معلومة

فحص الإنزيم - البكتيناز


أثناء فحص الإنزيم عند درجة حرارة عالية ، تتحلل الركيزة (البكتين) بسبب ارتفاع درجة الحرارة بدلاً من الإنزيم ، لذا كيف يمكنني تقليل تدهور الركيزة بواسطة درجة الحرارة؟


المعالجة المسبقة للإنزيم عند درجة حرارة عالية قبل إجراء الفحص عند درجة الحرارة القياسية - آلان بويد


فحص الإنزيم - البكتيناز - البيولوجيا

البكتينازات هي في الواقع مزيج من الإنزيمات ، والتي تستخدم على نطاق واسع في صناعة عصير الفاكهة ، إلى جانب غيرها مثل السليولاز ، حيث تستخدم على نطاق واسع للمساعدة في استخراج وتوضيح وتعديل عصائر الفاكهة. (انظر أسفل هذه الصفحة لمزيد من المعلومات)

البكتين عبارة عن جزيئات كبيرة من عديد السكاريد ، تتكون (بشكل أساسي) من سلاسل من عدة مئات من بقايا حمض الجالاكتورونيك. تشمل الإنزيمات في مجموعة البكتيناز هذه polygalacturonases و pectin methyl esterase و pectin lyases. تعمل إنزيمات البكتيناز هذه بطرق مختلفة على البكتين ، والتي توجد في جدران الخلايا الأولية وفي الصفيحة الوسطى. تشتهر البكتين أيضًا بقدرتها على تكوين المواد الهلامية.

يتم إنتاج البكتينازات أثناء عملية النضج الطبيعية لبعض الفواكه ، حيث تساعد مع السليولاز على تليين جدران خلاياها. تُفرز هذه الإنزيمات أيضًا عن طريق مسببات الأمراض النباتية مثل فطر Monilinia fructigena وبكتيريا العفن الناعم Erwinia carotovora ، كجزء من استراتيجيتها لاختراق جدران الخلايا المضيفة للنبات. في الواقع ، تعمل منتجات مثل هذه الهجمات الإنزيمية (oligosaccharins) كإشارة تحث الخلايا غير المصابة على الدفاع عن نفسها.

يعتمد مبدأ هذا الاختبار على قياس كمية العصير المائي المنطلق من هريس التفاح المعلب (الغني جدًا بالبكتين) نتيجة لعمل البكتيناز.

يمكن شراء هريس التفاح المعلب أو المعبأ في زجاجات لهذا الفحص.

    لعمل مستخلص من الفاكهة أو الخضار ، امزج 2 سم 3 من الماء لكل 1 جرام من الفاكهة. تحضير ما لا يقل عن 25 سم 3 من المستخلص.

الاختلافات في حجم العصير بين الأنبوبين تعطي مقياسًا لنشاط البكتيناز في المستخلص.

إذا تم تنفيذ هذه التجربة على نطاق واسع ، فيمكن جمع التصريف الأولي من الممرات في أنابيب اختبار ، ثم يتم قياس حجم العصير الذي تم جمعه لاحقًا.


ملاحظة: عند استخدام الإنزيمات المحضرة تجاريًا في تحقيقاتك. . .

العديد من منتجات الإنزيمات الصناعية عبارة عن خليط من إنزيمات مختلفة. وبالتالي قد يحتوي مستحضر "البكتيناز" على مجموعة من البكتينازات والسليولازات. قد تحتوي المستحضرات الأخرى على نوع واحد فقط من الإنزيمات ، خاصةً إذا تم إنتاج الإنزيمات بواسطة سلالات معدلة وراثيًا أو تم تنقيتها بدرجة عالية.

عند التخطيط لاستقصاءاتك الخاصة ، من المهم جدًا دراسة ورقة البيانات المرفقة مع كل إنزيم. سيشير هذا إلى ما إذا كان المنتج عبارة عن خليط أو يحتوي على نوع واحد فقط من الإنزيم.

توفر ورقة البيانات أيضًا دليلًا تقريبيًا لكيفية تصرف الإنزيم. من الناحية العملية ، يتأثر نشاط الإنزيم بالعديد من الأشياء (مثل درجة الحموضة ودرجة الحرارة ووجود مثبطات أو عوامل مساعدة) والتي ستؤثر على النتائج التي تحصل عليها. بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما يتم إعداد الرسوم البيانية لنشاط العينة باستخدام مواد بسيطة في ظل ظروف مثالية بدلاً من الركائز المعقدة والظروف دون المثلى التي يمكن مواجهتها في سياق صناعي أو مدرسي.

في المربى والخروج من العصير دليل تعليمي NCBE / Unilever للإنزيمات في إنتاج عصير الفاكهة


اسأل خبير: تأثير البكتيناز على إنتاج العصير

أقوم بمشروع علم الأحياء الخاص بي حول إنتاج العصير.
أنا أبحث في تأثير الإنزيمات المختلفة على إنتاج عصير التفاح.
قرأت دليلاً على هذا الموقع وأود أن أعرف: هل يجب أن تضع إنزيم + تفاح في حمام مائي؟

رد: تأثير البكتيناز على إنتاج العصير

نشر بواسطة دونهاردي 2 & raquo الأحد 18 ديسمبر 2011 6:58 مساءً

مرحبًا بكم في Science Buddies! هذا هو مشروع كبير. أفترض أنك تقوم بنسخة من المشروع التالي:

في هذا المشروع ، يتم تقطيع التفاح إلى قطع صغيرة جدًا بحجم 5 مم ويضاف الإنزيم إلى العينة بكمية صغيرة من الماء. يقترح الإجراء استخدام حمام مائي 40 درجة مئوية ، ومع ذلك ، يمكنك بالتأكيد استخدام درجة حرارة مختلفة. نظرًا لأنه يبدو أنك ستجرب إنزيمات مختلفة ، فإن الإنزيم سيكون المتغير المستقل الخاص بك وستكون كمية العصير المتغير التابع. في هذه التجربة ، يجب أن تكون درجة الحرارة إحدى المعلمات التي يتم التحكم فيها ويجب أن تكون هي نفسها لجميع العينات. هل تعرف ما هي درجة الحرارة المثلى للبكتيناز؟ ماذا عن الإنزيمات الأخرى التي ستستخدمها؟

هل لديك أسئله أخرى؟

رد: تأثير البكتيناز على إنتاج العصير

نشر بواسطة امه 11 & raquo الاثنين ديسمبر 19 ، 2011 10:29 صباحًا

شكرا جزيلا لردك.

هذه هي المشكلة. لا أعرف ما هي درجات الحرارة التي يجب أن أضع فيها الإنزيمات؟

أنا أستخدم إنزيمات مختلفة ولكني أعلم أن بعض الإنزيمات قد يتم تغيير طبيعتها عند 40 درجة ، فهل يجب علي معرفة جميع درجات الحرارة المثلى لكل إنزيم؟

أوصى موقع ويب آخر وجدته بعدم وضع إنزيم + تفاح في حمام مائي. هل يجب أن أفعل هذا؟ لأنني إذا قمت بتغيير درجة الحرارة ، فأنا لا أريد أن يتشوه الإنزيم.

شكرا جزيلا لك على مساعدتك

رد: تأثير البكتيناز على إنتاج العصير

نشر بواسطة دونهاردي 2 & raquo الاثنين ديسمبر 19 ، 2011 11:09 صباحًا

إليك تقرير ، على الرغم من عدم نشره في مجلة علمية ، يبدو أنه يؤكد أن 40 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى للبكتيناز:

ودرجة الحموضة المثلى هي 4.5 إلى 5.5:

فيما يلي مصدر جيد للمعلومات عن البكتيناز من أحد المراجع في مقالة ويكيبيديا:

سيؤدي حمام الماء الدافئ بالتأكيد إلى تسريع التفاعل مقارنة بدرجة الحرارة المحيطة.

ما هي الإنزيمات الأخرى التي كنت تخطط لاستخدامها؟ قد يكون من الأفضل استخدام درجة الحرارة المثلى ودرجة الحموضة لكل إنزيم.


تم شراء Xylan و polygalacturonic acid من شركة Sigma Chemical Co. ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية. كان PectinexTM Ultra SP-L (مستحضر تجاري من الإنزيمات المحللة للبكتيريا من سلالة مختارة من Aspergillus niger) هدية كريمة من الدكتور جيه إس راو ، نوفوزيميس ، بنغالور ، الهند. جميع المواد الكيميائية الأخرى المستخدمة كانت من الدرجة التحليلية.

تحديد نشاط البكتيناز

تم تقدير نشاط البكتيناز باستخدام حمض polygalacturonic كركيزة وفقًا للطريقة الموصوفة [21]. تُعرَّف وحدة واحدة من نشاط الإنزيم على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لإنتاج ميكرولتر واحد من حمض الجالاكتورونيك في الدقيقة تحت ظروف الفحص. تم تقدير كمية حمض الجالاكتورونيك باستخدام طريقة حمض ثنائي نيتروساليسيليك [22].

تحديد نشاط الزيلاناز

تم تقدير نشاط الزيلانيز باستخدام الزيلان كركيزة [23]. يتم تعريف وحدة واحدة من نشاط الإنزيم على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لإنتاج ميكرولتر واحد من تقليل السكر في الدقيقة تحت ظروف الفحص. تم تقدير كمية السكر المختزل باستخدام طريقة حمض ثنائي نيتروساليسيكليك [22].

تحديد نشاط السليولاز

تم تقدير نشاط السليلوز باستخدام كربوكسي ميثيل السليلوز كركيزة [24]. يتم تعريف وحدة واحدة من نشاط الإنزيم على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لإنتاج ميكرولتر واحد من تقليل السكر في الدقيقة تحت ظروف الفحص. تم تقدير كمية السكر المختزل باستخدام طريقة حمض ثنائي نيتروساليسيكليك [22].

تقدير البروتين

تم تحديد تركيز البروتين وفقًا للإجراء الذي وصفه برادفورد [25] باستخدام ألبومين مصل البقر كمعيار.

ترسيب الإنزيمات بالمذيبات العضوية

تمت إضافة المذيبات العضوية المبردة (الأسيتون ، ثنائي ميثوكسي إيثان (DME) و n-propanol ، 5 مل لكل منهما) بالتنقيط بشكل منفصل إلى 1 مل من المستحضر التجاري Pectinex ™ Ultra SP-L مع رجها وحفظها لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للترسيب الكامل لـ الإنزيمات ثم طردها لمدة 5 دقائق عند 10000 × جم. تم التخلص من المادة الطافية وأعيد إذابة الراسب في محلول أسيتات الصوديوم 0.05 مولار. تم تقدير أنشطة البكتيناز والزيلانيز والسليولاز في المحلول.

إعداد CLEA

يضاف n- بروبانول مبرد (5 مل) إلى المحلول الأنزيمي الخام (1 مل) في أنابيب الطرد المركزي المغطاة. بعد حفظ الخليط لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للترسيب الكامل للإنزيمات ، تمت إضافة كميات متفاوتة من الجلوتارالدهيد. تم اهتزاز الأنابيب بشكل مستمر أثناء الإضافة. تم حفظ الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات مع الرج المستمر عند 300 دورة في الدقيقة. في نهاية وقت التفاعل ، يطرد المعلق عند 10000 × جم لمدة 5 دقائق. تم صب المادة الطافية وغسلت الكريات 3 مرات باستخدام محلول أسيتات الصوديوم 0.05 مولار عند الرقم الهيدروجيني 5 لإزالة الجلوتارالدهيد غير المتفاعل. تم حفظ تحضير الإنزيم النهائي في نفس المخزن المؤقت (1 مل) عند 4 درجات مئوية.

تحديد المعلمات الحركية

تم تحديد المعلمات الحركية للإنزيمات الحرة و CLEA عن طريق قياس المعدلات الأولية للإنزيمات بكميات متفاوتة من محاليل الركيزة المعنية في ظل ظروف الفحص. تم تركيب البيانات في معادلة Hanes-Woolf باستخدام برنامج Leonora لحساب المعلمات الحركية [26].

دراسة الثبات الحراري

تم تحديد الثبات الحراري لكل من البكتيناز والزيلانيز والسليولاز الموجود في CLEA. في حالة البكتيناز ، تمت دراسة الثبات الحراري للإنزيم الحر و CLEA عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتم دراسة ثبات السليولاز والزيلانيز عند 70 درجة مئوية و 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على التوالي. في الحالات الثلاث ، تم أخذ النشاط عند 0 دقيقة بنسبة 100٪.

درجة الحموضة ودرجة الحرارة المثلى للبكتيناز والزيلاناز والسليولاز

تمت دراسة درجة الحموضة المثلى للبكتيناز والزيلانيز والسليولاز في CLEA على مدى درجة الحموضة 3.5-9.5. تمت دراسة درجة الحرارة المثلى للبكتيناز والزيلانيز والسليولاز في شكل حر وفي CLEA على مدى 25-70 درجة مئوية.

قابلية إعادة استخدام البكتيناز والزيلانيز والسليولاز

لتقييم قابلية إعادة استخدام البكتيناز والزيلانيز والسليولاز في CLEA ، تم غسل CLEA في كل حالة باستخدام محلول الفحص بعد كل استخدام ثم تعليقه مرة أخرى في خليط تفاعل جديد لقياس نشاط الإنزيم. تم حساب النشاط المتبقي بأخذ نشاط إنزيم الدورة الأولى بنسبة 100٪.


المقدمة

تم وصف تأثير درجة الحرارة على نشاط الإنزيم بواسطة معلمتين حراريتين راسختين: طاقة تنشيط Arrhenius ، التي تصف تأثير درجة الحرارة على ثابت المعدل الحفزي ، كقط، والثبات الحراري ، الذي يصف تأثير درجة الحرارة على ثابت معدل التثبيط الحراري ، كغير صحيح. تم حل الحالات الشاذة الناشئة عن هذا الوصف من خلال تطوير [1] والتحقق من صحة [2] نموذج جديد (نموذج التوازن) الذي يصف تأثير درجة الحرارة على نشاط الإنزيم بشكل كامل عن طريق تضمين آلية إضافية ينقص نشاط الإنزيم بواسطتها ترتفع درجة الحرارة. في هذا النموذج ، الشكل النشط للإنزيم (E.يمثل) في توازن قابل للانعكاس مع شكل غير نشط (لكن غير مشوه) (E.غير صحيح) ، وهو الشكل غير النشط الذي يخضع لتعطيل حراري لا رجعة فيه إلى الحالة المشوهة حرارياً (X):

يوضح الشكل 1 التأثير الرسومي الأكثر وضوحًا للنموذج ، وهو درجة الحرارة المثلى (تييختار، يقرر) في وقت صفر (الأشكال 1 أ و & # x200 ب و 1 ب) ، 1 ب) ، مطابقة الملاحظات التجريبية [2]. على النقيض من ذلك ، فإن & # x02018Classical Model & # x02019 ، الذي يفترض وجود توازن بسيط ثنائي الحالة بين حالة نشطة وحالة مشوهة حراريًا (Eيمثل& # x02192X) ، ويمكن وصفها من حيث معلمتين فقط (طاقة تنشيط Arrhenius والثبات الحراري) ، توضح أنه عندما يتم رسم البيانات في ثلاثة أبعاد لا يوجد تييختار، يقرر وقت الصفر (الشكل 1 ج).

بالإضافة إلى الاختلافات الواضحة في الرسوم البيانية التي تمثل النموذجين ، فقد لوحظ تجريبياً أنه في أي درجة حرارة أعلى من الحد الأقصى لنشاط الإنزيم ، فإن فقدان النشاط يعزى إلى التحول في Eيمثل/ هـغير صحيح التوازن سريع جدًا (& # x0003c1 & # x000a0s) بالنسبة لفقدان النشاط بسبب التمسخ الحراري (كما هو موضح في الشكل 1 بواسطة خطوط المعدل مقابل الوقت) [2]. هذه وغيرها من الأدلة حتى الآن [2] تشير إلى أن الظاهرة التي وصفها النموذج (أييمثل/ هـغير صحيح التوازن) ينشأ من تغييرات توافقية محلية بدلاً من التغيرات العالمية في الهيكل. ومع ذلك ، لم يتم بعد تحديد مدى التغيير المطابق ، والمدى الذي يمكن وصفه بأنه تكشف جزئي.

يمكن وصف التوازن بين الأشكال النشطة وغير النشطة للإنزيم من حيث المحتوى الحراري للتوازن ، & # x00394حمكافئ، ومعلمة حرارية جديدة ، تيمكافئ، وهي درجة الحرارة التي عندها تراكيز E.يمثل و هـغير صحيح متساوية تيمكافئ لذلك يمكن اعتباره المكافئ الحراري لـ كم. تيمكافئ له أهمية أساسية وتكنولوجية. له آثار مهمة على فهمنا لتأثير درجة الحرارة على تفاعلات الإنزيم داخل الخلية وتطور الإنزيم استجابة لدرجة الحرارة ، وربما يكون تعبيرًا أفضل عن تأثير درجة الحرارة البيئية على تطور الإنزيم من الاستقرار الحراري. تيمكافئ وبالتالي يوفر معلمة جديدة مهمة لمطابقة خصائص الإنزيم مع وظيفته الخلوية والبيئية. تيمكافئ يجب أيضًا أخذها في الاعتبار في هندسة الإنزيمات لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية في درجات حرارة عالية [3]. غالبًا ما يتم توجيه هندسة الإنزيمات نحو تثبيت الإنزيمات ضد التمسخ ، ومع ذلك ، فإن زيادة الاستقرار الحراري قد لا يعزز نشاط درجة الحرارة المرتفعة إذا تيمكافئ يبقى دون تغيير.

يتطلب اكتشاف تعطيل الإنزيم القابل للانعكاس ، والذي يشكل أساس نموذج التوازن ، الحصول على بيانات الفحص ومعالجتها بعناية بسبب عدد التأثيرات المتضاربة التي تنشأ عند زيادة درجة حرارة اختبار الإنزيم. تحديد تيمكافئ حتى الآن استخدمت المقايسات المستمرة ، لأن هذه الطريقة تنتج منحنيات تقدم مباشرة وتغني عن الحاجة إلى إجراء تجارب نشاط واستقرار منفصلة ، وقد استخدمت إنزيمات تكون تفاعلاتها بشكل أساسي غير قابلة للانعكاس (بعيدًا عن توازن التفاعل) ، ولا تظهر أي ركيزة أو تثبيط المنتج وتبقى مشبعة بالركيزة في جميع أنحاء الفحص. ومع ذلك ، هناك عدد كبير من الإنزيمات التي لا تتوافق مع هذه المعايير ، مما يضيق من الفائدة المحتملة للتحديد تيمكافئ. تصف الورقة الحالية طرق التحديد الموثوق به لـ تيمكافئ في ظل ظروف تفاعل إنزيم مثالية أو غير مثالية ، باستخدام فحوصات مستمرة أو متقطعة ، ويحدد بيانات الفحص المطلوبة لتحديد دقيق تيمكافئ والثوابت الديناميكية الحرارية (& # x00394جي& # x02021قط، & # x00394جي& # x02021غير صحيح و & # x00394حمكافئ) المرتبطة بالنموذج [2] كما أنها تقدم طريقة لمواءمة منحنيات التقدم مباشرة مع نموذج التوازن وتحدد متانة إجراءات ملاءمة البيانات. تظهر النتائج مباشرة كيف تتأثر معلمات نموذج التوازن بالبيانات.

تسمح الطرق الموضحة في هذا البحث بتحديد المعلمات الجديدة & # x00394حمكافئ و تيمكافئ، مطلوب لأي وصف للطريقة التي تؤثر بها درجة الحرارة على نشاط الإنزيم. بالإضافة إلى ذلك ، فهي تسهل التحديد المباشر والمتزامن لـ & # x00394جي& # x02021قط و & # x00394جي& # x02021غير صحيح تحت ظروف فسيولوجية نسبيًا. لذلك ، لديهم القدرة على أن تكون ذات قيمة كبيرة في الدراسة النقية والتطبيقية للإنزيمات.


فحص البكتيناز - نشاط البكتيناز (يونيو / 05/2010)

هنا فحص من ورثينجتون: مقايسة البكتيناز.

شكرا لردك. أشعر بصعوبة في حساب النشاط. هل يمكن أن تزودني بمصدر لحساب نشاط الإنزيمات.

من أجل مساعدتك في الحساب ، نحتاج إلى معرفة تنسيق البيانات وتفاصيل التفاعل (مثل تركيز الإنزيم وتركيز الركيزة وما إلى ذلك) وما هي الوحدات التي تريد النتائج فيها.

أنا باستخدام تركيز إنزيم 10 ملغ / مل وتركيز الركيزة 5 ملغ / مل

في النهاية عندما يتم قراءته في مقياس الطيف الضوئي فإنه يعطي قيمة للإنزيم ومعايير حمض الجالاكتورونيك D.

الآن كيف تحسب كمية حمض الجالاكتورونيك D المتحررة معبراً عنها بالميكرومولات.

اقترح لي من فضلك بعض الكتب أو المواد المتعلقة بهذا الحساب. سيكون مفيدًا جدًا بالنسبة لي


لقد حاولت أيضًا باستخدام طريقة DNSA لتقدير السكريات المختزلة ، وهنا أيضًا بعض المشاكل في الحساب.
ليس لدي الكثير من الأساسيات في الكيمياء الحيوية لذا الرجاء مساعدتي.

هل هذه تركيزات المخزون أو التركيز في الفحص؟

منتج (يبحث عن زيادة) أو ركيزة (تبحث عن انخفاض) منحنى قياسي (أعط معلومات محددة)؟


البكتيناز خارج الخلية من بكتريا Chryseobacterium indologenes سلالة SD وتطبيقاته في توضيح عصير الفاكهة.

الإنزيمات هي جزيئات بيولوجية تسرع التفاعلات الكيميائية الحيوية. البكتينازات هي مجموعة الإنزيمات التي تحفز تحلل المواد البكتيرية من خلال تفاعل إزالة البلمرة وإزالة الأسترة [1]. البكتيناز هو أيضًا مصطلح معروف جيدًا لتحضير الإنزيم التجاري أثناء تصفية عصير الفاكهة. هذا الإنزيم يفكك حمض الجالاكتورونيك إلى حمض أحادي الجالاكتورونيك عن طريق فتح الروابط الجليكوسيدية [2].

في السوق العالمية ، تم الإبلاغ عن أن البكتيناز يمثل 10٪ من الإنزيمات الصناعية العالمية المنتجة [3]. يتم إنتاج الإنزيمات المحللة للبكتين من قبل العديد من الكائنات الحية مثل البكتيريا والفطريات والخمائر والحشرات والديدان الخيطية والبروتوزوان والنباتات. من بين البكتينازات المختلفة ، تتمتع البكتينازات البكتيرية بمزايا أكثر على البكتينازات الأخرى. مع مرور الوقت ، تم نشر العديد من التقارير حول تحسين المعايير الميكروبيولوجية المختلفة واستراتيجيات التخمير لإنتاج البكتينازات [4].

البكتينازات لها تطبيقات هائلة في صناعات عصير الفاكهة لتحسين صفاء وعائد عصير الفاكهة [5]. تحتوي البكتينازات أيضًا على تطبيقات صناعية متنوعة أخرى مثل تنظيف القطن وإزالة الصمغ من الألياف النباتية ومعالجة مياه الصرف واستخراج الزيوت النباتية المستخدمة في صناعات مختلفة مثل صناعة اللب وصناعة النسيج وصناعة الأغذية وما إلى ذلك. كما تم وصف استخدام إنزيم البكتيناز لتغيير نسيج أو نكهة عصير الفاكهة ، وزيادة الاستخلاص والتوضيح ، وتقليل اللزوجة [6].

مع مراعاة جميع المزايا المذكورة أعلاه لأنزيمات البكتيناز ، تم تصميم الهدف من الدراسة الحالية لعزل الكائنات الحية الدقيقة المحللة للبكتين ، وتحسين ظروفها الثقافية لتحقيق أقصى إنتاج للبكتيناز ، والتحقيق في العوامل المختلفة المشاركة في الحد الأقصى لنشاط البكتيناز وأيضًا لتقييم إمكاناته في توضيح عصير الفاكهة المختلفة.

2.1. أخذ العينات والفحص. تم عزل البكتيريا المنتجة للبكتيناز من تربة مخلفات الخضروات. من العينات التي تم جمعها ، تم عزل وتنقية 40 عزلة بكتيرية باتباع تقنيات تعداد الصفائح المعيارية التي وصفها دوبي وماهيشواري [7]. من بين 40 عزلة ، تم العثور على ثمانية عزلات لإنتاج البكتيناز بينما نمت على مستخلص الخميرة أجار البكتين (YEP) أثناء الفحص الأولي. تم إجراء فحص البكتيريا المنتجة للبكتيناز في وسط أجار YEP المحتوي على مستخلص الخميرة 1٪ ، البكتين 1٪ ، أجار 1.5٪ ، وكلوريد الصوديوم 0.5٪ (درجة الحموضة 7.0) عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة من الحضانة. بعد الحضانة ، تم اختيار المستعمرات التي تظهر مناطق واضحة عند الإغراق بمحلول يوديد اليود والبوتاسيوم (1.0 جم من اليود ، 5.0 جم من يوديد البوتاسيوم ، و 330 مل [H.sub.2] O) كمنتجين للبكتيناز [8] والعزل K6 مع أقصى منطقة للقطر مسبقة لمزيد من الدراسات.

2.2. تحديد سلالة بكتيرية مختارة من خلال الخصائص المظهرية والكيميائية الحيوية. تم التعرف على العزلة المختارة من خلال الخصائص المورفولوجية والثقافية والكيميائية الحيوية. تم تحديد خصائص المستعمرة للعزلة على مائل مستخلص الخميرة - البكتين أجار المائل والتشكل الخلوي بطريقة الصبغة بالجرام. للخصائص الكيميائية الحيوية ، عدة اختبارات مثل اختبار السترات ، اختبار TSI (الحديد السكر الثلاثي) ، اختبار الإندول ، MR-VP ، الحركة ، الكاتلاز ، أوكسيديز ، التحلل المائي للنشا ، واختبارات التخمير للسكريات المختلفة مثل الجلوكوز ، السكروز ، اللاكتوز ، المالتوز ، تم إجراء اختبارات النشا والمانيتول.

2.3 التعريف الجزيئي للعزلة البكتيرية باستخدام تسلسل الرنا الريباسي 16S. في الوقت نفسه ، تم تحديد هذه العزلة المحتملة باستخدام الأداة الجزيئية لتسلسل الرنا الريباسي 16S. في هذه الطريقة ، تم استخدام مجموعة تنقية DNA Promega [R] Wizard [R] لاستخراج الحمض النووي الجيني للعزلة المختارة. تم تضخيم منطقة جين الرنا الريباسي 16S باستخدام البادئات الشاملة. كانت مخاليط التفاعل 5 [ميكرو] لتر من القالب ، الاشعال: 1 [ميكرو] لتر من التمهيدي الأمامي: 27 فهرنهايت (5'AGAGTTGATCCTGGCTCAG 3 ') ، 1 [ميكرو] لتر من التمهيدي العكسي: 1492R (5' TACCTTGTTACGACTT 3 ') ، 6 [ميكرو] لتر من محلول الفحص ، 2 [ميكرو] لتر من بوليميريز DNA Taq ، و 5 [ميكرو] لتر من مزيج dNTP. تمت تنقية منتجات PCR باستخدام PCR KlenzolTM وتم تسلسلها باستخدام تسلسل الحمض النووي من الجيل التالي. ثم تمت معالجة نتائج التسلسل باستخدام برنامج BioEdit. تم إجراء تحليل تسلسل النيوكليوتيدات باستخدام برنامج أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (بلاست) في موقع المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). تم تقديم بيانات النتائج التي تم الحصول عليها إلى NCBI GenBank برقم الانضمام KY684254. تم إجراء التحليل الوراثي في ​​برنامج التحليل الوراثي التطوري الجزيئي الإصدار 7.0 (MEGA7) [9].

2.4 تحضير اللقاح. لإنتاج إنزيم البكتيناز ، تم تحضير اللقاح عن طريق تلقيح 10 مل من وسط سائل YEP معقم في أنبوب اختبار مع حلقة واحدة مليئة بالثقافة النقية وحضنت عند 125 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. تم استخدام الثقافة النقية الطازجة بين عشية وضحاها كقاح لتحسين إنتاج الإنزيم.

2.5 إنتاج إنزيم البكتيناز. تم نقل اللقاح (5٪ حجم / حجم) بطريقة معقمة إلى 50 مل من وسط الإنتاج (مستخلص الخميرة مرق البكتات الذي يظهر التركيب التالي: مستخلص الخميرة 1٪ ، البكتين 1٪ ، كلوريد الصوديوم 0.5٪ ، والماء المقطر 100 مل) في 250 مل دورق مخروطي يحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة مع 125 دورة في الدقيقة في حاضنة اهتزاز [10]. بعد الحضانة ، تم الطرد المركزي لوسط الإنتاج عند 7000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للحصول على مادة طافية خالية من الخلايا. تم استخدام المادة الطافية كأنزيم خام لإجراء مزيد من الدراسات.

2.6. فحص البكتيناز تم تقييم نشاط البكتيناز عن طريق تقدير كمية السكريات المختزلة المنبعثة تحت ظروف الفحص عن طريق التحلل الأنزيمي لبكتين الحمضيات. تم تحضين خليط التفاعل المحتوي على 1.8 مل من محلول الركيزة (حمضيات بكتين) و 0.2 مل من محلول الإنزيم المخفف بشكل مناسب عند 40 درجة مئوية في حمام مائي لمدة ساعة واحدة. تم تحديد كمية السكر المختزل المحرر من خلال تعديل نيلسون لطريقة سوموجي [11 ، 12]. تم تعريف وحدة واحدة من نشاط الإنزيم (U) على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لإطلاق 1 [ميكرو] مول من السكر المختزل لكل مل في الدقيقة في ظل ظروف الفحص القياسية (1U = 1 [ميكرو] مول [min.sup.-1] [mL.sup.-1]) [13]. تم قياس كثافة اللون عند 500 نانومتر في مقياس الألوان [SpectroT60 (UV-VIS RS)] ومقارنتها بمنحنى قياسي تم تحضيره باستخدام "D-glucose" (25-200 ميكروغرام). تم الحفاظ على السيطرة مع الوسائط غير الملقحة والإنزيم المغلي. تم حساب النشاط النسبي للإنزيم كنسبة مئوية باستخدام الصيغة التالية:

النشاط النسبي = نشاط العينة × 100 / أقصى نشاط للعينة (1)

2.7. تقدير البروتين الكلي. تم تحديد محتوى البروتين الكلي بواسطة طريقة لوري [14] بقياس الامتصاص عند 600 نانومتر ومقارنته بالمنحنى القياسي المحضر بواسطة ألبومين مصل البقر (BSA).

2.8 تحسين العوامل المختلفة المشاركة في الحد الأقصى من إنتاج البكتيناز

2.8.1. تأثير درجة الحرارة ودرجة الحموضة ووقت الحضانة. تم إخضاع العزلة البكتيرية لظروف استزراع مختلفة لاشتقاق الظروف المثلى لأقصى إنتاج للبكتيناز. تم تقدير إنتاج البكتيناز بدرجات حرارة مختلفة (27 ، 30 ، 37 ، 40 ، 45 درجة مئوية) ، نطاق واسع من الأس الهيدروجيني (5.0 ، 5.5 ، 6.0 ، 6.5 ، 7.0 ، 7.5 ، 8.0 ، 8.5 ، 9.0) ، وفترات حضانة مختلفة (24 ، 48 ، 72 ، 96 ، 120 ساعة) ثم تم قياس نشاط الإنزيم.

2.8.2. تأثير مصادر الكربون والنيتروجين. لدراسة تأثير مصادر الكربون والنيتروجين على إنتاج البكتيناز من العزلة المختارة ، تمت إضافة مصادر الكربون المختلفة (بكتين الحمضيات والجلوكوز والسكروز والنشا) ومصادر النيتروجين (الببتون ، مستخلص الخميرة ، كلوريد الأمونيوم ، ونترات البوتاسيوم) وسط إنتاج بتركيز 0.5٪ وزن / حجم ثم تم تقييم نشاط البكتيناز.

2.9 تحسين معلمات التفاعل لأقصى نشاط للبكتيناز. تمت دراسة معاملات التفاعل المختلفة لتحديد الظروف المثلى لنشاط البكتيناز الخام عند درجات حرارة مختلفة ، ودرجة حموضة ، ووقت التفاعل ، وتركيز الركيزة.

2.9.1. تأثير درجة الحرارة ودرجة الحموضة. تم تحديد درجة الحرارة المثلى ودرجة الحموضة لأنزيم البكتيناز من خلال احتضان خليط التفاعل ذي الرقم الهيدروجيني 7.5 عند درجات حرارة مختلفة (30 ، 37 ، 40 ، 45 درجة مئوية) ، ثم نطاق من الأس الهيدروجيني (6.0 ، 6.5 ، 7.0 ، 7.5 و 8.0 و 8.5 و 9.0) عند 40 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة باستخدام مخازن مختلفة ، على التوالي. لهذا الغرض ، تم تحضير الركيزة (1٪ وزن / حجم بكتين الحمضيات) بقيم مختلفة من الأس الهيدروجيني (الأس الهيدروجيني 6.0-9.0) باستخدام محلول سيترات-فوسفات 0.2 م (درجة الحموضة 6.0-75) و 0.2 م من محلول تريس- حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0- 9.0). ثم تم تقييم نشاط البكتيناز باستخدام طريقة الفحص القياسية.

2.9.2. تأثير وقت رد الفعل. لتحديد وقت التفاعل الأمثل ، تمت دراسة ثبات الإنزيم عن طريق احتضان خليط التفاعل لفترات زمنية مختلفة عند 10 دقائق و 20 دقيقة و 30 دقيقة و 40 دقيقة و 50 دقيقة و 60 دقيقة تحت درجة الحرارة الأمثل ودرجة الحموضة ثم إجراء الفحص لنشاط البكتيناز.

2.9.3. تأثير تركيز الركيزة. لفحص تأثير تركيز الركيزة أثناء تفاعل الركيزة الإنزيمية ، تم تحضير تركيزات مختلفة من بكتين الحمضيات (0.5 ، 1.0 ، 1.5 ، 2.0 ، 2.5 ، 3.0٪) ثم تم قياس نشاط الإنزيم.

2.10. إنزيم البكتيناز الخام في توضيح عصير الفاكهة. لملاحظة تأثير البكتيناز الخام على تصفية عصير الفاكهة المختلفة ، تم تصنيف الأنابيب على أنها معالجة وضبط. تم أخذ 10 مل من البكتيناز الخام في أنبوب الاختبار (العلاج) وأخذ 10 مل من الماء المقطر في أنبوب اختبار التحكم. ثم تمت إضافة عشرين مل من عصير التفاح / العنب إلى كلا الأنبوبين. تم تحريك محتويات الأنابيب لخلط الإنزيمات في جميع أنحاء العصير. تم وضع الأنابيب في حمام مائي عند 40 درجة مئوية. تمت ملاحظة الأنابيب على فترات 5 دقائق على مدى ساعة واحدة. بعد الحضانة ، يرشح المحلول [15].

لا يوجد سوى عدد قليل من التقارير عن البكتينازات البكتيرية حتى الآن [16]. في هذه الدراسة ، هدفنا إلى اكتشاف البكتيريا المحللة للبكتين الجديدة والمحتملة ، لتحسين الظروف الثقافية لتعزيز إنتاج الإنزيم والتوصيف الجزئي للإنزيم. لهذا الغرض ، قمنا بجمع تربة مخلفات الخضروات كمصدر للكائنات الحية المحتملة. تم اختيار ثمانية عزلات في المقام الأول من 40 عزلة بكتيرية على أساس نشاطها التحلل البكتيني ، كما هو موضح في الشكل 1 ، أثناء الفحص ، وأخيراً ، تم اختيار العزلة K6 لمزيد من الدراسات.

3.1. تحديد العزلة البكتيرية المختارة. للتعرف على العزلة المختارة K6 ، تم الأخذ بعين الاعتبار كل من الطرق الميكروبيولوجية التقليدية والتقنيات الجزيئية الحديثة. على أساس الخصائص المورفولوجية والثقافية والكيميائية الحيوية المرصودة ، تمت مقارنة العزلة المختارة مع الوصف القياسي في دليل بيرجي لعلم الجراثيم المحدد [17] وتم تحديد العزلة K6 مؤقتًا على أنها إندولوجينات كريسوباكتيريوم.

في قاعدة بيانات NCBI ، أظهر BLAST محاذاة كبيرة من الإندولوجينات Chryseobacterium مع 95 ٪ تشابه. علاوة على ذلك ، تمت مقارنة التسلسل الذي تم الحصول عليه مع التسلسلات الأخرى ذات الصلة للعثور على أقرب متماثل في NCBI باستخدام BLAST. تم إنشاء شجرة النشوء والتطور (الشكل 2) على أساس تسلسل الجين 16S rRNA لعزل Chryseobacterium indologenes سلالة SD وسلالات أخرى من أنواع Chryseobacterium التي تم الحصول عليها من قاعدة بيانات GenBank. تم استخدام متواليات النوكليوتيدات الـ 16 ذات الصلة لبناء شجرة النشوء والتطور باستخدام طريقة ربط الجوار [18]. تم أخذ شجرة الإجماع التمهيدية المستنبطة من 1000 مكررة [19] لتمثيل التاريخ التطوري للأصناف التي تم تحليلها [19]. يتم طي الفروع المقابلة للأقسام المستنسخة في أقل من 50٪ من نسخ تمهيد التشغيل. يتم عرض النسبة المئوية للأشجار المكررة التي تتجمع فيها الأصناف المرتبطة معًا في اختبار التمهيد (1000 نسخة متكررة) بجوار الفروع [19]. تم حساب المسافات التطورية باستخدام طريقة احتمالية المركب القصوى [20] وهي بوحدات عدد البدائل الأساسية لكل موقع. اشتمل التحليل على 16 تسلسل نيوكليوتيد. تم التخلص من جميع المواقف التي تحتوي على فجوات وبيانات مفقودة. كان هناك إجمالي 1323 وظيفة في مجموعة البيانات النهائية. أجريت التحليلات التطورية في MEGA7 [9]. أخيرًا ، استنتجت النتيجة التي تم الحصول عليها من تحليلات الرنا الريباسي 16S أن سلالة Chryseobacterium indologenes SD كانت قريبة جدًا من سلالات Chryseobacterium indologenes الأخرى.

3.2 دراسات التحسين للعزلة لإنتاج البكتيناز. لتحسين ظروف الاستزراع لهذا الكائن الحي المحتمل في وسط الإنتاج ، تم أخذ درجات حرارة مختلفة ، ودرجة الحموضة ، وفترة الحضانة ، ومختلف مصادر C و N في الاعتبار. ارتفع إنتاج الإنزيم مع زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ثم انخفض (الجدول 1). كان الحد الأقصى للإنتاج الذي حدث عند درجة الحرارة هذه 0.679 وحدة / مل (100٪ من النشاط النسبي). انخفض هذا بشكل كبير إلى ما يقرب من 27٪ عند 45 درجة مئوية. في الدراسة السابقة لعائشة وبارات (2016) [21] ، لوحظ أعلى إنتاج للبكتيناز من بعض أنواع العصيات عند 37 درجة مئوية وهو ما يشبه دراستنا الحالية. تم الإبلاغ عن نفس النتائج أيضًا من قبل العمال الآخرين [22] في حالة السلالة المطفرة من Leuconostoc mesenteroides.

لوحظ نفس الاتجاه أيضًا عندما سُمح لهذا الكائن الحي بالنمو في وسط الإنتاج عند درجة حموضة متغيرة (الجدول 2). تم تسجيل أقصى إنتاج (0.564 وحدة / مل) عند درجة الحموضة 7.5. هذا الاستنتاج يتوافق مع العمال الآخرين الذين أفادوا أن معظم Bacillus sp. تنتج كمية عالية من البكتيناز بين 7.5 و 8 درجة الحموضة [21 ، 23]. في درجة الحموضة عالية الحموضة والقلوية ، انخفض إنتاج الإنزيم بحوالي 34٪ و 64٪ على التوالي. من هذه النتيجة ، يمكن الاستدلال على أنه في حالة درجة الحموضة المنخفضة جدًا والعالية جدًا ، يتباطأ نمو الكائن الحي.

جرت محاولة لتحديد الفترة الزمنية الأكثر ملاءمة لإنتاج الإنزيم بواسطة العزلة المختارة وتم تسجيل أعلى إنتاج للإنزيم (0.594 وحدة / مل) عند 72 ساعة من الحضانة (الجدول 3). انخفض إنتاج الإنزيم تدريجياً إلى 0.35 [ميكرو] مول [min.sup.-1] [mL.sup.-1] بعد 120 ساعة من الحضانة وهو ما يقرب من 40٪ أقل من الحد الأقصى. قد يكون هذا بسبب تراكم منتجات النفايات في فترة حضانة طويلة مع مصادر مغذية محدودة مما أدى بالتالي إلى كبت نمو الكائنات الحية الدقيقة. وفقًا لنووي وآخرون. (2017) [24], maximum pectinase production was determined from the Bacillus subtilis ADI1 after 72 hours of incubation which well agreed with our findings.

In this study, we also supplemented different types of carbon and nitrogen sources to find out the suitable production medium for pectinase production by Chryseobacterium indologenes strain SD. Among the four C sources, the organism lost almost 50% of production in case of sucrose utilization. It showed the highest production of 0.671 U/ml, while citrus pectin was used in the medium as C source and almost the same result was found in case of glucose supplement (Table 4) suggesting that the organism exploited citrus pectin more efficiently as compared to other C sources. Prakash et al. (2014) [25] observed the highest production of pectinase with lactose and glucose and Jayani et al. (2010) [26] reported citrus pectin as the best carbon source for pectinase production by Bacillus sphaericus. However, some researchers reported the maximum pectinase production from Bacillus subtilis ADI1 using rice brain as carbon source [24].

Likewise, the best enzyme production of this isolate was recorded when yeast extract was used as N source in the medium and the organism also produced nearly the same amount of enzyme when peptone was supplemented which indicates that this organism preferred yeast extract as compared to other N sources (Table 5). On top of that, our study revealed that organic nitrogen was used as better N sources by this organism than inorganic sources for enzyme production. These results are completely aligned with the findings of the other workers [25, 26].

Finally, by applying all the optimized parameters, the isolate was allowed to produce the enzyme in the production medium and we observed little increase in pectinase production (0.689 U/ml).

3.3 Total Protein Estimation for Crude Enzyme. Protein concentration of the crude enzyme was determined by Folin-Lowry method [14]. The total protein content was 1320 [micro]g/ml in the cell-free supernatant of Chryseobacterium indologenes strain SD.

3.4. Optimization Studies of Pectinase Activity. By growing the organism in the production medium under optimized conditions, the crude was collected by centrifugation to determine optimum conditions of the pectinase activity. Then the collected crude enzyme was allowed to react with different substrate concentrations (citrus pectin) at a wide range of temperatures, pH, and reaction time.

In this research work, the crude enzyme obtained from Chryseobacterium indologenes strain SD showed maximum activity at 40[degrees]C (Figure 3), whereas the organism showed the highest production at 37[degrees]C. This result is approximately similar to the result of other studies [27]. However, some studies reported [28] that pectinases from various Bacillus species were most active at 50[degrees]C and 60[degrees]C. From our study, it can be inferred that pectinase enzyme produced by the isolate is a moderately thermophilic enzyme.

Enzyme activity also depends on the pH of the reaction mixture. In our study, crude enzyme showed the highest activity at slightly alkaline pH 8 (Figure 4) and the organism also showed its maximum production at pH 7.5. Therefore, this enzyme can be used for vegetable purees and other preparations which need neutral to slightly alkaline pH [29]. This finding is in accordance with the reports of previous studies [28]. So, the result of our study indicates that this crude enzyme might be alkaline in nature.

As incubation time affects the activity of the enzyme, the crude enzyme was allowed to react with 1% of citrus pectin as substrate at optimized pH and temperature for different time intervals to determine its optimum reaction time. In our study, enzyme activity increased with the increase of incubation time up to 40 min and then remained stable in the subsequent incubation period (Figure 5). This result is in a good agreement with other studies [30].

The enzyme assay using different concentrations of substrate (citrus pectin) was observed and found that the enzyme activity augmented up to 2% of pectin and then it showed downward trend before being leveled off at 98% of relative activity in the subsequent increase of substrate concentration (Figure 6). This might be due to complete saturation of enzyme by the substrate.

3.5 Application of Crude Pectinase Enzyme in Fruit Juice Clarification. The effect of crude pectinase of the bacterial isolate Chryseobacterium indologenes strain SD was studied for apple/grape juice clarification. The crude enzyme of the selected isolate showed good activities by clarifying the juices as compared to control (Figure 7).

Nowadays, the need of industrially important enzymes has increased rapidly. Pectinase enzyme has taken great attraction in the field of juice clarification and other commercial applications. In this study, Chryseobacterium indologenes strain SD was found as a potential pectinase producer and it is the first report on Chryseobacterium indologenes strain SD. In this investigation, the crude enzyme was found to be slightly alkaline in nature and best active at 40[degrees]C for 40 minutes of incubation. Further studies can be done for complete characterization and purification of the crude enzyme and purified enzymes can be used in various types of fruit juice clarification.

The authors declare no conflicts of interest.

The financial support from the Ministry of Science and Technology and University Grant Commission (UGC), Bangladesh, is thankfully acknowledged.

[1] D. B. Pedrolli, A. C. Monteiro, E. Gomes, and E. C. Carmona, "Pectin and pectinases: production, characterization and industrial application of microbial pectinolytic enzymes," The Open Biotechnology Journal, vol. 3 ، لا. 1, pp. 9-18, 2009.

[2] O. A. Oyewole, S. B. Oyeleke, B. E. N. Dauda, and S. Emiade, "Production of Amylase and Protease Enzymes by Aspergillus niger and Penicillium frequestans Isolated from Abattoir Effluent," Journal of Microbiology, vol. 1 ، لا. 5, pp. 174-180, 2011.

[3] F. Stutzenberger, "Pectinase Production," in Encyclopedia of Microbiology, J. Lederberg, Ed., vol. 3, pp. 327-337, Academy press, New York, NY, USA, 1992.

[4] S. Kaur, H. P. Kaur, B. Prasad, and T. Bharti, "Production and Optimization of Pectinase by Bacillus sp. Isolated From Vegetable Waste Soil," Indo American Journal of Pharmaceutical Research, vol. 6 ، لا. 1, pp. 4185-4190, 2016.

[5] I. Alkorta, C. Garbisu, J. M. Llama, and J. L. Serra, "A Review," Process Biochemistry, vol. 17, pp. 35-41, 1982.

[6] K. Prathyusha and V. Suneetha, "Bacterial pectinases and their potent biotechnological application in fruit processing/Juice production industry: A review," Journal of Phytology, vol. 3 ، لا. 6, pp. 16-19, 2011.

[7] R. C. Dubey and D. K. Maheshwari, "Practical Microbiology," in S. Chand and Co. P Ltd, p. 413, ISBN, New Delhi, 2nd edition.

[8] L. K. Janani, G. Kumar, and K. V. Bhaskara Rao, "Production and Optimization of Pectinase from Bacillus sp. MFW7 using Cassava Waste," Asian Journal of Biochemical and Pharmaceutical Research, vol. 1 ، لا. 2, pp. 329-336, 2011.

[9] S. Kumar, G. Stecher, and K. Tamura, "MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 70 for bigger datasets," Molecular Biology and Evolution, vol. 33, no. 7, pp. 1870-1874, 2016.

[10] D. R. Kashyap, S. Chandra, A. Kaul, and R. Tewari, "Production, purification, and characterization of pectinase from a Bacillus sp," World Journal of Microbiology & Biotechnology, vol. 16, pp. 277-282, 2000.

[11] N. Nelson, "A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose," The Journal of Biological Chemistry, vol. 153, pp. 375-380, 1944.

[12] M. Somogyi, "Notes on sugar determination," The Journal of Biological Chemistry, vol. 195, no. 1, pp. 19-23, 1952.

[13] D. Silva, E. S. Martins, R. Silva, and E. Gomes, "Pectinase production by Penicillium viridicatum RFC3 by solid state fermentation using agro-industrial by-products," Brazilian Journal of Microbiology, vol. 33, pp. 318-324, 2002.

[14] O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr, and R. J. Randall, "Protein measurement with Folin phenol reagent," The Journal ofBiological Chemistry, vol. 193, pp. 265-275, 1951.

[15] S. A. Mehta, R. Mitali, S. Nilofer, and P Nimisha, "Optimization of physicological parameters for pectinase production from soil isolates and its applications in fruit juice clarification," Journal of Environmental Research and Development, vol. 7 ، لا. 4, pp. 1539-1546, 2013.

[16] R. S. Jayani, S. Saxena, and R. Gupta, "Microbial pectinolytic enzymes: a review," Process Biochemistry, vol. 40, no. 9, pp. 2931-2944, 2005.

[17] R. E. Buchannan and N. E. Gibbson, Bergey's manual of determinative Bacteriology, Williams and Wilkins Co, Baltimore, Maryland, USA, 8th edition, 1974.

[18] N. Saitou and M. Nei, "The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees," Molecular Biology and Evolution, vol. 4 ، لا. 4, pp. 406-425, 1987

[19] J. Felsenstein, "Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap," Evolution, vol. 39, pp. 783-791, 1985.

[20] K. Tamura, M. Nei, and S. Kumar, "Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method," Proceedings of the National Acadamy of Sciences of the United States of America, vol. 101, no. 30, pp. 11030-11035, 2004.

[21] G. Aaisha and D. Barate, "Isolation and Identification of Pectinolytic Bacteria from Soil Samples of Akola Region, India," International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, vol. 5 ، لا. 1, pp. 514-521, 2016.

[22] A. B. Saanu, "Pectinolytic Activity of Mutagenic Strain of Leuconostoc Mesenteroides Isolated From Orange and Banana Fruit Waste," Journal of Applied Microbiology and Biochemistry, vol. 1 ، لا. 2:7, pp. 1-6, 2017

[23] O. J. Oumer and D. Abate, "Characterization of Pectinase from Bacillus subtilis Strain Btk 27 and Its Potential Application in Removal of Mucilage from Coffee Beans," Enzyme Research, vol. 2017, Article ID 7686904, 7 pages, 2017.

[24] M. H. Nawawi, R. Mohamad, P M. Tahir, and W. Z. Saad, "Extracellular Xylanopectinolytic Enzymes by Bacillus subtilis ADI1 from EFB's Compost," International Scholarly Research Notices, vol. 2017, Article ID 7831954, 7 pages, 2017

[25] S. Prakash, R. Karthik, M. T. Venthan, B. Sridhar, and P. G. Bharath, "Optimization and Production of Pectinase from Bacillus subtilis (mtcc 441) by using Orange Peel as a Substrate," International Journal of Recent Scientific Research, vol. 5 ، لا. 6, pp. 1177-1179, 2014.

[26] R. S. Jayani, S. K. Shukla, and R. Gupta, "Screening of bacterial strains for polygalacturonase activity: its production by bacillus sphaericus (MTCC 7542)," Enzyme Research, vol. 2010, Article ID 306785, 5 pages, 2010.

[27] A. Thakur, R. Pahwa, S. Singh, and R. Gupta, "Production, purification, and characterization of polygalacturonase from mucor circinelloides ITCC 6025," Enzyme Research, vol. 2010, Article ID 170549, 7 pages, 2010.

[28] N. Torimiro and R. E. Okonji, "A comparative study of pectinolytic enzyme production by Bacillus species," African Journal of Biotechnology, vol. 12 ، لا. 46, pp. 6498-6503, 2013.

[29] M. M. C. N. Soares, R. Da Silva, and E. Gomes, "Screening of bacterial strains for pectinolytic activity: Characterization of the polygalacturonase produced by Bacillus sp," Brazilian Journal of Microbiology, vol. 30 ، لا. 4, pp. 299-303, 1999.

[30] I. G. Khan and D. L. Barate, "Effect of various parameters on activity of pectinase enzyme," International Journal of Advanced Research, vol. 4 ، لا. 1, pp. 853-862, 2016.

<ADD> Karabi Roy (iD), Sujan Dey (iD), Md. Kamal Uddin (iD), Rasel Barua, and Md. Towhid Hossain Department of Microbiology, University of Chittagong, Chittagong 4331, Bangladesh </ADD>

Correspondence should be addressed to Sujan Dey [email protected]

Received 21 September 2017 Revised 24 January 2018 Accepted 11 February 2018 Published 21 March 2018

Academic Editor: Denise Freire

Caption: Figure 1: Zone of pectin hydrolysis on YEP agar medium of isolate K6 after 48-hour incubation.

Caption: Figure 2: Phylogenetic tree constructed on the basis of 16S rRNA gene sequences of Chryseobacterium indologenes strain SD with other Chryseobacterium sp. obtained from GenBank database. Their names and respective accession numbers are shown on the tree.

Caption: Figure 3: Effect of temperature on pectinase activity.

Caption: Figure 4: Effect of pH on pectinase activity.

Caption: Figure 5: Effect of reaction time on pectinase activity.

Caption: Figure 6: Effect of substrate (citrus pectin) concentration on pectinase activity.

Caption: Figure 7: Application of pectinase in apple juice (a) and grape juice (b) clarification.


نتائج ومناقشة

Fungal strains have frequently been reported for the production of industrially important enzymes from waste materials. The hyphal mode of growth enables them to penetrate through the substrate and to utilize fermentable components by elaborating hydrolases. The availability of banana makes its waste, BP, a promising substrate for the fungal fermentation to obtain value-added products. Previously, A. fumigatus was found to have better growth on the banana peels medium when compared to the other fungal strains (Essien et al. 2005). Whereas, the strain MS16 of A. fumigatus reportedly produced cellulase, xylanase, and pectinase on apple peels (Jalis et al. 2014) and other waste materials (Naseeb et al. 2015). Subsequently, the ability of this fungus to produce xylanase and pectinase under submerged and solid-state fermentation of BP is being reported here. Considering the fact that fermentation processes are greatly influenced by environmental conditions and nutritional factors, a comparative study was conducted to investigate the effect of these factors on the production of the enzymes under two different sets of conditions i.e. Smf and SSF.

Submerged fermentation. The studies on the effect of the medium on the enzyme production showed that the maximum activity of xylanase was found in mineral salt medium (MSM), whereas, titers of pectinase were slightly higher in Czapeck dox broth than in MSM (Fig. 1). Therefore, MSM was used in the remaining experiments.

رسم بياني 1.

Effect of medium along with banana peels (BP) on the pec tinase and xylanase production by A. fumigatus MS16 under submerged fermentation.

When the effect of temperature on pectinase production was studied, it was observed that there wasn’t much variation in the titers of pectinase when the cultivation temperature varied from 25 to 35°C (Fig. 2). However, a drastic decrease in the levels of pectinase was observed when the temperature was adjusted to 40°C. Temperature affected the production of xylanase differently as it was observed that Smf could be carried out at a temperature from 20–40°C without affecting the enzyme yield, though titers of the enzymes were slightly higher at 30 and 35°C. This finding was in agreement with the results obtained by Naseeb et al. (2015).

الصورة 2.

Effect of temperature on pectinase and xylanase production under submerged (SmF) and Solid state fermentation (SSF) of banana peels by A. fumigatus MS16.

To investigate the induction of pectinase and xylanase by the corresponding substrate (pectin or xylan), the two substrates were added separately or in combination, in BP containing MSM and the production of both the enzymes was studied. It was noted that pectinase production was enhanced when only pectin or pectin with xylan was added to the MSM + BP (Fig. 3) however, the production was negatively affected if only xylan was added to the MSM + BP. Likewise, xylanase production by MS16 was induced in the presence of xylan supplemented MSM + BP or xylan and pectin containing MSM + BP. Previously, supplementation of pectin and xylan to apple peel powder was found to induce pectinase and xylanase, respectively, under SSF by A. fumigtus MS16 (Jalis et al. 2014).

تين. 3.

Effect of supplementation of pectin and xylan to banana peels containing medium on the production of pectinase and xylanase from A. fumigatus MS16 under solid-state (SSF) and submerged fermentation (Smf).

The pH value of the medium influences the production of an enzyme by regulating the solubility of the nutrients, the permeability of the cell membrane, and ionization of amino acids and/or proteins. Usually, fungal strains grow better under acidic conditions A. fumigates MS16 did not show any exception, indeed a value of 5 as initial pH of the medium favored the production of pectinase (Fig. 4) and pH 6 spurred xylanase production. The production of extracellular enzyme by A. fumigates under acidic conditions using municipal waste as a substrate (Gautam et al. 2011) and xylanase by a mutated strain of A. niger (Haq et al. 2004) was reported previously.

Fig. 4.

Effect of pH on pectinase and xylanase production from A. fumigatus MS16 under submerged fermentation.

In the submerged fermentation the varying concentrations (0.25–1.6%) of BP were tested to determine the optimal concentration for the production of the enzymes. MS16 produced the highest titers of pectinase in MSM with 1% BP and xylanase in 0.25% BP containing medium (Fig. 5).

Fig. 5.

Effect of banana peels concentration on pectinase and xylanase production from A. fumigatus MS16 under submerged fermentation.

After studying optimum levels of the above-mentioned factors, the enzyme production was studied by taking aliquots intermittently and the optimum incubation period for both the enzymes was determined. The data showed that pectinase production was maximum on day six, thereafter, it decreased slightly, while xylanase production dropped significantly when the incubation period extended from five days (data not shown).

Solid-State Fermentation. The production of pectinase and xylanase was also studied in the absence of water, i.e. under SSF. In this case, the optimum levels of the factors were different than was observed for Smf. For instance, a cultivation temperature of 25°C appeared as the most suitable temperature when the production of pectinase was studied under SSF (Fig. 2). Earlier, pectinase production by Fusarium ص. was reportedly found better at a lower temperature (Sohail et al. 2009) while A. niger also produced pectinase under similar conditions (Haq et al. 2004). The production of the enzyme under SSF appeared as sensitive to temperature as the levels of xylanase declined by 50% when the temperature was increased from 35 to 40°C. It can be attributed to poor control of heat transfer under SSF that usually results in an increase in the temperature inside the substrate and hence the enzyme can be denatured or organism’s growth can be restricted. Palaniswamy et al. (2012) also observed the decrease in xylanase production by فطر الرشاشيات ص. in rice bran containing medium at higher temperatures.

In SSF, the xylanase production increased with the supplementation of 0.5% xylan alone or with pectin, while it decreased when the pectin was supplemented without xylan (Fig. 3). The supplementation of pectin and/or xylan did not exert the significant effect on the pectinase production by MS16. In their studies, Rehman et al. (2014) reported about the indifferent pattern of pectinase production upon supplementation of pectin to BP under SSF by a fungal co-culture.

The moisture content is one of the important factors for solid-state fermentation but it did not affect the activity of xylanase it was almost the same but the pectinase activity was maximal at 65% moisture content (Fig. 6) that corroborated with the findings of Padma et al. (2012) where 65% moisture was optimal to obtain the highest levels of polygalactouronase by SSF of BP.

Fig. 6.

Effect of moisture content on pectinase and xylanase production under solid-state fermentation of banana peels.

Finally, the production of the enzyme was studied under optimum conditions for a period of 5–7 days and enzyme activity was assayed. The maximum pectinase was produced in five days of incubation while xylanase production was the highest after seven days of incubation (data not shown).

Factors affecting enzyme activities. The optimum temperatures and pH for the activities of xylanase and pectinase produced under Smf and SSF were also determined. The pectinase activity produced under Smf was found to be the highest at 45°C (Fig. 7) while the enzyme produced under SSF exhibited optimal activity at 60°C. Likewise, xylanase activity produced under SSF had higher temperature optima of 55–60°C compared to the enzyme produced under smf that was optimally active at 50°C. However, the extraction methods to obtain crude enzyme from Smf and SSF differed greatly and might have influenced the stability of the enzymes. Nonetheless, both the enzymes were more heat-stable as compared to the cellulase (Topt 40°C) produced on BP (Kiranmayi et al. 2011).

Fig. 7.

Effect of temperature on pectinase and xylanase activities produced under solid-state (SSF) and submerged fermentation (Smf).

The studies on the effect of pH on the enzyme activity showed that pectinase and xylanase were catalytically most active at pH 5.0 and 5.5 (Fig. 8), respectively, and this property remained unaffected when the production method was changed from Smf to SSF. Generally, fungal enzymes work well under acidic conditions. For instance, Kiranmayi et al. (2011) reported that a value of 6.0 as the most suitable pH for cellulase activity from A. niger on BP as a substrate.

الشكل 8.

Effect of pH on pectinase and xylanase activity produced from A. fumigatus MS16 under solid-state (SSF) and submerged fermentation (Smf).


Questions:

1. What was the optimal temperature for catalase activity? Was the prediction you made correct?

2. What happened to catalase activity at 80˚C? Based on what you know about protein structure, how would you explain that result?

3. What was the optimal pH for catalase activity? Was the prediction you made correct?

4. Can you identify any potential problems or sources of error with the experimental design? How could it be improved?

5. What is the substrate for catalase? What are the products of the reaction?

6. How is the substrate of an enzyme different from the active site?

7. The pH in the stomach is pH 2.0. What do you think the optimum pH is for pepsin, an enzyme that is secreted in the stomach?


شاهد الفيديو: Pectinase - How It Affects Apples and the AmountRate of Juice Produced (كانون الثاني 2022).