معلومة

كيف يمكنني إنشاء ميكروكابيلاري لمعالجة الخلايا المفردة؟


أنا أعمل سيرة ذاتية DIY. أجد طريقة لإنشاء أنبوب شعري زجاجي صغير لالتقاط خلايا مفردة. أرى هذا الفيديو على موقع youtube وأود أن أعرف ما هو الحد الأدنى لقطر الإدخال / الإخراج إذا قمت بسحب أنبوب شعري مثل هذا. هل يمكن أن تكون 10-50 ميكرومتر على الأقل؟


من الصعب جدًا تحديد نوع الطرف الذي ستحصل عليه من سحب الشعيرات الدموية على موقد بنسن. هناك العديد من المتغيرات التي يجب مراعاتها ، بما في ذلك الزجاج الذي تستخدمه ، ودرجة الحرارة التي تصل إليها قبل السحب ، وقوة السحب ، والسرعة والوقت ، سواء كنت تسحب مرة واحدة أو تقوم بعمليات سحب متعددة وما إلى ذلك.

إذا كنت لا ترغب في الاستثمار في مجتذب الماصة المجهرية (فهي مكلفة للغاية بالفعل) ، يمكنك على الأقل بناء بعض الآليات للحصول على قوة سحب ثابتة من حيث الوقت والقوة.

قد تكون الورقة التالية مفيدة:

أداة للإنتاج الآلي الخاضع للرقابة لماصات السيليكا المنصهرة بمقياس ميكرومتر

يبدو أنك ستحتاج إلى سرعة عالية إلى حد ما (0.8-1 م / ث) للحصول على حجم طرف أقل من 50 ميكرومتر.

لم أتمكن حقًا من العثور على مرجع محدد لسحب بنسن.


فيما يلي مرجع لسحب ماصات زجاج الكوارتز باستخدام موقد أوكسي هيدروجين مخصص. هنا مقطع فيديو لمجذب ماصة قائم على الموقد التجاري. لست متأكدا ما هي المواصفات. أعتقد أنه إذا كان بإمكانك إذابة زجاجك باستخدام خيوط ، فقد يكون ذلك أسهل من استخدام الشعلة (دائرة المصباح أسهل في التحكم من اللهب). ينتقل الناس إلى اللهب عند التعامل مع كوارتز ذو درجة انصهار عالية.

يمكنك الحصول على مجتذب الماصة الدقيقة من Sutter مقابل 1500 دولار من Ebay. لست متأكدًا تمامًا من كيفية عملها ميكانيكيًا ، لكنني استخدمت العديد من النماذج. يومًا ما أود أن أنظر داخلها (الآلية الحقيقية تحتها ، داخل الصندوق). يستخدمون خيطًا معدنيًا "على شكل عربة نقل" يتم تركيبه حول الغطاء ، وهذا يسخن عند مرور تيار من خلاله. تسحب بكرتان في الماصة ، متصلتان بشيء أدناه للقيام بالسحب الفعلي.

أعتقد أنه قد تكون هناك آلية محملة بنابض لتحقيق السحب ، بدلاً من مرحلة خطية آلية تتحرك بسرعة كبيرة. ربما تقوم مرحلة أو مشغل آخر أسفله بتمديد الزنبرك مسبقًا بحيث يتم سحبه إلى درجات مختلفة أثناء دورة الذوبان؟


في الواقع ليس بهذه الصعوبة ولكن من الصعب أن أجعلهم يدي باستمرار. لديّ مجتذب شعري في مختبري يمكنه إعطائي + -. 5um ID نستخدمها لإعداد مشبك التصحيح ولكن عندما أقوم بذلك يدويًا [تمامًا مثل الفيديو] يمكنني الحصول على معرف في حدود 10-50um. عادةً ما يتطلب الأمر شدتين أولاً للحصول على الشكل المخروطي الممدود والثاني لسحبه رقيقًا جدًا بحيث يبدو وكأنه سلك وقد تم إغلاق الفتحة. ومع ذلك ، إذا قمت بتوصيل الأنبوب الشعري المسحوب عبر أنبوب بلاستيكي مرن إلى حقنة ، يمكنك محاولة الحصول ببطء شديد على القطرة وستعرف أنك جيد. يعتبر تصوير الحافة أيضًا تحديًا في بعض الأحيان. هناك تأثير عدسة سلكي مع البورسليكات الذي أستخدمه


تطوير طريقة المعالجة الدقيقة لعزل خلية واحدة بدائيات النوى وتطبيقها في سلامة الغذاء

منذ ما يقرب من قرن من الزمان ، كانت الأساليب الميكروبيولوجية التقليدية ممارسة معيارية لاكتشاف وتحديد مسببات الأمراض في الغذاء. ومع ذلك ، فقد تحسنت السلامة الميكروبيولوجية للأغذية وتم تطوير طرق سريعة مختلفة للتغلب على قيود الطرق التقليدية. من المتوقع أن تكتشف الطرق البديلة انخفاض أعداد الخلايا ، حيث إن وجود خلية واحدة من الكائن الحي الممرض في الغذاء قد يكون معديًا. فيما يتعلق بمستويات السكان المنخفضة ، يتم تقييم أداء طريقة الكشف عن طريق إنتاج تخفيفات متسلسلة لتعليق بكتيري نقي لتلقيح مصفوفات الطعام التمثيلية بخلايا بكتيرية مخففة للغاية (أقل من 10 CFU / مل). إن دقة البيانات التي تم الحصول عليها من خلال تقنيات التخفيف المتعددة ليست مؤكدة ولا تستبعد بعض المستعمرات الناشئة عن كتل الخلايا. تم إدخال تقنيات المعالجة الدقيقة لالتقاط وعزل الخلايا المفردة من العينات البيئية منذ أكثر من 40 عامًا. لا يزال القيد الرئيسي لتقنية المعالجة الدقيقة الحالية هو معدل الاسترداد المنخفض لنمو خلية واحدة في وسط المزرعة. في هذه الدراسة ، نصف طريقة جديدة لعزل خلية واحدة ونوضح أنه يمكن استخدامها بنجاح لتنمية أنواع مختلفة من الكائنات الحية الدقيقة من الخلايا الفردية المختارة. أظهرت الاختبارات التي أجريت على الكائنات الحية سالبة الجرام موجبة الجرام ، بما في ذلك المكورات ، والقضبان ، والأيروبس ، واللاهوائية ، والخمائر ، والقوالب معدلات استرداد للنمو من 60٪ إلى 100٪ بعد المعالجة الدقيقة. نسلط الضوء أيضًا على استخدام طريقتنا لتقييم وتحدي حدود الكشف لطرق الكشف القياسية في عينات الأغذية الملوثة بخلية واحدة من السالمونيلا المعوية.

الاقتباس: Hohnadel M، Maumy M، Chollet R (2018) تطوير طريقة المعالجة الدقيقة لعزل خلية واحدة بدائيات النوى وتطبيقها في سلامة الغذاء. بلوس واحد 13 (5): e0198208. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198208

محرر: جيفري تشالمرز ، جامعة ولاية أوهايو ، الولايات المتحدة

تم الاستلام: 24 أكتوبر 2017 وافقت: 15 مايو 2018 نشرت: 31 مايو 2018

حقوق النشر: © 2018 Hohnadel et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط ذكر المؤلف والمصدر الأصليين.

توافر البيانات: جميع البيانات ذات الصلة موجودة داخل الورقة وملف المعلومات الداعمة الخاص بها.

التمويل: قدمت شركة Merck الدعم في شكل رواتب للمؤلفين [MH ، MM ، RC] ، ولكن لم يكن لها أي دور إضافي في تصميم الدراسة ، وجمع البيانات وتحليلها ، وقرار النشر ، أو إعداد المخطوطة. تم توضيح الأدوار المحددة لهؤلاء المؤلفين في قسم "مساهمات المؤلفين".

تضارب المصالح: قدمت شركة Merck الدعم في شكل رواتب للمؤلفين [MH ، MM ، RC]. هذا لا يغير التزامنا بسياسات PLOS ONE بشأن مشاركة البيانات والمواد.


يمكن لأداة تحرير الجينات الجديدة أن تنافس تقنية كريسبر ، وتقوم بإجراء ملايين التعديلات دفعة واحدة

مع الصعود النيزكي لـ CRISPR كأعجوبة في تعديل الجينات ، من السهل نسيان أصولها المتواضعة: تم اكتشافها لأول مرة على أنها نزوة في الجهاز المناعي البكتيري.

يبدو أن البكتيريا لديها المزيد لتقدمه. هذا الشهر ، اختطف فريق بقيادة عالم الأحياء الاصطناعية الشهير الدكتور جورج تشيرش من جامعة هارفارد قطعة غريبة أخرى من بيولوجيا البكتيريا. والنتيجة هي أداة قوية يمكنها - من الناحية النظرية - تعديل الملايين من تسلسلات الحمض النووي في آن واحد ، باستخدام "رمز شريطي" لتتبع التغييرات. كل ذلك دون كسر خيط واحد دقيق من الحمض النووي.

في الوقت الحالي ، تم اختبار هذه الأدوات البيولوجية ، المسماة "إعادة تجميع مكتبة Retron (RLR)" فقط في الخلايا البكتيرية. ولكن كما تظهر رحلة CRISPR إلى العلاج الجيني ، فإن حتى أغرب الاكتشافات من المخلوقات المتواضعة قد تقذف بالعلاج الجيني الأكثر جموحًا أو أحلام البيولوجيا التركيبية إلى حقيقة واقعة.

"يساعد هذا العمل في إنشاء خارطة طريق نحو استخدام RLR في أنظمة وراثية أخرى ، مما يفتح العديد من الاحتمالات المثيرة للبحث الجيني المستقبلي ، & # 8221 قال تشيرش.

انتظر ، لماذا تعد تقنية CRISPR غير كافية؟

Retrons غريبة. لنبدأ بـ CRISPR بدلاً من ذلك.

قد تكون بالفعل على دراية بكيفية عملها. هناك مكونان: نوع من الحمض النووي الريبي ، والبروتين. يقوم "الكلب الدموي" الذي يوجه الحمض النووي الريبي بربط بروتين كاس "المقص" بجين معين. في الإصدار الكلاسيكي ، يقوم كاس بتقطيع الجين لإيقافه. تسمح التطورات الحديثة لـ Cas باستبدال حرف وراثي معين ، أو قص جينات متعددة في وقت واحد.

بالنسبة لنسخة التقطيع والاستبدال ، حيث يشفي الجين نفسه ، غالبًا ما يبحث عن قالب. يمكن أن تحمل كريسبر جينًا نموذجيًا للخلية للاعتماد عليه. بهذه الطريقة يتم خداع الخلية في تعديل نسخة جينية: استبدال جملة جينية معيبة بأخرى نحوية بيولوجيًا.

مشكلة كريسبر هي تقطيع الحمض النووي. إذا سبق لك أن قطعت جملة على هاتفك ، وأدركت أنك قطعت الأجزاء الخاطئة ، ولصقتها مرة أخرى برسالة أخرى لا معنى لها الآن ، ثم اضغط على إرسال - حسنًا ، هذا مشابه لما يمكن أن يحدث مع كريسبر. يزداد خطر تلف الجينوم عندما نحتاج إلى تعديل جينات متعددة. تصبح هذه مشكلة كبيرة في علم الأحياء التركيبي ، الذي يستخدم التلاعب الجيني لمنح الخلايا قدرات جديدة ، أو حتى هندسة كائنات حية جديدة تمامًا.

الخلايا مخلوقات عنيدة نشأت منذ دهور التطور ، لذا نادرًا ما يكون تغيير جين واحد كافيًا للحصول ، على سبيل المثال ، على بكتيريا لضخ الوقود الحيوي أو الأدوية ، مما يجعل تعديل الجينات المتعدد ضروريًا. تنقسم معظم الخلايا أيضًا بسرعة ، لذا من الضروري لأي تعديل جيني أن يستمر عبر الأجيال. غالبًا ما تعاني تقنية CRISPR من كليهما. يعتقد فريق الكنيسة أن لديهم حلًا.

قابل Retrons

الأداة الجديدة تسمى RLR ، وأول حرف "R" يرمز إلى retrons. هذه كائنات منتشرة ولكنها غامضة تمامًا ، وكتب الفريق أن "بيولوجيتها الطبيعية & # 8230 غير معروفة إلى حد كبير" ، على الرغم من أنها تشبه كريسبر ، إلا أنها قد تكون متورطة في جهاز المناعة البكتيري.

تم اكتشافها لأول مرة في عام 1984 ، وهي عبارة عن شرائط عائمة من الحمض النووي في بعض خلايا البكتيريا والتي يمكن تحويلها إلى نوع معين من الحمض النووي - سلسلة واحدة من قواعد الحمض النووي يطلق عليها اسم ssDNAs (نعم ، إنه غريب). لكن هذه أخبار رائعة لتعديل الجينات ، لأن تسلسلات الحمض النووي المزدوج الشريطة لخلايانا تصبح سلاسل مفردة قابلة للتأثر عند الانقسام. التوقيت المثالي لطعم الريترون والتبديل.

عادة ، يوجد حمضنا النووي في حلزونات مزدوجة ملفوفة بإحكام في 23 حزمة تسمى الكروموسومات. تأتي كل حزمة كروموسوم في نسختين ، وعندما تنقسم الخلية ، تنفصل النسخ لتنسخ نفسها. خلال هذا الوقت ، تقوم النسختان أحيانًا بتبادل الجينات في عملية تسمى إعادة التركيب. هذا عندما يمكن أن تتسلل retrons ، وإدخال ذرية ssDNA في الخلية المنقسمة بدلاً من ذلك. إذا حملوا حيلًا جديدة - على سبيل المثال ، السماح لخلية بكتيرية بمقاومة الأدوية - وأدخلوا أنفسهم بنجاح ، فإن ذرية الخلية ترث تلك الصفة.

بسبب الآلية الطبيعية للخلية ، يمكن للريترونات التسلل إلى الجينوم دون قطعه. ويمكنهم فعل ذلك في ملايين الخلايا المنقسمة في نفس الوقت.

& # 8220 لقد توصلنا إلى أن retrons يجب أن تمنحنا القدرة على إنتاج ssDNA داخل الخلايا التي نريد تعديلها بدلاً من محاولة إجبارها على الخلية من الخارج ، ودون إتلاف الحمض النووي الأصلي ، وكلاهما من الصفات المقنعة للغاية ، & # 8221 قال مؤلف الدراسة الدكتور دانيال جودمان.

صنع RTR

على غرار CRISPR ، يحتوي RTR على مكونات متعددة: المقتطف الجيني الذي يحتوي على طفرة (الطُعم) ، وبروتينين ، RT و SSAP (النسخ العكسي وبروتينات التلدين أحادية السلسلة) ، التي تحول الريترون إلى ssDNA وتسمح لها بإدخال نفسها في خلية مقسمة.

مثل Game of Thrones ، هناك الكثير من اللاعبين. لتوضيح الأمر أكثر: تحمل retrons الشفرة الجينية التي نريد إدخال RT مما يجعلها في شكل أكثر توافقًا يسمى ssDNA و SSAP تلتصق بها في الحمض النووي أثناء انقسامها. في الأساس ، يغزو حصان طروادة الخلية ويخرج جواسيس يدخلون الخلية - ويغيرون حمضها النووي - بمساعدة السحرة الإنزيمات.

البروتينان جديدان في الحفلة. في السابق ، حاول العلماء استخدام retrons لتحرير الجينات ، لكن الكفاءة كانت منخفضة للغاية - حوالي 0.1٪ من جميع الخلايا البكتيرية المصابة. قام القادمان الجديدان بتهدئة "نظام الإنذار" الطبيعي للبكتيريا الذي يصحح تغيرات الحمض النووي - لذلك يتجاهلان بتات الحمض النووي الجديدة - ويسمحان بدخول التعديلات ونقلها إلى الجيل التالي. كانت إحدى الحيل الأخرى هي تحييد جينين يشفران البروتينات التي تدمر ssDNA بشكل طبيعي.

في أحد الاختبارات ، وجد الفريق أن أكثر من 90 في المائة من الخلايا البكتيرية اعترفت بسهولة تسلسل الريترون الجديد في حمضها النووي. ذهبوا بعد ذلك كبيرة. مقارنةً بـ CRISPR ، فإن retrons لها دور في أن تسلسلها يمكن أن يعمل كرمز شريطي. وهذا يعني أنه من الممكن إجراء تجارب متعددة لتحرير الجينات في وقت واحد ، ومعرفة الخلايا التي تم تحريرها باستخدام الريترون من خلال تسلسل الرمز الشريطي.

في اختبار إثبات المفهوم ، قام الفريق بتفجير بعض خلايا البكتيريا باستخدام retrons التي تحتوي على تسلسلات لمقاومة المضادات الحيوية. من خلال تسلسل أحرف DNA retron وحدها من مجموعة من البكتيريا المعالجة بالمضادات الحيوية ، وجدوا أن الخلايا التي تحتوي على retrons - مما يمنحها القوة العظمى الجديدة ضد الأدوية - بقيت في أجزاء أعلى بكثير من الخلايا الأخرى.

في اختبار آخر ، حاول الفريق تحديد عدد retrons التي يمكنهم استخدامها في وقت واحد. لقد أخذوا سلالة أخرى من البكتيريا المقاومة لمضادات البكتيريا ، وقاموا بتقطيع جينومها لبناء مكتبة من عشرات الملايين من retrons. ثم قاموا بغرز هذه القطع في أطواق من الحمض النووي - تسمى البلازميدات - وتطفو في خلايا البكتيريا. كما كان من قبل ، يمكن للفريق بسهولة العثور على retrons التي تمنح قوة مضادة للبكتيريا من خلال تسلسل الرموز الشريطية لتلك التي بقيت على قيد الحياة.

لكن لماذا؟

هذه هي الطريقة. لكن ما هو السبب؟

الهدف سهل: إيجاد حل آخر لـ CRISPR يمكنه التأثير على ملايين الخلايا في وقت واحد ، دون الإضرار بالخلايا. بعبارة أخرى ، خذ تحرير الجينات إلى عصر البيانات الضخمة ، عبر أجيال متعددة.

مقارنةً بـ CRISPR ، فإن أداة RLR الجديدة أبسط لأنها لا تتطلب أداة "دليل" بالإضافة إلى أداة "تحرير" - ريترون هو في الأساس اثنان في واحد. إن القدرة على التأثير على جينات متعددة في وقت واحد - دون اقتحامها جسديًا - تجعلها أيضًا أداة مثيرة للاهتمام في علم الأحياء التركيبي. تتمتع الأداة أيضًا بقدرتها على البقاء. بدلاً من روح كريسبر "واحد وقد تم" ، فإنه يستمر عبر الأجيال عندما تنقسم الخلايا.

ومع ذلك ، فإن RTR لديها منافسة. نظرًا لأنه يعمل بشكل أفضل مع الخلايا المنقسمة ، فقد لا يكون بنفس القوة في الخلايا المترددة التي ترفض الانقسام - على سبيل المثال ، الخلايا العصبية. من ناحية أخرى ، أتاحت الترقيات الأخيرة لـ CRISPR أيضًا تشغيل الجينات أو إيقاف تشغيلها - دون قطعها - من خلال علم التخلق.

لكن RLR تقدم النطاق. قال تشيرش: "القدرة على تحليل مكتبات متحولة مجمعة ومشفرة باستخدام RLR تتيح إجراء ملايين التجارب في وقت واحد ، مما يسمح لنا بمراقبة آثار الطفرات عبر الجينوم ، وكذلك كيفية تفاعل هذه الطفرات مع بعضها البعض".


التعديل الوراثي للمصنع

تقنيات أخرى غير الهندسة الوراثية

اختيار بسيط

أسهل طريقة للتعديل الوراثي للنبات (انظر التعريفات التشغيلية في الفصل 1) ، التي استخدمها أسلافنا الرحل والمستمرة اليوم ، هي الاختيار البسيط. وهذا يعني أنه يتم فحص مجموعة غير متجانسة وراثيًا من النباتات ، واختيار & # x0201csuperior & # x0201d فرد & # x02014 النباتات ذات الصفات المرغوبة ، مثل الاستساغة المحسنة والإنتاجية & # x02014 يتم اختيارها لاستمرار التكاثر. يتم أكل أو التخلص من الآخرين. تُزرع بذور النباتات المتفوقة لإنتاج جيل جديد من النباتات ، تحمل جميعها أو معظمها الصفات المرغوبة. على مدى عدة سنوات ، يتم حفظ هذه النباتات أو بذورها وإعادة زراعتها ، مما يزيد من عدد النباتات المتفوقة ويغير السكان الوراثي بحيث يهيمن عليه النمط الجيني المتفوق. تم تعزيز هذه الطريقة القديمة في التربية بالتكنولوجيا الحديثة.

مثال على الأساليب الحديثة للاختيار البسيط الاختيار بمساعدة علامة ، الذي يستخدم التحليل الجزيئي لاكتشاف النباتات التي من المحتمل أن تعبر عن السمات المرغوبة ، مثل مقاومة المرض لواحد أو أكثر من مسببات الأمراض المحددة في مجموعة سكانية. يسمح التطبيق الناجح للاختيار بمساعدة العلامات بآلية أسرع وأكثر كفاءة لتحديد الأفراد المرشحين الذين قد يكون لديهم & # x0201cs سمات فائقة. & # x0201d

الصفات المتفوقة هي تلك التي تعتبر مفيدة للبشر ، وكذلك للحيوانات الأليفة التي تستهلك نظامًا غذائيًا نباتيًا ، فهي ليست بالضرورة مفيدة للنبات في سياق بيئي أو تطوري. غالبًا ما تكون الصفات التي تعتبر مفيدة للمربين ضارة بالنبات من وجهة نظر اللياقة البيئية. على سبيل المثال ، فإن تقليل المواد الكيميائية غير المستساغة في النبات يجعله أكثر جاذبية للمستهلكين من البشر ، ولكنه قد يجذب أيضًا المزيد من التغذية بواسطة الحشرات والآفات الأخرى ، مما يجعله أقل احتمالية للبقاء على قيد الحياة في بيئة غير مدارة. نتيجة لذلك ، نادرًا ما تؤسس أصناف المحاصيل المزروعة تجمعات في البرية عندما تهرب من المزرعة. وعلى العكس من ذلك ، فإن بعض السمات التي تعزز مقاومة النبات للأمراض قد تكون ضارة أيضًا بالبشر.

العبور

يحدث العبور عندما يأخذ مربي نبات حبوب اللقاح من نبات واحد ويفرشها على مدقة نبات متوافق جنسيًا ، مما ينتج عنه هجين يحمل الجينات من كلا الوالدين. عندما يصل النسل الهجين إلى مرحلة النضج المزهر ، يمكن استخدامه أيضًا كأحد الوالدين.

عادة ما يرغب مربو النباتات في الجمع بين الميزات المفيدة لنبتين. على سبيل المثال ، قد يضيفون جينًا مقاومًا للأمراض من نبات إلى آخر عالي الغلة ولكنه عرضة للأمراض ، بينما يتركون وراءهم أي سمات وراثية غير مرغوب فيها للنبات المقاوم للأمراض ، مثل ضعف الخصوبة وإنتاجية البذور ، والتعرض للإصابة. الحشرات أو الأمراض الأخرى ، أو إنتاج المستقلبات المضادة للتغذية.

بسبب الطبيعة العشوائية لإعادة توحيد الجينات والسمات في النباتات المهجنة ، يتعين على المربين عادةً تكوين مئات أو آلاف من السلالات الهجينة لإنشاء وتحديد تلك القلة التي تمتلك ميزات مفيدة بحد أدنى من الميزات غير المرغوب فيها. على سبيل المثال ، قد تظهر غالبية النسل المقاومة المرغوبة للأمراض ، ولكن قد تكون السمات الجينية غير المرغوب فيها للوالد المقاوم للأمراض موجودة أيضًا في البعض. لا يزال العبور هو الدعامة الأساسية لتربية النباتات الحديثة ، ولكن تمت إضافة العديد من التقنيات الأخرى إلى مجموعة أدوات المربين.

معبر بين الأنواع

يمكن أن يحدث معبر الأنواع من خلال وسائل مختلفة. الأنواع وثيقة الصلة ، مثل الشوفان المزروع (أفينا ساتيفا) والشوفان البري النسبي العشبي (أفينا فاتوا) ، قد يتم التلقيح المتبادل لتبادل المعلومات الجينية ، على الرغم من أن هذا ليس هو الحال بشكل عام. يمكن أيضًا أن تندمج الجينات من نوع واحد بشكل طبيعي في جينومات الأقارب الأبعد في ظل ظروف معينة. يمكن أن تحمل بعض نباتات الطعام جينات تنشأ في أنواع مختلفة ، تنتقل عن طريق الطبيعة والتدخل البشري. على سبيل المثال ، تحمل أصناف القمح الشائعة جينات من الجاودار. بطاطا مشتركة ، Solanum tuberosum، يمكن أن تتقاطع مع أقارب الأنواع الأخرى ، مثل س. أكول (كوزوكو وآخرون ، 1999) أو س. chacoense (سانفورد وآخرون ، 1998 Zimnoch-Guzowska et al. ، 2000).

هندسة الكروموسوم هو المصطلح الذي يطلق على التلاعب الوراثي الخلوي غير المترابط (rDNA) ، حيث يتم إعادة تجميع أجزاء من الكروموسومات من الأنواع القريبة أو البعيدة من خلال عملية طبيعية تسمى الانتقال الكروموسومي. كان Sears (1956 ، 1981) رائدًا في الاستغلال البشري لهذه العملية ، والتي أثبتت قيمتها في نقل السمات التي لم يكن من الممكن الوصول إليها ، مثل مقاومة الآفات أو الأمراض ، إلى أنواع المحاصيل. ومع ذلك ، نظرًا لأن نقل أجزاء كبيرة من الكروموسومات ينقل أيضًا عددًا من الجينات المحايدة أو الضارة ، كانت فائدة هذه التقنية محدودة.

تسمح التحسينات الحديثة لمربي النباتات بتقييد المادة الوراثية المنقولة ، مع التركيز بشكل أكبر على الجين المعني (Lukaszewski ، 2004). نتيجة لذلك ، أصبحت هندسة الكروموسوم أكثر قدرة على المنافسة مع تقنية rDNA في قدرتها على نقل قطع صغيرة نسبيًا من الحمض النووي. تم تحسين العديد من أنواع المحاصيل ، مثل الذرة وفول الصويا والأرز والشعير والبطاطا باستخدام هندسة الكروموسومات (Gupta and Tsuchiya ، 1991).

إنقاذ الجنين

في بعض الأحيان يكون التدخل التقني البشري مطلوبًا لإكمال نقل الجينات بين الأنواع. سوف تقوم بعض النباتات بالتلقيح المتبادل ويتطور الجنين المهجن المخصب الناتج ولكنه غير قادر على النضج والبرعم. يعمل مربو النباتات الحديثون على حل هذه المشكلة عن طريق التلقيح الطبيعي ثم إزالة جنين النبات قبل أن يتوقف عن النمو ، ووضعه في بيئة زراعة الأنسجة حيث يمكنه إكمال نموه. إن إنقاذ الأجنة لا يعتبر هندسة وراثية ، ولا يتم استخدامه بشكل شائع لاشتقاق أنواع جديدة مباشرة ، ولكنه يستخدم بدلاً من ذلك كخطوة وسيطة في نقل الجينات من الأقارب البعيدين غير المتوافقين جنسياً من خلال الأقارب الوسيطة والمتوافقة جزئياً لكل من المتبرع والمتبرع. الأنواع المتلقية.

التهجين الجسدي

قدمت التطورات الحديثة في تقنيات زراعة الأنسجة فرصًا جديدة لإعادة تجميع الجينات من مصادر نباتية مختلفة. في تهجين جسدي عملية تعرف أيضًا باسم انصهار الخلية ، يتم تجريد الخلايا التي تنمو في وسط مستنبت من جدرانها الواقية ، عادةً باستخدام إنزيمات البكتيناز ، السليولاز ، والهيميسيلولاز. تسمى هذه الخلايا المجردة البروتوبلاست، يتم تجميعها من مصادر مختلفة ، ومن خلال استخدام تقنيات متنوعة مثل الصدمات الكهربائية ، يتم دمجها مع بعضها البعض.

عندما تندمج اثنتان من البروتوبلاست ، فإن الهجين الجسدي الناتج يحتوي على المادة الوراثية من كلا المصدرين النباتيين. تتغلب هذه الطريقة على الحواجز المادية للتهجين القائم على حبوب اللقاح ، ولكنها لا تتغلب على عدم توافق الكروموسومات الأساسي. إذا كان الهجين الجسدي متوافقًا وصحيًا ، فقد ينمو جدارًا خلويًا جديدًا ، ويبدأ الانقسامات الانقسامية ، وينمو في النهاية إلى نبات هجين يحمل السمات الوراثية لكلا الوالدين. في حين أن اندماج البروتوبلاست يتم إنجازه بسهولة ، نظرًا لأن جميع النباتات (والحيوانات) تقريبًا بها خلايا مناسبة لهذه العملية ، فإن القليل نسبيًا قادر على تجديد كائن حي كامل ، ولا يزال عدد أقل قادرًا على التكاثر الجنسي. تقنية الهندسة غير الوراثية هذه ليست شائعة في تربية النباتات لأن النطاق الناتج من الهجائن الخصبة الناجحة لم يمتد كثيرًا إلى ما هو ممكن باستخدام التقنيات التقليدية الأخرى.

الاختلاف Somaclonal

الاختلاف Somaclonal هو الاسم الذي يطلق على الطفرات التلقائية التي تحدث عندما تنمو الخلايا النباتية في المختبر. لسنوات عديدة ، كان للنباتات التي تم تجديدها من ثقافة tis-sue ميزات جديدة في بعض الأحيان. لم يكن حتى الثمانينيات يعتقد عالمان أستراليان أن هذه الظاهرة قد توفر مصدرًا جديدًا للتنوع الجيني ، وأن بعض النباتات المتنوعة قد تحمل سمات ذات قيمة لمربي النباتات (Larkin and Scowcroft ، 1981).

خلال الثمانينيات من القرن الماضي ، قام مربو النباتات في جميع أنحاء العالم بزراعة النباتات في المختبر وسجلوا مُجددًا للمتغيرات القيمة المحتملة في مجموعة من المحاصيل المختلفة. تم تطوير أنواع جديدة من العديد من المحاصيل ، مثل الكتان ، وإطلاقها تجاريًا (Rowland et al. ، 2002). لم تكن التحليلات الجزيئية لهذه الأصناف الجديدة مطلوبة من قبل المنظمين في ذلك الوقت ، ولم يتم إجراؤها من قبل المطورين للتأكد من طبيعة التغييرات الجينية الأساسية التي تقود السمات المتغيرة. لا يزال بعض المربين يستخدم التباين الجسدي النسوني ، لا سيما في البلدان النامية ، ولكن تم استبدال تقنية الهندسة غير الوراثية هذه إلى حد كبير بتقنيات الهندسة الوراثية الأكثر قابلية للتنبؤ.

التكاثر الطفري: الطفرات الكيميائية والأشعة السينية المستحثة

يتضمن التكاثر الطفري تعريض النباتات أو البذور لعوامل مطفرة (مثل الإشعاع المؤين) أو المطفرات الكيميائية (مثل إيثيل ميثان سلفونات) للحث على تغييرات عشوائية في تسلسل الحمض النووي. يمكن للمربي تعديل جرعة الطفرات بحيث تكون كافية لإحداث بعض الطفرات ، ولكنها ليست كافية لتكون قاتلة. عادة يتم تحوير عدد كبير من النباتات أو البذور ، وتنمو حتى النضج التناسلي ، ويتم اشتقاق النسل. يتم تقييم النسل للتعبير الظاهري عن السمات الجديدة ذات القيمة المحتملة.

كما هو الحال مع التباين الجسدي النسوني ، فإن الغالبية العظمى من الطفرات الناتجة عن هذه التقنية ضارة ، والصدفة فقط هي التي تحدد ما إذا كانت أي تغييرات جينية مفيدة للبشر ستظهر. بخلاف تغيير الجرعة ، لا توجد وسيلة للتحكم في تأثيرات الطفرات أو لاستهداف جينات أو سمات معينة. يبدو أن التأثيرات الطفرية عشوائية في جميع أنحاء الجينوم ، وحتى إذا حدثت طفرة مفيدة في نبات معين ، فمن المحتمل أيضًا حدوث طفرات ضارة. بمجرد تحديد طفرة مفيدة ، يعمل المربون على تقليل الطفرات الضارة أو غيرها من السمات غير المرغوب فيها للنبات المتحور. ومع ذلك ، لا يزال من المرجح أن تحمل المحاصيل المشتقة من التكاثر بالطفرات تغييرات في الحمض النووي تتجاوز الطفرة المحددة التي قدمت الصفة المتفوقة.

لا يتم تنظيم المحاصيل ذات الطفرات المستحثة في معظم البلدان (بما في ذلك الولايات المتحدة) للأغذية أو السلامة البيئية ، ولا يقوم المربون عمومًا بإجراء تحليلات وراثية جزيئية على هذه المحاصيل لتوصيف الطفرات أو تحديد مدى انتشارها. وبالتالي ، فمن شبه المؤكد أن الطفرات الأخرى غير تلك التي تؤدي إلى سمات مفيدة محددة تحدث أيضًا وقد لا تكون واضحة ، وتبقى غير مميزة مع تأثيرات غير معروفة.

في جميع أنحاء العالم ، تم تطوير أكثر من 2300 نوع مختلف من المحاصيل باستخدام الطفرات المستحثة (منظمة الأغذية والزراعة / الوكالة الدولية للطاقة الذرية ، 2001) ، وقد تم تطوير حوالي نصف هذه الأنواع خلال الخمسة عشر عامًا الماضية. في الولايات المتحدة ، تم تحوير أصناف المحاصيل التي تتراوح من القمح إلى الجريب فروت منذ أن استخدمت هذه التقنية لأول مرة في عشرينيات القرن الماضي. لا توجد سجلات للتوصيفات الجزيئية لهذه المحاصيل الطافرة ، وفي معظم الحالات ، لا توجد سجلات لتتبع استخدامها اللاحق.

تحديد الخلية

تم تطوير العديد من أنواع المحاصيل التجارية باستخدام اختيار الخلية بما في ذلك أصناف فول الصويا (سيباستيان وشليف ، 1987) ، والكانولا (سوانسون وآخرون ، 1988) ، والكتان (رولاند وآخرون ، 1989). تتضمن هذه العملية عزل مجموعة من الخلايا مما يسمى & # x0201celite plant & # x0201d بخصائص زراعية فائقة. ثم يتم استئصال الخلايا وتنمو في المزرعة. في البداية ، يكون السكان متجانسين وراثيًا ، ولكن يمكن أن تحدث التغييرات تلقائيًا (كما هو الحال في التباين الجسدي النسوني) أو يتم تحفيزها باستخدام عوامل مطفرة. يمكن اختيار الخلايا ذات الاختلاف الظاهري المطلوب وتجديدها في نبات كامل. على سبيل المثال ، قد تؤدي إضافة كمية مناسبة من مبيد الأعشاب المناسب إلى وسط الاستزراع إلى تحديد الخلايا التي تعبر عن النمط الظاهري المتغير الجديد لمقاومة مبيدات الأعشاب. من الناحية النظرية ، سوف تستسلم جميع الخلايا الطبيعية الحساسة لمبيدات الأعشاب ، لكن الخلية المقاومة حديثًا ستبقى على قيد الحياة وربما تستمر في النمو. وبالتالي يمكن اختيار خلية مقاومة لمبيدات الأعشاب وخط خلية نسلها المشتق وتجديدهما في نبات كامل ، والذي يتم بعد ذلك اختباره للتأكد من أن سمة النمط الظاهري مستقرة وينتج عن تغيير وراثي قابل للوراثة. من الناحية العملية ، تؤثر العديد من العوامل على نجاح إجراء الاختيار ، ويجب أن يكون للسمة المرغوبة أساس كيميائي حيوي يفسح المجال للاختيار في المختبر وعلى المستوى الخلوي.

لا يستطيع المربون الاختيار لزيادة الغلة في مزارع الخلايا لأن الآلية الخلوية لهذه السمة غير معروفة. تتمثل ميزة اختيار الخلايا على التكاثر التقليدي في القدرة على فحص أعداد كبيرة من الخلايا في طبق بتري بشكل غير مكلف في وقت قصير بدلاً من تكاثر عدد مماثل من النباتات في تجربة ميدانية كبيرة ومكلفة يتم إجراؤها على مدار موسم نمو كامل.

مثل الاختلاف الجسدي النسوني ، فقد حلت التقنيات المؤتلفة محل انتقاء الخلايا بسبب دقتها العالية ، ومعدلات نجاحها العالية ، وطفرات أقل غير موثقة.

الهندسة الوراثية

كما هو مذكور في الفصل 1 ، يحدد هذا التقرير الهندسة الوراثية على وجه التحديد كنوع واحد من التعديل الجيني الذي يتضمن تغييرًا مستهدفًا مقصودًا في تسلسل الجينات النباتية أو الحيوانية لإحداث نتيجة محددة من خلال استخدام تقنية rDNA. تم وصف مجموعة متنوعة من تقنيات الهندسة الوراثية في النص التالي.

النواقل الجرثومية

أغروباكتريوم توميفاسيانز هو ميكروب طبيعي في التربة يشتهر بتسببه في مرض مرارة التاج على الأنواع النباتية المعرضة للإصابة. إنه عامل ممرض غير عادي لأنه عندما يصيب مضيفًا ، فإنه ينقل جزءًا من الحمض النووي الخاص به إلى الخلية النباتية. يتم دمج الحمض النووي المنقول بشكل ثابت في الحمض النووي للنبات ، ثم يقرأ النبات ويعبر عن الجينات المنقولة كما لو كانت خاصة به. تقوم الجينات المنقولة بتوجيه إنتاج العديد من المواد التي تتوسط في تطور المرارة التاجية.

من بين هذه المواد واحد أو أكثر من الأحماض الأمينية غير البروتينية غير العادية ، تسمى الأوبينات. يتم نقل الفتحات في جميع أنحاء النبات ، لذلك فإن الطعام الذي يتم تطويره من النباتات المصابة بالمرارة التاجية سوف يحمل هذه الفتحات. في أوائل 1980s سلالات من الأجرعية كانت تفتقر إلى الجينات المسببة للأمراض ولكنها حافظت على القدرة على الارتباط بخلايا نباتية حساسة ونقل الحمض النووي.

من خلال استبدال الحمض النووي ذي الأهمية للحمض النووي المسبب لمرض مرارة التاج ، اشتق العلماء سلالات جديدة من الأجرعية التي توصل وتدمج بشكل ثابت مادة وراثية جديدة محددة في خلايا الأنواع النباتية المستهدفة. إذا تم إعادة توليد الخلية المحولة إلى نبات كامل الخصب ، فإن جميع الخلايا في السلالة تحمل أيضًا الجينات التي تم إدخالها وقد تعبر عنها. الأجرعية هو عامل هندسة وراثية يحدث بشكل طبيعي وهو مسؤول عن غالبية مصانع جنرال إلكتريك في الإنتاج التجاري.

القصف الدقيق للقذائف

اكتشف كلاين وزملاؤه (1987) أنه يمكن توصيل الحمض النووي العاري إلى الخلايا النباتية عن طريق & # x0201cshooting & # x0201d باستخدام حبيبات مجهرية يلتصق بها الحمض النووي. هذه طريقة فيزيائية بدائية لكنها فعالة لتوصيل الحمض النووي ، خاصة في الأنواع مثل الذرة والأرز وحبوب الحبوب الأخرى ، والتي الأجرعية لا يتحول بشكل طبيعي. تم تحويل العديد من مصانع جنرال إلكتريك في الإنتاج التجاري مبدئيًا باستخدام توصيل المحذوفات الدقيقة.

التفريد الكهربي

في التفريد الكهربي، تأخذ البروتوبلاستات النباتية الجزيئات الكبيرة من السوائل المحيطة بها ، وتسهلها نبضة كهربائية. يتم تجريد الخلايا التي تنمو في وسط استزراع من جدرانها الواقية ، مما ينتج عنه بروتوبلاست. إن إمداد الحمض النووي المعروف لوسط استنبات البروتوبلاست ثم تطبيق النبض الكهربائي يؤدي إلى زعزعة استقرار غشاء الخلية مؤقتًا ، مما يسمح للحمض النووي بالدخول إلى الخلية. يمكن للخلايا المحولة بعد ذلك تجديد جدرانها الخلوية وتنمو لتصبح نباتات كاملة ومعدلة وراثيًا. إن Electroporation محدودة بسبب ضعف كفاءة معظم أنواع النباتات للتجديد من البروتوبلاست.

حقن مكروي

يمكن حقن الحمض النووي مباشرة في الخلايا الراسية. ستبقى نسبة من هذه الخلايا على قيد الحياة وتتكامل مع الحمض النووي المحقون. ومع ذلك ، فإن العملية كثيفة العمالة وغير فعالة مقارنة بالطرق الأخرى.

الينقولات / العناصر القابلة للتبديل

تحمل جينات معظم أنواع النباتات وبعض الحيوانات (مثل الحشرات والأسماك) الينقولات ، وهي عبارة عن قطع قصيرة من الحمض النووي تحدث بشكل طبيعي مع القدرة على الانتقال من موقع إلى آخر في الجينوم. وصفت باربرا مكلينتوك لأول مرة مثل هذه العناصر القابلة للنقل في نباتات الذرة خلال الخمسينيات من القرن الماضي (مختبر كولد سبرينغ هاربور ، 1951). تم فحص الينقولات على نطاق واسع في المعامل البحثية ، خاصة لدراسة الطفرات وآليات إعادة تركيب الحمض النووي. ومع ذلك ، لم يتم تسخيرها بعد لتقديم معلومات وراثية جديدة لتحسين المحاصيل التجارية.

طرق التلاعب الجزيئية غير المعدلة وراثيا

يمكن إضافة السمات الجينية إلى النباتات والحيوانات دون إدخالها في الجينوم الأصلي للكائن المتلقي. قد يتم تسليم الحمض النووي ذي الأهمية إلى خلية نباتية ، معبراً عن بروتين جديد & # x02014 وبالتالي سمة جديدة & # x02014 دون الاندماج في الحمض النووي للخلية المضيفة. For example, virus strains may be modified to carry genetic material into a plant cell, replicate, and thrive without integrating into the host genome. Without integration, however, new genetic material may be lost during meiosis, so that seed progeny may not carry or express the new trait.

Many food plants are perennials or are propagated by vegetative means, such as grafting or from cuttings. In these cases the virus and new genes would be maintained in subsequent, nonsexually generated populations. Technically such plants are not products of rDNA because there is no recombination or insertion of introduced DNA into the host genome. Although these plants are not GE, they do carry new DNA and new traits. No such products are known to be currently on the market in the United States or elsewhere. (See McHughen [2000] for further information on genetic mechanisms used in plant improvement.)


Single-cell proteomics

Bernd Bodenmiller, assistant professor for quantitative biology at the University of Zürich, Switzerland, and Sean Bendall, assistant professor of pathology and immunology at the Stanford University School of Medicine, are both former postdocs of Garry Nolan, also at Stanford, who champions mass cytometry, a cross between flow cytometry and mass spectrometry that overcomes one of the key shortcomings of the former technique.

Traditional flow cytometry, constrained by overlapping fluorescent channels, is limited to about 18 simultaneous signals, or markers, though in practice, the real limit is even lower. Mass cytometry can theoretically resolve more than 100 channels, but is currently limited to about 44—the result of conjugation chemistry needing to catch up with the instrumentation itself.

Like flow cytometry, mass cytometry, commercialized by DVS Sciences as the CyTOF (recently acquired by Fluidigm), is a flow-based method that uses heavy metal-conjugated antibodies rather than fluorescent dyes to achieve its high information content. But in a pair of papers published in 2014, Bodenmiller and Bendall simultaneously demonstrated methods to turn a CyTOF analyzer into a mass spec imager, enabling a kind of high-throughput single-cell proteomics spatial analysis. “We built what you could call a mass cytometry-based microscope,” Bodenmiller explains, enabling “spatial systems biology or spatial proteomics.”

As with advanced mass spec imaging systems, this approach allows researchers to measure protein content cell by cell in situ. But, unlike traditional mass spec imaging, which typically detects the most abundant proteins, mass cytometry allows researchers to actually preselect the proteins they want to image.

Bodenmiller used his mass cytometry microscope to study the impact of tumor microenvironment on metastasis—for instance, the impact of macrophage infiltration. “I think here is the sweet spot of our imaging mass cytometry approach, because it’s antibody-based, so we can exploit prior knowledge to detect different immune cells or stromal cells, and we can use many antibodies to learn what these cells are actually doing.” Bendall and Nolan used their multiplexed ion beam imaging (MIBI) system to probe the histology of breast cancer sections.

Separately, Bendall and Nolan used traditional CyTOF mass cytometry to map the single-cell trajectories of B-cell development, using a set of 42-marker molecular profiles—everything from extracellular markers associated with B-cell development to intracellular signaling factors—and a novel algorithm called “Wanderlust” to trace how molecular signatures change as a lymphocytic stem cell differentiates into a mature B cell.

Though 40-plus parameters are impressive, researchers like Bendall and Bodenmiller hope to ultimately push that number even higher. All that’s required is efficient chemistry to conjugate the ions to the antibodies. Bendall jokes of a creeping condition among flow and mass cytometrists that he calls “PDS,” or “parameter dependency syndrome.” “At first you ask yourself, ‘Well, what the heck am I going to do with 40 parameters?’ And then after you’ve done this for a while, you’re like, ‘How am I [going to] fit everything I want to measure into 40 parameters?’” To put it another way, researchers never say no to more data.

Of course, those data describe just one particular aspect of single-cell biology. And therein lies one of the field’s primary challenges, says Eberwine. What’s needed now, he says, are methods for integrating these different datasets to gain a comprehensive, quantitative, and reproducible view of the cell. Work on that front is ongoing. “I think the information will be incredible,” he says.

Featured Participants


Methodology limitations

A potential limitation for plant systems may be the fact many/most of these studies rely on digestion of cell walls to dissociate tissues into single-cells, a process known as protoplasting [26,27]. While this method allows collection of many cells, there are obvious drawbacks. There are known stress-associated changes during this protoplasting protocol, including about 300 genes that are increased in expression in Arabidopsis root protoplasts [26]. Additionally there are clear biases in the capture of certain cell types, including difficulty in capturing vasculature, and a bias towards mesophyll cells in leaves (e.g. over representation of epidermis, under representation of stele) [5••]. We predict, much like in animal systems, the best, least biased method moving forward will be nuclei capture [28]. This has been done successfully for bulk-based assays using several methods, including Fluorescence Activated Nuclei Sorting, filtering crude plant tissue, or using the INTACT (isolation of nuclei tagged in specific cell types) method [29,30]. Each of these likely have unique drawbacks or advantages, but that has yet to be explored. Most platforms for single-cell genomics can also be used with nuclei, however to-date this has not been accomplished in plant systems. While nuclei only contain only a fraction of the RNA molecules whole cells do, they are enriched for nascent RNAs [31] which may contribute to better structure upon visualization [32]. Therefore, nuclei can result in similar cell type identification compared to whole cell preparations albeit with an increased gene dropout rates [33]. In animal systems, the power of these nuclei isolation techniques are highlighted by recent large scale single-nucleus RNA-seq studies of mice and human samples [20•,28,34]. An inherent limitation to the majority of single-cell RNA-seq methods is that they rely on 3’ end capture using an oligodT first strand synthesis primer, which carries the cell-specific barcode and a unique molecular identifier. This method relies on good annotations of plant 3’ UTRs and is largely incapable of determining changes in isoforms with the same 3’ end.


Wendel JF, Jackson SA, Meyers BC, Wing RA. Evolution of plant genome architecture. جينوم بيول. 201617:37.

Comai L. The advantages and disadvantages of being polyploid. نات ريف جينيت. 20056:836–46.

Soltis DE, Visger CJ, Soltis PS. The polyploidy revolution then. and now: Stebbins revisited. Am J Bot. 2014101:1057–78.

Adams KL, Wendel JF. Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol. 20058:135–41.

Jackson S, Chen ZJ. Genomic and expression plasticity of polyploidy. Curr Opin Plant Biol. 201013:153–9.

Leitch AR, Leitch IJ. Genomic plasticity and the diversity of polyploid plants. علم. 2008320:481–3.

Storchova Z, Pellman D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. بيول ريف مول خلية نات. 20045:45–54.

Bevan MW, Uauy C, Wulff BB, Zhou J, Krasileva K, Clark MD. Genomic innovation for crop improvement. طبيعة سجية. 2017543:346–54.

Chen ZJ, Sreedasyam A, Ando A, Song Q, De Santiago LM, Hulse-Kemp AM, Ding M, Ye W, Kirkbride RC, Jenkins J, et al. Genomic diversifications of five Gossypium allopolyploid species and their impact on cotton improvement. نات جينيه. 202052:525–33.

Selmecki AM, Maruvka YE, Richmond PA, Guillet M, Shoresh N, Sorenson AL, De S, Kishony R, Michor F, Dowell R, Pellman D. Polyploidy can drive rapid adaptation in yeast. طبيعة سجية. 2015519:349–52.

Chao DY, Dilkes B, Luo H, Douglas A, Yakubova E, Lahner B, Salt DE. Polyploids exhibit higher potassium uptake and salinity tolerance in Arabidopsis. علم. 2013341:658–9.

Ni Z, Kim ED, Ha M, Lackey E, Liu J, Zhang Y, Sun Q, Chen ZJ. Altered circadian rhythms regulate growth vigour in hybrids and allopolyploids. طبيعة سجية. 2009457:327–31.

Miller M, Song Q, Shi X, Juenger TE, Chen ZJ. Natural variation in timing of stress-responsive gene expression predicts heterosis in intraspecific hybrids of أرابيدوبسيس. Nat Commun. 20156:7453.

Song Q, Ando A, Xu D, Fang L, Zhang T, Huq E, Qiao H, Deng XW, Chen ZJ. Diurnal down-regulation of ethylene biosynthesis mediates biomass heterosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018115:5606–11.

Chen ZJ. Genomic and epigenetic insights into the molecular bases of heterosis. نات ريف جينيت. 201314:471–82.

Miller M, Zhang C, Chen ZJ. Ploidy and hybridity effects on growth vigor and gene expression in نبات الأرابيدوبسيس thaliana hybrids and their parents. G3 (Bethesda). 20122:505–13.

Galitski T, Saldanha AJ, Styles CA, Lander ES, Fink GR. Ploidy regulation of gene expression. علم. 1999285:251–4.

Coate JE, Doyle JJ. Quantifying whole transcriptome size, a prerequisite for understanding transcriptome evolution across species: an example from a plant allopolyploid. Genome Biol Evol. 20102:534–46.

Yu Z, Haberer G, Matthes M, Rattei T, Mayer KF, Gierl A, Torres-Ruiz RA. Impact of natural genetic variation on the transcriptome of autotetraploid Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010107:17809–14.

Wang J, Tian L, Lee HS, Wei NE, Jiang H, Watson B, Madlung A, Osborn TC, Doerge RW, Comai L, Chen ZJ. Genomewide nonadditive gene regulation in أرابيدوبسيس allotetraploids. Genetics. 2006172:507–17.

Coate JE, Doyle JJ. Variation in transcriptome size: are we getting the message? Chromosoma. 2015124:27–43.

Pirrello J, Deluche C, Frangne N, Gevaudant F, Maza E, Djari A, Bourge M, Renaudin JP, Brown S, Bowler C, et al. Transcriptome profiling of sorted endoreduplicated nuclei from tomato fruits: how the global shift in expression ascribed to DNA ploidy influences RNA-Seq data normalization and interpretation. Plant J. 201893:387–98.

Loven J, Orlando DA, Sigova AA, Lin CY, Rahl PB, Burge CB, Levens DL, Lee TI, Young RA. Revisiting global gene expression analysis. زنزانة. 2012151:476–82.

Birchler JA. Facts and artifacts in studies of gene expression in aneuploids and sex chromosomes. Chromosoma. 2014123:459–69.

Brennecke P, Anders S, Kim JK, Kolodziejczyk AA, Zhang X, Proserpio V, Baying B, Benes V, Teichmann SA, Marioni JC, Heisler MG. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. طرق نات. 201310:1093–5.

Islam S, Zeisel A, Joost S, La Manno G, Zajac P, Kasper M, Lonnerberg P, Linnarsson S. Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers. طرق نات. 201411:163–6.

Karaiskos N, Wahle P, Alles J, Boltengagen A, Ayoub S, Kipar C, Kocks C, Rajewsky N, Zinzen RP. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. علم. 2017358:194–9.

Navin N, Kendall J, Troge J, Andrews P, Rodgers L, McIndoo J, Cook K, Stepansky A, Levy D, Esposito D, et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. طبيعة سجية. 2011472:90–4.

Efroni I, Birnbaum KD. The potential of single-cell profiling in plants. جينوم بيول. 201617:65.

Libault M, Pingault L, Zogli P, Schiefelbein J. Plant systems biology at the single-cell level. اتجاهات نباتية. 201722:949–60.

Doyle JJ, Coate JE. Polyploidy, the nucleotype, and novelty: the impact of genome doubling on the biology of the cell. Int J Plant Sci. 2019180:1–52.

Ng DW, Zhang C, Miller M, Shen Z, Briggs SP, Chen ZJ. Proteomic divergence in Arabidopsis autopolyploids and allopolyploids and their progenitors. Heredity. 2012108:419–30.

Hu Z, Chen K, Xia Z, Chavez M, Pal S, Seol JH, Chen CC, Li W, Tyler JK. Nucleosome loss leads to global transcriptional up-regulation and genomic instability during yeast aging. Genes Dev. 201428:396–408.

Steffen JG, Kang IH, Macfarlane J, Drews GN. Identification of genes expressed in the Arabidopsis female gametophyte. Plant J. 200751:281–92.

Wang D, Zhang C, Hearn DJ, Kang IH, Punwani JA, Skaggs MI, Drews GN, Schumaker KS, Yadegari R. Identification of transcription-factor genes expressed in the Arabidopsis female gametophyte. بيول مصنع بيول. 201010:110.

Picelli S, Faridani OR, Bjorklund AK, Winberg G, Sagasser S, Sandberg R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. نات بروتوك. 20149: 171-81.

Grun D, Kester L, van Oudenaarden A. Validation of noise models for single-cell transcriptomics. طرق نات. 201411:637–40.

Choi Y, Gehring M, Johnson L, Hannon M, Harada JJ, Goldberg RB, Jacobsen SE, Fischer RL. DEMETER, a DNA glycosylase domain protein, is required for endosperm gene imprinting and seed viability in Arabidopsis. زنزانة. 2002110:33–42.

Kinoshita T, Miura A, Choi Y, Kinoshita Y, Cao X, Jacobsen SE, Fischer RL, Kakutani T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. علم. 2004303:521–3.

Koszegi D, Johnston AJ, Rutten T, Czihal A, Altschmied L, Kumlehn J, Wust SE, Kirioukhova O, Gheyselinck J, Grossniklaus U, Baumlein H. Members of the RKD transcription factor family induce an egg cell-like gene expression program. Plant J. 201167:280–91.

Sprunck S, Rademacher S, Vogler F, Gheyselinck J, Grossniklaus U, Dresselhaus T. Egg cell-secreted EC1 triggers sperm cell activation during double fertilization. علم. 2012338:1093–7.

Tung PY, Blischak JD, Hsiao CJ, Knowles DA, Burnett JE, Pritchard JK, Gilad Y. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Sci Rep. 20177:39921.

Gehring M, Huh JH, Hsieh TF, Penterman J, Choi Y, Harada JJ, Goldberg RB, Fischer RL. DEMETER DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. زنزانة. 2006124:495–506.

Chaudhury AM, Ming L, Miller C, Craig S, Dennis ES, Peacock WJ. Fertilization-independent seed development in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 199794:4223–8.

Grossniklaus U, Vielle-Calzada JP, Hoeppner MA, Gagliano WB. Maternal control of embryogenesis by MEDEA, a polycomb group gene in Arabidopsis. علم. 1998280:446–50.

Xiao W, Gehring M, Choi Y, Margossian L, Pu H, Harada JJ, Goldberg RB, Pennell RI, Fischer RL. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev Cell. 20035:891–901.

Raissig MT, Bemer M, Baroux C, Grossniklaus U. Genomic imprinting in the Arabidopsis embryo is partly regulated by PRC2. PLoS Genet. 20139:e1003862.

Kohler C, Wolff P, Spillane C. Epigenetic mechanisms underlying genomic imprinting in plants. Annu Rev Plant Biol. 201263:331–52.

Weinhofer I, Hehenberger E, Roszak P, Hennig L, Kohler C. H3K27me3 profiling of the endosperm implies exclusion of polycomb group protein targeting by DNA methylation. PLoS Genet. 20106:e1001152.

Bushell C, Spielman M, Scott RJ. The basis of natural and artificial postzygotic hybridization barriers in Arabidopsis species. الخلية النباتية. 200315:1430–42.

Josefsson C, Dilkes B, Comai L. Parent-dependent loss of gene silencing during interspecies hybridization. Curr Biol. 200616:1322–8.

Hu Y, Poh HM, Chua NH. The Arabidopsis ARGOS-LIKE gene regulates cell expansion during organ growth. Plant J. 200647:1–9.

Deprost D, Yao L, Sormani R, Moreau M, Leterreux G, Nicolai M, Bedu M, Robaglia C, Meyer C. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Rep. 20078:864–70.

Guo H, Li L, Ye H, Yu X, Algreen A, Yin Y. Three related receptor-like kinases are required for optimal cell elongation in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009106:7648–53.

Qin Z, Zhang X, Zhang X, Feng G, Hu Y. The Arabidopsis ORGAN SIZE RELATED 2 is involved in regulation of cell expansion during organ growth. بيول مصنع بيول. 201414:349.

Englhart M, Soljic L, Sprunck S. Manual isolation of living cells from the Arabidopsis thaliana female gametophyte by micromanipulation. Methods Mol Biol. 16692017:221–34.

Frawley LE, Orr-Weaver TL. Polyploidy. Curr Biol. 201525:R353–8.

Dresselhaus T, Franklin-Tong N. Male-female crosstalk during pollen germination, tube growth and guidance, and double fertilization. Mol Plant. 20136:1018–36.

Yu HJ, Hogan P, Sundaresan V. Analysis of the female gametophyte transcriptome of Arabidopsis by comparative expression profiling. Plant Physiol. 2005139:1853–69.

Sprunck S, Baumann U, Edwards K, Langridge P, Dresselhaus T. The transcript composition of egg cells changes significantly following fertilization in wheat (Triticum aestivum L.). Plant J. 200541:660–72.

Ishikawa R, Ohnishi T, Kinoshita Y, Eiguchi M, Kurata N, Kinoshita T. Rice interspecies hybrids show precocious or delayed developmental transitions in the endosperm without change to the rate of syncytial nuclear division. Plant J. 201165:798–806.

Chen J, Strieder N, Krohn NG, Cyprys P, Sprunck S, Engelmann JC, Dresselhaus T. Zygotic genome activation occurs shortly after fertilization in maize. الخلية النباتية. 201729:2106–25.

Wuest SE, Vijverberg K, Schmidt A, Weiss M, Gheyselinck J, Lohr M, Wellmer F, Rahnenfuhrer J, von Mering C, Grossniklaus U. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 201020:506–12.

Schmid MW, Schmidt A, Klostermeier UC, Barann M, Rosenstiel P, Grossniklaus U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. بلوس واحد. 20127:e29685.

Schmidt A, Schmid MW, Klostermeier UC, Qi W, Guthorl D, Sailer C, Waller M, Rosenstiel P, Grossniklaus U. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLoS Genet. 201410:e1004476.

Schon MA, Nodine M. Widespread contamination of Arabidopsis embryo and endosperm transcriptome datasets. الخلية النباتية. 201729:608-17.

Huang Q, Dresselhaus T, Gu H, Qu LJ. Active role of small peptides in Arabidopsis reproduction: expression evidence. J Integr Plant Biol. 201557:518–21.

Marshall E, Costa LM, Gutierrez-Marcos J. Cysteine-rich peptides (CRPs) mediate diverse aspects of cell-cell communication in plant reproduction and development. J اكسب بوت. 201162:1677–86.

Brady SM, Orlando DA, Lee JY, Wang JY, Koch J, Dinneny JR, Mace D, Ohler U, Benfey PN. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. علم. 2007318:801–6.

Berger F, Hamamura Y, Ingouff M, Higashiyama T. Double fertilization - caught in the act. اتجاهات نباتية. 200813:437–43.

Tian HQ, Yuan T, Russell SD. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Reprod. 200517:243–52.

Zhurinsky J, Leonhard K, Watt S, Marguerat S, Bahler J, Nurse P. A coordinated global control over cellular transcription. Curr Biol. 201020:2010–5.

Sundaresan V, Alandete-Saez M. Pattern formation in miniature: the female gametophyte of flowering plants. تطوير. 2010137:179–89.

Yang WC, Shi DQ, Chen YH. Female gametophyte development in flowering plants. Annu Rev Plant Biol. 201061:89–108.

Xiong Y, Sheen J. The role of target of rapamycin signaling networks in plant growth and metabolism. Plant Physiol. 2014164:499–512.

Brink RA, Cooper DC. Double fertilization and development of the seed in angiosperms. Bot Gaz. 1940102:1–25.

Ikeda Y, Kinoshita Y, Susaki D, Ikeda Y, Iwano M, Takayama S, Higashiyama T, Kakutani T, Kinoshita T. HMG domain containing SSRP1 is required for DNA demethylation and genomic imprinting in Arabidopsis. Dev Cell. 201121:589–96.

Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, Batut P, Chaisson M, Gingeras TR. STAR: تقويم RNA-seq الشامل فائق السرعة. المعلوماتية الحيوية. 201329:15–21.

Smith T, Heger A, Sudbery I. UMI-tools: modeling sequencing errors in unique molecular identifiers to improve quantification accuracy. الدقة الجينوم. 201727:491–9.

Huang da W, Sherman BT, Lempicki RA: Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res 2009, 37:1–13.

Kim D, Paggi JM, Park C, Bennett C, Salzberg SL. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nat Biotechnol. 201937:907–15.

Pertea M, Pertea GM, Antonescu CM, Chang TC, Mendell JT, Salzberg SL. يتيح StringTie إعادة بناء محسّن للنسخة من قراءات RNA-seq. Nat Biotechnol. 201533:290–5.

Clough SJ, Bent AF. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 199816:735–43.

Song Q, Ando A, Jiang J, Ikeda Y, Chen ZJ: Single-cell RNA-seq analysis reveals ploidy-dependent and cell-specific transcriptome changes in Arabidopsis female gametophytes. المجلد. SRP160651: NCBI SRA: https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?study=SRP160651 2020.

Song Q, Ando A, Jiang J, Ikeda Y, Chen ZJ: Single-cell RNA-seq analysis reveals ploidy-dependent and cell-specific transcriptome changes in Arabidopsis female gametophytes. GitHub: https://github.com/qingxinsong/single_cell 2020.


The Digital Cell Biology Revolution

A new nanofluidic technology that uses light to manipulate cells is already changing how biotech research is done. Invented by Berkeley Lights and developed with early input from Amgen, the technology has immediate applications and abundant long-term potential.

To make a biotech therapy, we need the machinery found inside living cells.

The challenge is that cells are both incredibly small and incredibly complex. It takes a lot of people, time, and equipment to engineer cells that can make new medicines.

I visited Berkeley Lights when it was a start-up company with just four people. They had a new technology that used light to manipulate individual cells.

It sounds simple, but it’s an absolutely transformative idea.

Amgen saw the potential and started working with Berkeley Lights to adapt the technology to the needs of biotech research.

Now, instead of needing tens of thousands of cells to produce one point of data, we can conduct experiments on single cells—with thousands of cells on a chip.

We can actually see how fast the cells are growing … how much antibody they produce … how effectively the antibodies bind to their targets and modify their biology.

This technology has changed how Amgen develops cell lines and searches for antibodies. Research that used to take weeks or months can be done in hours or days.

We’re working with Berkeley Lights to expand the range of experiments this tool can perform

In the long run, this technology will help us to solve complex problems that are too hard or expensive to solve with our current tools.

We’ll be able to search for those one-in-a-million cells that can make extraordinary medicines.

We’ll generate and analyze mountains of biological data, using artificial intelligence to show us why disease happens and how to prevent it.

This is a new scientific field — digital cell biology.

Thanks to some inspired engineering from Berkeley Lights, companies like Amgen are better equipped to find the breakthroughs that patients need.

The chip is roughly half the size of a credit card, but the action takes place in a stamp-sized glass enclosure set in the center. Through the glass, the unaided eye can detect narrow rows of parallel lines, which resolve, under magnification, into channels lined with thousands of miniscule pens. When the chip is in use, thousands of living cells flow into the channels, and single cells are encased inside boxes of light and gently escorted into the pens. The chip and its enabling technologies operate as a nanoscale laboratory, which can run a range of experiments that are normally done at a scale 50,000 times larger.

Welcome to the new frontier of digital cell biology, an emerging technology with immediate uses and abundant long-term potential. The chip and its related devices and software were invented by Berkeley Lights. The first company to embrace the new tool and apply it to biotech R&D was Amgen.

“I would say that it’s already a fairly big deal for us,” said Philip Tagari, Amgen’s VP for Therapeutic Discovery. “We’ve actually put this technology into practice in our antibody discovery work, and it takes about four months off the normal timeline. It’s also our standard method for cell line development, and we’re looking to extend our success in these areas to other applications. It’s starting to feel like a pretty transformative tool.”

In the near- to-medium term, digital cell biology offers scientists a faster and less resource-intensive way to run standard types of biotech experiments. In the long run, it has the potential to do for biology what sequencing did for genetics—make it possible to generate and analyze mountains of data to unravel the complexities of disease.

“I think we’re still very much at the tip of the iceberg in terms of what we can do with the technology and what people will discover by using it,” said Keith Breinlinger, chief technology officer for Berkeley Lights.

Cell-friendly optical tweezers

The science behind the platform was inspired by a laser-based technology known as “optical tweezers” which earned Arthur Ashkin a share of the 2018 Nobel Prize. Optical tweezers can be used to precisely manipulate a single bead or cell. Ming Wu, one of Berkeley Lights’ founders, was a professor at UCLA when he started to develop a new and greatly improved optical manipulation technique.

Ming’s new optoelectronic tweezers require about 10,000 times less power to manipulate micron-scale objects, which makes the technique suitable for manipulating living cells without damaging them. Whereas optical tweezers use a lensing effect to direct photons and push a cell toward the center of the laser beam, optoelectronic tweezers use light to activate photosensitive switches that create local dielectric forces that repels cells. And unlike optical tweezers this manipulation can be performed on hundreds or thousands of cells in parallel. As the two techniques use different physics and to avoid further confusion, Ming’s technique was renamed “OEP” or optoelectronic positioning.

When Tagari visited Berkeley Lights at the invitation of chief science officer, Kevin Chapman, a former colleague, he saw the platform’s potential in biotech R&D right away. “At that time, they had four people in a portable building by the water in Emeryville, California,” Tagari recalls. “In that first visit, we sketched out what Amgen would want from the technology. About three months later, we signed a milestone-driven collaboration, and Amgen started to work very closely with Berkeley Lights and educate them on the details of antibody discovery.”

― Marsela Jorgolli

While companies have been making antibody-based drugs for decades, the standard discovery methods are far from ideal. For starters, the immune system’s antibody-producing B cells are “terminally differentiated.” That means they don’t proliferate or live very long, which has made them impractical for antibody production. Scientists get around this problem by fusing B cells to myeloma cells to create durable hybridomas. While this approach works, it has drawbacks.

“With hybridoma fusion, you’re jamming two cells into one and saying, ‘I hope your DNA plays nice together,’” says Aaron Winters, a scientist in Amgen’s Therapeutic Discovery group. “In the best-case scenario, only one out of every 1,000 B cells survives that process. So right off the bat, your efficiency in antibody discovery is 0.1 percent.”

Once you create stable hybridomas, it can take weeks to grow the millions of cells needed to start searching for drug-like antibodies. That search involves a “step-by-step and labor-intensive process,” said Marsela Jorgolli, a scientist in Amgen’s Hybrid Modality Engineering group. “There are some great tools and technologies available, but they are all highly dedicated to one particular aspect of antibody discovery or engineering.” Scientists spend a lot of time pipetting cells into flasks or plates, and ferrying plates between different devices designed to provide one piece of a larger puzzle.

Results in days, not months

Jorgolli was part of a small team of scientists who served as a bridge between Amgen’s biologists and the Berkeley Lights engineers tasked with developing the platform’s capabilities. “We couldn’t just transfer our old procedures to the Berkeley Lights platform because the technologies are totally different,” she said. “We had to figure out how to tailor new procedures on the chip that would give us similar results, but much faster and more efficiently.”

Aaron Winters running antibody discovery assays on the Beacon® platform.

As the collaboration progressed, Amgen received the first full-scale prototype device in 2013 and the first commercial device, known as the Beacon® platform, in 2016. “Just before we shipped that first Beacon to Amgen in December, the entire company signed it,” Breinlinger recalls. “All our signatures are on it under the hood.

Many benefits of the platform envisioned at the outset have come to fruition. For starters, the chips can miniaturize and integrate experiments that are normally done on several different devices. You can quickly see which cells are making antibodies, if the antibodies bind to their target, and if that binding has the desired impact on the target’s biology. “We are getting the data we need in hours or days, rather than weeks or months,” said Jorgolli.

In addition, the chips eliminate the need to create and grow large numbers of hybridoma cells. In the Beacon’s scaled-down NanoPens™, individual antibody-secreting B cells can thrive long enough to generate useful data. Scientists can then snip out the antibody genes from the best B cells and put them into more durable cells. The top-performers provide the cell line used later to support large-scale clinical testing and manufacturing.

“So that’s what’s happening!”

The Berkeley Lights technology has become Amgen’s standard platform for cell line development, where it helps researchers to overcome the challenge of keeping cells happy. “Cells don’t like to be by themselves―they like to have friends around,” said Jennitte Stevens, a director in Amgen’s Process Development group. “They send out signals that help each other to grow. Dropping a cell into a 96-well plate is like dropping a person in an ocean. It takes weeks for them to get going again.” Cells prefer the cozier confines of NanoPens and grow better in that environment.

― Philip Tagari

Standard cell line development methods are also labor intensive. Hundreds of plates are needed to increase the odds of finding a good cell line. Every well in every plate must be visually inspected to ensure it holds one cell and one cell only. With the new technology, “we don’t have to carry stacks and stacks of plates and put them in the imager and stare at them because the software does this for us,” says Stevens. “It also allows us to see how well the cells are growing and how much antibody they are producing at a very early stage of clone development. We can see things we weren’t able to capture before, like cells with really high levels of productivity and other unique attributes.”

The ability to visualize biology is one of the tool’s most attractive features. “Normally when you conduct an experiment, you can’t see what is really happening,” said Breinlinger. “You mix some things together, you get a result, then you try to infer what has happened, but you can’t visualize it. With our technology, you can actually see the cells and say, ‘So that’s what’s happening!’ You can solve a problem on day one instead of taking months to figure out why an experiment isn’t working.”

While the Berkeley Lights technology is now in numerous research organizations, Amgen and Berkeley Lights have maintained their close collaborative relationship. The goal is to keep expanding the range of experiments the platform can support.

“At our user group meetings, Amgen scientists will show us new assays they’re doing that the Berkeley Lights team didn’t show them how to do—they just figured it out on their own,” said Breinlinger. “They might ask us to tweak our software to help them do it more efficiently. We’re constantly working closely with our customers to push the envelope.”

Single-cell experiments could yield new insights into the ability of individual T cells to fight cancer and guide the development of new immuno-oncology therapies.
Future applications

The technology could be especially useful in immuno-oncology, where the goal is often to prompt T cells to attack tumor cells. “In immunology, we talk about T cell fitness,” said John Ferbas, a director in Medical Science at Amgen. “How many T cells do you have that are even capable of killing tumor cells? That’s a difficult question, but with this type of platform, we can do single cell assays to better understand T cell fitness in general and in individual patients. We can actually get video of what’s going on and learn a lot in a short time.”

The platform could also speed up research into rare subtypes of immune cells that are hard to isolate in large quantities. “If you’ve collected 20,000 rare immune cells, that’s only enough for about 20 experiments using standard microplates,” Tagari noted. “On the chips, you could do a thousand or more experiments driven by the software and get insights into the function of these cells far more quickly.”

In the long run, the platform could address a bottleneck in the effort to translate genetic insights into new therapies. Human genetics can tell us which genes and proteins have a major impact on disease risk, while biology is needed to clarify the function of newly discovered proteins and how best to target them. However, while DNA sequencing technology has become much faster and cheaper, we haven’t seen an equivalent productivity surge in biology. Discerning a protein’s function remains a slow and pain-staking process that can take years.

Digital cell biology may offer a solution to this problem, especially if the power of artificial intelligence can be applied, said Tagari. “In the future, I can imagine a day when computer-designed experiments can look at a thousand different variables in thousands of individual cells on chips. This technology will eventually allow us to do very complicated, quantitative cell biology at an unprecedented scale.”


الملخص

Retrieving single cells of interest from an array of microwells for further off-chip analysis is crucial in numerous biological applications. To this end, several single cell manipulation strategies have been developed, including optical tweezers (OT). OT represent a unique approach for contactless cell retrieval, but their performance is often suboptimal due to nonspecific cell adhesion to the microwell surface. In this study, we focused on improving the surface chemistry of microwell arrays to ensure efficient single cell manipulation using OT. For this purpose, the surface of an off-stoichiometry thiol-ene-epoxy (OSTE+) microwell array was grafted with polyethylene glycol (PEG) molecules with different molecular weights: PEG 360, PEG 500, PEG 2000, and a PEG Mix (an equimolar ratio of PEG 500 and PEG 2000). Contact angle measurements showed that the PEG grafting process resulted in an increased surface energy, which was stable for at least 16 weeks. Next, cell adhesion of two cell types, baker’s yeast (خميرة الخميرة) and human B cells, to surfaces treated with different PEGs was evaluated by registering the presence of cellular motion inside microwells and the efficiency of optical lifting of cells that display motion. Optimal results were obtained for surfaces grafted with PEG 2000 and PEG Mix, reaching an average fraction of cells with motion of over 93% and an average lifting efficiency of over 96% for both cell types. Upon the integration of this microwell array with a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic channel, PEG Mix resulted in proper washing of non-seeded cells. We further demonstrated the wide applicability of the platform by manipulating non-responding yeast cells to antifungal treatment and B cells expressing surface IgG antibodies. The combination of the optimized microwell surface with continuous microfluidics results in a powerful and versatile platform, allowing high-throughput single cell studies and retrieval of target cells for off-chip analysis.


Artificial Life Forged in a Lab? Scientists Create Synthetic Cell That Grows and Divides Normally

Five years ago, scientists created a single-celled synthetic organism that, with only 473 genes, was the simplest living cell ever known. However, this bacteria-like organism behaved strangely when growing and dividing, producing cells with wildly different shapes and sizes.

Now, scientists have identified seven genes that can be added to tame the cells’ unruly nature, causing them to neatly divide into uniform orbs. This achievement, a collaboration between the J. Craig Venter Institute (JCVI), the National Institute of Standards and Technology (NIST) and the Massachusetts Institute of Technology (MIT) Center for Bits and Atoms, is described in the journal زنزانة.

Identifying these genes is an important step toward engineering synthetic cells that do useful things. Such cells could act as small factories that produce drugs, foods and fuels detect disease and produce drugs to treat it while living inside the body and function as tiny computers.

But to design and build a cell that does exactly what you want it to do, it helps to have a list of essential parts and know-how they fit together.

“We want to understand the fundamental design rules of life,” said Elizabeth Strychalski, a co-author on the study and leader of NIST’s Cellular Engineering Group. “If this cell can help us to discover and understand those rules, then we’re off to the races.”

A time lapse video showing cells of the synthetic organism JCVI-syn3A growing and dividing under a light microscope, from a research collaboration between the J. Craig Venter Institute, the National Institute of Standards and Technology and the Massachusetts Institute of Technology Center for Bits and Atoms. The scale bar represents 50 micrometers. Credit: E. Strychalski, NIST and J. Pelletier, MIT

Scientists at JCVI constructed the first cell with a synthetic genome in 2010. They didn’t build that cell completely from scratch. Instead, they started with cells from a very simple type of bacteria called a mycoplasma. They destroyed the DNA in those cells and replaced it with DNA that was designed on a computer and synthesized in a lab. This was the first organism in the history of life on Earth to have an entirely synthetic genome. They called it JCVI-syn1.0.

Since then, scientists have been working to strip that organism down to its minimum genetic components. The super-simple cell they created five years ago, dubbed JCVI-syn3.0, was perhaps too minimalist. The researchers have now added 19 genes back to this cell, including the seven needed for normal cell division, to create the new variant, JCVI-syn3A. This variant has fewer than 500 genes. To put that number in perspective, the بكتريا قولونية bacteria that live in your gut have about 4,000 genes. A human cell has around 30,000.

“We want to understand the fundamental design rules of life. If this cell can help us to discover and understand those rules, then we’re off to the races.” — Elizabeth Strychalski, a co-author on the study and leader of NIST’s Cellular Engineering Group

Identifying those seven additional genes took years of painstaking effort by JCVI’s synthetic biology group, led by co-author John Glass. Co-lead author and JCVI scientist Lijie Sun constructed dozens of variant strains by systematically adding and removing genes. She and the other researchers would then observe how those genetic changes affected cell growth and division.

NIST’s role was to measure the resulting changes under a microscope. This was a challenge because the cells had to be alive for observation. Using powerful microscopes to observe dead cells is relatively easy. Imaging live cells is much harder.

Holding these cells in place under a microscope was particularly difficult because they are so small and delicate. A hundred or more would fit inside a single بكتريا قولونية bacterium. Tiny forces can tear them apart.

A time lapse video showing cells of the synthetic organism JCVIsyn3.0 growing and dividing under a light microscope, from a research collaboration between the J. Craig Venter Institute, the National Institute of Standards and Technology and the Massachusetts Institute of Technology Center for Bits and Atoms. The scale bar represents 50 micrometers. Credit: E. Strychalski, NIST and J. Pelletier, MIT

To solve this problem, Strychalski and MIT co-authors James Pelletier, Andreas Mershin and Neil Gershenfeld designed a microfluidic chemostat — a sort of mini-aquarium — where the cells could be kept fed and happy under a light microscope. The result was stop-motion video that showed the synthetic cells growing and dividing.

This video shows JCVI-syn3.0 cells — the ones created five years ago — dividing into different shapes and sizes. Some of the cells form filaments. Others appear to not fully separate and line up like beads on a string. Despite the variety, all these cells are genetically identical.

This video shows the new JCVI-Syn3A cells dividing into cells of more uniform shape and size.

These videos and others like them allowed the researchers to observe how their genetic manipulations affected the cell growth and division. If removing a gene disrupted the normal process, they’d put it back and try another.

قال بيليتيير: "هدفنا هو معرفة وظيفة كل جين حتى نتمكن من تطوير نموذج كامل لكيفية عمل الخلية".

لكن هذا الهدف لم يتحقق بعد. من بين الجينات السبعة المضافة إلى هذا الكائن الحي من أجل الانقسام الطبيعي للخلايا ، يعرف العلماء ما يفعله اثنان فقط. الأدوار التي يلعبها الخمسة الآخرون في انقسام الخلايا غير معروفة بعد.

قال ستريشالسكي: "الحياة لا تزال صندوقًا أسود". ولكن مع هذه الخلية الاصطناعية المبسطة ، يلقي العلماء نظرة فاحصة على ما يجري في الداخل.


شاهد الفيديو: طريقة عمل قائمة منسدلة في الاكسل - Excel Data Validation (كانون الثاني 2022).