معلومة

بقايا ملامسة نيوكليوتيدات HIV-RT


أنا أقوم بالتحقيق في HIV-RT 3KLF و 1LWF في محاولة للعثور على وضع مثالي من الثايمين. ما هي المخلفات الموجودة على HIV-RT التي من المفترض أن يتصل بها Thymine على 3KLF و 1 LWF؟ أين هو بالضبط مجال ربط النوكليوتيدات على 3KLF و 1LWF؟

يرجى تقديم مقال صحفي كدليل.


يجب أن يقوم الثايمين بالاتصال في مكانين على HIV-RT قبل إضافته إلى حبلا النيوكليوتيدات. أول اتصال يتم مع منطقة الأصابع ثم يتم الاتصال في N-Site. تنظيم خيفي للنسخة العكسية لفيروس HIV-1 بواسطة ATP لاختيار النوكليوتيدات


النيوكليوتيدات

الملخص:

النيوكليوتيدات هي نيوكليوسيدات فسفرة. النيوكليوسيد هو مزيج من قاعدة الحمض النووي والسكر. ATP هو نوكليوتيد يشارك في العديد من تفاعلات تحويل الطاقة. NTPs هي اللبنات الأساسية للأحماض النووية. يشار إلى بوليميرات الحمض النووي بالقطب. في خلايا الثدييات ، يتم تحويل الريبونوكليوتيدات إلى ديوكسي ريبونوكليوتيدات على مستوى NDP. DNA و RNA عبارة عن بوليمرات متشابهة هيكليًا. يتم تحويل أحادي الفوسفات النيوكليوزيدية إلى مشتقات ثنائي وثلاثي الفوسفات الخاصة بها عبر نقل الفوسفوريل من ATP. يمكن تصنيع النيوكليوتيدات من جزيئات عضوية صغيرة ، ويتم حفظها من خلال مسارات الإنقاذ.


جون ايه جيرلت

مع توفر التسلسلات الكاملة للجينومات للعديد من البكتيريا eubacteria ، و archaea ، و eukaryotes ، فإن دراسات التركيب / الوظيفة المتوازية للإنزيمات المشتقة من سلف مشترك هي أفضل استراتيجية لتوضيح العلاقات الهيكلية / الوظيفية للتفاعلات المحفزة بالإنزيم. يسمح هذا النهج ، "إنزيم الجينوم" ، بتحديد فعال ودقيق للعلاقات الهيكلية / الوظيفية الأساسية التي تعتبر مهمة في التحفيز. كما يسمح بفهم الاستراتيجيات التي تستخدمها الطبيعة لتطوير إنزيمات "جديدة" ، وبالتالي ، يوفر مبادئ التصميم للتصميم المختبري للأنزيمات الجديدة التي تحفز التفاعلات غير الطبيعية. تعمل دراساتنا على تحسين القدرة على التنبؤ بوظائف البروتينات "غير المعروفة" المكتشفة في مشاريع الجينوم.

نحن ندرس ثلاث عائلات فائقة من الإنزيمات المشتقة من أسلاف مشتركة تشترك في كل مكان (& beta / & alpha)8-طي برميل. تحفز أعضاء عائلة enolase الفائقة التفاعلات الكلية المختلفة التي تبدأ عن طريق تجريد & alpha-proton لأنيون الكربوكسيل لتشكيل أنيون enediolate وسيط يجب أن يستقر بالموقع النشط. أعضاء عائلة D-ribulose 1،5-bisphosphate carboxylase / Oxygenase (RuBisCO) الفائقة. يحفز أعضاء orotidine 5'-monophosphate (OMP) decarboxylase suprafamily تفاعلات مختلفة لا تشترك في أي ميزات ميكانيكية يدعم اكتشافنا لهذه العائلة الفائقة فرضية أن الطبيعة انتهازية ويمكنها تحديد واستخدام قوالب موقع نشطة متعددة الاستخدامات وظيفيًا في التطور من الأنشطة الأنزيمية الجديدة.

نحن أيضًا نكتشف وتميز إنزيمات جديدة تشارك في تحلل اللجنين في الكتلة الحيوية النباتية. يقتصر إنتاج الوقود الحيوي من الكتلة الحيوية النباتية على وصول الإنزيمات المتحللة إلى السليلوز بواسطة اللجنين ، وهو بوليمر معقد من وحدات فينيل بروبانويد. سيسهل تحديد وتوصيف هذه الإنزيمات تصميم أنواع ميكروبية جديدة يمكن استخدامها لتحسين كفاءة إنتاج الوقود الحيوي.

تحتوي المواقع النشطة لأعضاء عائلة enolase الفائقة على موقع ربط محفوظ لـ Mg 2+ الضروري التحفيزي. توجد مجموعات الحمض / القاعدة على حواف "أكواب" المواقع النشطة الموجودة في الأطراف الطرفية C لـ (& beta / & alpha)8- مجالات البرميل ، مع مجموعة وظيفية واحدة تقع في نهاية كل من الخيوط الثمانية والبيتا.

لقد حددنا أكثر من 20 وظيفة داخل عائلة enolase الفائقة ، كل منها يبدأ عن طريق استخراج بروتون & ألفا من الكربوكسيل لتوليد أنيون enolate يتم تثبيته بواسطة Mg 2+ العديد من الركائز عبارة عن سكريات حمضية أو ثنائي الببتيدات. غالبًا ما يكون أفراد العائلة الفائقة منحلون وظيفيًا ، أي بالإضافة إلى تفاعلهم الطبيعي ، فإنهم يحفزون أيضًا رد فعل "عرضيًا" يمكن استغلاله لتطوير نشاط جديد. لقد سمح لنا فهم كيفية توفير البنية المحفوظة لوظائف مختلفة بما يلي: 1) التنبؤ بوظائف المتماثلات غير المعروفة في قواعد بيانات التسلسل و 2) إعادة تصميم الإنزيمات "القديمة" لتحفيز التفاعلات "الجديدة".

أعضاء عائلة RuBisCO الفائقة التي تحفز تجريد & alpha-proton للكيتون لتوليد enolate الذي يتم تثبيته بواسطة Mg 2+ الأساسي. يحفز معظم أفراد الأسرة الفائقة عملية الكربوكسيل لـ D-ribulose 1،5-bisphosphate لإنتاج جزيئين من 2-phosphoglyerate. ومع ذلك ، فقد سمحت مشاريع تسلسل الجينوم بتحديد البروتينات التي تفتقر إلى بقايا الموقع النشطة المطلوبة لثاني أكسيد الكربون2 التثبيت تسمى "البروتينات الشبيهة بـ RuBisCO" أو RLPs.

لقد أنشأنا علاقات هيكلية / وظيفية لعائلة من RLPs التي تحفز تفاعل توتوميرزيشن في مسار إنقاذ الميثيونين ، وكذلك ، حددنا تفاعل أزمرة جديد يتضمن وسيطًا في إنقاذ الميثيونين الذي من المحتمل أن يشارك في مسار إنقاذ جديد غير معهود. تتركز جهودنا على إقامة علاقات هيكلية / وظيفية لأفراد الأسرة الفائقة وكذلك فك رموز المسارات الأيضية التي يشاركون فيها.

عائلة OMP DECARBOXYLASE

يعد OMP decarboxylase ، الخطوة قبل الأخيرة في التخليق الحيوي للنيوكليوتيدات في بيريميدين ، أحد أكثر المحفزات كفاءة في الطبيعة. يتضمن تفاعل نزع الكربوكسيل تشكيل أيون معدني مستقل لمادة فينيل كربونيون وسيطة. نحن ندرس كل من آلية التفاعل ، مع تركيزنا على فهم كيفية استقرار الموقع النشط للوسيط الكربوني بحيث يمكن أن يكون مؤهلًا حركيًا. ندرس أيضًا الآلية الهيكلية التي يتم من خلالها استخدام "طاقة الربط الجوهرية" المرتبطة بمجموعة 5’-فوسفات من الركيزة لتعزيز التحفيز.

لا يشتمل OMP decarboxylase suprafamily على OMP decarboxylase فحسب ، بل يشمل أيضًا 3-keto-L-gulonate 6-phosphate decarboxylase و D-arabino-hex-3-ulose 6-phosphate synthase. على عكس OMP decarboxylase ، كلاهما يستخدم Mg 2+ لتحقيق الاستقرار في anolate anion وسيط. يتم حفظ بقايا الموقع النشط بشكل ملحوظ في الأسرة فوق ، على الرغم من عدم حفظ آليات التفاعلات. يبدو الآن أن قواعد بيانات التسلسل المتنامية تحتوي على أعضاء جدد من العائلة الفوقية التي من المحتمل أن تحفز ردود فعل "جديدة" ، حيث أن اكتشاف هذه التفاعلات قيد التحقيق.

التنازل الوظيفي

مع توسع قواعد بيانات التسلسل (الآن ، تم احتواء أكثر من 11.000.000 تسلسل بروتين فريد في قاعدة بيانات TrEMBL) ، نريد تحديد أعضاء جميع العائلات الثلاثة الفائقة التي لها وظائف غير معروفة - يتم تحديدها في مشاريع الجينوم بغض النظر عن الوظيفة البيولوجية والكيميائية الحيوية . في الواقع ، يعد التخصيص الوظيفي للبروتينات ذات الوظيفة غير المعروفة تحديًا رئيسيًا في علم الأحياء ما بعد الجينوم الذي يحد من فهم نطاق تنوع الطبيعة وأيضًا استغلال هذا التنوع للتطبيقات الطبية الحيوية والصناعية.

لمعالجة هذه المشكلة ، نقود مشروعين ممولين من المعاهد الوطنية للصحة يعملان على تطوير إستراتيجية متكاملة قائمة على التسلسل / الهيكل للتنبؤ بالركائز (وبالتالي الوظائف) لأعضاء غير معروفين من عائلات إنزيمات متنوعة وظيفيًا تم اكتشافها في مشاريع الجينوم. في هذه المشاريع متعددة التخصصات ، يتم الجمع بين الخبراء في البيولوجيا الوظيفية (الإنزيم الميكانيكي) ، والبيولوجيا الهيكلية (علم البلورات بالأشعة السينية) ، والبيولوجيا الحاسوبية (المعلوماتية الحيوية ، والنمذجة ، وفي إرساء السيلكو) ، وعلم الأحياء الدقيقة (علم الوراثة ، وعلم النسخ ، وعلم الأيض) لمعالجة مشكلة التخصيص الوظيفي للبروتينات غير المعروفة. يعكس هذا النهج متعدد التخصصات المتطلبات الفكرية والعملية لتعيين وظائف لأنزيمات غير معروفة / غير مميزة.

يركز مشروع البرنامج (P01GM071790 ، "فك شفرة خصوصية الإنزيم") على العائلات الفائقة enolase المتنوعة الوظيفية و amidohydrolase (Frank Raushel، Texas A&M). منحة الغراء الجديدة (U54GM093342 ، "مبادرة وظيفة الإنزيم") تركز بشكل إضافي على الجلوتاثيون ترانسفيراز المتنوع وظيفيًا (ريتشارد أرمسترونج ، كلية الطب بجامعة فاندربيلت) ، هالوجيناز حمض الهالوكانيك (كارين ألين ، جامعة بوسطن ديبرا دونواي ماريانو ، نيو مكسيكو) ، و isoprenoid synthase (ديل بولتر ، يوتا) العائلات الفائقة. يتولى ستيف ألمو (كلية ألبرت أينشتاين للطب) قيادة إنتاج البروتين وتحديد هيكله. يقدم المتعاونون في UCSF الخبرة في المعلوماتية الحيوية (Patsy Babbitt) ونمذجة التماثل / في رسو ليجند السيليكو (مات جاكوبسون ، وأندريه سالي ، وبريان شويشيت). ويقوم جون كرونان (علم الوراثة) وجوناثان سويدلر (علم الأيض) في إلينوي بالتحقيق في الأدوار الفسيولوجية للأنشطة الأنزيمية الجديدة التي تم اكتشافها من خلال مناهج السيليكو والإنزيمية.

يتم احتواء الكربوهيدرات البوليمرية في الكتلة الحيوية النباتية التي تعتبر المواد الخام للوقود الحيوي في مصفوفة معقدة. لا تتضمن المصفوفة فقط السليلوز البلوري الذي هو بوليمر من الجلوكوز (المصدر الأساسي للوقود الحيوي) ولكن أيضًا كل من هيميسليلوز (بوليمر معقد وغير متجانس من العديد من الكربوهيدرات) واللجنين. يمنع الهيميسليلوز واللجنين ، معًا "lignocellulose" ، وصول الإنزيمات المحللة للسليلوز إلى السليلوز ، مما يقلل من كفاءة إنتاج الوقود الحيوي. تم وضع مناهج صناعية لتحلل مادة اللجنوسليلوز ، على سبيل المثال ، المعالجة بالحمض والقلويات و / أو الحرارة ، ولكنها ليست فعالة بشكل خاص أو صديقة للبيئة. الهدف من برنامجنا هو ابتكار مناهج ميكروبيولوجية وكيميائية حيوية لتحلل اللجنين بحيث يمكن تحويل الكتلة الحيوية النباتية بشكل أكثر كفاءة إلى وقود.

يحتوي اللجنين ، وهو بوليمر معقد من وحدات فينيل بروبانويد ، على أنواع عديدة من الروابط الكيميائية التي لا توفر فقط الاستقرار الميكانيكي ولكن أيضًا مقاومة التدهور الكيميائي. نظرًا لأن العديد من الروابط تتضمن بنى عطرية مستقرة ، فقد تم استخدام إجراءات صارمة غير أنزيمية لإزالة البلمرة. تم الإبلاغ عن سلالات Streptomyces لإزالة بلمرة اللجنين ، ومع ذلك ، لم يتم تحديد الإنزيمات المؤكسدة والتحلل المائي المتضمنة في هذه العملية. نحن نركز على اكتشاف هذه الإنزيمات الجديدة وتوصيفها لأنها قد توفر نهجًا أكثر كفاءة وصديقًا للبيئة لإزالة بلمرة اللجنين.

تتمثل أهداف هذا البرنامج في 1) استخدام تسلسل الجينوم لاكتشاف المسارات التدهورية للجنين 2) تحديد خصائص الإنزيمات في تلك المسارات ميكانيكيًا وهيكليًا و 3) تصميم مسارات أيضية جديدة بحيث يمكن تسهيل تدهور اللجنين وتعزيز إنتاج الوقود الحيوي.

هذا البرنامج مدعوم من معهد الطاقة الحيوية (بتمويل من شركة بريتيش بتروليوم) ويتضمن أيضًا جون كرونان (علم وظائف الأعضاء الميكروبيولوجية وعلم الوراثة الميكروبيولوجي) وساتيش ناير (تحديد بنية الأشعة السينية للكيمياء الحيوية).

المنشورات التمثيلية

تطور متباين في عائلة Enolase الفائقة: استراتيجيات لتعيين الوظائف ، J.A. J. بيول. تشيم. 2012, 287, 29-34.

نماذج متجانسة دليل اكتشاف الخصائص المتنوعة للأنزيم بين ثنائي الببتيد Epimerases في Enolase Superfamily ، T. Lukk. A. Sakai، C. Kalyanaraman، SD Brown، HJ Imker، L. Song، AA Fedorov، EV Fedorov، R. Toro، B. Hillerich، R. Seidel، Y. Patsklvsky، MV Vetting، SK Nair، PC Babbitt، SC ألمو وجا جيرلت وعضو البرلمان جاكوبسون ، بروك. نات. أكاد. Sci USA 2012, 109, 4122-4127.

OMP Decarboxylase: تُستخدم طاقة ربط الفوسفوديانيون لتثبيت وسيط فينيل كاربانيون و B. Goryanova و T.L Amyes و J.A Gerlt و J.P Richard ، ج. عامر. تشيم. شركة 2011, 133, 6545-6548.

آلية تفاعل Orotidine 5’-Monophosphate Decarboxylase: Importance of Residues in the Orotate Binding Site، V. Iiams، B. J. Desai، A. A. Fedorov، E.V Fedorov، S.C Almo، and J. A. GERLT، Biochemistry 2011، 50، 8497-8507.

مبادرة وظيفة الإنزيم ، JA GERLT ، KN Allen ، SC Almo ، RN Armstrong ، PC Babbitt ، JE Cronan ، D. Dunaway Mariano ، HJ Imker ، MP Jacobson ، W. Minor ، CD Poulter ، FM Raushel ، A. Sali ، BK Shoichet و JV Sweedler ، الكيمياء الحيوية 2011, 50, 9950-9962.

تنشيط R235A Mutant Orotidine 5'-Monophosphate Decarboxylase بواسطة Guanidinium Cation: المولارية الفعالة للسلسلة الجانبية الكاتيونية لـ Arg-235 ، S.A Barnett ، T.L Amyes ، B.M Wood ، J. A. Gerlt ، and J P. الكيمياء الحيوية 2010, 49, 824-826.

التغييرات المطابقة في Orotidine 5’-Monophosphate Decarboxylase: "Remote" Residues that Stabilize the Active Conformation، B.M Wood، T.L Amyes، A. A. Fedorov، E.V Fedorov، A. Shabila، S.C Almo، J.P Richard، and J. A. Gerlt، الكيمياء الحيوية 2010, 49, 3514-3516.

تأثيرات نظائر الديوتيريوم على Orotidine 5 'Monophosphate Decarboxylase: تأثير تغيير بنية الركيزة والإنزيم على تقسيم وسيط تفاعل كاربانيون الفينيل ، K. Toth ، T. L. Amyes ، B. M. Wood ، K. Chan ، J. A. Gerlt ، and J. P. ج. عامر. تشيم. شركة 2010, 132, 7018-7024.

تصميم إنزيم (إعادة): دروس من التطور الطبيعي والحساب ، جيه إيه جيرلت وبي سي بابيت ، بالعملة. رأي. تشيم. بيول. 2009, 13, 10-18.

آلية تفاعل Orotidine 5 'Monophosphate Decarboxylase المحفز: تأثير لزوجة المذيب على الثوابت الحركية ، B.M Wood ، K.K Chan ، T.L Amyes ، J.P Richard and J A. الكيمياء الحيوية, 2009, 48, 5510-5517.

آلية تفاعل Orotidine 5 'Monophosphate Decarboxylase المحفز: دليل على عدم استقرار الركيزة ، K. K. Chan ، B. McKay Wood ، A. A. Fedorov ، E.V Fedorov ، T. L. Amyes ، J.P Richard ، S. C. Almo ، and J. A. GERLT ، الكيمياء الحيوية, 2009, 48, 5518-5531.

Acetoacetate Decarboxylase: Hydrophobics، Not Electrostatics (الأخبار والمشاهدات)، J. A. GERLT، علم الطبيعة. بيول. 2009, 5, 454-455.

العلاقة بين حجم حلقة الموقع النشط ومعلمات التنشيط الديناميكي الحراري لـ Orotidine 5’-Monophosphate Decarboxylase من Mesophilic and Thermophilic organisms ، K. Toth ، T. L. Amyes ، B. M. Wood ، K. K. الكيمياء الحيوية 2009, 48, 8006-8013.

التخصيص المُيسّر للحساب للوظيفة في عائلة Enolase الفائقة: إنزيم Galactarate Dehydratase المتميز من الناحية الكيميائية من Oceanobacilus iheyensis و JR Rakus و C. Kalyanaraman و AA Fedorov و EV Fedorov و FP Mills Groninger و R. Toro و J. Bonanno و K. Bain و R. سعودر ، إس كيه بورلي ، إس سي ألمو ، النائب جاكوبسون ، وجا جيرلت ، الكيمياء الحيوية 2009, 48, 11546-11558.


الإنسان RNase H2

يشتمل Human RNase H2 على ثلاث وحدات فرعية - الوحدة الفرعية الحفزية تشبه إلى حد بعيد الإنزيمات البكتيرية الأحادية والإنزيمات البدائية بينما لا تشترك الوحدتان الفرعيتان المتبقيتان في تشابه التسلسل مع أي بروتينات أخرى معروفة. تؤدي الطفرات في RNase H2 البشري إلى مرض مناعي ذاتي وراثي شديد - متلازمة إيكاردي جوتيير.

Figiel M ، Chon H ، Cerritelli SM ، Cybulska M ، Crouch RJ ، Nowotny M. يكشف التوصيف الهيكلي والكيميائي الحيوي لمركب RNase H2 البشري عن الأساس الجزيئي للتعرف على الركيزة وعيوب متلازمة إيكاردي جوتيريس. J. بيول. تشيم., 2011 286:10540-50

التركيب البلوري للـ RNase H2 البشري.

تم تعيين جميع الطفرات من مرضى AGS وتأثيرها على بنية وآلية الإنزيم المقترح.

التركيب البلوري لـ RNase H2 البشري. تظهر الوحدة التحفيزية باللون الأصفر والوحدات المساعدة باللون الأرجواني باللون الأزرق.


3.5 الأحماض النووية

بنهاية هذا القسم ، ستكون قادرًا على القيام بما يلي:

  • وصف بنية الأحماض النووية وتحديد نوعي الأحماض النووية
  • اشرح بنية الحمض النووي ودوره
  • اشرح بنية RNA وأدوارها

الأحماض النووية هي أهم الجزيئات لاستمرارية الحياة. إنهم يحملون المخطط الجيني للخلية ويحملون تعليمات لعملها.

DNA و RNA

النوعان الرئيسيان من الأحماض النووية هما الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA). الحمض النووي هو المادة الجينية في جميع الكائنات الحية ، بدءًا من البكتيريا وحيدة الخلية إلى الثدييات متعددة الخلايا. إنه موجود في نواة حقيقيات النوى وفي العضيات والبلاستيدات الخضراء والميتوكوندريا. في بدائيات النوى ، لا يكون الحمض النووي محاطًا بغلاف غشائي.

المحتوى الجيني الكامل للخلية هو جينومها ، ودراسة الجينوم هي علم الجينوم. في الخلايا حقيقية النواة ولكن ليس في بدائيات النوى ، يشكل الحمض النووي مركبًا مع بروتينات هيستون لتكوين الكروماتين ، وهو مادة الكروموسومات حقيقية النواة. قد يحتوي الكروموسوم على عشرات الآلاف من الجينات. تحتوي العديد من الجينات على المعلومات اللازمة لصنع منتجات بروتينية. كود الجينات الأخرى لمنتجات الحمض النووي الريبي. يتحكم الحمض النووي في جميع الأنشطة الخلوية عن طريق "تشغيل" أو "إيقاف" الجينات.

النوع الآخر من الحمض النووي ، RNA ، يشارك في الغالب في تخليق البروتين. لا تغادر جزيئات الحمض النووي النواة أبدًا ولكنها تستخدم وسيطًا للتواصل مع بقية الخلية. هذا الوسيط هو الرسول RNA (mRNA). أنواع أخرى من الرنا - مثل الرنا الريباسي ، الرنا المرسال ، و الرنا الميكروي - تشارك في تخليق البروتين وتنظيمه.

يتكون DNA و RNA من مونومرات يسميها العلماء نيوكليوتيدات. تتحد النيوكليوتيدات مع بعضها البعض لتشكيل عديد النيوكليوتيدات أو الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. ثلاثة مكونات تتكون من كل نوكليوتيد: قاعدة نيتروجينية ، بنتوز (خمسة كربون) سكر ، ومجموعة فوسفات (الشكل 3.31). ترتبط كل قاعدة نيتروجينية في نوكليوتيد بجزيء سكر ، والذي يرتبط بمجموعة أو أكثر من مجموعات الفوسفات.

القواعد النيتروجينية ، وهي مكونات مهمة للنيوكليوتيدات ، هي جزيئات عضوية وسميت بهذا الاسم لأنها تحتوي على الكربون والنيتروجين. إنها قواعد لأنها تحتوي على مجموعة أمينية لديها القدرة على ربط هيدروجين إضافي ، وبالتالي تقليل تركيز أيون الهيدروجين في بيئتها ، مما يجعلها أكثر أساسية. يحتوي كل نيوكليوتيد في الحمض النووي على واحدة من أربع قواعد نيتروجينية محتملة: الأدينين (A) والجوانين (G) والسيتوزين (C) والثيمين (T).

يصنف العلماء الأدينين والجوانين على أنها بورينات. هيكل البيورين الأساسي هو حلقتان من الكربون والنيتروجين. يصنف العلماء السيتوزين ، الثايمين ، واليوراسيل على أنها بيريميدين التي لها حلقة كربون-نيتروجين واحدة كهيكلها الأساسي (الشكل 3.31). كل من حلقات الكربون والنيتروجين الأساسية هذه لها مجموعات وظيفية مختلفة مرتبطة بها. في اختزال البيولوجيا الجزيئية ، نعرف القواعد النيتروجينية برموزها A و T و G و C و U. يحتوي DNA على A و T و G و C بينما يحتوي RNA على A و U و G و C.

سكر البنتوز في الحمض النووي هو ديوكسيريبوز ، وفي الحمض النووي الريبي ، السكر هو ريبوز (الشكل 3.31). الفرق بين السكريات هو وجود مجموعة الهيدروكسيل على ثاني كربون الريبوز وهيدروجين على ثاني أكسيد ريبوز الكربون. يتم ترقيم ذرات الكربون في جزيء السكر على أنها 1 و 2 و 3 و 4 و 5 (1 ′ تقرأ على أنها "عدد أولي واحد"). تلتصق بقايا الفوسفات بمجموعة الهيدروكسيل المكونة من 5 كربون لسكر واحد ومجموعة الهيدروكسيل المكونة من 3 كربون من سكر النوكليوتيد التالي ، والتي تشكل رابطة 5′ - 3 phosphodiester. تفاعل الجفاف البسيط مثل الروابط الأخرى التي تربط المونومرات في الجزيئات الكبيرة لا يشكل رابط الفوسفوديستر. يتضمن تكوينه إزالة مجموعتين من الفوسفات. قد يحتوي عديد النيوكليوتيد على آلاف من روابط الفوسفوديستر هذه.

هيكل DNA مزدوج الحلزون

الحمض النووي له هيكل مزدوج الحلزون (الشكل 3.32). يقع السكر والفوسفات على السطح الخارجي للحلزون ، ويشكلان العمود الفقري للحمض النووي. القواعد النيتروجينية مكدسة في الداخل ، مثل زوج من درجات السلم. تربط الروابط الهيدروجينية الأزواج ببعضها البعض. يتم فصل كل زوج أساسي في اللولب المزدوج عن الزوج الأساسي التالي بمقدار 0.34 نانومتر. يعمل خصلتا اللولب في اتجاهين متعاكسين ، مما يعني أن الطرف المكون من 5-كربون لخيط واحد سيواجه نهاية 3-كربون من خيطه المطابق. (يطلق العلماء على هذا التوجه المضاد وهو مهم لتكرار الحمض النووي وفي العديد من تفاعلات الحمض النووي.)

يُسمح فقط بأنواع معينة من الاقتران الأساسي. على سبيل المثال ، يمكن أن يقترن بورين معين فقط مع بيريميدين معين. هذا يعني أنه يمكن أن يقترن A مع T ، ويمكن أن يقترن G مع C ، كما يوضح الشكل 3.33. هذه هي القاعدة التكميلية الأساسية. وبعبارة أخرى ، فإن خيوط الحمض النووي مكملة لبعضها البعض. إذا كان تسلسل حبلا واحد هو AATTGGCC ، فإن الخيط التكميلي سيكون له تسلسل TTAACCGG. أثناء تكاثر الحمض النووي ، تنسخ كل خصلة نفسها ، مما ينتج عنه حلزون مزدوج للحمض النووي ابنة يحتوي على خيط DNA أبوي واحد وخيط مركب حديثًا.

اتصال مرئي

تحدث طفرة ، ويحل الأدينين محل السيتوزين. ما هو التأثير الذي تعتقد أنه سيكون له على بنية الحمض النووي؟

يشارك الحمض النووي الريبي ، أو RNA ، بشكل أساسي في عملية تخليق البروتين تحت إشراف الحمض النووي. عادة ما يكون الحمض النووي الريبي أحادي الجديلة ويتكون من ريبونوكليوتيدات مرتبطة بروابط الفوسفوديستر. يحتوي الريبونوكليوتيد الموجود في سلسلة الحمض النووي الريبي على ريبوز (سكر البنتوز) ، وهو أحد القواعد النيتروجينية الأربعة (A ، و U ، و G ، و C) ، ومجموعة الفوسفات.

هناك أربعة أنواع رئيسية من الرنا: الرنا المرسال (الرنا) ، الرنا الريبوزومي (الرنا) ، الرنا الناقل (الرنا) ، الرنا المجهري (الميرنا). الأول ، mRNA ، يحمل الرسالة من الحمض النووي ، الذي يتحكم في جميع الأنشطة الخلوية في الخلية. إذا كانت الخلية تتطلب تخليق بروتين معين ، فإن الجين الخاص بهذا المنتج "يعمل" ويقوم الحمض النووي الريبي المرسال بتوليف النواة. تسلسل قاعدة الحمض النووي الريبي مكمل لتسلسل تشفير الحمض النووي الذي تم نسخه منه. ومع ذلك ، في RNA ، القاعدة T غائبة و U موجودة بدلاً من ذلك. إذا كان حبلا DNA يحتوي على تسلسل AATTGCGC ، فإن تسلسل الحمض النووي الريبي التكميلي هو UUAACGCG. في السيتوبلازم ، يتفاعل الرنا المرسال مع الريبوسومات والآلات الخلوية الأخرى (الشكل 3.34).

تتم قراءة الرنا المرسال في مجموعات من ثلاث قواعد تعرف باسم الكودونات. يرمز كل كودون لحمض أميني واحد. بهذه الطريقة ، يتم قراءة mRNA ويتم تصنيع منتج البروتين. الرنا الريبوسومي (الرنا الريباسي) هو مكون رئيسي للريبوسومات التي يرتبط بها الرنا المرسال. يضمن الرنا الريباسي المحاذاة الصحيحة لمرنا والريبوزومات. يحتوي الرنا الريباسي للريبوسوم أيضًا على نشاط إنزيمي (بيبتيديل ترانسفيراز) ويحفز تكوين رابطة الببتيد بين اثنين من الأحماض الأمينية المتوافقة. RNA الناقل (tRNA) هو واحد من أصغر الأنواع الأربعة من الحمض النووي الريبي ، وعادة ما يكون بطول 70-90 نيوكليوتيد. يحمل الحمض الأميني الصحيح إلى موقع تخليق البروتين. إن الاقتران الأساسي بين الحمض الريبي النووي النقال و الرنا المرسال هو الذي يسمح للحمض الأميني الصحيح بإدخال نفسه في سلسلة البولي ببتيد. MicroRNAs هي أصغر جزيئات RNA وينطوي دورها على تنظيم التعبير الجيني عن طريق التدخل في التعبير عن رسائل معينة من mRNA. يلخص الجدول 3.2 ميزات DNA و RNA.

الحمض النووي RNA
وظيفةيحمل معلومات وراثيةتشارك في تخليق البروتين
موقعيبقى في النواةيترك النواة
بنيةالحلزون المزدوجعادة واحدة تقطعت بهم السبل
سكرديوكسيريبوزريبوز
بيريميدينالسيتوزين ، الثايمينالسيتوزين ، اليوراسيل
البيوريناتعدنين ، جوانينعدنين ، جوانين

على الرغم من أن RNA تقطعت به السبل أحاديًا ، فإن معظم أنواع RNA تُظهر اقترانًا قاعديًا واسعًا داخل الجزيء بين المتواليات التكميلية ، مما يخلق بنية ثلاثية الأبعاد يمكن التنبؤ بها ضرورية لوظيفتها.

كما تعلمت ، فإن تدفق المعلومات في الكائن الحي يحدث من الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي إلى البروتين. يفرض الحمض النووي بنية الرنا المرسال في عملية يسميها العلماء النسخ ، ويحدد الحمض النووي الريبي بنية البروتين في عملية يسميها العلماء الترجمة. هذه هي العقيدة المركزية للحياة ، والتي تنطبق على جميع الكائنات الحية ، ومع ذلك ، تحدث استثناءات للقاعدة فيما يتعلق بالعدوى الفيروسية.

ارتباط بالتعلم

لمعرفة المزيد عن الحمض النووي ، استكشف الرسوم المتحركة الحيوية التفاعلية الحيوية لمعهد هوارد هيوز الطبي حول موضوع الحمض النووي.


نتائج

يُظهر eEF1A ارتباطًا قويًا ومباشرًا بـ HIV-1 RT

لمزيد من توصيف الارتباط بين مجمع eEF1 و RTC ، استخدمنا مقايسات التداخل biolayer (BLI) لتحديد ما إذا كانت وحدة فرعية معينة من مجمع eEF1 يمكن أن ترتبط مباشرة بـ RT أو IN. تستخدم طريقة BLI نمط التداخل للضوء الأبيض المنعكس من سطحين على مسبار المستشعر الحيوي: طبقة من البروتين غير المتحرك ذي الأهمية وطبقة مرجعية داخلية. يؤدي أي تغيير في عدد الجزيئات المرتبطة بطرف المستشعر الحيوي بسبب تفاعل البروتين البروتين إلى حدوث تحول في نمط التداخل الذي يمكن قياسه. تم تعقيم مغاير RT p66 / p51 المنقى بيوتينيليًا وتثبيته على جهاز استشعار حيوي لنظام Octet-Red المطلي بالستربتافيدين. تم تقييم تفاعل RT p66 / 51 مع الوحدات الفرعية الفردية لمجمع eEF1 ، بما في ذلك eEF1A و eEF1B و eEF1G و eEF1D ، باستخدام حلول تحتوي على 60 نانومتر من وحدات eEF1 المؤتلفة الفردية. أظهر eEF1A فقط ارتباطًا قويًا بـ RT ، بينما لوحظ ارتباط ضعيف بين eEF1B و eEF1G مع RT ولم يتم اكتشاف أي تفاعل بين eEF1D و RT في ظل الظروف التي تم اختبارها (الشكل 1 أ). تم إجراء تجربة مماثلة باستخدام جهاز استشعار حيوي المسمى بـ HIV-1 IN ونفس الوحدات الفرعية eEF1. أظهرت جميع الوحدات الفرعية لـ eEF1 تفاعلًا ضعيفًا جدًا أو ضئيلًا مع IN (الشكل 1B). أجرينا تجربة متبادلة تم فيها تسمية أجهزة الاستشعار الحيوية بوحدات فرعية eEF1 فردية واحتضانها بمحاليل تحتوي على مغاير RT عند 90 و 30 و 10 نانومتر. تم اكتشاف ارتباط يعتمد على التركيز لـ eEF1A مع RT جنبًا إلى جنب مع ارتباط ضعيف لـ eEF1B (S1 الشكل). تشير هذه النتائج إلى أن ارتباط HIV-1 RTC مع مركب eEF1 ، كما تم تحديده في دراستنا المبكرة [9] ، يحدث من خلال الارتباط المباشر بين مكونات RT و eEF1A للمجمعين ، على التوالي.

(أ) مقايسات تداخل الطبقة الحيوية (BLI) لمستشعر حيوي لفيروس HIV RTp66 / p51 مع 60 نانومتر من تنقية eEF1A أو eEF1B أو eEF1D أو eEF1G أو BSA كتحليل. (ب) مقايسات BLI باستخدام مستشعر حيوي محمّل بيوتينيل HIV-1 كما هو موصوف في (أ). (ج) عنوان IP المشترك لـ RT مع eEF1A. تم نقل خلايا HEK 293T بالبلازميدات للتعبير عن RTp66 أو RTp51 أو RTp51 أو RTp66 أو Gag بعلامة FLAG. تم تأكيد التعبير عن البروتينات في محللات الخلية بواسطة لطخة غربية باستخدام جسم مضاد لـ FLAG (اللوحة العلوية). تم استخدام محلول الخلية لتحليل IP المشترك مع جسم مضاد للقبض على الأرانب مضاد لـ eEF1A. تم فحص التقاط الوحدات الفرعية RT و Gag بواسطة لطخة غربية بجسم مضاد لـ FLAG (اللوحة الثانية). تم استخدام لطخة غربية مع جسم مضاد للفأر مضاد لـ eEF1A لتأكيد التقاط eEF1A (اللوحة الثالثة). تم استبعاد الارتباط غير المحدد بالخرز بواسطة IP باستخدام جسم مضاد للقبض IgG مضاد للأرنب متبوعًا بصمة غربية باستخدام جسم مضاد لـ FLAG (اللوحة السفلية). (د) تمت معالجة خلايا HEK293T باستخدام اثنين من سيرنا eEF1A ، أو سيرنا تحكم واحد أو بدون سيرنا لمدة 48 ساعة قبل تحضير محللة الخلية. تم تحديد مستويات eEF1A (اللوحة العلوية) و tubulin (اللوحة السفلية) في محللة الخلية بواسطة لطخة غربية. تم استخدام تحليل قياس الكثافة لصورة اللطخة الغربية لحساب المستويات النسبية لـ eEF1A في كل عينة تمت معالجتها بـ siRNA مقارنةً بالتحكم غير المعالج (ه) Sensorgrams للارتباط والتفكك لمحللات الخلية التي تحتوي على مستويات مختلفة من eEF1A إلى المستشعرات الحيوية RTp66. (F) أدت إضافة بروتين MYC / DDK-eEF1A1 المنقى إلى محلول الخلية حيث تم تقليل eEF1A بشدة بواسطة علاج siRNA إلى استعادة ملف تعريف الاستشعار الذي يشير إلى تفاعل RT القوي. تم إجراء جميع التجارب ثلاث مرات على الأقل وتم عرض النتائج التمثيلية.

بعد ذلك ، قمنا بمقارنة تفاعل الوحدات الفرعية RT الفردية أو المغير المتغاير مع eEF1A باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية التي تحمل علامة eEF1A. تم تضمين بروتين HIV-1 Gag ، وهو بروتين مرتبط بـ eEF1A تم الإبلاغ عنه مسبقًا [12] كعنصر تحكم. أظهرت فحوصات BLI تفاعلًا يعتمد على التركيز بين البروتينات المختبرة (S2 الشكل). تمت الإشارة إلى ملاءمة المنحنى من خلال انخفاض واضح χ 2 من 1.07 إلى 2.12 ، حيث يعتبر أقل من 10 مقبولًا [13]. كشفت النتائج المجمعة عن تسلسل هرمي ملزم حيث RTp66 RTp66 / p51 & gt RTp51 & gt Gag. يعتبر حرف Kد من eEF1A مع الوحدات الفرعية RT تراوحت من 3-4 نانومتر لـ RTp66 و RTp66 / p51 و RTp51 و 21 نانومتر لـ Gag في ظل الظروف التي تم اختبارها ، مما يشير إلى أن كل وحدة فرعية RT يمكن أن تشكل مجمع بروتين مستقر مع eEF1A (الجدول 1).

تم تأكيد ارتباط الوحدات الفرعية RT و Gag مع eEF1A باستخدام تجارب الترسيب المناعي المشترك (co-IP). تم التعبير عن الوحدات الفرعية RT و Gag ، كل منها بعلامة FLAG- طرفية C ، في خلايا HEK293T بشكل فردي أو مجتمعة (الشكل 1C). تم تحضين محللات الخلية المحضرة على مدار 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع حبيبات agarose مترافقة بالبروتين G مرتبطة بجسم مضاد لـ eEF1A من الأرانب. أشار تحليل اللطخة الغربية للبروتينات المناعية إلى أن الوحدات الفرعية RT المرتبطة بـ eEF1A أفضل من Gag (الشكل 1C). أظهرت تجربة IP متبادلة أن RTp51 يمكن أن تشارك IP eEF1A (S3 الشكل). تشير بياناتنا المجمعة إلى أن eEF1A يتفاعل مع الوحدات الفرعية RT الفردية أو مغاير RT بشكل مباشر وقوي.

نظرًا لأن eEF1A عبارة عن بروتين خلوي وفير يربط بشدة فيروس HIV-1 RT ، فمن الممكن أن يكون eEF1A هو بروتين رابط خلوي سائد لـ RT. لفحص هذا الاحتمال ، تم تخفيض مستويات eEF1A باستخدام siRNAs الموصوفة سابقًا [9] وتم فحص ارتباط البروتين الخلوي الكلي بمستشعر حيوي RTp66 / p51 بواسطة BLI. في BLI فقط الجزيئات التي ترتبط بالمستشعر الحيوي أو تنفصل عنه يمكنها تغيير نمط التداخل. ومن ثم يمكن استخدام محللة الخلية الخام في فحوصات BLI للتحقيق في تفاعل البروتين والبروتين [14]. تمت مراقبة تركيز البروتين في محللات التحكم والمعالجة بـ siRNA بعناية باستخدام محلل بيولوجي وتم تأكيده بواسطة لطخة غربية باستخدام جسم مضاد لـ tubulin (الشكل 1D ، اللوحة السفلية). خفضت lysates الخلوية المعالجة بـ eEF1A siRNA1 و siRNA2 مستويات eEF1A من & gt80٪ و & gt40٪ على التوالي ، وأظهرت ارتباطًا أقل مع المستشعر الحيوي RT مقارنةً بالمحللات من الخلايا المعالجة بـ siRNA للتحكم ومحللات الخلايا غير المعالجة (الشكل 1E) ، والتي ترتبط بـ مستويات eEF1A الموجودة في كل خلية محللة (الشكل 1D ، اللوحة العلوية). أدت إضافة eEF1A المنقى بعلامة MYC / DDK إلى محلول الخلية المستنفد eEF1A إلى استعادة استجابة تداخل BLI (الشكل 1F) مما يوضح أن منحنيات الاستجابة تعكس مستويات eEF1A في الخلايا الخلوية. تقدم النتائج دليلاً على أن eEF1A هو بروتين رابط سائد في الخلايا لـ RT.

مجالات الإبهام والاتصال في RT مهمان للتفاعل مع eEF1A

لتحديد منطقة RT التي تعتبر مهمة للتفاعل مع eEF1A ، تم إجراء سلسلة من عمليات الحذف الطرفية C لنطاقات RT ، كل منها تم تمييزه بحلقة C-terminal V5 (الشكل 2A). تم نقل النوع البري أو بلازميدات التعبير RT المتحولة إلى خلايا HEK293T وتم إجراء لطخات غربية لإظهار أنه تم التعبير عن جميع بروتينات RT (الشكل 2C ، اللوحة العلوية). أظهر الترسيب المناعي لـ eEF1A انخفاضًا في IP المشترك لـ RT عندما تم حذف مجال الاتصال ، ولم يتم اكتشاف IP المشترك عندما تم حذف مجالات الإبهام والاتصال (الشكل 2C ، اللوحة الوسطى). تشير النتائج إلى أن مجالات الإبهام والاتصال RT مطلوبة للتفاعل مع eEF1A. تم إجراء سلسلة أخرى من عمليات الحذف الداخلية والطرفية N في RT لمزيد من التحقيق في الدور الذي يلعبه مجالي الإبهام والاتصال في تفاعل eEF1A (الشكل 2 ب). التعبير البلازميد الذي يحتوي فقط على الإبهام ومجالات الاتصال (RT-ΔF + P) يعبر عن البروتين بمستويات منخفضة (الشكل 2D ، اللوحة العلوية) ولكن تم تحصينه بقوة بواسطة eEF1A (الشكل 2D ، اللوحة الوسطى) ، مما يؤكد أن الإبهام و تعد مجالات الاتصال مهمة للربط بـ eEF1A. The RT thumb domain (residues 244–323) contains 3 alpha helices: helix H (residue 255–268), helix I (residues 278–286) and helix J (residues 298–311). Three RT constructs having internal deletions in the thumb domain were made to see if the entire thumb domain or a specific region was required for interaction with eEF1A. Deletion of the whole thumb domain, deletion of helix H alone and deletion of helices I and J combined, each resulted in a reduced co-IP of RT with eEF1A (Fig 2D). The combined data show that the connection and thumb domains of RT are required for interaction with eEF1A where multiple binding determinants in these domains mediate a stable protein interaction with eEF1A.

(أ و ب) Schematic diagrams representing V5-tagged RT truncation and deletion mutants, indicating important RT domains. (ج و د) Lysates from cells transiently expressing each wild type or mutant RT subunit, as indicated (top panels), were immunoprecipitated with an anti-eEF1A antibody and analyzed by western blot with an anti-V5 antibody (middle panels). Nonspecific binding to the beads was excluded by IP using an anti-rabbit IgG capture antibody followed by western blot using an anti-V5 antibody (bottom panels). (ه) Lysates from transiently transfected cells expressing RTp51-V5 having non-overlapping mutations consisting of 5 consecutive alanine substitutions, (F) overlapping double alanine substitutions), or (جي) single alanine substitutions (top panels) were visualized by western blot. Co-IP of RTp51 and RTp66 proteins using an anti-eEF1A antibody were visualized by western blot with an anti-V5 antibody (middle panels). Nonspecific binding to the beads was excluded by IP using an anti-rabbit IgG capture antibody followed by western blot using an anti-V5 antibody (bottom panels). All experiments were performed at least three times and representative results are shown.

Alanine substitution mutagenesis reveals residues in the thumb domain critical for RT interaction with eEF1A

As deletion of either N- or C-terminal regions of the RT thumb domain impaired the RT-eEF1A interaction, we used alanine substitution mutations to screen positions in the thumb domain that could mediate the RT-eEF1A interaction. We mutated the RTp51-V5 expression plasmid to make 15 non-overlapping substitutions consisting of 5 consecutive alanine residues that covered the thumb domain of RT. The RT expression plasmids were individually transfected into HEK293T cells and western blots of cell lysates prepared from the cells showed that each RT protein was made (Fig 2E, top panels). Co-IP analysis using an anti-eEF1A antibody identified mutations in two regions of the thumb domain, residues 249–253 and 294–313, that downregulated association of RT p51 with eEF1A (Fig 2E, middle panels). The mutation of residues 249–253 was investigated further by introducing overlapping double alanine mutations to make four new mutant RTp51-V5 expression plasmids: 249-250A, 250-251A, 251-252A and 252-253A. Co-IP experiments showed that the alanine substitutions 251-252A and 252-253A impaired interaction with eEF1A (Fig 2F), suggesting that W252 is important for the interaction. Single alanine substitutions at residues W252 or T253 were further evaluated and the W252A mutation significantly inhibited co-IP of RT with eEF1A, while the effect of the T253A mutation was minor compared to co-IP of wild type RT (Fig 2G). The result indicates that maintenance of W252 in RT is particularly important for its interaction with eEF1A.

The W252A mutation is important for RT structure but does not impair heterodimer formation

The X-ray crystal structure of the HIV-RT p66/p51 heterodimer (PDB B ID: 4G1Q, resolution 1.51 Å) [15] is shown (S4 Fig). The individual subunits that make up the heterodimer are identical in sequence, with the exception of the additional domain present in p66, absent in p51 (Fig 3A). The finger and palm structural domains in both subunits are made up from discontinuous regions of sequence. Structurally, the W252A mutation is located within the loop region that links the palm domain to the thumb domain, proximal to the first alpha-helix of the thumb domain, but distal to the inter-subunit interface (S4 Fig). The bulky aromatic side-chain of W252 is completely buried within the core of the protein, and supports numerous hydrophobic interactions with spatially proximal residues, including P247 (also located within the loop region between palm and thumb domains) and other residues in the thumb domain, I257, L260, L295 and L303 in both subunits. These interactions are mirrored in both subunits in this high resolution structure (Fig 3B). Given that W252 side-chain is buried in the RT core, it is unlikely to directly facilitate interaction between RT and eEF1A.

(أ) Schematic diagrams representing domains of RT p66 and p51. (ب) Surface representation of the p66/p51 heterodimer is shown along with a ribbon schematic representation, colored by domain with a transparency setting to allow visualization of the buried W252 residue and its interacting residues. The location of the W252 residue is shown its side-chain atoms are shown as red spheres. Residues that make hydrophobic contacts with W252 are shown colored green and labeled. The side-chain of W252 supports numerous hydrophobic interactions with spatially proximal residues, including P247, I257, L260, L295 and L303. (ج) Co-IP assays were performed with wild type and RT mutations predicted to interact with RT W252. Mutations flanking L295A and L303A, T296A and L301A, were included as controls. Only the L303A RT mutation reduced interaction with eEF1A in a co-IP assay as performed in Fig 2. The experiment was performed three times with similar results and a representative data set is shown. (د) A BLI assay using purified eEF1A immobilized on the biosensors and purified 6ᵡHis-tagged RTp66 protein in the solution. The association of 90 nM of wild type RT and RT mutant proteins was compared as indicated. The data is presented as a mean value ± standard deviation from 3 independent experiments. *p<0.05.

Thermodynamic stability calculations using the empirical forcefield FoldX program show that the mutation W252A severely destabilizes structure in both individual subunits and within the heterodimer (ΔΔG of mutations range between

4.7–5.3 kcal/mol) (Table 2). In contrast, mutation T253A reveals no adverse effect on protein stability [16–18]. This is in keeping with analysis of the lowest energy conformer of 252A (in both individual subunits and the heterodimer), which shows that critical hydrophobic interactions with three of the aforementioned interacting residues, P247, L260 and L303, are lost in the absence of the aromatic side-chain of W252 and could render this region more “open” or flexible. The predicted reduced stability of W252A could therefore have consequences on protein conformation that could in turn impact on RT:eEF1A interaction. To test this possibility further, wild type RTp51 or p51 with the single mutations L295A, T296A, L301A, and L303A were subjected to co-IP analysis as previously described. These residues were chosen because L295 and L303 interact with W252, and are in the region of 294–303 where mutation significantly impairs binding to eEF1A (Fig 2C), while neighbouring residues T296 and L301 were mutated to alanine for comparison. While the interaction between eEF1A and L295A, T296A and L301A were comparable to wild type RT, the L303A mutant, like W252A, interacted poorly with eEF1A (Fig 3C), which likely accounts for the reduction in interaction of the 299-303A amino acid mutations with eEF1A. These results suggest that a spatially proximal region, supported by W252 and L303 hydrophobic interactions, are necessary for interaction with eEF1A. A reduced interaction of eEF1A with RT W252A and L303A was further confirmed using BLI assay. The eEF1A biosensors were incubated in bacterially produced 6×his recombinant wild type RTp66 at 90, 30 and 10 nM, or mutant RTp66 W252A and L303A RT at 90 nM (Fig 3E S5A and S5B Fig). The binding responses of 90 nM 252A or 303A with eEF1A was substantially lower than 90 nM wild type RT, and on par with responses measured for 10 nM of wild type RTp66. As L303A and W252A RT mutation have similar affect on interaction with eEF1A, W252A was selected for use in further experiments.

RT heterodimer formation requires interaction between the connection domains of RTp51 and RTp66. In order to assess the effect of the W252A mutation on RT heterodimerization, a mammalian protein-protein interaction trap (MAPPIT) assay was undertaken [19,20] (S6 Fig). We co-transfected various combinations of wild type and mutant RT p51 and RT p66 prey and bait expression plasmids along with the reporter and a transfection control plasmid pCMV-Gluc2 in HEK293T cells and compared firefly luciferase levels induced by leptin stimulation (S7 Fig). The W252A and T253A mutations did not affect luciferase expression indicating that heterodimerization between R p51 and RT p66 harboring mutations were not affected. As previously reported, L234A had a significant reduction of the signal indicating this mutation negatively affect RT dimerization thus validating the system [21,22]. The results therefore indicate that W252A imparts only a localized effect on structure stability.

The W252A mutation regulates reverse transcription في المختبر

The RT W252 residue is largely invariant among published HIV-1 sequences but to our knowledge has not been investigated. Using an HIV-1NL4.3 proviral DNA plasmid, the RT W252A mutation was introduced in pol so that infectious virus could be produced. The HIV-1 wild-type and W252A RT mutant proviral plasmids were transfected into HEK293T cells, along with a control plasmid pCMV-Gluc2, and cell lysates and culture supernatants were collected at 48 h post-transfection. The expression of HIV-1 proteins in the cell lysate was examined by western blot using an anti-HIV-1 polyclonal antibody and virus particle production was determined by p24 ELISA from the culture supernatant. The levels of Gaussia luciferase were determined and used to normalize results for transfection efficiency. The levels, patterns and ratios of viral proteins in cell lysates were similar between the wild type and mutant (Fig 4A). Virus particle production of the W252A RT mutant in culture supernatant was slightly reduced compared to wild type virus (Fig 4B). Western blot of partially purified virions using an anti-HIV-1 polyclonal antibody or an anti-RT antibody showed similar protein staining patterns of viral proteins and RT (Fig 4C), suggesting that an W252A RT mutation did not significantly affect Gag-Pol steady-state levels or its cleavage by HIV-1 protease.

(أ) Proviral plasmids transiently expressing wild type or W252A RT mutant HIV-1 in HEK293T cells were visualized by western blot using a rabbit anit-HIV-1 antibody. Western blot samples were normalized for transfection efficiency using a co-transfected Gaussia luciferase reporter plasmid. (ب) The amount of virus present in culture supernatant was measured using a CA ELISA. Results are normalized for transfection efficiency as determined by secreted Gaussia luciferase. (ج) Western blot of concentrated HIV-1 virus particles from culture supernatants expressing wild type or W252A RT HIV-1, detecting with anti-HIV-1 (left, human serum, NIH AIDS reagent) or anti-RT antibodies (right). (د) The RT activities of wild type and W252A RT mutated viruses were measured using a standard RT colorimetric assay and normalized to CA levels in each sample. (ه) Jurkat cells were infected with wild type or W252A RT mutant virus using equivalent amount of CA (500 ng CA/10 7 cells) or (F) equivalent amount of RT (5 ng of RT/10 7 cells). Virus replication was monitored by using an ELISA to measure CA in the culture supernatant at 0, 3, 7 and 14 days post-infection. The mean values and standard deviations from an experiment performed in triplicate are shown. The experiment was repeated twice with similar results.

The thumb domain plays a role during reverse transcription to help properly position the viral nucleic acid through interactions that involve both the primer and template strands [23], so a W252A mutation could affect RT activity. To test this hypothesis, equal amounts of wild type or W252A RT mutant virus, normalized to CA levels, were used in a standard في المختبر RT assay. Each virus sample was incubated in reaction mixtures containing primer, template and nucleotides for 2 h at 37°C. The results show that a W252A RT mutation reduced the level of RT activity by

50% (Fig 4D). Hence a W252A RT mutation can down regulate both RT activity and the interaction between eEF1A and RT.

The W252A RT mutation affects late steps of reverse transcription and virus replication

The effect of a W252A RT mutation on reverse transcription efficiency was assessed in infected cells. Jurkat cells were infected with HIV-1 normalized to one of two parameters: using an equivalent amount of CA or an equivalent amount of total RT activity. The cells were incubated with virus for 2 h at 4°C to enable virus attachment and then at 37°C for 4 h to initiate virus entry and reverse transcription. The cytoplasmic nucleic acids were isolated 4 h later and levels of viral early DNA and late DNA were measured by qPCR, and the values were normalized to the total mitochondrial DNA present in each sample. Heat inactivated viruses were used as a negative control. When the infections were normalized to CA, the W252A RT mutant virus produced early viral DNA at levels slight lower than wild type virus (p > 0.05 Table 3), but the levels of late viral DNA made by the W252A RT mutant virus was significantly reduced (p < 0.05). The results show that the efficiency of reverse transcription, defined as the ratio of sssDNA levels to second strand transfer DNA levels, was reduced by 2-fold in the mutant virus compared to wild type HIV-1 (Table 3). When the amount of virus used for infection was normalized to total RT activity, thereby increasing the input of W252A RT mutant virus relative to wild type, the level of early DNA made by the W252A RT virus was proportionally increased, but the relative efficiency of reverse transcription remained low compared to wild type HIV-1 (Table 3). As expected, replication of the W252A RT virus was much weaker than wild type in Jurkat cells (Fig 4E and 4F). To examine whether synthesis of late reverse transcription DNA was more sensitive to RT activity changes rather than early reverse transcription DNA levels, the efficiency of reverse transcription was assessed by wild type virus infection in the presence of an RT inhibitor, nevirapine. When nevirapine was used to inhibit RT activity by

50%, synthesis of both early and late DNA products were equally affected so that the overall efficiency of reverse transcription was unchanged (Table 3). The combined results suggest that the W252A RT mutation affects late DNA synthesis due to changes in the RT-eEF1A interaction rather than due to reduced RT activity في حد ذاته, and this significantly reduced HIV-1 replication.

The W252A RT mutation significantly reduced the association of RT with eEF1A in infected cells

Proximity ligation assays (PLA) were performed to examine the association of RT with eEF1A in infected cells. Previously we used PLA to show an association of HIV-1 RT with eEF1A in infected cells [9]. Similar experiments were performed here using equivalent amounts of wild type or W252A virus, normalized to CA, to infect TZM-bl cells. The cells were fixed at 4 h post-infection and mouse anti-RT and rabbit anti-eEF1A antibodies were used to target RT and eEF1A, respectively, which were detected using oligonucleotide-conjugated secondary antibodies. Heat-inactivated viruses that are defective for entry into cells were used to monitor non-specific foci, due to low levels of non-specific antibody staining. The number of foci was significantly reduced in cells infected by W252A RT virus compared with wild type virus (p <0.05 Fig 5A), indicating a reduced association of W252A RT with eEF1A. The degree of cell entry of each virus was similar, as indicated by similar levels of viral genomic RNA in cells post-infection (Fig 5B). The PLA data correlate to decreased association of W252A RT with eEF1A as observed in the co-IP assays (Fig 2G) and provide further evidence that a W252A mutation in RT impairs its interaction with eEF1A.

Proximity ligation assays (PLA) were performed in TZM-bl cells infected with equivalent amounts of virus normalized to CA. Foci indicating association of RT with eEF1A were detected by fluorescence microscopy of cells infected with wild type or W252A RT mutant virus (bottom left panel), or with the same viruses that were heat-inactivated prior to infection. (أ) Foci from PLA positive cells in 20 fields totaling at least 200 cells were quantified for each infection experiment. (ب) Quantitative RT-PCR analysis of viral RNA in nevirapine-treated TZM-bl cells (to block reverse transcription of viral genomic RNA) infected with wild type or W252A RT HIV-1 or their heat-inactivated controls. The cytoplasmic RNA was extracted 2 h post-infection and measured by RT-PCR in triplicate. All values were normalized to cellular β-tubulin mRNA levels. All columns represent a mean value and standard deviation from at least three independent experiments. A p value for the wild type and W252A RT mutant HIV-1 outcome is shown.

The eEF1A inhibitor, didemnin B (Did B) inhibits HIV-1 reverse transcription

Did B is a marine natural product depsipeptide with antiviral and antitumor properties that can inhibit protein synthesis [24,25]. A proposed mechanism of action involves Did B irreversibly binding to a pocket in eEF1A domain 2, resulting in a conformational change that inhibits interaction of eEF1A with the nucleotide exchange factors eEF1B and eEF2 [25–27]. We hypothesized that binding of Did B to eEF1A may also inhibit reverse transcription via the RT-eEF1A interaction. To compare the effect of Did B, another protein synthesis inhibitor, cycloheximide (CHX), which blocks eEF2-mediated tRNA translocation by binding to the E site of the 60S ribosome [28], was used so possible effects on early HIV-1 replication could be discriminated from inhibition of translation.

Firstly, the effects of Did B and CHX on protein translation were measured in Jurkat cells. Jurkat cells were transfected with pCMV-Glu2 expressing secretable Gaussia luciferase and the culture medium was replaced 24 h post-transfection with media containing increasing subnanomolar concentrations of Did B and CHX (0.032 to 0.8 nM). At 8 h and 24 h post-treatment, Did B did not reduce levels of Gaussia luciferase in culture supernatant, while CHX modestly decreased levels when used at 0.8 nM (p < 0.05) compared to a DMSO control (Figs 6A and S8A), indicating that CHX had a greater negative effect on cellular translation. Cell proliferation was reduced using 0.8 nM of Did B, however a greater reduction of cell proliferation was detected at all concentrations of CHX used (S8B Fig). The data indicate that CHX is significantly more cytotoxic than Did B when used at 0.8 nM.

(أ) Jurkat cells transfected with pCMV-Gluc 2 were treated post-transfection with media containing didemnin B (Did B) or cycloheximide (CHX) at concentrations as indicated. The levels of secreted Gaussia luciferase in the culture supernatants were measured 8 h post-treatment. (ب و ج) Jurkat cells were incubated with subnanomolar concentrations of Did B and CHX as indicated and then infected with HIV-1 at 4°C for 2 h and 37°C for 4 h. The total cytoplasmic DNA was collected and the levels of HIV-1 early (ب) and late (ج) reverse transcription products were measured by qPCR. (د) Reverse transcription efficiencies were calculated as the ratio of late to early viral DNA, expressed as a percentage. (ه) The levels of HIV-1 RNA in cells treated with didemnin B (Did B) and cycloheximide (CHX). Jurkat cells were incubated with 100 nM nevirapine and concentrations of Did B and CHX as indicated at 37°C for 2 h followed by HIV-1 infection. The HIV-1 was incubated with cells at 4°C for 2 h and then at 37°C for 4 h. Heat inactivated virus was used as a negative control. The HIV-1 RNA was extracted from the cells and detected by RT-qPCR. A direct qPCR without RT from the RNA samples was performed to monitor for DNA contamination. All columns represent a mean value and standard deviation from at least three independent experiments. ** = ص < 0.05.

The effect of Did B and CHX on HIV-1 reverse transcription was then assessed. Jurkat cells were treated with equivalent concentrations of Did B or CHX for 2 h prior to infection. In the continued presence of the compounds, cells were infected with HIV-1 for 2 h at 4°C, then at 37°C for 4 h, after which the cytoplasmic nucleic acids were extracted and the levels of HIV-1 DNA in the samples were measured by qPCR. The results show that Did B strongly inhibited reverse transcription, especially at 0.8 nM, where DNA synthesis was reduced compared to mock (DMSO) treated cells (Fig 6B and 6C). CHX had a negligible effect on reverse transcription at the same concentration. Most noteworthy was a change in reverse transcription efficiency, as indicated by the amount of second strand DNA synthesis relative to the amount of sssDNA produced. The maximum reverse transcription efficiency was

24% in DMSO treated cells, whereas reverse transcription efficiency in cells incubated in the presence of 0.8 nM Did B was reduced

3-fold (Fig 6D). At a concentration of 0.16 nM, Did B had no detectable cytotoxicity (Figs 6A, S8A, and S8B), but still reduced reverse transcription efficiency (Fig 6D). No significant change in reverse transcription efficiency was observed in cells treated with CHX compared to the DMSO treated control. The levels of mitochondrial DNA, as measured by PCR of cytochrome c oxidase subunit II (COXII), were similar in all samples (S9A Fig), indicating that equivalent amounts of samples were assayed. Furthermore, we excluded any inhibition of HIV-1 entry by both Did B and CHX treatments (Fig 6E) and any direct effects of Did B and CHX on RT activity (S9B Fig). The results demonstrate Did B can inhibit early and late HIV reverse transcription, but that the effect of Did B on late DNA synthesis is greater, resulting in the reduction of reverse transcription efficiency. This outcome is consistent with a role we previously described for eEF1A in supporting the stability of the reverse transcription complex and completion of the reverse transcription process [9].

Did B induces instability of the wild type but not W252A mutant reverse transcription complex

Did B is believed to induce conformational changes in eEF1A [26,27], and this may affect interaction with RT and functionality of the RT-eEF1A complex. To determine if Did B could directly affect the eEF1A interaction with RT, cell lysate from cells expressing HIV-1 RTp51-FLAG were incubated with 1 nM Did B, or 100 nM CHX or DMSO as controls. eEF1A was immunoprecipitated from these treated lysates using an anti-eEF1A antibody and the captured proteins were analyzed by western blot using an anti-FLAG antibody. The results show that treatment with 1 nM Did B resulted in a small decrease in co-IP of RT (Fig 7A), but the difference was not statistically significant (Fig 7B).

(أ) Cell lysates from HEK293T cells transiently expressing HIV RTp51-FLAG were incubated for 30 min at 37°C with concentrations of Did B, CHX or DMSO as indicated. Immunoprecipitation was performed using a rabbit anti-eEF1A antibody and visualized by western blot using anti-FLAG (upper panel) or mouse anti-eEF1A antibodies (lower panel). The experiment was performed three times with similar results. (ب) Western blots in (أ) were analyzed by densitometry. Normalized density values for RTp51 were calculated by dividing the relative density of RTp51 in each sample lane by the relative density of the eEF1A in the same lane [45]. The columns represent the mean normalized densities and standard deviations of three independent experiments relative to the DMSO treated value. Student’s two-tailed T test was used to calculate statistical significance (جF) HEK293T cells were treated with Did B at 0.8 nM or with DMSO carrier. The cells were infected with VSV-G psuedotyped wild type (ج و ه) or W252A RT mutant (د و F) HIV-1. A lysate was prepared and viral RTCs were purified by isopycnography using a 20% to 70% linear sucrose gradient. Fractions collected from the tube bottom were assayed for (ج و D, left y-axis) CA by ELISA and (ه و F, left y-axis) viral strong stop DNA by qPCR. The density of the sucrose in each fraction (جF, right y-axis) is indicated by the blue line. The box in each graph indicates a fraction with a density of 1.33 g/ml. The experiment was repeated twice with similar results and a representative outcome is shown.

To test the effect of Did B on RTCs and reverse transcription, large scale infections of HEK293T cells were performed using VSV-G pseudotyped wild type and W252A mutant HIV-1. HEK293T cells were incubated with 0.8 nM Did B or DMSO carrier for 2 h. VSV-G pseudotyped HIV-1 was incubated with cells at 4°C for 2 h to allow virus attachment to cells, then at 37°C for 4 h. Cell lysates were made from the infected cells and fractionated by isopycnography using a 20% to 70% linear sucrose gradient. The analysis shows the bottom eight fractions that include a sucrose density of 1.33 g/ml, which corresponded to fraction 4 (F4), that contains viral RTCs [29] (Fig 7C–7F). Viral CA and DNA were observed with a peak in F4 in agreement with previous studies [9] and indicative of RTCs (Fig 7C–7F, boxed). While peak profiles for the wild type and mutant HIV-1 were similar (Fig 7C vs. 7D, and 7E vs. 7F), the W252A mutant HIV-1 made less early DNA than wild type HIV-1, in agreement with previous experiments. Did B reduced CA levels of wild type HIV-1 by 5-fold (Fig 7C, red vs. green lines), and early DNA levels by 13-fold (Fig 7E, red vs. green lines). Did B had a greater effect on early DNA synthesis in our previous experiments (Fig 6B). However, Did B had no dramatic effect on the W252A mutant HIV-1 CA or viral DNA levels in any fraction (Fig 7D and 7F, red vs. green lines). We also measured the levels of late DNA in F4 by qPCR. The results averaged from two experiments show that the efficiency of wild type HIV-1 reverse transcription was

21% in untreated cells and

11% in Did B treated cells. The W252A mutant reverse transcription efficiency was

12–13% in either the presence or absence of 0.8 nM Did B (Table 4). Based on these observations, we propose that Did B inhibits reverse transcription by binding to eEF1A thereby affecting its interaction with the RTC.


آليات الميتوكوندريا لاستيراد البروتين وتجميعه

نيلز ويدمان ونيكولاس بفانر
المجلد. 86 ، 2017

الملخص

الميتوكوندريا هي عضيات أساسية لها وظائف عديدة في التمثيل الغذائي الخلوي والتوازن. يتم تصنيع معظم بروتينات الميتوكوندريا المختلفة و GT1000 كسلائف في العصارة الخلوية ويتم استيرادها إلى الميتوكوندريا بخمس عمليات نقل. اقرأ أكثر

الشكل 1: نظرة عامة على المسارات الخمسة الرئيسية لاستيراد البروتين في الميتوكوندريا. يتم استيراد البروتينات المسبقة الحاملة للوجود المسبق عن طريق ترانسلوكاز من الغشاء الخارجي للميتوكوندريا (TOM) و presequin.

الشكل 2: مسار التواجد في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا (IM) والمصفوفة. يتكون غلاف الغشاء الخارجي (TOM) من ثلاثة بروتينات مستقبلية ، البروتين المكون للقناة To.

الشكل 3: دور إنزيم ترانسانساز تجميع أوكسيديز (OXA) في فرز البروتين. يتم تصدير البروتينات التي يتم تصنيعها بواسطة ريبوسومات الميتوكوندريا إلى الغشاء الداخلي (IM) بواسطة OXA translocase الريبوس.

الشكل 4: مسار الناقل في الغشاء الداخلي. يتم تصنيع سلائف حوامل المستقلب الكارهة للماء بدون وجود مسبق قابل للانقسام. السلائف مرتبطة بمرافقة عصاري خلوي.

الشكل 5: آلات استيراد وتجميع الحيز الغشائي للميتوكوندريا (MIA). تحتوي العديد من بروتينات الفضاء بين الغشاء (IMS) على أشكال مميزة للسيستين. يتم الاحتفاظ بالسلائف في صورة مخفضة.

الشكل 6: التولد الحيوي لبروتينات البرميل من غشاء الميتوكوندريا الخارجي. يتم استيراد سلائف بروتينات البرميل في البداية عن طريق ترانسيلوكاز الغشاء الخارجي (TOM) ، وترتبط بصغر حجمها.

الشكل 7: الدور المزدوج لتوزيع الميتوكوندريا وبروتين التشكل 10 (Mdm10) في مواقع تجميع البروتين وتلامس العضيات. يرتبط Mdm10 بآلات الفرز والتجميع (SAM).

الشكل 8: مسارات استيراد متعددة لبروتينات α- حلزونية متكاملة للغشاء الخارجي للميتوكوندريا. يتم عادةً إدخال سلائف البروتينات ذات تسلسل مرساة إشارة N-terminal في.

الشكل 9: يتفاعل موقع اتصال الميتوكوندريا ونظام تنظيم cristae (MICOS) مع ترانسيلوكاسيس البروتين. يتكون MICOS من وحدتين فرعيتين أساسيتين ، Mic10 و Mic60. يشكل Mic10 أوليغومرات كبيرة عشر.


Amino Acids with Hydrophobic Side Chain – Aliphatic

1 pKa is the negative of the logarithm of the dissociation constant for the -COOH group.
2 pKb is the negative of the logarithm of the dissociation constant for the -NH3 group.
3 pKx is the negative of the logarithm of the dissociation constant for any other group in the molecule.
4 pl is the pH at the isoelectric point.
Reference: D.R. Lide, Handbook of Chemistry and Physics, 72nd Edition, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991.


Characteristic structural features

Crystal and nuclear magnetic resonance (NMR) structures are available for retroviral proteases from HIV-1 [5], HIV-2 [6], simian [7] and feline [8] immunodeficiency viruses (SIV and FIV), rous sarcoma virus (RSV) [9] and equine infectious anemia virus (EIAV) [10] reviewed in [11]. The secondary structures of all retroviral proteases share a structural template (Figure 3) that was previously used to describe non-viral aspartic proteases [12]. Retroviral proteases form homodimers and the template structure shows that a monomer is formed by the duplication of four structural elements: a hairpin (containing loop A1), a wide loop (B1, containing the catalytic aspartic acid), an α helix (C1), and a second hairpin (D1). The second monomer contains the identical elements, named A2, B2, C2, and D2 in Figure 3. The length of loops A1 and A2 is different in various retroviral proteases, as are the length and conformation of the connecting segments between these structural elements. The α helix C1 is prominent only in EIAV protease, whereas it consists of a single helical turn in RSV and FIV proteases and is replaced by a loop in the proteases of HIV-1, HIV-2, and SIV. The flexible β loop D1, known as a 'flap' in non-viral proteases, is functionally very important, because it changes orientation during binding of the ligand (substrate or inhibitor) and forms numerous interactions with it. Two such flaps are present in the symmetric dimers of retroviral proteases. The hairpin D2 is substituted by a P strand in all retroviral proteases for which structural information is available. In addition to the four core structural elements, the amino and carboxyl termini in a dimer form a four-stranded β-sheet interface. The amino-acid sequences of retroviral proteases are significantly similar, particularly in the locations of residues that are important in preserving both structure and function.

Structural template for (أ) retroviral proteases compared to that for (ب) the aspartic protease family. In the symmetrical retroviral dimer (a), loops A1 and A2 are shown in yellow in each monomer, shown as stereo pairs. In the single-chain aspartic protease (b), the corresponding loops are labeled A1 and A2 in the left-side domain and A3 and A4 in the right-side domain. Likewise, loops B1 and B2 in (a) are shown in blue in each monomer of the retroviral dimer, and the analogous loops in blue are labeled B1, B2, B3, and B4 in the single-chain enzymes. Loops B1 in the retroviral enzymes and B1 and B3 in the single-chain enzymes contain the catalytic residues. Helical segments C1 and C2 (red) in (a) are mirrored by segments C1-C4 in (b). Finally, loop D1 in the retroviral monomers provides a double flap structure in (a), whereas the 'half loops' D2' provide the four strands that form a β sheet at the bottom of the dimer. In (b), loop D1 provides the flap on one side only, whereas D3 on the other side is pointing outward. Loops D2 and D4 provide the center of the β sheet at the bottom of these enzymes. (c) Movement of flaps in the retroviral protease during ligand binding. This stereo pair shows the movement that occurs upon binding of a ligand to the active site of HIV-1 protease. The 'empty' enzyme structure is shown as a green ribbon and the enzyme following binding is shown as an orange ribbon. The flap residues move downward by approximately 8 Å.

The active site of each retroviral protease contains a pair of aspartic acid residues (Asp25 and Asp25' amino acids are numbered according to their positions in HIV-1 protease). The conserved active-site residues - Asp25, Thr26 (replaced by Ser38 in RSV protease), and Gly27 - are located in a loop, the structure of which is stabilized by a network of hydrogen bonds similar to that found in the eukaryotic proteases (Figure 4 for a review, see [13]). The carboxylate groups of the Asp25 residues from both chains are nearly co-planar and make close contacts via their O1 atoms. The network is quite rigid as the result of a set of interactions called the 'fireman's grip', in which the Oγ atom of each Thr26 accepts a hydrogen bond from the main-chain NH group of the Thr26 in the opposing loop Thr26 also donates a hydrogen bond to the oxygen atom of the carbonyl group of residue 24 on the opposite loop. Identical interactions have been observed in all retroviral proteases thus far examined by crystallographic methods. The carboxylate residues are bridged by a water molecule, located within hydrogen-bonding distance of the oxygen atoms of the Asp25 carboxylates. Water molecules forming similar bridges have also been reported in non-viral proteases [13] they might correspond to the catalytic water molecule required for hydrolysis of the peptide bond in the substrate. The distances between the inner oxygen atoms of the co-planar carboxylates are 2.8 to 3 Å, indicating the presence of an acidic proton in the bridge.

The 'fireman's grip', a stereotypical rigid network structure involving the Asp-Thr-Gly signature sequence in (أ) the classical aspartic peptidases and (ب) the retroviral proteases. Amino acids are identified by three-letter codes. In each case, the catalytic aspartic acid residue (Asp) is hydrogen-bonded to the backbone NH group of the glycine (Gly) two amino acids further along in the sequence. In addition, the OH groups of threonine (Thr) are hydrogen-bonded to two points on the opposite domain or monomer, the backbone NH group (blue) of the threonine and to the carbonyl oxygen (red) of the residue before the catalytic aspartic acid.

Binding of inhibitors is accompanied by a large shift in the flaps of both subunits (Figure 3c). In some enzymes (for example, RSV protease), the flaps are disordered and therefore are not seen in the X-ray structure [9]. In other enzymes, the flaps are seen in an 'open' conformation when no ligands (substrates and/or inhibitors) are present. Binding to the active site induces a downward movement of the flap residues this allows additional interactions with the ligand and strengthens the binding of both substrates (by inference) and inhibitors.


شاهد الفيديو: النيوكليوتيدة والفرق بين لريبوز والديؤكسى ريبوز (كانون الثاني 2022).