معلومة

كيف كان العلاج الجيني قادرًا على علاج الأمراض من خلال تحويل الخلايا النشطة الانقسام؟


اعتقدت أن العلاج الجيني ، عند إجرائه على الخلايا المستهدفة التي تتجدد نفسها باستمرار ، يمكن أن يكون فعالاً لفترة محدودة فقط. بمعنى آخر ، يتلاشى التأثير تدريجياً بعد فترة ، اعتمادًا على مدى سرعة الخلايا المستهدفة في تجديد نفسها. بمعنى آخر ، يحتاج المريض إلى الاستمرار في تلقي العلاج الجيني بين الحين والآخر للحفاظ على التأثير المطلوب.

من ناحية أخرى ، عند استهداف الخلايا التي لا تنقسم / تتجدد ، مثل العين ، يمكن للعلاج الجيني أن يعالج العمى بالفعل وإلى الأبد ، ولم يعد المريض بحاجة إلى حقن العلاج الجيني.

إذن ماذا عن الأمراض الأخرى التي يُزعم أن العلاج الجيني شفيها؟ أعتقد أنها تشمل اضطرابات الدم مثل الهيموفيليا وبعض اضطرابات الجهاز المناعي الخطيرة؟ اعتقدت أنها تتضمن بشكل أساسي خلايا تتجدد ، مثل نخاع العظام والكبد؟


اجابة قصيرة
يمكن تعديل كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة بشكل دائم من خلال العلاج الجيني باستخدام نواقل تدمج حمولتها في الحمض النووي الصبغي للمضيف

خلفية
يمكن تطبيق العلاج الجيني القائم على النواقل باستخدام ناقلات ، مثل الفيروسات القهقرية المعدلة أو الفيروسات الغدية ، التي تدمج حمولتها في كروموسوم المضيف.

سواء كانت الخلايا المحولة تتكاثر بنعم أو لا ، فإن الوالد وكذلك أي خلية ابنة محتملة ستحمل الحمض النووي الجديد. على سبيل المثال ، عولج نقص المناعة بنجاح بالعلاج الجيني ، لكن التجارب الأولى أسفرت عن سرطان الدم والعظام ، لأن الخلايا الجذعية بدأت تتكاثر بشكل لا يمكن السيطرة عليه ، وبالتالي يمكن بالتأكيد أن تتحول الخلايا المنقسمة بشكل دائم. في الواقع ، عندما تتحول خلايا الخط الجرثومي بهذه الطريقة ، حتى نسل العائل سيرثها.

مصادر
- الجمعية الطبية الأميركية
- تعلم علم الوراثة
- جامعة يوتا


العلاج الجيني

العلاج الجيني هو مجال طبي سريع النمو يتم فيه إدخال الجينات في الجسم لعلاج الأمراض. تتحكم الجينات في الوراثة وتوفر الشفرة البيولوجية الأساسية لتحديد الوظائف المحددة للخلية. يسعى العلاج الجيني إلى توفير الجينات التي تصحح أو تحل محل وظائف التحكم في المرض للخلايا التي لا تؤدي وظيفتها في جوهرها. يقدم العلاج الجيني الجسدي جينات علاجية على مستوى الأنسجة أو الخلايا لعلاج فرد معين. يُدخل العلاج الجيني للخطوط الجرثومية الجينات في الخلايا التناسلية أو ربما في الأجنة لتصحيح العيوب الجينية التي يمكن أن تنتقل إلى الأجيال القادمة. تم تصميمه في البداية كنهج لعلاج الأمراض الوراثية ، مثل التليف الكيسي ومرض هنتنغتون ، فقد نما نطاق العلاجات الجينية المحتملة ليشمل علاجات السرطان والتهاب المفاصل والأمراض المعدية. على الرغم من أن اختبار العلاج الجيني لدى البشر قد تقدم بسرعة ، إلا أن العديد من الأسئلة تحيط باستخدامه. على سبيل المثال ، يشعر بعض العلماء بالقلق من أن الجينات العلاجية نفسها قد تسبب المرض. يخشى آخرون من أن العلاج الجيني للخطوط الجرثومية يمكن استخدامه للتحكم في النمو البشري بطرق لا ترتبط بالمرض ، مثل الذكاء أو المظهر.


العلاج الجيني خطوة أقرب إلى الإنتاج الضخم

مشروع EUREKA E! حقق 3371 وكلاء نقل الجينات تطورات كبيرة في تطوير ناقلات جديدة غير فيروسية قادرة على إدخال مادة وراثية في الخلايا المستهدفة. هذه العوامل الجديدة ، وهي مشتقات الكاتيونية البرمائية 1،4-ديهيدروبيريدين (1،4-DHP) ، تتجنب مشاكل الجهاز المناعي للمتلقي الذي يتفاعل ضد الناقل الفيروسي.

طور شركاء المشروع طرقًا لإنتاجها بكميات كبيرة ، مما يحل مشكلة أخرى تتعلق بالتوصيل الفيروسي. لكن الميزة الأكبر هي أن المركبات الجديدة أكثر فاعلية بشكل ملحوظ في توصيل الحمض النووي إلى نوى الخلية من الناقلات الاصطناعية القياسية الأخرى ، مما يزيد من فرصة نجاح الحمض النووي في التحكم في الجينات المعيبة والمرض.

يتضمن العلاج الجيني إدخال الحمض النووي في الخلايا البشرية داخل الجسم لعلاج المرض. لا تزال هذه التقنية في أيامها الأولى ، وقد تم إثباتها بنجاح فقط في العقد الماضي. كانت معظم التحقيقات في إمكانيات علاج الأمراض الوراثية المتعلقة بخلل جيني ، كما أن لهذه التقنية استخدامات محتملة في علاج المراحل المبكرة من السرطان ، وفي أمراض القلب والأوعية الدموية وأمراض التنكس العصبي.

يواجه العلاج الجيني العديد من الصعوبات كطريقة عملية ليس أقلها أن الحمض النووي عبارة عن بنية كبيرة ومعقدة تحتاج إلى توصيلها وربطها بالقسم الصحيح من مجموعة الحمض النووي الخاصة بالمستلم. هناك عدد من الطرق قيد الاستخدام أو قيد التحقيق لإدخال الحمض النووي في الخلايا (عملية تعرف باسم تعداء) - باستخدام الفيروسات أو العوامل الكيميائية أو الحقن الفيزيائي.

الفيروسات أو ناقلات المواد الكيميائية

مع ناقلات الفيروس ، يتم حقن الحمض النووي المراد إدخاله في الفيروس ، والذي ينقله إلى الخلية عن طريق حويصلة تتشكل حول جسيم الفيروس بواسطة جدار الخلية. بمجرد دخول الخلية ، تتفكك الحويصلة ويحقن الفيروس الحمض النووي في نواة الخلية. ومع ذلك ، فإن المسار الفيروسي له عيوب رئيسية. غالبًا ما يتداخل الجهاز المناعي للشخص الذي يتلقى العلاج مع النشاط الفيروسي ويمكن أن يكون للفيروسات آثار جانبية مطفرة لا يمكن التنبؤ بها. كما أن الإنتاج واسع النطاق للنواقل الفيروسية يمثل مشكلة.

من المعروف بالفعل أن مجموعة كبيرة من العوامل الكيميائية قادرة على تكوين مركب من 1.4-DHP مع الحمض النووي وإيصاله إلى خلايا المستلم. هذه العوامل أسهل بكثير في الإنتاج على نطاق واسع من الفيروسات ولا تسبب عادة استجابة مناعية. ومع ذلك ، فهي ليست فعالة في إدخال الحمض النووي مثل ناقلات الفيروس.

البحث عن أفضل ما في العالمين

كان التحدي الذي يواجه الشركاء في مشروع EUREKA هو الجمع بين فعالية النواقل الفيروسية ومزايا الإنتاج ونقص الاستجابة المناعية التي تظهرها العوامل الكيميائية. اكتشف العلماء في معهد لاتفيا للتخليق العضوي وجامعة كوبيو في فنلندا مجموعات جديدة من عوامل نقل الحمض النووي المحتملة: مشتقات 1.4-DHP. تم العثور على هذه المركبات لتكون أكثر فاعلية في نقل الجينات من اثنين من وكلاء توصيل الجينات المعياريين على نطاق واسع (المعروفين باسم DOTAP و PEI 25) وتم تغطية الاكتشاف ببراءة اختراع. قدمت هذه النتيجة احتمالية مثيرة لكفاءة أفضل من شركة نقل غير فيروسية.

يشرح البروفيسور أرتو أورتي من جامعة هلسنكي (سابقًا من كوبيو): "عندما تكون هذه المركبات في محلول ويضاف الحمض النووي ، فإنها ترتبط ببعضها البعض. ينهار جزيء الحمض النووي الكبير السائب وتتشكل جزيئات صغيرة يبلغ قطرها حوالي 10-50 نانومتر وتتشكل. من كل من الحمض النووي والحامل. عندما تقدم هذا للخلايا ، ترتبط الجسيمات النانوية بسطح الخلية ، والتي تنثني إلى الداخل لتشكيل حويصلة داخل الخلية ، ثم تهرب الجسيمات من الحويصلة ، وتطلق الحمض النووي.

وجد الباحثون في جامعة هلسنكي أنه من بين جميع المركبات التي تم اختبارها ، كانت الأكثر فعالية هي تلك التي نجحت في نقل الحمض النووي إلى النواة. الآلية التي يدخل بها الحمض النووي إلى النواة ليست مفهومة بشكل واضح حتى الآن ، ولكن من المعروف أن نقل الجينات يكون أكثر فاعلية في الخلايا التي تنقسم بنشاط ، على سبيل المثال خلايا سرطان.

ثم شرع الدكتور أيفا بلوتنيكي والدكتور أركاديج سوبوليفس وزملاؤهم في معهد لاتفيا في تصنيع العشرات من مركبات مشتقات DHP المختلفة. تعليقات الدكتورة بلوتنيس: "الميزة الكبيرة لهذه المركبات هي جزء 1.4-DHP النشط بيولوجيًا ، والذي يمكن أن يُظهر بعض الخصائص البيولوجية والفيزيائية الكيميائية أثناء المشروع. مما سمح لنا بإقامة علاقات بين الهيكل والنشاط ".

ساهم الشريك الثالث في المشروع ، وهو منتج كيميائي مستقل من لاتفيا بابيكس ، بتجربته في التوليف على نطاق واسع وقدم المشورة لباحثي معهد لاتفيا حول أفضل السبل لتوسيع منهجية التوليف. ثم تم توزيع المركبات على عدد من الزملاء الباحثين الآخرين في لاتفيا وفنلندا وليتوانيا لمزيد من الدراسة. في الوقت الحالي ، يشعر شركاء المشروع أن الاستخدامات الرئيسية ستكون في التجارب المعملية ، وهناك حاجة إلى مزيد من البحث قبل استخدامها لنقل الجينات في جسم الإنسان.

يعتقد الشركاء في مشروع EUREKA أنه على الرغم من الحاجة إلى مزيد من البحث ، إلا أن المشروع كان ناجحًا للغاية. يقول الدكتور سوبوليفس: "لقد كان أول مشروع كبير ومهم بالنسبة لنا". "لقد وسعنا بشكل كبير الاستخدامات المحتملة لمشتقات 1.4-ديهيدروبيريدين ذاتية التجميع في الطب النانوي وتوصيل الجينات وحتى في أنظمة توصيل الأدوية." وجد فريق المشروع أن دعم EUREKA ساعد بشكل كبير في إعداد وإدارة وإعداد التقارير عن المشروع. ومن خلال EUREKA أيضًا تم تقديم الشركاء الآخرين إلى Bapeks.

مصدر القصة:

المواد المقدمة من EUREKA. ملاحظة: يمكن تعديل المحتوى حسب النمط والطول.


الفيروسات القهقرية في العلاج الجيني

تعد الفيروسات القهقرية أداة رائعة للقيام بالعلاج الجيني. العلاج الجيني هو وسيلة لعلاج الأمراض الوراثية. هذا هو الحال عندما يكون لدى شخص ما طفرة في الجين تؤدي إلى عمل بروتين في الجسم بشكل سيء. إذا كان هذا & # 8217s بروتينًا مهمًا ، فقد يؤدي ذلك إلى المرض. يمكنك علاج ذلك بطرق مختلفة ، ولكن الطريقة الجيدة حقًا لعلاج هذا المرض هي إصلاح الخلل الجيني في الخلايا التي تحتاج إلى هذا البروتين.

استخدام آخر للعلاج الجيني الذي أصبح فعالاً بشكل متزايد هو السرطان. لذا فإن الخلايا السرطانية تقوم بأشياء مختلفة لجسمك الطبيعي ، والخلايا في جسمك ، وتنقسم بسرعة كبيرة. إنهم يمتصون الكثير من المستقلبات ، وربما ينمو الورم أوعية دموية وأشياء من هذا القبيل. لذا يمكنك وضع العلاج الجيني لتغيير مناعة الورم ، حتى يتمكن جهازك المناعي من رؤية الورم مرة أخرى ، حيث توقف الورم عن قدرته على أن يراه الجهاز المناعي. يمكنك إصلاح ذلك بالعلاج الجيني.

يتضمن العلاج الجيني بشكل أساسي القدرة على إصابة الخلايا المستهدفة بفيروس ، ويجب أن يحتوي هذا الفيروس على الجين الذي تريد إدخاله هناك إما لإصلاحها أو لجعل الورم مرئيًا لجهاز المناعة ، على سبيل المثال. يمكنك استخدام الفيروسات القهقرية للعلاج الجيني ، لأنه يمكنك أولاً صنع جزيئات فيروسية بجينوم بداخلها يحتوي فقط على الجين المفضل لديك ، ويمكنك بعد ذلك إصابة الخلايا المستهدفة. لن يتم تعديل هذه الخلايا المصابة إلا عن طريق إدخال الجين المستهدف في الكروماتين الخاص بها. هذا & # 8217s عظيم. والفيروسات القهقرية جيدة بشكل خاص في ذلك ، لأنها تدخلها في الكروماتين. لذلك بمجرد وجود الجين ، يصبح مستقرًا.

مع كل العلاج الجيني ، فإن خطوة تحديد المعدل هي ببساطة القدرة على وضع الجين في الخلايا الصحيحة. غالبًا ما تكون العلاجات الجينية التي تعمل بشكل أفضل هي تلك التي يمكنك من خلالها إما حقن الفيروس مباشرة في الموقع (على سبيل المثال ، في ورم) ، أو الحالة التي يمكنك فيها إخراج الخلايا من جسم شخص ما (على سبيل المثال) ، خلايا الدم أو خلايا نخاع العظام الخاصة بهم) ، قم بتعديلها عن طريق إصابتها بالناقل الفيروسي ، ثم إعادتها إلى أجسامها. وبهذه الطريقة ، توجد طريقة مباشرة نسبيًا لتعديل خلايا الأشخاص باستخدام ناقل للعلاج الجيني مشتق من فيروس قهقري.

في الأيام الأولى ، تم إجراء العلاج الجيني باستخدام فيروسات غاما القهقرية للفأر. كان ذلك يأخذ فيروس فأر ، يزيل جينات فيروس الفأر ، يضع الجين الخاص بك ثم يستخدمه لتوصيل الجين. هذا & # 8217s يعمل بشكل جيد للغاية. ولا تزال هناك تجارب علاج جيني جارية باستخدام فيروس الفأر. تتمثل مشكلة الفيروس الارتجاعي للفأر في أنه لن يصيب إلا الخلايا التي تنقسم بنشاط ، وهناك العديد من الخلايا التي تريد أن تصيبها والتي لا تنقسم بشكل خاص (الخلايا الجذعية لا تنقسم جيدًا وتنوع خلايا الدم الأخرى لا يصاب بالفعل بفيروسات غاما القهقرية).

لقد تحول تاريخ العلاج الجيني حقًا من تطوير النواقل إلى أن تكون أكثر تعقيدًا وأمانًا وأكثر عدوى. المشكلة الأخرى هي النقش. لذلك ، يجب أن تكون قادرًا على إعادة الخلايا المعدلة إلى جسم الشخص وألا تموت هذه الخلايا على الفور. اختبار طرق مختلفة للقيام بالعدوى ، كيف تعتني بالخلايا بعناية شديدة بعد أن أخرجتها من جسم الشخص ، وكم من الوقت تبقيها خارج الجسم ، وما هي الوسائط التي تزرعها فيها وأشياء من هذا القبيل. إنها صناعة ضخمة حيث يحاول الأشخاص إيجاد أفضل طريقة لإخراج الخلايا وإعادتها دون إتلافها بأي شكل من الأشكال.

واحدة من تلك العلاجات الجينية المثيرة التي تجري في الوقت الحالي هو ما يسمى CAR أو مستقبل المستضد الخيمري. هذا & # 8217s استنادًا إلى فكرة أنه عندما تصاب بالسرطان أعتقد أن الجميع متفقون الآن على أن السرطان هو شيء يكافحه نظام المناعة لديك حقًا. خلال حياتك ، تتشكل السرطانات على أساس خلية فردية ، لكنها ماتت. لذلك ، تقوم الخلايا بأشياء غريبة ، ويتعرف جهازك المناعي على شيء مضحك يحدث ويقتلها. لكي يعيش الورم في جسمك وينمو ، يجب أن يتغير بطريقة تجعل جهاز المناعة لديك & # 8217t يراه. هذه أخبار سيئة. إذا كان جهاز المناعة الخاص بك يستطيع & # 8217t رؤيته ، يمكن أن ينمو الورم.

فكرة العلاج CAR هي أنه يمكنك إخراج الخلايا من جسم شخص ما ، الخلايا التائية ، وهي الخلايا التي قد تقتل الخلايا السرطانية ، ويمكنك تعديل خصوصيتها ، حتى يتمكنوا من رؤية الورم مرة أخرى . يفعلون ذلك عن طريق صنع ما يشار إليه بمستقبل مستضد خيمري. بشكل أساسي ، مستقبل الخلايا التائية ، الموجود على سطح الخلية ، يسبح حول الأشياء التي يجب قتلها. تقوم بتغيير هذا الجزيء لجسم مضاد يتعرف على السرطان تحديدًا ، وتقوم بدمج ذلك الجسم المضاد بالنصف الآخر من مستقبلات الخلايا التائية ، الجزء الموجود داخل الخلية. عندما يربط الجسم المضاد الموجود على سطح الخلية التائية CAR ، مستقبل المستضد الخيمري ، فإنه ينشط الخلية التائية لقتل الورم. وهذا & # 8217s علاج فعال بشكل خيالي عندما يعمل. هناك أشخاص تم علاجهم & # 8217 في 2015-2016 ، وأطفال مصابين بسرطان الدم لا يمكن علاجه بأي طريقة أخرى ، ومع ذلك يمكن أن يمنحهم العلاج CAR علاجًا فعالًا. لذلك ، هذا هو مجال مثير حقًا من العلاج الجيني الذي يجري تطويره في الوقت الحالي. لقد بدأت بالفعل في العمل.

نظرًا لأن العلاج الجيني هو وسيلة لعلاج الآفة الجينية ، فإنه أحيانًا يكون الطريقة الوحيدة لعلاج مرض معين. قد لا تكون هناك أي استراتيجية أخرى للقيام بذلك. لذا ، أعتقد أن إحدى القيم الحقيقية للعلاج الجيني هي أنه يجلب سلسلة جديدة كاملة من خيارات العلاج. لسوء الحظ ، نظرًا لأنه يطورها باهظ الثمن و # 8217s ، فهي مخصصة جدًا. لذلك ، غالبًا ما تجد أنه لا يمكنك علاج سوى عدد قليل من المرضى سنويًا ، وقد تضطر إلى وجود هذا الشخص في المستشفى ، وقد تضطر إلى إخراج الخلايا من الجسم ، وقد تضطر إلى إجراء علاج يكون حقًا محددة لمرضهم. لذلك ، في الوقت الحالي ، العلاج الجيني ليس شيئًا يمكن أن يكون سائدًا ، ويمكن استخدامه لعلاج آلاف المرضى بالطريقة التي يمكن بها الجراحة أو العلاجات الأخرى. أعتقد أن & # 8217s أحد عيوبه الكبيرة. ولكن بينما نطور العلاج الجيني ، هناك فرصة كبيرة لأن يصبح علاجًا سائدًا.

أعتقد أن العلاج الجيني هو حقًا مستقبل أشياء كثيرة ، ليس فقط الأمراض الوراثية. على سبيل المثال ، هناك طرق لمحاولة علاج عدوى فيروس نقص المناعة البشرية بالعلاج الجيني. والفكرة هي أنك قد تحاول ، وقد تأخذ خلايا من الجهاز المناعي لشخص ما من أجسامهم ، ثم تجعلهم غير حساسين لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية ، على سبيل المثال ، عن طريق منعهم من صنع مستقبلات فيروس نقص المناعة البشرية CCR5 ، أو عن طريق التعبير عن جين مضاد للفيروسات هو جزء من جهاز المناعة الفطري. وضع عامل مناعي فطري معدل & # 8211 أنه داخل الخلايا التائية للشخص ، أعاد تلك الخلايا التائية إلى أجسامهم ، ثم تلك الخلايا التائية ، لن تصاب تلك الخلايا المعدلة بالفيروس في أجسامهم . لذلك ، يمكن لتلك الخلايا محاربة الخلايا المصابة بالفيروس. من الممكن نظريًا أن يكون ذلك علاجًا واحدًا ، لكننا بعيدون جدًا عن ذلك. يتعلق الأمر 8217 بتحسين قدرتنا على توصيل الجينات ، ويتعلق الأمر باختيار الجينات المناسبة لعلاج كل اضطراب معين ، ويتعلق الأمر بالتحسن في التسليم الفعلي لهذه الجينات لتحسين كفاءة التسليم وكفاءة التطعيم ، بحيث يتم إرجاع أقصى عدد من الخلايا إلى المريض بشكل فعال.

هناك بعض المخاطر مع العلاج الجيني ، وهناك حالات حيث انتهى الأمر بالأشخاص الذين أصيبوا بفيروسات غاما القهقرية التي تشفر الجين العلاجي بالسرطان. & # 8217s ليس واضحًا تمامًا سبب ذلك. إنه مزيج ، على ما أعتقد ، بين حقيقة أن الجين ، الجين العلاجي ، له خصائص معينة وفيروس غاما القهقرية له خصائص معينة ، وعندما يتم تجميع هذه الخصائص ، فإن ذلك يزيد بشكل كبير من خطر الإصابة بالسرطان.

تلك الدراسات التي اكتشفت السرطان والأطفال الذين عولجوا من متلازمات نقص المناعة ، كانت تلك الدراسات مقلقة للغاية ، لأن الناس اعتقدوا أن هذا ربما سيقتل العلاج الجيني ، وربما نكون في وضع الآن حيث لا تزال المخاطر كبيرة للغاية. لذلك ، من المهم جدًا إجراء العلاج الجيني بطريقة مختلفة ، بطريقة لن تسبب السرطان. أعتقد أن هذا يتحقق باستخدام جين علاجي مختلف قليلاً وباستخدام ناقل مختلف. إن التحول إلى استخدام النواقل القائمة على فيروس نقص المناعة البشرية مدفوع جزئيًا بحقيقة أنها أقل عرضة للتسبب بالسرطان ، لأن فيروس نقص المناعة البشرية عادة لا يسبب السرطان.

كان أحد المخاطر في الأيام الأولى هو أنه إذا تم علاج شخص & # 8217s بالعلاج الجيني باستخدام ناقل فيروس نقص المناعة البشرية ، فماذا لو أصيب بفيروس نقص المناعة البشرية من خلال الانتقال الجنسي الطبيعي. قد يؤدي ذلك إلى حالة يحتوي فيها الفيروس الموجود في أجسامهم على مزيج من الجينومات ، وجينومات الفيروس الذي أصابهم ، بالإضافة إلى جينوم جينوم العلاج الجيني. ثم يمكن أن يصيبوا شخصًا آخر ويمكن أن ينتقل الجينوم المعدل إليهم. لذلك ، توصل الناس إلى طريقة لمنع حدوث ذلك. هناك أجزاء صغيرة من الفيروس يمكنك التخلص منها ، وسيظل الفيروس يعمل ، لكن ظهور فيروس جديد لا يمكنه تجميع ذلك في جزيئات فيروسية. لقد أطلقوا على & # 8217re اسم طفرات ذاتية التعطيل ، وهم & # 8217re آمنون للغاية.

لذا ، فإن إحدى مشكلات إجراء العلاج الجيني بالفيروسات القهقرية ، خاصةً مع فيروس نقص المناعة البشرية ، هو أنه يتعين علينا نقل الخلايا في كل مرة نقوم فيها بعمل الناقل. هذا يعني ، علينا الحصول على خط خلوي في المختبر ، وعلينا وضعه في قوارير وعلينا إدخال الحمض النووي الفيروسي في القوارير طازجًا في كل مرة.هذا يجعله مكلفًا للغاية ، وفي كل مرة تقوم فيها بذلك ، عليك التحقق من أن هذا الإعداد المحدد آمن ، وعليك إجراء الكثير من الاختبارات التنظيمية عليه ، والتي تستهلك بعضًا من الإعداد ويجب عليك إعادة صنعها في كل مرة تريد علاج المريض.

ما نود فعله هو تطوير خط خلوي يحتوي على ناقل العلاج الجيني وينتجه باستمرار. ثم يمكن استخدام الفيروس الذي يخرج من تلك الخلايا كدواء ، ويمكنك زراعة هذه الخلايا لفترة من الوقت والاستمرار في إنتاج فيروس جديد. وهذا يتطلب تطوير خط خلوي ينتج باستمرار كميات كبيرة من ناقلات الفيروسات القهقرية. هذا هو أحد الكفاءات المقدسة في مجال العلاج الجيني لتطوير هذا النوع من الكواشف التي ستوفر باستمرار مصدرًا ثابتًا وآمنًا لناقلات الفيروسات القهقرية التي يتم وضعها في أجسام الأشخاص. أعتقد أن هذا & # 8217s أحد أكبر التحديات.

التحدي الكبير الآخر هو تطوير كل حالة علاج جيني. سيتطلب كل مرض جينًا جديدًا ، لذلك عليك معرفة الجين الذي تريد استخدامه ، والاستراتيجية التي تريد استخدامها لعلاج المريض. يجب أن تكون قادرًا على إصابة الخلية الصحيحة. هناك قدر كبير من العمل في تطوير طرق جديدة لاستخدام تقنيات العلاج الجيني الراسخة لعلاج الأمراض الجديدة. أعتقد ، كما قلت سابقًا ، أن أحد أكثر السمات إثارة لهذا العمل هو استخدام نواقل العلاج الجيني لعلاج السرطان.


استهداف النواقل

يعد استهداف عوامل العلاج الجيني أمرًا مهمًا بشكل خاص لأمراض الالتهاب المناعي الذاتي المزمنة ، حيث يتركز معظمها في نوع واحد من الأنسجة (مع وجود تأثيرات جهازية ثانوية في حالات المرض الشديدة). يعد الأداء الطبيعي لجهاز المناعة خارج العضو أو الأنسجة المصابة أمرًا حيويًا لنجاح تعافي المريض. هناك عدة طرق لتحقيق استهداف خاص بالأنسجة للعلاج الجيني. الأكثر مباشرة هو التسليم المحلي لعامل التحويل أو خارج الجسم الحي الخلايا المنقولة. تشمل الأساليب الأخرى: توظيف صاروخ موجه خاص بالأنسجة خارج الجسم الحي الخلايا المنقولة ، على سبيل المثال ، الخلايا التائية ، 79،132 إدخال المحفزات والمعززات الخاصة بالأنسجة ، وأخيرًا ، تعديل انتفاخ الجسيمات الفيروسية ، بحيث يتم نقل الخلايا التي تعبر عن علامات سطحية معينة فقط. من بين هذه الإستراتيجيات ، فإن الأخيرين فقط يتعاملان مباشرة مع النواقل نفسها وسيتم النظر فيها هنا.

يضمن الاستهداف باستخدام المروجين الخاصين بالأنسجة أن التعبير الجيني العلاجي يحدث فقط في الخلايا التي تعبر عن عوامل النسخ المرتبطة بمواقع محفز الحمض النووي المحددة هذه. يتم عرض بعض المحفزات الخاصة بالأنسجة التي تستهدف الأنسجة المتورطة في أمراض المناعة الذاتية ، أو التي تكون انتقائية للخلايا المناعية في الجدول 2. وسيؤدي توسيع قاعدة البيانات الجينية وتفكيك وظيفة الجين إلى تحديد عناصر محفز أخرى خاصة بالأنسجة لاستخدامها في الجينات علاج أمراض المناعة الذاتية.

أثبت الاستهداف عن طريق تعديل البروتينات السطحية لناقلات الفيروس أنه أكثر إشكالية مما كان متصورًا في البداية. كان هذا بشكل أساسي بسبب حقيقة أن ارتباط الجزيئات الفيروسية بالخلية والاندماج اللاحق للأغشية الدهنية أثبت أنهما عمليتان متميزتان ، والربط نفسه ليس كافيًا للعدوى الناجحة. وفقًا لذلك ، أدت معظم التجارب الواعدة مع التنميط الكاذب للنواقل الفيروسية إلى اتساع الانتفاخ الفيروسي ، حتى إلى حد انتقال غير محدد ، كما في حالة VSV-G ، بدلاً من التسليم المستهدف للجينات المحورة إلى نوع خلية معين.

بالنسبة للفيروسات القهقرية والفيروسات البطيئة ، يتم تسهيل مرحلتي العدوى بواسطة بروتين Env ، ويتضمن الاقتران بينهما تفاعلات معقدة وانتقالات لمجالات مختلفة من البروتين السكري للغلاف. 133 الاستهداف المباشر ، أي تحويل التروبيزم الفيروسي إلى نوع خلية مختلف تمامًا عن الفيروس الأبوي لم يتحقق جزئيًا إلا من خلال إدخال فواصل طويلة بين مجال الارتباط الخارجي وبقية البروتين. 134 قدمت نفس المجموعة لاحقًا موقع انقسام البروتين المعدني المصفوف (MMP) في هذا الفاصل ، بحيث يمكن تشققه بعد الارتباط ، مما يعرض بروتين Env الوظيفي الفيروسي. 135 ومع ذلك ، هذا ليس استهدافًا مباشرًا ، بل هو تقييد نطاق المضيف ، لأنه يتطلب وجود مستقبلات الفيروسات القهقرية الطبيعية على سطح الخلية.

تم تحقيق نتائج مماثلة من خلال إدخال أشكال ربط على سطح virion في مواقع لا تؤثر على الارتباط والاندماج بوساطة المستقبل الطبيعي. على سبيل المثال ، تم تحسين نقل الجينات إلى الخلايا التائية بشكل كبير عن طريق الإدخال على سطح virion لنطاقات الجسم المضاد المحددة على وجه التحديد عن طريق عرض الملتهمة. 136 استندت إستراتيجية أخرى ، الاستهداف العكسي ، إلى اكتشاف أن تكوين بعض أزواج مستقبلات الترابط يمنع التفاعل بين بروتين Env ومستقبلات الفيروسات القهقرية. عامل نمو البشرة (EGF) ومستقبلات عامل نمو البشرة (EGF) هما أهم زوج من هذا القبيل. وبالتالي ، إذا تم عرض EGF على سطح الفيروس الرجعي ، فإن الخلايا التي تعبر عن مستقبلات EGF تقاوم مثل هذه العدوى ، بينما لا يزال من الممكن نقل الخلايا الأخرى بسهولة. يمكن عكس هذه المقاومة بإضافة عامل نمو عامل قابل للذوبان إلى النظام. 137 مؤخرًا ، تم إجراء تجارب مماثلة مع الفيروسات البطيئة في الجسم الحي. على عكس الفيروسات البطيئة غير المستهدفة ، والتي تنقل بشكل رئيسي خلايا الكبد الغنية بمستقبلات EGF ، ناقل عامل EGF الملقح IV. مصابة بشكل رئيسي الخلايا الطحالية. 138

ركزت استراتيجيات تعديل مدار نواقل الإعلان على تعديلات مكون الألياف في القفيصة الفيروسية للسماح بنقل الجينات الخاصة بالأنسجة المستقلة عن طريق CAR. بادئ ذي بدء ، تم فحص بروتينات الألياف من الأنماط المصلية المختلفة من أجل التنميط الكاذب لناقلات الإعلان. تمت تجربة هذا النهج على خلايا CD34 + و 139 DC و 140 و HSCs. 141 بخلاف ذلك ، تم إدخال الروابط المستهدفة في حلقات مقبض بروتين الألياف. من بين هؤلاء ، كان أكثرها واعدًا هو نموذج RGD المرتبط بالإنتجرين ، والذي استهدف انتقال الفيروس الغدي بشكل تفضيلي نحو ، من بين أنواع الخلايا الأخرى ، DCs. 142 حتى الآن ، على الرغم من أن إدخال روابط الاستهداف في مجال المقبض قد حقق توسعًا في الانتفاخ الفيروسي ، ولكن ليس بالضرورة استئصال ارتباط CAR. أدت هذه الحقيقة إلى اتباع نهج أكثر جذرية لاستهداف الإعلان عن طريق الاستبدال الكامل للألياف أو المقبض. 143 تم الحصول على دليل أولي للنتائج الرئيسية فقط بهذه الطريقة ، ويبقى أن يتم توضيح ما إذا كان استقرار الناقل أو كفاءة نقل الجينات سيضعف.

من الواضح أن هناك عقبات كبيرة يجب تجاوزها قبل أن تتمكن الفيروسات من استهداف مجموعات الخلايا الانتقائية بكفاءة. عندها فقط سيكون اختيار استهداف الجزيء ذا أهمية قصوى ، وقد يكون هذا مجالًا يمكن فيه تسخير تقنية عرض الملتهمة بكفاءة لاختيار الببتيدات التي تستهدف حصريًا الخلايا المشاركة في عمليات أمراض المناعة الذاتية. تم إثبات قوة هذا النهج مؤخرًا في دراسة حيث تم تمييز الببتيدات التي ترتبط بالبطانة الزليلية التالية في الجسم الحي اختيار. 144


AAV VECTOR MANUFACTURING & # 8211 التحديات & # 038 الفرص في تصنيع ناقلات AAV المستخدمة في تقديم علاجات العلاج الجيني

تم إحراز تقدم كبير في الاستهداف المحدد لناقلات التوصيل وزيادة الفعالية العلاجية لهذه النواقل لتوصيل الجينات ، مما حفز الاهتمام الكبير في تطوير وتسويق المنتجات العلاجية التي تركز على مؤشرات العلاج الجيني. في السنوات القليلة الماضية ، كان هناك عدد كبير من المخرجات السريرية الإيجابية للمنتجات القائمة على العلاج الجيني والتي تغطي مجالات علاجية واسعة ، بما في ذلك العلاج المناعي للخلايا التائية CAR T ، وعلم الأورام ، والطب التجديدي القائم على الأمراض أحادية الجينات. من حيث توصيل الجينات ، ظهرت النواقل الفيروسية كأدوات مفضلة مفضلة ، مستخدمة في 48٪ من 483 تجربة علاج جيني جارية جارية. 1

من بين منتجات العلاج الجيني قيد التطوير ، تعد النواقل المؤتلفة المستندة إلى فيروس Adeno-Associated (AAV) هي الأكثر استخدامًا حاليًا وتُظهر أكبر إمكانية للتسليم في مؤشرات العلاج الجيني. 1-3 تم إجراء أول تجربة إكلينيكية قائمة على ناقل rAAV قبل 20 عامًا وهي دراسة المرحلة الأولى التي تقدم جينًا متحورًا لـ CTFR عبر ناقل Raav لمرضى التليف الكيسي البالغين المصابين بمرض الرئة الوسطى. 4 في عام 2015 ، تم الإبلاغ عن 103 من المنتجات القائمة على ناقلات rAAV قيد التطوير ، وهو رقم من المتوقع أن يزداد أكثر في السنوات القليلة المقبلة. 1 يرجع الاستخدام المفضل لأنظمة ناقلات rAAV ، جزئيًا ، إلى نقص المرض المرتبط بالفيروس من النوع البري ، وقدرة AAV على نقل الخلايا غير المنقسمة وكذلك المنقسمة ، وما ينتج عن ذلك من جين قوي طويل الأمد. التعبير الذي لوحظ في العديد من تجارب المرحلة الأولى / الثانية. 5 علاوة على ذلك ، يمكن استغلال أنماط مصلية مختلفة من ناقلات rAAV ، سواء كانت طبيعية أو هجينة / صناعية ، لاستهداف الأنسجة والأعضاء والخلايا المختلفة على وجه التحديد ، والمساعدة في التهرب من أي مناعة موجودة مسبقًا ضد الناقل ، وبالتالي توسيع التطبيق العلاجي والتجاري إمكانات العلاجات الجينية القائمة على AAV. 6

في حين أن غالبية (74٪) المنتجات العلاجية القائمة على AAV هي في مرحلة التطوير السريري المبكر إلى المتوسط ​​، فقد ساعد عدد من المخرجات السريرية الواعدة في تقدم خط أنابيب المنتجات المحتملة القائمة على AAV. في عام 2012 ، مُنحت الشركة الهولندية UniQure تصريح تسويق في أوروبا لـ Glybera ® ، وهو علاج جيني قائم على AAV1 لعلاج المرضى البالغين الذين تم تشخيصهم بنقص ليباز البروتين الدهني العائلي (LPLD). أدت النجاحات السريرية الأخيرة لـ AAV- وغيره من العلاجات الجينية الفيروسية القائمة على ناقلات إلى تغذية استثمارات كبيرة في هذا القطاع على هذا النحو ، وهناك طلب متزايد على حلول إنتاج ممارسات التصنيع الجيدة السريرية (GMP) لمنتجات ناقلات الفيروس هذه.

طبيعة التحدي

إن تطوير عمليات تصنيع المعالجات الحيوية الجديدة يستغرق وقتًا طويلاً ومكلفًا. يُنظر إلى إنتاج ناقلات الفيروس المؤتلف على أنه معقد ، مع اعتبار زيادة الإنتاج تحديًا كبيرًا من الناحية الفنية ، وحاجزًا كبيرًا للتسويق.

تتراوح الجرعات السريرية المُبلغ عنها للنواقل الفيروسية المستندة إلى AAV من 1011 إلى 1014 جسيمًا جينوميًا (ناقل الجينوم vg) لكل مريض يعتمد على المنطقة العلاجية. 1،3،6 من منظور تطوير العلاج الجيني الأوسع ، فإن مناهج التوسع الحالية تقصر عن توفير العدد المطلوب من الجرعات للسماح لمسارات المرحلة اللاحقة (II / III) بالتقدم ، وبالتالي تأخير تطوير منتجات العلاج الجيني. ويدعم ذلك حقيقة أن غالبية الدراسات السريرية كانت صغيرة جدًا ، وأجريت على 100 مريض (وفي بعض الحالات & lt10) ، باستخدام عمليات تعداء الخلايا الملتصقة التي تولد كميات متواضعة جدًا من المنتج. عند مقارنة الكميات المتوقعة من الفيروسات المطلوبة لتطوير المرحلة اللاحقة بالإنتاجيات الحالية (حوالي 5x 1011 vg من مصنع خلية واحدة ذات 10 طبقات) ، هناك قلق حقيقي من أن هذا النهج لن يفي بمتطلبات المواد للمرحلة المتأخرة وفي السوق يحتاج حتى للأمراض اليتيمة للغاية ، والتي لها جرعات عالية وأتراب صغيرة من المرضى ، ناهيك عن المزيد من مؤشرات العلاج الجيني "القياسي".

في حالة AAV ، يوجد عدد من استراتيجيات الإنتاج لتوليد ناقلات فيروسية كما هو الحال مع جميع الاستراتيجيات المختلفة ، يرتبط عدد من المزايا والعيوب مع كل منها.

خطوط الخلايا الثابتة للإنتاج

يؤدي توليد خطوط الخلايا الهندسية المستقرة ، من خلال إدخال كل من الجينات التنظيمية (Rep) والجينات الهيكلية (Cap) و / أو جينوم rAAV ، إلى ظهور خطوط الخلايا المنتجة أو التغليف ، على التوالي. يتم إنتاج النواقل الفيروسية AAV من خطوط خلايا التعبئة بعد تعداء تكوين AAV والعدوى المشتركة بفيروس مساعد ، مثل الفيروس الغدي (Ad) أو فيروس الهربس البسيط (HSV) أو عن طريق عدوى واحدة مع ناقل فيروسي مساعد مؤتلف يحتوي على جينوم rAAV. بالنسبة لخطوط الخلايا المنتجة ، يتم إنشاء AAV بعد إصابة من خطوة واحدة بفيروس Ad أو HSV المساعد. تم الإبلاغ عن خطوط الخلايا المستقرة لإنتاج جزيئات جينوم ناقل AAV (vg) عالية نسبيًا لكل خلية (تصل إلى 10000 فولت لكل خلية منتجة). تم إنشاء خطوط خلايا التغليف والمنتج باستخدام خطوط الخلايا القادرة على النمو الملتصق والمعلق ، مما يسمح بتطوير العمليات التي تستخدم أنظمة زراعة الأنسجة التقليدية على نطاق صغير ، جنبًا إلى جنب مع التصنيع على نطاق واسع الذي يتم إجراؤه في المفاعلات الحيوية المعلقة. تم استخدام هذا النهج القابل للتطوير في إنتاج منتج AAV1 لفشل القلب هنا تم إنشاء الناقل الفيروسي بمقياس 2000 لتر من خط خلايا منتج HeLaS3 ، بعد الإصابة بالفيروسات المساعدة. 7

على الرغم من العائد المرتفع نسبيًا وقابلية التوسع المبلغ عنها ، فقد أدى عدد من العيوب إلى الحد من استخدام خطوط خلايا المنتج والتعبئة في التطوير السريري. يتطلب إنشاء خطوط مستقرة تقنيًا ، ويستغرق وقتًا طويلاً للغاية ، ويجب إجراؤه لكل مجموعة من النمط المصلي المتجه و AAV. يعد توصيف النسيلة واستقرار خط الخلية مستهلكًا للوقت ومكلفًا للغاية ، كما أنه يحمل مخاطر محتملة تستند إلى تاريخ مرور الخلية والعلاقة بين حركية النمو وإنتاج المتجهات. مصدر القلق الرئيسي هو استخدام المتغيرات الهجينة والإعلان المساعد في هذه الأنظمة. يمكن أن يكون إنتاج الفيروس المساعد نفسه مكلفًا للغاية وطويلًا ، مع الحاجة إلى إجراء تقييم دقيق لجودة مادة البداية المهمة هذه قبل استخدامها في إنتاج AAV. علاوة على ذلك ، فإن وضع إجراءات إزالة وإزالة فعالة لفصل الفيروس المساعد بعيدًا عن منتج ناقل AAV ليس بالأمر الهين ، مما يؤدي إلى تطوير عملية معقدة ومكلفة وتكلفة عالية محتملة للسلع.

نظام إنتاج البكتيريا

ظهر إنتاج نواقل AAV باستخدام نظام التعبير Baculovirus (BV) كنتيجة لقدرة نظام BV على إنتاج بروتينات معقدة مؤتلفة مع الغليكوزيلات بمستويات عالية في خلايا حشرات SF9 بكثافة خلايا عالية. بناءً على إنتاج AAV عبر نظام خط خلوي مستقر ، تم تطوير نظام BV لإنتاج ناقل فيروسي دون الحاجة إلى الإصابة بفيروس مساعد بشري. تم إنتاج AAV2 في خلايا الحشرات Sf9 بعد الإصابة المشتركة بثلاثة نواقل BV المؤتلفة ، مما يؤدي إلى ترميز الجينات المحورة لجينوم Rep و Cap و rAAV ، على التوالي. منذ ذلك الحين ، تم تعديل وتحسين نظام BV ، مع تطوير الأنظمة الآن التي تستخدم نهجًا ثنائي الاتجاه ، مما يقلل من تعقيد العملية. تم أيضًا استخدام حلول قابلة للتطوير أحد الأساليب المستخدمة في خلايا الحشرات المصابة بالتهاب المهبل البكتيري المحفوظة بالتبريد والتي تحمل بشكل منفصل مكونات AAV المطلوبة (جينوم rAAV و Rep و Cap). تم استخدام الخلية المصابة لتلقيح مفاعل حيوي بحجم 200 لتر يحتوي على خلايا حشرية غير معدلة ، وأطلق rBV المعدية (rAAV ، rCAP ، rRep) بطريقة مستمرة أصابت الخلايا غير المصابة لاحقًا ، وبالتالي دفع مرحلة إنتاج مستدامة. 8

حاليًا ، يتم إنتاج عقار Glybera المستند إلى AAV1 باستخدام نظام BV ، ومع ذلك ، فقد حدت العديد من العيوب من استخدام نظام BV لإنتاج ناقلات AAV في البيئة السريرية. إن التغلب على جوانب بيولوجيا الخلية الجزيئية اللازمة لإنتاج ناقل فيروسي للثدييات في نظام خلية حشرية باستخدام فيروس الحشرات ، قد واجه تحديات كبيرة لعدم استقرار جينات AAV داخل BV ، إلى جانب عدم القدرة على تجميع جسيمات AAV باستخدام القياس المتكافئ الصحيح لبروتينات القفيصة ، يؤثر على عدوى الناقل الفيروسي AAV المنتج. على غرار أنظمة إنتاج خط الخلية المستقرة ، هناك تحديات في تطهير وإزالة BV بدء وانتشار من ناقلات الفيروس AAV أثناء عملية تنقية المصب. ومع ذلك ، تستخدم العديد من شركات المستحضرات الصيدلانية الحيوية حاليًا أشكال مختلفة من منصة BV ، وتعمل بنشاط على تحسينات للتخفيف من قيود نظام BV ، والانتقال نحو تصنيع rAAV السريري على نطاق واسع.

نقل عابر بدون مساعدة

تعد تعداء DNA البلازميد العابر إلى خلايا الثدييات لإنتاج ناقلات الفيروس AAV هي الإستراتيجية الأكثر شيوعًا في تصنيع الصف السريري لهذه النواقل الفيروسية. عادةً ما يتم إنتاج نواقل rAAV في 293 خلية جنينية بشرية (HEK293) ، أو متغيرات خلايا HEK293 بعد إدخال (تعداء) عادةً ثلاثة بلازميدات DNA تحمل الجينات التنظيمية (Rep) والقفيصة الهيكلية (Cap) ، والجين المتحور rAAV ، والجينات المحددة. الجينات التي توفر وظيفة الإعلان المساعد. إذا تم نقل جميع البلازميدات الثلاثة بنجاح إلى خلية ، فستنتج الخلية ناقل rAAV دون الحاجة إلى الإصابة بالفيروس المساعد من النوع البري. يعتبر نهج تعداء العدوى سريعًا إلى حد ما ومتعدد الاستخدامات وقد تم استخدامه لإنتاج أنماط مصلية مختلفة من rAAV ، حيث يجب فقط تغيير التسلسل الجيني لجينات Cap لإنتاج الأنماط المصلية المختلفة. علاوة على ذلك ، يسمح تعديل بلازميد الجينات المحورة بتوليد كل من الأشكال الفردية والمزدوجة (ذاتية التكميل) للناقل.

مرة أخرى ، يتمثل التحدي الرئيسي لهذا النهج في الافتقار المتأصل إلى قابلية التوسع بسبب استخدام خلايا HEK293 الملتصقة. على هذا النحو ، تتطلب أنظمة الخلايا الملتصقة نهجًا موسعًا يعتمد على التوسع الخطي لمساحة السطح ثنائية الأبعاد ، بدلاً من نهج التوسع ثلاثي الأبعاد الحجمي المستخدم عادةً في إنتاج المستحضرات الصيدلانية الحيوية. من أجل إنتاج وتنقية الجينوم المتجه (vg) لأعداد الجسيمات & gt1 & # 2151016 vg لدعم التجارب السريرية في المرحلة المتوسطة إلى اللاحقة ، أكثر من 500 Hyperstacks ™ (يحتوي Hyperstack على 36 طبقة ومساحة السطح الإجمالية 18000 سم 2) ستكون هناك حاجة. في حين أن هذا النهج ممكن ، إلا أنه ليس خيارًا قابلاً للتطبيق لمعظم منشآت التصنيع بسبب تأثير المنشأة والتكلفة والقيود المفروضة على الطاقة البشرية. يجري العمل على تطوير حلول إنتاج قابلة للتطوير ومتوافقة مع التنظيمات لتوليد ناقلات rAAV. تم تكييف خلايا HEK293 مع نمو المعلق في أنظمة الوسائط الخالية من المكونات الحيوانية ، والخالية من المصل ، والخالية من المضادات الحيوية ، مع تحسين ظروف انتقال العدوى التي تم تقييمها في دورق الاهتزاز ، والتأرجح ، وأنظمة المفاعلات الحيوية ذات الخزان المقلوب.

تنقية المتجه الفيروسي DOWNSTREAM

بصرف النظر عن عمليات الإنتاج النواقل والمقاييس ، فإن الهدف النهائي لتصنيع ناقلات AAV هو الحصول على تنقية نهائية قوية تولد مواد إكلينيكية نهائية ذات عيار عالٍ وفعالية عالية ونقاوة عالية. نظرًا للطبيعة الناشئة لحقل ناقلات الفيروس ، فإن معظم المناهج النهائية تعتمد على العمليات المختبرية التقليدية غير القابلة للتطوير أو المناسبة للتصنيع من الدرجة السريرية. توجد قيود في جميع مراحل التنقية النهائية للناقلات الفيروسية ، وهي تشمل: حصاد الخلايا المنتجة ، وإجراءات تحلل الخلايا لإطلاق ناقلات AAV ، وتوضيح وإزالة الشوائب الخلوية ، وفصل النواقل وتنقيتها ، وصياغة النواقل والترشيح المعقم.

يمكن تمثيل التحدي بالطريقة التي تم بها فصل الجسيمات النواقل المحتوية على الجينوم تقليديًا عن الجسيمات الفارغة باستخدام الطرد المركزي الفائق التدرج.في حين أن المواد الناتجة التي تم الحصول عليها من هذه الخطوة ذات نقاوة عالية وفعالية عالية ، فإن الطبيعة المستهلكة للوقت وتعقيد التوسع يحدان بشكل كبير من استخدام الطرد المركزي الفائق في عملية المصب. بالنسبة للاستطبابات العلاجية ، بخلاف تلك التي تركز على الأمراض اليتيمة للغاية التي تتطلب تنقية كميات صغيرة من المواد ، تتطلب الحاجة إلى معالجة كميات كبيرة طريقة بديلة للتنقية. على هذا النحو ، يتم تطوير النهج القائمة على الكروماتوغرافيا باستخدام ربط التقارب و / أو خطوات التبادل الأيوني التي توفر الكفاءة والمرونة وقابلية التوسع لتنقية نواقل AAV. نظرًا لأن النواقل عالية النقاء وعالية الفاعلية يمكن إنشاؤها باستخدام مناهج الطرد المركزي الفائق ، فإن التحدي الذي يواجه نهج التنقية الكروماتوغرافي هو إنشاء نواقل بنفس الدرجة من النقاء والفعالية. لذلك يجب مراعاة التنظيمات لأي تغيير في العملية أثناء برنامج التطوير السريري. أيضًا ، نظرًا للتباينات الكيميائية والبيولوجية التي لوحظت بين الأنماط المصلية المختلفة لـ AAV ، قد يكون تطوير منصة واحدة لاحقة لجميع نواقل AAV غير مرجح بدلاً من ذلك ، من المحتمل استخدام عدد من الحلول المحتملة.

الأنظمة التحليلية لتوصيف المنتجات وعمليات أمبير

التطورات جارية لتحسين عمليات التصنيع السريرية والانتقال إلى أنظمة إنتاج وتنقية قابلة للتطوير والتحكم. ومع ذلك ، يتم إعاقة ذلك بسبب نقص المعرفة بمعالجة المعلمات الحرجة في جميع مراحل عملية التصنيع ، مدفوعًا بعدم وجود أنظمة تحليلية مناسبة لدعم دراسات التنمية ، والتحقيق في عمليات الإنتاج والتحكم فيها ، وكذلك توصيف المواد النهائية. 9 يرتبط تحدي التصنيع بالمتطلبات التنظيمية لتحديد وتوصيف والتحكم من دفعة إلى دفعة للشوائب المرتبطة بالعملية والمنتج الموجودة في المواد عالية النقاء. تمثل الشوائب المتعلقة بمنتجات ناقل AAV تحديًا بشكل خاص ، والتي تشبه إلى حد كبير المتجه نفسه.

يمكن لجسيمات ناقل AAV أن تشارك في تغليف مادة بلازميد غير محددة في الكبسولة. تم الإبلاغ عن أن ما بين 1 ٪ و 8 ٪ من جسيمات AAV المنقى تحتوي على تسلسل غير صحيح للحمض النووي. 7 نظرًا لأن نطاقات الجرعة السريرية المُبلغ عنها تختلف من 1011 إلى 1014 جسيمًا جينوميًا ، يمكن أن يكون هناك ما يصل إلى 109 شوائب مغلفة لكل جرعة. تتطلب هذه الشوائب المتعلقة بالعملية توصيفًا تفصيليًا ، جنبًا إلى جنب مع تقييم احتمالية أن يكون الحمض النووي المعبأ بشكل غير صحيح نشطًا في الخلايا المنقولة. 10

ومن المثير للاهتمام ، أن معظم البلازميدات المستخدمة حاليًا في ترنسفكأيشن عابر تحمل جينًا مقاومًا للمضادات الحيوية لتمكين اختيار البلازميد وصيانته أثناء إنتاجها. لذلك ، سيكون من المرغوب فيه إزالة الجينات المقاومة للمضادات الحيوية لإنتاج AAV في أنظمة خالية من المساعد. توجد التكنولوجيا ، مثل نظام صيانة البلازميد المشغل (ORT ™) الحاصل على براءة اختراع من كوبرا ، لتوليد DNA البلازميد الذي يفتقر إلى جينات مقاومة المضادات الحيوية. 11 تقضي هذه الأنظمة على فرصة التغليف المشترك لجين وظيفي مقاوم للمضادات الحيوية في القفيصة الفيروسية ، وبالتالي زيادة سلامة المنتج وتقليل عبء توصيف الشوائب المرتبطة بـ AAV.

رؤية لمنصة إنتاج قابلة للتطوير قائمة على المعرفة

لا تزال هناك حاجة واضحة لتحسين إنتاجية العملية ، والحاجة إلى تطوير عمليات التصنيع التي يمكن تطبيقها على عدد كبير من المرشحين العلاجيين للناقلات الفيروسية المستندة إلى AAV. بشكل مبسط ، فإن ناقل AAV هو وسيلة توصيل لجين علاجي ، وعملية التصنيع ليست مرتبطة بهذا الجين. لذلك يفرض المنطق أنه يجب أن يكون من الممكن إنشاء عمليات النظام الأساسي الخاصة بالأنماط المصلية لـ AAV وحتى من الممكن إنشاء عمليات يمكن تطبيقها على أنماط مصلية متعددة. هذا النهج ليس غير مسبوق ، فقد كان لتطوير عمليات التطوير والتصنيع القائمة على المنصة التي تفصل الإنتاج عن منتجات معينة تأثير هائل في المجالات البيولوجية الأخرى (مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة) ، مما يقلل من تكلفة التطوير والجداول الزمنية وتكلفة السلع ، كما سمح لمطوري الأدوية بتوسيع خطوط الأنابيب السريرية بشكل كبير في مجالات علاجية متعددة.

لتحقيق ذلك بالنسبة لمتجهات AAV ، يجب إنشاء المعرفة العلمية الداعمة المحيطة بالمعلمات التشغيلية الحرجة في عملية التصنيع وتحسينها ، جنبًا إلى جنب مع مجموعة من الأساليب التحليلية القياسية. يجب أن تكون أي منصة تم تطويرها مرنة بما يكفي لاستيعاب أنواع ناقلات AAV المتعددة. سيكون لمثل هذا التطوير فوائد طويلة الأجل لتوليد المواد للدراسات التي يجريها الإنسان أولاً ، وما بعده للدراسات السريرية في المراحل المتأخرة وفي النهاية الإمداد في السوق.

1. سوق العلاج الجيني 2015-2025 ، تقرير تحليل الجذور (2015).
2. Ginn SL ، Alexander IE ، Edelstein ML ، Abedi MR ، Wixon J. التجارب السريرية للعلاج الجيني في جميع أنحاء العالم حتى عام 2012 - تحديث. J جين ميد. 201315: 65-77.
3. أوكادا. العلاج الجيني والأدوات والتطبيقات المحتملة. 2013C17.
4. فلوت وآخرون. همهمة جين هناك. 19967: 1145-1159.
5. أوكادا وآخرون. طرق الانزيم. 2002346: 378-393.
6. وو وآخرون. العلاج الجزيئي. 200614: 316-327.
7. حجار وآخرون. فشل بطاقة J. 200814: 355-367.
8. Cecchini et al. هموم جين ثير 201122: 1021-1030.
9. رايت جي إف. الطب الحيوي. 20142: 80-97.
10. الجودة ، والقضايا غير السريرية والسريرية المتعلقة بتطوير rec. ناقلات AAV 24 يونيو 2010 ، EMEA / CHMP / GTWP / 587488/2007.
11. كرانينبرج. وآخرون. الدقة الأحماض النووية. 200129: e26.

لعرض هذه المشكلة وجميع المشكلات السابقة عبر الإنترنت ، يرجى زيارة www.drug-dev.com.

دكتور دانيال سي سميث يشغل منصب كبير المسؤولين العلميين في Cobra Biologics ويتولى مسؤولية تطوير أعلى مستوى من التميز العلمي عبر المجموعة وتعزيز منصات البحث والتطوير الخاصة ببروتينات كوبرا DNA والفيروسات والميكروبات والثدييات. قبل انضمامه إلى كوبرا ، أمضى 4 سنوات مع فريق bioProcessUK في HealthTech & amp Medicines Knowledge Transfer Network (KTN) ، حيث كان يقود أجندة الابتكار للمعالجة الحيوية في المستحضرات الدوائية الحيوية في المملكة المتحدة كمدير نقل المعرفة. اكتسب الدكتور سميث خبرته الصناعية في كوبرا في مجموعة متنوعة من الأدوار التي تقدمت من عالم كبير إلى مدير تطوير علمي تجاري ، مسؤول عن تطوير إستراتيجية مشاريع العملاء ، إلى جانب الحفاظ على الإشراف العلمي لمشاريع Cobra للبحث والتطوير. حصل على درجة البكالوريوس (مع مرتبة الشرف) في الكيمياء الحيوية ودكتوراه في بيولوجيا الخلايا الجزيئية. لديه أكثر من 20 منشورًا بحثيًا لحسابه وقد عمل مع عدد من المجموعات الأكاديمية في جميع أنحاء المملكة المتحدة وأوروبا والولايات المتحدة ولديه خبرة بحثية أكاديمية واسعة في بيولوجيا الخلية والبيولوجيا الجزيئية وعلم المناعة والكيمياء الحيوية للبروتين ، مع خبرة خاصة في السموم التي أساسها البروتين ونواقل التوصيل الخلوية.


5. المصادر الرئيسية للخلايا الجذعية البالغة

5.1 الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام (BMSCS)

كان نخاع العظام هو المصدر الرئيسي للخلايا الجذعية اللحمية المتوسطة ، ومع ذلك ، فإن جمع نخاع العظم هو غازي وعزل MSC غير فعال (& # x0003c0.05٪) [86،87]. BMSCs قادرة على الخضوع لعملية اندماج الخلايا ، وهي عملية طبيعية لخلط المواد الجينية التي تعدل أنماط التعبير الجيني [88]. يساهم اندماج الخلايا في التجدد والتطور الطبيعي والاستجابة المناعية وتكوين الأنسجة ويلعب دورًا بارزًا في مرونة الخلايا الجذعية [89]. في الواقع ، يمكن أن يؤدي اندماج الخلية إلى تعديل برنامج الجينات والتحكم في مصير الخلية ، وتحويل الخلية إلى حالة غير ناضجة لتحقيق وظيفة تجديد [90].

زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم هو العلاج بالخلايا الجذعية الأول والأكثر انتشارًا [91]. hMSCs المستمدة من نخاع العظام قادرة على التمايز إلى الخلايا الظهارية للكبد والرئة والجهاز الهضمي والجلد [92].

تم تطبيق hMSCs المستنبتة المشتقة من نخاع العظم على الجروح ، باستخدام نظام رش الفيبرين المتخصص ، يتم حاليًا تنفيذ هذا النهج ويفترض أن يكون آمنًا وصالحًا لإدارة الخلايا الموضعية ، على الرغم من عدم وجود بيانات صلبة لدعم صحتها [93].

5.2 الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCS)

الخلايا الجذعية / اللحمية المشتقة من الدهون (ADSCs) هي خلايا جذعية جسدية متعددة القدرات يمكن أن تتمايز إلى عدة سلالات ، بما في ذلك الخلايا الدهنية والخلايا الغضروفية وخلايا بانيات العظم والخلايا البطانية والظهارة وخلايا عضلة القلب والخلايا العصبية [94]. تم الإبلاغ عن وجود الخلايا الجذعية داخل الأنسجة الدهنية لأول مرة في عام 2001 [95]. غالبًا ما توصف بالخلايا الشحمية المعالجة (PLA) ، أو الخلايا الجذعية الأولية ، أو الخلايا الجذعية الدهنية ، على الرغم من أن الجمعية الدولية للتكنولوجيا التطبيقية للدهون توصي بالمصطلح & # x0201cADSCs & # x0201d [6]. تعبر ADSCs عن علامات خاصة بالخلايا الوسيطة وعلامات جزيئية نموذجية للنمط الظاهري للخلايا الجذعية الجنينية: OCT4 و Nanog و Sox2 [96،97]. ADSCs غير متجانسة ، وتختلف تبعًا لمناطقها التشريحية واعتمادًا على نوعها (أبيض أو بني) [98].

تشير الأبحاث الحالية إلى أنها قد تكون في الواقع متعددة القدرات وتشكل أنواعًا من الخلايا لجميع الطبقات الجرثومية الثلاث [99]. تمثل ADSCs مصدرًا واعدًا للخلايا الجذعية الوسيطة للبالغين ، ويرجع ذلك أساسًا إلى أن العزل أقل توغلاً وأكثر كفاءة [6،71]. الدهون المستنشقة متوفرة بكثرة في العديد من إجراءات الجراحة التجميلية & # x02014e.g. شفط الدهون ونحت الدهون & # x02014 ويمكن تنقية الخلايا الأولية للحصول على جزء الأوعية الدموية اللحمية الغني بـ ADSC (SVF) [100]. SVF عبارة عن خليط غير متجانس يحتوي على خلايا بطانية وخلايا preadipocytes وخلايا ليفية وخلايا وعائية وضامة والعديد من الخلايا الجذعية الوسيطة [6] ويتم دراسته الآن كمكمل لنقل الدهون الحر من أجل زيادة المحصول [101]. يمكن أن يؤدي توسع مجموعات ADSC في المزرعة إلى إنتاج خلايا سلفية أكثر بما يتراوح بين 100 إلى 1000 مرة أكثر من العزلة من نخاع العظم [102].

إلى جانب كونها واحدة من أغنى مصادر ASCs في جسم الإنسان ، فإن الأنسجة الدهنية هي أيضًا عضو من أعضاء الغدد الصماء التي تفرز العديد من الهرمونات وعوامل النمو والسيتوكينات التي تدعم التئام الجروح والوظائف الأخرى مثل الليبتين وعامل نمو البشرة وعامل نخر الورم- & # x003b1 ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي ، عامل نمو الخلايا الكيراتينية ، عامل النمو المحول - & # x003b21 (TGF - & # x003b21) ، عامل نمو البطانة الوعائية ، عامل نمو الخلايا الكبدية ، الإنترلوكين (IL) -6 ، IL-7 ، IL- 8 ، IL-11 ، IL-12 ، عامل تحفيز مستعمرات البلاعم ، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ، عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ ، عامل تحفيز مستعمرة المحببات وعامل تثبيط اللوكيميا [6،102]. تعتبر تأثيرات الباراكرين ذات أهمية كبيرة في العديد من علاجات الخلايا الجذعية ، مما يخلق بيئة مواتية لتطوير خلايا أكثر وظيفية وإصلاح الأنسجة ، من خلال تعزيز الأوعية الدموية الجديدة ، وآليات إصلاح الجينات الداخلية وتنظيم الاستجابات المناعية [77،103].

تمثل ADSCs مصدرًا عالي الكفاءة لـ iPSCs [104]. يمكن استخدامها لاختبار سمية الأدوية ، مما يقلل الحاجة إلى الحيوانات. قد توفر أيضًا أداة مهمة للعلاج الجيني القائم على الخلايا في مجال التئام الجروح ، لأن ADSCs يمكن أن تنتقل بكفاءة (أعلى من 60٪) مع النواقل [12105].

أظهرت التجارب السريرية المختلفة القدرة التجديدية للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون في التخصصات الفرعية في المجالات الطبية مثل الجراحة التجميلية (لإعادة بناء الثدي وحشو الدهون) ، والجراحة العامة (لعلاج النواسير المزمنة في مرض كرون) ، وجراحة العظام ، وجراحة الفم والوجه والفكين. الجراحة (لتحفيز إصلاح العظام في عيوب القلبية) وأمراض القلب (أمراض القلب الإقفارية واحتشاء عضلة القلب الحاد) [77106107]. مع خطر تحول الورم الخبيث وعدم التجانس ، ومع ذلك ، لا توجد أدلة كافية لتشجيع الاستخدام الواسع والآمن لـ ADSCs وهناك حاجة إلى مزيد من البحث [108-110]. قد تؤدي الدراسات المستقبلية لتحسين تمايز ADSCs إلى خلايا ناقصة إلى إطلاق إمكاناتها العلاجية في الطب التجديدي.

بشكل عام ، تعد الخلايا الجذعية المستضدّة الخبيثة (ADSCs) واعدة لاستخدامها في إصلاح الأنسجة وتجديدها ، نظرًا لتوافرها ، وإفراز عامل تكوّن الأوعية ومضاد للاستماتة ، والتأثيرات المناعية والتمايز متعدد السلالات ، لتصبح واحدة من أشهر الخلايا الجذعية البالغة التي تم استكشافها حاليًا [6 ، 77100103111].

5.3 الحبل السري (الدم) الخلايا الجذعية المشتقة

يظل الحبل السري (UC) والخلايا الجذعية المشتقة من دم الحبل السري أكبر مصدر محتمل للخلايا الجذعية في العالم ، مع الأخذ في الاعتبار معدل المواليد العالمي البالغ حوالي 135 مليون سنويًا [86]. يمثل الحبل السري مصدرًا معروفًا للخلايا السلفية البطانية [112]. يحتوي دم الحبل السري على الخلايا المكونة للدم وكذلك الخلايا الجذعية غير المكونة للدم ، وهذه الأخيرة تسمى أيضًا CBEs (الخلايا الجذعية الشبيهة بالجنين في دم الحبل السري) [113،114]. لقد ثبت أن CBE تتمايز إلى سلائف عصبية ، كبدية صفراوية ، تشبه البنكرياس وربما أخرى [115،116].

دم الحبل السري للإنسان هو مصدر غني للخلايا الجذعية المكونة للدم للتطبيق السريري وقد يكون أحد أكبر مصادر الخلايا الجذعية ذات الحالة المناعية الساذجة [12،101].

من الأعمق إلى الأبعد ، تشتمل الطبقات داخل جامعة كاليفورنيا على الأوعية ، وهلام وارتون أو المصفوفة ، والغشاء الأمنيوسي أو بطانة الحبل ، أو الظهارة أو الطبقة السفلية [86]. يؤدي هلام وارتون إلى ظهور الخلايا الجذعية الوسيطة وله كثافة خلايا أقل ، ومع ذلك يسمح لنا بعزل العديد من الخلايا بسرعة [117]. قطعة واحدة بحجم 5 & # x0201310 مم 3 من هلام وارتون لديها القدرة على إنتاج ما يصل إلى 1 مليار MSCs في 30 يومًا مع الأخذ في الاعتبار أن متوسط ​​UC يبلغ 50 سم [15] ، فهي تمثل بلا شك مصدرًا غنيًا للـ SCs. الخلايا حول الأوعية الدموية للحبل السري البشري متطابقة تقريبًا مع الخلايا الجذعية الوسيطة لجيلي وارتون [118] (الشكل 2).

تشريح الحبل السري. مستنسخة من [10] بإذن من Rightslink.

يحتوي الحبل السري على أوعية (شريانان ووريد واحد) وهلام وارتون والغشاء الخارجي.

أحيانًا يكون الغشاء الأمنيوسي وبطانة الحبل كلمات قابلة للتبديل تشير إلى غشاء جامعة كاليفورنيا بشكل عام ، أو تشير إلى أنواع مختلفة من الخلايا. يعد الغشاء الخارجي لجامعة كاليفورنيا مصدرًا غنيًا للغاية بالخلايا الجذعية التي تساعد على تسطيح الحروق [12]. تؤدي بطانة الحبل إلى ظهور خلايا جذعية طلائية متعددة القدرات (الخلايا الجذعية الظهارية CL) [86].

الخلايا الجذعية المبطنة للحبل واللحمة المتوسطة (CL-MSC) تعبر عن CD23 و CD14 وكميات منخفضة من CD34 و CD35 فهي لا تعبر عن العلامة البطانية CD31 ولديها أكبر في المختبر توسع من MSCs المشتقة من الهلام في وارتون [119]. CD14 يثبط الخلايا التائية. لا تعبر MSCs المشتقة من هلام وارتون عن CD14 أو CD23. على الرغم من هذه الأوصاف ، فإن علامات الخلايا في الخلايا الجذعية السرطانية المشتقة من الحبل السري تخضع لنقاش كبير [86120] (الشكل 3).

الصور المجهرية للخلايا الظهارية المبطنة للحبل (أ) وخلايا اللحمة البطانية للحبل (ب). مستنسخة من [12] بإذن من Righstlink.

بشكل عام ، يمكن أن تتمايز الخلايا الجذعية السرطانية المشتقة من الحبل السري إلى العظام والجلد والبطانة وخلايا الكبد والأنساب العصبية وغيرها. الخلايا الجذعية التي يحيط بالجنين المشتقة من الغشاء الذي يحيط بالجنين يمكن أن تتمايز على وجه التحديد إلى العظام والغضاريف والدهون [12121].

فيما يتعلق بأمراض الدم ، يرتبط عدم نضج خلايا دم الحبل السري (UCB) بانخفاض المناعة ، مما يقلل من تفاعلها مع التطعيم ضد المضيف مقارنة بطعوم نخاع العظم المأخوذة من البالغين [122]. من ناحية أخرى ، يمد دم الحبل السري الخلايا الجذعية متعددة القدرات بمعدل 30٪ أقل من تلك التي يتم الحصول عليها من نخاع العظم البالغ [101]. تم تقديم دم الحبل السري كمصدر بديل لـ HSCs الخيفي بعد نجاح زراعة الحبل السري في طفل مصاب بفقر دم فانكوني. تشترك كل من عمليات زرع دم الحبل السري وعمليات زرع النخاع العظمي المتطابقة غير ذات الصلة في البقاء على قيد الحياة الخالية من الأمراض والوفيات المرتبطة بالزراعة [91]. سيحتاج المزيد من البحث إلى توضيح متى يكون من الأفضل تحديد زرع دم الحبل السري الخيفي [124].

فيما يتعلق بالحروق والتئام الجروح الجلدية ، قد يظهر الحبل السري والغشاء الأمنيوسي كمصادر جديدة واعدة للبشرة المصممة بالخلايا & # x0201coff-the-shelf & # x0201d [86]. علاوة على ذلك ، قد تؤدي الإدارة المشتركة لعدة أنواع من الخلايا الجذعية إلى فوائد تآزرية [77] ، مما يشير إلى استخدام كل من الخلايا الجذعية الظهارية والخلايا الجذعية الوسيطة.

5.4. الخلايا الجذعية لبصيلات الشعر

تعد بصيلات الشعر مصدرًا واعدًا لخلايا جذعية فعالة متعددة (أو متعددة) يمكن الوصول إليها بسهولة والتي لا تكون سرطانية ولا تحمل أي مخاوف أخلاقية ، على عكس الخلايا الجذعية الجنينية أو الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات. في الواقع ، يعتبر العديد من الباحثين أن بصيلات الشعر هي المصدر الواعد للخلايا الجذعية متعددة القدرات [19124].

تعد الخلايا الجذعية متعددة القدرات لبصيلات الشعر في فروة الرأس إيجابية بالنسبة لـ nestin وعوامل نسخ الخلايا الجذعية الجنينية Nanog و Oct4. يمكن لهذه الخلايا أن تتمايز إلى خلايا عصبية وخلايا عضلية ملساء وخلايا صباغية [125]. تحتوي منطقة انتفاخ بصيلات الشعر على خلايا nestin سلبية إيجابية K15 يمكن لهذه الخلايا أن تتمايز إلى خلايا كيراتينية وخلايا عصبية وخلايا دبقية وخلايا عضلية ملساء [126].

تعزز الخلايا الجذعية لبصيلات الشعر البشرية إصلاح الأعصاب أو التعافي الوظيفي للعصب المحيطي والحبل الشوكي المصاب [127].

تؤدي الخلايا الجذعية المنتفخة لبصيلات الشعر إلى تكوين خلايا بصيلات الشعر وخلايا البشرة. تشكل الخلايا الجذعية لبصيلات الشعر الخلايا الجذعية للبشرة فقط عند إصابة البشرة أو إجهادها [128]. تستجيب الخلايا الجذعية المنتفخة بسرعة لجرح البشرة عن طريق توليد خلايا TA قصيرة العمر مسؤولة عن إصلاح الجرح الحاد [129] (الشكل 4). تم تخصيص بحث مكثف لهذا المصدر الواعد للعلاج بالخلايا الجذعية لتحسين التئام الجروح.

انتفاخ بصيلات الشعر والخلايا الجذعية متعددة القدرات. مستنسخة من [19] بإذن من ولترز كلوير.

تمثيل تخطيطي للظهارة الجلدية وأنساب الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة الفعالية في انتفاخ بصيلات الشعر. في ظل ظروف الحالة المستقرة ، تكون الخلايا الجذعية هادئة. في بداية دورة الشعر عندما يتم تجديد البصيلة السفلية والمصفوفة ، تتكاثر الخلايا الجذعية في الانتفاخ لتكوين خلايا كيراتينية جديدة لبصيلات الشعر. في ظل ظروف الجرح ، تنتج الخلايا الجذعية خلايا ابنة تهاجر من مكانها لإعادة ملء الطبقة القاعدية للبشرة والغدة الدهنية.


Adenovirus هو ناقل رئيسي: الفوائد وعوامل الخطر

تم عزل الإعلانات من عدد كبير من الأنواع المختلفة ، 100 نمط مصلي ، 57 في البشر [4]. يعتبر الإعلان فعالًا للغاية في العلاج الجيني لقدرته على نقل الخلايا بكفاءة والتي تنقسم وغير مقسمة [6]. تمتلك نواقل الإعلان أيضًا القدرة على الاحتفاظ بأجزاء كبيرة من الحمض النووي (7.5 كيلو بايت في الثانية) ، ويمكن معالجتها بسهولة باستخدام تقنيات الحمض النووي المؤتلف ولديها القدرة على إنتاج عيارات عالية [6]. بالنسبة لمعظم الأنماط المصلية في Ad ، يتم التوسط في العدوى عن طريق ربط منطقة مقبض الألياف بمستقبل من الخلية المستهدفة ، يُعرف باسم مستقبل coxsackie-Ad (CAR). يتم ملاحظة ارتباط CAR بشكل شائع في النمط المصلي 5 عند البشر ، Ad5 [7].


يتم التوسط في دخول الفيروس واستيعابه من خلال تفاعل بين Arg-Gly-Asp الخماسي القاعدة (RGD) والإنتغرينات αv الخلوية ، مما يؤدي إلى تكاثر الفيروس من خلال حفر مغطاة بالكلاذرين [8].تحفز إنتغرينات αv بلمرة الأكتين التي تؤدي إلى دخول الفيروس إلى الجسيم الداخلي. ثم يتحمض الجسيم الداخلي ، مما يؤدي إلى فصل البروتينات القفيصة. يتفكك الفيروس في الجسيم الداخلي وينتقل الحمض النووي الفيروسي إلى النواة ، مما يؤدي إلى التعبير عن الجينات الفيروسية أو الجينات المعدلة [7]. لا يتم دمج الحمض النووي الفيروسي في جينوم المضيف ، لذا فإن خطر حدوث طفرة منخفضة للغاية ، ومع ذلك ، فإنه يظل في حالة عرضية [8].


تم الإبلاغ أيضًا عن تفاعلات المستقبلات الثانوية التي تشمل بروتيوغليكان كبريتات الهيباران (HSPGs) [7]. التعبير عن CAR هو عامل محدد للمعدل في عدوى Ad ، حيث أن التعبير متغير بدرجة كبيرة في خلايا الورم البشرية الأولية [8]. يرتبط الحد من تعبير CAR مع تطور الأورام الخبيثة وحالتها أو عدوانيتها [7]. يتم تحديد موقع CAR داخل تقاطعات ضيقة ، ويلعب أيضًا دورًا في التصاق الخلية [8].

يتم فصل دورة حياة الإعلان عن طريق عملية تكرار الحمض النووي في مرحلتين متميزتين: الأولى والمتأخرة [2]. الجينات المبكرة مسؤولة عن البروتينات أو البروتينات المنظمة التي تغير جينات المضيف لتخليق الحمض النووي ، وتنشط البروتينات الفيروسية الأخرى وتتجنب الموت المبكر للخلايا المصابة بواسطة الدفاعات المناعية للمضيف [2]. يمكن للجينات المبكرة أن تخلد الخلايا الأخرى ، على سبيل المثال ، E1A ، الذي يرتبط بقمع الورم الأرومي الشبكي ، ويخلد الخلايا الأولية في المختبر السماح لـ E1B ، الذي يرتبط بـ p53 مثبط الورم ، بالمساعدة في تكوين الخلايا السرطانية [2].

تستلزم عدوى ناقلات الإعلان مجموعة متنوعة من الاستجابات المناعية الخلطية والخلوية. ترجع الردود إلى كل من ناقلات الإعلان والخلايا المصابة بالفعل بالأمراض [8]. ينشط العرض الإعلاني الجهاز المناعي ويستقطب استجابة طبيعية لمكافحة مستضدات الورم [8]. ومع ذلك ، فإن استخدام الإعلان كنواقل أمر محفوف بالمخاطر حيث أن الجرعة العالية جدًا ستؤدي إلى سمية حادة ومناعة ذاتية [8]. حتى الآن ، كانت الآثار الجانبية خفيفة في العلاج بالإعلان ، ومع ذلك تتم مراقبة الآثار الجانبية غير المستهدفة باستمرار ، سواء على المدى الطويل أو على المدى القصير في المرضى ، لا سيما في الكبد [8].

يحاول الباحثون حاليًا زيادة نواقل نقل الجينات Ad لاستهداف الخلايا السرطانية وتقليل أي استهداف للكبد. هناك عدد من الطرق التي يتم طلبها حاليًا بما في ذلك: التنميط الكاذب للألياف الإعلانية ، أو "تعديل التروية" من خلال استبدال بروتينات ربط المستقبلات بتلك الخاصة بالأنماط المصلية الأخرى [9] ، على سبيل المثال ، استبدال النمط المصلي الإعلاني 5 (Ad5) بمقبض من النمط المصلي للإعلان 3 (Ad3) [9]. أظهرت البيانات التجريبية باستخدام الوهمين Ad5 / 3 زيادة العدوى في الخلايا السرطانية المعزولة دون زيادة توصيل الجينات والسمية إلى كبد الفئران [9].


الطفرة الجينية التي يمكن أن تعالج فيروس نقص المناعة البشرية لها ماض متقلب

لإعادة مراجعة هذه المقالة ، قم بزيارة ملفي الشخصي ، ثم اعرض القصص المحفوظة.

كان "مريض لندن" خاليًا وخاليًا من فيروس نقص المناعة البشرية لمدة 18 شهرًا. لا يزال من السابق لأوانه وصفه بأنه علاج & # 8212 يفضل الباحثون أن يقولوا إنه في حالة مغفرة طويلة المدى & # 8212 ، لكن يبدو أنه ثاني شخص تم الإبلاغ عن تخلصه من الفيروس باستخدام هذه الطريقة. مصدر العلوم

لإعادة مراجعة هذه المقالة ، قم بزيارة ملفي الشخصي ، ثم اعرض القصص المحفوظة.

في العقود الثلاثة والنصف التي مرت منذ اكتشاف فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز ، أودى المرض المميت بحياة 35 مليون شخص. بينما تسمح الأدوية الآن للمرضى بالعيش حياة طويلة مع الفيروس ، يعتقد أنه تم علاج رجل واحد فقط ، وهو أمريكي يدعى تيموثي راي براون ، والمعروف باسم "مريض برلين". الآن ، يبدو أنه لم يعد وحيدًا.

هذا الأسبوع ، زعم فريق من العلماء البريطانيين من جامعة كامبريدج أنهم عالجوا بنجاح رجلًا مصابًا بفيروس نقص المناعة البشرية من لندن بنفس تقنية الخلايا الجذعية التي استخدمها أطباء براون قبل عقد من الزمن. تضمنت زراعة نخاع عظمي للمريض من متبرع لديه طفرة طبيعية في جين يسمى CCR5. يستخدم فيروس نقص المناعة البشرية بروتين CCR5 لغزو خلايا مناعية معينة. بدونه ، يتم تأمين الفيروس.

إنها نفس الطفرة التي حاول باحث صيني يدعى He Jiankui تكرارها العام الماضي باستخدام تقنية Crispr على طفلين على الأقل. بينما أدان المجتمع العلمي الدولي تجربة هي لمجموعة من الانتهاكات الأخلاقية ، فإن استخدام كريسبر وأدوات تحرير الجينات الأخرى لإعادة إنشاء التأثيرات الوقائية لطفرة CCR5 قد يؤدي إلى علاجات متاحة على نطاق واسع بحيث لا يتعين علينا الإشارة إلى المرضى على أنهم لندن هذه أو برلين أن أي أكثر. سيحصلون فقط على ... العلاجات.

أفاد العلماء أن "مريض لندن" كان خاليًا وخاليًا من الفيروس لمدة 18 شهرًا. لا يزال من السابق لأوانه تسميته علاجًا - يفضل الباحثون القول إنه في حالة تعافي طويل الأمد - ولكن يبدو أنه ثاني شخص تم الإبلاغ عن تخلصه من الفيروس باستخدام هذه الطريقة. تم وصف النتائج في ورقة نشرت يوم الثلاثاء في المجلة طبيعة سجية.

بينما يصفق بعض الخبراء للأخبار كدليل على أن مريض برلين لم يكن مجرد صدفة ، فإن البعض الآخر أقل اقتناعًا بأن هذه الطريقة المعينة لها صلة كبيرة بأغلبية مرضى فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز. تعتبر عمليات زرع الخلايا الجذعية إجراءات مؤلمة وخطيرة ، وغالبًا ما يتم اقتراحها فقط للمرضى الأكثر مرضًا. السبب الوحيد لمحاولتهم في حالة برلين والآن المريض في لندن هو أنه في كلتا الحالتين كان الرجال مصابين أيضًا بسرطان يهدد حياتهم. من الصعب جدًا العثور على متبرعين متوافقين مع الأنسجة للعديد من الأشخاص ، ناهيك عن تحديد متبرع لديه أيضًا طفرة CCR5 النادرة ، والتي تحدث في 1 بالمائة فقط من السكان الأوروبيين. إنه قريب من علاج البوتيك الذي يمكنك التفكير فيه. كما قال أنتوني فوسي ، مدير المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية اوقات نيويورك: "لقد تم الأمر مع تيموثي راي براون ، والآن ها هي حالة أخرى - حسنًا ، ماذا الآن؟ الآن أين نذهب معها؟ "

أحد الاحتمالات المحيرة التي هي بالفعل موضوع الكثير من الاستثمار هو استخدام الهندسة الوراثية لإعادة إنشاء نفس الظروف مثل عملية الزرع دون الكثير من المخاطر وعدم الراحة.

تقول باولا كانون ، عالمة الأحياء الدقيقة الجزيئية التي تدرس فيروس نقص المناعة البشرية في كلية كيك للطب بجامعة جنوب كاليفورنيا: "هناك قائمة جيدة بالأشياء التي يمكننا القيام بها الآن". وتقول إن أحدث البيانات ، جنبًا إلى جنب مع مغفرة براون الآن لمدة 10 سنوات ، تشير إلى أن أي طريق لعلاج فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز يمر مباشرة من خلال CCR5. "ما أظهره هذان المريضان هو أن مهاجمة خزان الخلايا المصابة مع توفير خلايا مناعية لامعة جديدة ومقاومة لفيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن يؤدي إلى العلاج." إنها نوع من إستراتيجية الدفع والسحب من جزء دفاع وجزء واحد للهجوم.

يسعى الباحثون وشركات الأدوية بالفعل بنشاط إلى اتباع هذا النهج ، وعلى الأخص سانغامو ومقرها كاليفورنيا ، والتي تختبر حاليًا علاجين جيني لفيروس نقص المناعة البشرية في التجارب البشرية. منذ أكثر من عقد من الزمان ، بدأت الشركة في استخدام أداة قديمة لتحرير الجينات تسمى نوكلياز إصبع الزنك لضرب الجين CCR5 على الخلايا المناعية للمريض. بدونها ، لا يمكن لفيروس نقص المناعة البشرية أن يصيب تلك الخلايا ويكون قادرًا فقط على قتل الخلايا غير المهندسة. بطريقة ما ، يختار الفيروس بالفعل زواله ، ويحرق الخلايا المعرضة للخطر ويترك فقط الخلايا التي يمكنها المقاومة. اكتشف العلماء في الولايات المتحدة والصين أيضًا علاجات مماثلة باستخدام تقنية كريسبر ، ولكن حتى الآن فقط في الفئران وخطوط الخلايا البشرية. تتمثل إحدى الميزات المحتملة لـ Crispr في سهولة إجراء تعديلات متعددة. لذلك بالإضافة إلى القضاء على CCR5 ، يمكنك أيضًا زيادة قوة تلك الخلايا المناعية لتكون أكثر قدرة على اكتشاف الفيروس وتدميره. تعتمد بعض أكثر علاجات السرطان الجديدة الواعدة اليوم على هذا النهج بالضبط.


P53 العلاج الجيني لقمع الورم للسرطان

العلاج الجيني لديه القدرة على توفير علاجات للسرطان تعتمد على آليات عمل جديدة ذات سمية منخفضة محتملة. قد يوفر هذا العلاج تحكمًا أكثر فاعلية في التكرار الموضعي في أمراض مثل سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) بالإضافة إلى التحكم الجهازي في الانبثاث. على الرغم من القيود الحالية ، يمكن أن توفر ناقلات الفيروسات القهقرية والفيروسات الغدية ، في ظروف معينة ، وسيلة فعالة لتوصيل الجينات العلاجية إلى الخلايا السرطانية. على الرغم من أن الجينات المتعددة متورطة في التسرطن ، فإن طفرات الجين p53 هي أكثر الشذوذات شيوعًا التي تم تحديدها في الأورام البشرية. أظهرت الدراسات قبل السريرية في كل من المختبر والحي أن استعادة وظيفة p53 يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية. تعمل المستويات العالية من تعبير p53 والعوامل المدمرة للحمض النووي مثل سيسبلاتين (بلاتينول) والإشعاع المؤين بشكل تآزري للحث على موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية. تُظهر التجارب السريرية للمرحلة الأولى الآن أن العلاج باستبدال الجين p53 باستخدام كل من ناقلات الفيروسات القهقرية والفيروسات الغدية هو أمر ممكن وآمن. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العلاج ببدائل الجينات p53 يؤدي إلى تراجع الورم في المرضى الذين يعانون من NSCLC المتقدم وفي المرضى الذين يعانون من سرطان الرأس والعنق المتكرر. تصف هذه المقالة استراتيجيات العلاج الجيني المختلفة قيد التحقيق ، وتستعرض البيانات قبل السريرية التي توفر الأساس المنطقي لنهج استبدال الجينات ، وتناقش بيانات التجارب السريرية المتاحة حتى الآن. [علم الأورام 13 (ملحق 5): 148-154 ، 1999]

الملخص: العلاج الجيني لديه القدرة على توفير علاجات للسرطان تعتمد على آليات عمل جديدة مع سمية منخفضة محتملة. قد يوفر هذا العلاج تحكمًا أكثر فاعلية في التكرار الموضعي في أمراض مثل سرطان الرئة ذو الخلايا الصغيرة (NSCLC) بالإضافة إلى التحكم النظامي في الانبثاث. على الرغم من القيود الحالية ، يمكن أن توفر ناقلات الفيروسات القهقرية والفيروسات الغدية ، في ظروف معينة ، وسيلة فعالة لتوصيل الجينات العلاجية إلى الخلايا السرطانية. على الرغم من أن الجينات المتعددة متورطة في التسرطن ، فإن طفرات الجين p53 هي أكثر الشذوذات شيوعًا التي تم تحديدها في الأورام البشرية. أظهرت الدراسات قبل السريرية في كل من المختبر والحي أن استعادة وظيفة p53 يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية. تعمل المستويات العالية من تعبير p53 والعوامل المدمرة للحمض النووي مثل سيسبلاتين (بلاتينول) والإشعاع المؤين بشكل تآزري للحث على موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية. تُظهر التجارب السريرية للمرحلة الأولى الآن أن العلاج باستبدال الجين p53 باستخدام كل من ناقلات الفيروسات القهقرية والفيروسات الغدية هو أمر ممكن وآمن. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العلاج ببدائل الجينات p53 يؤدي إلى تراجع الورم في المرضى الذين يعانون من NSCLC المتقدم وفي المرضى الذين يعانون من سرطان الرأس والعنق المتكرر. تصف هذه المقالة استراتيجيات العلاج الجيني المختلفة قيد التحقيق ، وتستعرض البيانات قبل السريرية التي توفر الأساس المنطقي لنهج استبدال الجينات ، وتناقش بيانات التجارب السريرية المتاحة حتى الآن. [علم الأورام 13 (ملحق 5): 148-154 ، 1999]

مقدمة

تم تطوير مفهوم العلاج الجيني لعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان في الأصل كعلاج محتمل للاضطرابات الوراثية أحادية الجين. يتم علاجه وربما علاجه عن طريق إدخال نسخة طبيعية من الجين المتحور أو المحذوف في مجموعة سكانية متجددة من الخلايا المضيفة ، مثل الخلايا الجذعية لنخاع العظم. على الرغم من كونها بسيطة من الناحية المفاهيمية ، إلا أن استراتيجية العلاج ببدائل الجينات هذه تثبت أن لها تعقيدات عملية تجعل تنفيذها السريري أكثر صعوبة مما كان متوقعًا. لم تتمكن النواقل المتاحة حاليًا من الحفاظ على مستويات عالية بما يكفي من التعبير الجيني على مدى فترات زمنية طويلة بما يكفي.

انصب التركيز الرئيسي في العلاج الجيني على علاج السرطان. تضمنت الأساليب نقل جينات السيتوكين لتحفيز الاستجابة المناعية المضادة للأورام ، وتوصيل الجينات التي تعبر عن العقاقير الأولية للأورام ، ونقل الجينات لحماية الخلايا الجذعية أثناء العلاج الكيميائي بجرعات عالية. ستركز هذه المراجعة على استعادة وظيفة الجينات الكابتة للورم. في سياق السرطان ، قد يكون التعبير الجيني العابر الذي يؤدي إلى موت الخلايا السرطانية كافياً للتوسط في تأثير علاجي. كما أن التعبير عن الجين المحور في جزء صغير فقط من الخلايا السرطانية قد لا يكون مقيدًا لأن هذه الخلايا قد تغير نمو الخلايا المجاورة.

الأساس الجيني للتسرطن

تشمل عائلات الجينات المتورطة في التسرطن الجينات المسرطنة السائدة مثل راس والجينات الكابتة للورم مثل p53. [4-6] تشارك الجينات الأولية للورم (النظائر الطبيعية للجينات الورمية) عادة في وظائف مثل نقل الإشارة (نقل المعلومات من غشاء الخلية الخارجي إلى النواة) ونسخ الجينات. خلل (طفرة نقطية ، تضخيم ، إزفاء ، أو إعادة ترتيب) في واحد فقط من أليلين من الجين الورمي الأولي يكفي لتحويله إلى جين ورمي نشط ، أي لخلل وظيفته ويؤدي إلى تحول خبيث.

على النقيض من ذلك ، فإن جينًا واحدًا طبيعيًا مثبطًا للورم في الخلية يكون عادةً كافيًا لأداء الوظيفة الطبيعية للجين ، ولكن فقدان وظيفة كلا الأليلين ، عن طريق الطفرة أو الحذف أو مزيج منهما ، يؤدي إلى خلل في النمو الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل بعض الطفرات الجينية الكابتة للورم - على سبيل المثال ، بعض طفرات p53 - بطريقة "سلبية سائدة" ، أي أن طفرة في أليل واحد يمكن أن تؤدي إلى إنتاج بروتين p53 طافر يرتبط بـ ، وبالتالي يعطل ، البروتين الطبيعي هيكليًا المشفر بواسطة الأليل المقابل. قد ترتبط البروتينات الفيروسية أيضًا بـ p53 وتعطله وظيفيًا.

الأساس المنطقي لاستعادة وظيفة p53 في الخلية السرطانية

يُعتقد أن جميع السرطانات تحتوي على تشوهات متعددة في مجموعة متنوعة من الجينات التي تتحكم في جوانب مختلفة من نمو الخلايا وتطورها. وبالتالي ، قد يبدو تصحيح جميع التشوهات الجينية في الخلية السرطانية ضروريًا لعكس العملية الخبيثة. ومع ذلك ، فإن تصحيح جميع التشوهات الجينية سيكون مهمة مستحيلة ، خاصة وأن بعض هذه التشوهات لم يتم تحديدها بعد. علاوة على ذلك ، يجب تقييم أنماط التعبير الفردية - لكل جين في كل مريض. لحسن الحظ ، فإن تصحيح خلل جيني واحد يكفي في بعض الحالات للحث على موت الخلايا السرطانية عن طريق الاستماتة.

أظهر عدد من الدراسات في المختبر التي استخدمت خطوط الخلايا السرطانية المزروعة أن القضاء على التعبير عن أحد الجينات الورمية المهيمنة (راس) أو إضافة نسخة طبيعية من جين مثبط للورم (p53 أو جين الورم الأرومي الشبكي [Rb]) إلى الخلايا التي حذفت أو تحوّرت نسخًا من هذه الجينات ، قللت أو حتى ألغت جوانب حرجة من النمط الظاهري الخبيث ، مثل تكون الأورام في الحيوانات أو الإرساء - النمو المستقل [10-12] ولهذا السبب ، فإن مشكلة التصحيح المتزامن للعيوب الوراثية الوظيفية المتعددة في الخلية السرطانية لا تبدو مروعة.

كان يُعتقد أيضًا أن استعادة الوظيفة الجينية الطبيعية لكل خلية سرطانية ، والتي تتجاوز قدرات النواقل المتاحة حاليًا للاستخدام في العلاج الجيني ، ضرورية في وقت واحد. ومع ذلك ، فإن الخلايا المنقولة التي تعبر عن الجينات المعدلة السامة يتم التعرف عليها الآن لتغيير نمو الخلايا المجاورة غير المنقولة. وقد أطلق على هذا اسم "تأثير المتفرج". [3]

بينما تقدم الجينات المتعددة أهدافًا محتملة للعلاج الجيني في العديد من الأورام الخبيثة الشائعة ، فقد ركزت مجموعتنا على هدف استبدال وظيفة p53 الطبيعية. العديد من الجينات الكابتة للورم التي تم تحديدها والجينات الأولية للورم تشفر البروتينات التي هي مكونات لشبكة تتقارب على البروتين المشفر بواسطة جين Rb. لنمو الخلايا. يتم التحكم في فسفرة Rb بواسطة مركب متعدد الجزيئات من البروتينات ، يحتوي على السيكلينات والكينازات المعتمدة على السيكلين بالإضافة إلى مثبط قوي لمعظم الكينازات المعتمدة على السيكلين ، والتي تسمى p21. [15،16] في المقابل ، واحدة من العديد من وظائف ينظم بروتين p53 وظيفة p21. [17،18] وهكذا ، يلعب p53 دورًا مركزيًا في تنظيم دورة الخلية لأنه ينظم بشكل غير مباشر وظيفة Rb. عندما تكون وظيفة p53 طبيعية ، يتم تنظيم هذا المسار بإحكام ، ومع ذلك ، عندما يتحور p53 أو يكون غائبًا ، يعكس نمو الخلية غير المنضبط التحكم المفقود في المسار.

علاوة على ذلك ، يلعب p53 دورًا مركزيًا في مسارات التمثيل الغذائي الأخرى ، بما في ذلك ، بشكل مهم ، التحكم في موت الخلايا المبرمج. استجابةً للإهانات السامة المختلفة للخلايا ، مثل التعرض للإشعاع المؤين أو العلاج الكيميائي ، فإن الخلايا الطبيعية إما أن تتوقف مؤقتًا في دورة خلاياها لفترة كافية لإصلاح تلف الحمض النووي ، أو في حالات أخرى ، تخضع لإصلاح موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا المبرمج ، كلاهما يمنع الحمض النووي التالف من أن تنتقل إلى ذرية الخلية. عندما تكون وظيفة p53 العادية غائبة ، فإن الحمض النووي التالف يكون أكثر عرضة للإنتقال.

اختيار نموذج الورم

يعتبر سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة هدفًا منطقيًا لاستراتيجيات علاجية جديدة لعدة أسباب. إنه السبب الرئيسي للوفاة بالسرطان في الولايات المتحدة ، ويقاس متوسط ​​بقاء المرضى الذين يعانون من مرض المرحلة الثالثة أو الرابعة ، كما يفعل غالبية المرضى ، بالأشهر. بالنسبة لمعظم المرضى الذين لا يمكن علاجهم بالجراحة ، فإن العلاجات القياسية الأخرى غير فعالة نسبيًا. العلاج الإشعاعي ، الذي يوفر أفضل فرصة للسيطرة الموضعية للمرض في المرضى الذين يعانون من مرض لا يمكن استئصاله جراحيًا ، يكون ناجحًا في 20٪ فقط من الحالات ، وقد يكون الفشل الأولي المحلي أو التكرار هو الموقع الوحيد للفشل في ما يصل إلى ثلث المرضى. [ 21]

يحدث طفرة أو تعطيل p53 في نسبة عالية من جميع أنواع السرطانات البشرية الشائعة تقريبًا ، بما في ذلك سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة. [21-23] نظرًا للدور الرئيسي لـ p53 في تنظيم دورة الخلية والاستماتة ودور وظيفة p53 المعيبة في التسرطن ، ومحاولة استبدال p53 تمثل استراتيجية منطقية لاستبدال الجين. لذلك قمت أنا وزملائي بدراسة هذا النهج في المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة. اعتمد نهجنا الأولي على حقن الورم الأولي بناقل يعبر عن النوع البري p53 ، بهدف تحسين التحكم المحلي في سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة.

اختيار ناقل فعال

كانت معظم النواقل المتاحة غير فعالة في تحويل الجينات إلى خلايا سرطانية. وبالتالي ، كان الهدف التجريبي التالي هو تطوير ناقل فعال لإيصال الجين العلاجي إلى الخلايا السرطانية. أظهرت الدراسات التي أجريت على نماذج الأورام البشرية في المختبر وفي الفئران العارية (ذات الكفاءة المناعية) أن امتصاص ناقلات الفيروسات القهقرية التي تحتوي على النوع البري p53 أو مضاد المعنى راس كانت فعالة بما يكفي للتوسط في التأثير العلاجي. في المقابل ، لم تقم نواقل التحكم التي تحمل طفرات p53 المرتبطة بالسرطان بقمع نمو الخلايا ، مما يشير إلى أن التأثير العلاجي كان نتيجة مباشرة لتعبير p53 الطبيعي وليس تأثيرًا غير محدد ناتجًا عن نقل الناقل أو تسلسل p53.

استخدمت هذه التجارب والعديد من الدراسات المبكرة الأخرى ، بما في ذلك تجربتنا السريرية الأولى للعلاج باستبدال الجين p53 ، ناقلًا للفيروسات القهقرية يحتوي على p53 cDNA من النوع البري المرتبط بمحفز b-actin. بينما تنتج ناقلات الفيروسات القهقرية مستويات من التعبير الجيني كافية لإثبات التأثير البيولوجي ، يمكن للنواقل المشتقة من الفيروسات الغدية أن تحقق مستويات أعلى بكثير من التعبير الجيني ، والتي ينبغي أن توفر إمكانات علاجية أكبر.علاوة على ذلك ، تتمتع نواقل الفيروس الغدي بميزة إصابة كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة ، على عكس ناقلات الفيروسات القهقرية ، التي تصيب الخلايا المنقسمة بنشاط فقط. لا تتكامل نواقل الفيروس الغدي في الجينوم ، لذلك يكون التعبير عابرًا. هذا ليس بالضرورة عيبًا في مرضى السرطان ، لأن التعبير المطول ليس مطلوبًا أو حتى مرغوبًا فيه بالضرورة بعد قتل خلية الورم.

بالنظر إلى هذه المزايا النظرية للنواقل الفيروسية الغدية ، اخترنا الجيل الأول من الفيروسات الغدية التي تم فيها حذف الجينات غير الأساسية واستبدالها بـ p53 من النوع البري مدفوعًا بمحفز الفيروس المضخم للخلايا (أي ، الفيروس الغدي p53 [Ad-p53]). في الدراسات التي أجريت على الحيوانات ، أدى العلاج اللاحق بـ Ad-p53 إلى تثبيط نمو الأورام في خلايا سرطان الرئة الملقحة داخل الرغامى.

دراسات ما قبل السريرية للعلاج الجيني p53

على الرغم من إظهار التأثير المضاد للورم لـ p53 الطبيعي المنقول إلى خلايا سرطانية تنمو في المزرعة ، فقد كنا قلقين من أن جزءًا فقط من الخلايا السرطانية سيتم نقله في الجسم الحي ، مما يحد من الفعالية العلاجية. وبالتالي ، فإن اكتشاف أن النواقل الفيروسية يمكنها بسهولة اختراق مصفوفات الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد ، مما يشير إلى أنها ستنتشر خارج موقع الحقن داخل الرحم ، كان أمرًا مشجعًا. علاوة على ذلك ، فإن الفيروس الغدي الذي يحتوي على النوع البري p53 ليس سامًا للخلايا الظهارية للشعب الهوائية الطبيعية في المزرعة ، وهو قليل السمية في الفئران ، حتى عند المستويات العالية جدًا ، مما يشير إلى ملف أمان مناسب جدًا للتجارب السريرية. بالإضافة إلى العمل الذي تم الإبلاغ عنه مع سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، أظهرت الدراسات في نماذج الفئران العارية لسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة تأثيرًا علاجيًا مهمًا للفيروس الغدي p53 ، مما يؤكد تحريض موت الخلايا المبرمج الكبير.

على الرغم من الكفاءة العالية لنقل الخلايا السرطانية التي حققتها النواقل الفيروسية وانتشار النواقل المحقونة خارج موقع الحقن داخل الورم ، فمن غير المرجح أن يتم نقل كل خلية ورمية. أظهرت الدراسات في الجسم الحي للحقن داخل الورم لـ Ad-p53 في الأورام تحت الجلد في الفئران درجة من الانحدار تتجاوز تلك التي تنبأت بها كفاءة تحويل الناقل ، مما يشير إلى تأثيرات المتفرج. لوحظت هذه الظاهرة ، التي تعتبر حاسمة لتحقيق تأثير مضاد للأورام على نطاق واسع ، لأول مرة في الجسم الحي في خلايا ورم الدماغ المنقولة بجين الهربس البسيط thymidine kinase ثم تعرضت لـ ganciclovir (Cytovene). ganciclovir غير سام للخلايا الطبيعية ، لكن الفيروس المنقولة thymidine kinase يحول الدواء إلى ganciclovir triphosphates ، مما يؤدي إلى موت الخلايا السرطانية المنقولة.

عند التفكير في العلاج باستبدال الجينات بـ p53 أو جينات أخرى مثبطة للورم ، كان من الضروري إثبات وجود تأثير متفرج مشابه للتأثير الذي حدث مع جين ثيميدين كيناز أيضًا في حالة p53. باستخدام تجارب الخلط في الجسم الحي ، أظهر الباحثون أن الخلايا المنقولة من النوع p53 البرية الفيروسية يمكن أن تقلل من معدل نمو خلايا سرطان الرئة البشرية غير المنقولة ، مما يشير إلى وجود تأثير متفرج فعال في هذا النظام. قد تتوسط العديد من الآليات تأثيرات المتفرج ، والتي قد تختلف اعتمادًا على الجينات المنقولة والنوع المحدد لخلية الورم. وتشمل هذه الآليات نقل المنتجات الأيضية السامة من خلال الوصلات الفراغية ، وبلعمة الحويصلات الأبوطوزية لخلايا الورم الميتة بواسطة خلايا الورم الحية التي تتوسط في موت الخلايا المبرمج ، وتحريض استجابة مناعية ضد الورم ، وتثبيط تكوين الأوعية.

قد يتوسط ما يسمى بمستقبل الموت ، Fas ، تأثير مضاد للأورام المتفرج بعد تحويل ناقل التعبير p53. على سبيل المثال ، تعبر خلايا سرطان الرئة H358 عن يجند Fas الوفير ولكن ليس بروتين Fas اللازم لموت الخلايا المبرمج. [30] ينظم البروتين p53 من النوع البري التعبير عن بروتين Fas بواسطة هذه الخلايا ، ولأن البروتين يتم إطلاقه في شكل قابل للذوبان ، فقد ينتقل إلى الخلايا الأخرى ، مما يؤدي إلى تأثير متفرج.

قد يؤدي التعبير عن الجين p53 من النوع البري أيضًا إلى تقليل تنظيم التعبير عن عامل نمو بطانة الأوعية الدموية ، وهو أحد أكثر العوامل شيوعًا التي تحفز تكوين الأوعية في السرطانات البشرية. يقلل هذا التنظيم المنخفض من تكوين الأوعية الدموية بواسطة الخلايا السرطانية ، وبالتالي قد يمنع استمرار نمو السرطان.

في دراسة أخرى ، تمت دراسة نمو سرطان الرئة باستخدام نموذج تجريبي مثلي نمت فيه خلايا سرطان الرئة البشرية كأورام طعم أجنبي في الفئران nu / nu. [31] إدارة ناقل التعبير p53 البري من النوع البري الفيروسي مباشرة في الخلايا السرطانية في الجسم الحي قمع نمو الورم. بعد ذلك ، استخدمنا ناقل تعبير للفيروس الغدي لتوصيل p53 البشري من النوع البري (كدنا) إلى الخلايا السرطانية. تسبب ناقل التعبير p53 هذا في موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية التي تحمل p53 المتحور أو المحذوف ، ولكن كان له تأثير ضئيل على نمو الخلايا التي تحتوي على النوع البري p53. كما أدت تركيبات ناقلات الفيروس الغدي p53 المماثلة إلى تثبيط نمو الأورام الدبقية في الفئران ، وسرطانات الرأس والعنق البشرية ، وسرطانات القولون البشرية في الفئران العارية ويمكن أن تتوسط التعبير الجيني p53 في سرطان المثانة والكبد. كما تم العثور على منتجات جينات أخرى مثبطة للورم ، مثل p16 وجين Rb مبتور ، لتثبيط نمو الورم في النماذج الحيوانية.

التأثير التآزري لـ Transduced p53 مع العلاجات الأخرى

بالإضافة إلى التأثير المضاد للأورام للجينات المثبطة للورم المنقولة المستخدمة كطرائق مفردة في أنظمة تجريبية مختلفة ، أظهرت الدراسات قبل السريرية التآزر بين العلاج البديل p53 وعوامل العلاج الكيميائي المدمرة للحمض النووي والتي تكون مفيدة ضد سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، مثل سيسبلاتين و إيتوبوسيد (فيبيسيد). [33] يعزز العلاج الكيميائي التعبير عن الجينات المنقولة ، سواء تم استخدام ناقلات فيروسية أو غير فيروسية ، مع مجموعة من المحفزات. في أحد النماذج ، أدت إضافة السيسبلاتين قبل تعداء البروتين p53 إلى زيادة موت الخلايا المبرمج وتثبيط نمو الورم. الآلية الكامنة وراء هذا التأثير ليست معروفة بعد. أشارت الدراسات قبل السريرية أيضًا إلى أن العلاج الجيني قد يزيد من الحساسية للإشعاع.

اختبرنا ما إذا كان التعبير الجيني p53 من النوع البري بوساطة الفيروس الغدي يحسس خلايا سرطان القولون والمستقيم للإشعاع المؤين. تم إجراء نقل الجين p53 من النوع البري إلى خط خلايا سرطان القولون والمستقيم SW620 باستخدام Ad-p53 لتقييم تأثير تعبير p53 من النوع البري على حساسية الإشعاع. استنادًا إلى حقيقة أن البقاء على قيد الحياة عند 2 Gy قد انخفض من 55 ٪ إلى 23 ٪ (الشكل 1) ، أشارت النتائج إلى أن هذا المتجه يحسس الخلايا. أظهر تحليل التدفق الخلوي لخلايا ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز بوساطة dUTP-biotin نيك النهائية (TUNEL) الخلايا التي تحمل علامة الفحص وتلطيخ TUNEL في الموقع لأورام طعم أجنبي ، أظهر زيادة في الخلايا المصنفة بعد العلاج المركب. بالمقارنة مع العلاج الجيني p53 وحده ، عززت هذه الإستراتيجية المركبة بشكل كبير قمع نمو الورم في نموذج حيواني للورم تحت الجلد. كان التأخير في إعادة النمو للتحكم في حجم الورم البالغ 1000 مم 2 يومًا لمدة 5 غراي ، و 15 يومًا لـ Ad-p53 ، و 37 يومًا لـ Ad-p53 plus 5 Gy ، مما يشير إلى التفاعلات التآزرية. تشير هذه البيانات إلى أن توصيل البروتين p53 من النوع البري إلى الخلايا ذات الطفرات p53 يزيد من حساسيتها للإشعاع وأن هذا التسليم يمكن أن يتم عن طريق العلاج الجيني بوساطة الفيروس الغدي.

تم إجراء تجارب إضافية للتأكد مما إذا كان ناقل Ad-p53 سيؤدي أيضًا إلى حساسية الخلايا السرطانية غير الصغيرة للرئة للإشعاع. تم فحص سطرين مختلفين لسرطان الرئة غير صغير الخلايا ، H358 و H1299. يحتوي كلا سطري الخلايا على عمليات حذف متماثلة اللواقح من الجين p53. تم فحص خط H358 في المختبر. في هذه الحالة ، أصيبت الخلايا التي تنمو في المستنبت بـ Ad-p53 في عدوى متعددة (عدد الجزيئات الفيروسية المعدية لكل خلية ورمية) 70 وتم تشعيع الخلايا بعد 48 ساعة من الإصابة. تم تقييم التحسس باستخدام مقايسة استنساخ في المختبر. تم تقليل البقاء على قيد الحياة عند 2 Gy من 70 ٪ للخلايا التي تتلقى 2 Gy وحدها إلى 50 ٪ للخلايا التي تتلقى كلا العلاجين. تم حقن خلايا H1299 في الأرجل الخلفية لفئران عارية. عندما وصل حجم الأورام من 6 إلى 8 مم ، تم حقنها بـ 1.5 × 10 10 جسيمات فيروسية. بعد يومين ، تم إعطاء أورام طعم أجنبي جرعة إشعاعية واحدة مقدارها 5 جراي. على غرار النتائج مع طعم أجنبي في القولون والمستقيم ، كان لأورام طعم أجنبي لسرطان الرئة غير صغير الخلايا استجابة دراماتيكية للعلاج المشترك (الشكل 2). كان التأخير في إعادة النمو إلى حجم الورم المتحكم فيه 1000 مم مكعب ليوم واحد لجرعة 5-Gy وحدها ، و 14 يومًا لـ Ad-p53 وحده ، و 36 يومًا لمزيج من علاجات Ad-p53 plus 5-Gy. وهكذا ، يبدو أن نتائج الجمع بين الفيروس والإشعاع تشير إلى تفاعل تآزري وتثبت صحة استخدام استراتيجية العلاج الجيني هذه لعلاج سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة.

استنادًا إلى نتائج الدراسات قبل السريرية المكتملة مؤخرًا ، قد يكون Ad-p53 بالاشتراك مع الإشعاع أيضًا استراتيجية مفيدة لعلاج أورام المخ. ولتحديد تأثير إيصال الفيروس الغدي من النوع البري p53 على الاستجابة الإشعاعية لخلايا ورم الورم الدبقي ، أجريت تجارب في المختبر. تمت مقارنة استجابات سطرين من خلايا الورم الدبقي البشري: U87MG ، الذي يحتوي على p53 من النوع البري ، و U251MG ، الذي يحتوي على أليل p53 متحولة. أصيبت الثقافات أحادية الطبقة لهذه الخطوط الخلوية بـ Ad-p53 أو ناقل التحكم dl312 أو وسط الثقافة. تم تشعيع الثقافات بعد يومين وتم تحديد كفاءة تكوين المستعمرة.

كان للترنسفكأيشن مع p53 تأثير طفيف فقط على كفاءة الطلاء لخلايا U87MG غير المشعة ولكنه عزز بشكل كبير الحساسية الإشعاعية لهذه الخلايا. تم تخفيض الجزء الباقي على قيد الحياة عند 2 Gy من 0.61 في عناصر التحكم إلى 0.38 في خلايا U87MG المنقولة بـ p53 (الشكل 3). لم يؤثر متجه التحكم ، dl312 ، على الحساسية الإشعاعية. كان ناقل Ad-p53 سامًا لخط خلية U251MG ، وبالتالي لا يمكن تحديد تأثيره على الحساسية الراديوية. أظهر تحليل التدفق الخلوي للخلايا الملطخة بـ TUNEL أن ناقل Ad-p53 قد قام بتوعية خلايا U87MG بالموت المبرمج الناجم عن الإشعاع ، وزادت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لـ TUNEL بعد 9 Gy من حوالي 3 ٪ في عناصر التحكم إلى 19 ٪ في Ad - p53 بالإضافة إلى 9 خلايا معالجة. تشير هذه البيانات إلى أن p53 بوساطة الفيروس الغدي قد يعزز الاستجابة الإشعاعية لخلايا ورم الدماغ من النوع البري p53 وأن هذا التحسس الإشعاعي قد يتضمن جزئيًا على الأقل استعادة الميل للاستماتة. تم اشتقاق دعم إضافي لهذا المفهوم من دراسة تظهر أن الإشعاع يحسن كفاءة النقل الفوري ومدة التعبير الجيني من ناقل غدي.

الدراسات السريرية

في دراستنا البشرية الأولية ، تلقى تسعة مرضى مصابين بسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ناقلًا للفيروسات القهقرية يحتوي على جين p53 من النوع البري تحت سيطرة محفز b-actin. فشلت العلاجات الأخرى في هؤلاء المرضى ، وقد تم توثيق جميع أورامهم على أنها مصابة بطفرة p53. نظرًا لأنه من المعروف أن التنبيغ عن طريق الفيروسات القهقرية ينتج عيارًا منخفضًا من الجين المحول ، فقد تم حقن الناقل في الورم لمدة 5 أيام متتالية ، إما باستخدام منظار القصبات أو ، في حالة آفات جدار الصدر ، بإبرة عن طريق الجلد.

لوحظ تراجع الآفة المحقونة في ثلاثة مرضى بينما استقر المرض في ثلاثة مرضى آخرين. أحد المرضى الذين ماتوا من ورم خبيث في الكلى لم يظهروا أي دليل على وجود ورم قابل للحياة في الموقع المعالج عند تشريح الجثة بعد 4 أشهر من الحقن. تقدم المرض الأساسي لمريض واحد ، وكان مريضان لا يقدران بثمن (أحدهما لم يستطع تحمل التخدير العام وبالتالي لم يكمل العلاج ، وتوفي الآخر في غضون 3 أسابيع من العلاج). أظهرت دراسات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) و / أو دراسات التهجين في الموقع لخزعات ما بعد المعالجة من ثمانية مرضى قبل تقييم تأثيرات العلاج أن الخلايا السرطانية قد دمجت بالفعل متواليات DNA الناقل في ما يصل إلى 20٪ من الخلايا في مناطق معينة من الأورام. كان من النتائج المهمة أن تلطيخ TUNEL (الذي يكتشف خدش الحمض النووي) لعينات الخزعة بعد المعالجة أظهر أن موت الخلايا المبرمج قد زاد بعد العلاج مقارنة بخط الأساس للمعالجة المسبقة.

لم تحدث أي آثار جانبية تُعزى إلى تسلسل p53-vector في أي مريض ، على الرغم من حدوث مضاعفات متعلقة بتنظير القصبات في ثلاثة مرضى. لم نعثر على أي دليل على تسلسل الفيروسات القهقرية في الحمض النووي المستخرج من الخلايا الليمفاوية أو عينات البلغم أو الأنسجة غير السرطانية المختلفة التي تم الحصول عليها عند تشريح الجثة على ثلاثة مرضى. أكدت هذه النتائج وجود ملف أمان عالٍ ، وإيصال ناجح لتسلسل p53 الطبيعي إلى الخلايا السرطانية ، وتأثيرًا بيولوجيًا للجين المنقولة.

تم دعم هذه النتائج الواعدة من خلال دراسة حديثة أجريت على ذراعين حيث تم إعطاء جين p53 من النوع البري لـ 52 مريضًا مصابًا بسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة باستخدام ناقل الفيروس الغدي. تلقى المرضى Ad-p53 إما بمفرده أو يسبقه سيسبلاتين ، 80 مجم / م 2 على مدى ساعتين ، 3 أيام قبل حقن p53 (تم اختيار سيسبلاتين بسبب الأدلة قبل السريرية على وجود تأثير تآزري مع استبدال الجين p53). تم إعطاء حقنة واحدة داخل الورم من p53 ، إما عن طريق تنظير القصبات أو باستخدام التصوير المقطعي المحوسب ، مرة واحدة شهريًا لمدة تصل إلى 6 أشهر. كان معظم المرضى قد تلقوا علاجًا كيميائيًا سابقًا ، وفي بعض الحالات باستخدام سيسبلاتين ، وكانوا جميعًا يعانون من تطور الورم أثناء العلاج التقليدي قبل الدخول في الدراسة.

كما هو الحال مع الدراسة التي تستخدم ناقلات الفيروسات القهقرية ، شوهدت كل من الأدلة السريرية والمخبرية لتعبير p53. توسط Ad-p53 وحده (26 مريضًا قابلاً للتقييم) استجابتين جزئيتين واستقر المرض في 16 مريضًا. أدت جرعة أعلى من Ad-p53 إلى زيادة البقاء على قيد الحياة بدون تقدم. توسط Ad-p53 بالإضافة إلى سيسبلاتين (23 مريضًا قابلاً للتقييم) استجابة جزئية لدى مريضين عولجا باستخدام سيسبلاتين سابقًا. حصل مريض إضافي على استجابة جزئية ولكن لم يكن لديه وثائق المتابعة المطلوبة لتأكيد الاستجابة. Ad-p53 plus البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة خالية من التقدم مقارنة مع Ad-p53 وحده. كان لدى غالبية المرضى أيضًا دليل على وجود ناقل DNA بواسطة PCR لخزعات ما بعد المعالجة. على الرغم من اكتشاف الأجسام المضادة للفيروسات الغددية في جميع المرضى بعد علاج واحد ، لم يكن هناك حساسية مفرطة أو سمية أخرى باستثناء الحمى العابرة المصحوبة بعلاجات لاحقة. ربما يكون من المدهش ، على الرغم من المستويات العالية من الأجسام المضادة للفيروسات المصلية ، أن التعبير الجيني p53 حدث في الخلايا السرطانية ، وتم الحفاظ على الاستجابات السريرية.

على الرغم من أن هذه الدراسات صححت واحدة فقط من العديد من التشوهات الجينية الموجودة في سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، إلا أن الأدلة تشير إلى وجود تأثير مضاد للورم يعتمد مباشرة على موت الخلايا المبرمج بوساطة p53 ، كما هو موضح في تجربة الفيروس العكسي p53. لم تقدم التجربتان أي دليل على الرأي المعاكس بأن استقرار الورم وانحداره نتج عن تفاعل مناعي غير محدد. في دراسة Ad-p53 ، اكتشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ناقل الحمض النووي في غالبية المرضى ، لكن عددًا أقل من المرضى أظهروا دليلًا على التعبير الجيني. يعد اكتشاف التعبير الجيني بعد نقل النوع البري p53 في الجسم الحي أمرًا صعبًا لأن النقل والتعبير الناجح للنوع البري p53 في الورم قد يدمر دليل التعبير الجيني إذا تم إحداث موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا. ومع ذلك ، في المرضى الذين يمكن قياس تعبيرهم الجيني التسلسلي عن طريق الكيمياء المناعية ، كان من الواضح أن التعبير عن الجينات المحورة حدث على الرغم من وجود التتر العالي من الأجسام المضادة المضادة للفيروسات. من الممكن أن يكون للأجسام المضادة في الدم تأثير ضئيل بسبب ضعف اختراق الأورام الصلبة نتيجة لارتفاع ضغط السائل الخلالي. لا يُعرف ما إذا كان قمع الاستجابة المناعية المضادة للفيروسات سيعزز مستويات التعبير الجيني في الورم. على أي حال ، فإن الحقن المتكرر داخل الورم لـ p53 الفيروسي الغدي يبدو آمنًا على الرغم من الزيادات في الأجسام المضادة للفيروسات الغدية.

تم الإبلاغ عن استراتيجية مماثلة لعلاج تكرار سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة. قد يستفيد مرضى سرطان الرأس والرقبة من تحسين التحكم الموضعي ، لأن السبب الرئيسي لوفاة هؤلاء المرضى هو التكرار الموضعي. في دراسة تصعيد الجرعة في المرحلة الأولى ، تم حقن 33 مريضًا بجرعات تصل إلى 1011 وحدة لتشكيل اللويحات. لم يتم ملاحظة السمية المحددة للجرعة أو الأحداث الضائرة الخطيرة. تم توثيق التعبير الجيني في أنسجة الورم. كان لاثنين من 17 مريضًا يعانون من مرض غير قابل للاستئصال استجابة جزئية وستة لديهم مرض مستقر لمدة تصل إلى 3.5 شهرًا. لوحظ أن أحد المرضى المصابين بمرض قابل للاستئصال كان لديه استجابة مرضية كاملة في وقت الاستئصال. تم اكتشاف Ad-p53 المعدية في البلغم والبول عند أعلى جرعات من 1011 جسيمًا معديًا. ومن المثير للاهتمام أن دورة وقت الإفراز لم تتغير من حيث المدة أو الكمية مع الحقن اللاحقة على الرغم من وجود عيارات عالية من الأجسام المضادة المضادة للفيروسات. يثير هذا الاحتمال المثير للاهتمام أن الجسم المضاد قد لا يحد من التوافر الحيوي لـ Ad-p53 المُدار بشكل منهجي.

البحوث والاستنتاجات المستقبلية

تلقى أول مريض عولج بالفيروس الارتجاعي p53 تخديرًا عامًا ، لكن العلاج في العيادة الخارجية يُعطى الآن باستخدام التخدير الموضعي فقط. يستغرق الحقن حوالي 20 دقيقة. تشير بساطة إجراء العلاج إلى أن نقل الجينات باستخدام Ad-p53 قد يوفر علاجًا عالي الفعالية من حيث التكلفة. بالنظر إلى النتائج الواعدة لدراسات المرحلة الأولى هذه ، تجري الآن تجارب المرحلة الثانية على مرضى سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة أو سرطان الرأس والرقبة ، كما أن الخطط جارية لتوسيع هذه الدراسات لتشمل المرضى المصابين بالثدي المتكرر محليًا أورام المثانة والمبيض التي قد تستفيد من العلاج الأكثر شدة لمرض المنطقة المحلية. استنادًا إلى البيانات قبل السريرية الواعدة التي تشير إلى أن Ad-p53 والإشعاع المؤين متآزران في التسبب في موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية ، فقد بدأت تجربة المرحلة الثانية في المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة غير صغير الخلايا غير القابل للاكتشاف وغير المعالج والذي يجمع بين Ad-p53 الذي يُعطى عن طريق الحقن داخل الورم مع العلاج الإشعاعي المؤين الخارجي.

إن العيار الفيروسي المنخفض الذي تم تحقيقه مع ناقل p53 الفيروسي وتثبيطه عن طريق تعميم المكمل يجعله غير مناسب للاستخدام الجهازي (بدلاً من داخل الورم). لا تنطبق هذه القيود على ناقلات الفيروسات الغدية ، ولكن استخدامها بشكل منهجي يتطلب تعبيرًا محسنًا للجينات المحورة ، وسمية منخفضة للناقلات ، ومن الناحية المثالية ، القضاء على الاستجابة المناعية للناقل. تعديل النواقل المستخدمة قد يقلل من التعبير عن البروتينات الغدية الذاتية ، مما يؤدي إلى تناقص الاستجابة المناعية المضادة للفيروسات الغدية. قد تؤدي إضافة العوامل التي تعزز تعبير الجينات المحورة إلى زيادة فعالية المستويات المنخفضة من التعبير الجيني بشكل كافٍ لجعلها علاجية.

سيكون من المفيد أيضًا أن تكون طريقة استهداف إيصال الورم إلى الورم. اقترح العمل السريري المبكر أن بعض التأثيرات الجهازية تحدث من الفيروس الغدي المنطلق من موقع الحقن داخل الورم ، حيث أشارت أدلة تشريح الجثة إلى أن ناقل الحمض النووي قد تم اكتشافه في رواسب الورم البعيدة. تشمل المجالات الأخرى للبحث الحالي طرقًا لزيادة مستويات التعبير عن البروتين p53 وقمع الاستجابة المناعية عن طريق إعطاء ما يصاحب ذلك من جرعة منخفضة من الإيتوبوسيد.

في الختام ، أظهرت التجارب السريرية أن الإعطاء المتكرر داخل الورم لـ Ad-p53 جيد التحمل ولا يرتبط بسمية كبيرة. تدعم الأدلة كلاً من نقل الجينات والتعبير الجيني في غالبية الأورام. أظهرت الأورام المتزايدة تدريجياً المقاومة للعلاجات التقليدية استجابات إكلينيكية موضوعية لـ Ad-p53.

في المستقبل القريب ، تشمل المجالات الواعدة المحتملة للعلاج ببدائل الجينات علاج الأمراض المتقدمة محليًا ، والعلاج المساعد والمستحدث للمرضى الذين يعانون من أورام قابلة للاستئصال ، واستخدام العلاج الجيني لتوعية الأورام بالعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، وربما علاج خباثة مترجمة. قد يكتمل العلاج ببدائل الجينات أيضًا لأن البحث الأساسي والسريري في السرطان قد يساعد أيضًا في حل العقبات التي حالت دون تطبيق العلاج الجيني على الأمراض الوراثية أحادية الجين. نظرًا للوتيرة السريعة للتقدم الأخير وتزايد الاهتمام بالعلاج الجيني ، نتصور أنه في المستقبل القريب ، سيحل العلاج الجيني مكانه جنبًا إلى جنب مع العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي والجراحة كأحد الأدوات المتاحة بشكل روتيني للمساعدة في علاج مرضى السرطان .

مراجع:

1. أندرسون دبليو إف: العلاج الجيني البشري. Science 256: 808-813 ، 1992.

2. Blaese RM ، Culver KW ، Miller AD ، وآخرون: العلاج الجيني الموجه للخلايا اللمفاوية التائية لـ ADA-SCID: نتائج التجارب الأولية بعد 4 سنوات. Science 270: 475-480، 1995.

3. Culver KW، Ram Z، Wallbridge S، et al: نقل الجينات في الجسم الحي باستخدام خلايا منتجة للفيروسات القهقرية لعلاج أورام الدماغ التجريبية. Science 256: 1550-1552، 1992.

4. Bishop JM: الموضوعات الجزيئية في تكوين الأورام. الخلية 64: 235-248 ، 1991.

5. Weinberg RA: الجينات الكابتة للورم. Science 254: 1138-1146 ، 1991.

6. Weinberg RA: الجينات الورمية والجينات الكابتة للورم. CA Cancer J Clin 44: 160-170 ، 1994.

7. Werness BA ، Levine AJ ، Howley PM: رابطة أنواع فيروس الورم الحليمي البشري 16 و 18 بروتينات E6 مع p53. Science 248: 76-79 ، 1990.

8. Baker SJ ، Markowitz S ، Fearon ER ، et al: قمع نمو خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري عن طريق النوع البري p53. Science 249: 912-915 ، 1990.

9. Mukhopadhyay T، Cavender A، Tainsky M، et al: التعبير عن رسالة k-ras المضادة للمعنى في خط خلية سرطان الرئة البشري مع الجين الورمي k-ras المنشط تلقائيًا يغير النمط الظاهري المحول (الملخص 1799). Proc Am Assoc Cancer Res 31: 304-304 ، 1990.

10. تاكاهاشي تي ، كاربوني دي ، تاكاهاشي تي ، وآخرون: يمنع p53 من النوع البري ولكن غير المتحور نمو خلايا سرطان الرئة البشرية التي تحمل آفات وراثية متعددة. الدقة السرطان 52: 2340-2343 ، 1992.

11. Bookstein R ، Shew JY ، Chen PL ، et al: قمع الأورام السرطانية لخلايا سرطان البروستاتا البشرية عن طريق استبدال جين RB المتحور. Science 247: 712-715 ، 1990.

12. Alemany R ، Ruan S ، Kataoka M ، et al: التأثير المثبط لنمو الفيروس الغدي المضاد لـ K-ras على خلايا سرطان الرئة. جين السرطان 3: 296-301 ، 1996.

13. Chen PL ، Scully P ، Shew JY ، et al: يتم تعديل الفسفرة للمنتج الجيني للورم الأرومي الشبكي أثناء دورة الخلية والتمايز الخلوي. الخلية 58: 1193-1198 ، 1989.

14. Kaelin WG Jr و Pallas DC و DeCaprio JA et al: تحديد البروتينات الخلوية التي يمكن أن تتفاعل على وجه التحديد مع منطقة ارتباط T / E1A لمنتج الجين الشبكي للورم الأرومي. الخلية 64: 521-532 ، 1991.

15. Eastham JA، Hall SJ، Sehgal I، et al: العلاج الجيني في الجسم الحي باستخدام p53 أو p21 adenovirus لسرطان البروستاتا. الدقة السرطان 55: 5151-5155 ، 1995.

16. Harper JW ، Adami GR ، Wei N ، وآخرون: البروتين المتفاعل مع Cdk p21 Cip1 هو مثبط قوي للكينازات G1 المعتمدة على السيكلين. الخلية 75: 805-816 ، 1993.

17. El-Deiry WS، Tokino T، Velculescu VE، et al: WAF1 ، وسيط محتمل لقمع الورم p53. الخلية 75: 817-825 ، 1993.

18. Polyak K و Waldman T و He TC et al: المحددات الجينية لموت الخلايا المبرمج الناجم عن p53 وتوقف النمو. جينات ديف 10: 1945-1952 ، 1996.

19. Yonish-Rouach E ، Resnitzky D ، Lotem J ، et al: يستحث النوع البري p53 موت الخلايا المبرمج لخلايا ابيضاض الدم النخاعي الذي يثبطه إنترلوكين -6. Nature 352: 345-347 ، 1991.

20. Harris CC: الجين p53 الكابت للورم كهدف للعلاجات الجديدة المضادة للسرطان. أدف أونكول 14: 3-10 ، 1998.

21. Schaake-Koning C ، van den Bogaert W ، Dalesio O ، et al: تأثيرات السيسبلاتين المصاحب والعلاج الإشعاعي على سرطان الرئة ذو الخلايا الصغيرة غير القابل للتشغيل. إن إنجل جي ميد 326: 524-530 ، 1992.

22. Chiba I، Takahashi T، Nau MM، et al: الطفرات في الجين p53 متكررة في سرطان الرئة غير صغير الخلايا الأولي المستأصل: مجموعة دراسة سرطان الرئة. Oncogene 5: 1603-1610 ، 1990.

23. Harris CC: محاضرة Walter Hubert عام 1995 - علم الأوبئة الجزيئية لسرطان الإنسان: رؤى من التحليل الطفري للجين p53 الكابت للورم. Br J Cancer 73: 261-269 ، 1996.

24. Cai DW ، Mukhopadhyay T ، Liu Y ، et al: تعبير مستقر عن الجين p53 من النوع البري في خلايا سرطان الرئة البشرية بعد نقل الجينات بوساطة الفيروسات القهقرية. هوم جين ثير 4: 617-624 ، 1993.

25. Zhang WW ، Fang X ، Mazur W ، وآخرون: نقل الجينات عالي الكفاءة والتعبير عالي المستوى عن النوع البري p53 في خلايا سرطان الرئة البشرية بوساطة الفيروس الغدي المؤتلف. جين السرطان هناك 1: 5-13 ، 1994.

26. Fujiwara T، Grimm EA، Mukhopadhyay T، et al: يخترق ناقل التعبير p53 من النوع البري الفيروسي الشبه الكروية لسرطان الرئة البشري ويمنع النمو عن طريق إحداث موت الخلايا المبرمج. الدقة السرطان 53: ​​4129-4133 ، 1993.

27. Zhang WW ، Alemany R ، Wang J ، et al: تقييم أمان Ad5CMV-p53 في المختبر وفي الجسم الحي. Hum Gene Ther 6: 155-164 ، 1995.

28. كلايمان جي إل ، ليو تي جي ، أوفرهولت إس إم ، وآخرون: العلاج الجيني لسرطان الرأس والعنق: مقارنة جين مثبط الورم p53 مع منظم دورة الخلية WAF1 / CIP1 (ص 21). قوس Otolaryngol Head Neck Surg 122: 489-493، 1996.

29. نيشيزاكي إم ، فوجيوارا تي ، تانيدا تي ، وآخرون: الفيروس الغدي المؤتلف الذي يعبر عن النوع البري p53 مضاد لتكوّن الأوعية: آلية مقترحة لتأثيرات المتفرجين. Clin Cancer Res 5: 1015-1023 ، 1999.

30. Owen-Schaub LB، Zhang W، Cusack JC، et al: Wild-type human p53 and a mutant حساس لدرجة الحرارة تحفز تعبير Fas / APO-1. مول سيل بيول 15: 3032-3040 ، 1995.

31. Fujiwara T ، Cai DW ، Georges RN ، et al: التأثير العلاجي لمتجه التعبير p53 من النوع البري الفيروسي في نموذج سرطان الرئة مثلي. J Natl Cancer Inst 86: 1458-1462 ، 1994.

32. روث جا ، كريستيانو آر جيه: العلاج الجيني للسرطان: ماذا فعلنا وإلى أين نحن ذاهبون؟ J Natl Cancer Inst 89: 21-39 ، 1997.

33. Fujiwara T، Grimm EA، Mukhopadhyay T، et al: تحريض الحساسية الكيميائية في خلايا سرطان الرئة البشرية في الجسم الحي عن طريق نقل الجين p53 من النوع البري بوساطة الفيروس الغدي. الدقة السرطان 54: 2287-2291 ، 1994.

34. Nguyen DM، Spitz FR، Yen N، et al: العلاج الجيني لسرطان الرئة: تعزيز قمع الورم عن طريق مزيج من السيسبلاتين الجهازي المتسلسل ونقل الجين p53 بوساطة الفيروس الغدي. J Thorac Cardiovasc Surg 112: 1372-1377، 1996.

35. Spitz FR ، Nguyen D ، Skibber JM ، et al: التعبير الجيني من النوع البري p53 من النوع البري بوساطة الفيروس الغدي يحسس خلايا سرطان القولون والمستقيم للإشعاع المؤين. Clin Cancer Res 2: 1665-1671 ، 1996.

36. Lang FF، Yung WK، Raju U، et al: تعزيز الحساسية الإشعاعية لخلايا الورم الدبقي البشري من النوع p53 من خلال توصيل الجين p53 بوساطة الفيروس الغدي. J Neurosurg 89: 125-132 ، 1998.

37. Stevens CW، Zeng M، Cerniglia GJ: يحسن الإشعاع المؤين بشكل كبير من كفاءة نقل الجينات في خلايا الثدييات. Hum Gene Ther 7: 1727-1734 ، 1996.

38. Roth JA، Nguyen D، Lawrence DD، et al: نقل الجينات البرية من النوع p53 بوساطة الفيروسات القهقرية إلى أورام مرضى سرطان الرئة. نات ميد 2: 985-991 ، 1996.

39. Clayman GL ، El-Naggar AK ، Lippman SM ، et al: نقل الجين p53 بوساطة الفيروس الغدي في المرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الحرشفية المتقدم في الرأس والرقبة. J كلين أونكول 16: 2221-2232 ، 1998.

40. Kovesdi I ، Brough DE ، Bruder JT ، et al: ناقلات الفيروسات الغدية لنقل الجينات. Curr Opin Biotechnol 8: 583-589 ، 1997.


شاهد الفيديو: Gentherapie. Somatische Gentherapie - Gentherapie bei Krebs u0026 an der Leber einfach erklärt (كانون الثاني 2022).