معلومة

هل تختلف الجراثيم المعوية اختلافًا جوهريًا داخل رتج القولون؟


من صفحة ويكيبيديا للملحق الدودي:

يعتمد هذا الاقتراح على فهم جديد لكيفية دعم الجهاز المناعي لنمو البكتيريا المعوية المفيدة ، جنبًا إلى جنب مع العديد من الميزات المعروفة جيدًا للملحق ، بما في ذلك بنيته ، وموقعه أسفل التدفق الطبيعي أحادي الاتجاه للغذاء و الجراثيم في الأمعاء الغليظة ، وارتباطها بكميات وفيرة من الأنسجة المناعية. أظهرت الأبحاث أن الأفراد الذين ليس لديهم الزائدة الدودية كانوا أكثر عرضة أربع مرات لتكرار الإصابة بالمطثية العسيرة.

يبدو أن هذا الاقتباس يشير إلى أن الملحق يمكن أن يكون بمثابة أرض خصبة لنباتات الأمعاء التي تكون أقل شيوعًا (مثل جيم صعب) وليس في كل مكان مثل بكتريا قولونية أو Enterobacter sp. يمكن اعتبار الملحق مكانًا مثاليًا لهذا النمو الميكروبي في الأمعاء.

بالنظر إلى ذلك ، من أجل التقريب الأول ، من الناحية التشريحية ، فإن كل من الزائدة الدودية والرتج المشترك للقولون هما نتوءان بارزان للأمعاء الغليظة: إلى أي مدى يمكن أن يكون الرتج أيضًا قادرًا على دعم النباتات الأقل شيوعًا أو الأكثر تنوعًا ، وما مدى احتمالية حدوث ذلك أن يكون بسبب اختلاف في البيئة خارج الخلية (درجة الحموضة ، تركيز الأيونات) وما مدى احتمالية أن يكون ذلك بسبب الشكل؟


الزائدة الدودية هي نوع من رتج القولون الحقيقي ، على الرغم من وجوده لدى الجميع (إلا إذا أزاله الجراح). توجد بكتيريا في الأمعاء من الفم وصولاً إلى فتحة الشرج ، وتتغير أعداد وأنواع البكتيريا على طول القناة المعوية. مراجعة حديثة من J. Ridlon نشرت في مجلة Lipid Research (2006) متاحة على الإنترنت وقد وثقت هذه الملاحظات من عدد من الباحثين. في تلك الورقة ، تم وصف الأنواع البكتيرية على أنها متغيرة بالإضافة إلى الوفرة النسبية للبكتيريا التي تزداد على طول القناة المعوية. الشكل 1 من تلك الورقة التي يمكن الوصول إليها المفتوح من الرابط أعلاه أدناه.

أعتقد أنه من المثير للاهتمام أن صفحة wiki التي تستشهد بها تنص على أن الأفراد الذين ليس لديهم ملحق كانوا أكثر عرضة لتطوير C. فرق عدوى. يمكن للمرء أن يفسر ذلك كما فعلوا في ذلك الموقع بأن الملحق بطريقة ما يعيد ملء القولون ويجعل هذا الشخص أكثر مقاومة للعدوى المتكررة أو "المتكررة". ومع ذلك ، لا أعرف أي دراسات اختبرت هذه الفرضية بشكل مباشر.

من حيث ما إذا كانت نباتات الأمعاء - الملقب بـ "ميكروبيوتا الأمعاء" - مختلفة بشكل كبير في الملحق أمر ممكن ، لكنني لا أعتقد أن أي شخص قد حدد ذلك حتى الآن. تتمثل إحدى المشكلات في ذلك في أننا لا نزيل الملاحق بشكل روتيني ما لم تكن مصابة / ملتهبة مما يؤدي جوهريًا إلى تغيير الميكروبيوم محليًا.

لذا ، هل من الممكن أن يكون الميكروبيوم مختلفًا بشكل كبير في الملحق نفسه مقارنةً بالأعور التي تبعد بضعة سنتيمترات فقط؟ ستكون الإجابة - على الأرجح ، لكن لم يتمكن أحد من الإجابة على هذا السؤال حتى الآن.


الكلمة ميكروبيوتا يمثل مجموعة من الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش في بيئة سابقة التأسيس.

لدى البشر مجموعات من البكتيريا في أجزاء مختلفة من الجسم ، كما هو الحال في الطبقات السطحية أو العميقة من الجلد (ميكروبيوتا الجلد) ، والفم (الجراثيم الفموية) ، والمهبل (الجراثيم المهبلية) ، وما إلى ذلك.

الميكروبات المعوية (المعروفة سابقًا بالنباتات المعوية) هو الاسم الذي يطلق اليوم على الميكروبات التي تعيش في أمعائنا.

يحتوي على عشرات التريليونات من الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك ما لا يقل عن 1000 نوع مختلف من البكتيريا المعروفة التي تحتوي على أكثر من 3 ملايين جين (150 مرة أكثر من الجينات البشرية). يمكن أن يصل وزن الميكروبات في المجموع إلى 2 كجم.

ثلث ميكروبيوتا الأمعاء شائع لدى معظم الناس ، في حين أن الثلثين خاصين بكل واحد منا. بعبارة أخرى ، فإن الجراثيم الموجودة في أمعائك تشبه بطاقة الهوية الفردية.

هناك العديد من المكملات الغذائية التي عند تناولها كما هو مقترح يمكنها تعزيز واستعادة بطانة القناة الهضمية. يمكن القول إن Total Restore من GNDRY MD و 1MD Complete Probiotics Platinum هما المنتجان المتميزان.


الملخص

تنتج البيانات قبل السريرية والبيانات السريرية أدلة متزايدة على أن الجراثيم مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بتسرطن القولون والمستقيم. قد يغير دسباقتريوس مسار التسرطن حيث يبدو أن الإجراءات الميكروبية تؤثر على التغيرات الجينية والتخلقية التي تؤدي إلى خلل التنسج والتوسع النسيلي والتحول الخبيث. قد ينجم بدء سرطان القولون والمستقيم والترويج له عن الإجراءات البكتيرية المباشرة ، والمستقلبات البكتيرية والمسارات الالتهابية. تشمل الجوانب الأحدث من الجراثيم وسرطان القولون والمستقيم استشعار النصاب ، وتكوين الأغشية الحيوية ، والجوانب ، وتأثيرات / التأثيرات المضادة للجراثيم والبروبيوتيك على العلاج الكيميائي. في المستقبل ، من المحتمل أن يكون استهداف الكائنات الحية الدقيقة سلاحًا قويًا في المعركة ضد CRC ، حيث يعد علم الأحياء الدقيقة وعلم الجينوم وعلم الأيض بالكشف عن الروابط المهمة بين الكائنات الحية الدقيقة وصحة الأمعاء.

الكلمات الدالة: الجراثيم ، دسباقتريوز ، آليات دفاع الغشاء المخاطي ، الالتهاب ، التسرطن ، سرطان القولون والمستقيم.


مقدمة

الشيخوخة هي عملية متعددة العوامل تؤدي إلى تدهور وظائف معظم الأعضاء والأنسجة [1،2]. أشارت التوقعات السكانية العالمية الصادرة عن الأمم المتحدة لعام 2019 إلى وجود اتجاه عالمي نحو شيخوخة السكان [3]. مع تقدم الناس في السن ، يعانون من ضعف التعلم والذاكرة. هذه الإعاقات لها تأثير سلبي على نوعية حياتهم ووظائفهم اليومية. التدهور المعرفي الذي يكون بطيئًا في البداية وتدريجيًا يمكن أن يتفاقم بسبب عوامل الخطر والأحداث المختلفة [4،5]. لذلك ، من المهم استكشاف آليات التدهور المعرفي المرتبط بالعمر واكتشاف العلاجات المحتملة لمنع أو إبطاء التدهور المعرفي في مراحله المبكرة.

تشير ميكروبيوتا الأمعاء إلى تريليونات البكتيريا التكافلية التي تتعايش في الجهاز الهضمي ، والتي تعد عنصرًا أساسيًا في الحفاظ على صحة المضيف. أكثر الشعب البكتيرية اكتظاظًا بالسكان هي الجراثيم و الحزم، وتشكل أكثر من 90٪ من ميكروبيوتا الأمعاء [6] ، [7] ، [8]]. في الأفراد الأصحاء ، تكون جراثيم الأمعاء مستقرة نسبيًا لتكوين تكافؤ بين البكتيريا المضيفة. يشير التحليل التفصيلي إلى أن جراثيم الأمعاء تنظم تطور ووظيفة الدماغ من خلال المسارات الثلاثة (بمعنى آخر.، والمسارات المناعية ، والغدد الصم العصبية ، والمبهم) ، وأن الاضطرابات التي تصيب المجتمع الميكروبي قد تسهم في الإصابة بأمراض نفسية عصبية. تُعرف الروابط بين ميكروبيوتا الأمعاء ، والأمعاء ، والدماغ بمحور الجراثيم - الأمعاء - الدماغ [[9] ، [10] ، [11] ، [12]]. Fröhlich وآخرون. [13] ذكرت أن العلاج قصير المدى داخل المعدة للفئران البالغة بمزيج من المضادات الحيوية قد عطل المجتمع البكتيري في القولون وأضعف ذاكرة التعرف على الأشياء الجديدة. Gareau et al. [14] ذكرت أن الفئران الخالية من الجراثيم أظهرت عجزًا في الذاكرة غير المكانية في غياب ميكروبيوتا الأمعاء. تلعب سلامة محور الجراثيم - الأمعاء - الدماغ دورًا مهمًا في الوظيفة الإدراكية. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات أن الميكروبات المعوية لدى كبار السن تختلف اختلافًا جوهريًا عن البالغين الأصغر سنًا. يحدث اضطراب مجتمع ميكروبيوتا الأمعاء (dysbiosis) أثناء الشيخوخة الطبيعية (بمعنى آخر.، الحد من التنوع وفقدان الأصناف المفيدة) ، وبالتالي فإن ميكروبيوتا الأمعاء لكبار السن يمثل نمطًا ظاهريًا مؤيدًا للالتهابات في معظم الحالات [[15] ، [16] ، [17]]. لي وآخرون. [18] تم إجراء عملية زرع جراثيم برازية من الجرذان المسنة إلى الفئران الصغيرة ، وكان تكوين ميكروبيوتا الأمعاء للفئران الصغيرة المتلقية أقرب إلى الجرذان المسنة. تضررت الوظيفة المشبكية للجرذان الصغيرة المتلقية مع زيادة التهاب الأعصاب ولوحظت إعاقات سلوكية معرفية كبيرة. لذلك ، فإن الارتباط بين ميكروبيوتا الأمعاء والوظيفة المعرفية أثناء عملية الشيخوخة الطبيعية ، والظروف الفسيولوجية والمرضية ، والآليات المحتملة تستحق الاستكشاف.

قد يكون دخول السموم العصبية المشتقة من الجراثيم المعوية إلى الدوران الجهازي تمهيدًا لبداية الالتهاب العصبي ، مما يؤدي إلى إنشاء مسارات مسببة للأمراض للتواصل بين نظام المناعة الفطري المركزي والجهاز المناعي [14 ، [19] ، [20] ، [21]]. يحمي الجهاز المناعي الفطري الجسم من الميكروبات المعدية من خلال التعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (PAMPs) ، والتي تعمل على اكتشاف مسببات الأمراض عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs). عديد السكاريد الدهني (LPS) هو أحد مكونات جدار الخلية البكتيرية سالبة الجرام ومنبه قوي للالتهابات. نفاذية الأمعاء إلى LPS البكتيرية ، يبدو أنها محفز مهم للالتهاب الجهازي منخفض الدرجة ، والتهاب الأعصاب والعجز الإدراكي [22،23]. من خلال التفاعل مع مستقبلات Toll-like 4 (TLR4) على الخلايا أحادية النواة ، قد يكون LPS المشتق من الجراثيم حافزًا مهمًا في تطور الالتهاب [24]. تم العثور على التعبير الواسع لـ TLR4 في الدماغ البشري ، وخاصة في الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية ، والتي يمكن أن تنشط TLR4 / البروتين التفاضلي النخاعي 88 (MyD88) / مسار العامل النووي κB (NF-B) بعد الارتباط بـ LPS [25] . يعد تنشيط مسار TLR4 / MyD88 / NF-κB مفتاحًا لتطوير العديد من الأمراض. NF-B هو جزيء إشارة محوري في مسار TLR4 / MyD88. يمكن لـ MyD88 ، وهو جزيء محول لعائلة مستقبلات Toll-interleukin-1 (TIR) ​​، تنشيط عامل النسخ NF-B للحث على إنتاج السيتوكينات الالتهابية. أظهرت دراساتنا السابقة أن مسار TLR4 / MyD88 / NF-B يلعب دورًا مهمًا في التهاب الأعصاب [26 ، 27]. يمكن أن يؤدي الالتهاب العصبي إلى ضعف الإدراك [25 ، 28 ، 29]. بالنظر إلى أن الشيخوخة تضعف الأداء المعرفي ، فقد افترضنا أن هذا التأثير ناتج عن دسباقتريوز القناة الهضمية ، والتغيرات في التواصل بين الجراثيم والأمعاء والدماغ. عبر التهاب مزمن منخفض الدرجة والتهاب عصبي في الدماغ. قد تكون هذه العملية برمتها مرتبطة بمسار إشارات LPS-TLR4. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بمقارنة الوظيفة المعرفية والتركيب الميكروبي والظروف الفسيولوجية والمرضية لمحور القناة الهضمية في الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر شهرين (2 م) و 15 شهرًا (15 م). ارتبطت الاختلافات التي تم العثور عليها بين 2 م و 15 فأرًا بالتفعيل الناجم عن LPS لمسار إشارات TLR4 / MyD88 / NF-B.


ملاحظات ختامية

تشرح دراستنا النتائج المتباينة فيما يتعلق بمتطلبات T-bet لتحريض التهاب الأمعاء بوساطة الخلايا التائية CD4 + T وتسلط الضوء على أن تكوين الجراثيم المعوية يمكن أن يحدد المسارات الجزيئية التي تؤدي إلى التهاب مزمن. لا تشير هذه النتائج فقط إلى أن الفيزيولوجيا المرضية البشرية لـ IBD قد تكون فردية للغاية وتعتمد على الجراثيم ، ولكنها تؤكد أيضًا مرة أخرى على أهمية توحيد الكائنات الحية الدقيقة في التجارب على الحيوانات.


المواد والأساليب

تم شراء الفئران BALB / c و Rag1 من Charles River Laboratories ، Sulzfeld ، ألمانيا. تم تربية الفئران ΔdblGATA-1 [16] في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في منشأة تكاثر DRFZ في Bundesinstitut für Risikobewertung ، برلين. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل المكتب التنظيمي "Landesamt für Gesundheit und Soziales" في برلين ، ألمانيا (تصريح رقم G0045 / 17).

الزرع المتعايش وزرع الجراثيم

بالنسبة لتجارب التعايش ، تم الاحتفاظ بإناث BALB / c و ΔdblGATA-1 في نفس القفص بنسبة 1: 1 لمدة 3 أسابيع. من أجل استنفاد الجراثيم المعوية الأصلية ، عولجت الفئران BALB / c بالأمبيسيلين (1 مجم / مل من الليبيتوم) عبر مياه الشرب ومع تغذية إضافية بالتزقيم. من نيومايسين 5 مجم / مل وميترونيدازول 10 مجم / مل وفانكومايسين 5 مجم / مل (تم شراؤها كلها من سيجما ، دارمشتات) لمدة 14 يومًا. بعد أربع وعشرين ساعة من تناول المضادات الحيوية الأخيرة ، تم نقل الجراثيم البرازية المقابلة عن طريق التزقيم على ثلاثة أيام متتالية. لهذا الغرض ، تم جمع كريات برازية طازجة من BALB / c (IgA high) أو ΔdblGATA-1 (IgA low) الفئران وتعليقها في PBS (بيليه واحد في 1 مل). بعد الترشيح من خلال مصفاة خلية 30 ميكرومتر (Partec ، Görlitz) ، تم نقل 200 ميكرولتر من التعليق عن طريق التغذية بالتزقيم. تم تحليل الفئران بعد 3 أسابيع من آخر إدارة للميكروبات.

تحديد مستويات IgA القابلة للذوبان

تم جمع البراز الطازج ووزنه وتعليقه في برنامج تلفزيوني (1 مجم براز في 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني). تم تحديد مستويات IgA البرازية في المواد الطافية وكذلك في مصل الدم بواسطة ELISA (تم شراء أجسام ELISA المضادة من Southern Biotech عبر BIOZOL Diagnostica ، Eching).

التألق المناعي لأقسام الأنسجة PP

تم استئصال PP من الفئران BALB / c و ΔdblGATA-1 غير المغطاة وغير المتساقطة من الأمعاء ، وغسلها في PBS المثلج ، والمضمن في O.C.T. مركب (ساكورا فينيتيك ألبن آن دن راين ، NL) ، ومجمد. تم تقطيع الأنسجة المجمدة إلى 7 ميكرون ، والتي تم إصلاحها في 100 ٪ أسيتون (كارل روث كارلسروه) لمدة 20 دقيقة. بالنسبة لتلطيخ التألق المناعي ، تم حظر الأقسام باستخدام الجسم المضاد لـ FcγR (استنساخ 2.4G2 DRFZ) ، متبوعًا بالتلطيخ باستخدام الماعز المضاد للفأر IgA-FITC (Southern Biotech عبر BIOZOL Diagnostica ، Eching) ومضادة للفأر IgG1-PE (RMG1-1 Biolegend Fell). تم الحصول على الصور باستخدام مجهر المسح بالليزر LSM 710 (Carl Zeiss) وبرنامج ZEN2011.

عزل الخلية

لعزل خلايا siLP ، تمت إزالة PP وفتح الأمعاء الدقيقة طوليًا وغسلها في PBS بارد. بعد التقطيع إلى قطع قصيرة ، تم تحضين الأمعاء مرتين في وسط RPMI 1640 يحتوي على 25 ملي مولار EDTA ، و 10 ٪ FCS ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (P / S) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية تليها قوية يهتز لإزالة الظهارة. تم غسل القطع المعوية في برنامج تلفزيوني ، وتم تجانسها باستخدام مشرط ، وهضمها مرتين باستخدام RPMI 1640 التي تحتوي على 10 ٪ FCS ، P / S ، 1 مجم / مل كولاجيناز D (روش ، مانهايم) ، 0.1 مجم / مل DNase I ، و 1 مجم / مل Dispase II (سيجما ، دارمشتات) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في شاكر عند 200 دورة في الدقيقة. تم تمرير المعلقات الخلوية من خلال إبرة قياس 18 وتم ترشيحها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر (BD Biosciences ، هايدلبرغ). بعد الغسيل باستخدام متوسط ​​RPMI1640 (10٪ FCS ، P / S) ، تمت تنقية الخلايا بنسبة 30٪ من محلول بيركول (GE Healthcare ، Hamburg) في وسط RPMI 1640 (10٪ FCS ، P / S). تم بعد ذلك غسل الخلايا وتعليقها في وسط RPMI 1640 (10 ٪ FCS ، P / S). لعزل الخلايا من PP ، تمت إزالة الأنسجة من الأمعاء الدقيقة ، وتم دمجها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون (BD Biosciences ، هايدلبرغ) وأعيد تعليقها في RPMI 1640 ، 10 ٪ FCS ، وسط P / S.

التدفق الخلوي

تم إجراء تحليل التدفق الخلوي وفقًا للإرشادات المنشورة مسبقًا. [42] تم إجراء تلطيخ السطح وداخل الخلايا باستخدام الأجسام المضادة التالية: CXCR5-Bio (L138D7) ، PD-1-APC (29F.1A12 ، BioLegend ، Fell) ، B220-PacBlue (RA3.6B2) ، CD3-Bio (145-2C11) ، CD4-PB (GK1.5) ، جميعها منقى ومترافق في DRFZ ، CD45-FITC (30-F11 ، eBioscience ، Frankfurt ، PNA-Bio (Vector Laboratories) ، و IgA-DyLight 650 (BIOZOL Diagnostica ، Eching and BIOMOL GmbH ، هامبورغ). تم تحليل بيانات BD Canto II والبيانات باستخدام برنامج FlowJo V10. تم فرز خلايا Tfh عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام فارز خلايا BD Aria كخلايا CD3 + CD4 + CXCR5 hi PD-1 hi.

تحليل التعبير الجيني

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام QIAzol Lysis Reagent (Qiagen ، Hilden). تم إجراء النسخ العكسي إلى (كدنا) باستخدام مجموعة Sensiscript RT (Qiagen). التعبير عن Tgfb1 و Il4 على صلة قربى ب فعل تم قياسه بواسطة PCR في الوقت الفعلي (95 درجة مئوية و 30 ثانية و 60 درجة مئوية و 30 ثانية و 72 درجة مئوية و 45 دورة) باستخدام StepOnePlus (النظم البيولوجية التطبيقية) باستخدام Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix من Thermo Scientific والأشعال التالية : Tgfb1 (المرسل: 5´-CACAGCTCACGGCACCGGAGA-3´ Rv: 5´-GCTGTACTGTGTGTCCAGGCTCC-3´) فعل (المرسل: 5´-CTCCTGAGCGCAAGTACTCTGTG-3´ Rv: 5´-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3´).

تحليل الحمض النووي البكتيري البرازي

تم عزل الحمض النووي البكتيري من كريات البراز المجمدة باستخدام ZR Fecal DNA MiniPrep Kit (Zymo Research ، Freiburg) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحديد الكمية النسبية للشعبة البكتيرية المحددة باستخدام PCR في الوقت الحقيقي (95 درجة مئوية 30 ثانية و 55 درجة مئوية و 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية 30 ثانية و 55 دورة) و 16 ثانية من الرنا الريباسي المستهدف للجينات [43]. المبلغ الإجمالي لـ يوبكتيريا [44] تم استخدامه كمرجع داخلي. تم إجراء تحليل التسلسل العميق بواسطة LGC Genomics ، برلين ، ألمانيا باستخدام Illumina MiSeq V3 Chemistry (300 نقطة أساس للقراءة المزدوجة) و Bacteria 16S (341F-785R) amplicon. تم إعداد قوالب 16S rDNA وإنشاء مكتبات Illumina بالإضافة إلى معالجة القراءات كما هو موضح سابقًا [21]. تم تصنيف القراءات المجمعة باستخدام "classifier.jar" من مشروع قاعدة بيانات Ribosomal [45] مع قطع ثقة بنسبة 50٪ وتكتل على مستوى الجنس باستخدام RDPUtils [Quensen J. RDPutils: R Utilities for معالجة RDPTool Output. حزمة R الإصدار 1.2]. تم تقدير ترددات الأجناس البكتيرية باستخدام الإخراج المعدل لرقم النسخ وإجمالي عدد البكتيريا. تمثل خرائط الحرارة أجناسًا بكتيرية مصنفة بشكل سري ، بترددات أعلى من 0.01 ٪ في BALB / c غير المتعايش وأقل في الفئران غير المتجانسة ΔdblGATA-1. تم إجراء تقدير التنوع ألفا وبيتا دون إزالة الأصناف غير المصنفة وإعادة أخذ العينات إلى أحجام متساوية بواسطة عبوات "نباتي" (Oksanen، J. et al. Vegan: Community Ecology Package) و "phyloseq" [46]. تم حساب مؤشر شانون وكذلك مؤشر سيمبسون باستخدام دالة "تقدير التماثل". تم إجراء القياس متعدد الأبعاد غير المتري بواسطة وظيفة "التنسيق" في إعدادات المعلمة الافتراضية باستخدام مسافة Bray-Curtis. تم إيداع بيانات التسلسل الخام في قاعدة بيانات GEO تحت رقم الانضمام PRJNA607006.

تحضير مرشحات الجراثيم

تم جمع البراز الطازج من الفئران BALB / c وتعليقه في PBS المثلج. تم ترشيح المعلق البرازي لاحقًا من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون (كورنينج) ، 30 ميكرومتر (بارتيك ، جورليتس) ، 5 ميكرون (ميرك عبر سيجما ، دارمشتات) و 0.45 ميكرومتر (سارستيدت ، نومبرشت) مرشحات حقنة بكتيرية. بعد الطرد المركزي ، تمت إضافة الحبيبات إلى تعليق الكائنات الحية الدقيقة لفئران ΔdblGATA1. تم إعطاء مائتي ميكرولتر من المنتج النهائي لكل فأر بالتزقيم.

الزراعة المشتركة للخلايا الطحالية مع المرشحات البرازية

تم عزل إجمالي الخلايا الطحالية من فئران BALB / c ، مطلية على 96 طبقًا جيدًا (5 × 10 5 خلايا جيدًا) مُغلفة مسبقًا بـ CD3 (3 ميكروغرام / ميكرولتر) و CD28 (3 ميكروغرام / ميكرولتر) وأجسام مضادة تمت زراعتها بشكل مشترك مع 0.45 ميكرومتر المرشحات من الفئران BALB / c أو ΔdblGATA-1. بعد ثمانية وأربعين ساعة ، تم إعادة تنشيط الخلايا باستخدام PMA (50 نانوغرام / مل) والأيونوميسين (5 ميكروغرام / مل) لمدة ساعتين ، وغسلها ، وتعليقها في QIAzol Lysis Reagent لاستخراج الحمض النووي الريبي.

تهجين الفلورسنت في الموقع

تم تضمين خزعات أنسجة الفئران المعوية في مركب Tissue-Tek® O.C.T. ™ المركب. تم وضع أربعة أقسام سميكة ميكرومتر على شرائح SuperFrost plus ، وتم تثبيتها بمحلول Carnoy على الجليد لمدة 20 دقيقة ، وتركها حتى تجف. تم إجراء التهجين في المخزن المؤقت للتهجين (900 ملي كلوريد الصوديوم ، 100 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) ، 6.7 ملي مولار فورماميد ، 346.7 ملي مولار SDS ، 2 نانوغرام / ميكرولتر مسبار DNA) عند 50 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. تم شطف الشرائح بالماء غير المتأين ، وغسلها بمحلول غسيل (900 ملي كلوريد الصوديوم ، 100 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، 346.7 ملي مولار SDS) لمدة 5 دقائق عند 50 درجة مئوية ، وشطفها مرة أخرى بالماء غير المتأين. بعد التجفيف ، تم تلطيخ الأقسام بمحلول DAPI (3.6 ميكرومتر DAPI ، 900 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار Tris-HCl) عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وشطفها بالماء غير المتأين. تم إجراء التهجين في محطة التهجين a-Hyb (Miltenyi Biotec). تم تركيب المقاطع الجافة وفحصها بواسطة الفحص المجهري الفلوري (Keyence Biorevo BZ-9000). تم استخدام المسبار التالي المترافق مع AlexaFluor 647: AnaeroF1: 5’-ATGTAAAGTTCTTTATCAG-3 '.

تحليل احصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام GraphPad Prism 5.04. الاختبارات المقابلة موضحة في أساطير الشكل.


شكر وتقدير

نشكر أعضاء مجموعة البروفيسور Rescigno على الدعم العلمي الذي لا يقدر بثمن ، ومرفق الحيوانات IEO لتربية الحيوانات الممتازة ، والمعهد الوطني لمرفق Tetramer الصحي لتقديم h / mCD1d: PBS57 Tetramers ، و Erika Mileti للمساعدة الفنية. نشكر الدكتور فالكون والدكتور كاسوراتي والدكتور ديلابونا على القراءة النقدية للمخطوطة والبروفيسور دي ليبيرو والدكتور موري على المناقشات العلمية طوال فترة تطوير المشروع. أصبح هذا العمل ممكنًا من خلال منح Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (Start-Up 14378 to F Facciotti) ووزارة الصحة الإيطالية (GR-2016-02361741) و Fondazione IRCCS Policlinico Maggiore Milano (جائزة البحث 5X1000 إلى F Caprioli) .

الكاتب الاشتراكات

C Burrello: تنظيم البيانات والتحليل الرسمي والتحقيق.

G Pellegrino: معالجة البيانات والتحقيق فيها.

MR Giuffre: معالجة البيانات والتحقيق.

G Lovati: معالجة البيانات والتحقيق فيها.

I Magagna: معالجة البيانات والتحقيق فيها.

A Bertocchi: معالجة البيانات والتحقيق.

FM Cribiù: معالجة البيانات والتحقيق والمنهجية.

F Boggio: التحقيق والمنهجية.

E Trombetta: معالجة البيانات والتحقيق فيها.

A Di Sabatino: التحقيق والمنهجية.

إم فيكي: الموارد والمنهجية.

M Rescigno: الموارد والمنهجية.

F Caprioli: الموارد والحصول على التمويل والتحقيق والمنهجية وإدارة المشروع والكتابة - المراجعة والتحرير.

F Facciotti: وضع المفاهيم والإشراف والحصول على التمويل وإدارة المشروع والكتابة - المسودة الأصلية والمراجعة والتحرير.


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


نتائج

يؤثر تركيز الحديد اللمعي على تكوين الميكروبات في القولون

يظل معظم الحديد الذي يتم توصيله من خلال مكملات الحديد عند البشر غير ممتص بعد الابتلاع ويظل موضعيًا في تجويف الأمعاء ، حيث قد يؤثر بشكل مباشر على تكوين الجراثيم. لاكتساب نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير تركيز الحديد اللمعي على الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء ، قمنا بتغذية C57Bl / 6 الفئران بنظام غذائي مخصص يحتوي على اختلافات 10 أضعاف في محتوى الحديد ، وبصورة أدق 5 مجم / كجم (نقص الحديد) ، 50 مجم / كجم (الحديد الكافي ) و 500 مجم / كجم (مكمل بالحديد). كما هو مبين في الشكل 1 أ ، أدت هذه الحميات إلى زيادات تقارب 10 أضعاف في الحديد اللمعي. وهكذا ، في الفئران ، كما هو الحال في البشر ، يتم الاحتفاظ بمعظم الحديد الزائد في الفضاء اللمعي ، مما يسمح بالتعديل الناجح لمستويات الحديد اللمعي من خلال التلاعب الغذائي.

التحولات في التركيب الميكروبي للأمعاء مدفوعة بمستويات الحديد اللمعي. أ ، مستويات الحديد اللمعي في الفئران التي تم تغذيتها على وجبات تحتوي على 5 ، 50 ، أو 500 ملجم من كبريتات الحديدوز / كجم طعام. B – E ، تحليل تحولات الجراثيم البرازية مدفوعة بمستويات الحديد اللامعة التي تم تقييمها بواسطة (B) تحليل التنسيق الرئيسي (C) α- التنوع (D) مستوى الأسرة والتركيب الميكروبي على مستوى الأنواع (E). تحليل التباين: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001. ن. الصورة ، ليست كبيرة. في (أ) و (ب) و (هـ) تشير كل نقطة بيانات إلى ماوس واحد ، ن = 10 فئران لكل مجموعة.

التحولات في التركيب الميكروبي للأمعاء مدفوعة بمستويات الحديد اللمعي. أ ، مستويات الحديد اللمعي في الفئران التي تم تغذيتها على وجبات تحتوي على 5 ، 50 ، أو 500 ملجم من كبريتات الحديدوز / كجم طعام. B – E ، تحليل تحولات الجراثيم البرازية مدفوعة بمستويات الحديد اللامعة التي تم تقييمها بواسطة (B) تحليل التنسيق الرئيسي (C) α- التنوع (D) مستوى الأسرة والتركيب الميكروبي على مستوى الأنواع (E). تحليل التباين: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001. ن. الصورة ، ليست كبيرة. في (أ) و (ب) و (هـ) تشير كل نقطة بيانات إلى ماوس واحد ، ن = 10 فئران لكل مجموعة.

درسنا بعد ذلك تأثير تراكيز مختلفة من الحديد اللمعي على تركيبة الكائنات الحية الدقيقة في القولون. قمنا بتحليل الحمض النووي المستخرج من عينات البراز باستخدام تسلسل الجيل التالي من أمبليكون الجين الريبوسومي 16S (rRNA) على منصة Illumina. كما هو مبين في الشكل 1 ب ، كشف تحليل الإحداثيات الرئيسي للوفرة النسبية للمجموعات البكتيرية من نصوص الرنا الريباسي 16S عن تحولات في المجتمعات البكتيرية بين الفئران التي تم تغذيتها بالنظام الغذائي الذي يعاني من نقص الحديد والنظام الغذائي المكمل بالحديد ، وكلاهما يظهر تداخلًا جزئيًا مع الحديد- حمية كافية (أدونيس: ص = 0.008). ومع ذلك ، يشير تحليل تنوع ألفا (عدد OTUs ومؤشر شانون) ، الموضح في الشكل 1C ، إلى أن تنوع الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء لا يتأثر بشكل كبير بمستويات الحديد اللمعي. كشف تحليل جين الرنا الريباسي 16S أن زيادة مستويات الحديد اللمعي أدت إلى زيادات كبيرة في الوفرة النسبية للشعبة البكتيرية. الحزم (25٪ نقص الحديد مقابل 30٪ مكمل بالحديد ص & lt 0.05) ، بينما الجراثيم و بروتيوباكتيريا بقيت غير متأثرة إلى حد كبير (الشكل 1 د).

داخل الشعبة الحزم، 4 أنواع بكتيرية تزداد بتركيزات الحديد اللمعي (الشكل 1E) ، أي أعضاء الطلبات كلوستريدياليس (غير مصنف كلوستريدياليس و اوسيلوسبيرا ص) و اكتوباكيلالس (المكورات المعوية ص. وغير مصنف المكورات المعوية). على العكس من ذلك ، انخفضت 4 أنواع تنتمي إلى أوامر مختلفة: الترتيب كلوستريدياليس (غير مصنف Christensenellaceae)، ترتيب اكتوباكيلالس (المكورات اللبنية ص. وغير مصنف اكتوباكيلل) والنظام SHA-98 (غير مصنف SHA-98). التغييرات في غير المصنفة (موجي باكتيريا) من النظام كلوستريدياليس زادت من 5 إلى 50 مجم حديد / كجم من الطعام ولكنها انخفضت من 50 إلى 500 مجم حديد / كجم طعام ، مما يشير إلى أن هذه التغييرات المحددة قد لا تكون ذات صلة بمستويات الحديد اللمعي. داخل الشعبة TM7، ترتيب CW040، وجدنا انخفاضًا في القيمة غير المصنفة اف 16 مع تركيزات أعلى من الحديد. أخيرًا ، في الشعبة الجراثيم، ترتيب الجراثيم، تم العثور على تحولات في 4 أنواع: بارابكتيرويد ديستاسونيس, بارابكتيرويدس جوردوني, بكتيرويدس، وغير المصنفة Rikenellaceae.

تظهر هذه النتائج أن الاختلافات في مستويات الحديد اللمعي تؤدي إلى خلط الوفرة بدلاً من استبدال كبير لأفراد المجتمع كسبب للتحولات المجتمعية الملحوظة. كانت التحولات أكثر تواترا لأعضاء الحزم من الجراثيم أو TM7.

تؤثر تركيبات الحديد بشكل تفاضلي على تكوين ميكروبيوتا القولون

بعد ذلك ، سألنا عما إذا كان تأثير الحديد على تكوين الكائنات الحية الدقيقة قد يختلف اعتمادًا على تركيبات الحديد المستخدمة لتكملة النظام الغذائي. في العقود القليلة الماضية ، تم إدخال العديد من مركبات الحديد كمقويات غذائية للوقاية من نقص الحديد لدى البشر ، تم اختيارها بناءً على شرطين أساسيين: (1) "يجب ألا يغير المركب الخصائص الحسية لمركب الغذاء" و ( 2) "يجب أن تتمتع بتوافر حيوي مرتفع عند استهلاكها كمنتج نهائي". 44 اخترنا 3 مركبات حديد متوفرة تجاريًا ذات توافر حيوي مثبت وكيمياء معقدة مميزة والتي تعد من بين أكثر المركبات استخدامًا كمقويات للحديد ومكملات حديدية علاجية: FS و FBG و FEDTA. 44 ، 45 كما هو مبين في الشكل 2 أ ، فإن الفئران التي تم تغذيتها بتركيبات الحديد المختلفة بنفس تركيز الحديد (أي 50 مجم حديد / كجم تشاو) كانت تحتوي على كميات مماثلة من الحديد اللمعي ، وبالتالي باستثناء احتمال حدوث تغييرات في الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء يمكن أن تعزى إلى التغيرات في تركيز الحديد اللمعي. ومع ذلك ، على الرغم من مستويات الحديد اللمعية المتشابهة ، تُظهر مؤامرة تحليل الإحداثيات الرئيسية أن مركبات الحديد المتميزة أدت إلى تجمعات مختلفة بشكل كبير لمجتمعات الكائنات الحية الدقيقة (Adonis: ص = 0.03 الشكل 2 ب). يشير عدد OTUs ومؤشر Shannon (الشكل 2C) إلى أن تنوع الميكروبات المعوية لم يتأثر بشكل كبير بمركبات الحديد المميزة المستخدمة في الوجبات الغذائية.

تحولات في التركيب الميكروبي للأمعاء مدفوعة بتركيبات حديدية مميزة. أ ، مستويات الحديد اللمعي في الفئران التي تم إطعامها على وجبات تحتوي على 50 مجم من الحديد / كجم مضافًا على شكل كبريتات حديدية (FS) ، أو بيسجليسينات حديدية (FBG) ، أو حمض إيثيلين ديامينيتراسيتيك الحديدي (FEDTA). B - E ، تحليل تحولات الجراثيم البرازية مدفوعة بمستويات الحديد اللامعة التي تم تقييمها بواسطة (B) تحليل التنسيق الرئيسي (C) α- التنوع (D) مستوى الأسرة والتركيب الميكروبي على مستوى الأنواع (E). تحليل التباين: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001. ن. الصورة ، ليست كبيرة. في (أ) و (ب) و (هـ) تشير كل نقطة بيانات إلى ماوس واحد ، ن = 5-8 فئران لكل مجموعة.

تحولات في التركيب الميكروبي للأمعاء مدفوعة بتركيبات حديدية مميزة. أ ، مستويات الحديد اللمعي في الفئران التي تم تغذيتها على وجبات تحتوي على 50 مجم من الحديد / كجم مضافًا على شكل كبريتات حديدية (FS) ، أو بيسجليسينات حديدية (FBG) ، أو حمض إيثيلين ديامينيتراسيتيك الحديدي (FEDTA). B – E ، تحليل تحولات الجراثيم البرازية مدفوعة بمستويات الحديد اللامعة التي تم تقييمها بواسطة (B) تحليل التنسيق الرئيسي (C) α- التنوع (D) مستوى الأسرة والتركيب الميكروبي على مستوى الأنواع (E). تحليل التباين: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001. ن. الصورة ، ليست كبيرة. في (أ) و (ب) و (هـ) ، تشير كل نقطة بيانات إلى ماوس واحد ، ن = 5-8 فئران لكل مجموعة.

بينما في مستوى الشعبة ، لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية (الشكل 2 د) على مستوى الأنواع (الشكل 2E) ، وجدنا أن كلاً من FBG و FEDTA ، عند مقارنتها مع FS ، زاد من مستويات بارابكتيرويدس ص. (الشعبة الجراثيم). بالمقارنة مع FS ، انخفضت وفرة نوعين استجابة لـ FBG ، وهما الحزم غير مصنف المطثيات و ديهالوباكتيريوم ص. من أجل كلوستريدياليس. بدوره ، زاد FEDTA من وفرة 6 أنواع: واحد من الشعبة بروتيوباكتيريا (بيلوفيلا ص) ، 3 الحزم (من الطلب عصياتالمكورات العنقودية sciuri وغير مصنف اكتوباكيلل ومن النظام ErysipelotrichiAllobaculum س) ، وواحد من الشعبة أكتينوباكتيريا (محطة الوتدية). على العكس من ذلك ، وفرة 3 الحزم: المكورات اللبنية ص. من أجل اكتوباكيلل، إلى جانب المكورات المشتركة ص. و بيلة الورد ص. من أجل كلوستريدياليس انخفض بشكل ملحوظ في الفئران التي تم تغذيتها بنظام FEDTA (الشكل 2E).

بناءً على مستويات متساوية من الحديد اللمعي ، تُظهر هذه البيانات أن نوع مركب الحديد يغير بشكل كبير تكوين ميكروبيوتا القولون. ومع ذلك ، فإن التحولات التي تم تحديدها في مجتمعات ميكروبيوتا الأمعاء مدفوعة بتركيبات حديدية مميزة تختلف اختلافًا كبيرًا عن التحولات التي تسببها الاختلافات في مستويات الحديد اللمعي.

تُحدث مستويات الحديد اللمعية وتركيبات الحديد المميزة تغييرات في التركيب الوظيفي المتوقع لمجتمعات الميكروبات البرازية

بعد ذلك ، لتقييم ما إذا كانت التغييرات التي تتم بوساطة الحديد في وفرة الأصناف البكتيرية مصحوبة بتغييرات وظيفية ، استخدمنا تحليل PICRUSt 46 المطبق على بيانات تسلسل الجين 16S rRNA. ثم تم تحليل نتائج PICRUSt باستخدام حجم تأثير تحليل التمايز الخطي لتحديد الوظائف الميكروبية التي كانت مختلفة بشكل كبير بين المجموعات. كما هو مبين في الشكل 3 أ ، لوحظ ما مجموعه 9 وظائف بكتيرية وفيرة بشكل تفاضلي (α = 0.05 ، درجة LDA & gt2.5) بين الفئران التي تم تغذيتها بالنظام الغذائي الذي يعاني من نقص الحديد (5 مجم FS / كجم طعام) والفئران التي تم إطعامها النظام الغذائي المدعم بالحديد (500 مجم FS / كجم طعام). أدى النظام الغذائي المدعم بالحديد إلى زيادة عدد الجينات المتورطة في نقل الأغشية (الناقلات) والنسخ (عوامل النسخ) ، في حين أنه قلل من عدد الجينات المرتبطة باستقلاب الطاقة (مسارات تثبيت الكربون ، الفسفرة المؤكسدة ، واستقلاب الطاقة) ، وأيض الكربوهيدرات. (دورة السترات) ، والمرافقين (الطي والفرز والتحلل) ، واستقلاب العوامل المساعدة والفيتامينات.

التحولات الوظيفية الميتاجينومية المستنبطة الناتجة عن جرعات وتركيبات الحديد. A - C ، التحولات الوظيفية الميتاجينومية المتوقعة كما تم قياسها بواسطة حجم تأثير التحليل التمييزي الخطي (LDA) لمسارات KEGG في الفئران التي تم تغذيتها على وجبات تحتوي على: (A) 5 (أزرق فاتح) و 500 (أزرق غامق) مجم من الحديد / كجم في the form of ferrous sulfate (FS—blue) (B) Ferrous bisglycinate (FBG—green) and (C) Ferric ethylenediaminetetraacetic acid (FEDTA—red). FBG and FEDTA diets had 50 mg iron/kg chow. D, Basic features of gene regulation by the iron-regulated bacterial transcription factor ferric uptake regulator (Fur) and functions known to be regulated by Fur. Background colors are used to group related KEGG pathways which overlap with those shown in (A–C). Apo-Fur devoid of iron can directly bind iron (Fe), originating Holo-Fur. Both may bind the Fur binding site (BS) present on the promoter of target genes and activate or inhibit the recruitment of RNA polymerase (Rp) to the Rp BS, thereby regulating the expression of the target gene. Arrows indicate activation and blunted lines represent inhibition.

Inferred metagenomic functional shifts triggered by iron doses and formulations. A–C, Predicted metagenomic functional shifts as measured by Linear discriminative analysis (LDA) effect size of KEGG pathways in mice that were fed diets containing: (A) 5 (light blue) and 500 (dark blue) mg of iron/kg in the form of ferrous sulfate (FS—blue) (B) Ferrous bisglycinate (FBG—green) and (C) Ferric ethylenediaminetetraacetic acid (FEDTA—red). FBG and FEDTA diets had 50 mg iron/kg chow. D, Basic features of gene regulation by the iron-regulated bacterial transcription factor ferric uptake regulator (Fur) and functions known to be regulated by Fur. Background colors are used to group related KEGG pathways which overlap with those shown in (A–C). Apo-Fur devoid of iron can directly bind iron (Fe), originating Holo-Fur. Both may bind the Fur binding site (BS) present on the promoter of target genes and activate or inhibit the recruitment of RNA polymerase (Rp) to the Rp BS, thereby regulating the expression of the target gene. Arrows indicate activation and blunted lines represent inhibition.

Regarding the effect of iron formulations, analysis of the metagenomes using PICRUSt showed that 5 metabolic pathways were modulated by FBG and 12 by FEDTA when compared with FS. Both compounds led to an increase in genes associated with cellular processes and signaling and a decrease in genes implicated in cell motility ( Fig. 3B, C). There was also an increase in genes that are associated with general functions or poorly characterized genes ( Fig. 3B, C). Overall, the affected metabolic pathways were similar for FBG and FEDTA diets and may therefore represent an effect of the FS diet itself.

Taken together, these data suggest that bacterial community shifts induced by luminal iron concentration reflect both abundance changes and functional changes because, in addition to significant changes in the abundance of particular bacterial taxa, we also found significant modulation of several KEGG pathways. However, distinct iron formulations seem to impact similar inferred metabolic pathways.

Dietary Iron Compounds Differently Impact the Severity of DSS-induced Colitis

Because IBD has been associated with gut dysbiosis, and oral iron supplementation may further affect disease activity, we next investigated the effects of iron supplementation on chemically induced colitis using the 3 different iron compounds, i.e., FS, FBG, and FEDTA. To this end, colitis was induced by adding DSS to the drinking water of mice that were fed the iron-sufficient diet with 50 mg iron/kg chow as ferrous sulfate (FS50), or the iron-supplemented diet with 500 mg iron/kg chow as ferrous sulfate (FS500), ferrous bisglycinate (FBG500), or ferric ethylenediaminetetraacetic acid (FEDTA500). As shown in Figure 4A, mice that were fed the diet supplemented with FBG500 had the best survival rates (100%), whereas survival in mice that were fed FEDTA500 was substantially lower (64%). Intermediate survival rates were registered in mice that were fed the FS-supplemented diet (FS50—71% and FS500—88%). Accordingly, body weight ( Fig. 4B) was also substantially lower in mice receiving FEDTA500 (19% body loss) and FS50 (20% body loss), with FBG500 causing the least body lost (9% body loss), followed by FS500 (13% body loss). In addition, mucosal cell infiltration assessed in colonic samples, indicating heightened inflammation, was significantly higher in FEDTA500 and FS50 fed mice compared with FS500 or FBG500 ( Fig. 4C). Finally, mice that were fed the FEDTA500 supplemented diet developed splenomegaly, which was not observed in the other mouse groups ( Fig. 4D). These data indicate that, overall, FEDTA500 had the most negative impact on colitis, whereas FBG500 seems to exert a protective effect. The interpretation that FEDTA aggravated the colitis is further substantiated by the finding that mice in the FEDTA500 group that did not survive acute colitis had significantly shortened colon length compared with the surviving mice, indicating that mice died from the DSS-induced colitis as opposed to potential toxic effects ( Fig. 4E).

Dietary iron doses and formulations affect the severity of DSS-induced colitis. A, Survival. B, Body weight. C, Inflammation score. D, Spleen weight in mice that were fed diets containing 50 mg of iron/kg as ferrous sulfate (FS—light blue), 500 mg of iron/kg FS (dark blue), ferrous bisglycinate (FBG—green), and ferric ethylenediaminetetraacetic acid (FEDTA—red). Filled symbols in (D) represent surviving mice and empty symbols represent nonsurviving mice. E, Colon size of surviving (filled symbols) and nonsurviving (empty symbols) mice that were fed the diet supplemented with 500 mg of FEDTA/kg chow. In (D) and (E), each data point indicates a single mouse, ن = 12 to 24 mice per group, and the horizontal dashed line indicates values measured in control, DSS-untreated mice. F–G, Rescue of mice that were fed 500 mg of the FEDTA/kg chow diet by streptomycin (Strp) treatment. F, Survival. G, Body weight. Analysis of variance: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص < 0.001 †ص < 0.05 ††ص < 0.01 (compared with 50 and 500 mg of iron/kg chow in the form of FS). ¥¥ص < 0.01 ¥¥¥ص < 0.001 (compared with FEDTA and FEDTA-Strp).

Dietary iron doses and formulations affect the severity of DSS-induced colitis. A, Survival. B, Body weight. C, Inflammation score. D, Spleen weight in mice that were fed diets containing 50 mg of iron/kg as ferrous sulfate (FS—light blue), 500 mg of iron/kg FS (dark blue), ferrous bisglycinate (FBG—green), and ferric ethylenediaminetetraacetic acid (FEDTA—red). Filled symbols in (D) represent surviving mice and empty symbols represent nonsurviving mice. E, Colon size of surviving (filled symbols) and nonsurviving (empty symbols) mice that were fed the diet supplemented with 500 mg of FEDTA/kg chow. In (D) and (E), each data point indicates a single mouse, ن = 12 to 24 mice per group, and the horizontal dashed line indicates values measured in control, DSS-untreated mice. F–G, Rescue of mice that were fed 500 mg of the FEDTA/kg chow diet by streptomycin (Strp) treatment. F, Survival. G, Body weight. Analysis of variance: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص < 0.001 †ص < 0.05 ††ص < 0.01 (compared with 50 and 500 mg of iron/kg chow in the form of FS). ¥¥ص < 0.01 ¥¥¥ص < 0.001 (compared with FEDTA and FEDTA-Strp).

To further establish a link between the worsening of colitis and gut microbiota in mice receiving the FEDTA-supplemented diet, we cotreated mice with streptomycin, a broad-spectrum antibiotic that targets both gram-positive and gram-negative bacteria. This antibiotic, but not vancomycin, neomycin, or penicillin, has been shown by others to reduce colitis in mice treated with DSS, 37 presumably by killing specific bacterial species that contribute to DSS-induced colitis. Therefore, we treated mice that received the FEDTA-supplemented diet with the antibiotic streptomycin during the DSS treatment. As shown in Figure 4F, streptomycin treatment was able to rescue the mice by increasing survival rates to 100%, compared with a 64% survival rate in mice that did not receive antibiotic treatment. Likewise, body weight losses were significantly attenuated in mice receiving streptomycin with both FS- and FEDTA-supplemented diets ( Fig. 4G). These results reinforce the notion that FEDTA affects the outcomes of colitis through microbiota changes as opposed to unspecific toxic effects, in which case mice would have not been rescued by the antibiotic treatment.

Altogether, results from Figure 4 indicate that FEDTA presence in the diet may negatively affect the severity of DSS-induced colitis in mice, most likely through modulation of the microbiota. In contrast, FBG500 and FS500 had a protective effect compared with FS50, suggesting that iron supplementation may actually have a protective role in colitis.

The Probiotic بكتريا قولونية Nissle 1917 Requires Iron to Protect Mice from Colitis

The probiotic bacteria EcN has been shown to outcompete pathogenic bacteria such as السالمونيلا by limiting iron availability and thus limiting their growth. 47 Hence, we next examined the potential use of EcN in combination with iron supplementation in decreasing intestinal inflammation.

To this end, mice were kept on the iron-sufficient diet (FS50) or iron-supplemented diet (FS500) and received 10 9 CFUs of EcN or saline twice, before and at the beginning of the DSS treatment. As shown in Figure 5A, survival rates were lowest when mice were fed the iron-sufficient diet (FS50—80%) compared with mice that were fed any of the other diets with or without EcN treatment (100% survival rate). Overall, mice receiving a combination of iron-supplemented diet (FS500) and EcN were the most protected from colitis, as judged by changes in body weight ( Fig. 5B), colon size ( Fig. 5C), inflammation score ( Fig. 5D), and mRNA levels of the inflammatory marker Lcn2 ( Fig. 5E). Again, iron supplementation did not result in aggravation of colitis, recapitulating the results from the previous experiments. The most surprising result was the absence of any protective effect in mice receiving EcN when mice were fed the iron-sufficient as opposed to the iron-supplemented diet. To investigate if this was related to the ability of EcN to grow in an iron sufficient versus iron rich environment, we quantified EcN DNA levels in fecal samples. As shown in Figure 5F, this was not the case, as the quantity of amplified EcN DNA was similar in feces samples collected from both mice that were fed the FS50 and FS500 diets.

The beneficial effect of the probiotic الإشريكية القولونية Nissle 1917 (EcN) in DSS-induced colitis depends on the levels of luminal iron. All mice received DSS in drinking water while fed diets supplemented with 50 mg (light blue) and 500 mg (dark blue) of FS/kg chow-supplemented diet and were gavaged with PBS (controls—light and dark blue) and EcN (light and dark green). A, Survival. B, Body weight. C, Colon size. D, Inflammation score. E, Colon lipocalin 2 (Lcn2) mRNA levels. The horizontal dashed line indicates values measured in control, DSS-untreated mice. F، الإشريكية القولونية Nissle 1917 (EcN) DNA levels. Analysis of variance: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001. ¥ص < 0.05 (500 mg iron/kg chow + EcN compared with 50 mg of iron/kg chow + PBS). ن. s., not significant. In (C) and (E), each data point indicates a single mouse, ن = 8 to 10 mice per group.

The beneficial effect of the probiotic الإشريكية القولونية Nissle 1917 (EcN) in DSS-induced colitis depends on the levels of luminal iron. All mice received DSS in drinking water while fed diets supplemented with 50 mg (light blue) and 500 mg (dark blue) of FS/kg chow-supplemented diet and were gavaged with PBS (controls—light and dark blue) and EcN (light and dark green). A, Survival. B, Body weight. C, Colon size. D, Inflammation score. E, Colon lipocalin 2 (Lcn2) mRNA levels. The horizontal dashed line indicates values measured in control, DSS-untreated mice. F، الإشريكية القولونية Nissle 1917 (EcN) DNA levels. Analysis of variance: *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001. ¥ص < 0.05 (500 mg iron/kg chow + EcN compared with 50 mg of iron/kg chow + PBS). ن. s., not significant. In (C) and (E), each data point indicates a single mouse, ن = 8 to 10 mice per group.

These data suggest that the protective effect of EcN in colitis depends on the levels of luminal iron, as EcN provided to mice that were fed the FS50 diet seemed to have no significant effect on protecting mice from DSS-induced colitis, contrasting with the clearly protective effect achieved using the FS500 حمية.


معلومات الكاتب

Tzu-Wei Yang, Wei-Hsiang Lee and Chien-Ning Huang contributed equally.

الانتماءات

Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Internal Medicine, Chung Shan Medical University Hospital, Taichung, 402, Taiwan

Tzu-Wei Yang, Ming-Chang Tsai, Chi-Chih Wang, Hsuan-Yi Chen & Chun-Che Lin

School of Medicine, Chung Shan Medical University, Taichung, 402, Taiwan

Tzu-Wei Yang, Ming-Chang Tsai, Chi-Chih Wang, Hsuan-Yi Chen, Chi-Chou Huang, Kwo-Chang Ueng, Chien-Ning Huang & Chun-Che Lin

Institute and Department of Biological Science and Technology, College of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, Hsinchu, 300, Taiwan

Tzu-Wei Yang, Wei-Hsiang Lee, Wei-Chih Huang, Ting-Hsuan Sun, Tzu-Ling Yang, Hsin-Tzu Huang, Chih-Hung Chou, Shinn-Ying Ho, Wen-Liang Chen, Hsien-Da Huang & Yuh-Jyh Jong

Institute of Bioinformatics and Systems Biology, College of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, Hsinchu, 300, Taiwan

Wei-Hsiang Lee, Siang-Jyun Tu, Wei-Chih Huang, Hui-Mei Chen, Yu-Pao Chou, Chih-Hung Chou, Ya-Rong Huang, Yi-Run Sun, Chao Liang, Feng-Mao Lin, Shinn-Ying Ho & Hsien-Da Huang

Department of Medical Research, Chung Shan Medical University Hospital, Taichung, 402, Taiwan

Wei-Hsiang Lee, Wei-Chih Huang, Shun-Fa Yang & Kwo-Chang Ueng

Institute of Medicine, Chung Shan Medical University, Taichung, 402, Taiwan

Ming-Chang Tsai, Chi-Chih Wang, Bei-Hao Shiu & Shun-Fa Yang

Division of Colon and Rectum, Department of Surgery, Chung Shan Medical University Hospital, Taichung, 402, Taiwan

Chi-Chou Huang & Bei-Hao Shiu

Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Internal Medicine, Chung Shan Medical University Hospital, Taichung, 402, Taiwan

Graduate Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, 807, Taiwan

Departments of Pediatrics and Laboratory Medicine, Kaohsiung Medical University Hospital, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, 807, Taiwan

Institute of Molecular Medicine and Bioengineering, College of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, Hsinchu, 300, Taiwan

Warshel Institute For Computational Biology, The Chinese University of Hong Kong, Shenzhen, 518172, Longgang District, Shenzhen, China

School of Life and Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Shenzhen, 518172, Longgang District, Shenzhen, China

School of Sciences and Engineering, The Chinese University of Hong Kong, Shenzhen, 518172, Longgang District, Shenzhen, China


شاهد الفيديو: علامات تحذيرية تخبرك بانك تعاني من نقص البكتيريا النافعة في الامعاء اخطر مشكل يعاني منه الناس (كانون الثاني 2022).