معلومة

ما هي المدة التي تحتفظ بها عينات Ziehl-Neelsen الملطخة؟


لقد حصلت على شرائح مرض السل من المركز الصحي في مدينتي والتي من المفترض أن البكتيريا سريعة التحمل (AFB) إيجابية. ومع ذلك ، عندما ألقيت نظرة عليه ، لم أجد في الأساس بقع كاربول فوشسين.

كانت مطوية بشكل فردي بدقة في الورق. عندما فتحتهم ، كانت البقع مبللة قليلاً بالزيت الغاطس ، متجهة لأسفل. حتى الآن ، جيد جدًا (الصفحة 6). تم إعلامي لاحقًا أنه تم تحضير هذه العينات الربع الأول 2019. بناءً على بحثي ، تدوم حلول التلوين نفسها حتى 12 شهرًا (صفحة 33). لا يمكنني العثور على أي بيانات حول المدة التي ستستغرقها عينة ملطخة.

هل يزيلون اللون بمرور الوقت؟ كنت أتوقع أن يكون AFB ساطعًا ، أو على الأقل ورديًا قليلاً ، لكنني لا أرى شيئًا من هذا القبيل. أرى عصيات ، على الرغم من أن جميعها شبه شفافة / ميثيلين زرقاء اللون.


هذه بعض الصور النموذجية. أول 2 هما كيف توقعت أن يبدو AFB ، في حين أن 2 التاليين هما ما التقطته (وأعتقد أنه يجب أن يحتوي على AFB). آخر الموافقة المسبقة عن علم هي شريحة معايرة 10um / div كمرجع.


قد تساعدك دراسة السل هذه: صفحة خارجية

باختصار ، استخدموا عينات عمرها من 6 إلى 19 شهرًا ذات جودة سيئة في الغالب (نظرًا لسنهم). ومع ذلك ، فإن الجملة الأخيرة من الاقتباس أدناه تبدو واعدة.

تم تخزين 12543 مسحة من البلغم المخزنة في المختبر المرجعي الوطني لمرض السل لمدة 6 إلى 19 شهرًا في درجة حرارة الغرفة في صندوق خشبي منزلق بدون غطاء. لقد فقد معظمهم البقعة التي تعكس الطلاء المضاد بأزرق الميثيلين. أعطى الاحتفاظ بـ 436 شريحة مشكوك فيها بواسطة ZN نتائج مخيبة للآمال طوال [...]

بعد 6 إلى 19 شهرًا من تخزين مسحات البلغم الملطخة بـ ZN في جو غير مكيف ، اختفى اللون الأحمر الساطع للبيض الناتج عن carbolfuchsin تقريبًا. [...] في مثل هذه الحالة ، يسمح ZN المتبقي من مسحات البلغم بإعادة اكتشاف AFB الذي تغير لونه.

عندما فعلت ذلك في المرة الأخيرة ، استخدمنا عينات حديثة عمرها بضعة أشهر والتي بدت مشابهة للصورة الأولى من صورك. فقط ألقِ نظرة على الجريدة ، على ما أعتقد.


قد يكون من المفيد رسم دائرة على الجانب السفلي من الشريحة باستخدام قلم تعليم الأواني الزجاجية في تحديد المنطقة التي ستعد فيها اللطاخة بوضوح. يمكنك أيضًا تسمية الشريحة بالأحرف الأولى من اسم الكائن الحي على حافة الشريحة. يجب الحرص على عدم ملامسة الملصق لكواشف التلوين.

  • معلقات بكتيرية في مرق: باستخدام حلقة مبردة معقمة ، ضع حلقة من ثقافة المرق على الشريحة. ينتشر عن طريق الحركة الدائرية لحلقة التلقيح بقطر حوالي سنتيمتر واحد. قد يؤدي الانتشار المفرط إلى تعطيل الترتيب الخلوي. ستسمح اللطاخة المرضية بفحص الترتيب الخلوي النموذجي والخلايا المعزولة.
  • ثقافات الصفائح البكتيرية: باستخدام حلقة مبردة معقمة ، ضع قطرة من الماء المعقم أو محلول ملحي على الشريحة. عقم الحلقة وقم بتبريدها مرة أخرى والتقط عينة صغيرة جدًا من مستعمرة بكتيرية وحركها برفق في قطرة الماء / المحلول الملحي على الشريحة لإنشاء مستحلب.
  • عينات المسحة: لف المسحة على السطح النظيف لشريحة زجاجية.

يرجى الملاحظة: من المهم جدًا منع تحضير مسحات كثيفة كثيفة تحتوي على فائض من العينة البكتيرية. تقلل اللطاخة السميكة جدًا من كمية الضوء التي يمكن أن تمر من خلالها ، مما يجعل من الصعب تصور شكل الخلايا المفردة. تتطلب المسحات عادة كمية صغيرة فقط من الثقافة البكتيرية. تظهر اللطاخة الفعالة كطبقة بيضاء رقيقة أو غشاء بعد التثبيت الحراري.


ما هي المدة التي تحتفظ بها عينات Ziehl-Neelsen الملطخة؟ - مادة الاحياء

باراسيتول لاتينوام 61: 117 - 120 ، 2006 FLAP

الكشف عن كريبتوسبوريديوم البويضات بواسطة طرق تلطيخ الأورامين و Ziehl Neelsen

ROSIL & EacuteIA M. DE QUADROS * و SANDRA M. T.Markes ** و CAMILA R. AMENDOEIRA * و LARISSA A. DE SOUZA * و PAULA R.

* Departamento de Ci & ecircncias Biol & oacutegicas e da Sa & uacutede، Faculdade de Biologia، Universidade do Planalto Catarinense، Lages، Santa Catarina، Brasil.
** Laborat & oacuterio de Protozoologia، Faculdade de Medicina Veterin & aacuteria، Universidade Federal do Rio Grande do Sul، Porto Alegre، Rio Grande do Sul،
البرازيل.

كريبتوسبوريديوم spp هو أحد مسببات الأمراض المعوية الشائعة لدى الحيوانات والبشر. قد يكون له تأثير اقتصادي مهم على المزارع ويسبب عدوى حيوانية المصدر محتملة. جمعت عينات البراز من 331 حيوانا أليفا (81 بقرة ، 50 ضأن ، 100 خنزير و 100 كلب) وفحصت لوجودها. كريبتوسبوريديوم البويضات عن طريق طرق تلطيخ Ziehl Neelsen والأورامين. تم العثور على معدل إيجابي إجمالي 7.5٪ (25/331) ، بمعدلات 10٪ (10/100) بين الكلاب و 18.5٪ (15/81) بين الأبقار. تم اختبار براز الأغنام والخنازير سلبية. في الأبقار ، تم الكشف عن 15 و 12 عينة موجبة باستخدام تقنيات تلطيخ الأورامين وزيل نيلسن ، على التوالي ، مع عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين الطريقتين. في الكلاب ، تم العثور على نفس العدد من العينات الإيجابية بكلتا الطريقتين.

الكلمات الأساسية: خفية الأبواغ، الحيوانات الأليفة ، الأورامين ، طريقة Ziehl Neelsen.

أعضاء الجنس كريبتوسبوريديوم هي كائنات حقيقية النواة ، بما في ذلك الطفيليات الملتزمة وداخل الخلايا. كريبتوسبوريديوم دورة حياة معقدة ، بما في ذلك التكاثر الجنسي واللاجنسي ، ودورة العدوى الذاتية ، والقدرة على إكمال تطورها داخل مضيف واحد. شكل ناقل الحركة عبارة عن بيض قوي ومقاوم للبيئة ، يُفرز في البراز ، ويمكن أن يتواجد لفترات طويلة في البيئة. نظرًا لأن الحيوانات ، ولا سيما الماشية المستأنسة ، هي مضيفها الأساسي ، فإن العدوى البشرية عادةً ما تكون حيوانية المصدر 1. الأشخاص الأكثر تعرضًا للخطر هم البالغين والأطفال الذين يعانون من نقص المناعة ، وخاصة المصابين بالإيدز ، والأطفال في دور الرعاية النهارية ، والمسافرين إلى المناطق الموبوءة ، وعمال مزارع الألبان أو الماشية أو عائلاتهم أو جهات الاتصال بهم ، والمخالطين المنزليين للحالات أو الناقلين ، وربما أصحاب الكلاب المصابة أو القطط أو جيرانها 2-4.

الجنس كريبتوسبوريديوم يشمل 13 نوعًا تعتبر صالحة حاليًا ، موزعة بين الثدييات المنزلية والبرية والطيور والزواحف والأسماك. تم العثور على أنواع أخرى مميزة شكليًا في الأسماك والزواحف والطيور والثدييات ، ولكن لم يتم تسميتها 5. خمسة كريبتوسبوريديوم الأنواع (C. بارفوم، ج. الهومينيس، ج. كانيس، ج. ميليجريديس وج..felis ) هي العوامل المسببة للعدوى لدى البشر 6.

جيم بارفوم هو عامل ممرض حيواني المنشأ يتكون من طرز وراثية متميزة وراثيا ولكنها متطابقة شكليا. على الرغم من الدراسات واسعة النطاق كريبتوسبوريديوم تم إجراء عدوى للكلاب في العديد من البلدان ، ولم يتم تحديد العزلات بدقة بسبب عدم وجود طريقة للتحليل الجزيئي. من المهم تحديد العزلات المأوى في الكلاب ، والتي تكون على اتصال وثيق مع البشر ، من أجل السيطرة على كريبتوسبوريديوسيس البشري 7 ، 8.

تعتبر القطط مصدرًا لداء الكريبتوسبوريديوس عند البشر ، بغض النظر عما إذا كانوا يعانون من نقص المناعة أم لا ، ومع ذلك ، تم وصف حالة بشرية واحدة فقط ، حيث C. فيليس تم التعرف عليه باستخدام الطريقة الجزيئية 9.

في الخنازير انتشار كريبتوسبوريديوم بارفوم تم التحقيق في جميع أنحاء العالم ، تتراوح من 1 إلى 33٪ 10 ، وتم العثور على المعدلات التالية: ألمانيا (1.4٪) ، إسبانيا (21.9٪) ، اليابان (33.2٪) كندا (11٪) ، الولايات المتحدة (7.1٪) 11 ، 12. الإسهال قبل الفطام ، الناجم عن مجموعة من الكائنات الأولية بما في ذلك إيسوسبورا سويس و كريبتوسبوريديوم النيابة. ، لا تزال مشكلة رئيسية في الخنازير في جميع أنحاء العالم 13. ومع ذلك ، نظرًا لأوجه القصور في التشخيصات التقليدية ، لا يُعرف الكثير عن انتشار وأهمية كريبتوسبوريديوم في الخنازير 14.

وهو أحد الأسباب الرئيسية للإسهال عند حديثي الولادة في المجترات ، في الأبقار والأغنام والغزلان 15 والماعز 16 ، 17. كريبتوسبوريديوم قد تسبب العدوى في الثروة الحيوانية تأثيرًا اقتصاديًا مهمًا على المزارعين بسبب ارتفاع معدلات الإصابة بالأمراض وأحيانًا معدلات الوفيات المرتفعة بين حيوانات المزرعة 18 ، كما أن المرض موثق جيدًا. نسبيًا ، هناك معلومات أقل عن حدوث داء الكريبتوسبوريديوس في الأغنام والماعز ، على الرغم من أن العدوى شائعة في هذه الحيوانات مع معدلات انتشار تختلف من بلد إلى آخر ، وغالبًا ما تسبب الموت في الحملان 12،17،19-21.

تم إجراء القليل من الدراسات على الكلاب ، وتم إثبات معدل انتشار قدره 9.7٪ لداء خفيات الأبواغ بين الكلاب الكورية أثناء مراقبة مصادر التلوث البيئي 22 ومعدل 9.3٪ بين الكلاب في أوساكا باليابان 8. باستخدام الطريقة الجزيئية ، حدد المؤلفون جميع العزلات على أنها C. canis. كشفت دراسة أجريت في S & atildeo Paulo ، البرازيل ، عن معدل انتشار قدره 6.8٪ لداء خفيات الأبواغ بين كلاب الشوارع 23 و 2.41٪ في ريو دي جانيرو 24.

أجريت الدراسة الحالية للتحقق من حالة داء الكريبتوسبوريديوس في الأبقار والأغنام والخنازير والكلاب في المناطق الريفية والحضرية في لاجيز ، ولاية سانتا كاتارينا ، جنوب البرازيل ، باستخدام طريقتين تشخيصيتين.

من بين 331 عينة براز ، تم جمع 81 عينة من أبقار مُدارة على نطاق واسع ، و 50 عينة من أغنام رعي حرة ، و 100 عينة من خنازير مزروعة بشكل مكثف ، و 100 من كلاب مملوكة في لاجيز ، ولاية سانتا كاتارينا ، البرازيل. من بين الأبقار ، 32 كانت أصغر من 12 شهرًا (17 أنثى و 15 ذكرًا) و 49 أنثى كانت حتى 12 شهرًا. من بين الكلاب 40 من الإناث و 60 من الذكور ، سواء كانوا من الشباب أو البالغين ، وجميعهم يعيشون في ضواحي المنطقة الحضرية. من بين الخنازير ، كان هناك 80 خنزير و 12 ذكورًا ، ذكر واحد أكبر من 12 شهرًا و 7 ذكور تصل أعمارهم إلى 12 شهرًا. ومن بين الأغنام ، 49 نعجة وكبش واحد ، كلهم ​​أكبر من 12 شهرًا.

تم جمع العينات من الشرج لكل حيوان باستخدام قفازات اللاتكس المتاح. تم تقديم العينات لترسيب البويضات عن طريق الطرد المركزي ، حيث تم تثبيت الرواسب بالميثانول لمدة 5 دقائق ثم استخدامها لإجراء التلطيخ. تم تلطيخ العينات على شرائح زجاجية وتلطيخها باستخدام تقنيات Ziehl Neelsen و auramine المعدلة 25،26.

تم فحص العينات الملطخة بتقنية Ziehl Neelsen تحت المجهر الضوئي (1،000 X). تم تحليل المسحات الملطخة بالأورامين بواسطة الفحص المجهري الفلوري ، بعد فحص سابق (100 X) وتأكيد لاحقًا (400 X).

تم استخدام اختبار فيشر الدقيق (برنامج Graphpad ، الإصدار 2.04) للمقارنة بين طريقتين التشخيص. اعتبر احتمال خطأ ألفا أقل من 5٪ (p & lt 0.05) ذو دلالة إحصائية.

نتائج ومناقشة

بلغ معدل الإيجابية الكلية 7.5٪ بين 331 عينة براز تم فحصها كريبتوسبوريديوم ص. أظهرت المقارنة بين الطريقتين أن 25 (7.5٪) و 22 (5.7٪) عينة كانت موجبة لطريقتي الأورامين وزيل-نيلسن على التوالي.

من 100 عينة براز تم جمعها من الكلاب كانت 10 (10٪) موجبة ، خمس عينات في الإناث وخمس عينات من ذكور الحيوانات. عندما تم تقييم هذه الحيوانات حسب العمر ، كريبتوسبوريديوم س. وجد في 4 (40٪) كلاب أصغر من 12 شهرًا وفي 6 (60٪) كلاب بالغة. نسبة الإصابة 10٪ التي لوحظت تتفق مع المؤلفين الآخرين 8،23.

من بين 15 عينة برازية من الأبقار التي ثبتت إصابتها بداء الكريبتوسبوريديوس ، 7 (46.6٪) تنتمي إلى الثيران و 8 (53.3٪) للأبقار. من حيث العمر ، لوحظت نتائج إيجابية في 12 (80٪) من الماشية الأصغر من 12 شهرًا وفي 3 (20٪) من الماشية أكبر من 12 شهرًا.

اكتشف الأورامين 25 (100٪) عينة موجبة ، في حين اكتشفت طريقة Ziehl-Neelsen 22 (80٪) عينة إيجابية ، مع عدم وجود فرق معتد به إحصائياً.

عينات البراز التي تم جمعها من الاغنام والخنازير كانت سالبة كريبتوسبوريديوم بيض.

يتم استخدام العديد من الطرق ، بما في ذلك التعويم والترسيب ، للكشف عن كريبتوسبوريديوم ومع ذلك ، لا تظهر أي من الطريقتين أي فرق 2. لدى Auramine تقارب أكبر لـ كريبتوسبوريديوم جدار البويضة من fuchsin ، صبغة حمراء تستخدم في تقنية Ziehl Neelsen التلوين 25. البويضات الملطخة بالأورامين تتحمل تغير اللون لمدة 5 دقائق ، لكن البويضات الملطخة بتقنية Ziehl Neelsen تظهر تغيرًا كاملاً في نفس الإطار الزمني. يتميز تلطيخ Auramine بمزايا أكثر من طريقة Ziehl Neelsen ، أي أنه أسرع في الأداء والقراءة ، ومثالي للدراسات السكانية. يمكن للشرائح الملطخة ، إذا كانت محمية من الضوء ، أن تدوم لأشهر ، ويمكن تلطيخها لاحقًا بتقنية Ziehl Neelsen.

ربما تعكس نتائج التوزيع العمري في هذه الدراسة تحيزًا بسبب الهيكل السكاني المنحرف تجاه الحيوانات المسنة في المناطق الريفية والحضرية في مدينتنا. يُقترح أن يكون الاتصال المباشر بالحيوانات المصابة وسيلة مهمة لانتقال العدوى كريبتوسبوريديوم، والتي من المحتمل أن تكون موجودة في كل قطيع من الأبقار الداجنة في العالم مع عدوى بدون أعراض وإفراز طويل للبيض عن طريق الماشية المعترف بها كمصدر رئيسي ومستمر للتلوث البيئي 27،3.

13 على الأقل كريبتوسبوريديوم الأنواع المعترف بها حاليًا ، وهذا يعتمد على التنميط الجيني وعلى عدد محدود من تجارب الإرسال. جيم بارفوم من المعروف مؤخرًا أن لديه العديد من الأنماط الجينية المختلفة مثل النمط الجيني 1 ، الموجود حصريًا في البشر وعدد قليل من الرئيسيات الأخرى ، والنمط الجيني 2 ، الموجود في معظم الثدييات ، بما في ذلك البشر 27 على الرغم من C. hominis، الموجودة حصريًا في البشر ، تم وصفها جيدًا 5،28.

أظهر المسح الحالي ذلك كريبتوسبوريديوم تعد عدوى العجول مهمة وأن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لإظهار أهميتها النسبية ، خاصة في متلازمة الإسهال الوليدي.

لم نقم بتقييم النمط الجيني لـ جيم بارفوم في حيوانات هذه الدراسة. ستكون الدراسات المستقبلية ضرورية للتحقق من حالة إصابة هذه الحيوانات. يشير المعدل الإيجابي في الأبقار والكلاب إلى أن هذه الحيوانات يمكن أن تكون مصدرًا للعدوى البشرية. لأن جيم بارفوم هو أحد مسببات الأمراض الرئيسية المنقولة عن طريق المياه ، يجب التحقق من تلوث المياه لحماية الصحة العامة من مخاطر انتقال العامل الممرض.

بالإضافة إلى ذلك ، تسلط هذه النتائج الضوء أيضًا على أهمية التحقيق في إمكانية أن تعمل الحيوانات الأخرى أيضًا كمضيفين في المستودعات كريبتوسبوريديوم.

1.- CACCIO S M. طرق جديدة لتشخيص كريبتوسبوريديوم و الجيارديا. علم الطفيليات 2004 46: 151-5. [& # 160 روابط & # 160]

2.- DUBEY J P، SPEER C A، FAYER R. Cryptosporidiosis للإنسان والحيوان. مطبعة CRC ، 1990 ، 199 ص. [& # 160 روابط & # 160]

3.- YU J R ، LEE J K ، SEO M ، وآخرون. انتشار خفيات الأبواغ بين القرويين والحيوانات الأليفة في العديد من المناطق الريفية في كوريا. كوري J Parasitol 2004 42: 1-6. [& # 160 روابط & # 160]

4.- NYDAM D V ، LINDERGARD G ، SANTUCCI F ، وآخرون. خطر الإصابة بالعدوى كريبتوسبوريديوم بارفوم وكريبتوسبوريديوم هومينيس في أبقار الألبان في مستجمعات المياه في مدينة نيويورك. عامر J Vet Res 2005 66: 413-7. [& # 160 روابط & # 160]

5.- XI & AtildeO L، FAYER R، RYAN U، UPTON S. كريبتوسبوريديوم التصنيف: التطورات الحديثة والآثار المترتبة على الصحة العامة 2004 17: 72-97. [& # 160 روابط & # 160]

6.- GOMEZ-COUSO H ، M & EacuteNDEZ-HERMIDA F ، ARES-MAZ & AacuteS E. مستويات الكشف عن كريبتوسبوريديوم بيض الكيسات في بلح البحر (Mytilus galloprovincialis) ذ طرق IFA و PCR. Vet Parasitol 2006140: 44-53. [& # 160 روابط & # 160]

7.- TAN J S. الأمراض الحيوانية المنشأ التي تنتقل عن طريق الكلاب والقطط. Arch Int Med 1997157: 1933-43. [& # 160 روابط & # 160]

8.- ABE N ، SAWANO Y ، YAMADA K ، وآخرون. كريبتوسبوريديوم إصابة الكلاب في أوساكا باليابان. بيطري باراسيتول 2000108: 185-93. [& # 160 روابط & # 160]

9.- FAYER R، SANTIN M، TROUT J M، DU EY J P. Detection of خفية الأبواغ فيليس و الجيارديا الاثني عشرية تجميع F في مستعمرة القطط. Vet Parasitol 2006140: 44-53. [& # 160 روابط & # 160]

10.- مادوكس - هيتل سي ، لانغ كاير آر ، إنيمارك إتش إل ، فيجر إتش. كريبتوسبوريديوم و الجيارديا في مختلف الفئات العمرية من الأبقار والخنازير الدنماركية. حدوث وإدارة عوامل الخطر المرتبطة. Vet Parasitol 2006141: 48-59. [& # 160 روابط & # 160]

11.- QUILEZ J ، SANCHEZ-ACEDO C ، CLAVEL A ، وآخرون. انتشار كريبتوسبوريديوم العدوى في الخنازير في أراغ وأتيلدن (شمال شرق إسبانيا). Vet Parasitol 1996 67: 83-8. [& # 160 روابط & # 160]

12.- OLSON M E ، THORLAKSON C L ، DESELLIERS L ، وآخرون. الجيارديا و كريبتوسبوريديوم في حيوانات المزرعة الكندية. Vet Parasitol 1997 68: 375-81. [& # 160 روابط & # 160]

13.- DRIESEN S J، CARTLAND P G، FAHY V A. دراسات حول الإسهال قبل الفطام. Aust Vet J 1993 70: 259-62. [& # 160 روابط & # 160]

14.- ريان يو إم ، ساماراسينغهي ب ، اقرأ سي ، وآخرون. تحديد الرواية كريبتوسبوريديوم التركيب الوراثي في ​​الخنازير. تطبيق Env Microbiol 2003 69: 3970-4. [& # 160 روابط & # 160]

15.- FAYER R، TROUT J M، GRACZYK T K، LEWIS E J. انتشار كريبتوسبوريديوم, الجيارديا و ايميريا العدوى في الماشية بعد الفطام والماشية البالغة في ثلاث مزارع في ولاية ماريلاند. بيطري باراسيتول 2000 93: 103-12. [& # 160 روابط & # 160]

16.- KOUDELA B ، JIRI V. كريبتوسبوريديوسيس التجريبية عند الأطفال. Vet Parasitol 1997 71: 273-81. [& # 160 روابط & # 160]

17.- MAJEWSKA A C، WERNER A، SULINA P، LUTY T. انتشار كريبتوسبوريديوم في الأغنام والماعز تمت تربيتها في خمس مزارع في المنطقة الغربية الوسطى من بولندا. Vet Parasitol 2000 89: 269-75. [& # 160 روابط & # 160]

18.- CASEMORE D P، WRIGHT S E، COOP R L. Cryptosporidiosis - علم الأوبئة البشرية والحيوانية. في: FAYER، R. (Ed.)، كريبتوسبوريديوم و Cryp-tosporidiosis. مطبعة CRC ، بوكا راتون ، فلوريدا ، 1997 ص 65-92. [& # 160 روابط & # 160]

19.- VIEIRA L S ، SILVA M B ، TOLENTINO A C ، وآخرون. تفشي خفيات الأبواغ في ماعز الألبان في البرازيل. بيطري Rec 1997 140: 427-8. [& # 160 روابط & # 160]

20.- CAUSAPE A C ، QUILEZ J ، S & AacuteNCHEZ-ACEDO C ، وآخرون. انتشار وتحليل عوامل الخطر المحتملة ل كريبتوسبوريديوم بارفوم إصابة الحملان في سرقسطة (شمال شرق إسبانيا). Vet Parasitol 2002104: 287-98. [& # 160 روابط & # 160]

21.- تشالمرز آر إم ، إلوين ك ، ريلي دبليو جي ، وآخرون. كريبتوسبوريديوم في حيوانات المزرعة: اكتشاف رواية عزل في الأغنام. Int J Parasitol 2002 32: 21-6. [& # 160 روابط & # 160]

22.- KIM J T، WEE S H، LEE C G. Detection of كريبتوسبوريديوم البويضات في عينات براز الكلاب عن طريق مقايسة التألق المناعي. كوري J Parasitol 1998 36: 147-9. [& # 160 روابط & # 160]

23.- OLIVEIRA-SEQUEIRA T C G ، AMARANTE A F T ، FEREIRA T D ، NUNES L C. انتشار الطفيليات المعوية في الكلاب من S & atildeo Paulo State ، البرازيل. Vet Parasitol 2002103: 19-27. [& # 160 روابط & # 160]

24.- HUBER F، BOMFIM T C، GOMES R S. مقارنة بين العدوى الطبيعية بواسطة كريبتوسبوريديوم ص. ، الجيارديا ص. في كلاب في حالتين معيشيتين في المنطقة الغربية من بلدية ريو دي جانيرو. بيطري باراسيتول 2005130: 69-72. [& # 160 روابط & # 160]

25.- TABOADA J L، CREGO A M، CASAL J F، CRUZ A L. كريبتوسبوريديوم، Un Protozoo Asociado Al Sida. سانتياغو دي كومبوستيلا ، 1993 ، 126 ص. [& # 160 روابط & # 160]

26. - كوادروس آر إم دي. أوكور و ecircncia دي كريبتوسبوريديوم (TYZZER، 1907) دكتادا بيلو إم آند إيكوتيتودو دي إمونوفلوريسك وإيركنسيا أتراف وإيكوتيس دا تي آند إيكوتكنيكا دي كولورا وكسيدل وأتيلديو دي أورامينا إم بوفينوس دي بروبريداديس رورايس دو مونيك آند إيكوتبيو دي لاجز (SC) ، برازيل. Disserta & ccedil & atildeo de mestrado، 2002. FAVET / UFRGS، Porto Alegre، RS، 53 p. [& # 160 روابط & # 160]

27.- TZIPORI S، WARD H. Cryptosporidiosis: علم الأحياء ، الإمراضية والمرض. ميكروب إنف 2002 4: 1047-58. [& # 160 روابط & # 160]

28.- NEVES D P، MELO A L، LUNARDI P M، VITOR R W A. Parasitologia Humana، 11. ed.، Atheneu، S & atildeo Paulo 2005 19: 173-9. [& # 160 روابط & # 160]

المؤلف المراسل:

ساندرا إم. ماركيز. بريد إلكتروني: [email protected]
Faculdade de Medicina Veterin & aacuteria، Universidade Federal do Rio Grande do Sul، Av. Bento Gon & ccedilalves 9090، CEP: 91540-000 Porto Alegre، RS، Brasil. الفاكس: +55 51 33167305.

/> Todo el contenido de esta revista، excepto dónde está identificado، está bajo una Licencia Creative Commons


بقعة Ziehl-Neelsen عالية الكفاءة: التحديد من جديد المتفطرة السلية داخل الخلايا وتحسين الكشف عن مرض السل خارج الخلية في السائل الدماغي النخاعي

الشكل 1 مقارنة بين صبغة Ziehl-Neelsen (ZN) التقليدية والمعدلة لعينات CSF من مرضى التهاب السحايا السلي. (A و B) تُظهر البقعة التقليدية البنية الخلوية التالفة (A) وتجمعات الخلايا (B). لم يلاحظ أي عصيات سريعة الحمض داخل الخلايا (AFB) بالطريقة التقليدية. (ج) الطريقة المعدلة يمكن أن تركز AFB في CSF. كثيرا ما يتم ملاحظة AFB داخل الخلايا في العدلات (D) ، وحيدات (E) ، والخلايا الليمفاوية (F). تظهر الأسهم AFB سريع الصبغة الحمضي. تُظهر الأشكال الداخلية طرق عرض تكبير أعلى لـ AFB أو الخلايا المشار إليها بواسطة الأسهم. أشرطة مقياس ، 20 (A إلى F) و 5 ميكرومتر (داخلي). الشكل 2 التوزيع داخل الخلايا لـ AFB في العدلات والوحيدات على صبغة Ziehl-Neelsen المعدلة. يُظهر وضع العلامات المزدوجة لـ AO (A و E ، أخضر) مع CD11b (B ، أحمر) و ED1 (F ، أحمر) الموقع داخل الخلايا لـ AFB في العدلات (A إلى D) و monocytes (E إلى H). AO ، CD11b ، و ED1 تسمية AFB ، العدلات ، وحيدات ، على التوالي. النوى ملطخة بواسطة Hoechst 33342 (أزرق). تعرض اللوحات D ′ و D ″ و H و H مناظر تكبير أعلى للوحات D و H في ض توقعات المحور. أشرطة مقياس ، 20 (A إلى H) و 5 ميكرومتر (D ′ ، D ″ ، H ′ ، و H). الشكل 3 التوزيع داخل الخلايا لـ AFB في الخلايا الليمفاوية على صبغة Ziehl-Neelsen المعدلة. يُظهر وضع العلامات المزدوجة لـ AO (A و D ، أخضر) مع CD3 (B ، أحمر) و CD20 (E ، أحمر) الموقع داخل الخلايا لـ AFB في الخلايا الليمفاوية (C و F). النوى ملطخة بواسطة Hoechst 33342 (أزرق). شريط النطاق ، 5 ميكرومتر.
مجموعة ABF (ن) النسبة المئوية (عدد العينات الموجبة) لكل تقنية
صبغة ZNصبغة ZN المعدلة
خارج الخلية (48)16.7 (8)100 (48)
داخل الخلايا (48)0 (0)93.8 (45)
الشكل 4 مقارنة الحقول الإيجابية لـ AFB بواسطة صبغة Ziehl-Neelsen التقليدية (CZN) والمعدلة (MZN). تمت ملاحظة ثلاثمائة حقل في كل شريحة من 48 عينة من السائل الدماغي النخاعي. بالمقارنة مع صبغة ZN ، التي لا تكشف عن وجود حقول إيجابية داخل الخلايا ، فإن صبغة ZN المعدلة تحدد بالتأكيد AFB داخل الخلايا المناعية. علاوة على ذلك ، تكشف البقعة المعدلة عن المزيد من الحقول الموجبة خارج الخلية AFB مقارنة بصبغة ZN التقليدية.

البقع الحمضية السريعة

التلوين السريع للحمض هو أسلوب آخر شائع الاستخدام للتلوين التفاضلي يمكن أن يكون أداة تشخيصية مهمة. ان بقعة سريعة الحموضة قادر على التفريق بين نوعين من الخلايا موجبة الجرام: تلك التي تحتوي على أحماض فطرية شمعية في جدرانها الخلوية ، وتلك التي لا تحتوي عليها. طريقتان مختلفتان للتلوين السريع الحمضي هما تقنية Ziehl-Neelsen و ال تقنية كينيون. كلاهما يستخدم كاربولفوشين كالبقعة الأساسية. تحتفظ الخلايا الشمعية سريعة الحموضة بالكاربولفوكسين حتى بعد استخدام عامل إزالة اللون (محلول كحول حمضي). ثم يتم تطبيق صبغة ثانوية ، وهي الميثيلين الأزرق ، والتي تجعل الخلايا غير سريعة الحمض زرقاء.

يتمثل الاختلاف الأساسي بين الطريقتين المستندة إلى الكربولفوشين في ما إذا كانت الحرارة تستخدم أثناء عملية التلوين الأولية. تستخدم طريقة Ziehl-Neelsen الحرارة لبث carbolfuchsin في الخلايا سريعة الحموضة ، بينما لا تستخدم طريقة Kinyoun الحرارة. كلتا الطريقتين أدوات تشخيصية مهمة لأن عددًا من الأمراض المحددة ناتجة عن البكتيريا سريعة الحمض (AFB). في حالة وجود AFB في عينة الأنسجة ، يمكن رؤية لونها الأحمر أو الوردي بوضوح مقابل الخلفية الزرقاء لخلايا الأنسجة المحيطة (الشكل 5).

استخدام المجهر لتشخيص مرض السل

الشكل 5. جعل تلطيخ Ziehl-Neelsen خلايا Mycobacterium tuberculosis حمراء ومؤشر النمو المحيط باللون الأزرق المتوسط. (الائتمان: تعديل العمل من قبل الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة)

السل الفطري، البكتيريا المسببة مرض السل، يمكن اكتشافه في عينات بناءً على وجود عصيات مقاومة للحموضة. في كثير من الأحيان ، يتم تحضير مسحة من عينة من بلغم المريض ثم يتم صبغها باستخدام تقنية Ziehl-Neelsen (الشكل 5). إذا تم تأكيد البكتيريا المقاومة للأحماض ، فإنها تُزرع عمومًا لتحديد هوية إيجابية. يمكن استخدام الاختلافات في هذا النهج كخطوة أولى في تحديد ما إذا كان مرض السل أو غيرها من البكتيريا المقاومة للأحماض موجودة ، على الرغم من أن عينات من أماكن أخرى في الجسم (مثل البول) قد تحتوي على أنواع أخرى المتفطرة محيط.

نهج بديل لتحديد وجود مرض السل هو تألق مناعي. في هذه التقنية ، ترتبط الأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلوروكروم مرض السل، إذا كان موجودا. يمكن استخدام الأصباغ الفلورية الخاصة بالأجسام المضادة لعرض البكتيريا الفطرية باستخدام مجهر مضان.

فكر في الأمر


المنع

الشكل 3. يقلل استخدام عوامل الحجب القائمة على البروتين من تلطيخ غير محدد.

إذا كنت ستستخدم الأجسام المضادة لتسمية الهياكل في الخلايا الثابتة والمتفجرة ، فإن استخدام محلول مانع قبل خطوة الجسم المضاد الأولية يمكن أن يكون مفيدًا. عادةً ما يتم إجراء الحظر بمحلول يحتوي على فائض من البروتين يعمل على تقليل كمية الارتباط غير المحدد في عينتك. يمكن أن يكون هذا مهمًا إذا كان لدى الجسم المضاد الأساسي أو الثانوي ميلًا للتفاعل مع جزيئات في العينة ليست هدفك. إن تقليل تلطيخ الخلفية غير المحدد ، على الأرجح بسبب التفاعلات الكارهة للماء بين الجسم المضاد والجزيئات غير المستهدفة ، سيسهل عليك تحديد إشارة إيجابية وسيمنحك نتيجة نهائية أنظف.

أكثر أنواع حلول الحجب شيوعًا لـ ICC هي 3٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر في برنامج تلفزيوني و / أو محلول 10٪ (حجم / حجم) من مصل خاص بالأنواع المعطلة بالحرارة في برنامج تلفزيوني ، حيث تتطابق أنواع المصل أنواع الجسم المضاد الثانوي. على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم جسمًا مضادًا ثانويًا من نوع IgG مضاد للفأر ، فاختر مصل الفئران العادي المعطل بالحرارة لصنع كاشف الحجب.

الشكل 4. تساعد عوامل الحجب القائمة على البروتين في تقليل تلطيخ غير محدد. الأجسام المضادة قادرة على إزاحة البروتينات المعوقة لتشكيل رابطة عالية التقارب مع حواتمها ، بينما يمنع منع البروتينات تفاعلات الأجسام المضادة منخفضة التقارب في مكان آخر من العينة.

ستحتاج إلى احتضان عينتك في محلول مانع لمدة 60 دقيقة على الأقل ، ولكن يمكن أيضًا تركها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة أو في الثلاجة. بمجرد الانتهاء من خطوة المنع ، إذا كنت لا تنوي استخدام الأجسام المضادة ، فمن المهم إزالة محلول المنع الزائد عن طريق الغسل باستخدام برنامج تلفزيوني.

قد يكون من الصعب معرفة أين حدث خطأ ما في عملية متعددة الخطوات ، والتألق المناعي ليس استثناءً. الأسباب الأكثر احتمالا لسوء النتيجة في التألق المناعي هي الجسم المضاد الأولي (سواء النوع و / أو التركيز) أو الجسم المضاد الثانوي (التركيز). راجع تصنيف الجسم المضاد للحصول على اقتراحات حول عناصر التحكم التجريبية لمساعدتك في تحسين نتائجك.


حلول مجهرية لعلم الأنسجة وعلم التشريح المرضي

يهدف علم الأمراض أو علم الأنسجة أو علم الأنسجة إلى دراسة مظاهر المرض عن طريق الفحص المجهري لتشكل الأنسجة. في علم الأمراض ، عادة ما تكون العينة التي يتم فحصها تحت المجهر نتيجة لعملية جراحية أو خزعة أو تشريح بعد التثبيت والمسح / التضمين وتقطيع عينة الأنسجة. بدلاً من ذلك ، تتم معالجة القسم المجمد باستخدام ناظم البرد عند الحاجة إلى نتائج سريعة (على سبيل المثال أثناء الجراحة) أو قد يكون التثبيت ضارًا بالبنى المستهدفة مثل الدهون أو مستضدات معينة. عادةً ما يتم تقطيع أقسام الأنسجة بعد التثبيت ودمج الشمع إلى شرائح رفيعة من 2 إلى 5 ميكرون مع مبضع قبل التلوين ونقلها إلى شريحة زجاجية لفحصها باستخدام مجهر ضوئي. العينات النموذجية في علم الأمراض هي القولون أو الكلى أو البنكرياس أو عنق الرحم أو الرئة أو الثدي أو البروستاتا أو النسيج الضام.

في حين تم تطوير إجراءات تلطيخ مختلفة للأنسجة البشرية / الحيوانية والنباتية في وقت مبكر من القرن السابع عشر ، كان الطبيب الألماني رودولف فيرشو هو أب علم التشريح الحديث. أدرك فيرشو إمكانات تقنيات الميكروسكوب الجديدة الناشئة في القرن التاسع عشر لأبحاثه الرائدة ، ونشر قدرًا هائلاً من الكتابات العلمية وأنشأ مجموعة رائعة من آلاف شرائح عينات الأنسجة المرضية ، وبالتالي بناء أساس علم الأنسجة الحديث وأبحاث السرطان.

يبدأ تحضير شريحة الأنسجة بتثبيت عينة الأنسجة. هذه خطوة حاسمة في تحضير الأنسجة ، والغرض منها هو منع التحلل الذاتي للأنسجة والتعفن. للحصول على أفضل النتائج ، يجب نقل عينات الأنسجة البيولوجية إلى مادة مثبتة فور جمعها ، وعادة ما تكون في شكل فورمالين محايد بنسبة 10٪ لمدة 24 إلى 48 ساعة. بعد التثبيت ، يتم قطع العينات باستخدام مشرط لتمكينها من وضعها في كاسيت مناديل مناسب يتم تخزينه في الفورمالين حتى تبدأ المعالجة.

الخطوة الأولى في المعالجة هي الجفاف ، والذي يتضمن غمر العينة في تركيزات متزايدة من الكحول لإزالة الماء والفورمالين من الأنسجة. المقاصة هي الخطوة التالية ، حيث يتم استخدام مذيب عضوي مثل الزيلين لإزالة الكحول والسماح بالتسلل بشمع البرافين. التضمين هو الخطوة الأخيرة ، حيث يتم اختراق العينات بعامل التضمين - عادةً شمع البارافين الذي يوفر مصفوفة دعم تسمح بتقطيع رفيع جدًا. يتم استخدام مبضع لتقطيع أقسام الأنسجة الرفيعة للغاية من الكتلة على شكل شريط ، بعد تلطيخ النسيج الكيميائي (عادةً الهيماتوكسيلين ويوزين - "صبغة HE") لتوفير تباين لأقسام الأنسجة ، مما يجعل هياكل الأنسجة مرئية بشكل أفضل ويسهل تقييمها . في بعض الحالات ، تكون اللطخات الكيميائية النسيجية المناعية (IHC) ، مثل HER2 أو Ki-67 ، مطلوبة لمزيد من التحليل.


بروتوكول تلطيخ IHC لعينات جبل كاملة

تلطيخ الجبل الكامل هو تلطيخ قطع صغيرة من الأنسجة - عادة الأجنة - بدون تقطيع.

يشبه تلطيخ الجبل الكامل الكيمياء المناعية (ICC) أو تلطيخ التجميد. إذا تم استخدام الجسم المضاد بنجاح في عمليات التجميد (لا يشمل ذلك المقاطع المضمنة بالبارافين) ، فيجب أن يعمل الجسم المضاد مع جنين التركيب الكامل.

الفرق هو أن العينة الملطخة أكبر بكثير وأكثر سمكًا من القسم العادي على الشريحة. لذلك ، يجب أن تكون حضانات المثبت ، والعازل الحاجز ، والأجسام المضادة ، ومخزن الغسيل ، والنفاذية ، وتطور لون الركيزة أطول بكثير للسماح بالنفاذية في مركز العينة.

يجب تحسين توقيت هذه الخطوات لتتناسب مع تجاربك ، لكن التفاصيل الواردة في هذه البروتوكولات توفر إرشادات.

تثبيت

أيا كان المثبت الذي استخدمته بنجاح في IHC-Fr مع الجسم المضاد الخاص بك ، يجب أن يكون مناسبًا أيضًا للتركيب الكامل. ومع ذلك ، فإن معظم الباحثين يستخدمون 4 ٪ لامتصاص العرق (PFA).

على الرغم من أن تركيز PFA منخفض جدًا ، إلا أنه يجب تركه لفترة طويلة من الوقت على عينات التثبيت الكاملة للسماح بالنفاذ إلى مركز العينة. لذلك ، لن يكون هذا مناسبًا لجميع الأجسام المضادة ، حيث أن الارتباط المتبادل للبروتين المتشكل بواسطة المثبت قد يمنع وصول الجسم المضاد إلى الحاتمة.

عادة ، في IHC-P يمكنك إجراء استرجاع المستضد. هذا غير ممكن على عينات الأجنة لأن إجراء التسخين قد يؤدي إلى تدمير العينة. إذا لم يعمل تثبيت PFA مع نسيج التثبيت بالكامل ، فهناك احتمال أن يكون الجسم المضاد حساسًا للربط المتبادل للبروتين ، وسوف تحتاج إلى مثبت آخر. الميثانول هو الخيار الثاني الشائع للمثبت عند تحسين إجراءات التركيب بالكامل.

يتطلب تثبيت وتحضير جنين الزرد خطوات إضافية لضمان نفاذية غشاء البويضة.

الحصول على الصور

يرى بعض الباحثين ويحصلون على صور للأجنة كما هي. يمكن تصوير الجنين بأكمله أثناء الطفو في محلول الجلسرين في طبق بتري ، قبل التركيب. إذا كان صغيرًا بدرجة كافية ، يمكن تركيب الجنين بأكمله في الجلسرين قبل وضعه في غطاء. في هذه الحالة ، يجب استخدام الشحوم حول زاوية زلة الغطاء للمساعدة في إبقائها في مكانها.

يمكن أيضًا وضع الأجنة في الجيلاتين وتقسيمها إذا كان من الصعب الحصول على رؤية واضحة للتلطيخ من خلال الجنين بأكمله (خاصة في مراحل الجنين المتأخرة الأكبر أو عينات الأنسجة الأكبر).

إذا تم استخدام وضع العلامات المناعية ، فيمكن أن يكون الفحص المجهري متحد البؤر أداة مفيدة لمسح الجنين ، بدلاً من تقسيم الجنين بأكمله إلى شرائح منفصلة بعد التلوين.

اختيار عمر الجنين

مع نمو الجنين ، سيصبح أكبر من أن يصبغ. The various reagents, including fixative, antibody and developing solution will not be able to permeate to the center of the sample, and the number of stained cells will make obtaining a clear image very difficult. However, larger and older embryos can be dissected into segments before staining if necessary.


Pathogenesis:

M. leprae replicates intracellularly, typically within skin histiocytes, endothelial cells, and the schwann cells of nerves. Cell mediated immunity (CMI) plays major part in determining the response of the host to leprosy.

  1. Tuberculoid leprosy: very few acid-fast bacilli in skin smear (paucibacillary disease): Cell-mediated immune (CMI) response is adequate and lepromin test is positive.
  2. Lepromatous leprosy: large numbers of Mycobacterium leprae chiefly in masses within the lepra cells, often grouped together like bundles of cigars or arranged in a palisade (multibacillary disease).The cell-mediated immune (CMI) response to organism is poor and the lepromin test is negative.

Ridley and Jopling (1966) have introduced a scale for classifying the spectrum of leprosy into five groups:

  1. Tuberculoid (TT)
  2. Borderline Tuberculoid (BT)
  3. Borderline (BB)
  4. Borderline Lepromatous (BL)
  5. Lepromatous (LL)

According to World Health Organization (WHO), leprosy is divided into two groups, paucibacillary and multibacillary.

Comparison of tuberculoid and lepromatous leprosy

Lepromin Skin Test:

The lepromin skin test is not used to diagnose leprosy but to determine what type of leprosy a person has. Lepromin skin test is similar to tuberculin test. An extract of M.leprae is injected intradermally and induration is observed 48 hours later in those whom a cell-mediated immune response against organism exists.

Lepromin test is employed mostly for the following two purposes.

1. To classify the lesions of leprosy patients.

2. To assess the prognosis and response to treatment.


Microbiology Interview Questions And Answers

  • Simple stain: where only one stain is used and all bacteria are stained similarly. Eg: F1ethylene blue, dilute carbol fuchsin
  • Differential staining: where different bacteria stain differently to a common staining technique depending on their physiological properties. Eg: Gram&rsquos stain and Acid fast staining
  • Special stain: where structures of bacteria like spores. granules. capsule etc are demonstrated. Eg: silver impregnation technique for demonstration of spirochetes. Feulgen stain for demonstration of nucleus. Sudan black stain for demonstration of lipid vacuoles. Ryu&rsquos stain for demonstration of flagella. Albert&rsquos stain for demonstration of metachromatic granules.
  • Negative staining: where the background is stained with an acidic dye such as India ink or Nigrosin. Used for demonstration of capsules.

Stains are classified based on the pH of their chromophore (color bearing ion) into acidic, basic and neutral. Acidic dyes have anionic chromophore

eg.. sodium+ eosinate-. Basic dyes have cationic chromophore eg.. metFiylene blue+ chloride-. Acidic dyes combine more strongly with cytoplasmic components of bacteria, especially the nucleus that is basic in nature. Neutral dyes have both acidic and basic component that nullity each other.

They are Romanowsky&rsquos stain and are used in staining parasitic forms. Stains can be either natural (eg: carmine and hematoxylin) or coal-tar derivatives /aniline stains (eg: methylene blue. crystal violet). Supravital (cells removed from the body) and intravital (cells still a part of the body).

LoetTler&rsquos methylene blue solution treated with Potassium hydroxide turns into Polychrome methylene blue after prolonged storage with shaking. Used in McFadyean&rsquos reaction for Bacillus anthracis in blood films and demonstration of metachromatic granules of Corynebacterium diphtheriae.

Hans Christian Gram invented this stain in 1884. The original formulation was Aniline Gentian violet. Lugol&rsquos iodine, absolute alcohol and Bismark brown.

Cell wall theory: Cell wall of Gram positive bacteria are 40 times thicker than those of Gram negative cells, hence they are thought to help retain the dye-iodine complex.
Lipid Content Theory: Cell envelope of Gram negative bacteria contains an additional membrane (outer membrane). hence containing more lipids than Gram positive bacteria. Acetone or alcohol dissolves the lipid thus forming large pores in Gram negative bacteria through which the dye-iodine complex leaks out. Alcohol/acetone dehydrates Gram positive bacteria shrinking the cell wall and the closing the pores.
Magnesium Ribonucleate Theory: A compound of magnesium ribonucleate and basic protein concentrated at the cell membrane helps Gram positive bacteria retain the primary dye. Gram negative bacteria do not possess this substance.
Cytoplasmic pH Theory: The cytoplasm of Gram positive bacteria are said to be more acidic (2) than those of Gram negative ones (3). Hence the dye is said to bind with more affinity to Gram positive cells.

It is the cytoplasm (especially the nucleic acid) that gets stained and not the cell wall. Presence of an intact cell wall is important for retaining Gram positivity. Cell wall deficient forms such as Mycoplasma and L forms are Gram negative.

  • Extremely slender bacteria such as Treponema
  • Cells containing waxy substances impermeable to stain such as Mycobacteria
  • Minute intracellular bacteria such as Chlamydia and Rickettsia
  • Cell organelles such as capsule. spore. flagella etc
  • Primary stain: Crystal violet. Methyl violet and Gentian violet
  • Mordant: Grams iodine, rarely Lugols iodine
  • Decolorizer: Alcohol, acetone. acteone-alcohol mixture (1:1)
  • Counterstain: Dilute carbol fuchsin. safranin, neutral red. (Sandiford stain ror Gonococcj
  • When over-decolourized by either prolonged exposure to decolourizer or using acetone alone.
  • When cell wall gets damaged by exposure to lysozyme or cell wall acting antibiotics such as Penicillin.
  • Old cultures, where cell wall is weakened or action of autolytic enzymes
  • Those bacteria that are phagocytosed. where cell wall is acted upon by lysosomal contents

Decolourization is the most important step as this step differentiates between Gram positive and Gram negative bacteria. Over-decolourization can result in Gram positive bacteria appearing Gram negative and under-decolourization can result in Gram negative bacteria appearing Gram positive.

  • Rapid presumptive diagnosis of diseases such as bacterial meningitis
  • Selection of empirical antibiotics based on Gram stain finding
  • Selection of suitable culture media based on Gram stain finding
  • Screening of quality of clinical specimens. such as sputum that should contain many pus cells and few epithelial cells
  • Counting of bacteria
  • Appreciation of morphology and types of bacteria in a clinical specimen
  • Kopeloll&rsquo and Beerman&rsquos (Primary stain: Methyl violet. decolourizer: acetone or alcohol-acetone mixture 1:1)
  • Jensen&rsquos (Primary stain: Methyl violet, decolourizer: absolute alcohol. counterstain: Neutral red)
  • Preston and Morrell&rsquos (Primary stain: crystal violet. decolourizer: iodine-acetone)
  • A.igert&rsquos (Primary stain: Carbol gentian violet. decolourizer: Aniline-xylol). This is used to stain tissue sections.

Certain bacteria or their structures have the ability to retain the primary dye (strong carbol fuchsin) and resist clecolourization by weak mineral acids such as H2S04. HCI. Such bacteria or their structure are termed acid fast and this property is termed acid fastness. There are two types of acid fast staining, the hot method and the cold method. The hot method (Ziehl-Neelsen) involves heating the slide while the cold methods such as Kinyoun&rsquos and Gabbett&rsquos do not involve heating the slide.

Ehrlich in 1882 discovered acid fastness. The original method involved staining with aniline-gentian violet and decolourization with strong nitric acid.

It was later improved by Ziehl and Neelsen.

The cell walls of Mycobacterla are made up of waxy substance, Mycolic acid that Is relatively Impermeable to ordinary stainIng techniques. But, by apphcation of heat and a mordant (phenol), the cell can be stained The purpose of heating is to soften the waxy material of the cell wall and allow the stain to enter the cell. Basic fuchsin is more soluble in phenol and phenol is a better solvent for lipids and waxes.

  • Primary stain: Strong Carbol Fuchsin (contain Basic fuchsin and Phenol)
  • Decolourizer 20% sulphuric acid
  • Counterstain LoelTler&rsquos Methylene blue or 1% Malachite green, Picric acid for color-blind workers

3% HCI in 95% alcohol (methylated spirit). This is useful in dilrerentiating saprophytic Mycobacteria from pathogenic Mycobacteria Pathogenic Mycobacteria are both acid and alcohol fast but saprophytic Mycobacterla are only acid-fast Saprophytic Mycobacterla can get declourized by alcohol. 95% alcohol can be used as a secondary decolorizer after decolourizing with acid Especially used in staining smears prepared from urine that may contain Mycobacterium smegmatis.

  • Mycobacterlum leprae - 5% H2S04
  • Oocysts of Cryptosporidium. Isospora - 1 % H2S04
  • Tissue sections containing Actinomyctes. Nocardia - 1 % H2S04
  • Cultures of Nocardia - 0.5% H2S04
  • Bacterial spores - 0.25-0.5% H2S04

The two methods namely Kinyoun&rsquos and Gabbetts dont involve heating of slides, hence called cold methods. Heating is substituted by increased concentration of phenol and prolonging the duration of staining. Kinyoun&rsquos method is favoured for detection of Cryptosporidium oocysts in fecal samples. Gabbetts method has decolourizer and counterstain in one solution.

For uniform distribution of heat, or else the slide may break.

  • A new slide must be used for every specimen. because scratch marks may give false positive.
  • A uniform smear from thick portion of the sputum must be made.
  • Staining jars should not be used to staining smear as there is risk to cross contamination
  • Fresh blotting paper must be used for each smear for drying the slide to prevent transfer from one slide to another.

At least 100 oIl Immersion fields must be viewed before declaring the smear as negative The sensitivity of smear Is low because It requires the presence of 104 bacillilml to be smear positive. If the number of bacilli is less than this, the chances of detecting them are less In such a case, the sample should be subjected to concentration techniques such as Petroff s method If the smear Es positive for AFB. it should be counted/graded Failure to detect any AFB does not rule tuberculosis Grading of smears has prognostic value.

Smears are graded depending on the number of bacilli seen

  • 3-9 bacilli/entire smear: +
  • 10 bacilli/entire smear ++
  • 10 bacilli/in most oil Immersion fields: +++

Sputum smears for Mycobacterla can be stained by fluorescent dyes such as Auramine and Rhodamlne as they have affinity for mycolic acid In their cell walIs The fluorescent microscopy is useful in screening large number of specimens. Large area of smear can be quickly observed that too under high power dry objective.

Beaded appearance is used to describe the appearance of Mycobacterla when the cell doesn&rsquot stain uniformly. showing stained and unstained regions. These forms are common in Mycobacterium tuberculosis while Mycobacterium bovis stains uniformly. Most saprophytic Mycobacteria stain uniformly.

Metachromatic granules are pol&rsquoymetaphosphate reserves produced by Corynebacterium diphtheriae in nutritious medium. These granules are also known as Babes Ernst granules. &lsquoblutin granules. Polar bodies etc. They are called metachromatic granules because of they exhibit metachromasia.

a property where the granules appear in a colour different from that of the dye used When stained with polychrome methylene blue, they appear purple They are produced In abundance In serum containing medium such as Loeffler&rsquos serum slope.

Albert&rsquos stain. Neissers stain, Ponder&rsquos stain and Pugh&rsquos stain They can be demonstrated as retractile bodies in wet mount or slightly more gram positive structures in Gram stain.

The bacdh are arranged at angles to each other resembling English letter V or L or Chinese letter (cuneiform) pattern because the daughter cells doWt separate completely after cell dMslon (binary rission).

Solution A(1) contains Toluidine blue, Malachite green, Glacial acetic acid and Alcohol while solution 8(2) contains iodine and potassium iodide In distilled water.

The process of kdling all hying forms including spores is called sterilization and the process of killing of only the vegetative form of pathogenic bacteria as well as other microbes is disinfection

121°C for 15 minutes at 15 pounds per square inch of pressure

Glassware&rsquos, metallic instruments like scissors and forceps, swabs. powder. oils and grease.

Culture media, gloVes. cotton and clothes.

By High Elliciency Particulate Air (HEPA) filters.

Phenol. Lysol, Formaldehyde. Sodium hypochlorite.

Antiseptics are mild disinfectants that can be safely used on skin and mucous membranes.

Quaternary ammonium compounds are positively charged polyatomic ions, which concentrate at the cell surface and alter the physical and chemical properties of the membrane, thus killing the cefl. Examples inlcude Benzalkonium chloride and Cetrimonium bromide.

The active ingredient of Dettol is chloroxylenol whereas Savlon contains a combination of Cetrimide and Chiorhexidine.

The active ingredients include Chlorhexidine. Triclosan. Thymol. Cetylpyridinium Chloride, and alcohol. The composition varies across brands.

These are the chemicals used for sterilization. They are 2% Gluteraldehyde (cidex). Ethylene Oxide (EO). Formaldehyde + steam and Beta &mdash Propiolactone (BPL).

  • Tincture Iodine - 2% of Iodine in 70% alcohol - lodophore - Povidone Iodine.
  • Name some antiseptics.
  • Chlorhexidine. Chloroxylenol. spirit (70% alcohol), tincture of Iodine. H202.

Sodium hypochlorite or Calcium hypochlorite

By treating them with disinfectant, boiling or autoclaving and finally by incineration

Gamma rays. Electron beams and Ethylene oxide

Glutaraldehyde or a combination of peracetic acid and hydrogen peroxide can be used.

Alkylation (hydrogen atom is replaced with an alkyl group) of protein. الحمض النووي. and RNA afFects bacterial metabolism and replication. EQ gas (8.5%) is often mixed with stabilizers such as CO2 (91 5%) or hydrochlorofluorocarbons (HCFC). This requires high humidity (40-80%) and long exposure times (1-6 hrs).

Ducking Is a process of inactivation of Anthrax spores in animal products such as wool, hairs or bristles. It was introduced by Elmhirst Duckering, an enginer at wool factory. This is a live-step process. each lasting for 10 minutes and carried out at 40.5°c.

  • immersion in 0.25-0.3% alkali
  • immersion in soapy water
  • immersion in 2% formaldehyde
  • secondimmersion in 2% formaldehyde
  • rinsinq in water

Porcelain filters. Seitz (asbestos) filters. Sintered glass filters. Membrane filters and HEP filters.

It disinfects and solidifies egg and serum containing media such as U medium and LoelTiers serum slope.


شاهد الفيديو: TINCION ZIEHL-NEELSEN (كانون الثاني 2022).