معلومة

هل يجب علي استخدام السكروز لتحفيز محفز لاك؟


أرغب في تحسين التعبير عن الحرف F.أب شظية في الإشريكية القولونية. لتحريض لاك مروج على ناقل pAK400 أستخدم IPTG والسكروز. هل أقوم بتحسين التعبير في حالة إضافة IPTG فقط؟


يمكنك تحفيز أوبرون اللاكتوز عن طريق شيئين: اللاكتوز (أو بشكل أكثر دقة الأولاكتوز مستقلب منه) ونظائر اللاكتوز التي لا يتم استقلابها بواسطة البكتيريا.

يحفز اللاكتوز التعبير ويتم استقلابه بينما لا يكون IPTG هدفًا لـ $ beta $ -Galactosidase وسيمنحك تحفيزًا قويًا ودائمًا. لن يكون للسكروز أي تأثير على المروج.


T7 و DH5 alpha - ساعدني في مسح بعض الأشياء (فبراير / 04/2010)

مرحبًا & # 33
أقوم بإعداد أطروحة الماجستير الخاصة بي وأحاول توضيح بعض الأشياء حتى أفهمها تمامًا. أنا الآن أتحقق من نظام التعبير T7. إذا فهمت الأشياء بشكل صحيح ، فعادة ما يتم دمج بوليميريز T7 RNA في جينوم الكروموسومات تحت سيطرة مشغل lac يبدأ النسخ مع إضافة IPTG. بعد ذلك ، يجد البوليميراز المروج T7 على البلازميد ويبدأ في نسخ mRNA من هذا الموقع.

ومع ذلك ، قرأت في مكان ما أن السلالة البكتيرية ، DH5 alpha ، لا تحمل جين T7 RNA polymerase الخاص بها ، وأن هذا يجب أن يكون موجودًا على البلازميد ويجب أن يتم تحويله. هل هذا صحيح؟ أنا & # 39m أشك في أنه لا ، لأنني لا أستطيع أن أرى أن البلازميدات الخاصة بي (pTZ19R و pSE420) تحتوي على أي شيء من هذا القبيل. هل يمكنك مساعدتي في توضيح الأمور؟

ما تقرأه صحيح. يتم إجراء معظم تعبيرات T7 في سلالات من البكتيريا التي تم تحللها باستخدام العاثية DE3 ، والتي تحمل بوليميريز T7 RNA تحت سيطرة محفز lac. DH5a لا يملك هذا. عادة ما يشار إلى السلالات التي تحتوي على هذا التعديل باسمها ، مثل BL21 (DE3). السبب في أن DH5a لا يحمل هذا التعديل عادةً هو أنه ضعيف في التعبير عن البروتين ، لأنه لا يزال يحتوي على بروتياز lon ، الذي يميل إلى تحلل البروتينات المعبر عنها. يتم التخلص من سلالة BL21 من أجل هذا والبروتياز الأخرى.

يمكنك بالتأكيد حمل محفز lac وجين T7 بوليميريز RNA على البلازميد (إما نفس واحد أو واحد محوّل مشارك) في DH5a. قلة من الناس يفعلون ذلك ، لأنهم يهتمون بتعبير البروتين الناتج.

شكرًا لك على إجابتك & # 33 ، كنت أتمنى أن أخطأ في فهم الأمور حتى تكون أكثر منطقية على الرغم من ذلك .. لقد عدت إلى مصدري الأصلي ، وقاموا باستنساخ جيني في ناقل تعبير pTZ19R وتحويله إلى DH5a للتعبير. إذا كان DH5a عبارة عن سلالة ضعيفة في التعبير الجيني ، فلماذا يريد أي شخص القيام بذلك؟ وكيف يحدث التعبير إذا لم يكن هناك بوليميريز T7 RNA؟

لقد حاولت البحث في هذا الموضوع الآن ، لكن كل ما يفعله هو جعلني أكثر ارتباكًا. لقد وجدت هذا في بعض وثائق معلومات Invitrogen:
هام: DH5 & # 945 E. coli لا تتطلب IPTG للحث على التعبير من مروج lac حتى
على الرغم من السلالة تعبر عن القامع لاك. يتجاوز عدد نسخ معظم البلازميدات
رقم القامع في الخلايا. إذا كنت قلقًا بشأن الحصول على أقصى مستويات
التعبير ، أضف IPTG إلى تركيز نهائي قدره 1 مم.

لم يذكر مصدري الأصلي IPTG على الإطلاق ، وافترضت أن السبب هو أنهم لم & # 39t يريدون إعطاء جميع المعلومات حول إنتاج البروتين ، لكن ربما لا يستخدمونه فقط؟

لقد لاحظت أيضًا أنني أحصل على نتائج أوضح على SDS-PAGE الخاص بي أثناء استخدام طريقة تتضمن PMSF. رأي المشرفين الخاص بي هو أنه ليس هناك حاجة إليه ، لكن أعتقد أنه سيمنع البروتياز الوحيد ويكون له نوع من التأثير؟ من المحتمل أن أقوم ببعض الاختبارات الإضافية على ذلك ، فقط من أجل التسلية الشخصية ..

حسنًا ، أنا & # 39m أبتعد عن أسئلتي ، لكن الأسئلة الأولى هي الأهم. أين & # 39s البوليميراز؟

يحتوي بلازميد pTZ19R على كلا من محفز lac ومروج T7 قبل موقع الاستنساخ المتعدد الخاص به. في سلالة LacI ، سيعبر هذا من مروج lac ، وليس له علاقة بمروج T7. يوجد محفز T7 للسماح بالتعبير في سلالة BL21 (DE3). إذا كنت مهتمًا بالبروتين ، فسوف أقوم باستنساخه إلى BL21 (DE3) وأحثه باستخدام IPTG ، ثم (كما تفعل) تنقيته في وجود PMSF ، على الرغم من أن هذا أقل أهمية في سلالات BL21.


أنظمة التعبير T7 للإنتاج المحرض للبروتينات من الجينات المستنسخة في بكتريا قولونية

أنظمة التعبير المحرض T7 قادرة على إنتاج مجموعة واسعة من البروتينات في بكتريا قولونية. تشمل التحسينات على الممارسة الشائعة: (1) منع الحث غير المقصود من خلال إنشاء والحفاظ على سلالات التعبير في وسائط نمو غير محفزة تتكون بالكامل من مكونات نقية بدلاً من وسائط النمو المعقدة التي قد تحفز البروتينات المستهدفة بشكل متغير عند الاقتراب من التشبع و (2) التعبير عن العديد تستهدف البروتينات بالتوازي عن طريق الحث التلقائي المريح والمنتج في BL21 (DE3) والمضيفات المناسبة الأخرى ، بدلاً من تحريض IPTG. منذ الأيام الأولى ، منع التعبير القاعدي من تكوين سلالات محفزة لإنتاج البروتينات المجهدة للمضيف. تعمل نواقل pAL المطورة حديثًا الآن على تقليل التعبير الأساسي إلى مستويات يمكن فيها الحفاظ على تسلسل الترميز حتى للبروتينات الأكثر إرهاقًا وتحفيزها. يسمح الربط غير المتماثل بالاستنساخ البسيط والفعال لتسلسلات التشفير الفردية أو الاستنساخ المتزامن لاثنين أو ثلاثة من متواليات التشفير للتعبير المشترك من متجه pAL واحد. © 2018 بواسطة John Wiley & Sons، Inc.


نتائج

هندسة المكورات المتزامنة 2973 لإنتاج السكروز

لهندسة تصدير السكروز المكورات المتزامنة 2973 سلالة ، تصاريح السكروز CSCB تم استنساخ الجين في موقع محايد 3 (NS3) - بلازميد مستهدف 17 ، والذي تم إدخاله بعد ذلك في المكورات المتزامنة 2973 عن طريق الاقتران البكتيري (الشكل 1 ب). تم الحصول على سلالة منفصلة تمامًا عن طريق إعادة ترقيع الصفائح عدة مرات ، وتم تأكيد تعديل الجينوم المصحح عن طريق التنميط الجيني PCR (الشكل 1C). لاختبار إنتاج السكروز في المكورات المتزامنة 2973 ، هندستها 2973-CSCB سلالة (الجدول 1) نمت في BG11 مع 100-200 ملي كلوريد الصوديوم (الشكل 2 أ). تمت إضافة IPTG (1 مم) للحث CSCB التعبير الجيني. تم جمع المواد الطافية لتحليل السكروز. لوحظ أعلى عيار سكروز ، 8 جم لتر -1 في 5 أيام ، في BG11 مع 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. كانت أعلى إنتاجية حجمية 1.9 جم لتر -1 يوم -1 في 4 أيام ، وهو ما يتوافق مع محصول السكروز 3.1 جم / جرام من الكتلة الحيوية للخلية. هذه الإنتاجية أعلى مرتين من تلك الناتجة عن السلالة وثيقة الصلة المكورات المتزامنة 7942 (الشكل التكميلي S1). كان الرقم الهيدروجيني للوسط أقل في ظل ظروف إنتاج السكروز لأن البروتونات يتم تصديرها مع السكروز بواسطة CscB السكروز / H + symporter (الجدول التكميلي S1). بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا أن الإجهاد الملح أدى إلى ضعف نمو المكورات المتزامنة 2973 (الشكل 2 ب) ، مما أدى إلى انخفاض OD730 القيم مع زيادة تركيزات كلوريد الصوديوم.

إنتاج السكروز في CSCB-تعبير المكورات المتزامنة 2973. (أ) دورة زمنية لإنتاج السكروز في CSCB- التعبير عن الإجهاد في وسط BG11 بتركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم. (ب) التطوير التنظيمي730 التابع CSCBسلالة التعبير. (ج) تقسيم الكربون بين السكروز والكتلة الحيوية للخلية (BG11 مع 150 ملي كلوريد الصوديوم). (د) إنتاج السكروز في ظروف استزراع مختلفة مع 150 ملي مول كلوريد الصوديوم (5 أيام). ال WT المكورات المتزامنة تم تضمين 2973 كعنصر تحكم. تمثل البيانات متوسط ​​± sd من ثلاث مكررات بيولوجية. ND ، لم يتم الكشف عنها.

لاستكشاف مقدار الكربون الثابت الضوئي الذي يتم توجيهه إلى إنتاج السكروز في ظل ظروف إجهاد الملح ، قمنا بتحليل تجزئة الكربون بين السكروز والكتلة الحيوية للخلية (الشكل 2 ج). خلال الـ 24 ساعة الأولى من النمو ، تم استخدام 71 ٪ من الكربون الثابت (0.8 جم لتر -1) لتخليق الكتلة الحيوية للخلية ، وتم إنتاج 0.3 جم فقط من السكروز في هذه الفترة. من اليوم الأول إلى اليوم الرابع ، زاد عيار السكروز بشكل كبير. خلال كل يوم من هذه الأيام ، كانت إنتاجية السكروز أكبر من 2 جم لتر -1 يوم -1. تم إنتاج أعلى كمية من السكروز بين اليوم 3-4 ، حيث بلغت إنتاجية السكروز 2.8 جم لتر -1. بعد اليوم الثالث ، تم توجيه أكثر من 88٪ من الكربون الثابت إلى السكروز. انخفض العيار خلال اليوم 4-5 ، حيث تم إنتاج 0.7 جم لتر -1 سكروز فقط.

علاوة على ذلك ، قمنا باختبار قدرة إنتاج السكروز دون إضافة IPTG أو كاناميسين المضاد الحيوي. بدون الحث IPTG ، 2973-CSCB أنتجت السلالة 6.4 جم لتر -1 سكروز (الشكل 2 د) ، وهو أقل بنسبة 21٪ من ذلك في الظروف التي يسببها IPTG (الشكل 2 أ). أفادت دراسة حديثة أن المروجين المحرضين IPTG (trc, لاك، و LlacO-1) تتسرب منها المكورات المتزامنة 2973 18. تشير بياناتنا أيضًا إلى أن ملف لاك المروج يتسرب فيه المكورات المتزامنة 2973. وبالمثل ، فإن 2973-CSCB أنتجت السلالة 6.6 جم لتر -1 سكروز بدون إضافة كاناميسين (الشكل 2 د). على الرغم من أن CSCB تم إدخال الجين في الجينوم ، وأظهرت هذه النتيجة أن الكاناميسين مطلوب للحفاظ على إنتاجية عالية من السكروز في المكورات المتزامنة 2973.

التحقيق في التمثيل الغذائي للكربوهيدرات في إنتاج السكروز المكورات المتزامنة 2973

بعد مرحلة النمو الأسي ، المكورات المتزامنة 2973 تتراكم كمية كبيرة من الجليكوجين للاحتفاظ بالكربون الثابت الزائد 16. لفهم تخصيص الكربون بين الجليكوجين والسكروز بشكل أكبر ، قمنا بتحليل محتوى الجليكوجين في إنتاج السكروز. المكورات المتزامنة سلالة 2973. 2973-CSCB نمت الخلايا في BG11 مع أو بدون 150 ملي كلوريد الصوديوم ، وتم تحليل كميات الجليكوجين والسكروز. كانت الكتلة الحيوية للخلية أعلى مرتين في وسط BG11 دون إضافة كلوريد الصوديوم (الشكل 3 أ). في غياب كلوريد الصوديوم ، المكورات المتزامنة 2973 أنتج فقط 0.4 جرام لتر -1 من السكروز في 5 أيام ، وهو أقل بـ 19 ضعفًا من ذلك في وجود الملح (الشكل 3 ب). في المقابل ، انخفض محتوى الجليكوجين بشكل ملحوظ في ظل ظروف إنتاج السكروز. بحضور 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2973-CSCB سلالة الجليكوجين المتراكمة أقل من 1 ٪ من الوزن الجاف للخلايا (DW) خلال اليوم الأول واليوم 3 (الشكل 3 ج). في اليوم الخامس ، زاد محتوى الجليكوجين إلى 10٪ من الوزن الجاف ، وهو ما يقابل 0.2 جم لتر -1 من الجليكوجين (40 ضعفًا أقل من السكروز). بدون إضافة كلوريد الصوديوم ، تراكمت الخلايا الجليكوجين لأكثر من 40٪ من الوزن الجاف بعد 3 أيام (الشكل 3 ج). أكدت هذه الملاحظات أيضًا أن الإجهاد الملحي أعاد توجيه تدفقات الكربون من تراكم الجليكوجين إلى إنتاج السكروز في هذه السلالة المصممة هندسيًا.

تحليل التمثيل الغذائي للكربوهيدرات في المكورات المتزامنة 2973 CSCBسلالة التعبير. نمت الخلايا في وسط BG11 مع أو بدون إضافة 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. (أ) تراكم الكتلة الحيوية. (ب) إنتاج السكروز. (ج) محتوى الجليكوجين. (د) RT-PCR شبه الكمي لرصد التعبير الجيني في توليفات الجليكوجين والسكروز. جين التدبير المنزلي rpoA تم استخدامه كعنصر تحكم. تمثل الأرقام الموجودة أسفل الجل شدة النطاق النسبي من العينات التي تنمو مع 150 ملي كلوريد الصوديوم مقابل 0 ملي مول كلوريد الصوديوم. يتم عرض المواد الهلامية كاملة الطول في الشكل التكميلي S2. تمثل البيانات في اللوحات من A إلى C متوسط ​​± sd من ثلاث مكررات بيولوجية. DW ، الوزن الجاف للخلية rpoA، RNA polymerase subunit α.

أجرينا بعد ذلك اختبار RT-PCR شبه كمي لفحص نسخ الجينات المشاركة في التخليق الحيوي للجليكوجين والسكروز ، بما في ذلك جى ال جى سى, غلغا، و sps (الشكل 1 أ). GlgC (ADP- بيروفوسفوريلاز الجلوكوز) و GlgA (غليكوجين سينثيز) هما الإنزيمات المسؤولة عن التخليق الحيوي للجليكوجين. في Synechococcus elongatus، يحتوي إنزيم SPS على أنشطة سينثيز السكروز والفوسفات وأنشطة فوسفاتاز الفوسفات والسكروز 19. لذلك ، التعبير عن sps تم رصد الجين. جين التدبير المنزلي rpoA (ترميز الوحدة الفرعية لـ RNA polymerase α) كعنصر تحكم لتجربة RT-PCR 20. مستويات نص جي إل جي سي و غلغا لم تكن مختلفة بشكل كبير مع أو بدون إضافة كلوريد الصوديوم (الشكل ثلاثي الأبعاد). في المقابل ، فإن جين تخليق السكروز sps تم التعبير عنها بدرجة عالية في حالة الإجهاد الملحي (الشكل ثلاثي الأبعاد) ، مما يشير إلى أن زيادة إنتاج السكروز في وسط الملح يرجع إلى تنظيم مسار التخليق الحيوي للسكروز.

هندسة مسار التخليق الحيوي للسكروز

في البكتيريا الزرقاء ، يلزم إجهاد الملح للحث على إنتاج السكروز. جين التخليق الحيوي للسكروز sps يتم تنظيمه في وسط الملح BG11 (الشكل ثلاثي الأبعاد). لتوسيع تطبيقات إنتاج السكروز في البكتيريا الزرقاء ، صممنا المكورات المتزامنة 2973 لإنتاج السكروز في وسط BG11 بدون إضافة كلوريد الصوديوم. مسار التخليق الحيوي للسكروز من متزامن ص. تم التعبير عن PCC 6803 في 2973-CSCB سلالة (الشكل 4 أ). من المعروف أن الإفراط في التعبير عن sps و النيابة الجينات من متزامن 6803 يؤدي إلى تحسن مضاعف في إنتاج السكروز داخل الخلايا تحت ظروف إجهاد الملح 14. للتعبير عن متزامن 6803 sps و النيابة الجينات في المكورات المتزامنة 2973 ، قمنا باستنساخها في البلازميد 21 RSF1010 ذاتي التكرار تحت سيطرة IPTG-inducible trc1O المروجين. معربا عن البلازميدات sps وحده أو sps-النيابة ثم تم إدخال الجينات في 2973-CSCB سلالة (الجدول 1). على حد سواء sps و sps-النيابة كانت سلالات الإفراط في التعبير قادرة على إنتاج السكروز في وسط BG11 بدون كلوريد الصوديوم الإضافي (الشكل 4 ب). في حالة عدم وجود IPTG ، فإن sps و sps-النيابة أنتجت السلالات 1.6 جم لتر -1 و 3.4 جم لتر -1 من السكروز في 3 أيام ، على التوالي ، والتي كانت 11 ضعفًا و 23 ضعفًا أعلى من المجموعة الضابطة 2973-CSCB سلالة (الشكل 4 ب). بالنسبة إلى sps السلالة ، لم يكن لعيار السكروز فرق كبير مع أو بدون إضافة 1 ملي مولار IPTG. ومن المثير للاهتمام ، أن عيار السكروز انخفض بشكل ملحوظ عند إضافة 1 ملي مولار IPTG في sps-النيابة سلالة (الشكل 4 ب) ، مشيرا إلى أن الحث الكامل sps و النيابة قد يكون التعبير ضارًا بإنتاج السكروز.

هندسة مسار التخليق الحيوي للسكروز في المكورات المتزامنة 2973. (أ) مخططات للتعبير عن متزامن 6803 sps و النيابة الجينات في 2973-CSCB أضنى. (ب) إنتاج السكروز في sps و sps-النيابة سلالات التعبير. تمت زراعة الخلايا في وسط BG11 لمدة 3 أيام بدون إضافة كلوريد الصوديوم. يشير الرمز "+" إلى أن السلالة تحتوي على الإنزيم (الإنزيمات) المفرط التعبير المحدد. تمثل البيانات متوسط ​​± sd لثلاث مكررات بيولوجية. RBS ، موقع ربط الريبوسوم.


تحرض الوحدة الفرعية σ 70 من بوليميراز الحمض النووي الريبي لاكالمروج UV5 - الإيقاف القريب للنسخ

الوحدة الفرعية σ 70 من الإشريكية القولونية بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNAP) هو عامل بدء النسخ الذي يمكن أن يرتبط أيضًا بـ RNAP أثناء الاستطالة. نحن نقدم دليلًا كيميائيًا حيويًا على أن σ 70 يؤدي إلى توقف النسخ مؤقتًا عند لاكمحفز UV5 بعد أن قام RNAP بتجميع نسخة 17 نيوكليوتيد. يتطلب التوقف المؤقت σ 70 المعتمد تفاعلًا بين σ 70 وجزءًا من لاك تسلسل مشغل القامع يشبه المروج − 10 إجماع. يؤدي الهيبارين متعدد السكاريد إلى إطلاق 70 من المجمعات المتوقفة مؤقتًا ، مما يدعم الرأي القائل بأنه أثناء الانتقال من البدء إلى الاستطالة ، تضعف التفاعلات بين σ 70 و RNAP الأساسي. نقترح أن يتم تثبيت ارتباط 70 والاحتفاظ به في مجمعات الاستطالة من خلال قدرته على تكوين اتصالات مع DNA لفقاعة النسخ. بالإضافة إلى ذلك ، نقترح أن الوحدة الفرعية σ 70 في مجمع الاستطالة قد توفر هدفًا لتنظيم التعبير الجيني.


الخلايا الجنينية

كلاوس آي ماتاي ، في كتيب الخلايا الجذعية ، 2004

أوبيرون لاك البكتيرية

ال لاك أوبرون في البكتيريا الإشريكية القولونية من خلال آلية قمع يرتبط فيها بروتين مثبط (lacI) بالمواقع التنظيمية (لاكو) في المروج وإيقاف النسخ (الشكل 59-2). عند إضافة اللاكتوز ، يخضع بروتين lacI لتغيير توافقي ، مما يغير ألفة ارتباطه بـ لاكو التسلسلات. وبالتالي يأتي بروتين lacI من لاكو المواقع ، ويمكن أن يحدث النسخ. بكتريا قولونية يستخدم هذا النظام للتحكم بإحكام في الجينات المطلوبة لاستخدام اللاكتوز ، وهو قابل للعكس تمامًا.

الشكل 59-2. أوبرون بكتيري. ال لاك وظائف الاوبرون بواسطة آلية قمع. (أ) يرتبط بروتين مثبط ، lacI ، بالمواقع التنظيمية لاكو في المروج (P) وإيقاف نسخ الجينات اللازمة لاستقلاب اللاكتوز. (ب) عند إضافة اللاكتوز ، يخضع بروتين lacI لتغيير توافقي ، مما يغير ألفة ارتباطه بـ لاكو التسلسلات. وبالتالي يأتي بروتين lacI من لاكو المواقع ونسخ ملفات لاك يمكن أن تحدث الجينات. (A ، ترانس أسيتيلز Y ، بيرميز و Z ، β-galactosidase.)


المواد والأساليب

Xenopus التلاعب بالجنين

Xenopus Tropicalis تم الحصول على الأجنة عن طريق الإخصاب في المختبر ، وتم فكها في 3٪ سيستين وجمعها في المراحل المرغوبة. تم حقن البويضات المخصبة بـ 500 نانوجرام من الرنا المرسال الاصطناعي في مرحلة الخلية الواحدة وتم تربيتها حتى وصلت الأجنة الضابطة إلى المرحلة 8. تم زرع أغطية الحيوانات في المرحلة 8 وتم تربيتها حتى المرحلة 10.5 في 0.1 × MMR. تم توفير تراخيص استخدام الحيوانات من خلال تصاريح DEC RU-DEC 2012-116 و 2014-122 وموافقة CCD AVD1030020171826.

المرحلة والأنسجة المحددة ATAC-seq

بعد إزالة تعدد الإرسال ، تم قطع القراءات باستخدام fastp v0.20.1 (Chen وآخرون، 2018) ومتماشية مع العاشر الاستوائية جينوم (xt9.0 و xt10.0) مع bwa-mem v0.7.17 باستخدام الإعدادات الافتراضية. تم استبعاد قراءات تعيين الحمض النووي للميتوكوندريا من التحليل مع قراءات منخفضة الجودة بما في ذلك التكرارات والتكرارات (MAPQ & lt 10). تمت إزاحة جميع القراءات المعينة بمقدار + 4 نقطة أساس للضفيرة + و - 5 نقطة أساس للضفيرة. تم استدعاء القمم لكل عينة باستخدام MACS2 v2.2.7 (Zhang وآخرون، 2008) مع المعلمات "-q 0.05 - نموذج ، إزاحة −100 - حجم 200 ، keep-dup 1".

الخلية الواحدة ATAC-seq

تم عزل النوى بطريقة مقتبسة من ماريانو (ماريانو ، 1964). باختصار 100 Xenopus تم تعليق الأجنة في المخزن المؤقت E1 المثلج 300 ميكرولتر (110 ملي مولار بوكل ، 50 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك pH 7.4 ، 5 ملي مولار MgCl2، 0.1 مم يدتا ، 2 مم DTT) تحتوي على 0.25 م سكروز. للعينة ، تمت إضافة 2.4 مل من المخزن المؤقت E1 المثلج مع 2.2 مولار من السكروز وخلطها برفق. تم بعد ذلك وضع تعليق الجنين على وسادة 150 ميكرولتر من السكروز المثلج 2.2 متر مكعب في أنبوب متعدد الألومر SW60 بيكمان. تم تكوير النوى بواسطة الطرد المركزي عند 130.000 ز عند 4 درجات مئوية. تم إعادة تعليق الحبيبات بعناية في محلول نووي سعة 250 ميكرولتر (25٪ جلسرين ، 25 ملي مولار تريس- حمض الهيدروكلوريك pH 7.4 ، 70 ملي مول كلوريد ، 5 ملي مول كلوريد2، 0.2 ملي مولار EDTA ، 2 ملي مولار DTT) ، وتم غسل النوى مرتين عن طريق تدويرها خلال وسادة جلسرين 20 ميكرولتر 80٪. بعد الغسل الأخير ، تم تعليق النوى في 200 ميكرولتر 1 × محلول نوى (10 × علم الجينوم). تم إنشاء المكتبات باستخدام Chromium Single Cell ATAC (v1.1 Chemistry 10 × Genomics). تم إجراء الاتصال الأساسي وإزالة تعدد الإرسال ورسم الخرائط باستخدام cellranger-atac (v1.2.0 ، 10 × Genomics). تم تعيين القراءات إلى العاشر الاستوائية جينوم (xt10.0) ، تم تنزيله من Xenbase (http://www.xenbase.org/ ، RRID: SCR_003280 كريمي وآخرون، 2018). يتم عرض إحصاءات التسلسل ورسم الخرائط في Dataset EV7. تم استبعاد الرموز الشريطية ذات التغطية المنخفضة للتسلسل (الخلايا التي تحتوي على & lt 1000 جزء نقل) ، أو التخصيب المنخفض (تخصيب TSS & lt 4.5) ، أو تغطية الكروموسوم شديدة التغير (أجزاء فريدة لكل ميجا بايت في الثانية ، محسوبة لكل معامل كروموسوم للتباين في تغطية الكروموسوم & gt 1) من المصب التحليلات.

الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ومجموع إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي وتسلسلها

تم فصل إإكسبلانتس الجنين المتشريح إلى خلايا مفردة باستخدام وسائط خالية من الكالسيوم 2+ و Mg 2+ (Sive وآخرون، 2007). تم اختيار 200 خلية لأداء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية باستخدام النسخة المعدلة من بروتوكول STRT-seq (الإسلام وآخرون، 2012 دونغ وآخرون، 2018) تم إضافة ERCC spike-in RNA (Thermo Fisher Scientific ، 4456740) إلى المخزن المؤقت للتحلل. بعد تفاعل النسخ العكسي ، أجرينا 4 + 16 دورة من تضخيم PCR لتوليف (كدنا). تمت تنقية (كدنا) المضخم باستخدام مجموعة تنقية Zymo وحبات Agencourt AMPure XP ، على التوالي ، وتم قياس تركيزه باستخدام مقياس التألق Qubit® 2.0 (Q32866 ، تقنيات الحياة). تم تقييم جودة (كدنا) المضخم وتوزيع حجم جزء الحمض النووي بواسطة Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) باستخدام مجموعة DNA عالية الحساسية (5067-4626 ، Agilent). تم إعداد مكتبات التسلسل باستخدام KAPA Hyper Pre-Kit (KR0961 - v6.17 ، Kapa Biosystems). تم قياس تركيزات الأجزاء مع المحولات المفهرسة التقريبية عن طريق القياس الكمي لمكتبة KAPA. تم تسلسل المكتبات في منصة Illumina وتم تعيين البيانات باستخدام Bowtie (الإصدار: 1.2.2 Langmead & Salzberg ، 2012) إلى الملفات المفهرسة لجينوم xt9 (راجع Dataset EV7).

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أغطية الحيوانات باستخدام بروتوكول Trizol-Zymo Hybrid المعدّل داخليًا. تم قياس تركيزات جميع عينات الحمض النووي الريبي باستخدام مقايسة DeNovix dsDNA عالية الحساسية (رقم الكتالوج: KIT-DSDNA-HIGH-1). تم إنشاء (كدنا) باستخدام KAPA RNA HyperPrep مع RiboErase (رقم الكتالوج: 08278555702 ، Kapa Biosystems). قمنا بفحص جودة العينات بواسطة RT – qPCR باستخدام بادئات تغطي مناطق ترميز الجينات المرشحة والتدبير المنزلي.

تحليل بيانات ATAC-seq

تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية

تمت تصفية مجموعة البيانات والتحقق من جودتها للخلايا والجينات باستخدام الحزمة Scater (مكارثي وآخرون، 2017). تم تحميل مجموعة البيانات التي تمت تصفيتها بشكل أكبر في حزمة R Seurat (Satija وآخرون، 2015). تم استخدام الجينات شديدة التغير لتحليل المكونات الرئيسية ، والتي تم من خلالها استخدام أجهزة الكمبيوتر ذات الأهمية الإحصائية لإسقاط UMAP (تقليل الأبعاد). حددنا سبع مجموعات متميزة من الخلايا باستخدام وظيفة FindClusters في Seurat. بناءً على المجموعات المتوقعة ، تم أخذ جينات العلامة ذات الصلة بكل مجموعة لمزيد من التحليل مع مجموعات البيانات الأخرى. معالجة وتصور بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية للجنين بالكامل (Briggs وآخرون، 2018) باستخدام scanpy (Wolf، Angerer & Theis، 2018). تم وضع مجموعات أحادية الخلية من المرحلة 10 و AC و DMZ في بيانات الجنين بأكملها بناءً على ارتباطات سبيرمان بين مجموعات كلتا مجموعتي البيانات ، بناءً على تعبير متوسط ​​الكتلة للجينات شديدة التغير المشتركة لمجموعتي البيانات.

تكامل ATAC-seq وحيدة الخلية RNA-seq

ارتبطت الجينات عالية المتغير (HVGs) من تحليل scRNA-seq بأقرب قمم AC-DMZ ATAC-seq باستخدام تحليل GREAT (الشكل 5 ب و ج). يتكون نموذج الذروة إلى الجين هذا من مصفوفة ، مع صفوف كمواقع ذروة وأعمدة كقيم تعبير للجينات المستهدفة عبر المجموعات السبع. تم استخدام هذا كمدخل لتوقع الحافز باستخدام وظيفة gimme maelstrom لـ GimmeMotifs (نسخة أولية: Bruse & Heeringen ، 2018). تم بعد ذلك فحص عوامل النسخ المرتبطة بالزخارف المتوقعة بناءً على ارتباطها بين نشاط الحافز وتعبيرها الجيني عبر المجموعات.

  • تسلسل ATAC المجمع: رقم الانضمام إلى GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi؟acc=GSE145619).
  • تسلسل ATAC أحادي الخلية: رقم دخول GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi؟acc=GSE145619).
  • تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية: رقم الانضمام إلى GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi؟acc=GSE145619).
  • تسلسل الحمض النووي الريبي بالجملة: رقم الانضمام إلى GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi؟acc=GSE145619).

هل يجب علي استخدام السكروز لتحفيز محفز لاك؟ - مادة الاحياء

أ) في ظل وجود تركيزات عالية من التربتوفان ، يتم تصنيع نسخة قصيرة فقط من أوبرون trp بسبب توهين النسخ 5 'للجينات الهيكلية. يتم التوسط في ذلك من خلال التعرف على اثنين من أكواد Trp في التسلسل الرئيسي. إذا تم تحوير هذه الكودونات لتكون طفرات هراء كهرمانية UAG ، فما تأثير ذلك على تنظيم الأوبون في وجود أو عدم وجود التربتوفان؟ يشرح

تذكر ، بخلاف عامل التشغيل الخاص به ، يتم التحكم في عامل التشغيل t rp عن طريق القمع والتوهين.

إذا كان هناك الكثير من trp ، فسيتم قمع الأوبون.

سيتم الكشف عن تأثير الطفرات غير المنطقية تحت مستويات trp المتوسطة حيث يقوم المخفف عادة بتعديل كفاءة إنهاء النسخ. عادةً عند تركيزات trp المتوسطة تنتهي بعض النصوص وبعضها يتابع عبر الأوبون ، اعتمادًا على مدى سرعة ترجمة أكواد trp في القائد. سيؤدي تغييرها لإيقاف الكودونات إلى توقف الريبوسومات هناك ، مما يؤدي بشكل فعال إلى محاكاة الجوع الشديد في trp مما يؤدي إلى أقصى قدر من التعبير عن الأوبرا.

سيتم التعبير عن أوبرا trp عند المستويات القصوى في حالة عدم وجود التربتوفان ، نظرًا لأن مثبط trp سيكون غير مقيد وستسمح منطقة القائد المتحور بالتعبير الكامل.

ب) تم تحديد جين اندماج lacI-lacZ الذي ينتج بروتين خيمري مع كل من وظيفة الكابح و & szlig-gal. ما هو النمط الظاهري (أنواع) Lac التي تتوقعها لسلالة تحمل هذا الجين الاندماجي.

يجب أن يعبر المتحول عن نشاط lacZ بشكل أساسي ولكن عند مستويات منخفضة جدًا نظرًا لأن التعبير عن بروتين الاندماج سيكون مدفوعًا من محفز lacI.

سيكون هذا من الناحية الظاهرية لاك - لأن التعبير منخفض المستوى لن يسمح بالنمو على اللاكتوز. تذكر أنه لا توجد طريقة للحث على تخليق بروتين الاندماج أو جين lacY لأنه تم حذف منطقة مشغل lac المروج.

ج) عندما يتم تزاوج سلالة Hfr تحمل نفاذة لامدا مع متلقي غير ليسوجينيك ، يتم تحفيز النبضة على النمو حلليًا بعد وقت قصير من النقل إلى المتلقي. ماذا يشير هذا حول الآلية التي يتم من خلالها الحفاظ على نشرة لامدا في الكروموسوم البكتيري؟

هذا مشابه تمامًا لتجربة PaJaMo ويشير إلى أن lysogeny يتم التحكم فيه عن طريق القمع.

د) عندما يتم عبور ذكر من سلالة P من ذبابة الفاكهة إلى أنثى من النوع M ، تكون النسل عقيمة عادة. إذا تم نقل ذكر من النوع M أو P إلى أنثى من النوع P ، فإن السلالة تكون خصبة.

& # 9i) ماذا يعني ذلك بخصوص الآلية التي يتم من خلالها التحكم في نقل عنصر P؟

هذا مشابه تمامًا للحالة مع lambda أعلاه و PaJaMo expt. تقوم بإحضار عناصر P إلى النمط الخلوي M وتحصل على التحويل. في الاتجاه المعاكس أو P إلى P لا يحدث شيء. السيطرة سلبية.

& # 9ii) لماذا سلالة P X & trade M قابلة للحياة ولكنها معقمة؟

لأن التحويل يقتصر على الخط الجرثومي. تحدث تعبئة العناصر P فقط في الغدد التناسلية للذرية. وبالتالي فإن النسل طبيعي جسديًا ولكن بسبب التعبئة الهائلة لعناصر P في غدد التناسلية الخاصة بهم تكون عقيمة.

س) ابتكر مساعد تدريس ما قبل الطب تجربة لإثبات مفهوم الطفرات المهيمنة على رابطة الدول المستقلة لفئة المختبر. كان لدى TA الفصل لإنشاء نسختين مؤتلفتين في ناقل البلازميد متعدد النسخ pBR322. حمل البلازميد الأول منطقة مشغل lac من النوع البري والجينات الهيكلية Z - و Y - المتحولة. حمل البلازميد الثاني منطقة المشغل من النوع البري وجينات Z + و Y +. تم إدخال البلازميدات في سلالات الإشريكية القولونية من الأنماط الجينية I + o c Z + Y + و I + o c Z - Y - وتم فحصها لنشاط lacZ عن طريق الطلاء على ألواح X-gal بالنتائج التالية:

النمط الظاهري للمستعمرة على لوحات X-gal

I + o + Z + Y + سلالة التحكم

I + o c Z + Y + سلالة التحكم

pBR322 o + Z - Y - / I + o c Z + Y +

pBR322 o + Z + Y + / I + o c Z - Y -

أ) لماذا كانت النتائج مفاجئة ل TA؟

توقعت TA أن يكون الضغط في الصف السفلي من الجدول محرضًا وليس تكوينيًا. الآثار المترتبة على النتائج الواردة في الجدول هي أن طفرة oc هي سائدة وليست مسيطر عليها من قبل رابطة الدول المستقلة.

ب) ما الخطأ الذي حدث؟ قدم تفسيرًا للنتائج التي تبدو غير طبيعية.

ترجع المشكلة إلى البلازميد متعدد النسخ. أراد TA تقليد الحالة ثنائية الصبغة ولكن بدلاً من استخدام نسخة واحدة F '، استخدم النسخ المتعدد pBR322. هذا يعني أن تسلسل المشغل كان موجودًا في نسخ متعددة وعاير الكمية المحدودة من القامع (

10 جزيئات) موجودة في سلالة من النوع البري. وبالتالي ، فإن معظم البلازميدات عبرت عن جينات lacZ و Y في الصف السفلي مما يعطي مظهرًا أن o c يعمل في trans.

ج) اقترح تجربة لاختبار إجابتك على الجزء ب).

إذا كان هذا صحيحًا ، يجب أن يكون المرء قادرًا على محاكاة الموقف عن طريق استنساخ عامل من النوع البري فقط (بدون جينات Z + أو Y +) على البلازميد وإدخال هذا في سلالة من النوع البري. قد يتوقع المرء تعبير lac التأسيسي لأن عامل البلازميد سوف يعاير المكبِط.

الاختبار الثاني هو تضمين الجين المكبّر على البلازميد متعدد النسخ. في هذه الحالة ، يجب عمل مثبط كافٍ لقمع جميع مشغلي o + ويمكن للمرء أن يرى التأثير المهيمن لطفرة oc.

الاختبار الثالث هو استخدام نسخة واحدة من البلازميد. هناك سيكون الوضع كما هو الحال مع F 'وستكون شخصية التمثيل cis لأليل o c واضحة.

س) توضح الرسوم البيانية الثلاثة التالية نمو الإشريكية القولونية وإنتاج & szlig-galactosidase (منتج lacZ) عند نموه في وسط مع كل من الجلوكوز واللاكتوز كمصادر للكربون.

س) توضح الرسوم البيانية الثلاثة التالية نمو الإشريكية القولونية وإنتاج & szlig-galactosidase (منتج lacZ) عند نموه في وسط مع كل من الجلوكوز واللاكتوز كمصادر للكربون.

(أ) اشرح أهمية الرسم البياني الأيسر.

يوضح الرسم البياني عملية النمو diauxic. تستخدم الخلايا أفضل مصدر للكربون (الجلوكوز) أولاً وتستخدم اللاكتوز فقط عند استنفاد الجلوكوز. تظل جينات اللاكتوز مكبوتة أثناء وجود الجلوكوز على الرغم من وجود المحفز (اللاكتوز) ، ولا يتم تصنيعه إلا عند استهلاك الجلوكوز.

(ب) هل النتائج الموضحة في الرسوم البيانية الوسطى واليمنى تتفق مع فكرة أن الجلوكوز اللاكتوز ديوكسي (قمع الهدم) يتم تنظيمه مباشرة عن طريق تركيز cAMP الخلوي؟ اشرح لماذا ولماذا لا.

لا ، البيانات غير متوافقة مع الفكرة. يشير الرسم البياني المركزي إلى أن B-gal يتم تصنيعه بمعدل مرتفع في وجود الجلوكوز إذا لم يكن هناك بروتين مثبط. يشير هذا إلى أن مركب CRP-cAMP يجب أن يرتبط بمحفز lac operon حتى في وجود الجلوكوز. وفقًا لنموذج تركيز cAMP ، يجب أن تكون مستويات cAMP منخفضة في الجلوكوز ، وبالتالي يجب إيقاف تشغيل lac operon بشكل أساسي حتى في حالة عدم وجود مثبط. تشير البيانات الموجودة في الرسم البياني الأيمن بشكل أساسي إلى نفس الشيء. عندما يضاف المحرض IPTG في وجود الجلوكوز ، يتم إحداث أوبرون اللاكتوز على الفور. يشير هذا أيضًا إلى أنه يجب ربط CRP-cAMP بمحفز lac في وجود الجلوكوز.

6) يصيب فيروس نقص المناعة البشرية الخلايا البشرية من خلال عملية تنطوي على تفاعل فيزيائي بين البروتين السكري للمغلف الفيروسي gp120 وبروتين CD4 الموجود على سطح العديد من خلايا الجهاز المناعي. لكي يدخل فيروس نقص المناعة البشرية إلى الخلايا ، يُعتقد أن gp120 يجب أن يتفاعل أيضًا مع منتج الجين ccr-5 (المعروف أيضًا باسم ckr-5). والاحتمال البديل هو أن بروتين القفيصة الفيروسية يتفاعل مع CCR-5 بعد اندماج غشاء الخلية والمغلفات الفيروسية ، وأن هذا التفاعل يسمح للقفيصة الفيروسية بدخول السيتوبلازم.

أ) اقترح اختبارًا جينيًا يميز ما إذا كان gp120 أو بروتين القفيصة الذي يتصل جسديًا بـ CCR-5. حدد التجارب ، بما في ذلك أي عناصر تحكم تعتقد أنها ستكون مفيدة ، وحدد النتائج المتوقعة إذا كانت الفرضية الأولى صحيحة.

استخدم النظام ثنائي الهجين. قم بدمج CCR-5 و CD4 في مجال ربط DNA lexA و gp120 وبروتين القفيصة في مجال تنشيط نسخ GAL4. قم ببناء بناء مراسل يضع lacZ تحت سيطرة محفز الخميرة القاعدي ومواقع مشغل lexA. اختبر بروتينات الاندماج المختلفة من خلال النظر إلى تعبير lacZ. تشير المستويات العالية من نشاط & szlig-gal إلى وجود تفاعل إيجابي بين البروتين المنصهر في مجال ربط الحمض النووي والذي يندمج في مجال التنشيط.


أنواع المروجين المحرضين

Chemical agents, temperature, and light are all examples of factors that can lead to the induction of a promoter. Below, you’ll find a short description of these three types of inducible promoters, and examples of each type. Many of these promoter systems are available at Addgene!

Chemically inducible promoters

Chemically regulated promoters are among the most common inducible promoters. The positive inducible tetracycline ON (Tet-On) system, a versatile tool developed for use in prokaryotes and eukaryotes, works via direct activation. In this system, the activator rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) is normally inactive and cannot bind the tetracycline response elements (TRE) in a promoter. Tetracycline and its derivatives serve as inducing agents to allow promoter activation.

One of the most commonly used prokaryotic promoters is the negative inducible pLac promoter. This promoter requires removal of the lac repressor (lacI protein) for transcription to be activated. In the presence of lactose or lactose analog IPTG, the lac repressor undergoes a conformational change that removes it from lacO sites within the promoter and ceases repression of the target gene. A simplified lac inducible system is found in many bacterial expression vectors.

Negative inducible promoter pBad is another popular prokaryotic promoter often used for bacterial protein purification. When arabinose is absent, regulatory protein AraC binds O and I1 sites upstream of pBad, blocking transcription. The addition of arabinose causes AraC to bind I1 and I2 sites, allowing transcription to begin. In addition to arabinose, cAMP complexed with cAMP activator protein (CAP) can also stimulate AraC binding to I1 and I2 sites. Supplementing cell growth media with glucose decreases cAMP and represses pBad, decreasing promoter leakiness.

Other examples of chemically induced promoters include positive inducible كحول و steroid regulated promoters commonly used in plant research.

Temperature inducible promoters

Temperature sensitive expression systems are typically less leaky than chemically induced promoters they show near-zero expression at regular temperatures but can be induced by heat or cold exposure. Examples include the heat shock-inducible Hsp70 or Hsp90-derived promoters, in which a gene of choice is only expressed following exposure to a brief heat shock. In the case of Hsp70, the heat shock releases heat shock factor 1 (HSF-1), which subsequently binds to heat shock elements in the promoter, thereby activating transcription. Addgene depositors have developed heat shock-inducible Cre and Cas9 for easy genome engineering in species like C. elegans and Drosophila.

Light inducible promoters

Light is another way to activate gene expression, and two-component systems used in synthetic biology use light to regulate transcription. Red flame plasmid pDawn contains the blue-light sensing protein YFI. When light is absent, YFI phosphorylates FixJ, which binds to the FixK2 promoter to induce transcription of the phage repressor cI. Repressor cI inhibits transcription from phage promoter pR, preventing expression of a reporter gene. When light is present, YFI is inactive, preventing repressor cI synthesis and allowing reporter gene transcription to take place. Addgene also has yellow flame light-regulated two component systems designed by the Tabor lab.


This work was supported by grants from the National Key R&D Program of China (2018YFA0900600), the National Natural Science Foundation of China (31788103, 31971370 and 31900301), the Chinese Academy of Sciences (QYZDY-SSW-SMC030), and R&D Program in Key Areas of Guangdong Province (2018B020202005).

Sinian Xing and Kunling Chen contributed equally to this work.

الانتماءات

State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Center for Genome Editing, Institute of Genetics and Developmental Biology, Innovation Academy for Seed Design, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

Sinian Xing, Kunling Chen, Haocheng Zhu, Rui Zhang, Huawei Zhang & Caixia Gao

College of Advanced Agricultural Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, China


شاهد الفيديو: ماهي الكاربوهيدرات: أهميتها في إنقاص و زيادة الوزن. HAMZA ESQALI (كانون الثاني 2022).