معلومة

هل يؤثر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل على نتائج ميكروأري أو جهاز استشعار الحمض النووي؟


لقد لاحظت أن تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل يتم عادة قبل تحليل عينة الحمض النووي باستخدام المصفوفات الدقيقة أو المستشعرات الحيوية.

ومع ذلك ، ألا تؤدي تحيزات التضخيم أو الأخطاء إلى إفساد نتائج ملف تعريف التعبير الجيني التي تحصل عليها من مصفوفة ميكروية؟ ثانيًا ، هل يعني هذا أن التضخيم يسمح لك فقط بالحصول على معلومات نوعية من جهاز استشعار حيوي كهروكيميائي؟ (بدلاً من المعلومات الكمية الفعلية حول تركيز الحمض النووي)


في أي وقت يكون لديك PCR في بروتوكول ، نعم ، قد تفسد القياس الكمي. لذلك يمكنك القيام بأقل قدر ممكن من PCR ، بحيث يظل في النطاق الخطي ، مع الحفاظ على وفرة القوالب المختلفة (بعد كل شيء ، qPCR هو المعيار الذهبي للقياس الكمي للتعبير) ، وتأمل أن يكون هناك حد أدنى من تحيزات PCR بين القوالب.


نعم إنها كذلك.

هذا هو السبب في أنه يجب عليك تضمين عناصر تحكم إيجابية وسلبية وتكرار التجارب عدة مرات ثم متوسط ​​النتائج.

بشكل عام ، يكون التضخيم بواسطة PCR متحيزًا بواسطة كفاءة الاعتماد على التسلسل. لعدة أسباب (من بينها محتوى GC ، تلدين عدم تطابق المخزن المؤقت PCR وتوقيت ودرجات حرارة خطوات التدوير) يمكن أن يكون هناك قالب معين مبالغ فيه أو أقل من المتوقع.

على سبيل المثال ، إذا تم تضخيم تسلسل واحد بنسبة 10٪ أكثر من الآخر في جولة واحدة ، فسيكون 1.1 ^ 30 = 17.4 مرة أكثر وفرة بعد 30 دورة تضخيم.

هنا بعض المؤلفات حول هذا الموضوع:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2292241/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3628873/ https: //www.ncbi.nlm. nih.gov/pmc/articles/PMC3129672/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2727727/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4433096/

هذا لا يعني أنه لا يمكنك الحصول على معلومات كمية. يستخدم PCR للحصول على نتائج كمية في العديد من مجالات البحث. عليك "فقط" أن تتأكد من أنك تقوم بذلك بشكل صحيح. اعلم أن الإرباكات التجريبية قد تفسد نتائجك ، لذا كن حرجًا عند تحليل بياناتك الخاصة.


PCR الكمي

سارة مادوكس ، روينا جنكينز ، في فهم PCR ، 2017

4.1 مقدمة

تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (Q-PCR) هو طريقة يمكن من خلالها تحديد كمية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، في الوقت الفعلي ، وهي مفيدة جدًا في التحقيق في التعبير الجيني. غالبًا ما يتم اختصارها إلى Q-PCR ، يشار إلى هذه الطريقة أحيانًا باسم PCR في الوقت الفعلي أو اعتمادًا على التطبيق ، PCR النسخ العكسي الكمي (كلاهما مختصرا بـ RT-PCR ، والذي يمكن أن يكون مربكًا إلى حد ما). سوف نشير إلى جميع طرق PCR الكمية كـ Q-PCR في هذا الفصل ، حيث سيميز هذا بين نوعي RT-PCR حسب الضرورة. لا يعتمد Q-PCR على أي تحليل لاحق مثل الرحلان الكهربي أو قياس الكثافة وهو متعدد الاستخدامات للغاية ، مما يتيح تقييم أهداف PCR المتعددة في وقت واحد ولكن يمكن أن يكون إعدادها أصعب قليلاً من PCR "القياسي" ولكن ، إذا كنت مألوفًا بما فيه الكفاية مع PCR "القياسي" فأنت في وضع جيد لإجراء Q-PCR بنجاح.


الملخص

في هذه الدراسة ، تم اقتراح جهاز استشعار حيوي ميرنا الكهروكيميائي فائق الحساسية يعتمد على دوائر تفاعل إزاحة حبلا ذات موطئ قدم (SDRCs) وتفاعل بلمرة إزاحة دائرية متساوية الحرارة بوساطة منارة جزيئية (ICSDPR). أثناء وحدة SDRCs ، يؤدي تفاعل إزاحة الخيط المتسلسل إلى إعادة تدوير الهدف 7 أ وتوليد كمية كبيرة من الخيط A (SA). يفتح التعرف على SA مسبار التقاط دبوس الشعر المثبت على قطب الذهب ، وبالتالي ، يغير المسافة بين جزيئات الأكسدة والاختزال وسطح القطب. لوحظ أن ICSDPR بوساطة التمهيدي يؤدي إلى زيادة توليد كمية كبيرة من SA ، مما يؤدي إلى انخفاض في الإشارة. بالنظر إلى هذه المزايا ، لوحظ أن الطريقة المقترحة تُظهر خطيًا لوغاريتميًا خطيًا من 10 صباحًا إلى 100 مساءً وحساسية فائقة تجاه السماح 7 أ حتى 6.2 أمبير ، مع القدرة على التمييز بين أفراد عائلة Let 7a ، وبالتالي توفير كهروكيميائية جديدة طريق الفحص المبكر للسرطان.


دليل استكشاف أخطاء PCR وإصلاحها

ترتبط المشكلات الشائعة في تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل أساسي بظروف التفاعل ودقة التسلسل وإنتاجية التضخيم والخصوصية. في هذه الصفحة ، تعرف على أسبابها المحتملة وتوصياتنا حول كيفية حل هذه المشكلات.

على هذه الصفحة:

  • تقليل تقطيع وخدش الحمض النووي أثناء العزل. تقييم تكامل الحمض النووي للقالب عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام ، إذا لزم الأمر.
  • قم بتخزين الحمض النووي في الماء الجزيئي أو المخزن المؤقت TE (درجة الحموضة 8.0) لمنع التحلل بواسطة نوكليازات.
  • اتبع توصيات الشركة المصنعة بصرامة عند استخدام مجموعات التنقية لعزل الحمض النووي للقالب. راجع دليل المستخدم وأدلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها للتخفيف من سوء جودة الحمض النووي.
  • تأكد من عدم وجود مثبطات PCR متبقية مثل الفينول ، EDTA ، وبروتيناز K في حالة اتباع بروتوكولات تنقية الحمض النووي الكيميائية أو الأنزيمية.
  • إعادة تنقية أو ترسيب وغسل الحمض النووي باستخدام 70٪ من الإيثانول ، لإزالة الأملاح أو الأيونات المتبقية (على سبيل المثال ، K + ، Na + ، إلخ) التي قد تثبط بوليميرات الحمض النووي.
  • اختر بوليميرات الحمض النووي ذات الإنتاجية العالية ، والتي تظهر تحمل عاليًا لمثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل الشائعة المنقولة من التربة والدم والأنسجة النباتية ، إلخ.
  • افحص كمية إدخال DNA وقم بزيادة الكمية إذا لزم الأمر.
  • اختر بوليميرات الحمض النووي ذات الحساسية العالية للتضخيم.
  • إذا كان ذلك مناسبًا ، فقم بزيادة عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  • اختر بوليميرات الحمض النووي ذات المعالجة العالية ، والتي تظهر تقاربًا كبيرًا لقوالب الحمض النووي وتكون أكثر ملاءمة لتضخيم الأهداف الصعبة.
  • استخدم مادة مضافة PCR أو مذيب مشترك للمساعدة في تغيير طبيعة الحمض النووي الغني بالـ GC والتسلسلات ذات الهياكل الثانوية.
  • قم بزيادة وقت التمسخ و / أو درجة الحرارة لفصل قوالب الحمض النووي مزدوجة الشريطة بكفاءة.
  • تحقق من قدرة طول التضخيم لبوليميرات الحمض النووي المحدد. استخدم بوليميرات الحمض النووي المصممة خصيصًا لتفاعل البوليميراز المتسلسل الطويل.
  • اختر بوليميرات الحمض النووي عالية المعالجة ، والتي يمكنها تضخيم الأهداف الطويلة في وقت أقصر.
  • تقليل درجات حرارة التلدين والتمديد للمساعدة في ربط التمهيدي وثبات الإنزيم بالحرارة.
  • قم بإطالة وقت التمديد وفقًا لأطوال أمبليكون.
  • مراجعة التصميم التمهيدي. استخدم أدوات التصميم التمهيدي عبر الإنترنت عندما يكون ذلك مناسبًا.
  • تأكد من أن البادئات خاصة بالهدف محل الاهتمام.
  • تحقق من أن البادئات مكملة للخيوط الصحيحة للحمض النووي المستهدف.
  • البادئات الكوة بعد إعادة التعليق وتخزينها بشكل صحيح.
  • أعد تكوين قسامات أولية جديدة أو احصل على مواد أولية جديدة إذا لزم الأمر.
  • تحسين تركيزات التمهيدي (عادة في نطاق 0.1-1 ميكرومتر).
  • بالنسبة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الطويل و تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع بادئات متدهورة ، ابدأ بتركيز لا يقل عن 0.5 ميكرومتر.
  • استخدم بوليمرات الدنا ذات البداية الساخنة لمنع تدهور البادئات من خلال نشاط نوكلياز خارجي 3'→ 5 'لتصحيح التجارب المطبعية لبوليميرات الحمض النووي. تزيد بلمرات الدنا ذات البدء الساخن أيضًا من إنتاجية منتجات PCR المرغوبة من خلال القضاء على التضخيم غير المحدد.
  • بدلاً من ذلك ، قم بإعداد PCR على الجليد ، أو أضف بوليميريز DNA أخيرًا إلى خليط التفاعل.
  • اختر بوليميرات الحمض النووي ذات الحساسية العالية للتضخيم.
  • مراجعة التوصيات بشأن كمية بوليميريز الحمض النووي لاستخدامها في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتحسينها حسب الضرورة.
  • قم بزيادة كمية بوليميريز الحمض النووي إذا كان خليط التفاعل يحتوي على تركيز عالٍ من مادة مضافة (على سبيل المثال ، DMSO ، فورماميد) أو مثبطات من مصادر العينة.
  • تحسين تركيز Mg 2+ لتحقيق أقصى عوائد PCR. قد يتطلب وجود EDTA ، أو خالب المعادن الأخرى ، أو تركيزات عالية غير معتادة من dNTPs أعلى تركيز Mg 2+.
  • تحقق من تفضيل بوليميريز الحمض النووي لمحاليل ملح المغنيسيوم. على سبيل المثال، Pfu يعمل بوليميراز الحمض النووي بشكل أفضل مع MgSO4 من MgCl2.
  • راجع التركيزات الموصى بها لمضافات تفاعل البوليميراز المتسلسل أو المذيبات المشتركة. استخدم أقل تركيز ممكن عند الاقتضاء.
  • اضبط درجات حرارة التلدين ، حيث تضعف التركيزات العالية من إضافات PCR أو المذيبات المشتركة ارتباط التمهيدي بالهدف.
  • زيادة كمية بوليميراز الحمض النووي ، أو استخدام بوليميرات الحمض النووي عالية المعالجة.
  • ضع في اعتبارك استخدام مادة مضافة أو مذيب مشترك تمت صياغته خصيصًا لبوليميراز DNA معين (على سبيل المثال ، GC Enhancer المزود ببوليميراز Invitrogen Platinum DNA).
  • تأكد من أن بوليمرات الحمض النووي المحددة قادرة على دمج النيوكليوتيدات المعدلة.
  • تحسين نسبة النيوكليوتيدات المعدلة إلى dNTP لزيادة كفاءة PCR.
  • قم بخلط مخزون الكاشف والتفاعلات المحضرة جيدًا للتخلص من تدرجات الكثافة التي قد تكون قد تشكلت أثناء التخزين والإعداد.
  • تحسين وقت تمسخ الحمض النووي ودرجة الحرارة. قد لا تفصل فترات تغيير الطبيعة القصيرة ودرجات الحرارة المنخفضة بين قوالب الحمض النووي المزدوج الشريطة جيدًا. من ناحية أخرى ، قد تؤدي أوقات التمسخ الطويلة ودرجات الحرارة المرتفعة إلى تقليل نشاط الإنزيم.
  • قم بتحسين درجة حرارة التلدين تدريجياً بزيادات 1-2 درجة مئوية ، باستخدام جهاز تدوير متدرج عند توفره. عادة ما تكون درجة حرارة التلدين المثلى 3-5 درجات مئوية تحت أدنى درجة حرارة تمهيدي Tم.
  • اضبط درجة حرارة التلدين عند استخدام مادة مضافة PCR أو مذيب مشترك.
  • استخدم درجة حرارة التلدين الموصى بها لبوليميراز DNA معين في المخزن المؤقت الأمثل. يمكن أن تختلف قواعد درجة حرارة التلدين لمجموعات التمهيدي بين بوليميرات الحمض النووي المختلفة.
  • حدد فترة تمديد مناسبة لطول amplicon.
  • قم بتقليل درجة حرارة الامتداد (على سبيل المثال ، إلى 68 درجة مئوية) للحفاظ على نشاط الإنزيم أثناء تضخيم الأهداف الطويلة (على سبيل المثال ، GT10 كيلو بايت).
  • استخدم بوليميرات الحمض النووي ذات المعالجة العالية لتضخيم قوي حتى مع فترات التمديد القصيرة.
  • اضبط عدد الدورات (بشكل عام إلى 25-35 دورة) لإنتاج عائد مناسب من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل. قم بتمديد عدد الدورات إلى 40 إذا كان إدخال الحمض النووي أقل من 10 نسخ.
  • راجع الكميات المثلى من مدخلات الحمض النووي. قلل الكمية لتقليل توليد منتجات PCR غير محددة.
  • قد يظهر الحمض النووي المتحلل على شكل مسحات أو يؤدي إلى خلفية عالية في الرحلان الكهربائي للهلام. تقليل تقطيع وخدش الحمض النووي أثناء العزل.
  • تقييم سلامة قالب DNA قبل PCR بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام ، إذا لزم الأمر. قم بتخزين الحمض النووي في الماء الجزيئي أو المخزن المؤقت TE (درجة الحموضة 8.0) لمنع التحلل بواسطة نوكليازات.
  • اختر بوليميرات الحمض النووي ذات المعالجة العالية ، والتي تظهر تقاربًا كبيرًا لقوالب الحمض النووي وتكون أكثر ملاءمة لتضخيم الأهداف الصعبة.
  • استخدم مادة مضافة PCR أو مذيب مشترك للمساعدة في تغيير طبيعة الحمض النووي الغني بالـ GC والتسلسلات ذات الهياكل الثانوية. قم بزيادة وقت التمسخ و / أو درجة الحرارة لفصل قوالب الحمض النووي مزدوجة الشريطة بكفاءة.
  • تحقق من قدرة طول التضخيم لبوليميرات الحمض النووي المحدد. استخدم بوليميرات الحمض النووي المصممة خصيصًا لتفاعل البوليميراز المتسلسل الطويل.
  • اختر بوليميرات الحمض النووي عالية المعالجة ، والتي يمكنها تضخيم الأهداف الطويلة في وقت أقصر.
  • تقليل درجات حرارة التلدين والتمديد للمساعدة في ربط التمهيدي وثبات الإنزيم بالحرارة. قم بإطالة وقت التمديد وفقًا لأطوال أمبليكون.
  • مراجعة التصميم التمهيدي. استخدم أدوات التصميم التمهيدي عبر الإنترنت عندما يكون ذلك مناسبًا. تحقق من أن البادئات خاصة بالهدف ، مع الحد الأدنى من التشابه مع المناطق الأخرى في القالب.
  • تأكد من أن البادئات لا تحتوي على متواليات تكميلية أو نيوكليوتيدات G أو C متتالية في النهايات 3 ، لمنع تكوين ثنائي التمهيدي.
  • تجنب التكرار المباشر في البادئات لمنع المحاذاة الخاطئة في الارتباط بالهدف. ضع في اعتبارك استخدام مواد أولية أطول لتعزيز الخصوصية.
  • ضع في اعتبارك تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لتحسين الخصوصية.
  • تحسين تركيزات التمهيدي (عادة في نطاق 0.1-1 ميكرومتر). تعمل التركيزات العالية من البرايمر على تعزيز تكوين التمهيدي - الثنائى.
  • مراجعة التوصيات بشأن كمية بوليميريز الحمض النووي لاستخدامها في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتقليلها حسب الضرورة.
  • استخدم بوليميرات الحمض النووي ذات البداية الساخنة التي ليس لها نشاط في درجة حرارة الغرفة ولكنها تعمل فقط بعد خطوة تنشيط عالية الحرارة ، لتعزيز الخصوصية. باستخدام بوليميرات الحمض النووي غير الساخنة البدء ، قم بإعداد PCR على الجليد للحفاظ على نشاط الإنزيم منخفضًا.
  • قم بمراجعة تركيزات Mg 2+ وخفضها حسب الاقتضاء لمنع منتجات PCR غير المحددة. تحسين تركيزات Mg 2+ لكل مجموعة أولية والحمض النووي المستهدف.
  • قم بزيادة وقت التمسخ و / أو درجة الحرارة لفصل الحمض النووي بكفاءة عند العمل مع قوالب وتسلسلات غنية بالـ GC مع الهياكل الثانوية.
  • استخدم درجة حرارة التلدين الموصى بها لبوليميراز DNA معين في المخزن المؤقت الأمثل. يمكن أن تختلف قواعد درجة حرارة التلدين لمجموعات التمهيدي بين بوليميرات الحمض النووي المختلفة.
  • زيادة درجة حرارة التلدين لتحسين النوعية. تكون درجة حرارة التلدين المثلى عادة ما لا تقل عن 3-5 درجات مئوية تحت أدنى طبقة تمهيدية Tم.
  • قم بتحسين درجة حرارة التلدين تدريجياً بزيادات 1-2 درجة مئوية ، باستخدام جهاز تدوير متدرج عند توفره.
  • النظر في عملية اللمس PCR لتعزيز الخصوصية.
  • تقصير وقت التلدين لتقليل ارتباط التمهيدي بالتسلسلات غير المحددة.
  • خفض درجة حرارة التمديد 3-4 درجات مئوية لمساعدة بوليميريز الحمض النووي بالحرارة ، خاصة بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الطويل.
  • إطالة وقت التمديد عند تضخيم أهداف الحمض النووي الطويلة.
  • قم بتضمين خطوة تمديد نهائية بوقت كافٍ (5-15 دقيقة) لتمديد الهدف بأكمله.
  • تقليل عدد الدورات ، دون خفض كبير في إنتاجية منتجات PCR المرغوبة ، لمنع تراكم الأمبليكونات غير المحددة.
  • استخدم بوليميرات الحمض النووي بدقة عالية بشكل استثنائي لتوليد أجزاء PCR للتطبيقات النهائية مثل الاستنساخ والتسلسل والطفرات الموجهة للموقع.
  • راجع تركيزات Mg 2+ وقللها حسب الضرورة. التركيزات المفرطة تفضل التضمين الخاطئ للنيوكليوتيدات بواسطة بوليميراز الحمض النووي.
  • تأكد من تركيزات متساوية من dATP و dCTP و dGTP و dTTP في التفاعل. تزيد تركيزات النوكليوتيدات غير المتوازنة من معدل خطأ تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  • تقليل عدد الدورات دون خفض كبير في إنتاجية منتجات PCR المطلوبة. تزيد الأعداد الكبيرة من الدورات من دمج النيوكليوتيدات غير المتطابقة.
  • قم بزيادة كمية إدخال الحمض النووي عندما يكون ذلك مناسبًا لتجنب تشغيل عدد مفرط من الدورات.
  • استخدم مربعًا ضوئيًا طويل الموجة فوق البنفسجية (360 نانومتر) لتصور الأجزاء الهلامية ، والحد من وقت الإضاءة قدر الإمكان.
  • إذا كنت تستخدم صندوق ضوء قصير الموجة (254-312 نانومتر) ، فحد من إضاءة الأشعة فوق البنفسجية لبضع ثوان واحتفظ بالجيل على لوح زجاجي أو بلاستيكي.
  • بدلاً من ذلك ، استخدم الأصباغ ذات الطول الموجي الأطول (أقل ضررًا) لإثارة تصور الحمض النووي.
  • تسلسل كل من خيوط الحمض النووي للتحقق من موثوقية نتائج التسلسل. استخدم عينات مكررة عند الاقتضاء.
  • تجنب التكرارات المباشرة داخل تسلسلات التمهيدي ، حيث قد تظهر التكرارات المتعددة من اختلال التسلسل في نهايات منتجات PCR.
  • اطلب بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع التنقية لإزالة قليل من الحمض النووي غير كامل الطول ، والتي يتم اقتطاعها في نهاياتها الخمسة.
  • استخدم الكواشف الجزيئية الخالية من نوكلياز في إعداد PCR. قم بإعداد ردود الفعل على الجليد للحفاظ على نشاط نوكليازات خارجية ملوثة منخفضة.
  • استخدم مربعًا ضوئيًا طويل الموجة فوق البنفسجية (360 نانومتر) لتصور الأجزاء الهلامية ، والحد من وقت الإضاءة قدر الإمكان.
  • إذا كنت تستخدم صندوق ضوء قصير الموجة (254-312 نانومتر) ، فحد من إضاءة الأشعة فوق البنفسجية لبضع ثوان واحتفظ بالجيل على لوح زجاجي أو بلاستيكي.
  • بدلاً من ذلك ، استخدم الأصباغ ذات الطول الموجي الأطول (أقل ضررًا) لإثارة تصور الحمض النووي.
  • تسلسل كل من خيوط الحمض النووي للتحقق من موثوقية نتائج التسلسل. استخدم عينات مكررة عند الاقتضاء.
  • تجنب البادئات التي تحتوي على متواليات تكميلية ومتكاملة ذاتيًا ، والتي تفضل تكوين البادئة ثنائية التمهيدي وقلة القلة الذاتية وتضخيمها اللاحق.
  • تجنب تلوث الحمض النووي في بيئة العمل باتباع التوصيات العامة لإعداد PCR.
  • استخدم أطراف الماصة مع حواجز الهباء الجوي. خصص منطقة عمل منفصلة وقم بتطهير المنطقة بعد كل استخدام.
  • اتبع تقنيات التحكم في ترحيل PCR مثل دمج dUTP مع علاج UDG.

لمزيد من المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، يرجى زيارة مركز دعم End-Point PCR و PCR Primers أو الاتصال بفريق الدعم الفني.


النوعية

يعد التضخيم غير المحدد أحد العقبات الرئيسية في PCR لأنه يمكن أن يؤثر بشكل كبير على العائد وحساسية التضخيم المستهدف ، وبالتالي يعرض للخطر تفسير النتائج ونجاح التطبيقات النهائية. غالبًا ما توسع بوليميرات الحمض النووي الأهداف التي تم ضبطها بشكل خاطئ وثنائيات التمهيدي ، والتي تعد مصادر شائعة للتضخيم غير المحدد. تتمثل إحدى طرق تقليل التضخيم غير المحدد في إعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل على الجليد. يساعد هذا في الحفاظ على نشاط بوليميريز الحمض النووي منخفضًا ، ولكن قد يستمر حدوث تخليق المنتجات غير المرغوب فيها قبل بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل. حل آخر هو تأخير إضافة DNA polymerase حتى خطوة التلدين من الدورة الأولى. تسمى هذه التقنية "البداية الساخنة" حيث لا يمكن أن يبدأ التضخيم إلا بعد خطوة تمسخ أولية أعلى من 90 درجة مئوية.

ما هو بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟

تعرف على معلومات حول بدء PCR سريعًا وفوائده لتطبيقات PCR الخاصة بك. اكتشف كيف يمكنك تقليل التضخيم غير المحدد وزيادة العائد في تفاعل البوليميراز المتسلسل.

على الرغم من فعاليته في تحسين الخصوصية ، فإن إجراء البدء الساخن اليدوي شاق ويزيد من خطر تلوث العينة وضعف التكاثر. في عام 1994، طق تم تطوير بوليميرات الحمض النووي مع خاصية البداية الساخنة الحقيقية [1،2] ، حيث ترتبط أجسام مضادة معينة بالبوليميراز لتثبيطها في درجة حرارة الغرفة أثناء إعداد التفاعل. أثناء خطوة التمسخ الأولي لدرجات الحرارة المرتفعة (على سبيل المثال ، gt90 درجة مئوية) ، تتحلل الأجسام المضادة المرتبطة ، مما يؤدي إلى تنشيط بوليميرات الحمض النووي (شكل 1).

الشكل 1. إنزيم بوليميراز DNA عالي البداية المستند إلى الجسم المضاد وتنشيطه في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتعزيز الخصوصية.

تفصل خطوة التمسخ أيضًا بين الأهداف التي تم ضبطها بشكل خاطئ وثنائيات البادئة التي ربما تكونت أثناء إعداد التفاعل ، وبالتالي تمنع تضخيمها بواسطة بوليميرات الحمض النووي في خطوات التلدين والتمديد اللاحقة. بهذه الطريقة ، تقلل بوليمرات الحمض النووي ذات البدء الساخن التضخيم غير المحدد ، وتزيد الغلة ، وتسمح بإعداد مناسب لدرجة حرارة الغرفة للتطبيقات عالية الإنتاجية (الأشكال 2-4). (ملاحظة التطبيق: PCR عالي الإنتاجية).

الشكل 2. نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من بوليميراز الحمض النووي غير ساخن البدء مقابل البدء الساخن. لاحظ الغلة المحسنة للأمبليكون المطلوب وعدم وجود تضخيم غير محدد مع بوليميراز DNA عالي البداية.

الشكل 3. ملاءمة بوليميراز DNA البدء الساخن لإعداد تفاعل درجة حرارة الغرفة للتطبيقات عالية الإنتاجية. تم تحضير تفاعلات PCR واحتضانها عند درجة حرارة الغرفة لمدة 0 ، 24 ، و 72 ساعة قبل التحميل في جهاز تدوير حراري. تمت ملاحظة تضخيم محدد للغاية لجزء 2 كيلو بايت من gDNA البشري حتى 72 ساعة بعد إعداد درجة حرارة الغرفة ، مما يدل على قوة بوليمرات الحمض النووي ذات البداية الساخنة للتجارب واسعة النطاق.

الشكل 4. مقارنة نشاط البلمرة: (أ) بوليميراز DNA "بداية ساخنة" حقيقي مقابل (ب) بوليميريز DNA "بداية دافئة". تم قياس نشاط البوليميراز عند 60 درجة مئوية (ثابت) لمدة 60 دقيقة. في اختبارات التنشيط الحراري (المنحنيات الزرقاء) ، تمت معالجة البوليميرات الحرارية عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين لفصل الأجسام المضادة عن البوليميرات. بدون التنشيط الحراري (المنحنيات الحمراء) ، لم يُظهر بوليميراز DNA ذي البداية الساخنة أي نشاط يمكن اكتشافه ، في حين أن إنزيم البدء الدافئ عرض التنشيط عند 60 درجة مئوية ، مما يجعله غير مناسب لتطبيقات البدء الساخن.

كبدائل للأجسام المضادة ، يمكن أيضًا تحقيق سمات البداية الساخنة من خلال تعديلات كيميائية قابلة للحرارة للموقع النشط للإنزيم ، وكذلك باستخدام جزيئات صغيرة مثل الأبتاميرات لتقصير وقت التنشيط. بغض النظر عن اختيار تقنيات البدء الساخن ، فمن الأهمية بمكان أن يتم حظر نشاط بوليميريز الحمض النووي بكفاءة في ظل ظروف غير ساخنة لضمان الخصوصية (الشكل 4).

PCR أبسط وأنظف وأكثر ذكاءً

بالنسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية ، يمكنك تحقيق استقرار في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة بعد إعداد التفاعل ودورة مشتركة لأهداف PCR المختلفة باستخدام Invitrogen Platinum II طق البدء الساخن لبوليميراز DNA.


حساس حيوي للحمض النووي بتلألؤ كهربي حساس يعتمد على تضخيم إشارة تفاعل سلسلة التهجين بمساعدة إنزيم ExoIII جنبًا إلى جنب مع مجسات متعددة محملة بالجسيمات النانوية

تم إنشاء مستشعر حيوي للحمض النووي بتلألؤ كهربي كهربائي (ECL) بناءً على مساعدة نوكلياز ExoIII وتقنية تضخيم تفاعل سلسلة التهجين (HCR). يتم استخدام نوكلياز ExoIII ومفتاح جزيئي DNA ثلاثي الحلزون في الكشف عن هدف في الدورة الدموية. من خلال الجمع بين HCR و AuNPs @ DNA ، تم بناء مسبار إشارة جديد ، والذي يتيح تضخيم الإشارات المتعددة والكشف عالي الحساسية للأرز المعدّل وراثيًا BT63 DNA. الحديد3ا4يضاف محلولAu إلى قطب كربون زجاجي متحكم فيه مغناطيسيًا ، ويتم تثبيت DNA الالتقاط المعدل بالكبريتيد (CP) على Fe3ا4Au من خلال سندات Au – S. يضاف Mercaptoethanol لإغلاق المواقع ومنع الامتزاز غير المحدد لـ CP على قطب الكربون الزجاجي المغنطروني. يضاف الحمض النووي المستهدف إلى أنبوب الطرد المركزي الجزيئي ثلاثي الحلزون للحمض النووي من أجل التفاعل. نظرًا للتكامل الأساسي والتبديل العكسي للحالة الجزيئية ثلاثية الحلزون للحمض النووي ، يقوم الحمض النووي المستهدف بتشغيل التبديل الجزيئي للحمض النووي ثلاثي الحلزون ويتم تهجينه باستخدام مسبار التعرف على الخيوط الطويلة (RP) لتشكيل DNA مزدوج الشريطة (dsDNA) ). تتم إضافة نوكلياز ExoIII للتعرف بشكل خاص على dsDNA وقطعه وإطلاق الحمض النووي المستهدف. ثم يدور خيط الحمض النووي المستهدف بالكامل مرة أخرى لفتح المفتاح الجزيئي متعدد الحلزون الثلاثي للحمض النووي ، مما يؤدي إلى إطلاق عدد كبير من مجسات نقل الإشارة (STP). للتهجين مع CP ، يتم إضافة كمية كبيرة من STP إلى القطب. أخيرًا ، يضاف مسبار إشارة AuNPs @ DNA للتهجين باستخدام STP. تمت إضافة مجسات H1 و H2 لتفاعل سلسلة التهجين والتمديد غير المحدود لشريط التمهيدي على المسبار. بعد ذلك ، يضاف تريس- (بيبيريدل) روثينيوم (II) للكشف عن إشارة ECL باستخدام PBS-tri-n-propylamine كحل أساسي. في نطاق التركيز 1.0 × 10 −16 إلى 1.0 × 10 8 مول / لتر من الحمض النووي المستهدف ، تم تحقيق علاقة خطية جيدة مع إشارة ECL المقابلة. حد الكشف هو 3.6 × 10 −17 مول / لتر. تتراوح نسبة الاسترداد السريع لعينات الأرز من 97.2 إلى 101.5٪. المستشعر حساس للغاية وله انتقائية جيدة واستقرار وقابلية للتكاثر.

مجردة رسومية

تم تحضير مستشعر حيوي جديد للتلألؤ الكهربائي مع حساسية أعلى للغاية لتحديد كمية الأرز المعدلة وراثيا BT63 DNA. تم تحسين الحساسية بشكل كبير من خلال تحسينات الإشارة المتعددة. أولاً ، يتم إطلاق عدد كبير من مجسات نقل الإشارة عند فتح المفتاح الجزيئي للحمض النووي ثلاثي الحلزون بعد إعادة التدوير بمساعدة نوكلياز ExoIII تحت الهدف BT63 DNA ثم تهجين مجسات نقل الإشارة مع مجسات إشارة AuNPs @ (DNA-HCR) المنتجة من خلال تفاعل سلسلة التهجين. أخيرًا ، تنتج مجسات الإشارة التي تم تضمينها بكمية كبيرة من كاشف اللمعان الكهربائي كثافة عالية في التلألؤ. كان حد الكشف 3.6 × 10 −17 مول / لتر ، وهو ما يقرب من أكثر الطرق حساسية التي تم الإبلاغ عنها.


تقييم نتائج ميكروأري الحمض النووي مع منصات التعبير الجيني الكمي

لقد قمنا بتقييم خصائص الأداء لثلاث تقنيات للتعبير الجيني الكمي وربطنا قياسات تعبيرها بتلك الخاصة بخمس منصات ميكروأري تجارية ، بناءً على مجموعة بيانات MicroArray Quality Control (MAQC). تم تقييم حدود الاكتشاف ، ونطاق الفحص ، والدقة ، والدقة ، وارتباطات تغيير الطية لـ 997 TaqMan Gene Expression Assays ، و 205 مقايسات RT-PCR المعيارية RT (Sta) و 244 مقايسات QuantiGene. TaqMan هي علامة تجارية مسجلة لشركة Roche Molecular Systems، Inc. لقد لاحظنا وجود ارتباط كبير بين قيم التعبير الجيني الكمي ونتائج منصة ميكروأري ووجدنا القليل من القياسات المتعارضة بين جميع الأنظمة الأساسية. كان السبب الرئيسي للتباين هو الاختلافات في تسلسل المسبار وبالتالي الموقع المستهدف. كان المصدر الثاني للتباين هو الحساسية المحدودة والمتغيرة لمنصات ميكروأري المختلفة للكشف عن الجينات المعبر عنها بشكل ضعيف ، والتي أثرت على التكاثر بين الأنظمة الأساسية وبين المواقع للجينات المعبر عنها تفاضليًا. من هذا التحليل ، نستنتج أن مجموعة بيانات مصفوفة ميكروأري MAQC قد تم التحقق من صحتها من خلال منصات التعبير الجيني الكمي البديلة وبالتالي دعم استخدام منصات ميكروأري للتوصيف الكمي للتعبير الجيني.


تهجين المصفوفات الدقيقة للحمض النووي وتقدير دراسات الطفرات.

تتكون رقائق الحمض النووي من سطح دعم يحمل "نقاط" (8 ، 9). تحتوي كل بقعة على عدد قليل من النيوكليوتيدات من تسلسل متطابق ومعروف ، "مجسات" ، مثبتة نهائيًا على السطح. يتم وضع النقاط في نمط متقلب بحيث يتم تخصيص موقع فريد لكل تسلسل. يتم تهجين كل مسبار بشكل تفضيلي باستخدام ssDNA يحتوي على تسلسل مكمل ، يشار إليه باسم "الهدف". في تجربة نموذجية ، يتم غمر المصفوفة الدقيقة للحمض النووي في محلول يحتوي على خليط من أجزاء ssDNA المسمى تسلسل غير معروف. يتم الإشارة إلى وجود تسلسل معين عن طريق التهجين على البقعة المقابلة كما يتم رصده من خلال ربط قوة إشارة التسمية بموضع البقعة.

يمكن أن تحدث إيجابيات كاذبة لأن كل مسبار يمكن أيضًا أن يتهجين بتسلسل غير متطابق. عندما يتم تصميم ميكروأري DNA للتحقيق في التعبير الجيني ، فمن الممكن تحسين تصميم المسبار لتقليل هذا التأثير (11 ، 12) ومع ذلك ، فإن تنفيذ هذه الاستراتيجية يكون أكثر صعوبة لدراسات الطفرات النقطية. عند دراسة الطفرات النقطية الجسدية ، يزداد الوضع تعقيدًا بسبب وجود فائض من الحمض النووي من النوع البري وغير المتحول. اثنتان من الملاحظات تؤكد هذه النقطة. الملاحظة الأولى هي أن الأورام الصلبة غير متجانسة ، وتحتوي على مزيج من الخلايا اللحمية السرطانية والصحية. تشكل الخلايا السرطانية أقلية ، ويمكن أن تكون نسبة الحمض النووي الطافرة المأخوذة من خزعة الورم المتجانسة صغيرة تصل إلى 15٪ (2). الملاحظة الثانية هي أن جزء الحمض النووي الطافر أصغر بكثير للاختبار غير الجراحي لسرطانات المرحلة المبكرة باستخدام سوائل الجسم مثل البول (5) أو المصل (4) أو البراز (3 ، 6). نظرًا لأن التهجين يتحكم فيه قانون العمل الجماعي ، فإن الزيادة في التسلسل من النوع البري ستساهم عادةً في التهجين على البقع المخصصة للطفرات النقطية. وفقًا لذلك ، قد لا تعكس نسبة شدة البقع المختلفة نسبة تركيزات أنواع الحمض النووي في العينة. ستزداد مساهمة التهجين المختلط مع نسبة الحمض النووي من النوع البري إلى الحمض النووي الطافر ، مما يقلل من فعالية فحص المرحلة المبكرة. توجد حالة مماثلة في تحليل العينات المجمعة لتعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات.

يمكن حل هذه المشكلة عن طريق تحديد مساهمة الحمض النووي من النوع البري في إشارة نقاط الطفرة. كما سنناقش ، يكون هذا ممكنًا عند استيفاء ثلاثة شروط: (أ) يُسمح للتهجين بالوصول إلى التوازن. (ب) تساوي درجة حرارة التهجين المتوازن ، المرتبط بجزء التهجين على الفور بتكوين العينة ، هو من شكل Langmuir ، أي x / (1 - x) = Kc ، حيث x هو جزء من مواقع السطح التي تربط مادة متفاعلة من التركيز ج ، و K هو ثابت التوازن للتفاعل (13). هذا النظام متوقع عندما تكون كثافة سطح المجسات منخفضة بدرجة كافية (14). (ج) تحتوي العينة على فائض من ssDNA كما هو الحال عند استخدام تضخيم PCR غير المتماثل (15 ، 16) أو بعد الهضم بواسطة نوكلياز لامدا (17). في ظل هذه الظروف ، يمكن الحصول على جزء من المجسات المهجنة بشكل صحيح في مكان ما ، مما ينتج عنه أيضًا تركيزات الحمض النووي المتحور والنوع البري في العينة. هناك طريقتان ممكنتان: (أ) مقارنة إشارات نقطتين مع مجسات تتطابق ، على التوالي ، مع التسلسلات من النوع البري والمتواليات الطافرة و (ب) مقارنة إشارات البقعة المقابلة لطفرة الاهتمام عند درجتي حرارة مختلفتين ، [ T.sub.1] و [T.sub.2]. يتطلب النهج الأول قياس إشارة التشبع للنقطتين ، بينما بالنسبة للنهج الثاني ، يمكن إلغاء هذه الخطوة. الأهم من ذلك ، تم الإبلاغ عن الإعداد التجريبي بواسطة Fotin et al. (18) يفي بالشروط الثلاثة المذكورة أعلاه ويسمح بتنفيذ نهج درجتي الحرارة.

يعتمد تحليلنا على حقيقة أن تساوي درجة حرارة التهجين لرقائق الحمض النووي تسمح بنوعين من التهجين التنافسي (14). يحدث التهجين السطحي التنافسي عندما يمكن تهجين هدفين مختلفين باستخدام نفس المسبار ، بينما يحدث التهجين الجماعي التنافسي عندما يمكن للهدف التهجين مع تسلسل تكميلي في الحجم. تكون العملية الثانية هي السائدة عندما يتم إنتاج العينات عن طريق تضخيم PCR المتماثل. عند استخدام PCR غير المتماثل (15 ، 16) ، تحتوي العينة على فائض من ssDNA ولا تواجه تأثير التهجين بالجملة التنافسي. يمكن أيضًا الحصول على هذه الحالة عن طريق هضم ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتماثل مع نوكلياز لامدا (17). في ظل هذه الظروف ، يهيمن فائض ssDNA على التهجين باستخدام المجسات ، ويصبح التهجين السطحي التنافسي المصدر الرئيسي للخطأ. في الحالة العامة ، يعكس تساوي درجة حرارة التهجين العقوبة الكهروستاتيكية المتكبدة لأن كل حدث تهجين يزيد من شحنة طبقة المسبار (14 ، 19). سنركز على الأنظمة التي يتم فيها فحص هذه التفاعلات ويفترض تساوي درجة حرارة التهجين شكل Langmuir (13) ، مما يسهل التحليل الكمي للبيانات. استخدام تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل يجعل التركيزات المطلقة لأنواع الحمض النووي لا معنى لها. وبالتالي ، فإن تحليلنا يهتم بنسبة [c.sub.m] / [c.sub.w] للتركيزات الزائدة للطفرة ([c.sub.m]) والنوع البري ([c.sub.w] ]) أشكال ssDNA.

تركز مناقشتنا على الموقف بعد التضخيم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل (الشكل 1) وتتعلق بنقطتين: بقعة طفرة تحمل مجسات m وبقعة من النوع البري تحمل مجسات. يحتوي محلول العينة على جزء ssDNA من النوع البري w وجزء متحور m بالإضافة إلى شظاياها التكميلية ، w 'و m'. ومع ذلك ، فإن عدد شظايا w و m أكبر. نحن نفترض أن جميع أجزاء w 'و m' الحرة تتهجين مع أجزاء w و m ssDNA التكميلية المجانية. يركز تحليلنا على الزيادة في شظايا m و w غير المهجنة ، والتي يُشار إلى تركيزاتها بواسطة [c.sub.m] و [c.sub.w] ، على التوالي. نحن نعتبر حد البقعة الصغيرة ، حيث يكون للتهجين في الموقع تأثير ضئيل على التركيزات السائبة. في هذا الحد ، لا تؤثر أزواج الحمض النووي المزدوج الشريطة (dsDNA) ww و mm 'في السائبة على توازن التهجين في الموقع. بعبارة أخرى ، ترتبط درجة حرارة التهجين [c.sub.m] و [c.sub.w] بإشارة التهجين المقاسة من بقعة. الأهداف في الواقع أكبر بكثير من المسابير. في دراسات K-ras التي نستشهد بها ، يتكون الهدف من 117 (10) إلى 157 (6) مونومر (نيوكليوتيدات) ، بينما تحتوي المجسات على 13-14 مونومر. كما سنناقش ، فإن "عدم تناسق الحجم" هذا يؤثر في الغالب على حدود نظام لانجموير. إن تأثيره على متساوي درجة حرارة التهجين للبقع ذات الكثافة العالية للمسبار خارج نطاق هذا التقرير. في القسم التالي ، نقدم الخلفية اللازمة حول تساوي درجة حرارة التهجين عندما يكون التهجين السطحي التنافسي هو السائد. يناقش القسمان التاليان نهجي البقعتين ودرجتين درجة الحرارة ، على التوالي ، لتحديد [c.sub.m] / [c.sub.w]. يتم عرض الاعتبارات التجريبية والعلاقة بالدراسات التجريبية الحالية والأسئلة المفتوحة في المناقشة.

ترتبط درجة حرارة التهجين بجزء التوازن للمسبارات المهجنة على الفور بتكوين العينة (14). يمكن اشتقاق بسيط من هذا متساوي الحرارة عند معادلة معدلات التهجين والتمسخ على سطح البقعة (13). في المناقشة التالية ، نعتبر متساوي الحرارة الذي تم الحصول عليه عندما يكون التهجين السطحي التنافسي مهمًا. على وجه الخصوص ، يمكن تهجين كل من التسلسل من النوع البري ، w ، والمتغير ، m ، في بقعة m المتغيرة. ضع في اعتبارك بقعة تحمل إجمالي مجسات [n.sub.T] m 'في عينة تحتوي على أهداف غير مهجنة m و w من التركيزات [c.sub.m] و [c.sub.w] mol / L ، على التوالي. يعكس التهجين الكلي كلاً من تهجين الأهداف المتطابقة تمامًا والأهداف غير المتطابقة. يُشار إلى كسور مجسات m'm و m'w المهجنة ، على التوالي ، بواسطة x و y. معدل تمسخ طبيعة مجسات m'w غير المتطابقة هو [k.sub.dm] y [n.sub.T] ، في حين أن معدل تهجين مجسات m مع أهداف w هو [k.sub.hm] [c. sub.w] (1 - x - y) [n.sub.T] ، حيث [k.sub.dm] و [k.sub.hm] هي ثوابت المعدل المقابلة. عندما يتم فحص التفاعلات الكهروستاتيكية داخل الطبقة بقوة ، لا تعتمد ثوابت المعدل على كثافة المسبار وكسر المسابير المهجنة. عند التوازن ، يكون المعدلان متساويين ، أي [k.sub.dm] y [n.sub.T] = [k.sub.hm] [c.sub.w] (1 - x - y) [n .sub.T] ، مما يؤدي إلى:

[التعبير الرياضي غير قابل للاستنساخ في ASCII] (1)

حيث [k.sub.hm] / [k.sub.dm] = [K.sub.m'w] هو ثابت التوازن (20). وبالمثل ، فإن المعدلين لتحقيقات m'm المتطابقة تمامًا هما [k.sub.dp] x [n.sub.T] و [k.sub.hp] [c.sub.m] (1 - x - y ) [n.sub.T]. مساواتهم في التوازن ، [k.sub.dp] x [n.sub.T] = [k.sub.hp] [c.sub.m] (1 - x - y) [n.sub.T] ، يؤدي إلي:

[التعبير الرياضي غير قابل للاستنساخ في ASCII] (2)

هنا ، [K.sub.m'w] و Km'm ، على التوالي ، هما ثوابت التوازن للتهجين بين أهداف m 'و w و m [DELTA] [G.sup.0.sub.m'w] و [DELTA] [G.sup.0.sub.m'm] هي المواصفة القياسية المقابلة لطاقات جيبس ​​الحرة T هي درجة الحرارة المطلقة و R هي ثابت الغاز. يسترد هذا الاشتقاق الحركي نتائج تحليل ديناميكي حراري صارم (14) مع تحذير واحد: يجب استبدال التركيزات المولية بأنشطة بلا أبعاد ، [a.sub.i] = [غاما] [c.sub.i] ، حيث [جاما ] هو معامل النشاط (20). نظرًا لأن [gamma] تقترب من 1 مع اقتراب [c.sub.i] من الصفر ، فسوف نحتفظ بالتعبيرات المستخدمة أعلاه ، مع ملاحظة أن [c.sub.i] بلا أبعاد ، ولها القيمة العددية للتركيزات المولية للأنواع i . متساوي الحرارة (المعادلات 1 و 2) ليست مفيدة لأن تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لعينة معينة لا يسمح بتسميات مختلفة للأهداف m و w. نظرًا لأن كلاهما تم وصفهما بشكل متماثل ، فإن القياس ينتج عنه جزء التهجين الكلي [ثيتا] = س + ص بدلاً من س وص بشكل منفصل. وفقًا لذلك ، فإن متساوي الحرارة المرصود للبقعة m هو:

[[OMEGA] .sub.m '] - [[ثيتا] .sub.m'] / 1 - [[ثيتا] .sub.m '] = [K.sub.m'm] [c.sub.m ] + [K.sub.m'w] [c.sub.w] (3)

كما تم الحصول عليها بجمع المعادلات. 1 و 2. جزء المجسات المختلطة على البقعة m هو:

[التعبير الرياضي غير قابل للاستنساخ في ASCII] (4)

هنا وفي ما يلي ، الرمز i = m '، w' لـ [[OMEGA] .sub.i] ، Pi ، وما إلى ذلك يحدد البقعة. [P.sub.m '] = 1/2 عندما [c.sub.w] = [c.sub.m] [K.sub.m'm] / [K.sub.m'w] و [P .sub.m '] & gt & gt 1/2 لـ [c.sub.w] & gt [c.sub.m] [K.sub.m'm] / [K.sub.m'w]. في حالة الاهتمام ، عندما يكون [c.sub.w] & gt & gt [c.sub.m] ، يكون [P.sub.m '] الخاص بالنقطة m كبيرة ، بينما [P.sub.w'] من w 'بقعة:

[التعبير الرياضي غير قابل للاستنساخ في ASCII] (5)

دائما صغيرة. تؤكد قيم [P.sub.m '] (الشكل 2) لحالة نموذجية (الجدول 1) أن التهجين السطحي التنافسي مهم فقط عندما تكون الأنواع المتنافسة موجودة في فائض كبير. كما لوحظ سابقًا ، هذا هو الحال في دراسات طفرات النقطة الجسدية عندما يكون ssDNA من النوع البري مكونًا رئيسيًا. ثم يساهم ssDNA من النوع البري في التهجين في جميع مواقع الطفرات. على النقيض من ذلك ، فإن تركيزات أنواع مختلفة من ssDNA الطافرة أصغر بكثير. نتيجة لذلك ، فإن مساهماتهم في التهجين على البقعة وعلى نقاط الطفرات الأخرى لا تكاد تذكر. تبرر هذه الملاحظة قصر التحليل على المنافسة بين نوعين ، m و w.

عندما يكون التهجين التنافسي ضئيلًا ، فإن المعادلة. 3 يقلل إلى [[OMEGA] .sub.m '] = [K.sub.m'm] [c.sub.m] ، ومتساوي الحرارة المقابل للنوع البري هو [[OMEGA] .sub.w'] = [K.sub.w'w] [c.sub.w]. في مثل هذه الحالات ، يمكن تحديد [c.sub.m] / [c.sub.w] من:

[[OMEGA] .sub.m '] / [[OMEGA] .sub.w'] = [K.sub.m'm] / [K.sub.w'w] [c.sub.m] / [ c.sub.w] (6)

يمكن تحقيق هذا الموقف في دراسات التعبير الجيني بتصميم مسبار مناسب وفي حالة عدم وجود فائض ساحق من نوع واحد مستهدف. لاحظ أنه يمكن ضبط [ثيتا] بقعة الطفرة لتكون منخفضة ، [ثيتا] & lt & lt 1 ، عن طريق ضبط درجة حرارة التهجين. في مثل هذه الأنظمة ، يمكن للمرء أن يستدعي تقريب "نقطة الضعف":

[[OMEGA] .sub.i] [يساوي تقريبًا] [[ثيتا]. sub.i] (7)

كما سنناقش ، عند الاقتضاء ، هذا يبسط تحليل تجارب درجتي الحرارة. أخيرًا ، في معظم الحالات ، تكون إشارة النقطة i عند التوازن ، [I.sub.i] ، متناسبة مع [[theta] .sub.i] [n.sub.T] و:

[[ثيتا] .sub.i] = [I.sub.i] / [I.sup.max.sub.i] (8)

حيث [I.sup.max.sub.i] هي الإشارة المشبعة للبقعة i كما تم الحصول عليها عند الموازنة بمحلول مركز للهدف المتطابق تمامًا. من المهم ملاحظة أن [I.sup.max.sub.i] يمكن أن يعتمد على درجة الحرارة.

يتم استخدام درجات حرارة انصهار dsDNA كمعايير تصميم للتحقيقات (6 ، 12). لذلك من المفيد ملاحظة أن التهجين السطحي التنافسي يؤثر على درجة حرارة الانصهار الفعالة ، [T.sub.M] ، والتي يتم تحديدها من خلال الحالة [ثيتا] = 1/2 أو [[OMEGA] .sub.i] = 1. بشكل عام ، يعتمد [T.sub.M] على كل من [c.sub.m] و [c.sub.w] أي [T.sub.M] = [T.sub.M] ([c.sub .m] ، [c.sub.w]). لاحظ أن هناك هدفين يمكن تهجينهما باستخدام نفس المسبار. يختلف هذا الموقف ، الذي يشمل ثلاثة أنواع من الحمض النووي الريبي (ssDNA) ونوعين مختلفين من dsDNA ، عن ذلك الذي تم استدعاؤه في تعريف درجة حرارة انصهار dsDNA. في هذه الحالة الأخيرة ، يتم تهجين نوعين من أنواع ssDNA التكميلية لتشكيل نوع واحد من dsDNA ، والعدد الإجمالي للأنواع هو ثلاثة بدلاً من خمسة. علاوة على ذلك ، نحن نفكر في حد البقعة الصغيرة ، حيث يكون للتهجين مع المجسات تأثير ضئيل على التركيبة السائبة. في غياب التهجين السطحي التنافسي ، يقلل [T.sub.M] إلى أشكاله المألوفة: بالنسبة إلى [c.sub.w] = 0 ، يؤدي هذا إلى [T.sub.m'm] ([c.sub. m]) = [DELTA] [H.sup.0.sub.m'm] / ([DELTA] [S.sup.0.sub.m'm] + R ln [c.sub.m]) ، بينما بالنسبة إلى [c.sub.m] = 0 ، فإنها تؤدي إلى [T.sub.m'w] ([c.sub.w]) = [DELTA] [H.sup.0.sub.m'w] /((DELTA][S.sup.0.sub.m'w] + R ln [c.sub.w]). ليس من الممكن الحصول على تعبير تحليلي صريح لـ [T.sub.M] ([c.sub.m] ، [c.sub.w]) ، ولكن في نظام الفائدة ، [c.sub.m] /[c.sub.w] & lt & lt 1 ، يتم تقريب درجة حرارة الانصهار جيدًا بواسطة المصطلحين الأولين لتوسع تايلور في [c.sub.m] حول [c.sub.m] = 0 ، أي ،

[التعبير الرياضي غير قابل للاستنساخ في ASCII]

وبالتالي تحديد درجة حرارة الانصهار في بقعة الطفرة:

[التعبير الرياضي غير قابل للاستنساخ في ASCII] (9)

الأهم من ذلك ، في هذا النظام ، أن [T.sub.M] يزيد بشكل حاد مع [c.sub.m] (الشكل 3) ، وقيمته الأولية ، لـ [c.sub.m] = 0 ، هي [T.sub.m] .m'w] بدلاً من [T.sub.m'm]. في تمييز ملحوظ ، بالنسبة إلى [c.sub.m] / [c.sub.w] = 1 ، يكون تأثير التهجين السطحي التنافسي ضئيلًا ، و [T.sub.M] [يساوي تقريبًا] [T.sub .m'm] ([c.sub.m]) مع اعتماد لوغاريتمي ضعيف على [c.sub.m].

عندما تكون كثافة المسبار عالية نسبيًا ويكون تركيز الملح منخفضًا بدرجة كافية ، فمن الضروري السماح بالعقوبة الكهروستاتيكية المتكبدة على التهجين بسبب الشحنة الإضافية المودعة في طبقة المسبار. في هذا النظام ، تأخذ متساوي درجة حرارة التهجين شكلاً مختلفًا يتمثل في:

[التعبير الرياضي غير قابل للاستنساخ في ASCII] (10)

في حالة المجسات والأهداف ذات الطول المتساوي والقصير ، [[GAMMA] .sub.m '] = ثابت x [[sigma] .sub.m'] حيث [[sigma] .sub.m '] هي الشحنة كثافة بقعة m غير المهجنة والثابت يتم ضبطها بواسطة القوة الأيونية وطول المسبار (14). فيما يلي ، نعتبر الحد المعاكس ، عندما يتم فحص تفاعلات الكهرباء الساكنة ولا تتفاعل السلاسل. يتم بعد ذلك وصف التهجين بواسطة متساوي حرارة لانجموير بسيط ، أي حالة [[GAMMA]. sub.i] [تساوي تقريبًا] 0. الأهم من ذلك ، في دراسات الطفرات النقطية ، تكون الأهداف عادةً أطول من المجسات. عادة ، يقع موقع التهجين تقريبًا في منتصف الهدف. وفقًا لذلك ، يشتمل المسبار المهجن على قسمين مستهدفين غير مهجنين بطول مماثل. مدى هذه المقاطع هو [R.sub.0] [يساوي تقريبًا] [(nal). sup.1 / 2] ، حيث n هو عدد القواعد في القسم ، و a هو الحجم الأساسي ، و l هو طول المثابرة. القيم النموذجية هي [تساوي تقريبًا] 0.6 نانومتر و l [تساوي تقريبًا] 0.75 نانومتر (21). يحدث نظام Langmuir عندما تتجاوز مساحة كل مسبار ، [SIGMA] ، [R.sup.2.sub.0] ، مما يضمن عدم تفاعل المسابير المهجنة. بالنسبة لأزواج المجسات المستهدفة التي تم النظر فيها ، يتم استيفاء هذا الشرط عند [SIGMA] [يساوي تقريبًا] 65 ن [m.sup.2] أو أقل من 1.5 × [10. sup.4] تحقيقات مطعمة لكل [ميكرو] [م .sup.2]. تسمح لنا العملية في هذا النطاق بالاستفادة من غياب السلوك غير الخطي المقدم من المصطلح exp [- [[GAMMA] .sub.m '] (1 + [[ثيتا] .sub.m'])].

لا يمكن تطبيق متساوي التهجين إلا عند التوازن. وهذا بدوره يعني شرطين: إشارة ثابتة واستقلالية المسار ، أي استقلالية طريقة التحضير وتاريخ العينة. تختلف الأوقات المبلغ عنها المطلوبة للحصول على إشارة ثابتة بين دقيقة (18) و 14 ساعة (22 ، 23). الأهم من ذلك ، قد يعتمد وقت الموازنة على كثافة المسبار وظروف التهجين والتوازن [[ثيتا]. sub.i] وعوامل أخرى. يتطلب استقلالية المسار ألا تتغير الإشارة المقاسة عند التوازن مع التاريخ الحراري (دورات التدفئة والتبريد). كما ذكرنا سابقًا ، يتم استيفاء هذه الشروط بواسطة نظام Fotin et al. (18). في ظل ظروف التوازن الديناميكي الحراري ، فإن الطرق الكمية للتحليل التي نصفها أدناه قابلة للتطبيق. ومع ذلك ، تتطلب هذه الأساليب معرفة [[ثيتا]. sub.i] و [[أوميغا]. sub.i]. بالمقابل ، للحصول على [[ثيتا] .sub.i] و [[OMEGA] .sub.i] ، من الضروري التأكد من قيمة تشبع إشارة i spot ، [I.sup.max.sub. i] ، أو ما يعادله ، [n.sub.T] من i البقعة.

يتطلب التنفيذ العددي للتحليل الذي نصفه معرفة ثوابت التوازن [K.sub.m'm] و [K.sub.m'w] بالإضافة إلى [K.sub.w'm] و [K.sub. w'w]. يمكن الحصول عليها بشكل أفضل تجريبيًا من تساوي درجة حرارة التهجين في بقعة ملامسة لعينات مكونة واحدة. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يستغرق وقتًا طويلاً عندما تكون هناك حاجة إلى العديد من ثوابت التوازن. Fortunately, in the Langmuir regime, it is reasonable to approximate the equilibrium constants by their bulk values. The nearest-neighbor model, with the unified set of parameters compiled by Santa Lucia's group (24-26), allows calculation of [DELTA][H.sup.0] and [DELTA][S.sup.0] for the hybridization of perfectly matched oligonucleotide pairs as well as for pairs containing a single mismatch. In the numerical calculations, we use probe-target pairs incorporating the 12th and 13th K-ras codons. The [DELTA][H.sup.0] and [DELTA][S.sup.0] values are obtained by use of HYTHERTM software implementing the nearest-neighbor approach (27). The identity of the probes and targets considered in the numerical calculations as well as the corresponding standard enthalpies and entropies are listed in Table 1, which also lists the free energies of formation and the equilibrium constants of hybridization at 37[degrees]C. The hybridization temperatures considered were chosen in view of the conditions in the cited experiments. Fotin et al. (18) studied hybridization at the temperature range of -20 to 60[degrees]C. In the K-ras studies, the hybridization temperatures were 37 (6) and 50[degrees]C (10). The [c.sub.m] values in the numerical examples vary around 3 x [10.sup.-10] mol/L, whereas the concentration of the control target [c.sub.w] is [10.sup.-2]- to [10.sup.-3]-fold larger (6).

When two spots carrying, respectively, wild-type (w') and mutation (m') probes are placed in contact with a solution of w and m targets, the corresponding isotherms are:

[[OMEGA].sub.w'] = [c.sub.w][K.sub.w'w] + [c.sub.m][K.sub.w'm] (11)

[[OMEGA].sub.m'] = [c.sub.w][K.sub.m'w] + [c.sub.m][K.sub.m'm] (12)

where [[OMEGA].sub.i] = [[theta].sub.i]/(1 - [[theta].sub.i]) of spot i = w', m' and [[theta].sub.i] is the corresponding fraction of hybridized probes, irrespective of their identity (mismatched or perfectly matched). These two equations immediately determine [c.sub.w] and [c.sub.m]:

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII] (13)

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII] (14)

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII] (15)

where, in the regime considered, [alpha] = [[OMEGA].sub.w']/[[OMEGA].sub.m'] >> 1. The range of [alpha] values varies between [[alpha].sub.max] = [K.sub.w'w]/[K.sub.m'w] >> 1, corresponding to [c.sub.m] = 0 and [[alpha].sub.min] = [K.sub.w'm]/[K.sub.m'm] << 1 when [c.sub.w] = 0. In the realistic limit of [K.sub.m'w] << [K.sub.w'w], this expression reduces to [c.sub.m]/[c.sub.w] [[approximately equal to] [K.sub.w'w]/[alpha][K.sub.m'm], that is:

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII] (16)

where [I.sub.m'] and [I.sub.w'] are the measured intensities of the m' and w' spots, whereas [I.sup.max.sub.m'] and [I.sup.max.sub.w'] are the corresponding saturation values. Thus, the implementation of this approach requires knowledge of [n.sub.T], or equivalently [I.sub.max], for the two spots. In the general case it is necessary to know four equilibrium constants, whereas in the simplest case, of [alpha][K.sub.m'w] << [K.sub.w'w], knowledge of [K.sub.m'm] and [K.sub.w'w] is sufficient.

The two-spot approach is feasible when the values of [[theta].sub.m'] and [[theta].sub.w'] for different sets of [c.sub.m] and [c.sub.w] are distinguishable. In practical terms, this imposes two requirements: (a) it is necessary to avoid the saturation regimes of the melting curve (Fig. 4) and the hybridization isotherm (Fig. 5) and (b), the [[theta].sub.i] values corresponding to the sample composition must be large enough in comparison with the experimental errors. One may optimize the performance by tuning the hybridization temperature T: Increasing T lowers the extent of hybridization, thus preventing saturation at the price of weaker [[theta].sub.i] and a higher noise-to-signal ratio.

The operational conditions are thus determined by two inputs: the typical [c.sub.w] of the amplicon and the desired range of [c.sub.m]/[c.sub.w]. Once these two variables are specified, it is possible to calculate the relevant melting curves and hybridization isotherms to choose the hybridization temperature. As noted before (Eq. 15), [c.sub.m]/[c.sub.w] is extracted from [alpha] = [[OMEGA].sub.w']/[[OMEGA].sub.m']. The temperature dependence of [alpha] is relatively weak (Fig. 6). The accessible range of [alpha], however, depends on the detection limit of [[theta].sub.m'], which sets a lower bound of [[theta].sub.m'],[[theta].sub.m'] (min). Because [[OMEGA].sub.w'] is [less than or equal to]1, the maximum range of [alpha] is roughly 1/[[theta].sub.m'](min).

The Two-Temperature Approach

An alternative approach involves equilibration of the DNA chip with the biological sample at two different temperatures, [T.sub.1] and [T.sub.2]. Focusing on the m' spot, we have:

[[theta].sub.m']([T.sub.1]) = [c.sub.w][K.sub.m'w]([T.sub.1]) = [c.sub.m][K.sub.m'm]([T.sub.1]) (17)

[[theta].sub.m']([T.sub.2]) = [c.sub.w][K.sub.m'w]([T.sub.2]) = [c.sub.m][K.sub.m'm]([T.sub.2]) (18)

Solving Eqs. 17 and 18 leads to:

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII] (19)

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII] (20)

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII] (21)

To simplify this equation, it is convenient to express

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII]

where [T.sub.2] = [T.sub.1] + [DELTA]T. On defining [lambda] = [[theta].sub.m']([T.sub.2])/[[theta].sub.m']([T.sub.1]), we obtain [c.sub.m]/[c.sub.w] in the form:

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII] (22)

Eq. 22 can be simplified further when [DELTA]T/[T.sub.1] << 1, thus allowing approximation of

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII]

[MATHEMATICAL EXPRESSION NOT REPRODUCIBLE IN ASCII]

and the saturation signals cancel when [I.sup.max.sub.m'](T) is independent of T. When [I.sup.max.sub.m'](T) does vary with T, it is possible to eliminate this contribution by use of an appropriate calibration method (18). Hence, measurement of the saturation values can be eliminated in the weak spot regime. This is of interest when the measurement technique allows study of the [[theta].sub.i] << 1 range.

As we discussed, optimization of the two-spot approach is achieved by tuning a single hybridization temperature. In the two-temperature approach, it is attained by choosing [T.sub.1] and [DELTA]T = [T.sub.2] - [T.sub.1]. The general requirements are the same: avoiding the saturation regimes on one hand and the high noise-to-signal ratios on the other. Two additional observations merit comments: (a) increasing [DELTA]T magnifies the range of [lambda] corresponding to the [c.sub.m]/[c.sub.w] range of interest (Fig. 7) and (b) it also allows one to avoid the divergence regions in the [c.sub.m]/[c.sub.w] vs [lambda] curves (Fig. 8) where ultraprecise values of [lambda] are required.

Studies of somatic point mutations inevitably concern samples with a large excess of wild-type DNA. This excess is propagated by the PCR amplification unless peptide nucleic acid (PNA) clamps (28) are used. The use of DNA chips to characterize the composition of such samples is hampered by competitive surface hybridization attributable to the pairing of the wild-type target with the mutation probe. This mishybridization contributes significantly to the intensity of the mutation spot signal and thus gives rise to false positives. Our theoretical analysis suggests a systematic approach to the minimization of such errors. At best one can extract [c.sub.m]/[c.sub.w], thus obtaining additional clinical data. At least, this method provides a rational approach for devising criteria for identification of false positives.

DNA chips designed to detect point mutation in solid tumors were developed by Lopez-Crapez et al. (10). The sample preparation in this case involves asymmetric PCR or symmetric PCR followed by digestion with lambda exonuclease. DNA chips of higher sensitivity for the detection of K-ras mutations in stool were reported recently by Prix et al. (6). The amplification method uses PNA-mediated PCR clamping (28). The PNA binds to the wild-type codons of interest, thus inhibiting their amplification. The PNA binding to the mutated DNA is weaker and does not inhibit its amplification. The overall result is a selective amplification of the mutated DNA. The methods we propose can be used to improve the performance of the approach of Lopez-Crapez et al. (10). In this case, the [c.sub.m]/[c.sub.w] values may provide supplementary information of diagnostic value. In marked contrast, our methods are of little use within the approach of Prix et al. (6), which relies on preferential amplification of the mutated DNA thus avoiding problems attributable to excess of wild-type DNA.

Our analysis suggested two methods to obtain [c.sub.m]/[c.sub.w]. The advantage of the two-spot approach is that it does not involve a change in T. This approach, however, requires knowledge of the saturation value of the two spots. Obtaining the saturation values can be time-consuming, but for chips designed for multiple use, this step need be performed only once provided the saturation value does not change with the hybridization regeneration cycles. The two-temperature approach is attractive when a label-free detection scheme such as surface plasmon resonance is used. In this case, the two measurements can be carried out with no washing steps. Importantly, Fotin et al. (18) demonstrated the feasibility of studying the temperature dependence of hybridization isotherms even for targets labeled with fluorescent tags.

Thermodynamic equilibrium is a necessary condition for implementation of the quantification methods proposed in this report. The equilibration times of DNA chips and their variation with the hybridization conditions are not yet fully understood. The reported equilibration times for hybridization on DNA chips vary widely. In comparing the results, it is important to note differences in hybridization conditions, length of probes, type of chip, and detection techniques. Two studies are of special interest. Peterson and coworkers (22, 23) reported equilibration times of up to 14 h. In marked contrast, the results of Fotin et al. (18) suggest equilibration within minutes. In the present context, the work of Fotin et al. (18) is of special interest because it reports equilibrium hybridization isotherms at different temperatures. Importantly, the isotherms indeed satisfy the conditions of equilibrium: stationary state and lack of hysteresis. Furthermore, the system exhibits a Langmuir-type hybridization isotherm, and the thermodynamic parameters extracted from the temperature dependence of the hybridization isotherms are in good agreement with the reported bulk values. Note, however, that the hybridization constants describing other types of DNA chips do not always exhibit such agreement (29, 30).

The proposed methods require DNA chips that obey Langmuir-type hybridization isotherms. In turn, this requires spots with a relatively low probe density. Clearly, there are advantages to chips carrying spots with a high probe density. One is that high density enables smaller spots, thus allowing for greater number of different spots. Importantly, in DNA microarrays, high probe density gives rise to an electrostatic modification of the isotherms. The resulting nonlinearities are undesirable for obtaining quantitative results.

We benefited from insightful discussions with T. Livache. The work of E.B.Z. was funded by the Centre National de la Recherche Scientifique with additional support from the Russian Fund Fundamental Research (RFBR 02-0333127).

Received May 13, 2004 accepted August 24, 2004.

Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2004.037226

(1.) Lodish H, Berk A, Zipursky L, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. Molecular cell biology, 4th ed. New York: WH Freeman, 2000: 1084pp.

(2.) Kirk BW, Feinsod M, Favis R, Kliman RM, Barany F. Single nucleotide polymorphism seeking long term association with complex disease. Nucleic Acids Res 200230:3295-311.

(3.) Sidransky D, Tokino T, Hamilton SR, Kinzler KW, Levin B, Frost P, et al. Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors. Science 1992256:102-05.

(4.) Hibi K, Robinson CR, Booker S, Wu L, Hamilton SR, Sidransky D, et al. Molecular detection of genetic alternations in the serum of colorectal cancer patients. Cancer Res 199858:1405-7.

(5.) Sanchez-Carbayo M. Use of high-throughput DNA microarrays to identify biomarkers for bladder cancer. Clin Chem 200349:23-31.

(6.) Prix L, Uciechowski P, Bockmann B, Giesing M, Schuetz AJ. Diagnostic biochip array for fast and sensitive detection of K-ras mutations in stool. Clin Chem 200248:428-35.

(7.) Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, et al. Molecular classification of cancer: class discovery and prediction by gene expression monitoring. Science 1999286: 531-7.

(8.) Graves DJ. Powerful tools for genetic analysis come of age. Trends Biotechnol 199917:127-34.

(9.) Wang J. From DNA biosensors to gene chips. Nucleic Acids Res 200028:3011-6.

(10.) Lopez-Crapez E, Livache T, Marchand J, Grenier J. K-ras mutation detection by hybridization to a polypyrrole DNA chip. Clin Chem 200147:186-94.

(11.) Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, et al. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol 199614:1675-80.

(12.) Li F, Stormo GD. Selection of optimal DNA oligos for gene expression arrays. Bioinformatics 200117:1067-76.

(13.) Adamson AW. Physical chemistry of surfaces, 4th ed. New York: J Wiley, 1982:664pp.

(14.) Halperin A, Buhot A, Zhulina EB. Sensitivity, specificity and the hybridization isotherms of DNA chips. Biophys J 200486:718-30.

(15.) Gyllensten UB, Erlich HA. Generation of single stranded DNA by the polymerase chain reaction and its application to the direct sequencing of the HLA-DQA locus. Proc Natl Acad Sci U S A 198885:7652-6.

(16.) Gao HF, Tao SC, Wang D, Zhang C, Ma XM, Cheng J, et al. Comparison of different methods for preparing single stranded DNA for oligonucleotide microarray. Anal Lett 200336:2849-63.

(17.) Higuchi RG, Ochman H. Production of single stranded DNA templates by exonuclease digestion following the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res 198917:58-65.

(18.) Fotin AV, Drobeyshev AL, Proudnikov DY, Perov AN, Mirzabekov AD. Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchip. Nucleic Acids Res 199826:1515-21.

(19.) Vainrub A, Pettitt MB. Coulomb blockage of hybridization in two-dimensional DNA arrays. Phys Rev E 200266:041905.

(20.) Moore WJ. Physical chemistry. London: Longman, 1972:997pp.

(21.) Smith SB, Cui Y, Bustamante C. Overstretching B-DNA: the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science 1996271:795-9.

(22.) Peterson AW, Heaton, RJ, Georgiadis RM. The effect of surface probe density on DNA hybridization. Nucleic Acids Res 200129: 5163-8.

(23.) Peterson AW, Wolf LK, Georgiadis RM. Hybridization of mismatched or partially matched DNA at surfaces. J Am Chem Soc 2002124:14601-7.

(24.) SantaLucia J Jr. A unified view of polymer, dumbbell and oligonucleotide DNA nearest neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci U S A 199895:1460-5.

(25.) Peyret N, Senerviratne PA, Allawi HT, SantaLucia J Jr. Nearest-neighbor thermodynamics and NMR of DNA sequences with internal A-A, C-C, G-G and T-T mismatches. Biochemistry 1999 38:3468-77.

(26.) Bommarito S, Peyret N, SantaLucia J Jr. Thermodynamic parameters for DNA sequences with dangling ends. Nucleic Acids Res 200028:1929-34.

(27.) Peyret N, SantaLucia J Jr. HYTHERTM version 1.0. http://ozone2.chem.wayne.edu/Hyther/hytherm1main.html (accessed April 2004).

(28.) Thiede C, Bayerdorffer E, Blasczyk R, Wittig B, Neubauer A. Simple and sensitive detection of mutations in ras proto-oncogenes using PNA-mediated clamping. Nucleic Acids Res 200124:983-4.

(29.) Held GA, Grinstein G, Tu Y. Modeling of DNA microarray data by using physical properties of hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 2003100:7575-80.

(30.) Zhang L, Miles MF, Aldape, KD. A model of molecular interactions on short oligonucleotide microarrays. Nat Biotechnol 200321: 818-21.

Avraham Halperin, [1] * Arnaud Buhot, [1] and Ekaterina B. Zhulina [2]

[1] Unite Mixte de Recherche (UMR) 5819 [Universite Joseph Fourier (UJF), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Commissariat a l'Energie Atomique (CEA)], DRFMC/SI3M, CEA Grenoble, Grenoble, France.

[2] Institute of Macromolecular Compounds of the Russian Academy of Sciences, Bolshoy, Russia.

* Address correspondence to this author at: UMR 5819 (UJF, CNRS, CEA), DRFMC/SI3M, CEA Grenoble, 17 rue des Martyrs, 38054, Grenoble cedex 9, France. Fax 33-4-3878-5691 e-mail [email protected]

[3] Nonstandard abbreviations: ssDNA, single-stranded DNA dsDNA, double-stranded DNA and PNA, peptide nucleic acid.


الاستنتاجات

Despite successful studies of reproducibility [27] and specificity [97], microarrays have been often subject of criticism as a method which fails to identify relevant information that can be transferred directly into clinical applications [98]. The main reason is that statistical significance often differs from biological relevance due to a very limited number of samples or to the influence of other factors, such as cellular heterogeneity or variability of the morphological features, which are difficult to separate from the studied features. This highlights the importance of experimental design which utilizes an adequate number of samples and biological replicates to answer questions defined in the project.

In this article we describe the experimental protocol used for Affymetrix microarrays and important factors that may influence its outcomes, summarized in Fig.  5 . The entire procedure has been subject of many changes since the first Affymetrix microarrays were released, mainly involving different sets of reagents which allow obtaining a higher yield of reactions with shorter incubation times. The most important changes include the transition from one-step to two-step cDNA synthesis in 2004, and the addition of whole transcript (WT) microarrays in 2009, which utilize different sets of reagents produced by Ambion. Apart from the differences in cDNA synthesis, which as described in step two of the experimental protocol, is based on random primers instead of oligo-dT, significant modification was also made to the labeling process of WT microarrays., The labeling takes place after cDNA fragmentation and uses terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) that adds labeled nucleotides only at the 3′-end of the cRNA. Despite similar methods of oligonucleotide probe design, changes in the experimental procedure might explain the differences in transcript level estimates obtained using various platforms, and their modifications with time might be a source of the inconsistencies observed among experiments conducted by different laboratories and even in the same laboratory, when separated by long periods of time.

Individual steps of a microarray experiment. Right panel describes factors that may affect experimental outcomes, left panel typical methods that are used to validate each of the processing steps

The capabilities of microarray studies are limited, since the measurement of transcript levels provides only a rough estimate of the intracellular conditions at a specific time point, and is affected by a plethora of experiment-specific factors. The process of discovery of new drugs, using expression or genotyping microarrays, is therefore uneven in pace and in some cases might be even misleading. However, microarrays can be successfully used to validate the effects of existing drugs by helping to identify their targets and off-target effects [99]. Microarrays are becoming less popular due to the decreasing costs of the RNA-seq methods [100], although one has to remember that some of the steps used in the microarray procedure, with their drawbacks and limitations, are also utilized in other techniques including the RNA-seq approaches [101�]. Despite the evolution of experimental procedures, the fundamental principles behind microarray experiments remain similar and their understanding is also an essential step towards appropriate interpretation of the data provided by more advanced but related methods.


Spotted DNA arrays (“cDNA arrays”)

  • Chips are prepared by using cDNA.
  • Called cDNA chips or cDNA microarray or probe DNA.
  • The cDNAs are amplified by using PCR.
  • Then these immobilized on a solid support made up of nylon filtre of glass slide (1 x 3 inches). The probe DNA are loaded into a a spotting spin by capillary action.
  • Small volume of this DNA preparation is spotted on solid surface making physical contact between these two.
  • DNA is delivered mechanically or in a robotic manner.

Jaenisch, R. & Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. نات. Genet. 33 (Suppl.), 245–254 (2003).

Jenuwein, T. & Allis, C.D. Translating the histone code. علم 293, 1074–1080 (2001).

Wolffe, A.P. & Matzke, M.A. Epigenetics: regulation through repression. علم 286, 481–486 (1999).

Lippman, Z.L. وآخرون. Role of transposable elements in heterochromatin and epigenetic control. طبيعة سجية 430, 471–476 (2004).

Sutherland, E., Coe, L. & Raleigh, E.A. McrBC: a multisubunit GTP-dependent restriction endonuclease. جيه مول. بيول. 225, 327–348 (1992).

Gendrel, A.-V., Lippman, Z., Martienssen, R. & Colot, V. Profiling histone modification patterns using genomic tiling microarrays. نات. أساليب 2, – (2005).

Iyer, V.R. وآخرون. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. طبيعة سجية 409, 533–538 (2001).

Bowtell, D. & Sambrook, J. (eds.) DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2003).

Rabinowicz, P.D. وآخرون. Genes and transposons are differentially methylated in plants, but not in mammals. الدقة الجينوم. 13, 2658–2664 (2003).

Lippman, Z., May, B., Yordan, C., Singer, T. & Martienssen, R. Distinct mechanisms determine transposon inheritance and methylation via small interfering RNA and histone modification. بلوس بيول. 1, E67 (2003).

Tompa, R. et al. Genome-wide profiling of DNA methylation reveals transposon targets of CHROMOMETHYLASE3. بالعملة. بيول. 12, 66–68 (2002).

Shi, H. et al. Oligonucleotide-based microarray for DNA methylation analysis: principles and applications. J. Cell Biochem. 88, 138–143 (2003).


شاهد الفيديو: Primer Design for PCR (كانون الثاني 2022).