمعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا.


مناقشة

في هذا العمل ، أظهرنا ذلك ALDH1L1 تم قمع الجين بشدة في 100 ٪ من عينات قبل الميلاد. انخفاض مماثل في ALDH1L1 لوحظ التعبير في غالبية الأورام الخبيثة الأخرى التي تم اختبارها حتى الآن (Krupenko and Oleinik ، 2002 Rodriguez et al. ، 2008 Oleinik et al. ، 2011 Chen et al. ، 2012 Dmitriev et al. ، 2014). أظهر تحليلنا لبيانات TCGA أن كبت الجين في BC مصحوب بفرط ميثيل CpG في منطقة المروج. وفقًا لذلك ، أبلغت العديد من الدراسات سابقًا عن المثيلة الشاذة لـ ALDH1L1 محفز في سرطان الغدة الرئوية ، وسرطان الخلايا الكبدية (Oleinik et al. ، 2011) ، وسرطان الخلايا الحرشفية المريئي (Chen et al. ، 2015) ، مما يدعم فكرة أن فرط الميثيل من ALDH1L1 هي آلية رئيسية لقمع الجين في السرطان.

تتم دراسة دور المروج hypermethylation في السرطان بشكل مكثف. أكثر من 60٪ من جميع الجينات لديها جزر CpG وجزء معين (يصل إلى 10٪) يمكن أن يكون مفرط الميثيل في السرطان (Baylin and Jones ، 2016). قد يعمل بعضها كجينات مثبطة للورم ، لكن تمييز الجينات التي تساهم بشكل مباشر في تكون الأورام مهمة صعبة. حاليا ، لا يمكن أن يقال على وجه اليقين ما إذا كان ALDH1L1 هو حسن النية الجين الكابت للورم أو مجرد & # x201Cpassenger & # x201D الذي غالبًا ما يكون محفزًا مفرط الميثيل في السرطان. لكن، ALDH1L1 سمح لنا القمع في 100 ٪ من عينات BC بمعالجة العديد من الأسئلة حول ديناميكية ونمط عملية مثيلة المحفز. يفعل ALDH1L1 يرتبط مستوى مثيلة المروج أو مستوى التعبير الجيني بالمرحلة السريرية لسرطان الثدي؟ ما هي مواقع CpG الضرورية ALDH1L1 إخماد؟ هل hypermethylation لمواقع معينة من CpG أو متوسط ​​مستوى مثيلة المحفز مسؤول عن كبت الجينات؟ تتطلب الإجابة على هذه الأسئلة فيما يتعلق بجين معين (1) أخذ عينات تمثيلية لعينات السرطان المقترنة و (2) طريقة عالية الدقة لقياس مستوى المثيلة في المنطقة محل الاهتمام.

فيما يتعلق بالجانب الزمني ، لم نلاحظ أي علاقة بين ALDH1L1 مستوى التعبير أو مستوى مثيلة المروج لها ومرحلة BC. من ناحية ، يمكن أن يشير فرط الميثيل وإسكات الجين حتى في المراحل المبكرة إلى أن إسكات ALDH1L1 شرط أساسي للتحول الخبيث ويمكن اعتبار الجين مثبطًا للورم. من ناحية أخرى ، قد تنبع النتيجة من حجم العينة وقد تتغير عند فحص مجموعة أكبر من عينات BC المقترنة.

يمكن أن يختلف عدد مواقع CpG المميثل المطلوبة لإسكات الجين وموقعها اعتمادًا على جين معين (Tirado-Magallanes et al. ، 2017). Oleinik وآخرون. (2011) تطبيق تحويل ثنائي كبريتات الحمض النووي من 10 عينات من سرطان الغدة الرئوية والتسلسل التقليدي لمنطقة المنبع ، وأول إكسون وبداية أول إنترون ALDH1L1. لوحظ وجود فرط ميثيل معين في جميع المناطق الثلاث مع عدم وجود تفضيل كبير. على الرغم من أهمية exon الأول ALDH1L1 تم التأكيد عليه في التجارب ، حيث تم ميثلة exon على نطاق واسع في عينات مع تقليل التنظيم بشدة ALDH1L1 الجين ، وكذلك إضافة exon 1 إلى ناقل المراسل ، مما أدى إلى تحسين تعبير luciferase إلى حد كبير.

في الدراسة الحالية ، قمنا بفحص نفس المنطقة الجينومية التي تحتوي على 97 موقعًا من مواقع CpG وطبقنا التسلسل العميق للحمض النووي المحول إلى بيسلفيت. تسلسل بيسلفيت هو الأسلوب القياسي الذهبي للكشف عن مثيلة CpG في الحمض النووي الجيني. على عكس التقنيات القائمة على ميكروأري ، ينتج التسلسل بيانات مثيلة بدقة CpG الفردية ولا يعاني من الأخطاء المحتملة التي يسببها التهجين المتبادل للمسبار (Chatterjee et al. ، 2017). يعتبر التسلسل الحراري والتحليل التقليدي للمستعمرات من أكثر أساليب التسلسل شيوعًا استخدامًا للحمض النووي المحول إلى بيسلفيت. ومع ذلك ، فإن تطبيق التسلسل العميق للحمض النووي المحول إلى بيسلفيت يوفر دقة غير مسبوقة في قياس مستوى المثيلة في كل موقع من مواقع CpG ويسمح بمراقبة الاختلافات الصغيرة بين الورم والأنسجة الطبيعية. نظرًا للتغطية العالية للقراءة لمنطقة المروج البالغة 1.5 كيلو بايت التي تم فحصها ، فقد تمكنا من استجواب كل موقع من مواقع CpG عن طريق تحليل الارتباط وتحديد مواقع CpG التي كان للمثيلة التأثير الأكبر عليها ALDH1L1 التعبير. منطقة مضغوطة في بداية الإنترون الأول من ALDH1L1 أظهر الجين أعلى ارتباط سلبي مع التعبير الجيني. ثانيًا ، كانت الذروة الأقل عمقًا تنتمي إلى منطقة المروج غير المكتوبة وتقع بالقرب من موقع بدء النسخ. لم يتم الكشف عن مواقع CpG من exon 1 في هذا التحليل. التناقض في هذه النتيجة مع ملاحظة Oleinik وآخرون. (2011) يمكن أن يعزى إلى نوع الورم المختلف (سرطان الثدي عكس سرطان الغدة الرئوية) أو التقنية التجريبية (التسلسل العميق عكس التسلسل التقليدي للعديد من الحيوانات المستنسخة).

بشكل عام ، في هذه الدراسة ، أظهرنا أن القمع القوي لـ ALDH1L1 الجين في كولومبيا البريطانية مرتبط بفرط الميثيل في جزيرة CpG. تمكنا من تمييز الإنترون الأول باعتباره المنطقة الأكثر تأثرًا بفرط الميثيل. ومع ذلك ، يبدو أن المثيلة غير متجانسة تمامًا بين عينات BC: أظهرت العديد من عينات الورم عدم وجود زيادة في مثيلة جزيرة CpG. يجادل هذا الظرف بأن فرط الميثيل ليس الآلية الوحيدة المسؤولة عن ALDH1L1 خفض التنظيم في كولومبيا البريطانية.


الملخص

موضوعي-

متلازمة تسرع القلب الوضعي (POTS) لها أعراض متعددة ، أهمها عدم انتظام دقات القلب ، والضعف ، وتكرار إغماء أثناء الوقوف. أشارت الأبحاث السابقة إلى وجود خلل وظيفي في ناقل إفراز. طفرة ترميز في جين ناقل النوربينفرين (SLC6A2) تم الإبلاغ عن التسلسل في عائلة واحدة متقاربة فقط. كان الهدف من هذه الدراسة هو زيادة توصيف دور وتنظيم SLC6A2 الجين في الأواني.

الطرق والنتائج -

تم فحص استجابات الجهاز العصبي السمبثاوي لإمالة الرأس من خلال الجمع بين قياسات حركية البلازما بافراز وتسجيلات نشاط العصب السمبثاوي العضلي في المرضى الذين يعانون من POTS مقارنة مع تلك الموجودة في الضوابط. ال SLC6A2 تم فحص تسلسل الجينات في الكريات البيض من مرضى POTS والضوابط الصحية باستخدام التنميط الجيني لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ، وتسلسل ثنائي الكبريتيت ، ومقايسات الترسيب المناعي للكروماتين لتعديلات الهيستون وربط المركب التنظيمي النسخي ، بروتين ربط الميثيل- CpG 2. كان التعبير عن ناقل النوربينفرين أقل في مرضى POTS مقارنة بالمتطوعين الأصحاء. في حالة عدم تغييرها SLC6A2 تسلسل الجينات أو مثيلة المحفز ، كان هذا التعبير المخفض مرتبطًا ارتباطًا مباشرًا بتعديلات الكروماتين.

استنتاج-

نقترح أن ترتبط الأحداث المعدلة للكروماتين بـ SLC6A2 قد يشكل كبت الجينات آلية لـ POTS.

مقدمة

متلازمة تسرع القلب الوضعي (POTS) لها أعراض متعددة ، من بينها عدم انتظام دقات القلب المصحوب بأعراض ، والضعف ، وتكرار إغماء أثناء الوقوف. ومن الشائع أيضًا ضعف التركيز والإدراك أثناء الوقوف ، والتأمل الوضعي ، وآلام الصدر ، والرعشة ، والصداع ، والحمى ، والقلق ، واضطراب النوم ، والتشنج الوعائي في الأطراف ، بما في ذلك ظاهرة رينود. عادة ما يكون هناك انخفاض طفيف في ضغط الدم عند الوقوف ، على الرغم من الميل للإغماء. شدة ومسار الأواني متغيرة. في بعض المرضى تكون الأعراض خفيفة إلى حد ما ولكن في البعض الآخر يكون الاضطراب معطلاً لدرجة تجعلهم طريح الفراش بشكل فعال بسبب الضعف وعدم القدرة على الوقوف دون الإغماء.

تظل أسباب POTS غير مؤكدة وربما تكون متعددة. توجد أدلة لدعم أهمية التجمع المفرط للدم في أوردة الساقين عند الوقوف 2 واستجابة مستقبلات حجم القلب والرئة شديدة الحساسية للتجمع الوريدي. 2،3 العمل من قبلنا ، 4 والآخرين ، 5،6 ولكن ليس كلهم ​​، 7 يشير أيضًا إلى أوجه قصور في وظيفة أو تعبير ناقل النوربينفرين (NET). في عائلة واحدة متقاربة ، تم إرجاع سبب ذلك إلى طفرة نقطية في منطقة الترميز لجين NET (SLC6A2) مما أدى إلى إنتاج بروتين ناقل مختل. 6 تم العثور على هذا العيب ، كما هو متوقع ، لزيادة إشارة السمبفونورال ، بشكل أكثر وضوحًا في القلب ، وزيادة معدل تدفق النوربينفرين إلى البلازما. 6 في ما تبقى من مرضى POTS ، لم يتم تحديد أي فقد مماثل لطفرة وظيفية ، ولا يزال سبب النمط الظاهري لضعف نشاط NET غير معروف.

هنا ، أجرينا تحليلًا مكثفًا لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) في SLC6A2 الجين في مرضى POTS والمتطوعين الأصحاء ، بالإضافة إلى اختبار آلية وراثية بديلة مرتبطة بوظيفة NET. على الرغم من وجود ارتباط اسمي بين SNP واحد غير متزامن وتشخيص POTS ، لم نجد أي متغير جيني يمكن أن يعزى إليه النمط الظاهري لـ POTS. بدون القدرة على الوصول إلى نوى الأعصاب المتعاطفة في البشر ، استخدمنا الكريات البيض في بحثنا عن العوامل اللاجينية ، والتي قد تؤثر على التعبير الجيني NET. نجحت هذه الأساليب ، باستخدام أنسجة محيطية يسهل الوصول إليها ، في تحديد عدد من الواسمات فوق الجينية في أمراض أخرى. 8-12 أدت بنا نتائجنا إلى استنتاج مفاده أنه بغض النظر عن SLC6A2 يرتبط تسلسل الجين وميثيل CpG ، والتلوين بواسطة بروتين ربط الميثيل CpG 2 (MeCP2) وتعديلات هيستون ، التي قمنا بتوثيقها في غالبية مرضى POTS الذين تم اختبارهم ، بضعف النمط الظاهري لوظيفة NET في POTS ويمكن أن يكون عنصرًا تنظيميًا مهمًا آلية في الاضطراب.

مرضى وطرق

يتم توفير مزيد من التفاصيل المتعلقة بالمواد والإجراءات في ملحق البيانات عبر الإنترنت فقط.

توظيف

تم تجنيد المرضى الذين يعانون من POTS من خلال عيادة تقويم العظام لدينا بعد تقييم سريري شامل لاستبعاد أي حالة طبية أخرى ذات صلة. شارك جميع المرضى الذين يعانون من POTS الخصائص السريرية الشائعة للنوبات المتكررة من قبل الإغماء أثناء الوقوف ، والتحرر من انخفاض ضغط الدم الوضعي (انخفاض في ضغط الدم الانقباضي أثناء الوقوف في العيادة و 20 ملم زئبق) ، ولكن وجود تسرع القلب المرتبط بالوضع (زيادة معدل ضربات القلب في يقف مسجل في العيادة & gt30 نبضة في الدقيقة). تم إجراء المكون اللاجيني لهذه الدراسة باستخدام عينات تم الحصول عليها من 22 مريضًا غير مرتبطين مع POTS (16 امرأة و 6 رجال) و 40 شخصًا يتمتعون بصحة جيدة (23 امرأة و 17 رجلاً). يتم عرض البيانات السريرية المشاركين في الجدول.

طاولة. Hemodynamics and Sympathetic Function While Supine in Control Subjects and Patients With POTS

Means±SEM are listed. HR indicates heart rate SBP, systolic blood pressure DBP, diastolic blood pressure Change in HR at 40 ° , refers to change in MSNA MSNA, muscle sympathetic nerve activity POTS, postural tachycardia syndrome BMI, body mass index.

ص value from ر اختبار.

Sympathetic Nerve Recording

To quantify the degree of sympathetic activity in POTS and healthy subjects, multiunit sympathetic nerve activity in postganglionic fibers distributed to the skeletal muscle vasculature was recorded by microneurography. 13 Recording from the common peroneal nerve was performed in 8 patients with POTS and 8 healthy subjects.

Genetic Analyses of the SLC6A2 الجين

To account for the possible influence of polymorphisms in the SLC6A2 gene, including the single nucleotide polymorphism (SNP) reported by Shannon et al, 6 the promoter region and exon 9 of the SLC6A2 gene were amplified with the use of the polymerase chain reaction and sense and antisense primers. Using the Sequenom MassARRAY platform (Sequenom, Inc., San Diego, CA) as previously described, 14 93 other polymorphisms in the SLC6A2 gene, including synonymous and nonsynonymous SNPs, were also analyzed in DNA samples from a total of 65 healthy volunteers and 20 POTS patients.

Epigenetic Analyses of the SLC6A2 الجين

To examine individual sites of methylation, we bisulphite sequenced the SLC6A2 gene at −872/−514 (region 1), −515/−215 (region 2), and −180/+167 (region 3) using DNA extracted from arterial blood from POTS and healthy subjects. For chromatin immunoprecipitation experiments, leukocytes were isolated by the Ficoll method from blood taken at rest from 6 POTS (age 20.8±1.4, body mass index 23.7±2.2) and 6 healthy (age 23.3±1, body mass index 23.8±1.2) female subjects. Details of the DNA methylation and chromatin immunoprecipitation experiments are provided in the online-only Data Supplement.

نتائج

Hemodynamics and Sympathetic Function

Age, supine blood pressure, and body mass index were similar between the 2 groups, whereas resting heart rate was significantly elevated in the POTS patients (Table). Although supine heart rate was significantly elevated, muscle sympathetic nerve activity, expressed in terms of both burst frequency and burst incidence, was reduced in POTS patients. The ratio of norepinephrine spillover to plasma to multiunit sympathetic nerve activity burst frequency was substantially elevated in the POTS group, in keeping with impaired norepinephrine reuptake.

SLC6A2 Polymorphisms in POTS

Of the 16 naturally occurring polymorphisms (including the SNP causing the A457P mutation) known to encode a change in the amino acid sequence of the NET protein, 15 which were tested, none were present in the 20 POTS patients analyzed (Table V in the online-only Data Supplement). One synonymous SNP, rs5564, was significantly associated with the diagnosis of POTS after adjustment for multiple testing (ص=0.0014, target-α 0.0024). The rs5564 polymorphism lies within the splice site consensus sequence of exon 5. Because only a small number of patients were examined, this association requires validation in a larger cohort, and the possible functional significance also requires investigation.

SLC6A2 Promoter Methylation Is Unremarkable in POTS

The methylation of cytosine in the CpG dinucleotide distinguishes the epigenome, and this covalent modification is inversely associated with transcriptional expression. 16 CpG sites occur in clusters called CpG islands, which are most commonly, but not exclusively, located in the promoters of genes. 17 The human SLC6A2 gene has a CpG Island within the proximal promoter (Figure 1A). Region 1 was hypermethylated in both healthy and POTS individuals (81%–90% methylation of individual clones sequenced), whereas region 2 of the CpG Island was hypomethylated (9%–19% methylation), and region 3 was unmethylated (<1.5% methylation, Figure 1B). The data in region 3 are consistent with the unmethylated status of the CpG island proximal to the SLC6A2 gene transcription initiation start site in mouse neuronal cortical cells. 18 SLC6A2 genomic methylation was similar between the POTS patients and the healthy control subjects.

شكل 1. DNA methylation analysis of the human SLC6A2 gene in healthy and postural tachycardia syndrome (POTS) individuals. أ, Schematic representation of the analysis of the 3 regions of the CpG Island within the proximal promoter of the SLC6A2 الجين. ب, Examples of the bisulphite genomic sequencing are shown for healthy and POTS individuals with multiple clones for the SLC6A2 الجين. Specific methylated (black squares) and unmethylated (open squares) CpG dinucleotides are illustrated. The percentage CpG methylation determined by bisulphite sequencing is also accompanied in pie-graph. Regions 1 and 2 of SLC6A2 are predominantly hypermethylated and hypomethylated, respectively, whereas region 3 is largely unmethylated in healthy and POTS individuals. The arrow represents the transcriptional start site for SLC6A2.

Altered Gene Expression Patterns in POTS

Consistent with the above observations of unremarkable SLC6A2 gene methylation, we found no difference in the expression of the DNA methyltransferase DNMT1 in POTS patients (Figure 2A). Because the methylation of DNA is often associated with the binding of methyl-CpG determinants, we examined the methyl-CpG binding domain proteins, MBD1 and MeCP2. Although we found no difference in the expression of MBD1, (Figure 2B) we observed a small but significant change in MeCP2 expression in POTS patients (Figure 2C, ص<0.005). Recent experimental evidence in the mouse cortical cells suggests SLC6A2 gene-activating complexes comprise regulatory determinants that mediate histone modifications. 18 We, therefore, tested the expression of the H3K27m3 histone methyltransferase, EZH2 (Figure 2D), as well as the acetyltransferase p300. EZH2 mRNA levels were increased and inversely correlated with p300 in POTS individuals (Figure 2E ص& lt0.0001).

الشكل 2. A–E, Altered gene expression for methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2), EZH2، و p300 in healthy and postural tachycardia syndrome (POTS) patients. Gene expression was determined using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) and normalized against endogenous جابده الجين. Samples were analyzed in triplicate, and the data are presented as mean±SEM of n=6 healthy and n=6 POTS.

Histone Modifications Distinguish the SLC6A2 Promoter in POTS

A unique property of gene sequences is the polyvalent chromatin fiber, which is structurally and chemically altered to regulate gene expression. To address this, solubilized chromatin fractions were prepared in 6 healthy subjects and 6 POTS patients and immunopurified with antibodies that identify posttranslational modification of the histone H3 tail. We examined 3 regions of the SLC6A2 promoter sequence that included the CpG island. As shown in Figure 3أ، ال SLC6A2 gene is consistently deacetylated in POTS individuals for the gene-activating modification mark, histone H3 lysine 9/14 acetylation (H3K9/14ac, ص<0.0001) in all 3 regions of the gene and demethylated in POTS for the gene-activating mark, histone H3 lysine 4 methylation (H3K4m3, ص<0.001) in regions 1 and 2 (Figure 3B). These chromatin modifications were inversely correlated with the gene-suppressive modifications, histone H3 lysine 9 trimethylation (H3K9m3, Figure 3C) and lysine 27 trimethylation (H3K27m3) in all 3 regions of the gene in POTS patients (Figure 3D). This type of analysis also revealed similar results for the coregulatory determinant, MeCP2, 19 which was clearly enriched on the promoter region of the SLC6A2 gene in POTS individuals when compared with healthy subjects (Figure 3E). The increased association of MeCP2 was tightly associated with H3K9m3 and H3K27m3 enrichment of the −872/−514 sequence of the SLC6A2 الجين. To assess the specificity of MeCP2 chromatin binding, we also examined association of MeCP2 on nontarget genes, IFIH1 و FOXA1. The level of MeCP2 association on these genes did not significantly change between healthy and POTS patients (Figure II in the online-only Data Supplement). In the POTS patients H3K9m3, H3K27m3, and MeCP2 enrichment on the hNET gene were inversely correlated with the NET protein expression shown by Western blot (Figure 4). In comparison with healthy patients, we observed a significant reduction in NET protein expression in POTS relative to actin protein signal 0.66 (SD 0.043, SEM±0.031). Taken together, these results suggest that chromatin modifications may account for the impaired NET function. Protein detection was also validated using an alternate antibody to hNET (sab2102224, Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia) (Figure III in the online-only Data Supplement). NET mRNA expression was found to be extremely low in leukocytes therefore quantitative comparison between patient groups was not performed.

الشكل 3. Chromatinization of the SLC6A2 gene indicates extensive histone modifications and chromatin bound methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2) in postural tachycardia syndrome (POTS) individuals. Chromatin immunopurifications (ChIP) were performed and determinant binding analyzed for (أ) H3K9/14ac, (ب) H3K4m3, (ج) H3K9m3, (د) H3K27m3, and (ه) MeCP2. Quantification of ChIP assays are performed on region 1 (–872 to –514), region 2 (–515 to –225), and region 3 (–180 to +167) using quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR). All samples were analyzed in triplicate and the data represented as means±SEM of n=6 healthy and n=6 POTS.

الشكل 4. Western blot analysis shows the hNET (Abcam ab84057) protein is significantly repressed in postural tachycardia syndrome (POTS) individuals. Norepinephrine transporter (NET) protein signal was calculated relative to actin protein expression for both healthy individuals =1 (SD 0.043, SEM 0.031) and POTS individuals =0.66 (SD 0.022, SEM 0.015).

مناقشة

The present study identifies a change in NET expression in patients with POTS. This change in expression is attributable to increased binding of the repressive MeCP2 regulatory complex, in association with an altered histone modification composition at the promoter region of the SLC6A2 الجين.

Possible dysfunction of the NET has previously been actively investigated in POTS patients, given the previous evidence in them for presence of faulty norepinephrine reuptake. 4,6 Reuptake of norepinephrine into sympathetic nerves after its release terminates the neural signal. A fault in transmitter inactivation augments the effects of sympathetic nerve traffic. In the heart at least 80% of released noradrenaline is recaptured into sympathetic nerves, 20 so the heart is more sensitive than the other organs to impairments in transmitter reuptake. Head-up tilt to 70° after selective pharmacological blockade of NET with reboxetine in healthy subjects generates a clinical phenotype that bears a close resemblance to that seen in POTS patients during tilt, with heart rate increasing by around 40 bpm. 21 Our own data, documenting a reduction in expression of NET protein in sympathetic nerves accessed via subcutaneous vein biopsies in POTS patients, provides further support for deficiencies in NET as being important in POTS. To date, it has not been possible to study sympathetic nerve NET gene expression. The cell nuclei of sympathetic neurons are in sympathetic ganglia and cannot ethically be biopsied in POTS patients unlike the sympathetic fibers in the wall of subcutaneous veins. 4 Contrary to these findings, elevated cardiac norepinephrine spillover to plasma in POTS patients in the absence of neurochemical evidence of an uptake defect has been previously described. 7 In the present study, we estimated the proportionality of norepinephrine spillover to plasma per burst of sympathetic activity as an index of norepinephrine uptake, noting that the amount of norepinephrine overflowing into the circulation per sympathetic burst was significantly higher in the POTS patients, in keeping with impaired norepinephrine reuptake. Although this may have arisen from a defect in norepinephrine reuptake, it could also occur if the quanta of norepinephrine released per action potential was elevated. Further, if norepinephrine reuptake is reduced, this might be the consequence to swamping of the transporter by high synaptic levels of the transmitter in POTS. Supporting this premise, in response to yohimbine, cardiac norepinephrine spillover was elevated to a greater extent in POTS patients compared with controls, 7 and once cardiac norepinephrine spillover exceeded ≈200 pmol/min, the cardiac extraction of tritiated norepinephrine declined appreciably, suggesting there was a diminution in the action of NET during periods of extreme sympathetic activation in POTS patients.

Direct sequence analysis of the SLC6A2 gene has been performed in many patients, but to date a loss of function coding region mutation of the SLC6A2 gene has been found in 1 family kindred only. 6,22 Extensive analysis of SLC6A2 gene polymorphisms in the present study identified no genotype that could explain a dysfunction of NET in the majority of POTS patients. Given the evidence for the existence of the faulty neuronal norepinephrine reuptake phenotype in POTS patients, almost invariably in the absence of identifiable loss of function SLC6A2 gene coding region mutations, we tested for epigenetic modification of the SLC6A2 الجين. Gene promoter region DNA methylation, involving the covalent addition of methyl groups at the 5' position of cytosine within CpG dinucleotides, is a major mechanism of gene regulation. Methylation occurring in CpG-rich islands of gene promoter regions is directly associated with the pathological silencing of the tumor suppressor genes in cancers, imprinting disorders, and gene-linked neurodevelopment syndromes. 23 Silencing of transcription by promoter region DNA hypermethylation produces effects on phenotypes, which are usually indistinguishable from those caused by coding region mutations. 24–26

The findings presented are novel at least in 2 aspects that identify a role of epigenetic regulation of NET in POTS patients. First, they demonstrate that in the POTS individuals, the promoter sequence of the SLC6A2 gene is subject to significant alterations of histone modifications that are associated with gene-suppressive transcriptional events. Chromatin immunopurifications and the detailed analysis of the 3 regions of the SLC6A2 gene indicate a substitution of gene-activating H3K9/14 acetylation and H3K4 trimethylation with gene-suppressive H3K9 and H3K27 trimethylation that is consistent with reduced NET expression in the POTS patients. Indeed, the importance of histone H3 tail modification of the SLC6A2 gene sequence is consistent with recent identification of epigenetic control in mouse neocortical cells. 18 A major conclusion of these experiments in healthy individuals and POTS patients is the evidence that differential NET protein expression is associated with specific histone modifications.

Second, as genomic methylation was not associated with the binding of the MeCP2 repressor on SLC6A2, this result argues against methylation of the cytosine residue as the precedent determinant of silencing in POTS patients. Rather, experiments had identified H3K9 and H3K27 trimethylation to strongly correspond with MeCP2 association on the SLC6A2 الجين. In this context, the unremarkable changes in CpG methylation observed between healthy individuals and POTS patients were less surprising. Recent findings are indicative of a multifunctional role for MeCP2 that is also found on nonmethylated CpG sequences. Indeed, our observations argue against the old model that has for so long relied on the paradigm of DNA methylation-mediated repression. 18 The emerging picture for MeCP2 is remarkably complex with less exclusivity to methyl-CpG content and the possibility that its binding preferences are now broadened to unmethylated sequences. 27 Distinct regulatory outcomes mediated by MeCP2 are also evident on unmethylated templates, and recent studies show, in its most simplest form, gene-activating epigenetic changes. 28 In this context, our observations of unremarkable MeCP2 binding preferences for genomic methylation are unsurprising. Recent findings demonstrate that chromatinization by MeCP2 mediates silencing of unmethylated genes. 29,30 The existence of distinct regulatory outcomes not exclusive to methyl-CpG content suggests a multifunctional role for MeCP2 with binding preferences that include histone modifications. A striking mechanistic commonality associated with MeCP2 cosuppression is the clear distinction of SLC6A2 gene silencing with histone H3K9m3 in cortical cells. 18 If correct and analogous with reduced NET protein in POTS patients, the intricate H3K9m3 and H3K27m3 marks contextualizes the promoter in the course of histone deacetylation and reduced H3K4m3 to recognize MeCP2 to assist in downstream silencing (Figure 5). The changes we observed in mRNA expression require further experimental validation, and future studies could examine protein levels in the leukocytes of POTS. It is unclear at present why the expression of MECP2 and histone-modifying enzymes would be altered in the leukocytes of POTS patients and what further changes in gene expression at the global level may be occurring. Although this study has focused on changes at the NET gene, it may be worthwhile in the future to analyze the POTS transcriptome in detail using genome-wide sequencing.

الشكل 5. Schematic representation of SLC6A2 gene expression in healthy individuals and postural tachycardia syndrome (POTS) patients. SLC6A2 gene activity is strongly associated with hyperacetylation (ac) of H3K9/14 and trimethylation of H3K4. These gene-activating histone modifications are inversely associated for the suppressive trimethylation (m3) mark on H3K9 and H3K27. Modification of SLC6A2 chromatin in POTS is associated with H3K9m3, H3K27m3, and histone deacetylation, as well as the recruitment of the methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2) corepressor to assist in transcriptional suppression.

Studies by our group and others have shown that gene-regulating events involve transcription factors, remodeling enzymes, and chromatin modifications. 18 Why the SLC6A2 gene in the leukocytes of POTS patients is suppressed is poorly understood. In noradrenergic cell types, the transcription factors Hand2 and Gata3 are regulated by cytokines and associated with SLC6A2 التعبير. 31 Hand2 interacts directly with the histone acetyltransferase p300 to alter chromatin structure. 31,32 We found reduced expression of p300 in POTS patients in this study. The dysregulation of transcriptional networks in POTS in relation to inflammation may be an important area for future research, given that POTS often develops after prolonged febrile illness. 3

لماذا SLC6A2 chromatin in the leukocytes of POTS patients is modified with gene-suppressive histone marks remains unknown. Also unclear at present is whether therapeutic targeting of the SLC6A2 gene, or of the faulty neuronal norepinephrine reuptake phenotype, may prove to be of clinical value in the future. At the level of indirect pharmacological modification of the faulty reuptake phenotype, drugs available in the clinical arena can reduce norepinephrine reuptake, most notably the tricyclic antidepressants, 20 but none have been demonstrated to augment reuptake. What relation impairment of norepinephrine reuptake in POTS patients has to their constellation of symptoms remains unknown, except perhaps for their tachycardia, which might be attributable to failure of clearance of norepinephrine from the cardiac sympathetic nerve synaptic spaces. For POTS patients, treatment in the foreseeable future will continue to involve exercise, 33 agents such as the mineralocorticoid and fludrocortisone, which provides some protection against syncope by increasing plasma volume, and β-adrenergic blockade, for relief of symptomatic tachycardia. 34 On the basis of the results presented here, however, in addition to our preclinical data 35 further research into the potential application of histone-modifying drugs may hold promise

مصادر التمويل

We acknowledge the grant and fellowship support from the National Health and Medical Research Council (NHMRC) . This work was supported, in part, by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program .


Allelic silencing is an important mechanism for coping with gene dosage changes in polyploid organisms that is well known in allopolyploid plants. Only recently, it was shown in the allotriploid fish Squalius alburnoides that this process also occurs in vertebrates. However, it is still unknown whether this silencing mechanism is common to other allopolyploid fish, and which mechanisms might be responsible for allelic silencing. We addressed these questions in a comparative study between Squalius alburnoides and another allopolyploid complex, the Amazon molly (Poecilia formosa). We examined the allelic expression patterns for three target genes in four somatic tissues of natural allo-anorthoploids and laboratory-produced tri-genomic hybrids of S. alburnoides و P. formosa. Also, for both complexes, we evaluated the correlation between total DNA methylation level and the ploidy status and genomic composition of the individuals. We found that allelic silencing also occurs in other allopolyploid organisms besides the single one that was previously known. We found and discuss disparities within and between the two considered complexes concerning the pattern of allele-specific expression and DNA methylation levels. Disparities might be due to intrinsic characteristics of each genome involved in the hybridization process. Our findings also support the idea that long-term evolutionary processes have an effect on the allele expression patterns and possibly also on DNA methylation levels.

In allopolyploid organisms, ancestral homologous alleles that diversified during evolution, designated ‘homoeologs’, are brought together again in one individual. Consequently, a successful allopolyploidization process requires the reconciliation of two or more sets of diverged genomes in the same nucleus (Feldman et al., 2012). Importantly, the regulatory interactions between genomes must be stabilized as the increased ploidy level and increased heterozygosity lead to gene redundancy, altered gene dosage and altered relationships within and between loci (Feldman et al., 2012 Yoo et al., 2013). These features make allopolyploid plants and animals exciting objects for understanding the molecular mechanisms of gene regulation in an evolutionary context.

However, studies of the different aspects of allopolyploidy are strongly biased towards plant models (Mable, 2003 Stöck and Lamatsch, 2013). A few years ago, data on the mechanisms underlying gene expression regulation and the dynamics of genome-specific expression in vertebrate allopolyploids were almost absent. Pala et al. (2008) reported for the first time a regulation mechanism of ‘functional diploidization’ involving gene-copy silencing in an allopolyploid vertebrate, the S. alburnoides مركب. Squalius alburnoides is a hybridogenetic fish that resulted from a cross of a Squalius pyrenaicus female (contributing the ص genome) with an Anaecypris-like male (contributing the أ genome) (Alves et al., 2001) (Fig. S1A). It emerged between 1.4 million years ago (MYA) (Cunha et al., 2004) and less than 0.7 MYA (Sousa-Santos et al., 2007). In present days the complex comprises several ploidy levels and genomic compositions distributed across the Iberian Peninsula (Alves et al., 2001 Collares-Pereira et al., 2013). Taking advantage of the hybrid status of S. alburnoides, genome-specific sequence differences were used to determine the contribution of each parental genome to the overall expression of loci individually analyzed in diploid and triploid hybrid individuals (Pala et al., 2008). Results showed that in most triploid S. alburnoides من paa genome composition, which is the most common form in Iberian southern river basins, for several loci and in different tissues the unpaired minority genome, the ص haplome, was not contributing to the overall expression, whereas it was contributing to expression in other tissues. Also, the observed allelic expression patterns were different between genes and between different tissues for the same gene. This indicated a most extreme case of homoeolog expression bias (Grover et al., 2012), namely, allele silencing (AS). Therefore, in S. alburnoides, the problem of keeping the balance of the expression regulatory networks in an uneven-numbered genomic context might have been solved by AS. These observations were in accordance with gene regulation phenomena already reported in polyploid plants, which showed patterns of differential expression according to organs (Adams et al., 2003) and non-additiveness of expression following gene copy rise (Auger et al., 2005 Wang et al., 2006).

However, it remained unclear whether the silencing mechanism reported for triploid S. alburnoides, which is very frequent among both natural and synthesized allopolyploid plants (Adams et al., 2003), was also a common mechanism in allopolyploid vertebrates. A further restriction for generalization is that the allotriploid S. alburnoides analyzed so far were all carriers of a duplicated genomic set from one parental species and an unpaired genomic set from another parental species: paa و ppa in southern populations, and cca و caa in northern populations, where S. pyrenaicus is absent and is replaced by Squalius carolitertii (contributing the ج genome) (Pala et al., 2008, 2010). This situation did not allow the exclusion of monoallelic expression in those cases where the minority genome was not expressed.


Electronic supplementary material

(أ)

Additional file 1: Figure S1: RRBS data quality. Total number of reads and uniquely aligned reads in each RRBS library. (ب) Mappability of each library, or fraction of uniquely aligned reads by BS-Seeker. (ج) Average coverage in cytosines. (د) Sequencing error rate in reads as the percentage of reads that do not match expected genotypes in libraries from B6 and DBA mice (Reads with error). (E,F) Genome-wide average methylation levels for each sample in (هـ) CG, (F) CHG and CHH contexts. (PDF 28 KB)

(أ)

Additional file 2: Figure S2: Strain specific differences. Differentially methylated cytosines in B6 and DBA male parents. The number of cytosines differentially methylated in each 100-kb bin is shown on the Y-axis and the genomic position of the bin is on the X-axis. All sites plotted are significant at 1% FDR, and the horizontal dashed line represents the significance threshold for each bin. (قبل الميلاد) Fraction of differentially methylated cytosines in each context in (ب) female and (ج) male B6 and DBA strains. (د) Overlap of differentially methylated cytosines identified in B6 and DBA female mice, or B6 and DBA male mice. (E,F) The distribution of the number of differentially methylated cytosines in (هـ) B6 and DBA females and (F) B6 and DBA males. The cumulative distribution function for the number of cytosines differentially methylated is shown for non-polymorphic bins, and polymorphic bins containing at least one SNP. (PDF 188 KB)

13059_2013_3267_MOESM3_ESM.pdf

Additional file 3: Figure S3: Cytosine methylation clusters by genotype of chromosomes. Hierarchical clustering of samples based on methylation levels from 38,427 cytosine sites. Individual B6 or DBA chromosomes in BXD mice were determined based on the genotype of polymorphic SNPs present in the read. (PDF 26 KB)

Additional file 4: Table S1: Genes differentially methylated by sex. (DOC 664 KB)

(A-I)

Additional file 5: Figure S4: Validation of sexual dimorphism by qPCR. Expression levels measured by qPCR on mouse liver cDNA for nine genes differentially methylated between females and males. Expression levels of each gene are plotted on the Y-axis relative to the house-keeping gene Rpl. Each bar represents the average of 10 female (F) and 6 male (M) mice. (PDF 36 KB)

Additional file 6: Table S2: Imprinted genes identified through AMRs. (DOC 111 KB)

(A-D)

Additional file 7: Figure S5: Validation of AMRs by traditional bisulfite sequencing. Traditional bisulfite sequencing for AMRs in (أ) Nsd1, (ب) Vps37b, (ج) Oprd1 و (د) Mapk15. Sequences in different bacterial clones are on the Y-axis and the genomic location of CpGs is on the X-axis. Open circles are unmethylated and filled circles are methylated CpGs. (PDF 79 KB)

(أ)

Additional file 8: Figure S6: Intergenerational methylation differences. Average number of epimutations between parent and F1s. The average of parent-F1 comparisons is shown for all, or specifically for comparisons between females, males, B6 or DBA chromosomes. (ب) Methylation levels across all samples in the gene Wdr63, showing variation in B6 chromosomes from different samples. BXD are F1 mice of B6 female and DBA male parents, DXB are F1 mice of DBA female of B6 male parents. The height of the bar represents percentage methylation from 0 to 100%. Gray represents missing data. (C,D) Reproducible epimutations across the genome identified in at least one (ج) or two (د) parent- F1 comparisons. The number of epimutations in each 100-kb bin is shown on the Y-axis and the genomic position of the bin is on the X-axis. The horizontal dashed line represents the significance threshold for each bin. (PDF 230 KB)


شاهد الفيديو: نسبة اليمن المركز الأول في فحص جينات dna للعرب نسبة العرب % اللون الاسود في الخريطة (كانون الثاني 2022).