معلومة

الديناميكا الحرارية لطي البروتين العفوي: دور التغيرات في المحتوى الحراري


أحاول أن أوضح سبب حدوث طيّ البروتين تلقائيًا.

$$ ce Delta G = Delta H-T Delta S $$

وفقًا للديناميكا الحرارية ، يجب أن يكون ΔG سالبًا حتى تحدث العملية تلقائيًا. عندما يطوي البروتين ، يتناقص ΔS (إنتروبيا) ، لأن البروتين يزداد ترتيبًا. ومع ذلك ، أعتقد أن تكوين الروابط (ثاني كبريتيد والتفاعلات الضعيفة الأخرى) يوازن هذا الانتروبيا المتزايدة غير المواتية عن طريق تكوين المحتوى الحراري (ΔH) والذي سيؤدي بالتالي إلى ΔG سالب.

ومع ذلك ، رأيت بعض التفسيرات الأخرى عبر الإنترنت والتي لم تطبق صيغة الطاقة المجانية Gibbs على البروتين ولكن بدلاً من ذلك على الماء. نظرًا لأن الماء يكون مرتبًا بشكل أكبر عند الكشف عن البروتين ، فسيكون من الأفضل وفقًا للقانون الثاني للديناميكا الحرارية أن يطوي البروتين لأنه بعد طي جزيئات الماء يمكن أن تتحرك بحرية أكبر -> إنتروبيا أعلى -> سلبي G -> تلقائي قابلة للطي.

لذا فإن سؤالي هو أي من هذين (أو ربما كلاهما) هو سبب الطي التلقائي للبروتينات؟


ملخص

  • التفسير الأول شائع.
  • لا يمكن أن يكون التفسير الثاني صحيحًا ، كما هو قائم، لأنه يتجاهل تغير الطاقة الحرة في البروتين.
  • تعديل التفسير الثاني (ربما كان المقصود) هو أنه من الضروري اعتبار أن طي البروتين والتغير في الماء مترابطان ، وفي هذه الحالة يكون التغير الكلي في الطاقة الحرة - مجموع الاثنين يتم النظر فيهما بشكل منفصل - هو محددات طي البروتين. سيكون التأكيد عندئذ أن التغير السلبي في الطاقة الحرة في نظام المياه هو العامل الحاسم. تم تأييد هذا الرأي بشكل مقنع على أساس القياسات التجريبية.

تغيير الطاقة الحرة في التحولات الفردية

من الممارسات المعيارية في الكيمياء الحيوية النظر في طاقة جيبس ​​الحرة للتحول من النوع A → B بمعزل عن تحديد ما إذا كانت ستستمر تلقائيًا. قد يؤدي التفاعل الكيميائي الذي يكون G سالبًا فيه إلى توليد حرارة (أي أن يكون له تغير سلبي في المحتوى الحراري (ΔH)) مما يؤثر على محيطه المائي ، ولكن يبدو أنه من المبرر النظر في التفاعل بمعزل حيث لا يوجد أي شعور بأن التغيير في اهتزاز جزيئات الماء تقود أو تقترن بالتفاعل.

تم تطبيق هذا النهج على التغيير الهيكلي لطي البروتين مع الاستنتاج (بما يتوافق مع التفسير الأول) أن التغيير في المحتوى الحراري (ΔH) كافٍ لإنتاج ΔG سالب وبالتالي دفع البروتين إلى طي (الاقتباس 1 ، أدناه).

تغيير الطاقة الحرة في التحولات المقترنة تتضمن العديد من التغييرات الكيميائية الحيوية التحولات التي يكون لها بشكل فردي تغيير إيجابي في الطاقة الحرة ، ولكنها أصبحت ممكنة من خلال الاقتران بتفاعل آخر مع تغير سلبي في الطاقة الحرة ، أكبر حجمًا:

أ → ب ، ΔG1 = + س

C → D ، ΔG2 = -ص

إذا تم اقتران y> x وتفاعلا هذين (بشكل عام من خلال مسار تفاعل معقد على إنزيم) ، فعندئذ يكون لدينا:

أ + ج ← ب + د ، ΔGشاملة = -ve

ارى أيضا بيرج وآخرون.

على الرغم من أنه يمكن للمرء أن يرفض التفسير الثاني في السؤال كما هو لأنه يتجاهل تغيير الطاقة الحرة في طي البروتين ، فربما كان المقصود منه أن طي البروتين (A → B) يجب اعتباره مقترنًا بالتغيير في بيئة الماء (C → D) ، وأن ΔG السالب للبيئة المائية قد ساهم بشكل أكبر في إجمالي ΔG مقارنةً بطي البروتين.

هل يصح اعتبار هذين النظامين متزاوجين؟ في النسخة الأصلية من إجابتي جادلت ضد وجهة النظر هذه ، لكنني لم أعد مقتنعًا بحججي الخاصة. من الواضح أن البيئة المائية ضرورية للتأثير المسعور - دفن المخلفات الكارهة للماء في وسط البروتين بعيدًا عن الماء. يتضح هذا إذا اعتبر المرء نفس البروتين في بيئة كارهة للماء مثل غشاء الخلية - فلن يطوي. في بروتينات الغشاء ، تكون البقايا الكارهة للماء التي تتعرض للطبقة الدهنية الثنائية ومن الداخل هي التي تحتوي أحيانًا على قنوات محبة للماء.

إذن في هذا النظام المقترن ، ما هو محدد التغير السلبي في الطاقة الحرة؟ يؤكد Minikel (الاقتباس 2 أدناه) أنه لا يوجد تغيير صافٍ في المحتوى الحراري لطي البروتين ، وأن تأثير الانتروبيا على ΔG للبيئة المائية هو الذي يحرك الطي. ويشير إلى أن هذا الرأي مدعوم بالقياس اللوني للمسح التفاضلي ، وعلى الرغم من أنه لا يستشهد بالمراجع ، إلا أن هناك مراجعة حديثة (وإن كانت معقدة إلى حد ما) لهذا الموضوع من قبل كريستوفر م. جونسون.

الاقتباس 1: تأكيد دور ΔH للبروتين

التفسير التالي ، المأخوذ من الكيمياء الحيوية الأساسية ، يعالج البروتين القابل للطي بشكل منفصل ويؤكد أن التغيير في المحتوى الحراري كافٍ لإنتاج تغيير سلبي في الطاقة الحرة:

يوفر طي البروتين أيضًا مثالاً على المصطلحين "ΔH" و "-TΔS" المتنافسين مع بعضهما البعض لتحديد ΔG لعملية الطي. كما هو موصوف أعلاه ، فإن التغيير في إنتروبيا البروتين أثناء طيه يكون سالبًا ، لذا فإن مصطلح "-TΔS" يكون موجبًا. ومع ذلك ، بالإضافة إلى التأثيرات الحتمية ، هناك مساهمات محتوى حراري لطي البروتين. وتشمل هذه الروابط الهيدروجينية ، وجسور الملح الأيونية ، وقوى فان دير فال. مطلوب إدخال من الطاقة الحرارية (الحرارية) لتعطيل هذه القوى ، وعلى العكس من ذلك عندما تتشكل هذه التفاعلات أثناء طي البروتين فإنها تطلق الحرارة (ΔH سالبة). عندما يتم وزن كل هذه المساهمات في الانتروبيا والمحتوى الحراري ، ينتصر مصطلح المحتوى الحراري على مصطلح الانتروبيا. لذلك فإن الطاقة الحرة لطي البروتين سلبية ، وطي البروتين عملية تلقائية.

الاقتباس 2: دحض دور ΔH للبروتين وتأكيد دور الماء

التفسير التالي ، مأخوذ من ملاحظات المحاضرة عبر الإنترنت لإريك ف. مينكل من جامعة هارفارد ، دحض وجهة النظر أعلاه:

وجهة نظر غير صحيحة ومبسطة لطي البروتين هي كما يلي. يحتوي البروتين غير المطوي على نسبة عالية من الانتروبيا التكوينية ولكنه يحتوي أيضًا على نسبة عالية من المحتوى الحراري لأنه يحتوي على القليل من تفاعلات التثبيت. يحتوي البروتين المطوي على نسبة أقل بكثير من الانتروبيا ، ولكنه يحتوي أيضًا على محتوى أقل بكثير من المحتوى الحراري. هناك مفاضلة بين H و S هنا. لاحظ أنه نظرًا لأن ΔG = ΔH - TΔS ، فإن زيادة درجة الحرارة تزن مصطلح S بشكل أكبر ، مما يعني أن درجة الحرارة المرتفعة تفضل الانفتاح.

هذا التفسير بأكمله يأخذ في الاعتبار طاقة البروتين فقط وليس طاقة المذيب. في الواقع ، تقيد المجالات الكارهة للماء للبروتين التكوينات المحتملة للمياه المحيطة (انظر الشرح أعلاه) ، وبالتالي فإن دفنها عند الطي يزيد من إنتروبيا الماء. علاوة على ذلك ، اتضح أن الرابطة الهيدروجينية للمخلفات القطبية والعمود الفقري يتم استيفائها في كل من الحالة غير المطوية (بواسطة الماء) وفي حالة الطي (من خلال بعضها البعض). لذلك فإن المحتوى الحراري هو "مجموع الصفر" ، وطي البروتين مدفوع بالكامل تقريبًا بالانتروبيا.


الديناميكا الحرارية لطي البروتين: المنهجية وتحليل البيانات وتفسير البيانات

تشير الديناميكا الحرارية لطي البروتين إلى قياسات الثبات حيث تتم مراقبة التغيرات الهيكلية لبروتين معين في وجود عامل تغيير طبيعة من خلال تقنيات التحليل الطيفي أو المسعرات. من وجهة النظر العيانية ، يمثل استقرار البروتين نسبة السكان في حالته غير المكشوفة إلى الحالة المطوية في حالة التوازن ، بينما من وجهة النظر المجهرية ، فإن الاستقرار هو في الواقع قيمة صافية من مجموعة من المساهمات الإيجابية وغير المواتية التي تؤثر على السلامة الهيكلية لجزيء البروتين. في هذه المخطوطة ، يتم عرض المبادئ والجوانب المنهجية للدراسات الديناميكية الحرارية وطرق تحليل البيانات وكذلك تفسير النتائج.

مجردة رسومية

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


التغير في المحتوى الحراري في طي البروتين وربطه: تنقيح المعلمات للحسابات القائمة على الهيكل

هناك تأثيران مسؤولان بشكل رئيسي عن التغير الملحوظ في المحتوى الحراري في تكشف البروتين: تعطيل التفاعلات الداخلية داخل جزيء البروتين (فان دير فالس ، روابط الهيدروجين ، إلخ) وترطيب المجموعات المدفونة في الحالة الأصلية والتي تصبح مكشوفة. إلى المذيب عند تتكشف. في التحليل الديناميكي الحراري التقليدي ، عادةً ما يتم تقييم تأثيرات الماء باستخدام البيانات الديناميكية الحرارية لنقل مركبات النموذج الصغيرة من الطور الغازي إلى الماء. من ناحية أخرى ، يتم تقدير مساهمة التفاعلات الداخلية عادةً عن طريق طرح تأثيرات الماء من المحتوى الحراري التجريبي للتكشف. العيب الرئيسي لهذا النهج هو أن المساهمات الحرارية للترطيب ، وتلك الناتجة عن اضطراب التفاعلات الداخلية ، أكبر من قيمة المحتوى الحراري التجريبية بأكثر من ترتيب واحد. إن مساهمات المحتوى الحراري للترطيب وتعطيل التفاعلات الداخلية لها علامات معاكسة وتلغي بعضها البعض بشكل كامل تقريبًا مما يؤدي إلى قيمة نهائية تزيد 10 مرات عن الشروط الفردية. لهذا السبب ، لا يمكن استخدام النهج الكلاسيكي للتنبؤ بدقة بتكشف المحتوى الحراري من الهيكل: أي خطأ في تقدير المحتوى الحراري للترطيب سيتم تضخيمه بعامل 10 أو أكثر في تقدير المحتوى الحراري المتفتح. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات أن المعادلات البارامترية البسيطة التي تربط تغيير المحتوى الحراري مع معلمات هيكلية معينة ، خاصة التغييرات في مناطق السطح التي يمكن الوصول إليها بواسطة المذيبات ، تتمتع بقدرة تنبؤية كبيرة. في هذه الورقة ، نقدم أساسًا ماديًا لتلك المعلمات وفي العملية نقدم نظامًا من المعادلات يتضمن صراحة التأثيرات الحرارية لكثافة التعبئة بين الذرات المختلفة داخل جزيء البروتين. باستخدام هذا النهج ، يكون الخطأ في توقع المحتوى الحراري القابل للطي / المتفتح عند 60 درجة مئوية ، متوسط ​​درجة الحرارة للتكشف الحراري ، أفضل من ± 3٪ (الانحراف المعياري = 4 كيلو كالوري / مول). © 1996 Wiley-Liss، Inc.


الملخص

لقد قمنا بقياس التغيرات في السعة الحرارية ، والإنتروبيا ، والمحتوى الحراري لكل خطوة في تفاعل الطي لـ CD2.d1 وقمنا بتقييم آثار الطفرات الأساسية على هذه الخصائص. يتم طي جميع الأشكال البرية والطفرة من خلال حالة وسيطة سريعة التكوين تسبق حالة الانتقال المحددة للمعدل. للطفرات تأثير واضح على المحتوى الحراري لكل من الحالتين الوسيطة والمطوية ، ولكن في جميع الحالات ، يؤدي التغيير التعويضي في الانتروبيا إلى تغيير صغير في الطاقة الحرة. بينما يمكن أن يُعزى التغير في المحتوى الحراري في الحالة المطوية إلى فقدان تفاعلات van der Waals ، فقد تم بالفعل إثبات أن التغييرات في ثبات المادة الوسيطة تهيمن عليها التغييرات في ميل البنية الثانوية [Lorch et al. (1999) الكيمياء الحيوية38، 1377-1385]. ويترتب على ذلك أن الأساس الديناميكي الحراري للنزعة β هو محتوى حراري في الأصل. تكون تأثيرات الطفرات على المحتوى الحراري والإنتروبيا في حالة الانتقال أصغر من تأثيرها على الحالات الأرضية. تتم مناقشة عدم الحساسية النسبية للطفرة في ضوء النظريات المتعلقة بطبيعة حاجز الحد من المعدل في تفاعلات الطي.


الملخص

يوفر تحليل البيانات الديناميكية الحرارية حول انحلال ثنائي الببتيدات الحلقية الصلبة في الماء من حيث إضافة المجموعة الأساس المنطقي لدرجات حرارة التقارب في المحتوى الحراري والانتروبيا التي لوحظت لتمسخ البروتين الكروي الصغير وانحلال المركبات النموذجية في الماء. درجات حرارة التقارب هي درجات حرارة يتغير فيها المحتوى الحراري أو الأنتروبيا المستقراء لسلسلة من المركبات ذات الصلة بقيمة مشتركة. في درجات الحرارة هذه (T H ∗ و T S) المساهمات القطبية للقيم الديناميكية الحرارية المقابلة (ΔH° و ΔS°) تظهر على أنها صفر. يمكن بعد ذلك تقييم المساهمات الأخرى مثل الترابط الهيدروجيني والتأثيرات التكوينية وتقييم آثارها الكمية على استقرار البروتينات الكروية.

يتضح أن السعة الحرارية للتحول إلى الطبيعة تتكون من مساهمة إيجابية كبيرة من التعرض للمجموعات القطبية ومساهمة سلبية كبيرة من تعرض المجموعات القطبية بالاتفاق مع النتائج السابقة. تشير المساهمة القطبية الكبيرة إلى أن نموذج الهيدروكربون السائل للتأثير الكارهة للماء لا يمثل بدقة مساهمة القطبية في ΔH° تمسخ. بدلاً من ذلك ، تم العثور على مساهمات كبيرة في تثبيت المحتوى الحراري تنشأ من مجموعات الببتيد (الرابطة الهيدروجينية).


نتائج

تأثيرات داخل الخلية على الحالة المطوية.

البروتين النموذجي الخاص بنا هو السقالة المكونة من 110 بقايا للبرميل [كود بنك بيانات البروتين (PDB) 4BCZ] الخاص بالزبال الجذري المنتشر في كل مكان ديسموتاز أكسيد النحاس والزنك الفائق (كود PDB 1HL5). تم إنشاء متغير SOD1 (برميل SOD1) عن طريق اقتطاع حلقة الربط المعدني IV والحلقة الكهروستاتيكية VII للبروتين الأم (26) ، والتي تمحو التباين الأصلي وتترك مونومر غير نشط حفزيًا وحسن التصرف والذي يقدم العديد من المزايا لـ التحليل داخل الخلية (الشكل S1). يعرض برميل SOD1 انتقالًا بسيطًا للطي ثنائي الحالة (26) يفتقر إلى التعقيد في شكل روابط ربط معدنية أصلية (27) وشقوق سيستين (28) ويتميز على نطاق واسع فيما يتعلق بالاستجابة الطفرية (27 ، 29 ، 30) ، الديناميكيات الهيكلية (26 ، 31) ، وسلوك التجميع (6). أيضًا ، يعرض برميل SOD1 أطياف الرنين المغناطيسي النووي التي تم حلها بالكامل في خلايا الثدييات (32). بالنسبة لتجارب خلايا الثدييات ، استخدمنا خط خلايا سرطان المبيض البشري A2780 (33) ، والذي وجد أن له خصائص جيدة لتوصيل البروتين والاستدامة في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي. تم تسليم 15 بروتينًا يحمل علامة N إلى العصارة الخلوية لخلايا الثدييات عن طريق التثقيب الكهربائي (مواد وطرق SI) وبعد الشفاء والغسيل ، تمت تعبئة الخلايا المعالجة بلطف في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي (مواد وطرق SI). كانت تركيزات SOD1 داخل الخلايا 20-30 ميكرومتر ، مطابقة لتلك الموجودة في الفئران المعدلة وراثيا ALS (34 ، 35) ، وأعلى بكثير من التركيز الداخلي من 1 إلى 5 ميكرومتر من SOD1 في خلايا الثدييات (36). ضوابط الكفاءة وعائد الاستيعاب موصوفة في ضوابط SI والشكل S2أ. تُظهر النتائج أطياف التماسك الكمي المتعدد غير المتجانسة عالية الدقة داخل الخلية (HMQC) من جزيئات البرميل SOD1 المطوية والمنقولة بحرية ، والتي تتطابق بشكل وثيق مع تلك التي تم الحصول عليها في المختبر (ضوابط SI والشكل S2ب). ومع ذلك ، فإن التأثير الملحوظ للاستيعاب هو زيادة درجة بروتون السلاسل الجانبية للهيستيدين للبروتين. باستخدام SOD1 I35A نفسه كمسبار pH ، نحدد الرقم الهيدروجيني داخل الخلايا إلى 6.5 (ضوابط SI والشكل S2ج). هذا التحمض الخلوي متوقع وينشأ من ظروف نقص الأكسجة في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي المعبأة بإحكام: تقوم الخلايا السرطانية المستزرعة بإعادة توجيه عملية التمثيل الغذائي إلى مسارات تحلل السكر مع تأثير ضئيل على قابلية الحياة (32). تظهر القمم المتقاطعة NMR أن التحميض يبدأ في وقت مبكر من التجربة ، ويكون موحدًا عبر مجموعة البروتين ، ويظل مستقرًا لأكثر من 5 ساعات.

هيكل ثنائي SOD1 الأصلي (كود PDB 1HL5) ومناطق الحلقة التي تمت إزالتها بواسطة هندسة البروتين. (أ) في ثنائي SOD1 الأصلي ، تتكيف الحلقات الطويلة IV و VII بهيكل مضغوط ومرتّب للغاية حول الموقع النشط ، حيث تشكل الحلقة IV أيضًا جزءًا من واجهة dimer (خضراء). يظهر المونومر الأيسر كسطح يمكن الوصول إليه (نصف قطر مسبار 1.4) بينما يتم تمثيل المونومر الأيمن كرسوم متحركة. تم تسليط الضوء على المخلفات التي تنسق الموقع النشط أيونات Cu 1 + / 2 + و Zn 2+ ووصلة ثاني كبريتيد C57 – C146 بين الحلقة IV والبرميل المركزي. (ب) إزالة الحلقات IV و VII من apoSOD1 يقلل من واجهة dimer وكذلك شقوق ربط المعدن ويؤدي إلى ذوبان monomers apoSOD1 برميل (رمز PDB 4BCZ). يتم تمييز الحلقات المبتورة IV و VII باللون الأخضر والأزرق على التوالي. (مقتبس من المرجع 26.)

(أ) ضوابط الاستيعاب. أحادي البعد 15 أطياف N-HMQC لـ SOD1 I35A في خلايا A2780 (زرقاء) وطاف (أحمر) لا تظهر أي تسرب أو كميات صغيرة. (ب, اليسار) هيكل الأشعة السينية لبرميل SOD1 (رمز PDB 4BCZ) ، يمثل سقالة برميل من البروتين المرتبط بـ ALS Cu / Zn superoxide disutase 1 (66). ينتج عن الطريقة هنا تركيزات داخل الخلايا من 20-30 ميكرومتر ، مطابقة لتركيزات SOD1 البشرية في الفئران المعدلة وراثيًا ALS (43) ودراسات التجميع في المختبر (6). (ب, مركز و حق) أطياف HMQC لبرميل SOD1 في خلايا الثدييات (أزرق) ومحلول الخلية اللاحقة (أسود). (ج, اليسار) تم الحصول على تراكب أطياف HMQC - <15 N> -HMQC عند قيم الأس الهيدروجيني تتراوح من 5.8 إلى 7.6. (ج, مركز) لقطات مقرّبة للقمم المتقاطعة الأكثر تضررًا. (ج, حق) تراكب الأطياف الأنسب في المختبر (الأحمر) والأطياف داخل الخلية (الأزرق) ، تُستخدم مع بقية البيانات لتقدير الرقم الهيدروجيني داخل خلايا A2780 إلى 6.5 ± 0.1 (32).

التحليل الديناميكي الحراري.

على الرغم من أنه يمكن استخدام الطيف داخل الخلية لبرميل SOD1 المطوي لإنشاء الأس الهيدروجيني الخلوي والتنقل الجزيئي الأساسي ، إلا أنه لا يمكن استخدامه بمفرده لقياس توازن الطي. يتطلب مثل هذا التحليل اكتشافًا متزامنًا لكل من الحالات المطوية (N) والتشويه (D) في توازن حر ، أي منحنى معايرة قابل للطي (37) ، حيث توازن الطي (كD-N) والاستقرار (ΔجيD-N) بواسطة Δ G D-N = - R T ln K D-N = - R T ln [N] [D]. [1] لإنشاء مثل هذا التوازن المتوازن ، قمنا بزعزعة استقرار برميل SOD1 عن طريق الطفرة الأساسية I35A (SOD1 I35A). الطفرة تترك الهيكل والسطح دون تغيير (ضوابط SI، التين. S3 أ-ف، والجدول S1) ولكنه يجعل البروتين مكشوفًا جزئيًا في ظل الظروف الفسيولوجية. كدليل على المبدأ ، يُظهر طيف الرنين المغناطيسي النووي لـ SOD1 I35A مجموعات مختلطة من D و N في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني عند درجة الحموضة 6.5 و 37 درجة مئوية (الشكل 1). لتقدير كD-N = [N] / [D] نستخدم أحجام القمم المتقاطعة C-terminal Q153 ، والتي تكون منفصلة جيدًا وغير حساسة لتأثيرات الاسترخاء الناتجة عن درجة الحرارة / اللزوجة (ضوابط SI والشكل S3 جي إل).عند خفض درجة الحرارة ، يتحول توازن SOD1 I35A تدريجياً نحو N ، ويعرض نقطة منتصف تتكشف حراريًا تيم = 35 درجة مئوية في التحكم في المختبر (الشكل 1). عند 17 درجة مئوية ، تصل N إلى الحد الأقصى من الإشغال بنسبة 85 ٪ لتنخفض أخيرًا مرة أخرى مع انخفاض درجة الحرارة. هذا الاعتماد على درجة الحرارة المنحنية كD-N هو تأثير عام لزيادة السعة الحرارية عند الكشف (Δجص) حسب الحكام. 37 و 38 ، Δ G D-N (T) = Δ H D-N (T 0) - T Δ S D-N (T 0) + Δ C p [T - T 0 - T ln (T T 0)] ، [2] حيث ΔحD-N و ΔسD-N هي المحتوى الحراري والإنتروبيا للتكشف ، على التوالي. Δجص التغيير ناتج عن زيادة في الماء الكاره للماء ويوفر مقياسًا مفيدًا للزيادة في مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بواسطة المذيبات للانتقال من N إلى D (39). نظرًا لأن الترطيب يزداد "أقوى" في درجات الحرارة المنخفضة ، فإن مساحة السطح الأكبر لـ D تعزز الانفتاح البارد والانحناء ΔجيD-N(تي) ملامح (38). بالنسبة إلى SOD1 I35A ، تم تحديد نقطة المنتصف التي تتكشف على البارد على تيج = −3 درجة مئوية ، في اتفاق جيد مع الضوابط المستقلة القائمة على بيانات القرص المضغوط (ضوابط SI والشكل S4 أ و ب). يحدد هذا الوصف الديناميكي الحراري لـ SOD1 I35A في المختبر مرجعًا للتقدير الكمي للتأثيرات في الخلية (الجدول 1 والجدول S2).

القياس في المختبر لبرميل SOD1 ، يتأهب عند الاستقرار الديناميكي الحراري الهامشي بواسطة الطفرة SOD1 I35A. (أ) أطياف HMQC لبرميل SOD1 عند 37 درجة مئوية ، مما يُظهر البروتين المطوي بشكل موحد. أقحم يُظهر بنية الأشعة السينية لبرميل SOD1 (كود PDB 4BCZ) ، والذي يشكل سقالة برميل من البروتين الأصلي المرتبط بـ ALS Cu / Zn superoxide disutase 1 (32). (ب) أطياف HMQC المتطابقة لـ SOD1 I35A المتحولة (رمز PDB 4XCR) ، والتي تُظهر مجموعة مختلطة من المواد المطوية (N) والمكشوفة (D). القياس الكمي لتوازن D / N هو من أحجام الذروة المتقاطعة للرنين C-terminal Q153. (ج) ΔجيD-N مقابل ملامح درجة الحرارة لبرميل SOD1 و SOD1 I35A التي تم الحصول عليها من عمليات المسح الحراري بالرنين المغناطيسي النووي. تظهر تجمعات D و N مقابل درجة الحرارة نقطة انصهار تيم = 35.4 درجة مئوية ، أي ΔجيD-N = 0 (مكافئ. 1) ، والبرد تتكشف في درجة حرارة تحت الصفر. المنحني ΔجيD-N تعتبر الملامح ذات الحد الأقصى للثبات حول درجة حرارة الغرفة مميزة للبروتينات المتطورة بشكل طبيعي (58) وتحدد مجموعة قياسية من المعلمات الديناميكية الحرارية ذات المعنى الهيكلي الراسخ (Eq. 2).

المعلمات الديناميكية الحرارية لبيانات الخلية وفي عناصر التحكم في المختبر

(أ-ج) التركيب البلوري لـ SOD1 I35A (رمز PDB 4XCR) (أحمر) مضاف إليه هيكل برميل SOD1 (رمز PDB 4BCZ) (رمادي) ، مما يدل على أن الحالات المطوية لمتغيري البروتين متماثلتان إلى حد كبير. (د و ه, العلوي) أطياف HMQC في المختبر لـ SOD1 I35A المستقرة هامشيًا وبرميل SOD1 المطوي بالكامل. (د و ه, أدنى) الأسطح الكهروستاتيكية للبروتينين. مجتمعة ، تظهر البيانات أن الهياكل وخصائص السطح لبراميل SOD1 I35A و SOD1 متشابهة جدًا. (F) قطع شيفرون لـ SOD1 I35A عند 17 درجة مئوية و 25 درجة مئوية و 37 درجة مئوية. تُظهر درجات الحرارة المنخفضة توقيع مجلد من حالتين (28) ، بينما عند 37 درجة مئوية تكون نقطة المنتصف منخفضة جدًا بحيث لا يمكن ملاحظة أي تجدد للبروتين. (جي) ملف تعريف الطاقة الحرة لـ SOD1 I35A في خلايا A2780 (أزرق) وبيانات في المختبر مع محاكاة متغيرة للخط الانتقائي لتوسيع الذروة المتقاطعة Q153 للحالة المطوية ، PF (أحمر). (ح) تطبق عوامل توسيع الخط على P.F لإعادة إنتاج البيانات داخل الخلية (باللون الأزرق) مقارنة بالعوامل المقاسة من البيانات داخل الخلية (الأحمر) والعوامل المقاسة في اللزوجة العالية في عينات المختبر (أسود). (أنا) أقصى تأثير محسوب على ΔجيD-N من تأثيرات اللزوجة عند درجات الحرارة المنخفضة. يمكن أن يعاني تحديد حجم الذروة من أخطاء منهجية بسبب توسيع الخط في درجات حرارة منخفضة ، ولكن التأثير الأقصى أقل من 250 J⋅mol −1. (ي) نسبة ص2 بالنسبة للذروة المتقاطعة Q153 المطوية وغير المطوية عند 280 كلفن و 290 كلفن و 310 كلفن تظهر فقط اعتمادًا معتدلًا على درجة الحرارة. (ك) تراكب أطياف HMQC لبرميل SOD1 المطوي و SOD1 I35A / G93A مزدوج الطور بالكامل. (إل) أحجام الذروة النسبية لـ Q153 D (أحمر) و N (أسود) كدالة لدرجة الحرارة. يظل عدد السكان المحسوب لـ N ثابتًا عند 0.5 (أزرق) ، كما هو متوقع لنظام مع مساهمة صغيرة فقط من توسيع الخط وتحيز الاسترخاء.

إحصائيات جمع وصقل البيانات البلورية

(أ) ملفات تعريف الطاقة الحرة لبرميل SOD1 (أزرق) و SOD1 I35A (أخضر) ، مشتق من بيانات ذوبان القرص المضغوط (أقحم) ، مقارنة بملف الطاقة الحرة لـ SOD1 I35A المحدد بواسطة NMR (برتقالي). (ب) الاعتماد على الرقم الهيدروجيني تيم و Δح من SOD1 I35A المستخدمة لتحديد Δجص من العلاقة Δجص = δΔح/ δتيم. (ج) استقرار العينة في الخلية مقابل الوقت. أطياف 1D 1H- <15 N> -HMQC لـ SOD1 I35A في خلايا A2780 في بداية التجربة (أحمر) وبعد الاستحواذ ثنائي الأبعاد (أزرق) متشابهة بشكل عام. (د–H) ضوابط تأثير درجة الحموضة والملح. (د) تم تحديد مادة SOD1 I35A المطوية للسكان من القمم المتقاطعة Q153 كدالة للرقم الهيدروجيني. (ه) نقطة الانصهار الحرارية لـ SOD1 I35A المحددة بواسطة القرص المضغوط كدالة للرقم الهيدروجيني. (F) ملفات تعريف الطاقة الحرة المحددة من البيانات داخل الخلية مباشرة (باللون الأزرق) وانحراف البيانات الناتج عن موازنة الأس الهيدروجيني إلى 6.25 (أحمر) و 6.72 (أسود). (جي) ملفات تعريف الطاقة الحرة لـ SOD1 I35A بدون ملح مضاف (برتقالي) وبكميات متزايدة من كلوريد الصوديوم ، حتى 300 ملي مولار. (ح) درجات حرارة الانصهار لـ SOD1 I35A بتركيزات كلوريد الصوديوم المستخدمة في جي.

المعلمات الديناميكية الحرارية لبيانات الخلية وفي عناصر التحكم في المختبر

تعزز الخلايا الانكشاف العالمي لـ SOD1 I35A.

عند النقل إلى خلايا الثدييات A2780 ، يتزعزع البروتين SOD1 I35A بشكل واضح: عند 37 درجة مئوية ، يتحول توازن الطي أربعة أضعاف نحو الحالة المشوهة (الشكل 2 والجدول 1). والجدير بالذكر أن هذا التأثير هو عكس ذلك المتوقع من الازدحام الفراغي (11 ⇓ -13) ويشير إلى وجود تفاعلات جذابة بين SOD1 I35A والوسط داخل الخلايا. تتم الإشارة إلى طبيعة هذه التفاعلات من خلال اعتماد درجة الحرارة على الاستقرار داخل الخلية. داخل الخلايا ، يُظهر انتقال D ⇄ N زيادة بنسبة 37 ٪ بمقدار Δجص (الجدول S2) ، مما أدى إلى تضييق التحولات الحرارية تتكشف (الشكل 2). أيضًا ، تظل الأنواع D و N في توازن ديناميكي خلال تجارب 4 ساعات ، دون انجراف كبير في المجموعات السكانية أو فقدان مادة البروتين (ضوابط SI والشكل S4ج). نظرًا لأن التحولات الكيميائية بالرنين المغناطيسي النووي وتوسيع الخط تشير إلى أن بنية N الداخلية تظل دون تغيير وخالية من التفاعلات المحددة (الشكل S3) ، فمن المعقول استنتاج أن Δجص ترجع الزيادة بشكل أساسي إلى التعديل داخل الخلية لـ D. للتحكم في انحراف البيانات عن طريق تحولات الأس الهيدروجيني الناتجة عن درجة الحرارة والقوة الأيونية ، انظر ضوابط SI والشكل S4 دح. كاختبار إضافي ، أجرينا تجارب داخل الخلية على SOD1 I35A مفرط التعبير في الإشريكية القولونية (الصورة 2). تظهر النتائج أن بكتريا قولونية النقصان تيم إلى مدى أصغر من خلايا A2780 ، لكنه يرفع ΔجيD-N(تي) الملف الشخصي لاستقرار أقل بشكل عام (الشكل 2). يقترن هذا المصعد بزيادة كبيرة في نقطة المنتصف الباردة التي تتكشف ، والتي تنتقل إلى النظام الفسيولوجي عند تيج = 8.4 ± 1.7 درجة مئوية (الجدول 1) ، وتتحول درجة الحرارة لأقصى استقرار SOD1 I35A من 14 درجة مئوية في خلايا الثدييات إلى 20 درجة مئوية في بكتريا قولونية (الشكل 2 ، الجدول 1 ، بيانات SI، والشكل S5 أ, ح، و أنا). وهكذا ، اذا حكمنا من خلال تيم وحدها ، فإن خلايا الثدييات تبدو مخادعة وكأن لها تأثير مزعزع للاستقرار أصغر من بكتريا قولونية، مؤكدين على أهمية توصيف الكل ΔجيD-N(تي) الملف الشخصي في هذا النوع من التجارب. بسبب اتساع الخط الأعلى في بكتريا قولونية الخلايا (الشكل S5 ح و أنا) ، لا يمكننا حاليًا تحديد ذلك بدقة كD-N = [N] / [D] أقل من 10 درجات مئوية ، وبالتالي التأثير الدقيق على Δجص. من Δجص زيادة في خلايا الثدييات ، ومع ذلك ، يُشار إلى أن عدم استقرار SOD1 I35A يكون مصحوبًا هنا بزيادة مساحة السطح للحالة المحوَّلة. يبدو أن الهياكل الأساسية لـ D ، والتي لوحظ أنها انهارت نسبيًا في الماء النقي (40) ، تتوسع عند التفاعل مع المكونات داخل الخلايا. يتوافق هذا التوسع أيضًا مع الملاحظات السابقة حول زيادة الانكشاف م القيم في بكتريا قولونية (21) وزيادة حساسية درجة الحرارة من حركية انعكاس البروتين في خلايا الثدييات (18).

تقدير كمية استقرار البروتين داخل الخلية. (أ) توضيح تخطيطي لتسليم البروتين عن طريق التثقيب الكهربائي. تنتج الطريقة تركيزات داخل الخلايا من SOD1 I35A = 20-30 ميكرومتر ، مطابقة لتركيزات SOD1 البشرية في الفئران المعدلة وراثيًا ALS (43) ودراسات التجميع في المختبر (6). (ب) طيفان HMQC متراكبان في الخلية من SOD1 I35A يوضحان أن البروتين مطوي بشكل أساسي عند 17 درجة مئوية (أحمر) وكشف بالكامل بالفعل عند 37 درجة مئوية (أزرق). من مزايا استراتيجية الكشف هذه أن البروتين المستهدف يتم الاحتفاظ به فسيولوجيًا بالكامل وخاليًا من مراسلي التحليل الطيفي المحتمل التداخل. (ج) ΔجيD-N مقابل ملفات تعريف درجة الحرارة بناءً على القياس الكمي لتوازن D / N من أحجام الذروة المتقاطعة Q153. أظهرت النتائج أن كلا من خلايا الثدييات والبكتيريا تزعزع بشكل كبير استقرار SOD1 I35A ، وإن كان ذلك بطرق مختلفة قليلاً. السمة المشتركة هي أن عدم الاستقرار داخل الخلية يغير من حالة البرودة (تيج) ودرجات حرارة الانصهار (تيم) للنظام الفسيولوجي (الجدول 1).

ملفات تعريف الطاقة الحرة المستخدمة في الضوابط المختبرية. المراجع في المختبر (PBS) موضحة باللون البرتقالي. (أ) تأثير بكتريا قولونية lysates على استقرار SOD1 I35A حساس للغاية لإعداد المحللة. (ب) زيادة كميات الطحينة الخاملة Ficoll 70 تزيد من ثبات SOD1 I35A: 50 مجم / مل (أخضر) ، 100 مجم / مل (أحمر) ، 150 مجم / مل (أزرق) ، 200 مجم / مل (أسود) ، 250 مجم / مل مل (وردي). (ج) التأثير المقابل لـ PEG 400: 5٪ (بني) ، 10٪ (أزرق) ، 20٪ (أسود) ، 30٪ (وردي). (د) يؤدي الازدحام مع مساحة سطح الجسم إلى تأثيرات معتدلة فقط: 40 مجم / مل (أحمر) ، و 80 مجم / مل (أزرق) ، و 100 مجم / مل (أسود). (ه) التأثير المقابل لـ 100 مجم / مل holoSOD1 dimer (أحمر). (F) الازدحام بـ TTHA pwt: 50 مجم / مل (أزرق) و 100 مجم / مل (أحمر). (جييؤدي الازدحام باستخدام الليزوزيم إلى زعزعة استقرار ملحوظة حتى عند التركيزات المنخفضة: 30 مجم / مل (أزرق) و 50 مجم / مل (أحمر). (ح و أنا) في-E. القولونية أطياف HMQC لـ SOD1 I35A عند 290 كلفن و 310 كلفن توسيع خط العرض. ومع ذلك ، يمكن استخدام القمم المتقاطعة الضيقة للمحطة الديناميكية C Q153 لتحديد دقيق لمجموعات D و N. (J –L) التشابه الديناميكي الحراري والحركي لـ SOD1 I35A وانخفاض apoSOD1 pwt. يُظهر الصهر الحراري لمتغيري SOD1 آثارًا لا تنفصم. (ك) مقارنة ملفات تعريف الطاقة الحرة لـ SOD1 I35A المستمدة من بيانات NMR (أسود) وبيانات القرص المضغوط (أزرق) وملف تعريف الطاقة الحرة لـ apoSOD1 pwt المستمدة من بيانات القرص المضغوط (أحمر). (إل) يُظهر SOD1 I35A و apoSOD1 pwt معدلات تكشف مماثلة واعتماد خطي مماثل لليوريا ، مما يشير إلى هياكل مطوية مماثلة (66).

الوصف الرسمي للتفاعلات داخل الخلية.

شريطة أن تكون التفاعلات بين SOD1 I35A والبيئة داخل الخلايا ضعيفة بشكل عام ، كما هو مقترح في بيانات NMR ، فمن الممكن وصف تأثيرها رسميًا على توازن D-N على النحو التالي. افترض أن أحدهم يحتوي على عدد من المكونات الخلوية التركيز جي. لكل مكون ، يتم إعطاء إمكانية التفاعل مع SOD1 I35A بواسطة Uاي جاي(صاي جاي,<τ>) ، أين أنا تشير إما إلى N أو D ، صاي جاي هو الموضع النسبي ل أنا و ي، و τ يشير إلى جميع الإحداثيات الأخرى اللازمة لوصف الإمكانات. التأثير على توازن D ⇌ N للتفاعلات غير المحددة U (صاي جاي) يمكن بعد ذلك قياسها الكمي باستخدام التمدد الفيروسي للضغط الاسموزي والمعامل الفيروسي الثاني هو B ij = - 1 N (τ) ∫ exp <- U ij (r →، τ) k T - 1> d τ dr → ، [3] أين ن(τ) هو تكامل للتطبيع على المتغيرات <τ>. التكامل على مركز فصل الكتلة دصاي جاي يعني أن باي جاي له أبعاد الحجم. ويترتب على علاقة جيبس ​​- دوهيم أن الإمكانات الكيميائية لـ SOD1 I35A في التشكل أنا هو μ i = μ i 0 + k T ln C i + k T ∑ j B ij C j. [4] عندما نهمل شروط الترتيب الأعلى في التمدد الفيروسي ، فإنه يتبع من المعادلة. 4 أن ثابت التوازن في الخلية هو K D-N الخلية = K D-N المرجع exp ، [5] حيث K D - N ref هو المرجع في المختبر. وبالتالي ، اعتمادًا على الاختلاف بين المعاملات الفيروسية في بيئة الخلية ، يمكن تفضيل إما N أو D. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن يكون المجموع فوق مكونات الخلية ي يحتوي على كل من المصطلحات السلبية والإيجابية ، حيث قيمة المعامل الفيروسي باي جاي يتم تحديده من خلال الجهد بين الجزيئات Uاي جاي (مكافئ. 3). المساهمة البغيضة الرئيسية في U المحتملةاي جاي يرجع إلى حجم التفاعل المستبعد. الحجم المستبعد موجود دائمًا ويعطي مساهمة إيجابية في المعامل الفيروسي ، والذي يكون أكبر بالنسبة لـ D الممتد منه بالنسبة لـ N الأكثر ضغطًا إذا كانت هذه هي المساهمة المهيمنة في Bاي جاي، خلية K D - N & lt K D - N ref في Eq. 5 وسيتحول التوازن نحو N: غالبًا ما يشار إلى هذا التثبيت للأنواع ذات الحجم الأصغر بتأثير الازدحام (11 ⇓ –13). بالإضافة إلى تأثير الحجم المستبعد المثير للاشمئزاز ، هناك أيضًا مصطلحات جذابة في الإمكانات بين الجزيئات ، مما يعطي مساهمة سلبية في المعامل الفيروسي. تنبع المساهمات الجذابة المهيمنة ، ولكن ليست الوحيدة ، من التفاعلات المحلية بين المجموعات الأيونية ذات الشحنة المعاكسة وجهات الاتصال غير المكتملة الكارهة للماء. بالنسبة إلى SOD1 I35A ، بشحنة صافية صغيرة ومجموعات أنيونية وكاتونية متقاربة ، من المتوقع أن تُظهر أنواع N المدمجة تفاعلات كهروستاتيكية محلية ضعيفة نسبيًا مع مكونات الخلية الأخرى. من ناحية أخرى ، في حالة D الأكثر اتساعًا ، حيث تنتشر الشحنات ومرنة من الناحية المكانية ، توجد احتمالات أكبر للعثور على مثل هذه التفاعلات الجذابة ، التي تميل إلى صنع | ب دى جى | & GT | ب نيوجيرسي | في مكافئ. 5. تنطبق الحجة المماثلة على التفاعلات الضعيفة الكارهة للماء حيث ، مرة أخرى ، ستستقر المجموعة المشوهة نظرًا لتعرضها العالي للبقع الكارهة للماء في البيئة داخل الخلايا. رسم توضيحي لكيفية إزاحة التشكل D الموسع لخلية K D - N (مكافئ. 5) من خلال توفير المزيد من الفرص للتفاعلات مع المكونات الخلوية من خلال التوازن المزدوج (انظر الشكل 4).

القرائن من الحشود في المختبر.

لتحديد المساهمات بشكل تجريبي في زعزعة الاستقرار داخل الخلية لـ SOD1 I35A ، حددنا تأثير سلسلة من cosolutes المتميزة كيميائيًا في المختبر (بيانات SI والشكل S5 ب- ج). بما يتوافق مع التوقعات من تأثيرات الحجم المستبعدة (12) (مكافئ. 35) ، ينتج عن ficoll 70 "محاكاة الكرة الصلبة" زيادة تدريجية في استقرار SOD1 I35A (الشكل 3). ومع ذلك ، تُظهر البيانات أن أصل هذا التثبيت أكثر تعقيدًا من الناحية الجزيئية من الحجم المستبعد وحده ، لأنه يغلب عليه المحتوى الحراري بطبيعته وبدون تأثير ملحوظ علىجص (الجدول S2). هذا ليس مفاجئًا لأن الأسمولية بشكل عام لا تشغل فقط الحجم ولكن أيضًا تغير الضغط الاسموزي ، مما ينتج عنه مكونات متعددة للتأثير على استقرار البروتين (قارن Eq. 3). نظرًا لأن تأثير ficoll 70 يتناقض مع البيانات الموجودة في الخلية ، يبدو أن مساهمات الحجم المستبعد / الضغط الاسموزي يفوقها معارضة التفاعلات الجذابة في الخلايا الحية (Eq. 5). بعد ذلك ، قمنا بقياس PEG 400 التي تم الإبلاغ عنها على أنها وسيط بين الأسمولية المستقرة والمُحول الكيميائي (41). على غرار ficoll 70 ، ينتج PEG 400 استقرارًا عامًا لـ SOD1 I35A (الشكل 3) ، ولكن مع زيادة مصاحبة لـ Δجص (الجدول S2). يشير الأخير إلى توسع حالة التحريف الصفري لـ SOD1 I35A ، بما يتوافق مع ربط PEG 400 المرصود سابقًا (41) والبيانات الموجودة داخل الخلية (الجدول 1 والجدول S2). لعزل المساهمات المذابة الجذابة بشكل أفضل ، قمنا أخيرًا بتزاحم SOD1 I35A بسلسلة من البروتينات الكروية المختلفة. الافتراض هو أن هذه البروتينات الثابتة هيكليًا تمثل كرات صلبة ذات خصائص سطحية متغيرة تحددها تركيبة الأحماض الأمينية الخاصة بها. كشريك تفاعلي "قوي" مفترض ، استخدمنا الليزوزيم المطوي بشحنة موجبة صافية (+8.5 هـ) ، مما يسمح بإمكانيات تنسيق كهروستاتيكي متعددة مع أنواع SOD1 I35A سالبة الشحنة (−0.5 هـ) (الجدول S3). لتقليل أي تأثيرات معاكسة للحجم المستبعد ، أجرينا التجارب في نظام التركيز المنخفض لـ [الليزوزيم] = 0 مجم / مل ، 30 مجم / مل ، و 50 مجم / مل. على عكس الأسمولات الخاملة ، فإن الليزوزيم يعزز عدم استقرار ملحوظ لـ SOD1 I35A (الشكل 3 ، الجدول 1 ، والجدول S2). من ناحية أخرى ، لا يظهر ألبومين المصل البقري السلبي (BSA) (−8.5 e) وبروتين ربط المعادن الثقيلة المزعوم البكتيري TTHA pwt (−1.5 e) ، أي تأثير أو تأثير ضئيل على استقرار SOD1 I35A ، في حين أن السيستين المستنفد SOD1 dimer ، holoSOD1 dimer (−5 e) ، ينتج عنه استقرار طفيف (الشكل 3 ، الجدول 1 ، والجدول S2). تُظهر هذه النتائج مجتمعة أن تأثير البروتينات المحيطة متغير ويعتمد على ميزات سطحها التفصيلية. لا تتوافق الملاحظة فقط مع القاعدة القائلة بأن تفاعلات البروتين والبروتين محددة التسلسل ، ولكنها تؤكد أيضًا أن التأثير داخل الخلية يعتمد على تسلسل البروتين المستهدف نفسه: تعتمد إمكانية الجذب على جميع الشركاء في اللعب (مكافئ. 3).

مقارنة بين البيانات في الجسم الحي وفي المختبر ، تُظهر أن الأسمولية تنتج تغيرات ثباتية معاكسة لتلك الموجودة في الخلايا ، في حين أن حشود البروتين تسفر عن مجموعة كاملة من التأثيرات ، مما يؤكد اعتماد تسلسل الأحماض الأمينية لتفاعلات البروتين المذاب. تركيزات المذاب A2780 و بكتريا قولونية تُظهر الخلايا تباينًا كبيرًا في الأدبيات (13) ، تمتد على نطاق أشرطة الخطأ.


المساهمة في الديناميكا الحرارية لطي البروتين من تقليل مساحة السطح غير القطبية التي يمكن الوصول إليها بالماء

مشاهدات المقالات هي مجموع تنزيلات النصوص الكاملة للمقالات المتوافقة مع COUNTER منذ نوفمبر 2008 (بتنسيق PDF و HTML) عبر جميع المؤسسات والأفراد. يتم تحديث هذه المقاييس بانتظام لتعكس الاستخدام حتى الأيام القليلة الماضية.

الاقتباسات هي عدد المقالات الأخرى المقتبسة من هذه المقالة ، ويتم حسابها بواسطة Crossref ويتم تحديثها يوميًا. اعثر على مزيد من المعلومات حول عدد الاقتباسات من Crossref.

درجة الانتباه Altmetric هي مقياس كمي للانتباه الذي تلقته مقالة بحثية عبر الإنترنت. سيؤدي النقر فوق أيقونة الكعك إلى تحميل صفحة على altmetric.com تحتوي على تفاصيل إضافية حول النتيجة ووجود وسائل التواصل الاجتماعي للمقالة المحددة. اعثر على مزيد من المعلومات حول "نقاط الانتباه البديلة" وكيفية احتساب النتيجة.

ملحوظة: بدلاً من الملخص ، هذه هي الصفحة الأولى للمقالة.


الديناميكا الحرارية لطي البروتين العفوي: دور التغيرات في المحتوى الحراري - علم الأحياء

حقوق النشر والنسخ 2015 للمؤلف وشركة Scientific Research Publishing Inc.

هذا العمل مُرخص بموجب رخصة المشاع الإبداعي نَسب المُصنَّف (CC BY).

تم استلامه في 10 يناير 2015 قبل 25 يناير 2015 تم نشره في 29 يناير 2015

تتم مراجعة فرضية Anfinsen الديناميكية الحرارية وتوضيح سوء الفهم. يجب أن يطلق عليه حقًا مبدأ الديناميكا الحرارية لطي البروتين. منظر الطاقة هو في الحقيقة مجرد رسم بياني رياضي لوظيفة الطاقة الحرة جيبس ​​، سطح مفرط عالي الأبعاد. بدون معرفة ذلك ، فإن أي صورة لمشهد الطاقة الحرة في جيبس ​​ليس لها أساس نظري ، بما في ذلك ادعاءات شكل القمع. تمت مناقشة الرؤية الجديدة التي قدمتها وظيفة الطاقة الحرة Gibbs التحليلية التي تم الحصول عليها حديثًا /> لطي البروتين المستمدة من خلال ميكانيكا إحصائية الكم. نزاعات مثل على أساس الهدف أو على أساس السبب ما هي قوة الطي ، تأثير كاره للماء أو القوة المحبة للماء؟ تمت مناقشة الجزيء المفرد أو مجموعة الجزيئات التي سيتم استخدامها في دراسة الفيزياء الإحصائية لطي البروتين. تبين أن الملاحظات الكلاسيكية في السبعينيات والثمانينيات حول الخصائص الهندسية العالمية للبنى الأصلية للبروتينات الكروية قد استولت على جوهر طي البروتين ، ولكن للأسف تم نسيانها إلى حد كبير.

طي البروتين ، الطاقة الحرة جيبس ​​، الإحصاء الكمي ، جزيء واحد

1.1 القانون الثاني للديناميكا الحرارية

ينص القانون الثاني للديناميكا الحرارية على أنه في نظام معزول ستزداد الإنتروبيا. بالنسبة لعملية عفوية في نظام درجة حرارة ثابتة /> ، ضغط /> ، وتكوين ، ينص البيان المكافئ للقانون الثاني للديناميكا الحرارية على أن طاقة جيبس ​​الحرة ستنخفض ، وفي حالة التوازن الجديدة ستكون في الحد الأدنى. في الواقع ، هذا ينطبق على أي عملية أو أي تفاعل كيميائي مع درجات حرارة وضغط ثابتين [1]. طاقة جيبس ​​الحرة لها شكل /> ، حيث /> هي الطاقة الداخلية ، /> الضغط ، /> الحجم ، /> درجة الحرارة ، و /> الانتروبيا ، للنظام. حتى /> و /> ليسا منتظمين في النظام ، علاوة على ذلك ، حتى لم يتم تعريفهما جيدًا في النظام ، سيتم خفض الطاقة المجانية المتاحة /> وتقل إلى الحد الأدنى طالما أن الحمام الحراري للنظام يحتوي على درجة حرارة محددة جيدًا والضغط وعلى حدود النظام هما ثوابت /> و /> على التوالي [2]. كان هذا المبدأ الأساسي معروفًا منذ فترة طويلة.

1.2 فرضية الديناميكا الحرارية لـ Anfinsen لطي البروتين

من الأمثلة الجيدة لتطبيق هذا المبدأ الأساسي لرفع النتائج التجريبية إلى النظرية الإرشادية لمزيد من البحث فرضية Anfinsen الحرارية الديناميكية لطي البروتين [3]. بعد سنوات عديدة من العمل التجريبي أثبت أن عملية إعادة تشكيل الريبونوكلياز هي عملية تلقائية ، لخص أنفينسن: "تتطلب الدراسات حول إعادة تشبع الريبونوكلياز المحوَّل بالكامل العديد من التحقيقات الداعمة لتأسيس ، أخيرًا ، العمومية التي أطلقنا عليها أحيانًا اسم" الفرضية الديناميكية الحرارية " ". تنص هذه الفرضية على أن التركيب ثلاثي الأبعاد للبروتين الأصلي في بيئته الفسيولوجية الطبيعية (المذيب ، ودرجة الحموضة ، والقوة الأيونية ، ووجود مكونات أخرى مثل أيونات المعادن أو المجموعات الاصطناعية ، ودرجة الحرارة ، وغيرها) هو الذي يكون فيه جيبس الطاقة الحرة للنظام بأكمله هي الأدنى أي أن التشكل الأصلي يتم تحديده من خلال مجمل التفاعلات الذرية ، وبالتالي من خلال تسلسل الأحماض الأمينية ، في بيئة معينة. " [3].

بمجرد أن نعرف أن طي البروتين هو عملية تلقائية ، يجب ترقية الفرضية الديناميكية الحرارية إلى مبدأ الديناميكا الحرارية. مبدأ الديناميكا الحرارية يجعل مشكلة طي البروتين مشكلة فيزيائية خالصة ، كل المعرفة البيولوجية المطلوبة هي كيفية تحديد البيئة الفسيولوجية لبروتين معين وكيفية تبسيط البيئة بشكل معقول لمزيد من الدراسة.

ولكن لم يتم التعرف على هذا حتى الآن ، وبدلاً من ذلك ، يُعتقد أنه في المشكلات البيولوجية مثل النظر في طي البروتين ، يعتبر الاعتبار النظري غير عملي. من قبيل الصدفة ، في أوائل السبعينيات ، في نفس الوقت الذي أسس فيه Anfinsen مبدأ الديناميكا الحرارية لطي البروتين ، دخل الكمبيوتر في البحث ولعب دورًا أكثر أهمية في أبحاث طي البروتين. تم إهمال النظرية ، وأصبحت المحاكاة ضرورية كما لو كانت تجارب ، لكن العديد منها لا يستطيع تلبية المتطلبات الأساسية للتجارب في العلوم التجريبية ، التكاثر ، انظر [4]. علاوة على ذلك ، نادرًا ما تم التشكيك في تبرير الخلفية النظرية لهذه المحاكاة. يتساءل المرء أنه إذا كانت قوة الكمبيوتر المتزايدة تسترشد حقًا بمبدأ الديناميكا الحرارية ، فربما اليوم لم يعد لغز ظاهرة طي البروتين لغزًا حقًا بعد الآن.

1.3 تم إهمال أسباب مبدأ الديناميكا الحرارية لطي البروتين

لماذا لم يتم اتباع مبدأ الديناميكا الحرارية بشكل نشط ومستمر؟

أولاً ، لا يعتقد البعض أن مبدأ الديناميكا الحرارية صحيح. على سبيل المثال ، في [5] تم الادعاء بأن نظرية Anfinsen قد تم رفضها لفترة طويلة لأن "التعقيدات الأخرى للأنظمة البيولوجية على سبيل المثال المذيبات ذات التركيبات المختلفة قد تؤثر على طي / تفتح البروتينات ، ودور ثابت العزل الكهربائي للماء ، المرافق ساعد في طي البروتينات ووجود وسائط قابلة للطي مستقرة ".

جميع الأسباب المذكورة أعلاه "لرفض" مبدأ الديناميكا الحرارية تنتمي إلى إهمال أنه في مبدأ الديناميكا الحرارية لبيئة طي البروتين تلعب نفس الدور المهم مثل سلسلة الببتيد للبروتين. في الواقع ، لم تدعي Anfinsen أبدًا أن "تسلسل الأحماض الأمينية الأولية لعديد الببتيدات يحتوي على جميع المعلومات الضرورية لتوجيه طيها إلى بروتينات أصلية وظيفية" [6]. بدلاً من ذلك ، شدد Anfinsen على أنه "في بيئة معينة". المذيبات ذات التركيبات المختلفة ، والخصائص الخاصة للمياه ، والمرافقين للمساعدة في الطي ، وما إلى ذلك ، هي من مكونات البيئة. على سبيل المثال ، تحتوي البروتينات الكروية على أبسط بيئة يمكن تبسيطها كجزيئات ماء فقط تحيط بجزيء بروتين. بالنسبة للبروتينات التي تحتاج إلى مرافقين للمساعدة في الطي ، يجب أن تظهر جزيئات المرافق في البيئة. بالنسبة لبروتينات الغشاء ، يجب وصف البيئة على أنها تشتمل على ثلاث طبقات ، والطبقة الوسطى كارهة للماء ، والاثنان الآخران عبارة عن جزيئات ماء بشكل أساسي. بعض البروتينات لن تنثني في البيئات التي لا تحتوي على مكونات معينة ، ولا تعارض مبدأ الديناميكا الحرارية ، بل إن البروتينات ليست في "محيطها الفسيولوجي الطبيعي". هذا مجرد مثال واحد على أن عمومية مبدأ الديناميكا الحرارية غالبًا ما يُساء فهمها ومن ثم يُنظر إليها على أنها خاطئة.

1.3.2. سوء الفهم الناجم عن "نظرية" مشهد الطاقة

ثانيًا ، السبب الرئيسي لمبدأ الديناميكا الحرارية لم يتم اتباعه بشكل كافٍ هو بسبب الالتباسات التي تسببها "نظرية" الطاقة الطبيعية ، كل من EL (منظر طبيعي للطاقة) و GEL (منظر طاقة جيبس) "نظريات". في الواقع لتقليل طاقة جيبس ​​الحرة ، يجب أن يكون لدى المرء وظيفة طاقة حرة جيبس ​​/> ، حيث يكون المتغير /> عبارة عن تشكيل للبروتين /> ، والمعلمة /> هي البيئة الفسيولوجية التي ينطوى فيها البروتين. على الرغم من أن الكثيرين حاولوا اشتقاق /> ، على سبيل المثال ، [7] ، إلا أن جميعها فشلت.

دون معرفة /> ، تحدث "نظريات" المناظر الطبيعية ، مثل "نظرية" جيل. في الواقع ، "نظرية" GEL ليس لها نظرية حقًا ، ومن حيث المبدأ لا يمكنها تفسير أي شيء [8]. جميع صيغ حساب الطاقة الحرة جيبس ​​مخصصة ، دون أي أساس نظري. مصطلحات مثل صيغة الطاقة العشوائية ، مبدأ الحد الأدنى من الإحباط ، ليست سوى استعارة من مجال آخر دون مناقشة التبرير ، انظر [8]. على وجه الخصوص ، على الرغم من أن البروتينات تنثني في بيئة ثابتة ، فإن GEL لها درجات حرارة مختلفة عديدة لاستخدامها في حساب طاقات جيبس ​​الحرة ذات التركيبات المختلفة ، [9] ، وهو أمر خاطئ من حيث المبدأ. بمعنى ، إذا اخترع المرء نظرية لشرح ظاهرة طبيعية ، فلا يمكنه إضافة شيء غير موجود في الظاهرة الطبيعية.

في الواقع ، GEL هو مجرد رسم بياني لـ /> ، سطح مفرط عالي الأبعاد (البعد /> على الأقل أكثر من 200 لسلسلة ببتيد 100 بقايا). يفهم المدافعون عن GEL هذا تمامًا ، على سبيل المثال ، في [10] ، ورد أنه "في مجال الكيمياء الفيزيائية ، يُعرَّف المشهد الطاقي لنظام مذيب البروتين على أنه وظيفة طاقة /> ، حيث /> متغيرات تحديد الحالات المجهرية للبروتين ". تحاول "نظرية" GEL إنتاج صور ذات أبعاد عالية جدًا للسطح السفلي. بالطبع ، لا يمكن لأحد أن يخترق البعد العالي المثبط لهذا السطح السفلي ، في محاولة لإظهاره كسطح ثنائي الأبعاد يعطي العديد من الاستعارات المضللة مثل "شكل قمع" ، يسبب ارتباكًا أكثر من الفهم.

وبالتالي ، إذا علمنا /> ، فإن تصوير الرسم البياني الخاص به لا يؤدي إلا إلى حدوث مشكلة ، فنحن في الحقيقة لا نحتاج إلى GEL. إذا لم نكن نعرف ما هو / ، فإن "نظرية" GEL تقوم فقط بحسابات مخصصة لطاقة جيبس ​​الحرة بمطابقات مختلفة بدون قاعدة نظرية وبدون تناسق. لا عجب أنه تسبب في سوء فهم أكثر من فهم مبدأ الديناميكا الحرارية لطي البروتين.

على سبيل المثال ، في [1] يُزعم أن اتباع مبدأ الديناميكا الحرارية (المكافئ لـ GEL) يؤدي إلى عيوب ، ولن يساعد مبدأ الديناميكا الحرارية في حل مشكلة طي البروتين [5] ، [11].

1.3.3. نقص التدريب الرياضي

أحد الأسباب الرئيسية لـ GEL ، في الواقع ، أن مبدأ الديناميكا الحرارية ، لن يساعد في حل مشكلة طي البروتين هو أن القانون الثاني للديناميكا الحرارية لا يمكن أن يضمن أن طاقة جيبس ​​الحرة /> سيكون لها الحد الأدنى العالمي [6]. على الرغم من عدم وجود صيغة واضحة لدينا ، فإن القليل من المعرفة الرياضية سيساعد في توضيح هذا الموقف. على سبيل المثال ، يمكن دائمًا لوظيفة شبه مستمرة أن تحقق الحد الأدنى لها في مجموعة مضغوطة هي نظرية في الرياضيات. نظرًا لأن قطر أي شكل محدد بشكل موحد ، فإن نطاق تعريف /> موجود بالتأكيد في مجموعة مضغوطة في مساحة إقليدية ذات أبعاد أعلى. من الصعب تصوير أن وظيفة الطاقة أسوأ من منخفضة شبه مستمرة ، وبالتالي /> يجب أن يكون لها حد أدنى عالمي. بالإضافة إلى ذلك ، تم مؤخرًا اشتقاق معادلة تحليلية /> للبروتينات الكروية الأحادية من خلال الإحصاء الكمي ، [12] - [15] ، وهذه الوظيفة بالتأكيد مستمرة ، انظر (6). في [6] ، دحض ادعاء شكل قمع GEL من خلال الشك في وجود حد أدنى عالمي ليس حجة جيدة.

1.3.4. هل يجب أن يكون الهيكل المحلي مجرد حد أدنى محلي؟

سبب رئيسي آخر لـ GEL لن يساعد في حل مشكلة طي البروتين هو أن التركيب الأصلي للبروتين ربما يكون فقط عند الحد الأدنى المحلي ، بدلاً من الحد الأدنى العالمي للطاقة الحرة Gibbs. هذا ممكن ، ولكن في ظروف لا تتعارض مع القانون الثاني للديناميكا الحرارية ، وبالتالي لن ينفي مبدأ الديناميكا الحرارية. في هذه الحالة ، سيحدد التشكل الأولي النقاط الدنيا التي سيتم تحقيقها من خلال البنية الأصلية. يجب أن نعرف المزيد عن التشكل لسلسلة البولي ببتيد المركب حديثًا في الخلية. هل هو دائمًا نفس الشكل أم أنه يختلف مع كل جزيء على حدة؟ إذا كانت هي الأولى ، فإن البدء بالتشكيلات الأولية الأخرى قد يؤدي إلى حدود دنيا محلية أو عالمية مختلفة عن البنية الأصلية. إذا كان هذا هو الأحدث ، فربما يكون الهيكل الأصلي حقًا هو الحد الأدنى العالمي الفريد ، نظرًا لأن البدء من جميع المطابقات الأولية يؤدي إلى نفس البنية الأصلية. إذا حكمنا من نتائج تجربة تمسخ / إعادة تكوين الريبونوكلياز ، فإن الريبونوكلياز المحوَّل لا يزال يحتفظ بوظيفة بيولوجية بنسبة 1٪. نظرًا لوجود 105 أنماطًا للوفاء بسندات ثنائي الكبريتيد الأربعة ، يمكننا أن نستنتج أنه ربما يكون لكل نمط من الأنماط 105 نسبة مماثلة في الحالة المشوهة. ومع ذلك ، فإن كل هذه المطابقات الأولية تعود إلى نفس البنية الأصلية التي يكون للبروتين فيها وظيفة بيولوجية بنسبة 100٪. وبالتالي يمكننا أن نستنتج أنه بالنسبة للريبونوكلياز ، فإن /> لديها بالفعل حد أدنى عالمي فريد. نظرًا لأن هذه كانت المعرفة الكاملة التي كان Anfinsen معروفًا بها ، فقد افترض أن طاقة جيبس ​​الحرة "الأقل". النظر في بعض التشكل الأولي يؤدي إلى بعض التقليل ، محلي أو عالمي ، تعديل مبدأ الديناميكا الحرارية للاعتراف بالحد الأدنى المحلي لن يضر بالمبدأ.

1.3.5. بيئة خاطئة

تمت مناقشة قلق مشروع حقًا بشأن مبدأ الديناميكا الحرارية في [16]. هذا ما تقوله

"وفقًا لهذه الفرضية ، إذا حددنا /> على أنها طاقة جيبس ​​الحرة G لبروتين مطوي في حالته الأصلية N ، /> هو الحد الأدنى العالمي لوظيفة الطاقة الحرة للبروتين />. ومع ذلك ، لا يمكن الوصول إلى /> إلا إذا كانت N هي حالة التوازن الحالية للظروف الديناميكية الحرارية الأصلية />. نحن نصف مجموعة الحالة /> as /> ، حيث /> و /> هي ضغط التوازن ودرجة الحرارة لبروتين في الحالة X مع التشكل />. نحن نفترض ثابتين T و P ونستخدم تركيبة المذيب المجهري الوحيدة /> لتحديد الظروف الحالية لـ X. لذلك ، يبدو أن فرضية Anfinsen الديناميكية الحرارية منطقية. في الواقع ، من القانون الثاني (عند الثابتين T و P) ، يجب الحصول على تغيير حر للطاقة /> لأي مسار ديناميكي حراري لتخفيف حالة عدم التوازن X إلى حالة التوازن الأصلي المطوي N مع الطاقات الحرة المعنية /> و />. /> و /> هي التركيبة الأصلية وتكوين المذيب ، على التوالي. المأزق المحتمل هو أن /> طاقة حرة غير متوازنة لأن /> ليست في حالة توازن لـ />. التغيير الحقيقي في الطاقة الحرة الذي يجب مراعاته في مسار حيث يكون للحالة الوسيطة X وقتًا كافيًا للوصول إلى التوازن هو /> ، حيث /> (نعتقد أن هذا خطأ لـ /> ، وإلا />) يكون التوازن خاليًا الطاقة من أجل />. لذلك ، لا يمكن لفرضية Anfinsen الديناميكية الحرارية أن تثبت بشكل جيد إلا إذا />. ومع ذلك ، لا يمكن استبعاد الحالات التي يكون فيها /> حدًا أدنى عميقًا مع /> ، مما قد يؤدي إلى />. "

النقطة المهمة هي أن تركيبة المذيب /> تختلف حقًا وفقًا للتشكيل /> ، أي أنه لا يوجد أي تكوين مذيب مشترك /> ، انظر القسم التالي حول الصيغة /> ، حيث /> هي الطبقة المائية الأولى من التشكل /> وهو جزء من النظام الديناميكي الحراري /> لكل شكل /> ، و /> هو في الحقيقة طاقة جيبس ​​الحرة للنظام الحراري الديناميكي />. بالنسبة للتوازن ، يجب اعتبار عملية طي البروتين عملية شبه ثابتة ، وكما ذكرنا سابقًا ، نحتاج فقط إلى أن يكون للحمام الحراري درجة حرارة ثابتة /> وضغط /> ، وفي هذه الحالة يكون القانون الثاني للديناميكا الحرارية هو أن الطاقة المتاحة تحصل على الحد الأدنى كما هو مذكور في البداية وفقًا لـ [2].

بعد توضيح هذه الشكوك حول مبدأ الديناميكا الحرارية ، سوف نوضح ما هو /> وننظر إلى بعض الأفكار الجديدة التي يقدمها.

2. الصيغة />

لن نعطي اشتقاق /> ، الذي تم في [12] - [15] ، بنفس الفكرة ولكن بشكل تدريجي فهم أفضل لفيزياء الكم. نحن نركز على الأسباب المنطقية القادمة من فهم مبدأ الديناميكا الحرارية لطي البروتين.

فهمنا لمبدأ الديناميكا الحرارية هو أنه يركز على النظرة الشاملة ، ويتطلب طريقة جزيء واحد وإحصاءات كمومية بدلاً من الإحصائيات الكلاسيكية لاشتقاق معادلة جيبس ​​للطاقة الحرة />.

2.1. لا يمكن أن تكون الوظيفة /> مجموع المساهمات المحلية

على عكس وظيفة الطاقة الكامنة ، فإن وظيفة الطاقة الحرة Gibbs ، أو GEL ، ليست مضافة زوجية كما تم الإشارة إليه في [6]. في الواقع ، لا يمكننا أولاً التفكير في المساهمات المحلية ثم تلخيصها للحصول على طاقة جيبس ​​المجانية. هذا ما أكده Anfinsen في العبارة "أي أن التشكل الأصلي يتم تحديده من خلال مجمل التفاعلات الذرية ، وبالتالي من خلال تسلسل الأحماض الأمينية ، في بيئة معينة." [3].

لذلك عند محاولة اشتقاق /> بالمبدأ الأول ، لا يمكننا تقسيم /> إلى عدة أجزاء ، والنظر في كل جزء ، وتلخيص طاقات جيبس ​​الحرة لجميع هذه الأجزاء. في الواقع ، لا يمكننا حتى أن نأخذ نموذجًا خشنًا للتشكيل لمحاولة اشتقاق /> ، لأن مساهمة الذرة في الكل لا يمكن فصلها. ومن ثم بالنسبة لنا ، فإن التشكل هو إحداثيات المراكز الذرية لجميع الذرات /> للبروتين المعطى /> ، مثل />. بالنسبة للبروتينات التي تحتوي على أكثر من سلاسل ببتيد متعددة ، يجب النظر في جميع السلاسل معًا ، على سبيل المثال ، let /> ، /> ، /> ، then />.

2.2. العلاج بجزيء واحد ضروري

مثل أي محاكاة حاسوبية لطي البروتين ، نصف جزيء بروتين واحد فقط في تركيبات مختلفة /> ، وليس مجموعة من (نفس) جزيئات البروتين التي تأخذ كل منها شكلاً. لاشتقاق /> ، من الطبيعي أن يحتاج المرء إلى اعتماد الفيزياء الإحصائية. عند تطبيق الإحصائيات ، من الطبيعي أن يعتقد المرء أنه يجب أن يكون هناك العديد من النسخ لنفس الكائن ، مثل جزيء البروتين ، لتشكيل مجموعة. تم متابعة هذا من قبل الكثيرين ، انظر على سبيل المثال ، [7] ، حيث تم إجراء عمليات تكامل على جميع المطابقات الجزيئية للمجموعة باستثناء واحد /> للحصول على />. مع تكامل غير قابل للتكامل (في الواقع ، هو في شكل أسي) وبدون تحديد واضح للمجال المتكامل ، فإن الصيغة التي تم الحصول عليها /> هي دالة معقدة غير معروفة مدفونة في تكامل متعدد الأبعاد. والأسوأ من ذلك ، أن /> ليست حتى طاقة جيبس ​​الحرة. ومع ذلك ، أطلق عليها مؤلفو [7] الطاقة الفعالة واستخدموها في العديد من الأماكن كما لو كانت تتبع مبدأ الديناميكا الحرارية.هذا مثال ممتاز على البدء من مبدأ الديناميكا الحرارية وينتهي الأمر بتعبيرات مجازية ومحاكاة حاسوبية لا نهاية لها للتغطية على الفقر النظري. باتباع هذا الاتجاه ، لن يتم حل مشكلة طي البروتين أبدًا.

نظرًا لأن إحدى مهام مشكلة طي البروتين هي معرفة البنية الأصلية للبروتين الفردي ، ولكن في مجموعة الجزيئات ، تتجاهل جميع الطرق المتاحة في الواقع هياكل الجزيء الفردي ، فلا يمكننا استخدام طريقة التجميع. لذلك ، علينا أن نأخذ جزيءًا واحدًا /> ، ونعتبر التشكل التعسفي منه ، ومعرفة النظام الديناميكي الحراري وهو مصمم خصيصًا للتوافق ويحتوي على البيئة المحيطة المباشرة لـ. أخيرًا ، طاقة جيبس ​​الحرة هي طاقة جيبس ​​الحرة للنظام الحراري الديناميكي.

2.3 الإحصاءات الكلاسيكية أم الكم؟

علينا معرفة كيفية عمل إحصائيات حول هذا النظام الديناميكي الحراري. تمت تجربة كل من الإحصائيات الكلاسيكية والكمية ، انظر [12] ، حيث تفتقد النتيجة الكلاسيكية لمساهمة الحجم في الصيغة (6). ضع في اعتبارك أن الميكانيكا الكلاسيكية لا تصلح لوصف فيزياء كائنات الجزيء وحتى حجم الجزيء الكلي ، فنحن نختار الإحصائيات الكمومية. علاوة على ذلك ، ستسمح لنا الإحصائيات الكمومية بإجراء المزيد من الدراسات النظرية حول طي البروتين ، إذا تمكنا من التعامل مع وظيفة الكثافة الإلكترونية المحددة في [17] ، والتي لا يمكننا القيام بها حاليًا. تحمل هذه الوظيفة أصول تصنيفنا لمستوى الكراهية للماء في القسم الفرعي 2.6.

2.4 أهمية البيئة

نظامنا الديناميكي الحراري المصمم خصيصًا في الواقع يحتوي على البيئة المحيطة المباشرة للتشكيل. تأتي المعرفة البيولوجية هنا لمساعدتنا في وصف وإجراء التبسيط الضروري والمنطقي لهذه البيئة المباشرة. على سبيل المثال ، يُعرف بالبروتينات الكروية ، يمكننا ببساطة افتراض أنه في الحالة الفسيولوجية فقط جزيئات الماء المحيطة بالتشكيل مباشرة. بالنسبة لبروتينات الغشاء ، يجب أن تحتوي البيئة المباشرة على ثلاث طبقات متوازية على الأقل ، وجزيئات الماء في الطبقتين الخارجيتين ويكون الوسط كارهًا للماء. بالنسبة للبروتينات التي تحتاج إلى مساعدة المرافقين على الانطواء ، يجب احتواء هذه المرافقين في البيئة المباشرة للتشكيل. هذه أيضًا وجهة نظر شاملة ، بدون المرافقين ، يكون البروتين في بيئة خاطئة وسينثني إلى بنية أخرى ، أو لا يوجد هيكل على الإطلاق ، مما يعني أن العديد من المطابقات المختلفة تحقق الحد الأدنى من طاقة جيبس ​​الحرة.

منذ باستثناء البروتينات الكروية الأحادية ، لم نكتشف كيفية التعامل مع البيئة ، وظيفتنا الحالية هو فقط للبروتينات الكروية الأحادية.

2.5 النظام الديناميكي الحراري للبروتينات الكروية أحادية

نظرًا لأن البروتينات الكروية فقط هي التي تسمح لنا بتبسيط بيئتها الفسيولوجية باعتبارها تتكون من جزيئات الماء فقط ، فإننا سنعمل فقط على البروتينات الكروية الأحادية هنا. تشكيل بروتين كروي بوليمري هو,. نظريا ، وظيفتنا يمكن تعميمها دون أي صعوبة نظرية للبروتينات الكروية البوليمرية. لكن لتطبيقه سنواجه مشكلة الالتحام ، أي فكر والمواقف النسبية بينهما'س. هذا صعب للغاية في الوقت الحالي.

أولا ، التشكل بحكم التعريف يعيش في، ولكن تعريف الكتاب المدرسي للنظام الديناميكي الحراري هو أنه منطقة فيراجع ، على سبيل المثال ، [18]. لنصنع او لنبتكر، نحن نعتبر، أين

هي كرة صلبة نصف قطرها وتركزت في. أساسا جنبا إلى جنب مع الطبقة الأولى من جزيئات الماء سيكون لدينا. هنا افترضنا أن كل ذرةشكل كرة صلبة بنصف قطر فان دير فال. على الرغم من أن شكل كل ذرة في يتم تعريفها جيدًا من خلال نظرية الذرات في الجزيئات [17] ، ما يثير قلقنا هنا هو الشكل العام للهيكل. قطع كثافة الإلكترون في [17] ، يعطي الشكل العام للبنية الجزيئية التي تشبه تمامًا، مجموعة من الكرات المتداخلة. علاوة على ذلك ، فإن حدود القطع هو تقريبا نفس السطح الجزيئي التي حددها ريتشاردز في عام 1977 [19] وفي عامي 1992 و 1993 ، [20] و [21] تبين أنها سطح حد أكثر ملاءمة من من الأسطح الأخرى.

لشرح الصيغة، علينا أن نصف بالتفصيل.

بشكل عام ، أي سطح مغلق (متصل ، محدد ، وليس له حدود ، على سبيل المثال ، كرة) سوف يقسم إلى ثلاثة أجزاء ،

(1)

أين هو مجال محدود (مجموعة مفتوحة متصلة) و مجال غير محدود ، تعني حدود.

دحرجة كرة نصف قطرها على سطح الحدود من سوف ينتج سطح جزيئي [19]. يترك يكون قطر جزيء الماء ويشير إلى السطح الجزيئي كما. لو متصل ، ثم يمكننا استخدامها في 1). لو له عدة مكونات متصلة, ، مثل ذلك هو أكبر مكون ، أي جميع المكونات الأخرى لـ ترد في (هذه هي الحالة التي لديها التجاويف, ، كل منها كبير بما يكفي لاحتواء جزيء الماء) ، ثم قم بالإشارة إليه و. وهكذا ، لدينا دائما

(2)

(3)

كن أول غلاف ترطيب يحيط به. ثم تم تصميم النظام الديناميكي الحراري للتشكيل يكون

(4)

يجب ألا تحتوي أي صيغة للطاقة الحرة من Gibbs على شكل عام إلى حد ما لجميع البروتينات ، أو على الأقل فئة من البروتينات مثل البروتينات الكروية الأحادية ، ولكن يجب أيضًا أن تكون قادرة على التمييز بين البروتينات المختلفة. هذا يعني أنه إذا و نوعان من البروتينات المختلفة مع نفس العدد من الذرات ، على سبيل المثال. ثم حتى يظهر في وقت واحد كتوافق على حد سواء و, و ليست متطابقة في أي حي. على وجه الخصوص ، حتى و لها نفس القيم الدنيا ، و يجب أن يكون لديهم هياكل أصلية مختلفة ، إذا كان لديهم هياكل أصلية على الإطلاق.

ومن ثم ، يجب أن نجد طريقة لتمييز البروتينات من خلال سلاسل الببتيد الخاصة بها. أصعب مهمة هي تلك التي تعطى سلسلة الببتيد، يترك يكون عدد الأحماض الأمينية يظهر في، خلط الأحماض الأمينيةمن حولنا تسلسل الأحماض الأمينية المختلفة ، الصيغة يجب أن يكون قادرًا على التمييز بين كل هذه الأشياء سلاسل الببتيد. على سبيل المثال ، يجب أن يكون هناك مشاكل التصغير المختلفة في (9) ، على الرغم من أن أدوات التخفيض قد تختلف قليلاً فقط بالنسبة لبعضها.

لهذا الغرض ، نقسم الذرات في بروتين وفقًا لمستويات نفاذه للماء. توجد الذرات في جزيء البروتين بشكل طبيعي في مجموعات أو شقوق ذرية لها خصائص فيزيائية كيميائية مختلفة. إحدى هذه الخصائص هي أن توزيعات الشحنة الإلكترونية تسببت في ميل تكوين روابط هيدروجينية إما مع شقوق أخرى (داخل الجزيئية) أو مع جزيئات أخرى في البيئة (بين الجزيئات). وفقًا لذلك ، يمكننا تقسيم مجموعات الذرة أو الشقوق إلى مستويات مختلفة من كره الماء ، من أكثرها كارهًا للماء (لا يمكنها تكوين رابطة هيدروجينية) إلى أكثرها مقاومة للماء ، على سبيل المثال. المستويات,. ثم يمكننا تخصيص ذرة في مستوى واحد كاره للماء لو ينتمي إلى مجموعة الذرة. على سبيل المثال ، قد نفترض أن التصنيف كما في [22] ، هناك فصول ، C ، O / N ، O؟ ، N + ، S. على عكس [22] ، نصنف أيضًا كل ذرة هيدروجين إلى واحدة من مجموعات مستوى الكراهية للماء. لاحظ أن هذا التصنيف مستقل عن المطابقة ، فهو يعتمد فقط على سلسلة الببتيد.

لأي مجموعة مدمجة (مغلقة ومحدودة)، يترك تكون المسافة بين النقطة والمجموعة الفرعية. تحديد المجموعات المدمجة, ، من ثم. تحديد الأسطح تحتية في,

(5)

أين هي مجموعة النقاط التي تنتمي إلى لكن لا تنتمي إلى.

لكل مستوى مسعور، هناك إمكانية كيميائية، بحيث تلامس جزيئات الماء سوف تكسب طاقة جيبس ​​الحرة. وبالمثل ، هناك إمكانية كيميائية للإلكترونات بالداخل. يترك هو متوسط ​​عدد جزيئات الماء التي يمكن أن تلامس في نفس الوقت في مساحة الوحدة ، إذن سيكون الجهد الكيميائي لكل وحدة مساحة. علاوة على ذلك ، منذ انحناء مقيد بشكل موحد لجميع التكوينات,لا تعتمد على التوافق.

2.7. الصيغة

يترك يكون حجم و مساحة السطح. الآن يمكننا كتابة صيغة جيبس ​​التحليلية للطاقة الحرة.

النظرية 1 Let يكون بروتين كروي أحادي مع ذرات و يكون التشكل. يترك تكون الشحنات الإلكترونية في نواة.

(6)

في [12] - [15] ، يحصل الاشتقاق الإحصائي الكمي أولاً على صيغة وسيطة ، وهي مألوفة كثيرًا ولكن لها معنى جديد لـ:

(7)

أين وهي متوسط ​​عدد الإلكترونات في وجزيئات الماء التي تلامس. علاوة على ذلك ، هناك ملف مثل ذلك لذلك حدد. استخدام وتحلل الحجم

(8)

مع المنشأة من الناحية النظرية، لا يصبح التنبؤ بالبنية ab initio ممكنًا فحسب ، بل يصبح بسيطًا أيضًا. إنها مشكلة رياضية محض البحث عن الحد الأدنى من. هذا هو ، دعونا كن الهيكل الأصلي ، إذن

(9)

أو ، في حالة ذلك ليست سوى أداة تصغير محلية ، يجب أن تفي بما يلي:

(10)

كما تمت مناقشته من قبل ، في هذه الحالة ، التشكل الأولي أنه مهم. إذا كانت المعرفة البيولوجية بما في ذلك تشكيل سلسلة الببتيد الوليدة ، فيجب علينا استخدامها.

لحل المشكلة (9) ، ليست هناك حاجة للبحث عن المناظر الطبيعية كما نراها مهمة جدًا في "نظرية" GEL [9]. ما عليك سوى اتباع (التدرج السلبي لـ في) من أي تشكّل أولي إلى, و هو رقم موجب صغير. إذا كان GEL على شكل قمع بالفعل ، فسيتم الوصول إلى الهيكل الأصلي في النهاية من خلال طريقة نيوتن الكلاسيكية الهابطة.

عندما تأخذ البنية الأصلية حدًا أدنى محليًا فقط بدلاً من بنية عالمية ، يتعين علينا تجربة مطابقة أولية مختلفة، للحصول على أكبر عدد ممكن من أدوات التصغير المحلية (مثل ذلك) عن طريق أعلى طريقة هبوط نيوتن الأسرع. يجب أن يكون الهيكل الأصلي واحدًا من'س. هناك حاجة إلى معلومات أخرى لتحديد أيهما.

بالطبع يمكننا استخدام مجموعة أخرى من المتغيرات ، أي الزوايا ثنائية الأضلاع، بما في ذلك كل زوايا ثنائية الأضلاع قابلة للتوجيه ، في السلسلة الرئيسية أو السلاسل الجانبية. الزوايا ثنائية الأضلاع المقابلة للرابطة التساهمية داخل حلقة بنسن هي مثال على زاوية ثنائية السطح غير قابلة للدوران.

في الواقع ، الزوايا ثنائية الأضلاع هي المتغيرات الأكثر فاعلية في حل (9) و (10). للصيغ المشتقة الصريحة من، يرجى مراجعة [23] و [13].

3.2 فهم عملية الطي

مشتق نظريا يمكن أن يفسر الظواهر المختلفة في عملية الطي. على سبيل المثال ، لأن قوة الطي هي، أي أن عملية الطي الطبيعية ستتبع أسرع هبوط لنيوتن

المسار ، التشكل الأولي يحدد مسار الطي. لاختبار شكل GEL ، يمكن للمرء اختيار أكبر عدد ممكن من المطابقات الأولية وتطبيق أسرع طريقة تنازلية للعثور على حل (10) ، أي التشكل مثل ذلك. إذا كانت جميع المطابقات الأولية تؤدي إلى نفس الحل، ثم المناظر الطبيعية جل هو حقا على شكل قمع. إذا حصلنا على الكثير من الاختلاف، إذن أي واحد هو الهيكل الأصلي بحاجة إلى مزيد من المناقشة بمزيد من المعلومات. ولكن في هذه الحالة ، إذا كان شكل سلسلة الببتيد الوليدة هو نفسه دائمًا ، فلا يزال لدينا مسار واحد قابل للطي ، ويمكننا أيضًا ملاحظة ظاهرة الطي الكلاسيكية ثنائية الطور.

الآن فكر في مجموعة من مطابقة نفس البروتين ،. تعتبر حالة المجموعة هذه أكثر شيوعًا ، وهي في الواقع النظام الديناميكي الحراري الوحيد الذي ظهر في أدبيات طي البروتين حتى الآن. لا يمكن أبدًا استنتاج ظواهر الجزيء الفردي ، مثل شكل البنية الأصلية ، من نظام المجموعة هذا. بدلاً من ذلك ، يجب أن يتركز الاهتمام على معرفة الظواهر الجماعية مثل معدل الطي

ووقت الطي ، وما إلى ذلك. ثم في الواقع يجب أن نفكر في التوزيع. على سبيل المثال ، يشير القانون الثاني للديناميكا الحرارية إلى وجود توزيع بحيث عندما تكون البروتينات في حالة وظيفية كاملة ، لأي توزيع، سيكون ذلك

(11)

أين هي طاقة جيبس ​​الحرة للمجموعة قيد التوزيع. المشكلة هي ، لا أحد يعلمكما اعترف بن نعيم في [24]. أحد الاقتراحات هو أن نطبق وجرب توزيع Boltzmann

(12)

العقلاني هو أن أي تشكّل مع سيكون أصغر من ذلك بكثير,

وبالتالي تقل فرصة الظهور في حالة الوظيفة الكاملة للمجموعة. بالطبع ، هذا مجرد تخمين وليس من المهم معرفة ذلك ، على الأقل ليس كادعاء تم تقديمه في [24]: "إذا كان المرء يعرف هذا التوزيع ، فيمكن عندئذٍ معرفة أي التطابقات أكثر احتمالًا من غيرها بموجب بيئة معينة ". في الواقع ، نعلم جميعًا الآن أنه في الحالة الفسيولوجية ، تكون البنية الأصلية "أكثر احتمالًا من غيرها في بيئة معينة" ، لكننا ما زلنا لا نعرف شكل البنية الأصلية. لذا لحل مشكلة طي البروتين ، على الأقل بالنسبة للتنبؤ بالبنية الأصلية من خلال معرفة تسلسل الأحماض الأمينية ، علينا أن نعرف ما هو وحل (9) أو (10) بأي طريقة رياضية.

في [6] ، يُدعى أن قوة الطي. في [6] يُزعم أيضًا أن البحث في أداة الحد الأدنى في GEL ، كما هو الحال في (9) ، يعتمد على الهدف ، وأن تحديد قوة الطي يعتمد على السبب. في الواقع ، الاستناد إلى الهدف والقائم على السبب ما هي إلا اختلافات مصطنعة. نرى أنه في حل (9) ، ليس لدينا هدف للاقتراب الذاتي وإذا استخدمنا الطريقة الأسرع تحديدًا للعثور على الحد الأدنى ، فنحن حقًا نعتمد على السبب ، لأننا نستخدم القوة بشكل صريح.

3.4. فهم التمسخ وإعادة التشكيل

إذا اشتق نظريا معروف بأي بيئة محددة، على سبيل المثال ، تختلف البيئات فقط في قيم درجة الحرارة ، يمكن أن يفسر تمسخ البروتين وإعادة تشكيله عن طريق البيئات المتغيرة. تغيير البيئة ليقول، الهيكل الأصلي من لن يكون بعد الآن تصغيرًا لـ في المشكلة (9) أو (10) ، لذلك غير مستقر في. وعلاوة على ذلك،. بموجب نفس القانون الثاني للديناميكا الحرارية ، أو مبدأ الديناميكا الحرارية ، ستفرض تصغير، مما ينتج عنه أدوات تصغير مختلفة بخلاف. هذا هو التفسير النظري للتمسخ. لأنواع معينة من البروتينات عندما تكون البيئة يتغير إلى الوراء، أو ما شابهها ، يحدث إعادة الطي بنفس الإجراءات المتبعة في المشكلة (9).

علاوة على ذلك ، وظائف الديناميكا الحرارية المختلفة ، مثل الانتروبيا، يمكن الحصول عليها من قبل الأسرة. على سبيل المثال،

(13)

3.5 مسعور ، محبة للماء ، ما هي قوة الطي؟

هناك جدل ساخن في [6] حول أيهما قوة الطي الرئيسية ، تأثير كاره للماء أم القوة المحبة للماء؟ بمجرد أن نعرفتتحرك على طول اتجاه القوة, سيصبح أصغر. الصفة النوعية لـ هل هذا إذا كان الفصل هو كاره للماء ، إذن، و إذا محبة للماء ، إذن. وبالتالي تقليل المناطق الناهضة للماء (تأثير كاره للماء) أو توسيع المناطق المحبة للماء (القوة المحبة للماء؟) ستقلل من طاقة جيبس ​​الحرة.

من حيث القوة، فإن الوضع أكثر تعقيدًا. النظر في حالة و، يساهمون فيها قوة تدفع لتشكيل جديد مثل ذلك و. يوضح هذا جيدًا أن كلا من التأثير الكارثي للماء والقوة المحبة للماء يلعبان دورهما في تقليل طاقة جيبس ​​الحرة. لكن هذه ليست سوى فترتين في، فإن قيم المصطلحات الأخرى ستحدد في النهاية علامة. و إذا، أوماذا سيحدث؟ لذلك علينا أن نتبنى نظرة شاملة لقوة الطي ، يلعب كل من التأثير الكارهة للماء والقوة المحبة للماء دورهما ، والذي يعتمد على الظروف الملموسة.

لتبسيط مناقشة التأثيرات الكارهة للماء والماء (أو القوة) ، فإننا نعتبر أبسط تصنيف لمستويات كره الماء ، أي ، ، لا يوجد سوى مجموعات ذرات كارهة للماء ومحبة للماء. دل كطبقة كارهة للماء ، كطبقة محبة للماء. في هذه الحالة ، لدينا

(14)

وهكذا ثابت، تكبير يعادل الحد، لا يوجد تمييز بين التأثير الكارهة للماء والقوة المحبة للماء. في هذه الحالة،

(15)

حيث، مزيج من تأثير كاره للماء والقوة المحبة للماء هو تأثير تقليل المنطقة الكارهة للماء. في [25] محاكاة الاختزال وحدها ، كانت النتيجة مثيرة جدًا للاهتمام. الهياكل الثانوية ، مثل حلزونات خيوط المنعطفات ، وظهرت الروابط الهيدروجينية في مطابقة تم الحصول عليها ذات دلالة إحصائية [25]. لاحظ أنه عند التقليل، لا-

تم النظر في البنية الثانوية والرابطة الهيدروجينية. لا يوجد حساب للزوايا ثنائية الأضلاع. لا يوجد اختبار لمواقف المتبرعين والمجموعات المستقبلة ، ناهيك عن أي نية لدفعهم أقرب لتكوين رابطة هيدروجينية. ومع ذلك ، ظهرت الهياكل الثانوية والرابطة الهيدروجينية ذات دلالة إحصائية. قبل هذه المحاكاة ، تم التعرف على أن الرابطة الهيدروجينية يجب أن تُصاغ بشكل صريح لتشكيل اللولب وأن المحاكاة الزوجية دون تحديد الرابطة الهيدروجينية لا يمكن أن تنتج هياكل ثانوية [26].

3.6 تابع عرضًا عالميًا كلاسيكيًا

لو، من ثم في الإصدار (15) هو إدراك للرؤية العالمية الكلاسيكية لخصائص الهندسة العالمية للهياكل الأصلية للبروتينات الكروية. هذه الخصائص هي: 1) الهيكل الأصلي له حجم أصغر 2) الهيكل الأصلي به مساحة أصغر 3) الهيكل الأصلي به قلب مسعور أفضل أو منطقة كارهة للماء أصغرو [19] و [21] و [27] - [31]. تم نسيان هذه الملاحظات المهمة بعد التسعينيات ، وكان الناس أكثر اهتمامًا بمحاكاة الكمبيوتر بناءً على مجال القوة ، و GEL ، و EL ، وما إلى ذلك. وبناءً على هذه الخصائص ، تم تشكيل نموذج ظاهري بالشكل بالضبط (15) مع ثلاثة معاملات إيجابية ، وبالتالي يدعي أن تقليل الحجم والمساحة والمنطقة الكارهة للماء سيؤدي في النهاية إلى البنية الأصلية ، انظر [32] و [25]. علاوة على ذلك ، فإن أول شرطين من الصيغة (15) هما صيغة طاقة جيبس ​​الحرة لتجويف في الماء ، والمعاملان هما الضغط والتوتر السطحي [18]. المبدأ الأول والظواهر ، وكلاهما اشتقا نفس صيغة جيبس ​​للطاقة الحرة ، هل يمكن أن يكون ذلك مجرد مصادفة؟

تم تحليل وتوضيح الأسباب التي أدت إلى رفض فرضية Anfinsen الديناميكية الحرارية على مدى أربعة عقود باعتبارها تؤدي إلى المزالق ، حيث تم رفضها ، نظرًا لعدم وجود أهمية على الإطلاق. إنها ناتجة عن سوء الفهم وعدم القدرة على استنباط صيغة Gibbs الخالية من الطاقة لطي البروتين. يأتي سوء الفهم بشكل أساسي من إهمال دور البيئة الذي أكده Anfinsen على هذا النحو. تأتي عدم القدرة على اشتقاق دالة جيبس ​​للطاقة الحرة لطي البروتين من استخدام مجموعة من المطابقات التي أهملت الشكل ثلاثي الأبعاد للتشكيل الفردي. جاء رفض عدم الأهمية متزامنًا مع العديد من المحاكاة الحاسوبية دون مناقشة نظرية لقواعدها النظرية.مشتق حديثا وظيفة الطاقة الحرة جيبس تم تقديمه ، وتناقش أدواره في التنبؤ ببنية البروتين وفي شرح عملية الطي. اشتقاق يطبق الإحصاء الكمي على الأنظمة الديناميكية الحرارية مصمم خصيصًا لتشكيل واحد وبيئتها المباشرة ، باتباع اتجاه الجزيء الأحادي الأصلي لـ Anfinsen.


الديناميكا الحرارية لمفتاح التحويل المطابق GTP-الناتج المحلي الإجمالي لـ عامل الترجمة الخاص بالسيلينوسيستين SelB

تستند الأسئلة أدناه إلى بيانات ورسوم بيانية وأرقام من المقالة التالية:

الديناميكا الحرارية لمفتاح التحويل المطابق GTP-الناتج المحلي الإجمالي لعامل الترجمة Selenocysteine ​​المحدد SelB. ألينا باليسكافا ، وأندري إل. كونيفيجا ، ومارينا في رودنينا. مجلة الكيمياء البيولوجيةذ 287، 27906-27912 (2012). دوى: 10.1074 / jbc.M112.366120.

أسئلة الخلفية / المراجعة:

أ. بالنظر إلى خلايا قياس المسعرات أعلاه ، ما المكونات التي من المرجح وضعها في الخلية المرجعية وخلايا العينة والمحقنة؟

الإجابة: تحتوي الخلية المرجعية على محلول منظم ، وتحتوي خلية العينة على بروتين (ربما يكون من الصعب تركيزه بدرجة كافية لوضعه في المحقنة) ، وتحتوي الحقنة على نوكليوتيد GXP.

ب. يعتبر مركز التجارة الدولية حساسًا للغاية ويمكنه اكتشاف التغيرات الدقيقة في المحتوى الحراري عند حقن جهاز معايرة في الخلية المرجعية. اذكر العمليات الفيزيائية والكيميائية المحتملة التي قد تؤدي إلى تغييرات المحتوى الحراري عند حقن محلول معاير في خلية التحكم.

الإجابة: التخفيف ، تغيرات البروتونات ، الربط الترابطي ، التغيرات التوافقية والتفاعلات الكيميائية.

ج. ما هي أكثر تجربة تحكم منطقية يمكنك إجراؤها؟ كيف ستصحح تغيرات المحتوى الحراري المشتق التجريبي لمن يرون في علبة التحكم؟

الإجابة: قم بحقن يجند (GTP ، الناتج المحلي الإجمالي ، إلخ) في خلية العينة التي تحتوي على محلول منظم فقط (والذي يتم وضعه أيضًا في الخلية المرجعية. اطرح D H للتخفيف من D H للتجريب D Hs.

د. ضع في اعتبارك التوازن البسيط التالي لتفاعل ligand L مع جزيء ضخم M يتميز بثابت التفكك Kd كما هو موضح أدناه.

حيث M هو تركيز الجزيء الكبير الحر ، L هو تركيز الترابط الحر ، و ML هو تركيز المركب. بالنسبة لتفاعلات الارتباط القابلة للفصل ، فإن Kd لا يقل أهمية عن pka لبروتون مؤين من حمض. معادلة لـ ML كدالة لـ M.ا، L و K.د هو مبين أعلاه. يتم تحديد قيم Kd عادةً من تجربة الربط عند Mا، إجمالي كمية M أقل بكثير من L. الحرة من معادلة ML أعلاه ، ارسم رسمًا بيانيًا لـ ML مقابل L على المحاور أدناه.

ه. تبسيط معادلة ML كدالة لـ L لكل من الشروط التالية:

يرتبط ثابت التوازن ، Keq = 1 / Kd ، بالتغير القياسي في الطاقة الحرة ، D G 0 باستخدام المعادلة التالية:

F. ما هو D G عند التوازن؟ باستخدام هذه المعلومات ، قم باشتقاق معادلة توضح العلاقات بين D G 0 و Keq وكذلك Kd.

أسئلة تستند إلى المقال:

1. أجب عن الأسئلة التالية بناءً على الرسوم البيانية الحرارية لمركز التجارة الدولية لربط GTP بـ SelB (A) والناتج المحلي الإجمالي إلى SelB (B) أدناه.

أ. تبدو منحنيات المعايرة أعلاه سينية على عكس منحنى ربط التشبع الزائدي الذي رسمته لتوازن ربط بسيط M + L. غالبًا ما ترتبط مؤامرات الربط السيني ML مقابل L بتفاعلات الربط التعاونية. لماذا هذه المؤامرات ليست زائدية حتى مع أنه يمكن نمذجة تغييرات المحتوى الحراري بشكل أفضل من خلال ربط بسيط وغير تعاوني بين M و L مع قياس العناصر المتكافئ من 1؟

الإجابة: المخططات السفلية الموضحة أعلاه تغير الإشارة (تغيير المحتوى الحراري) كدالة للنسبة المولية ، وليس الترابط الحر. باستخدام Kd المشتق من التوافق النظري ، والتركيزات الإجمالية الفعلية لـ SelB و GXP ، يمكن حساب مقدار ML و GXP المجاني. قد تكون قطعة من تغيير المحتوى الحراري مقابل GXP المجاني زائدية.

ب. هل الارتباط طارد للحرارة أم ماص للحرارة؟ ما هي علامة D H؟

الجواب: طارد للحرارة سلبي

ب. أي واحد يبدأ مع ثابت التفكك السفلي (Kd)؟

الإجابة: ارتباط GTP بنسبة 1: 1 مولارية من SelB و GTP ، فإن تغيير الإشارة (المحتوى الحراري) هو نصف تغيرها الأقصى ، مما يشير إلى تركيز عالٍ من مركب SelB: GTP مقارنةً بالرؤية في B.

ج. بافتراض أن الارتباط مفضل ، أيهما أكثر سلبية D G 0؟ افترض تركيزات متساوية من SelB في خلية العينة. أيهما أكثر تفضيلاً في ظل الظروف القياسية؟

الإجابة: ارتباط GTP كلما زاد Keq ، كلما انخفض Kd ، زادت سالب D G 0.

د. يرتبط التغيير في طاقة جيبس ​​الحرة أيضًا بالتغير في المحتوى الحراري والإنتروبيا كما هو موضح في المعادلة أدناه:

هل يمكنك الاستنتاج من الفحص البسيط للمنحنيات أعلاه إذا كانت D S 0 تساوي & lt أو = أو & gt؟ يشرح.

الإجابة: نظرًا لأن الارتباط يحدث في ظل الظروف التجريبية ، فلنفترض Keq & gt 1 و Kd & lt 1 (على الرغم من أن هذا قد لا يكون صحيحًا إذا كانت تركيزات SelB و GXP عالية بما يكفي في التجربة للتغلب على Keq & lt 1). ومن ثم D G 0 & lt0. نظرًا لأن الارتباط طارد للحرارة ، D H 0 & lt 0. هذا يعني أن -T D S 0 يمكن أن يكون سالبًا (لذا D S 0 موجب) أو أن T D S 0 موجب (لذا D S 0 سالب) ولكنه ليس موجبًا بما يكفي لجعل التفاعل غير مرغوب فيه.

تظهر الرسوم البيانية الحرارية لمركز التجارة الدولية التي تقارن ربط GTP (A) واثنين من نظائر GTP و GTP & # 947S (B) و GDPNP (C) أدناه

د. مرة أخرى بافتراض تركيز مماثل لـ SelB في العينة C ، قارن Kds لتفاعل GTP & # 947S و GDPN إلى SelB.

الجواب: لقد تقدم رد فعل GTP & # 947S بدرجة أكبر عند 1: 1 كيميائي متكافئ من رد فعل الناتج المحلي الإجمالي على SelB. ومن ثم فإن GTP & # 947S لديها Kd أقل لربط SelB.

ه. يتم عرض هياكل GTP والنظير أدناه. يقترح سبب استخدام المحققين للنظير في دراساتهم.

الإجابة: من المحتمل أن يخضع هؤلاء للتحلل المائي في جاما P وهو استيراد حيث يدرسون بروتينًا يمكن أن يربط إما GTP أو الناتج المحلي الإجمالي وله نشاط GTPase. يعتبر S في GTP & # 947S أقل كهربيًا من O وبالتالي أقل احتمالية لسحب الإلكترونات المرتبطة بـ pi في الرابطة المزدوجة نحو حالة الانتقال النامية لتشكيل وسيط خماسي التكافؤ من oxyanion. وبالمثل ، فإن رابطة PN في النظير الآخر من غير المرجح أن تنكسر لأن المجموعة المغادرة ذات الشحنة السالبة على N الأقل كهربيًا تكون أقل استقرارًا.

F. تتلاءم الرسوم البيانية الحرارية لمركز التجارة الدولية مع النموذج النظري للربط M و L مع قياس العناصر المتكافئ بواحد. من تناسب البيانات هذا ، يمكن تحديد Kd. كيف تحسب D S 0 لتفاعل SelB و GXP؟

الإجابة: إذا كنت تعرف Kd ، فيمكنك تحديد D G 0 لأنها تساوي -RTlnKeq = RTlnKd. يمكنك تحديد D H 0 مباشرة من التجربة. ومن ثم يمكنك الحصول على D S 0 من المعادلة D G 0 = D H 0 -T D S 0.

يتم عرض المعلمات الديناميكية الحرارية لربط SelB بالنيوكليوتيدات الجوانين عند درجات حرارة مختلفة أدناه.

ز. هل يؤكدون إجاباتك على "ب" و "د" أعلاه؟

2. لتحديد تأثير التغيير في حالة البروتون على ارتباط SelB و GXP ، تمت دراسة تأثير المحاليل العازلة المختلفة على المحتوى الحراري الملزم لـ SelB-GTP.

يوضح الشكل (أ) أدناه المحتوى الحراري الملزم لـ GTP بـ SelB في المخزن المؤقت للفوسفات (& # 9679) ، و HEPES buffer (& # 9675) ، و Tris buffer (& # 9632) كدالة لدرجة الحرارة.

أ. أي تغيير في المحتوى الحراري المصاحب لإطلاق البروتون أو امتصاصه عند ارتباط جزيء ضخم بالرابط سوف يتأثر بالتغير في المحتوى الحراري عند ارتباط البروتونات بالقاعدة العازلة. للتحقيق في تأثير المحتوى الحراري لتأين المخزن المؤقت ، يحتوي كل من المحاليل المؤقتة على DH مختلفأيون وهو التغير في المحتوى الحراري عند تأين البروتون من حمض العازلة. اذكر حقيقتين تميزان الرسوم البيانية.

الإجابة: إليك نوعان - الرسوم البيانية كلها متوازية ويعتمد D H لربط SelB و GXP على درجة الحرارة

ب. يوضح الشكل B أعلاه اعتماد المحتوى الحراري الملزم لتفاعل SelB-GTP (المحور y) على المحتوى الحراري لتأين البروتون المؤقت عند 10 درجة مئوية (& # 9679) ، 15 درجة مئوية (& # 9675) ، 20 درجة مئوية (& # 9632) ، و 25 درجة مئوية (& # 9633) لأربعة مخازن مختلفة يُعرف المحتوى الحراري للتأين فيها عند درجات حرارة مختلفة (المحور س). ما وحدات ميل الخط المستقيم؟ ما هو المنحدر الفعلي؟ ماذا يخبرك هذا؟ ماذا يخبرك التقاطع y؟ لماذا استخدام تقاطع y في هذه الدراسة؟

الجواب: بلا حدود. ينتج عن منحدر الرسم البياني صافي عدد البروتونات المقترنة بتفاعل الارتباط ، 0.2 & # 82110.3 للمخازن المؤقتة الثلاثة المستخدمة ، وينتج عن تقاطع Y تغير المحتوى الحراري الملزم البيوكيميائي عند درجة حرارة معينة ، & # 916H. يمثل الأخير الحرارة الحقيقية المنبعثة عند التكوين المعقد عندما لا يتأثر التكوين المعقد بحرارة التأين العازلة لأن التقاطع يعطي قيمة الحرارة للتفاعل في مخزن مؤقت افتراضي مع حرارة تأين البروتون تساوي 0. هذا ما أراده المحققون : تغيير المحتوى الحراري المرتبط بربط SelB و GTP مع عدم وجود مساهمات في التغييرات في بروتون مكونات محلول المخزن المؤقت.

يوضح الشكل C أعلاه تغيير المحتوى الحراري لربط SelB و GTP المصحح لتغييرات بروتونات محلول المخزن المؤقت. يتم إعطاء الانحرافات المعيارية للقياسات بواسطة أشرطة الخطأ (في بعض الحالات غير مرئية لأنها أصغر من حجم الرمز) لاحظ أن DH هي دالة خطية لدرجة الحرارة. يحتوي منحدر الخط على وحدات من kcal / mol / o C وهي السعة الحرارية. يمكن أن يمنحنا التغيير في السعة الحرارية ، D Cp = d D H / dT نظرة ثاقبة لطبيعة تفاعلات الربط. لفهم هذا ، ضع في اعتبارك أولاً التغيير في المعلمة الديناميكية الحرارية عندما يتم نقل البنزين من البنزين النقي إلى الماء. يظهر أدناه رسم بياني يوضح الخصائص الديناميكية الحرارية كدالة لدرجة الحرارة لتفاعل النقل هذا.

ج. هل القيمة الإيجابية لـ DG لنقل البنزين من البنزين النقي إلى الماء تتفق مع فهمك للخواص الفيزيائية والكيميائية للبنزين؟ يشرح.

الجواب: نعم. البنزين غير قطبي وبالتالي فهو غير قابل للذوبان في الماء. ومن ثم يجب أن تكون تغييرات الطاقة المجانية لتلك العملية إيجابية.

د. للوهلة الأولى ، قد تتوقع أن تكون مجمعات البنزين والبنزين IMFs و H2O-H2O IMFS أقوى من صناديق البنزين H2O ومن ثم قد يتطلب انحلال البنزين في الماء مدخلاً من الطاقة الحرارية لدفعها وبالتالي فإن العملية ستكون ماصة للحرارة . ومع ذلك ، فمن المفضل أن يذوب البنزين في الماء بحوالي 275 ألفًا إلى حد ما. ما لا يفضله بشكل كبير هو الانتروبيا. هذا مظهر من مظاهر التأثير الكارثي للماء الذي يساعد على تحريك البروتين بحيث يتم دفن السلاسل الجانبية الكارهة للماء.

إن التوقيع الرئيسي للتأثير الكارهة للماء هو أن انتقال المجموعات غير القطبية إلى الماء يرتبط بـ D Cp موجب. لاحظ أن أخذ البنزين من البنزين هو ماء يتميز بزيادة DH خطيًا مع زيادة درجة الحرارة وبالتالي D Cp موجب. سنستخدم هذه الفكرة لتحليل D Cp لربط SelB و GTP. بالنسبة للرسم البياني C أعلاه ، ما هي علامة D Cp؟ ما هو التفسير الجزيئي الذي يمكن أن تقدمه لهذه القيمة؟

الإجابة: يستمر ارتباط SelB و GTP مع D Cp سالب حيث يصبح D H أكثر سلبية مع زيادة درجة الحرارة. هذا يعني أن ربط SelB و GTP مصحوب بدفن صافي للمجموعات الكارهة للماء.

3. ينشأ المصدر الرئيسي لتغيرات D Cp عند الارتباط من فقدان الماء من الماء المتفاعل من أسطح البروتين والرابط عند الارتباط ، مع المساهمة الرئيسية الناتجة عن التأثير الكارثي للماء. قد تنشأ مساهمة أخرى أقل حجمًا في D Cp من دفن المخلفات القطبية مع التغييرات اللاحقة في إمكانات التفاعل المائي المربوط والكتل. تم استخدام المعادلة التالية لإظهار المساهمة في & # 916Cp من تحلل من مركبات الجوامد في الماء:

حيث D ASAا ف ب و D ASAص هي تغيرات المساحات السطحية التي يمكن الوصول إليها بواسطة المذيب القطبي والقطبي ، على التوالي. تعطي مركبات النموذج قيم D cا ف ب = 0.45 و د ج ص= -0.26 لكل مول من SA (مربع أنجستروم).

يوضح الجدول 2 أدناه التغيرات في السعة الحرارية ومساحة السطح التي يمكن الوصول إليها لربط SelB بالنيوكليوتيدات الغوانين. & # 916Cp ، تغير السعة الحرارية الذي تم الحصول عليه كـ & # 916H / dT & # 916ASAap و & # 916ASAp ، التغييرات في المناطق السطحية التي يمكن الوصول إليها بواسطة المذيبات القطبية والقطبية بافتراض أن جميع التغييرات قد تم منحها إما بواسطة Apolar (AAap) أو القطبية (AAp) المخلفات ، على التوالي مع عدم وجود مساهمة من الآخر. (على سبيل المثال: لـ GTP في Hepes ، 621 / 0.45 = 1380) تم تحويل قيم المنطقة المدفونة إلى أعداد الأحماض الأمينية التي تمت إزالتها من السطح باستخدام متوسط ​​ASA للقطب (34 2) والقطبي (56 ... 2) الأحماض الأمينية.

يوضح الشكل 3 تغيرات السعة الحرارية عند تفاعل SelB مع نيوكليوتيدات الجوانين. أ ، يتغير الاعتماد على درجة الحرارة في المحتوى الحراري الملزم على تفاعلات SelB مع GTP (& # 9679) و GTP & # 947S (& # 9675) و GDPNP (& # 9632) والناتج المحلي الإجمالي (& # 9633). يتم إعطاء الانحرافات المعيارية للقياسات بواسطة أشرطة الخطأ ، والتي تكون أصغر من حجم الرمز. ب ، يتغير تمثيل شريط السعة الحرارية عند تفاعلات SelB مع نيوكليوتيدات الجوانين.

من الرسوم البيانية A و B والجدول 2 أعلاه ، قارن أوجه التشابه والاختلاف بين الحالات الحرة والمحدودة لـ SelB مع الروابط المختلفة.

الإجابة: تسبب ارتباط GTP بـ SelB في حدوث تغيير كبير في السعة الحرارية ، مما يشير إلى إعادة ترتيب هيكلية كبيرة تقابل 41 & # 821143 من الأحماض الأمينية التي غيرت ملامساتها عند الربط. مع GTP & # 947S ، كانت التغييرات التوافقية أصغر إلى حد ما ، مما يشير إلى أن الأحماض الأمينية 31 & # 821132 قد تأثرت بالتكوين المعقد. لوحظت أصغر التغييرات مع الناتج المحلي الإجمالي و GDPNP مع 15 & # 821119 من الأحماض الأمينية التي غيرت شركاء التفاعل عند التفاعل مع SelB. تشير قياسات مركز التجارة الدولية إلى أن هياكل الأشكال المرتبطة بـ GTP و الناتج المحلي الإجمالي لـ SelB مختلفة وأن حوالي 25 من الأحماض الأمينية تعيد ترتيبها أثناء التبديل المطابق GTP-GDP. على الرغم من أنه يُفترض عادةً أن جميع نظائر GTP غير القابلة للتحلل يمكن أن تحل محل GTP بسهولة ، تشير نتائجنا إلى أن التحليل الدقيق لنظائر GTP المختلفة مطلوب للعثور على النظير الذي يشبه الركيزة الطبيعية عن كثب. تقارب SelB لـ GDPNP أقل مرتين فقط من GTP ، لكن قيم كل من تغيرات المحتوى الحراري والإنتروبيا تشبه قيم ربط الناتج المحلي الإجمالي. علاوة على ذلك ، فإن SelB GDPNP لديه تقارب أقل بمقدار 10 أضعاف لـ Sec-tRNASec عند مقارنته بـ SelB GTP ، مما يدعم فكرة أن الناتج المحلي الإجمالي المحلي ليس تناظريًا أصليًا لـ GTP لـ SelB. من ناحية أخرى ، فإن ربط GTP & # 947S بـ SelB محكم بشكل مدهش مع قيمة aKd 3 & # 82114 مرات أصغر من تلك الخاصة بـ SelB GTP. نظرًا لأن المعلمات الديناميكية الحرارية الأخرى قابلة للمقارنة مع مجمعات GTP & # 947S و GTP الخاصة بـ SelB ، فإننا نستنتج أن GTP & # 947S هو تناظرية GTP أفضل لـ SelB مقارنة بـ GDPNP. المعنى العام لهذه النتائج هو أن نظائر GTP غير القابلة للتحلل ليست في جميع الحالات بدائل مخلصة لـ GTP ، وبالتالي ، يجب تفسير النتائج التي تم الحصول عليها بمساعدة هذه النظائر ، بما في ذلك الهياكل البلورية ، بحذر.

4. لمزيد من دراسة الاختلافات في مطابقة SelB عند ربط GTP و GDP و nonhydrolyzable ، تم فصل SelB ومجمعاته عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التي تنفصل على الحجم الهيدروديناميكي (مع جزيئات أكبر من نفس الشكل يتم فصلها أولاً). يوضح الشكل 4 أدناه الفصل بين شكل apo والأشكال المرتبطة بالنيوكليوتيدات لـ SelB عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. ملامح Elution من SelB GTP (& # 8212 & # 8212) ، SelB GTP & # 947S (& # 8211 & # 8211 & # 8211) ، SelB GDP ( ) ، SelB GDPNP ( & # 8211 & # 8211 & # 8211) ، و SelB ( & # 8211 & # 8211 & # 8211) تمت مراقبتها بواسطة مضان التربتوفان الجوهري (& # 955 الإثارة = 280 نانومتر ، & # 955 الانبعاث = 355 نانومتر). أ. ش ، وحدات تعسفية. هل هذه النتائج متوافقة مع نتائج مركز التجارة الدولية؟ هل ترتيب الشطف متوقع بناءً على النتائج؟

الجواب: كانت نصف الأقطار الهيدروديناميكية الظاهرة لـ SelB في شكل apo والأشكال المرتبطة بالنيوكليوتيدات مختلفة اختلافًا كبيرًا ، مما وفر فصلًا واضحًا لجميع الأشكال الخمسة لـ SelB (الشكل 4). يتبع ترتيب الشطف حجم التغييرات التوافقية في SelB التي تم اشتقاقها من بيانات ITC ، مع استخلاص المجمعات بالترتيب SelB GTP و SelB GTP & # 947S و SelB GDP و SelB GDPNP و SelB-apo. الاختلافات بين أشكال GTP و GDP و apo واضحة بشكل خاص.

لاحظ مع ذلك ، أن ترتيب الشطف ليس ما كان متوقعًا. إذا كان SelB: GTP يحتوي على أكبر قيمة سالبة & # 916Cp ، وهذا مرتبط بأكبر التغييرات في مساحة سطح البروتين ، فستتوقع أن يكون لمركب SelB: GTP أصغر نصف قطر هيدروديناميكي ويخرج أخيرًا من العمود ، وليس أول. بدلاً من الهياكل البلورية ، والتي قد تظهر شكلًا غير كروي قد يبرر ترتيب الشطف الملحوظ ، يجب أن نكون مقتنعين بأن الفصل قد ارتبط بالفعل بقيم & # 916Cp التجريبية.

5. التفاعلات الملزمة بين SelB و GTP مفضلة من الناحية الحرارية وغير مفضلة من الناحية الحتمية وتواصل مع D Cp سالب.

أ. ضع قائمة بالعوامل المحتملة (لا تشمل محلول المخزن المؤقت DHأيون) يمكن أن يؤدي إلى تغييرات المحتوى الحراري عند الربط

الجواب: إن تغير المحتوى الحراري يصاحب صنع وكسر IMF بين الذرات في كلا النوعين. قد تشمل هذه:

  • فقدان البروتين & # 8211 روابط الهيدروجين المذيبات وتفاعلات فان دير فالس ،
  • فقدان تفاعلات المذيبات الرابطة ،
  • تشكيل روابط بروتين يجند ، وجسور ملح ، واتصالات فان دير فال
  • إعادة تنظيم شبكة الروابط الهيدروجينية داخل الجزيئية للبروتين ،
  • إعادة تنظيم المذيبات بالقرب من سطح البروتين ، والتغيرات التوافقية في موقع الربط بسبب الارتباط حتى

ب. ضع قائمة بالعوامل المحتملة (لا تشمل محلول المخزن المؤقت DHأيون يمكن أن يؤدي إلى تغييرات المحتوى الحراري عند الربط

  • إطلاق جزيئات الماء المحصورة أو السطحية للكتلة (+ D S)
  • تنطلق جزيئات الماء من السطح المعقد (+ D S)
  • تقليل درجات التوافق (التناوب والاهتزازي) لحرية السلاسل الجانبية للبروتين (- D S)
  • فقدان درجات الحرية متعدية عند الربط في الترابط (- D S)

ج. ضع قائمة بالعوامل المحتملة التي يمكن أن تؤدي إلى تغييرات في السعة الحرارية عند الربط

انخفاض صافي في تعرض المجموعات الكارهة للماء عند التكوين المعقد (- D Cp)

صافي إزالة مساحة سطح البروتين من ملامسة المذيب (- & # 916Cp)

أي عملية يتم فيها إطلاق الماء من السطح (- & # 916Cp) ، بما في ذلك التغييرات التوافقية في البروتين التي تقلل نصف القطر الهيدروديناميكي وبالتالي مساحة سطح البروتين في التكوين المعقد.

6.لخص بإيجاز النتائج الرئيسية التي توضح وظيفة RelB في الخلية.

الإجابة: تشير البيانات إلى أن SelB يمكن أن يتبنى ثلاثة مطابقة منفصلة تختلف بوضوح عن بعضها البعض: شكل apo ، وهو الشكل الأكثر انفتاحًا للبروتين ، والنموذج المرتبط بـ GTP والشكل المرتبط بالناتج المحلي الإجمالي ، وهو وسيط بين نموذج apo والنموذج المرتبط بـ GTP. نظرًا للتركيز العالي لـ GTP في الخلية وارتفاع معدل ارتباط النيوكليوتيدات بـ SelB ، فمن المحتمل أن يكون شكل apo قصير الأجل وبالتالي من غير المحتمل أن يلعب دورًا وظيفيًا ، في حين أن الانتقال بين نموذج GTP إلى الناتج المحلي الإجمالي ضروري للوظيفة من SelB على الريبوسوم. يشير تحليل مركز التجارة الدولية إلى أن أشكال SelB المرتبطة بـ GTP والناتج المحلي الإجمالي مختلفة وأنه من المرجح أن يتبع العامل الدورة الوظيفية والهيكلية النموذجية للعديد من GTPases الأخرى


دعم المعلومات

طرق S1. تفاصيل عن طرق المحاكاة والنظرية.

طرق S2. تفاصيل عن الأساليب التجريبية.

طرق S3. تفاصيل حول طرق تحليل البيانات الوصفية.

نص S1. نتائج إضافية لدعم الحجج في النص الرئيسي.

جدول S1. تقديرات α من تجارب مركز التجارة الدولية على أربعة بروتينات مختلفة.

تم تركيب البيانات من التجارب على Eq 11 لتقدير قيمة α.

الجدول S2. التسلسلات المستخدمة لحساب إجمالي مساحة السطح الكارهة للماء.

تم استخدام مناطق amyloigenic من الألياف فقط (والتي لا تساوي التسلسل الكامل لـ α-لاكتالبومين ، α-سينوكلين و β-2 ميكروجلوبيولين).

S1 الشكل. مخططات الحالة لاستطالة ليفي.

هنا ، اكتشفنا تأثير قوة الاعتماد على درجة الحرارة الكارهة للماء ، α، على استقرار الركام. يمكن تمييز ثلاث حالات مختلفة: الليف المتشكل بالكامل (الأسود) ، وتمسخ الليف إلى مونومرات (سماوي) ومجموع غير متبلور حيث لا تتشكل الطبقتان الإضافيتان بشكل كامل. فقط في النماذج التي تعتمد على درجة حرارة مسعور ، عدم استقرار البرودة (α = 40 ، 60) ، أو التمسخ البارد إلى مونومرات ، يمكن ملاحظتها (α = 60). تشير الخطوط المتقطعة إلى أن الحالة لم يتم ملاحظتها (أخذ عينات) في عمليات المحاكاة عند درجة الحرارة المقابلة. لاحظ أنه يمكن تفسير وحدات درجة الحرارة المنخفضة لهذا النموذج على أنها تحتوي على نقطة تجمد حول T = 0.18 ، ونقطة غليان أعلى بقليل من T = 0.4.

شكل S2: تغيير مساهمة المحتوى الحراري في استقرار الليف من خلال الروابط الهيدروجينية.

استكشفنا استقرار الحالة الليفية لقيم مختلفة لقوة رابطة الهيدروجين (ϵهب) في النموذج. لقيم متفاوتة ϵهب، و α = 40 يتم عرض مخطط الحالة للحالة الليفية (A) ، والطاقة الحرة (B) ، والمساهمات الحتمية (C) والمحتوى الحراري (D). زيادة قوة الرابطة الهيدروجينية تجعل الليف أكثر استقرارًا (ب) ، مما يؤدي إلى نطاق درجة حرارة أوسع تكون فيه الحالة الليفية مستقرة (أ). تشير الخطوط المنقطة إلى تقديرات المساهمات الكارهة للماء ، ويتم إنشاء هذه التقديرات باستخدام Eqns. 13 و 15 و 14 مع ما يقابلها α، Δجح = −6 ومع الإزاحة ، هint = Δح استنادًا إلى عمليات المحاكاة باستخدام الببتيد المكافئ لـ α = 0.

شكل S3: تغيير المساهمة الحتمية لاستقرار الليف من خلال إنتروبيا السلسلة.

استكشفنا استقرار الحالة الليفية لقيم مختلفة للميل (الانتروبيا) لـ β-ستراند الدولة (نβ) في النموذج. لقيم متفاوتة نβ، و α = 40 يتم عرض مخطط الحالة للحالة الليفية (A) ، والطاقة الحرة (B) ، والمساهمات الحتمية (C) والمحتوى الحراري (D). زيادة β- ميل الخيط يجعل الليف أكثر ثباتًا (B) ، مما يؤدي إلى نطاق درجة حرارة أوسع تكون فيه الحالة الليفية مستقرة (A). تشير الخطوط المنقطة إلى تقديرات المساهمات الكارهة للماء ، ويتم إنشاء هذه التقديرات باستخدام Eqns. 13 و 15 و 14 مع ما يقابلها α، Δجح = −6 ومع الإزاحة ، هint = Δح استنادًا إلى عمليات المحاكاة باستخدام الببتيد المكافئ لـ α = 0.

S4 الشكل. البيانات الأولية لمركز التجارة الدولية التمثيلية.

يتم عرض البيانات الأولية لتجارب مركز التجارة الدولية للتجارب حيث تمت معايرة حلول المونومر في معلقات ليفي البذور. تم إجراء التجارب باستخدام أدوات VP-ITC (A ، C) و ITC200 (C). (أ) حقن 10 ، 80 ، 80 ، 80ميكرومترل (40 درجة) و 10 ، 80 ، 40 ، 80ميكرومترلتر (50 درجة) من محلول α-لاكتالبومين (50 ميكرومترM في 10 ملي حمض الهيدروكلوريك + 100 ملي كلوريد الصوديوم) في تعليق ليفية البذور الصوتية. (ب) حقن 2 ميكرومترلتر من حلول أحادي α-سينوكلين عند 380 ميكرومترم (50 درجة مئوية) ، 390 ميكرومترم (30 درجة مئوية) و 430 ميكرومترM (40 درجة مئوية) في معلقات ليفي البذور. (ج) حقن 20 ، 80 ، 80 ، 80ميكرومترلتر (30 و 47 درجة) من محلول الجلوكاجون (100 ميكرومترM في 10 ملي حمض الهيدروكلوريك + 30 ملي كلوريد الصوديوم) في تعليق ليفية البذور الصوتية.

S5 الشكل. صور AFM توضح α- استطالة ليفي أميلويد سينوكلين.

تم التقاط صور مجهر القوة الذرية (AFM) لألياف البذور قبل صوتنة لتقصير توزيع الطول وتعزيز كفاءة البذر (A) ، بعد 10 ثوانٍ من الصوتنة بمسبار صوتنة (B) وبعد تجربة مركز التجارة الدولية (C) ، حيث الألياف (40 ميكرومترM) تم احتضانها بإجمالي 60 ميكرومترم أحادي α-سينوكلين.

S6 التين. إزالة البلمرة الكيميائية لليفات اميلويد.

(أ) α- ألياف ليفية أميلويد اللاكتالبومين تمت إزالتها من بلمرة مع GndSCN المُحول القوي. (ب) ألياف جلوكاجون أميلويد تمت إزالتها بلمرة مع GndHCl. قيم فرق الطاقة الحرة بين الحالة القابلة للذوبان والحالة الليفية هي -52.5 kJ / mol (α-لاكتالبومين) و -51.2 كيلوجول / مول (جلوكاجون). يجب مقارنة هذه القيم بالقيم المحددة للأقل استقرارًا بشكل ملحوظ α- ألياف السينوكلين أميلويد من -33.0 كيلوجول / مول [36] أو -37.4 كيلوجول / مول (هذه الدراسة) في محلول PBS.

S7 التين. الديناميكا الحرارية لتبلور GNNQQNY.

(أ) بيانات مركز التجارة الدولية الخام لحقن بلورات ومونومر GNNQQNY في الماء النقي. التفاصيل التجريبية انظر قسم المواد والطرق. (ب) ملخص النتائج المسعرية لانحلال الكريستال GNNQNY. يتم تصحيح نقاط البيانات للحرارة الطاردة للحرارة لتخفيف المحتوى الأحادي لكل حقنة. يتم استخدام الملاءمة الخطية لمجموعات البيانات عند درجتي حرارة لتحديد المحتوى الحراري المولي لإذابة البلورات ، والذي يتوافق مع الحرارة المولية السالبة لنمو البلورات.

S8 التين. أطياف التألق الجوهرية للطفرة F94W α-سينوكلين.

اليسار: تألق جوهري لـ F94W أحادي αتم قياس السينوكلين في PB pH 7.4 في وجود وغياب 150 ملي كلوريد الصوديوم وفي وجود وغياب 5 مولار من اليوريا. إلى اليمين: تم رسم نسب شدة التألق عند 340 و 330 نانومتر لجميع الظروف الأربعة ، مما يؤكد أن هذه النسبة ثابتة تقريبًا للمونومر في ظل جميع الظروف المرصودة. توفر هذه النتائج دعمًا قويًا لتفسيرنا للتغيير في نسبة شدة التألق مع زيادة تركيز اليوريا كعكس إزالة بلمرة الليف.

S9 التين. موازنة α- ألياف السينوكلين عند 4 درجات مئوية.

سلسلة تمسخ اليوريا من F94W αتم تحضين ألياف السينوكلين في وجود وغياب 150 ملي كلوريد الصوديوم عند 4 درجات مئوية لمدة 4 أسابيع وتم قياس أطياف التألق الجوهرية وتم تحديد منحنيات التمسخ الكلي وتحليلها باستخدام نموذج البلمرة المتساوية. تم رسم قيم الطاقة الحرة المحددة كدالة لوقت الموازنة. يمكن ملاحظة أنه يتم الوصول إلى التوازن بعد بضعة أيام.

S10 التين. التمسخ البارد للوزن α- ألياف السينوكلين أميلويد تليها مضان تى اتش تى و التحليل الطيفى للقرص المضغوط.

(أ) α- ثبات ليف السينوكلين اميلويد كدالة لتركيز اليوريا في درجة حرارة الغرفة وبعد الموازنة عند 7 درجات مئوية ، باستخدام مضان ثيوفلافين- T كقراءة لدرجة إزالة البلمرة الليفية. (ب) دورة زمنية لإزالة بلمرة الليف الجزئية عند 7 درجات مئوية ، كما يليها التحليل الطيفي ثنائي اللون (CD). راجع قسم المواد والأساليب للحصول على تفاصيل تجريبية. تم تركيب البيانات على وظائف أسية سلبية ، تتوافق مع السلوك المتوقع لانحلال الألياف ، حيث يكون عدد الألياف ثابتًا تقريبًا خلال معظم الدورة الزمنية للانفصال وحيث يكون معدل التفكك متناسبًا مع الفرق بين تركيز التوازن و التركيز الفعلي للمونومر.


شاهد الفيديو: كيمياء 1ث باب رابع. 3 المحتوى الحرارى او الانثالبى المولارى (كانون الثاني 2022).