معلومة

ما هو معرف الجين الأكثر استقرارًا؟


لقد عانيت في الماضي في تصميم البيانات (القواعد) حول معرفات الجينات التي تتطور بمرور الوقت. على سبيل المثال ، يغير UniProt و Ensembl معرفاتهما لبعض البروتينات / الجينات وتختفي المعرفات بعد فترة (سنوات). هل يبدو HGNC أفضل لهذا؟ ما أرغب فيه هو الحصول على معرف فريد واحد لكل جين بشري يظل ثابتًا لسنوات عديدة. أعلم أن الجينات يتم إعادة تصنيفها من حين لآخر ، لكن لا يجب أن ينتهي بك الأمر بمعرف جديد لنفس المكان.

اقتراحات؟

شكرا


يعد الحفاظ على تناسق المعرفات مشكلة شائعة. لم أر أبدًا أي حلول معقولة لذلك ولا أعتقد أن هناك أيًا منها. ومع ذلك ، هناك بعض الاختصارات.

  1. يمكنك إنشاء جدول إضافي بأسماء مستعارة لعمليات إعادة التسمية لاحقًا وإحالتها إلى المعرفات الأصلية. الايجابيات - إنها مرنة. السلبيات - الصيانة مرهقة وتحتاج إلى تحديد طريقة لشرح للمستخدمين سبب إدخال معرف واحد واستلام الآخر.
  2. الحل واضح جدًا - إذا كنت ترغب في الحصول على "معرّف فريد واحد لكل جين بشري يظل ثابتًا لسنوات عديدة" ، يمكنك فقط التقاط لقطة للحالة الحالية لأي قاعدة بيانات تريدها وعدم لمسها لعدة سنوات. يمكنك إصدار إصدارات خاصة بالإصدار من قاعدة البيانات الخاصة بك وتحديد إصدارات قاعدة البيانات المرجعية التي تستخدمها. على سبيل المثال "Glioblastoma_drug_perturbation_2016_ (GRCh38_ENS87)".

تحديد وتقييم الجينات المرجعية للتحليل الكمي في الوقت الحقيقي PCR في بوليغونوم كوسبيداتوم على أساس بيانات النسخ

بوليغونوم كوسبيداتوم من عائلة Polygonaceae هو نبات طبي تقليدي يحتوي على العديد من المركبات النشطة بيولوجيًا التي تلعب أدوارًا مهمة في صحة الإنسان واستجابات الإجهاد. حاول البحث تحديد جينات التخليق الحيوي ومسارات التمثيل الغذائي في هذا النوع ، وشائع استخدام PCR في الوقت الحقيقي الكمي (RT-qPCR) للكشف عن التعبير الجيني بسبب سرعته وحساسيته وخصوصياته. ومع ذلك ، لا P. cuspidatum تم تحديد الجينات المرجعية ، مما يعيق دراسات التعبير الجيني. هنا ، نهدف إلى تحديد الجينات المرجعية المناسبة لتطبيع دقيق وموثوق لـ P. cuspidatum بيانات RT-qPCR.

نتائج

اثنا عشر جينًا مرجعيًا مرشحًا ، بما في ذلك تسعة جينات شائعة (يمثل, TUA, حوض, جابده, EF-1γ, UBQ, UBC, 60 سرنا، و eIF6A) وثلاث روايات (SKD1, YLS8، و NDUFA13) ، تم تحليلها في أنسجة مختلفة (الجذر والساق والأوراق) بدون معالجة وفي الأوراق تحت ضغوط غير حيوية (الملح والأشعة فوق البنفسجية والبرودة والحرارة والجفاف) ومحفزات الهرمونات (حمض الأبسيسيك [ABA] والإيثيلين [ ETH] ، جبريلين [GA3] وميثيل جاسمونيت [MeJA] وحمض الساليسيليك [SA]). تم حساب ثبات التعبير في 65 عينة باستخدام طريقة CT و geNorm و NormFinder و BestKeeper و RefFinder. اثنان من الجينات المرجعية (NDUFA13 و EF-1γ) كافية لتطبيع التعبير الجيني عبر جميع مجموعات العينات. لقد كانوا أيضًا الجينين الأكثر استقرارًا للضغوط اللاأحيائية والأنسجة المختلفة ، بينما NDUFA13 و SKD1 كانت أفضل خيارين لمنبهات الهرمونات. النظر في المجموعات التجريبية الفردية ، جابده كان الجين الأعلى مرتبة في ABA و ETH و GA3 العلاجات ، في حين 60 سرنا أظهر ثباتًا جيدًا في ظل MeJA والمعالجات الباردة. يمثل, UBC، و حوض كانت الجينات المناسبة لعلاجات الجفاف والأشعة فوق البنفسجية و ABA على التوالي. TUA لم يكن مناسبًا بسبب الاختلاف الكبير في التعبير في ظل ظروف مختلفة. أنماط التعبير عن بك بال ، بكستس، و PcMYB4 في ظل علاجات UV و SA وفي الأنسجة المختلفة التي تم تطبيعها بواسطة جينات مرجعية مستقرة وغير مستقرة ، أظهر مدى ملاءمة الجينات المرجعية المثلى.

الاستنتاجات

نحن نقترح NDUFA13 و EF-1γ كجينات مرجعية للتطبيع P. cuspidatum بيانات التعبير. على حد علمنا ، هذه هي أول دراسة منهجية للجينات المرجعية في P. cuspidatum والتي يمكن أن تساعد في تقدم أبحاث البيولوجيا الجزيئية في P. cuspidatum والأنواع المتحالفة معها.


التحقق من صحة الجينات المرجعية لتحليل التعبير الجيني باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في خطوط البازلاء (بيسوم ساتيفوم) مع قابلية مختلفة للسكن

Michał Knopkiewicz ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة آدم ميكيفيتش في بوزنان ، أومولتوسكا 89 ، 61-614 بوزنان ، بولندا.

كلية الأحياء ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة آدم ميكيفيتش في بوزنان ، بوزنان ، بولندا

كلية الأحياء ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة آدم ميكيفيتش في بوزنان ، بوزنان ، بولندا

Michał Knopkiewicz ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة آدم ميكيفيتش في بوزنان ، أومولتوسكا 89 ، 61-614 بوزنان ، بولندا.

كلية الأحياء ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة آدم ميكيفيتش في بوزنان ، بوزنان ، بولندا

الملخص

يجب تطبيع بيانات PCR في الوقت الحقيقي من كل تجربة تحليل التعبير الجيني مع الجينات المرجعية المناسبة ، والتي يتم التعبير عنها بشكل موحد في مجموعة عينات يتم تحليلها. يجب اختبار الجينات المرجعية بشكل مستقل لكل مجموعة تجريبية. قدرنا التعبير الجيني لخمسة جينات مرجعية محتملة (فوسفوبروتين فوسفاتيز 2 أ, هيستون H3, بيتا توبولين, عامل النسخ IIA و الأكتين) في 33 حبة البازلاء (بيسوم ساتيفوم L.) عينات. تتكون المواد النباتية من أجزاء جذعية من أربعة إضافات من البازلاء (ثلاثة أصناف ذات قابلية مختلفة للإصابة وتيبس الساق ومدخل واحد من النوع البري). تم اختبار مراحل التطور الفينولوجية المختلفة للنباتات والظروف البيئية تحت ثلاث مجموعات فرعية من العينات. فوسفوبروتين فوسفاتيز 2 أ و بيتا توبولين كانت الجينات الأكثر استقرارًا في المجموعة الفرعية للنباتات لمدة 30 يومًا ، والتي نمت في الدفيئة. تمت زراعة النباتات في بداية مرحلة الإزهار في الدفيئة وفي الحقل. فوسفوبروتين فوسفاتيز 2 أ و عامل النسخ IIA أظهر التعبير الأكثر استقرارًا في ظل الظروف الميدانية ، بينما هيستون H3 و بيتا توبولين كانت الأكثر استقرارًا في ظل ظروف الاحتباس الحراري. فوسفوبروتين فوسفاتيز 2 أ و بيتا توبولين كانت أيضًا الجينات الأكثر استقرارًا بين جميع العينات المختبرة. لقد حددنا الجينات المعبر عنها بثبات ، والتي يمكن استخدامها كمرجع لتطبيع بيانات PCR في الوقت الفعلي في مجموعتنا الفرعية للعينة. يعد بحثنا نقطة انطلاق جيدة لدراسات أخرى حول التعبير الجيني في أنسجة جذع البازلاء. هذه هي الخطوة الأولى لإجراء دراسات التعبير الجيني المرتبطة بمقاومة البازلاء.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


تحديد الهوية (علم الأحياء)

هوية في علم الأحياء هي عملية تعيين اسم أصنف موجود مسبقًا لكائن حي. قد يعتمد تحديد الكائنات الحية على الأسماء (أو الرموز) العلمية الفردية على سمات الجسم الطبيعية الفردية ، [1] علامات فردية تم إنشاؤها تجريبيًا (على سبيل المثال ، أنماط النقاط اللونية) ، أو الواسمات الجزيئية الفردية الطبيعية (المشابهة لتلك المستخدمة في تحديد الأمومة أو الأبوة الاختبارات). يتم استخدام التعريف الفردي في علم البيئة وإدارة الحياة البرية وبيولوجيا الحفظ. الشكل الأكثر شيوعًا لتحديد الهوية هو تحديد الكائنات الحية لأسماء شائعة (على سبيل المثال ، "أسد") أو اسم علمي (على سبيل المثال ، ".ليو بانثيراويستند هذا بالضرورة إلى السمات الموروثة ("السمات") للكائنات الجنسية ، ويشكل الميراث أساس تعريف فئة ما ، وقد تكون السمات ، على سبيل المثال ، شكلية ، أو تشريحية ، أو فسيولوجية ، أو سلوكية ، أو جزيئية.

يمكن استخدام مصطلح "القرار" أحيانًا كمرادف للتعريف (على سبيل المثال) ، [2] أو كما في "قسائم التحديد". [3]

قد تكون طرق تحديد الهوية يدوية أو محوسبة وقد تتضمن استخدام مفاتيح تحديد الهوية ، أو تصفح دليل الحقول الذي يحتوي (غالبًا ما يكون مصورًا) على حسابات الأنواع ، أو مقارنة الكائن الحي مع عينات من مجموعات التاريخ الطبيعي ، أو التقاط الصور لتحليلها ومقارنتها مع أحد المدربين مسبقًا قاعدة المعرفة مع معلومات الأنواع. [4]


التحقق من صحة الجينات المرجعية لتحليل التعبير الجيني باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في خطوط البازلاء (بيسوم ساتيفوم) مع قابلية مختلفة للسكن

Michał Knopkiewicz ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة آدم ميكيفيتش في بوزنان ، أومولتوسكا 89 ، 61-614 بوزنان ، بولندا.

كلية الأحياء ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة آدم ميكيفيتش في بوزنان ، بوزنان ، بولندا

كلية الأحياء ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة آدم ميكيفيتش في بوزنان ، بوزنان ، بولندا

Michał Knopkiewicz ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة آدم ميكيفيتش في بوزنان ، أومولتوسكا 89 ، 61-614 بوزنان ، بولندا.

كلية الأحياء ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة آدم ميكيفيتش في بوزنان ، بوزنان ، بولندا

تسجيل الدخول المؤسسي
قم بتسجيل الدخول إلى مكتبة Wiley Online

إذا سبق لك الحصول على حق الوصول باستخدام حسابك الشخصي ، فيرجى تسجيل الدخول.

شراء الوصول الفوري
  • شاهد المقال بصيغة PDF وأي ملاحق وأرقام مرتبطة به لمدة 48 ساعة.
  • المادة يمكن ليس أن تتم طباعتها.
  • المادة يمكن ليس يمكن تنزيلها.
  • المادة يمكن ليس يتم إعادة توزيعها.
  • عرض غير محدود لمقال PDF وأي ملاحق وأرقام مرتبطة به.
  • المادة يمكن ليس أن تتم طباعتها.
  • المادة يمكن ليس يمكن تنزيلها.
  • المادة يمكن ليس يتم إعادة توزيعها.
  • عرض غير محدود للمقال / الفصل PDF وأي ملاحق وأرقام مرتبطة.
  • يمكن طباعة المقال / الفصل.
  • يمكن تحميل المادة / الفصل.
  • المادة / الفصل يمكن ليس يتم إعادة توزيعها.

الملخص

يجب تطبيع بيانات PCR في الوقت الحقيقي من كل تجربة تحليل التعبير الجيني مع الجينات المرجعية المناسبة ، والتي يتم التعبير عنها بشكل موحد في مجموعة عينات يتم تحليلها. يجب اختبار الجينات المرجعية بشكل مستقل لكل مجموعة تجريبية. قدرنا التعبير الجيني لخمسة جينات مرجعية محتملة (فوسفوبروتين فوسفاتيز 2 أ, هيستون H3, بيتا توبولين, عامل النسخ IIA و الأكتين) في 33 حبة البازلاء (بيسوم ساتيفوم L.) عينات. تتكون المواد النباتية من أجزاء جذعية من أربعة إضافات من البازلاء (ثلاثة أصناف ذات قابلية مختلفة للإصابة وتيبس الساق ومدخل واحد من النوع البري). تم اختبار مراحل التطور الفينولوجية المختلفة للنباتات والظروف البيئية تحت ثلاث مجموعات فرعية من العينات. فوسفوبروتين فوسفاتيز 2 أ و بيتا توبولين كانت الجينات الأكثر استقرارًا في المجموعة الفرعية للنباتات لمدة 30 يومًا ، والتي نمت في الدفيئة. تمت زراعة النباتات في بداية مرحلة الإزهار في الدفيئة وفي الحقل. فوسفوبروتين فوسفاتيز 2 أ و عامل النسخ IIA أظهر التعبير الأكثر استقرارًا في ظل الظروف الميدانية ، بينما هيستون H3 و بيتا توبولين كانت الأكثر استقرارًا في ظل ظروف الاحتباس الحراري. فوسفوبروتين فوسفاتيز 2 أ و بيتا توبولين كانت أيضًا الجينات الأكثر استقرارًا بين جميع العينات المختبرة. لقد حددنا الجينات المعبر عنها بثبات ، والتي يمكن استخدامها كمرجع لتطبيع بيانات PCR في الوقت الفعلي في مجموعتنا الفرعية للعينة. يعد بحثنا نقطة انطلاق جيدة لدراسات أخرى حول التعبير الجيني في أنسجة جذع البازلاء. هذه هي الخطوة الأولى لإجراء دراسات التعبير الجيني المرتبطة بمقاومة البازلاء.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


تحديد الجينات المرجعية لدراسات التعبير الجيني أثناء إنبات البذور وإنشاء الشتلات Ricinus communis L.

  • APA
  • مؤلف
  • BIBTEX
  • هارفارد
  • اساسي
  • RIS
  • فانكوفر

في: بحوث علوم البذور ، المجلد. 24 ، رقم 4 ، 2014 ، ص. 341-352.

مخرجات البحث: المساهمة في المجلة ›المقالة› الأكاديمية ›مراجعة الأقران

T1 - تحديد الجينات المرجعية لدراسات التعبير الجيني أثناء إنبات البذور وإنشاء الشتلات Ricinus communis L.

N2 - تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) هو تقنية مهمة لتحليل مستويات التعبير الجيني أثناء تطوير النبات أو استجابة للعلاجات المختلفة. من المتطلبات المهمة لقياس مستويات التعبير الجيني بدقة مجموعة الجينات المرجعية التي تم التحقق من صحتها بشكل صحيح. في هذا السياق ، قمنا بتحليل الاستخدام المحتمل لـ 17 جينًا مرجعيًا مرشحًا عبر مجموعة متنوعة من العينات ، بما في ذلك العديد من الأنسجة والمراحل المختلفة والظروف البيئية ، بما في ذلك إنبات البذور ونمو الشتلات في Ricinus communis L. تم اختبار هذه الجينات بواسطة RT-qPCR وتم تصنيفها وفقًا لاستقرار تعبيرها باستخدام طريقتين مختلفتين: GeNorm و NormFinder. أشار GeNorm و Normfinder إلى أن ACT و POB و PP2AA1 تشتمل على التركيبة المثلى لتطبيع بيانات التعبير الجيني في الدراسات بين الأنسجة (لوحة عينة غير متجانسة). وصفنا أيضًا التركيبة المثلى للجينات المرجعية لمجموعة فرعية من عينات الجذر والسويداء والنبتة. بشكل عام ، تتوافق الجينات الأكثر استقرارًا التي اقترحها GeNorm مع تلك التي أشار إليها NormFinder ، والتي تسلط الضوء على قوة اختيار الجينات المرجعية في دراستنا. قمنا أيضًا بالتحقق من صحة الجينات المرجعية المحددة من خلال تطبيع مستويات التعبير لثلاثة جينات مستهدفة تشارك في استقلاب الطاقة مع الجينات المرجعية التي اقترحها GeNorm و NormFinder. تم تطبيق النهج المستخدم في هذه الدراسة لتحديد الجينات المعبر عنها بثبات ، وبالتالي الجينات المرجعية المحتملة ، بنجاح على R. communis ، كما أنه يوفر إرشادات مهمة لدراسات RT-qPCR في البذور والشتلات للأنواع الأخرى (خاصة في تلك الحالات التي يكون فيها ميكروأري واسع النطاق. البيانات غير متوفرة)

AB - تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) هو تقنية مهمة لتحليل مستويات التعبير الجيني أثناء تطوير النبات أو استجابة للعلاجات المختلفة. من المتطلبات المهمة لقياس مستويات التعبير الجيني بدقة مجموعة الجينات المرجعية التي تم التحقق من صحتها بشكل صحيح. في هذا السياق ، قمنا بتحليل الاستخدام المحتمل لـ 17 جينًا مرجعيًا مرشحًا عبر مجموعة متنوعة من العينات ، بما في ذلك العديد من الأنسجة والمراحل المختلفة والظروف البيئية ، بما في ذلك إنبات البذور ونمو الشتلات في Ricinus communis L. تم اختبار هذه الجينات بواسطة RT-qPCR وتم تصنيفها وفقًا لاستقرار تعبيرها باستخدام طريقتين مختلفتين: GeNorm و NormFinder. أشار GeNorm و Normfinder إلى أن ACT و POB و PP2AA1 تشتمل على التركيبة المثلى لتطبيع بيانات التعبير الجيني في الدراسات بين الأنسجة (لوحة عينة غير متجانسة). وصفنا أيضًا التركيبة المثلى للجينات المرجعية لمجموعة فرعية من عينات الجذر والسويداء والنبتة. بشكل عام ، تتوافق الجينات الأكثر استقرارًا التي اقترحها GeNorm مع تلك التي أشار إليها NormFinder ، والتي تسلط الضوء على قوة اختيار الجينات المرجعية في دراستنا. قمنا أيضًا بالتحقق من صحة الجينات المرجعية المحددة من خلال تطبيع مستويات التعبير لثلاثة جينات مستهدفة تشارك في استقلاب الطاقة مع الجينات المرجعية التي اقترحها GeNorm و NormFinder. النهج المستخدم في هذه الدراسة لتحديد الجينات المعبر عنها بثبات ، وبالتالي الجينات المرجعية المحتملة ، تم تطبيقه بنجاح على R. communis ويوفر إرشادات مهمة لدراسات RT-qPCR في البذور والشتلات للأنواع الأخرى (خاصة في تلك الحالات التي يكون فيها ميكروأري واسع النطاق. البيانات غير متوفرة)


ما هو معرف الجين الأكثر استقرارًا؟ - مادة الاحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يمكن إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة ويعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


ما هو معرف الجين الأكثر استقرارًا؟ - مادة الاحياء


وصف تنظيم الجين محل الاهتمام من خلال تخيله

  • التعبير عبر الأنسجة وأنواع الخلايا
  • التعبير عبر مراحل النمو
  • الاستجابة للضغوط الحيوية وغير الحيوية
  • التعبير المقارن في الأنماط الجينية المختلفة


ابحث عن الجينات المعبر عنها على وجه التحديد في

  • الأنسجة أو أنواع الخلايا ذات الأهمية
  • مراحل التنمية
  • الاستجابة للتوترات الحيوية واللاأحيائية
  • مقارنات بين الأنماط الجينية


تحليل تجربة مثيرة للاهتمام

  • التعبير عن جين مهم عبر عينات من تجربة مختارة
  • الجينات المعبر عنها تفاضليًا في ظروف من قاعدة بياناتنا المنسقة
  • الجينات المعبر عنها تفاضليًا في ظروف من تجربتك الخاصة
  • مراقبة الجودة: انظر كيف تجمع العينات حسب ملامح تعبيرها
  • تحقق من العوامل التي تسبب الاختلاف الرئيسي بين العينات


قارن نتائجك مع البيانات العامة المنظمة


قارن النتائج عبر الأنواع


ابحث عن المسارات المرتبطة بقائمة الجينات

  • تحليل التمثيل الزائد ضد مسارات Reactome وشروط GO
  • مخطط Venn لما يصل إلى أربع قوائم / مسارات


ابحث عن الجينات التي لها معظم التعبيرات المتشابهة

  • الأنسجة وأنواع الخلايا
  • مراحل التنمية
  • ظروف تجريبية
  • عينات


قارن التعبير عن اثنين من الجينات المهمة عبر

  • الأنسجة وأنواع الخلايا
  • مراحل التنمية
  • ظروف تجريبية
  • عينات


ابحث عن الجينات المرجعية لـ RT-qPCR وقارن بينها

  • الأكثر استقرارًا في الأنسجة المختارة
  • مقارنة مع الجينات المرجعية غير المحددة المستخدمة بشكل متكرر


ابحث عن أخصائي تقويم جيني وظيفي من الأنواع الأخرى

  • بناءً على معلومات البروتين والتطور (بناءً على OMA)
  • بناءً على تعبير الأنسجة المماثل (استنادًا إلى GENEVESTIGATOR®)

بيانات المصنع المنسقة

في NEBION ، نقوم باستمرار بجمع البيانات من الأنواع النباتية ورعايتها ودمجها. في عام 2020 ، أضفنا عباد الشمس والبطيخ بينما قمنا أيضًا بزيادة المحتوى لأنواع المحاصيل الأخرى والأرابيدوبسيس. يوضح الشكل أدناه عدد العينات (مجموعات بيانات ميكروأري و RNA-Seq) لكل نوع. لمعرفة المزيد حول أدوات التنظيم والتحليل الخاصة بنا ، راجع النشرة الإعلانية الخاصة بنا أو شاهد بعض لقطات الشاشة.

تحليلات المثال ولقطات أمبير

تحليل التعبير التفاضلي لتأثير عزلة M. oryzae في تجربة الأرز (GSE95394). مؤامرة بركان تُظهر جينات أعلى ومنخفضة التنظيم بشكل كبير ، مع قائمة مختصرة من الجينات المهمة للغاية والتي تم تمييزها واختيارها للمقارنة مع الظروف التجريبية الأخرى (انظر الشكل أدناه).

مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل التعبير التفاضلي أعلاه مع خلاصة وافية لبيانات الأرز الأخرى. يتسبب عدد من الاضطرابات الحيوية والوراثية في استجابة مماثلة. بالامتداد ، يمكن ترجمة التوقيع إلى أنواع أخرى باستخدام ميزة أو أداة تقويم العظام لدينا ، والتوقيع المطابق للظروف التجريبية الموجودة في هذه الخلاصة الأخرى. يتيح ذلك فهمًا أفضل لقائمة الجينات التي تم الحصول عليها في تحليلنا الأصلي.

مخطط فين للجينات المنظمة استجابة للإجهاد البارد والملح والتناضحي من التجربة AT-00814 ، بالإضافة إلى تحليل التخصيب ضد مسارات Reactome.

تحديد الجينات المعبر عنها على وجه التحديد في السويداء القمح ، كما تم حسابه من 55 فئة تشريحية مجمعة من 2332 عينة.

تجميع الجينات الخاصة بالسويداء المحددة في المثال السابق. تظهر مجموعتان رئيسيتان ، إحداهما تتضمن الجينات التي يتم التعبير عنها أيضًا في طبقة aleuron.

مؤامرة جينية تقارن التعبير عن LTP3 و LTP4 عبر 1727 عينة من Arabidopsis RNA-Seq.

تحديد الجينات المرجعية المرشحة ذات التعبير المستقر في أوراق نبات الأرابيدوبسيس البالغة ، كما تم قياسها من 1006 عينة. يتم عرض الجينات المرجعية المعروفة كأمثلة في الجزء العلوي من المؤامرة بالمقارنة ، مما يدل على وجود جينات بديلة تتمتع بثبات تعبير أعلى في الأوراق البالغة.

NEBION هي شركة سويسرية للتهيئة الحيوية وتكامل البيانات. نحن نقدم للباحثين والعلماء بيانات نصية عالية الجودة ومنسقة بعناية وأدوات متقدمة لاكتشافات مثيرة في الأوساط الأكاديمية والصناعية.


جينات PPIA و HPRT1 و YWHAZ مناسبة لتطبيع تعبير mRNA في الخلايا الجذعية البشرية المتوسطة الموسعة طويلة المدى

يعد التوسع طويل الأمد للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) في ظل ظروف زراعة محددة أمرًا ضروريًا في العلاج بالخلايا الجذعية البشرية. ومع ذلك ، فإنه يغير خصائص MSCs. نظرًا لاستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) على نطاق واسع كأحد الطرق التحليلية الرئيسية للتوصيف المقارن ، فإن التحقق من صحة الجينات المرجعية (RGs) للتطبيع تحت كل حالة تجريبية مهم لتحقيق نتائج موثوقة qRT-PCR. لذلك ، تم تقييم RGs الأكثر ثباتًا لـ MSCs المستمدة من نخاع العظم ودم الحبل السري على المدى الطويل (BM-MSCs و UCB-MSCs) في ظل ظروف استزراع محددة لما يصل إلى 20 مقطعًا. لوحظت التغييرات الأكثر وضوحًا في الخصائص مثل قدرة التمايز ، والانتشار ، والشيخوخة ، والتعبير عن RGs في BM-MSCs مقارنة بـ UCB-MSCs أثناء التوسع طويل الأجل. اقترحت برامج التحقق من صحة RG (GeNorm و NormFinder) أن PPIA و HPRT1 و YWHAZ كانت مناسبة للتطبيع في qRT-PCR بغض النظر عن أنواع MSC وتوسع الثقافة على المدى الطويل ، وكانت RGs التقليدية (ACTB و GAPDH) أقل استقرارًا لفترة طويلة - على المدى الموسع MSCs. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر استخدام RGs لتطبيع تعبير OCT4 في BM-MSCs الموسع طويل المدى أن RG (GAPDH) الأقل استقرارًا أظهر بيانات متناقضة مقارنةً بـ RGs الأخرى. لذلك ، يوصى بشدة باستخدام RGs مثل PPIA و HPRT1 و YWHAZ للتطبيع في تجارب qRT-PCR من أجل MSCs الموسعة طويلة الأجل لإنشاء بيانات دقيقة وموثوقة.

1 المقدمة

نظرًا لأن دراسات التعبير الجيني قد مكنتنا من فهم شبكة تنظيم الجينات للآليات الخلوية ، فإن التحليل الكمي للتعبير الجيني ضروري في علم الأحياء الخلوي [1]. من بين التقنيات الشائعة الاستخدام ، كان تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) هو الأسلوب الأكثر استخدامًا لمراقبة التعبير الجيني بسبب حساسيته وخصوصياته وقابلية استنساخه ونطاق ديناميكي كبير ودرجة عالية من الأتمتة [2-4 ]. في qRT-PCR ، يعد تطبيع الجينات ذات الأهمية (GOI) مقابل الجين المرجعي (RG) أمرًا ضروريًا للتحقيق في القياس الكمي النسبي للتعبير الجيني ، حيث يُعتقد أن RGs يتم التعبير عنها بشكل ثابت ومستمر في الخلايا بغض النظر عن الظروف التجريبية [ 4-6]. لسوء الحظ ، لا توجد تقارير حول استخدام RG عام واحد له تعبير ثابت. لقد تم الكشف عن أن التعبير عن RGs شائعة الاستخدام يختلف باختلاف نوع الخلية ومصدر الخلية والظروف التجريبية. علاوة على ذلك ، يتأثر تعبير RG أيضًا بجودة الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه ، وظروف تخليق (كدنا) ، ونوع كيمياء الكشف ، والملوثات المثبطة [6-10]. نظرًا لأن اختيار مجموعات التناوب غير الملائمة وغير المستقرة لتطبيع حكومة العراق قد يؤدي إلى توليد بيانات خاطئة أو نتائج متناقضة ، فإن التحقق من صحة مجموعات التناوب الأكثر ثباتًا من مجموعة مجموعات التناوب المستخدمة على نطاق واسع تحت كل إعداد تجريبي هو شرط أساسي للحصول على نتائج دقيقة وموثوقة عن طريق qRT-PCR [5 ، 11].

يتم تسليط الضوء على الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كمرشحين واعدين للعلاج بالخلايا الجذعية وكان لها تأثير كبير في مجال الطب التجديدي بسبب خاصية التجديد الذاتي ، وإمكانية الوصول الواسعة ، وإمكانية التمايز متعدد السلالات ، وخصائص تعديل المناعة [12]. في هذا السياق ، تمت دراسة MSCs المشتقة من نخاع العظم (BM-MSCs) على نطاق واسع في العقود الماضية. ومع ذلك ، فإن عزل BM-MSCs يتطلب إجراءات غازية وترتبط هذه الخلايا ببعض القيود مثل الانخفاض المعتمد على العمر في تكاثرها وقدرتها على التمايز [13]. لذلك ، فإن الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من دم الحبل السري (UCB-MSCs) تعمل كبدائل محتملة لـ BM-MSCs لأن عينات UCB التي تحتوي على العديد من مجموعات MSC الأولية يتم حفظها بالتبريد في جميع أنحاء العالم [14 ، 15].

من أجل التطبيق السريري للخلايا الجذعية الوسيطة ، يجب التغلب على العديد من العقبات التي تحدث أثناء زراعة الخلايا. يجب توسيع MSCs الأولية المعزولة على نطاق واسع في المختبر لتحقيق كمية كافية للأغراض العلاجية نظرًا لحدوثها عند انخفاض عدد السكان في العديد من الأنسجة البشرية. ومع ذلك ، فإن في المختبر- MSCs الموسعة ليست خالدة وبالتالي تخضع للتغييرات الخلوية مثل فقدان القدرة على التكاثر وإمكانات التمايز والشيخوخة التكرارية والتغيير في التعبير عن الجينات بما في ذلك RGs [16 ، 17]. بالإضافة إلى ذلك ، تم بذل العديد من الجهود لاستبدال المكملات المشتقة من الحيوانات مثل مصل الأبقار الجنيني (FBS) بشروط استزراع محددة مثل الوسائط الخالية من المصل والزينو لمنع الآثار الضارة المحتملة مثل ردود الفعل المناعية الشديدة والالتهابات الفيروسية والبكتيرية ، والأمراض حيوانية المصدر [18 ، 19]. حيث في المختبر البيئات (في المختبر قد يؤثر أيضًا التوسع طويل الأجل والوسائط الخالية من المصل والزينو) على الخصائص الخلوية ، يجب دراسة التغييرات الخلوية في MSCs الموسعة طويلة الأجل في ظل ظروف ثقافة محددة من أجل السلامة والموثوقية والفعالية قبل التطبيقات السريرية. في الآونة الأخيرة ، تم التأكيد بشدة على أن اختيار مجموعات التناوب المناسبة تحت كل حالة تجريبية لبحوث MSC يعد خطوة أساسية للحصول على نتائج موثوقة قبل إجراء qRT-PCR [4-6 ، 20]. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لم يتم دراسة اختيار مجموعات التناوب المناسبة للخلايا الجذعية متعددة المراحل الموسعة طويلة الأجل في ظل ظروف ثقافة محددة جيدًا. لذلك ، تهدف الدراسة الحالية إلى التحقيق في RGs الأكثر استقرارًا لتوفير تقييم دقيق لتغيير أضعاف mRNA النسبي لـ GOI في MSCs البشرية الموسعة طويلة الأجل (BM-MSCs و UCB-MSCs) في ظل ظروف ثقافة محددة. تمت دراسة عشرة RGs شائعة الاستخدام (18S و B2M و EEF1A1 و GAPDH و HPRT1 و PPIA و RPLP0 و TBP و ACTB و YWHAZ) ومقارنتها لتحديد RGs المناسبة لـ BM-MSCs و UCB-MSCs الموسع على المدى الطويل في ظل ثقافة محددة الشروط من خلال برامج التحقق من صحة RG المستخدمة على نطاق واسع: GeNorm و NormFinder.

2. المواد والأساليب

2.1. الكيماويات والأخلاق

تم شراء جميع المواد الكيميائية والوسائط من Thermo Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ما لم يُنص على خلاف ذلك. تم منح جميع المتطوعين للتبرع بالعينة موافقة خطية مستنيرة ، ووافقت لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة جيونج سانج الوطنية (GNUH-2012-09-004) على الدراسة الحالية.

2.2. توصيف BM-MSCs الموسع طويل الأجل و UCB-MSCs

تم الحصول على نضح BM أو UCB أثناء الجراحة أو الولادة لعزل BM-MSCs (ن = 5 ، ذكر) أو UCB-MSCs (ن = 5 ، ذكر) ، على التوالي. تم بعد ذلك استنبات MSCs في وسط استزراع محدد (وسط StemPro MSC SFM Xenofree مكمل بـ L-alanyl-L-glutamine ، 100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكرومترg / ml Streptomycin) ويتم فصله مع TrypLE أثناء الزراعة الفرعية للتوسع على المدى الطويل. باختصار ، تم تخفيف شفاطات BM و UCBs بمحلول ملحي مخزّن من فوسفات Dulbecco (DPBS 1: 1 (v / v)) وطبقت على Ficoll (كثافة 1.077 جم / سم 3 ، GE Healthcare ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد الطرد المركزي (400 × جم ، 30 دقيقة) عند 4 درجات مئوية ، تم حصاد جزء الخلية أحادية النواة (MNC) ، وطليها على صفيحة من 6 آبار عند 1 × 10 5 خلايا / سم 2 في وسط استزراع محدد ، وتم تربيتها عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5٪

كما ذكرت سابقا [13]. بمجرد وصول مجموعات MSC الأولية الملتصقة إلى 80 ٪ التقاء ، تم حصادها باستخدام TrypLE وتمريرها حتى 20 مقطعًا باستخدام وسائط استزراع محددة. تم تصنيف BM-MSCs الموسع على أنه ممر مبكر (E-BM-MSCs) أو منتصف مرور (M-BM-MSCs) أو مرور متأخر BM-MSCs (L-BM-MSCs) عند المرور 2-4 ، 10-12 ، أو 18-20 ، على التوالي. وبالمثل ، تم تصنيف UCB-MSCs أيضًا على أنه ممر مبكر (E-UCB-MSCs) ، ممر منتصف (M-UCB-MSCs) ، ومرور متأخر UCB-MSCs (L-UCB-MSCs) في المقطع 2-4 ، 10-12 ، أو 18-20 ، على التوالي. تم تحليل MSCs في جميع المجموعات من أجل تعبيرها عن علامات السطح الخاصة بـ MSC (CD44 و CD105 و vimentin) وغياب التعبير عن علامات الخلايا الجذعية المكونة للدم (CD34 و CD45). باختصار ، تم حصاد MSCs عند نقطة التقاء 80٪ ، وتثبيتها في بارافورمالدهيد 4٪ طوال الليل. تم بعد ذلك غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني واحتضانها بفلورسين أيزوثيوسيانات (FITC) - مترافق مع الفئران المضادة للإنسان CD34 (1: 200 BD Biosciences ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، CD44 ضد الإنسان للفأر (1: 200 BD Biosciences) ، مضاد للفأر -Human CD45 (1: 200 BD Biosciences) ، CD105 مضاد للإنسان بالماوس (1: 200 BD Biosciences) ، و Alexa Fluor® 488 فأر مضاد للإنسان فيمنتين (1: 200 BD Biosciences). تم الحصول على إجمالي 1 × 10 4 MSCs المسمى FITC وتحليلها باستخدام BD FACS Calibur (BD Biosciences). تم تقييم قدرة التمايز لجميع MSCs تجاه الأنساب اللحمية المتوسطة باتباع البروتوكولات السابقة [12 ، 21]. باختصار ، تم إحداث التمايز العظمي لمدة 3 أسابيع باستخدام Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع 10٪ FBS ، 200 ملي مولار حمض الأسكوربيك ، 10 ملي مولار β- الجلسروفوسفات ، و 0.1 ملي ديكساميثازون ، وتكوين العظم تم تأكيده من خلال ملاحظة رواسب الكالسيوم بعد تلطيخها بمحلول نترات الشظية بنسبة 5٪ (تلوين فون كوسا). تم تحفيز تكوين الغضروف باستخدام مجموعة التمايز الغضروفي STEMPRO. باختصار ، تم تعليق 1 × 10 6 MSCs في أنبوب 15 مل وتم طرده عند 450 × جم لمدة 5 دقائق. تمت زراعة الكريات لمدة 3 أسابيع في وسط ستيمبرو لتكوين الغضروف. ثم تم استخدام الكريات لتحضير المقاطع المضمنة بالبارافين على شرائح زجاجية. كانت المقاطع ملطخة بمحلول 1 ٪ أزرق ألكيان للكشف عن البروتيوغليكان وتمت مواجهتها بمحلول أحمر سريع نووي بنسبة 0.1 ٪. تمت تربية MSCs لمدة 3 أسابيع في DMEM مع 10٪ FBS ، و 100 ملي إندوميثاسين ، و 10 ملي مولار من الأنسولين ، و 1 ملي ديكساميثازون لتكوين الشحم. تم تأكيد التمايز في سلالة الخلايا الشحمية من خلال تقييم تراكم الفجوات الدهنية داخل الخلايا بعد التلوين بمحلول 0.5 ٪ زيت أحمر O.

2.3 إمكانية التكاثر و β-نشاط الجالاكتوزيداز في BM-MSCs الموسع على المدى الطويل و UCB-MSCs

تم استخدام اختبار تكاثر الخلايا Vybrant® MTT [3- (4،5-dimethylthiazol-2-yl) -2،5-diphenyltetrazolium bromide] للتقييم المقارن لإمكانية التكاثر للخلايا الجذعية الوسيطة. باختصار ، تمت زراعة 1 × 10 3 MSCs في 96 لوحة جيدة وتم تحضين 20 خلية كل يوم ميكرومترل محلول MTT (5 مجم / مل) لمدة 4 ساعات. بعد الحضانة ، تمت إزالة المادة الطافية و 50 ميكرومترتمت إضافة ل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تم بعد ذلك نقل المنتج المتشكل إلى 96 لوح بئر وقياس الامتصاصية عند 540 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (VersaMax ™ ، Molecular Devices ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). الشيخوخة المرتبطة β- نشاط الجالاكتوزيداز (SA-β-gal) باستخدام β-طقم فحص الجالاكتوزيداز باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. باختصار ، تم حصاد الخلايا عند التقاء 70-80 ٪ عن طريق المعالجة بـ TrypLE وغسلها مرتين باستخدام DPBS ، وتم علاج إجمالي 5 × 10 5 خلية بـ 200 ميكرومترل كاشف M-PER ثم تحريكه برفق لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي عند 27000 × جم لمدة 15 دقيقة لإزالة حطام تحلل الخلية ، 50 ميكرومترتم نقل لتر من المادة الطافية إلى صفيحة ميكروية 96 بئر. تم تحضين مستخلص الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع 50 ميكرومترلتر من β-كاشف الجالاكتوزيداز والامتصاصية تم قياسها عند 405 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (VersaMax ™ ، Molecular Devices ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.4 جينات مرجعية مرشح وتسلسلات أولية

تم اختيار عشرة مجموعات تناوب بناءً على نشاط وظيفي مختلف داخل الخلايا ووفقًا للتقارير السابقة [4-6]. تم تصميم البادئات لكل RG بواسطة برنامج Primer 3 Plus (مع الأخذ في الاعتبار درجة حرارة التلدين 60 درجة مئوية) وتم تحليلها لتشكيل دبابيس الشعر ، وأجهزة القياس المتجانسة ، وأجهزة القياس غير المتجانسة باستخدام برنامج OligoAnalyzer 3.1. من أجل التحقق من كفاءات PCR ، تم عمل منحنى قياسي لكل جهاز تمهيدي من قيم عتبة الدورة (Ct) عن طريق التخفيف التسلسلي بأربعة أضعاف لـ cDNA (1:10 ، 1: 100 ، 1: 1000 و 1: 10000) من E-BM-MSCs باتباع البروتوكولات السابقة [6 ، 22]. معلمات المنحنى القياسية مثل الميل (M) والتقاطع (B) وكفاءة PCR (E =

) باستخدام برنامج RotorGene Q Series (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) أو Excel (Microsoft ، WA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم وصف الاسم الكامل ، ورمز الجين ، وتسلسل النوكليوتيدات ، وأحجام الأمبليكون ، ورقم المدخل ، وكفاءات PCR لبادئات RG في الجدول 1.

2.5 استخراج الحمض النووي الريبي ، وتوليف (كدنا) ، و qRT-PCR

تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من MSCs باستخدام RNeasy Mini Kit (Qiagen) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة مع خطوة إزالة الحمض النووي الجينومي المتبقي بواسطة علاج DNase الخالي من RNase (Qiagen). تم قياس تركيز ونقاء عينة الحمض النووي الريبي من خلال تقييم نسبة A260 / A280 باستخدام مقياس الطيف الضوئي (NanoDrop 1000 ، Thermo Fisher Scientific). تم تصنيع أول حبلا (كدنا) من 1 ميكرومترجم من إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة النسخ العكسي Omniscript (Qiagen) عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. لتضخيم PCR ، خليط التفاعل الذي يحتوي على مزيج Rotor-Gene 2X SYBR Green (Qiagen) ، 2 ميكرومترتم تشغيل l (كدنا) و 400 نانومتر من كل بادئات أمامية وعكسية في آلة Rotor Gene Q qRT-PCR (Qiagen) بعد برنامج التمسخ المسبق عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 45 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ ، 60 درجة مئوية لمدة 6 ثوان ، و 72 درجة مئوية لمدة 4 ثوان ، ومنحنى ذوبان من 60 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية بمقدار 1 درجة مئوية / ثانية والتبريد عند 40 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. Rotor-Gene Q Series Software (Qiagen) was used for the analysis of amplification curves, melting curves, and cycle threshold values (Ct values). All amplicons from qRT-PCR were checked by gel electrophoresis to verify their expected product size and confirmed the absence of nonspecific amplification.

2.6. Analysis of Stable Reference Gene Expression

The experimental groups for analyzing stable RGs throughout long-term culture expansion of MSCs under defined culture conditions were allocated into BM-MSCs (Group 1), UCB-MSCs, (Group 2), and both BM-MSCs and UCB-MSCs (Group 3). The Ct values of each RG were assessed via commonly used RG validation programs: geNorm and NormFinder. The geNorm program measures the gene expression stability (M value), where a gene calculated as the highest M value is excluded from the pool of tested genes as the least stable RG then the new M values are continuously generated until the last two genes with the lowest M values are left as the most stable RGs. In addition, the GeNorm suggests the normalization factors (NF) for an optimal number of RGs (

) with pairwise variation (Vn/n+1) estimated by continuous calculation depending on adding other genes sequentially from 2 genes with the lowest M value [23]. In the present study, correlations between and NF for three most stable reference genes (NF3) were analyzed by Pearson’s correlation using PASW Statistics 18 (SPSS inc., NY, USA) to reduce excessive number of RGs during normalization. Using NormFinder the stability and standard errors of the transcriptional variation of the RGs were calculated via analysis of variance (ANOVA)-based model to evaluate both the single most stable RG showing the lowest value and the best combination of two RGs [24].

2.7. The Use of Different RGs in the Normalization of GOI

The effect of stability of RGs in the normalization of GOI was evaluated by using different RGs including the most stable RGs in the present study, and the traditional RGs, which are verified as less stable to calculate the relative gene expression of OCT4 in E-BM-MSCs, M-BM-MSCs, and L-BM-MSCs (Table 1). The qRT-PCR for evaluating OCT4 expression was carried out as described above. The Ct values of OCT4 were then normalized to five RGs (ACTB, GAPDH, HPRT1, PPIA, and YWHAZ) using RotorGene Q Series Software (Qiagen).

2.8. تحليل احصائي

The one-way ANOVA with Tukey’s post hoc test was performed to determine the significant difference among the groups using PASW Statistics 18 (SPSS Inc.). Differences were considered significant when ص < 0.05 and all data were represented as mean ± SD.

3. النتائج

3.1. Comparative Characterization of Long-Term Expanded BM-MSCs and UCB-MSCs

The BM-MSCs showed a gradual change in their fibroblastic morphology upon culture expansion however, UCB-MSCs maintained their fibroblastic morphology until L-UCB-MSCs under defined culture conditions (Figure 1(a)). Both E-BM-MSCs and E-UCB-MSCs were strongly positive for MSC-specific surface markers expression such as CD44, CD105, and vimentin while negative for hematopoietic stem cell markers (CD34 and CD45), and the expression patterns were maintained throughout the long-term culture expansion period. The expression of CD105 in L-BM-MSCs was reduced although not significant (ص > 0.05) (Figure 1(b) & Supplementary Figures 1 and 2). Further, UCB-MSCs showed differentiation capacity towards mesenchymal lineages such as osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes from E-UCB-MSCs to L-UCB-MSCs, whereas, BM-MSCs lost their differentiation potential during long-term expansion as observed in M-BM-MSCs and L-BM-MSCs (Figure 1(c)). Similar to differentiation capacity, proliferative ability and SA-β-gal in UCB-MSCs were not affected by long-term expansion when compared to that in long-term expanded BM-MSCs (M-BM-MSCs and L-BM-MSCs), which displayed weaker proliferative ability and increased SA-β-gal activity than E-BM-MSCs (Figures 1(d) and 1(e)). Overall, both BM-MSCs and UCB-MSCs maintained their stemness during early passage, and that the long-term expansion of BM-MSCs to later passages under defined culture conditions resulted in alteration of their characteristics and loss of stemness.

ص < 0.05 vs E-BM-MSCs. (e) Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) activity in long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs. Absorbance was measured at 405 nm. The data were presented as mean ± SD, ص < 0.05 vs E-BM-MSCs. E-/M-/L-BM-MSCs, bone marrow-derived mesenchymal stem cells at early passage (passage 2-4)/middle passage (passage 10-12)/late passage (passage 18-20) E-/M-/L-UCB-MSCs, umbilical cord blood mesenchymal stem cell at early passage (passage 2-4)/middle passage (passage 10-12)/late passage (passage 18-20).

3.2 Evaluation of Primer Specificity, Amplicon Size, and Ct Values of Selected RGs

The standard curves were generated to check primer efficiency, which resulted in 0.990-0.999 correlation coefficient ( ) and 0.93-1.03 PCR efficiencies (E), indicating that the selected RGs in the present study for qRT-PCR are acceptable and valid for the quantification of transcripts and further experimentation (Table 1). Each RG amplified showed a high peak of a single product without any considerable nonspecific amplification in melting curve analysis. In addition, all amplicons were evaluated for primer specificity with expected product size by gel electrophoresis (Figure 2(a) and Table 1). When 10 RGs were evaluated for possible change in their mRNA levels during long-term expansion of both BM-MSCs and UCB-MSCs by qRT-PCR, a significant difference in Ct values was noted in some RGs. The HPRT1 was the only RG that showed different Ct values between E-UCB-MSCs and L-UCB-MSCs. However, many RGs including 18S, B2M, EEF1A1, GAPDH, RPLP0, and TBP showed significantly (ص < 0.05) different Ct values during long-term expansion of BM-MSCs (Figure 2(b)). These results indicate that the expression level of RGs can be affected by long-term expansion of cells, especially in BM-MSCs.

3.3 Analysis of the Most Stable Reference Gene by geNorm

The Ct values of long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs were analyzed by geNorm to obtain M value and stable ranking of 10 RGs via gradual stepwise exclusion of the least-stable RGs. In the present study, all M values of each gene were found to be less than 1.5 indicating that all genes were reliable to use as RGs. The geNorm software suggested that YWHAZ, HPRT1, and PPIA were the 3 most stable RGs in all groups of MSCs except the traditional RGs such as GAPDH and ACTB which were found to be unstable or less stable (Figure 3(a)). Furthermore, pairwise variations by geNorm proposed that in Group 1, Group 2, or Group 3 was

, and , respectively (Figure 3(b)). Since it is inefficient to use 4-7 RGs in the normalization of GOI, the correlation between and

was assessed to remove the excessive usage of RGs where all groups had high correlation (r > 0.9, Pearson) between and (Figure 3(c)).

3.4. Analysis of the Most Stable Reference Gene by NormFinder

Using NormFinder analysis program, the PPIA or YWHAZ were determined as the most stable reference genes in Group 1 or Group 2 and 3, respectively. Furthermore, when intergroup variations were considered, the best combination of two genes from the pool of 10 RGs was YWHAZ with HPRT, or PPIA with HPRT in Group 1 or Group 2 and 3, respectively (Figure 4). In consistent with the results obtained from geNorm, NormFinder showed that YWHAZ, HPRT1, and PPIA were the most stable RGs during long-term expansion of BM-MSCs and UCB-MSCs while traditional RGs were less stably expressed. A slight difference obtained in the rankings of 10 RGs between geNorm and NormFinder may possibly due to the different algorithms used.

3.5 Use of Most Stable Reference Genes for Normalization of GOI

Based on the results obtained in Figures 1 and 2, it is likely that long-term expansion under defined culture conditions has affected the characteristics of BM-MSCs in terms of their differentiation and proliferative ability, degree of cellular senescence, and RG expression levels. Therefore, to verify the influence of RGs on normalization of gene of interest, the expression of OCT4, a key pluripotency-related gene, was normalized against the three most stable RGs (PPIA, HPRT1, and YWHAZ) determined in the present study and the less stable traditional RGs (ACTB and GAPDH) in E-BM-MSCs, M-BM-MSCs, and L-BM-MSCs. As a result, OCT4 expression in L-BM-MSCs was significantly (ص < 0.05) decreased when compare to that in E-BM-MSCs when PPIA, HPRT1, YWHAZ, and ACTB were used for normalization. However, the traditional RG GAPDH showed no significant difference in OCT4 expression between E-BM-MSCs, M-BM-MSCs, and L-BM-MSCs (Figure 5).

4. مناقشة

As MSCs are currently promising regimens for regenerative medicine and immunomodulatory agents, the use of suitable RGs is indispensable to assess the accurate and reliable gene expression data [10, 11, 21]. In addition, since long-term expansion of MSCs under defined culture conditions and the effect of such في المختبر environments on cells must be studied prior to their application. Hence, the expression stability of 10 commonly used RGs was evaluated in long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs under defined culture conditions through widely used RG validation programs (geNorm and NormFinder). Both programs suggested that PPIA, HPRT1, and YWHAZ are the three most stable RGs regardless of في المختبر culture expansion period.

The long-term expanded MSCs display limited proliferation ability similar to somatic cells may be due to the replicative senescence [25–27]. The senescent MSCs display not only altered proliferation ability but also morphological changes, loss of differentiation capacity, increased expression of SA-β-gal, elevated oxidative stress, epigenetic modifications, telomere shortening, DNA damage, and change in genes expression profile [27–32]. In the present study, BM-MSCs showed enlarged and irregular morphologies, gradual loss in trilineage differentiation capacity and proliferative ability, and increased senescence-associated SA-β-gal marker expression, while UCB-MSCs maintained their phenotypes through early passages to late passages (Figure 1). Although, the decreased expression of CD105 during long-term expansion of BM-MSCs was not significant, this slight decrease in the expression may be due to the unknown consequences under serum free culture conditions [33]. In addition, the expression of several RGs in BM-MSCs was affected by long-term expansion. However, the HPRT1 was the only gene affected in the long-term expanded UCB-MSCs under present experimental conditions. Since HPRT1 known to play a central role in purine salvage pathway, cell cycle, and proliferation mechanisms, its change in expression in L-UCB-MSCs may possibly be due to a compensatory mechanism to maintain proliferative ability under defined culture conditions (Figures 1(d) and 2(b)) [34, 35]. Overall, the long-term expansion of MSCs resulted in the alteration of cellular characteristics as well as the expression of RGs.

The validation of most stable RGs under each experimental condition is an essential step to obtain accurate and reliable results by qRT-PCR because there is no single RG that is universally stable in its expression under all defined culture conditions. The present study also demonstrated that the expression level of RGs could be affected by experimental conditions as evident in Figure 2(b). For instance, although ACTB and GAPDH are the basic cell survival factors, their expression level was found to change as high as seventeen times based on culture conditions and culture duration [5, 6, 20, 36]. Therefore, the selection of nonvalidated or unstable RGs during normalization of GOI may lead to inconsistent or misleading results [11, 37]. The incorrect selection of RGs drastically affects the results [4, 11, 22, 38]. When the expression of lineage-specific markers in differentiated MSCs toward adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes was normalized against the most stable RGs (RPLP0 and EEF1A1 for osteogenesis TBP and YWHAZ for adipogenesis and chondrogenesis) and the least stable RG (EEF1A1 for adipogenesis B2M for osteogenesis and chondrogenesis), inconsistent results of the relative expression of lineage-specific markers were significantly (ص < 0.0001) identified. Especially, normalization against the least stable RGs in differentiated MSCs toward osteoblasts and chondrocytes resulted in less fold change in the expression compared to that when using the most stable RGs [4].. In addition, the relative gene expression levels of chondrogenic markers or OCT4 from chondrogenesis-induced ATDC5 cells (progenitor cells for chondroblasts) or different types of porcine blastocysts were found to be varied depending on the use of RGs, respectively [22, 38]. The present study also demonstrated an inconsistence in results obtained between stable RGs (PPIA, HPRT1 and YWHAZ) and the traditional RGs (ACTB and GAPDH) during long-term expansion of MSCs under defined culture conditions. Considering the occurrence of loss of stemness during long-term expansion of BM-MSCs, the expression of OCT4 in L-BM-MSCs was reduced when compared to E-BM-MSCs when three most stable RGs verified in the present study were used however, no significant difference in the expression of OCT4 was noted in BM-MSCs irrespective of culture period when GAPDH was used for normalization (Figure 5). Therefore, these results indicate that the validation and use of stable RGs under each experimental condition are critical for accurate analysis of qRT-PCR in order to avoid the false conclusions resulting from the use of invalidated RGs.

The validation of Ct values obtained by qRT-PCR using well-established algorithms such as geNorm, NormFinder, and BestKeeper is necessary to investigate the stability of RGs. Recently, several studies have evaluated the most stable RGs in human MSCs or progenitor cells [4–6, 20, 39, 40]. The importin 8 (IPO8), cancer susceptibility candidate 3 (CASC3), and TBP were recommended as RGs for studies on osteoarthritis patient-derived BM-MSCs [39]. Further, it has been demonstrated that the expression of TBP and YWHAZ is found to be stable in BM-MSCs and adipose tissue-derived MSCs (AT-MSCs) regardless of treatments such as supplementation of vascular endothelial growth factor (VEGF) to potentially enhance the properties of MSCs [40]. Considering that the studies involving comparative characterization of various source derived MSCs including an evaluation of stable RGs under varied differentiation status are prerequisite to define the most appropriate cell source for clinical applications. The expression of RPL13A in AT-MSCs and Wharton’s jelly-derived MSCs (WJ-MSCs) and HPRT1 in BM-MSCs has been validated as stable and the expression of TBP, YWHAZ, glucuronidase beta (GUSB), and RPL subtypes has been identified as most stable for UCB-MSCs, BM-MSCs, and AT-MSCs with or without induction of differentiation [4, 5]. Further, PPIA, B2M and RPL13A are recommended to use as RGs for BM-MSCs and fetal tissue-derived MSCs (FT-MSCs) [6]. In general, RPL subtypes are found to be more stable with minor inconsistency among donors when compared to other RGs [20]. The different experimental conditions such as cell source, donor, treatment, differentiation induction, and cell expansion may have profound effect on the stability of RGs. Therefore, it is important to verify the most stable RGs under each experimental condition before using for further studies. The present study recommends the use of PPIA, HPRT1, and YWHAZ for normalization of GOI in qRT-PCR experiments to get accurate and reliable results as determined by geNorm and NormFinder analysis for long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs [Figures 3 and 4].

Previously, several RGs such as ACTB and GAPDH were traditionally used for normalization as they were thought to be constantly expressed in different cell lines and conditions [5]. However, these traditional RGs have been reported to be unstable in many studies with MSCs [4, 5, 20, 39, 41]. The analysis of higher maximum fold change (MFC) of ACTB among other RGs in osteogenesis-induced BM-MSCs indicated the expression of ACTB was associated with morphological changes of differentiated MSCs and found to be unstable during osteogenesis [41]. In addition, the lower stability of ACTB among pool of candidate RGs was demonstrated in AT-MSCs, BM-MSCs, WJ-MSCs, and UCB-MSCs under different experimental conditions [4, 5, 20, 39]. Similar to ACTB, the expression of another RG GAPDH was also found to be variable or less stable in AT-MSCs and BM-MSCs [5, 42, 43]. In consistency with these earlier findings, the present study also demonstrated that ACTB and GAPDH were less stable in long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs and were not always successful in all normalization data. Both geNorm and NormFinder analysis found that the stability rankings of ACTB and GAPDH were placed in fifth to ninth among the pool of 10 RGs. In addition, GAPDH led to inconsistent or misleading results during normalization of OCT4 [Figure 5]. These results indicated that both ACTB and GAPDH are not suitable RGs with regard to gene expression analysis in long-term expanded BM-MSCs and UCB-MSCs under defined culture conditions and, therefore, highlighting the importance of validation of RGs.

In conclusion, the present study demonstrated that the three RGs, PPIA, HPRT1, and YWHAZ among the pool of 10 RGs are more suitable for normalizing the expression of GOI and that the traditional RGs such as ACTB and GAPDH are identified as less stable under current experimental conditions. To our knowledge, this is the first kind of its study to evaluate the stability of the expression of RGs under multifactorial conditions with respect to cell source, long-term expansion until passage 20, and defined media culture conditions.

توافر البيانات

All the data related to the current manuscript can be made available upon request whenever needed.

تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.

شكر وتقدير

This research was supported by a grant from Ministry of Food and Drug safety (12182MFDS666 2012), Republic of Korea.

المواد التكميلية

Supplementary 1. Supplementary Figure 1: Cell surface marker analysis of MSC-positive markers (CD44, CD105, and Vimentin) and negative markers (CD34 and CD45) in long-term expanded BM-MSCs. Here E-BM, M-BM, and L-BM represent the early, middle, and late bone marrow MSCs.

Supplementary 2. Supplementary Figure 2: Cell surface marker analysis of MSC-positive markers (CD44, CD105, and Vimentin) and negative markers (CD34 and CD45) in long-term expanded UCB-MSCs. Here E-UCB, M-UCB, and L-UCB represent the early, middle, and late umbilical cord blood MSCs.

مراجع

  1. H. Nailis, T. Coenye, F. Van Nieuwerburgh, D. Deforce, and H. J. Nelis, “Development and evaluation of different normalization strategies for gene expression studies in Candida albicans biofilms by real-time PCR,” BMC Molecular Biology، المجلد. 7 ، المادة لا. 25, 2006. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  2. A. Radonić, S. Thulke, I. M. Mackay, O. Landt, W. Siegert, and A. Nitsche, “Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR,” الكيمياء الحيوية والبيوفيزيائية تبحث في الاتصالات، المجلد. 313, no. 4, pp. 856–862, 2004. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  3. P. A. Davoren, R. E. McNeill, A. J. Lowery, M. J. Kerin, and N. Miller, “Identification of suitable endogenous control genes for microRNA gene expression analysis in human breast cancer,” BMC Molecular Biology، المجلد. 9, article 76, 2008. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  4. E. Ragni, M. Viganò, P. Rebulla, R. Giordano, and L. Lazzari, “What is beyond a qRT-PCR study on mesenchymal stem cell differentiation properties: how to choose the most reliable housekeeping genes,” مجلة الطب الخلوي والجزيئي، المجلد. 17 ، لا. 1, pp. 168–180, 2013. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  5. P. R. Amable, M. V. T. Teixeira, R. B. V. Carias, J. M. Granjeiro, and R. Borojevic, “Identification of appropriate reference genes for human mesenchymal cells during expansion and differentiation,” بلوس واحد، المجلد. 8 ، لا. 9, Article ID e73792, 2013. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  6. X. Li, Q. Yang, J. Bai, Y. Yang, L. Zhong, and Y. Wang, “Identification of optimal reference genes for quantitative PCR studies on human mesenchymal stem cells,” Molecular Medicine Reports، المجلد. 11 ، لا. 2, pp. 1304–1311, 2015. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  7. E. M. Cordoba, J. V. Die, C. I. González-Verdejo, S. Nadal, and B. Román, “Selection of reference genes in Hedysarum coronarium under various stresses and stages of development,” الكيمياء الحيوية التحليلية، المجلد. 409, no. 2, pp. 236–243, 2011. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  8. T. D. Schmittgen and B. A. Zakrajsek, “Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR,” Journal of Biochemical and Biophysical Methods، المجلد. 46 ، لا. 1-2, pp. 69–81, 2000. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  9. M. Uddin, M. Cinar, D. Tesfaye, C. Looft, E. Tholen, and K. Schellander, “Age-related changes in relative expression stability of commonly used housekeeping genes in selected porcine tissues,” ملاحظات أبحاث BMC، المجلد. 4, article 441, 2011. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  10. S. A. Bustin and T. Nolan, “Pitfalls of quantitative real- time reverse-transcription polymerase chain reaction,” Journal of Biomolecular Techniques، المجلد. 15 ، لا. 3, pp. 155–166, 2004. View at: Google Scholar
  11. K. Dheda, J. F. Huggett, J. S. Chang et al., “The implications of using an inappropriate reference gene for real-time reverse transcription PCR data normalization,” الكيمياء الحيوية التحليلية، المجلد. 344 ، لا. 1, pp. 141–143, 2005. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  12. W. J. Lee, Y. S. Hah, S. A. Ock et al., “Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs,” أبحاث الخلايا التجريبية، المجلد. 333, no. 2, pp. 273–288, 2015. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  13. S. Kern, H. Eichler, J. Stoeve, H. Klüter, and K. Bieback, “Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue,” الخلايا الجذعية، المجلد. 24 ، لا. 5, pp. 1294–1301, 2006. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  14. M. W. Lee, I. K. Jang, K. H. Yoo, K. W. Sung, and H. H. Koo, “Stem and progenitor cells in human umbilical cord blood,” International Journal of Hematology، المجلد. 92 ، لا. 1, pp. 45–51, 2010. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  15. H. Doi, Y. Kitajima, L. Luo et al., “Potency of umbilical cord blood- and Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells for scarless wound healing,” التقارير العلمية، المجلد. 6, no. 1, 2016. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  16. L. M. Ball, M. E. Bernardo, H. Roelofs et al., “Cotransplantation of ex vivo-expanded mesenchymal stem cells accelerates lymphocyte recovery and may reduce the risk of graft failure in haploidentical hematopoietic stem-cell transplantation,” دم، المجلد. 110 ، لا. 7, pp. 2764–2767, 2007. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  17. A. Menssen, T. Häupl, M. Sittinger, B. Delorme, P. Charbord, and J. Ringe, “Differential gene expression profiling of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells during adipogenic development,” علم الجينوم BMC، المجلد. 12, article 461, 2011. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  18. A. Kocaoemer, S. Kern, H. Klüter, and K. Bieback, “Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue,” الخلايا الجذعية، المجلد. 25 ، لا. 5, pp. 1270–1278, 2007. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  19. B. Lindroos, S. Boucher, L. Chase et al., “Serum-free, xeno-free culture media maintain the proliferation rate and multipotentiality of adipose stem cells in vitro,” Cytotherapy، المجلد. 11 ، لا. 7, pp. 958–972, 2009. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  20. S. Palombella, C. Pirrone, M. Cherubino, L. Valdatta, G. Bernardini, and R. Gornati, “Identification of reference genes for qPCR analysis during hASC long culture maintenance,” بلوس واحد، المجلد. 12 ، لا. 2 ، المادة لا. e0170918, 2017. View at: Google Scholar
  21. W.-J. Lee, R.-H. Jeon, S.-J. Jang et al., “Selection of reference genes for quantitative gene expression in porcine mesenchymal stem cells derived from various sources along with differentiation into multilineages,” Stem Cells International، المجلد. 2015, Article ID 235192, 14 pages, 2015. View at: Google Scholar
  22. W. Lee, S. Jang, S. Lee et al., “Selection of reference genes for quantitative real-time polymerase chain reaction in porcine embryos,” Reproduction, Fertility and Development، المجلد. 29 ، لا. 2, pp. 357–367, 2015. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  23. J. Vandesompele, K. De Preter, F. Pattyn et al., “Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes,” بيولوجيا الجينوم، المجلد. 3 ، لا. 7, pp. 0034.1–0034.11, 2002. View at: Google Scholar
  24. C. L. Andersen, J. L. Jensen, and T. F. Ørntoft, “Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets,” ابحاث السرطان، المجلد. 64 ، لا. 15, pp. 5245–5250, 2004. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  25. M. Fasullo and L. Endres, “Nucleotide salvage deficiencies, DNA damage and neurodegeneration,” المجلة الدولية للعلوم الجزيئية، المجلد. 16, no. 5, pp. 9431–9449, 2015. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  26. L. Hayflick and P. S. Moorhead, “The serial cultivation of human diploid cell strains,” أبحاث الخلايا التجريبية، المجلد. 25 ، لا. 3, pp. 585–621, 1961. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  27. V. Turinetto, E. Vitale, and C. Giachino, “Senescence in human mesenchymal stem cells: functional changes and implications in stem cell-based therapy,” المجلة الدولية للعلوم الجزيئية، المجلد. 17 ، لا. 7 ، 2016. عرض على: الباحث العلمي من Google
  28. W. Wagner, P. Horn, M. Castoldi et al., “Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process,” بلوس واحد، المجلد. 3 ، لا. 5, Article ID e2213, 2008. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  29. R. Vono, E. Jover Garcia, G. Spinetti, and P. Madeddu, “Oxidative stress in mesenchymal stem cell senescence: regulation by coding and noncoding RNAs,” مضادات الأكسدة وإشارات الأكسدة والاختزال، المجلد. 29 ، لا. 9, pp. 864–879, 2018. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  30. M. A. Baxter, R. F. Wynn, S. N. Jowitt, J. E. Wraith, L. J. Fairbairn, and I. Bellantuono, “Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion,” الخلايا الجذعية، المجلد. 22 ، لا. 5, pp. 675–682, 2004. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  31. B. Kulterer, G. Friedl, A. Jandrositz et al., “Gene expression profiling of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow during expansion and osteoblast differentiation,” علم الجينوم BMC، المجلد. 8, article 70, 2007. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  32. S. Tanabe, Y. Sato, T. Suzuki, K. Suzuki, T. Nagao, and T. Yamaguchi, “Gene expression profiling of human mesenchymal stem cells for identification of novel markers in early- and late-stage cell culture,” مجلة الكيمياء الحيوية، المجلد. 144 ، لا. 3, pp. 399–408, 2008. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  33. P. Mark, M. Kleinsorge, R. Gaebel et al., “Human mesenchymal stem cells display reduced expression of CD105 after culture in serum-free medium,” Stem Cells International، المجلد. 2013, Article ID 698076, 8 pages, 2013. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  34. T. H. Kang, Y. Park, J. S. Bader, and T. Friedmann, “The housekeeping gene hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) regulates multiple developmental and metabolic pathways of murine embryonic stem cell neuronal differentiation,” بلوس واحد، المجلد. 8 ، لا. 10, 2013. View at: Google Scholar
  35. H. Skottman, A.-M. Strömberg, E. Matilainen, J. Inzunza, O. Hovatta, and R. Lahesmaa, “Unique gene expression signature by human embryonic stem cells cultured under serum-free conditions correlates with their enhanced and prolonged growth in an undifferentiated stage,” الخلايا الجذعية، المجلد. 24 ، لا. 1, pp. 151–167, 2006. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  36. E. Beillard, N. Pallisgaard, V. H. J. van der Velden et al., “Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using 'real-time' quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - A Europe against cancer program,” سرطان الدم، المجلد. 17 ، لا. 12, pp. 2474–2486, 2003. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  37. M. Provenzano and S. Mocellin, “Complementary Techniques,” in Microarray Technology and Cancer Gene Profiling, S. Mocellin, Ed., vol. 593 of التقدم في الطب التجريبي وعلم الأحياء, pp. 66–73, Springer Science+Business Media, New York, NY, USA, 2007. View at: Google Scholar
  38. Z. Zhai, Y. Yao, and Y. Wang, “Importance of suitable reference gene selection for quantitative RT-PCR during ATDC5 cells chondrocyte differentiation,” بلوس واحد، المجلد. 8 ، لا. 5, 2013. View at: Google Scholar
  39. T. Schildberg, J. Rauh, H. Bretschneider, and M. Stiehler, “Identification of suitable reference genes in bone marrow stromal cells from osteoarthritic donors,” Stem Cell Research، المجلد. 11 ، لا. 3, pp. 1288–1298, 2013. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  40. J. Tratwal, B. Follin, A. Ekblond, J. Kastrup, and M. Haack-Sørensen, “Identification of a common reference gene pair for qPCR in human mesenchymal stromal cells from different tissue sources treated with VEGF,” BMC Molecular Biology، المجلد. 15, article 11, 2014. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  41. F. G. Quiroz, O. M. Posada, D. Gallego-Perez et al., “Housekeeping gene stability influences the quantification of osteogenic markers during stem cell differentiation to the osteogenic lineage,” Cytotechnology، المجلد. 62 ، لا. 2, pp. 109–120, 2010. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  42. K. M. Curtis, L. A. Gomez, C. Rios et al., “EF1α and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells,” BMC Molecular Biology، المجلد. 11 ، لا. 1 ، المادة لا. 61, 2010. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  43. T. Fink, P. Lund, L. Pilgaard, J. G. Rasmussen, M. Duroux, and V. Zachar, “Instability of standard PCR reference genes in adipose-derived stem cells during propagation, differentiation and hypoxic exposure,” BMC Molecular Biology، المجلد. 9, article 98, 2008. View at: Publisher Site | منحة جوجل

حقوق النشر

Copyright © 2019 Ryoung-Hoon Jeon et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط الاستشهاد بالعمل الأصلي بشكل صحيح.


معلومات الكاتب

الانتماءات

School of Veterinary Science, The University of Queensland, Gatton, QLD, Australia

N. Sarker, J. Meers, H. Owen, J. M. Seddon & G. Simmons

School of Animal and Veterinary Sciences, The University of Adelaide, Roseworthy, SA, Australia

J. Fabijan, F. Hemmatzadeh, N. Speight, D. Trott & L. Woolford

School of Veterinary Medicine and Science, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, LE12 5RD, United Kingdom

Advanced Data Analysis Centre (ADAC), University of Nottingham, Sutton Bonington, United Kingdom