معلومة

5.12: التسلسل الحيوي - علم الأحياء


في المختبرات حول العالم ، هناك رغبة شديدة لتسلسل المزيد من الجينومات.

  • تلك الخاصة بمجموعة متنوعة من الكائنات الحية للمساعدة في إقامة علاقات تطورية ؛
  • تلك الموجودة في مجموعات الكائنات الحية الدقيقة المتجمعة في ، على سبيل المثال ، مياه البحر والتربة والأمعاء الغليظة ؛
  • البشر الآخرون للبحث عن الجينات التي تهيئ للمرض والأنماط الجينية في المجموعات العرقية المختلفة.

تم تحديد جميع الجينومات المتسلسلة المدرجة في أحجام الجينوم باستخدام طريقة dideoxy التي اخترعها فريدريك سانجر ووصفت elsehwere. ومع ذلك ، يتم الآن بذل جهد كبير لإيجاد طرق لتسلسل الحمض النووي بسرعة أكبر (وبتكلفة أقل).

مُسلسِل الجينوم

يتم تطوير العديد من الطرق الجديدة وأحدها متاح بالفعل تجاريًا (نظام Genome Sequencer 20). تسمى طريقتها بالتسلسل الحراري أو التسلسل بالتوليف. يعمل مثل هذا.

  • يتم تقسيم الحمض النووي المراد تسلسله إلى أجزاء من حوالي 100 زوج قاعدي وتشويه الصفات الطبيعية لتشكيل DNA أحادي الجديلة (ssDNA).
  • يتم إرفاق شظايا ssDNA المفردة بالخرز المجهرية ، والتي يتم فصلها عن بعضها البعض.
  • يتم تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على كل حبة بحيث يتم تغليف كل منها بـ ~ 10 مليون نسخة متطابقة من تلك القطعة.
  • يتم وضع الخرزات منفردة في آبار منفصلة مجهرية (حوالي 200000 منهم).
  • يتلقى كل بئر مزيجًا من الكواشف:
    • بوليميريز الحمض النووي - لإضافة ديوكسي ريبونوكليوتيدات إلى ssDNA
    • فوسفوسلفات الأدينوزين (APS)
    • ATP sulfurylase - إنزيم يشكل ATP من فوسفات الأدينوزين (APS) والبيروفوسفات (PPi)
    • لوسيفيرين
    • لوسيفيراز - وهو ATPase الذي يحفز تحويل لوسيفيرين إلى أوكسيلوسيفيرين مع تحرير الضوء

تشغيل التسلسل:

  • يتم غمر كل من آلاف الآبار بواحد من أربعة ديوكسي ريبونوكليوتيدات ، dTTP ، dCTP ، و dGTP ، ولكن بدلاً من dATP (الذي قد يؤدي إلى تفاعل لوسيفيرين) ، يتم استخدام deoxyadenosine alpha-thiotriphosphate (dATPαS) بدلاً من ذلك. يتجاهل DNA polymerase الاختلاف ويستخدمه كلما تمت مصادفة T في قالب ssDNA ، لكن لوسيفيراز لا يتعرف عليه.
  • في أي بئر حيث يوجد النوكليوتيدات التكميلية في نهاية 3 'من القالب ، يضاف النيوكليوتيد ويتحرر البيروفوسفات.
  • كمية الضوء تتناسب مع عدد النيوكليوتيدات المضافة. لذلك ، على سبيل المثال ، إذا كان النوكليوتيد الوارد هو dGTP ، وهناك سلسلة من 3 Cs على القالب ، فإن الضوء المنبعث سيكون أكثر سطوعًا بثلاث مرات من وجود C واحد فقط.
  • يلتقط الكاشف الضوء (إن وجد) من كل بئر ويتم تسجيل البيانات.
  • ثم يتم إضافة كل من النوكليوتيدات الثلاثة المتبقية بالتسلسل.
  • ثم يتكرر تسلسل 4 إضافات حتى يكتمل التوليف.

يوضح الرسم البياني أعلاه أيضًا نوع البيانات المنتجة في بئر واحد. يعطي ارتفاع ذروة إنتاج الضوء عدد الإضافات التي حدثت عند إضافة نوكليوتيد معين (أسفل). ثم يعرض برنامج الكمبيوتر تسلسل القالب (أعلى) لكل من آلاف الأجزاء المختلفة المتسلسلة. باستخدام هذه التقنية ، يمكن تعلم ما يصل إلى 20 مليون زوج أساسي من تسلسل الجينوم في أداة تعمل بأقل من 6 ساعات.


مُسلسِل الحمض النووي

أ مُسلسِل الحمض النووي هي أداة علمية تستخدم لأتمتة عملية تسلسل الحمض النووي. بالنظر إلى عينة من الحمض النووي ، يتم استخدام مُسلسِل الحمض النووي لتحديد ترتيب القواعد الأربعة: G (الجوانين) ، C (السيتوزين) ، A (الأدينين) و T (الثايمين). ثم يتم الإبلاغ عن هذا كسلسلة نصية تسمى قراءة. يمكن أيضًا اعتبار بعض متواليات الحمض النووي أدوات بصرية لأنها تحلل الإشارات الضوئية الناشئة عن الفلوروكرومات المرتبطة بالنيوكليوتيدات.

تم تقديم أول مُسلسِل الحمض النووي الآلي ، الذي ابتكره Lloyd M. Smith ، بواسطة Applied Biosystems في عام 1987. [1] واستخدمت طريقة Sanger للتسلسل ، وهي تقنية شكلت أساس "الجيل الأول" من متواليات الحمض النووي [2] [ 3] ومكن من إكمال مشروع الجينوم البشري في عام 2001. [4] هذا الجيل الأول من متواليات الحمض النووي هي في الأساس أنظمة فصل كهربائي آلية تكشف عن هجرة شظايا الحمض النووي الموسومة. لذلك ، يمكن أيضًا استخدام أجهزة التسلسل هذه في التنميط الجيني للواسمات الجينية حيث يلزم تحديد طول جزء (أجزاء) الحمض النووي فقط (على سبيل المثال ، السواتل المكروية ، AFLPs).

حفز مشروع الجينوم البشري على تطوير منصات أرخص وعالية الإنتاجية وأكثر دقة تُعرف باسم متسلسلات الجيل التالي (NGS) لتسلسل الجينوم البشري. وتشمل هذه المنصات 454 و SOLiD و Illumina لتسلسل الحمض النووي. زادت آلات التسلسل من الجيل التالي من معدل تسلسل الحمض النووي بشكل كبير ، مقارنةً بطرق Sanger السابقة. يمكن تحضير عينات الحمض النووي تلقائيًا في أقل من 90 دقيقة ، [5] بينما يمكن ترتيب تسلسل الجينوم البشري بتغطية 15 مرة في غضون أيام. [6]

الأحدث ، متسلسلات الحمض النووي من الجيل الثالث مثل SMRT و Oxford Nanopore تقيس إضافة النيوكليوتيدات إلى جزيء DNA واحد في الوقت الفعلي.

نظرًا للقيود في تقنية تسلسل الحمض النووي ، فإن هذه القراءات قصيرة مقارنة بطول الجينوم ، لذلك يجب تجميع القراءات في contigs أطول. [7] قد تحتوي البيانات أيضًا على أخطاء ناجمة عن قيود في تقنية تسلسل الحمض النووي أو بسبب أخطاء أثناء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. يستخدم مصنعو أجهزة تسلسل الحمض النووي عددًا من الطرق المختلفة لاكتشاف قواعد الحمض النووي الموجودة. البروتوكولات المحددة المطبقة في منصات التسلسل المختلفة لها تأثير في البيانات النهائية التي يتم إنشاؤها. لذلك ، يمكن أن تكون مقارنة جودة البيانات والتكلفة عبر التقنيات المختلفة مهمة شاقة. يوفر كل مصنع طرقه الخاصة للإبلاغ عن أخطاء التسلسل والنتائج. ومع ذلك ، لا يمكن دائمًا مقارنة الأخطاء والنتائج بين الأنظمة الأساسية المختلفة بشكل مباشر. نظرًا لأن هذه الأنظمة تعتمد على مناهج مختلفة لتسلسل الحمض النووي ، فإن اختيار أفضل مُسلسِل وطريقة للحمض النووي سيعتمد عادةً على أهداف التجربة والميزانية المتاحة. [2]


ملامح الطفرات الجسدية لسرطان القولون والمستقيم MSI و MSS التي تم تحديدها من خلال تسلسل الجيل التالي من exome بالكامل وتحليل المعلومات الحيوية

خلفية: يعتبر سرطان القولون والمستقيم (CRC) ثالث أكثر أنواع السرطانات شيوعًا في جميع أنحاء العالم مع ما يقرب من مليون حالة. تجري أبحاث مكثفة لفك رموز الأنماط الجينية الكامنة على أمل تحسين التشخيص المبكر للسرطان وعلاجه. في هذا الاتجاه ، أحدث التقدم الأخير في تقنيات تسلسل الجيل القادم ثورة في مجال علم جينوم السرطان. ومع ذلك ، يبقى أحد التحذيرات في هذه الدراسات هو الكم الهائل من الاختلافات الجينية التي تم تحديدها وتفسيرها.

المنهجية / النتائج الرئيسية: نقدم هنا العمل الأول على exome NGS الكامل لسرطانات القولون الأولية. أجرينا 454 تسلسلًا حراريًا كاملًا للإكسوم للورم بالإضافة إلى أنسجة القولون الطبيعية المجاورة غير المتأثرة من مرضى سرطان القولون المستقر للأقمار الصناعية الصغيرة (MSS) والأقمار الصناعية غير المستقرة (MSI) وحددنا أكثر من 50000 اختلاف نيوكليوتيد صغير لكل نسيج. وفقًا للتنبؤات المستندة إلى آليات MSS و MSI المرضية ، حددنا ثمانية أضعاف الاختلافات الجسدية غير المترادفة في سرطانات MSI مقارنة بـ MSS وتمكنا من إعادة إنتاج النتيجة في أربعة CRCs إضافية. قلص نهج ترشيح المعلوماتية الحيوية الخاص بنا من معدل الطفرات الأكثر أهمية إلى 359 لـ MSI و 45 لـ MSS CRCs مع وظائف البروتين المتغيرة المتوقعة. في كل من CRCs و MSI و MSS ، وجدنا طفرات جسدية في مجال كيناز داخل الخلايا لمستقبلات البروتين المشكل للعظام 1A ، BMPR1A ، وهو جين ترتبط فيه طفرات السلالة الجرثومية حتى الآن بمتلازمة داء البوليبات الشبابية ، وتظهر أن الطفرات تضعف وظيفيًا وظيفة البروتين .

الاستنتاجات / الأهمية: نستنتج أنه من خلال التسلسل العميق لإكسومات الورم ، قد يكون المرء قادرًا على التنبؤ بحالة الأقمار الصناعية الدقيقة لـ CRC بالإضافة إلى تحديد الطفرات المحتملة ذات الصلة سريريًا.

بيان تضارب المصالح

تضارب المصالح: أعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة.


أساليب

تصميم التمهيدي

يجب أن تستهدف المواد الأولية المطبقة في تحليل محتوى القناة الهضمية للحيوانات المفترسة بشكل مثالي التسلسلات القصيرة من الحمض النووي متعدد النسخ بسبب الطبيعة المتدهورة للتسلسلات المشتقة من الفريسة [13 ، 16 ، 17 ، 36]. لذلك غالبًا ما يستخدم الحمض النووي الريبوزومي كهدف لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في دراسات النظام الغذائي لأن جينات الحمض النووي الريبوزي (rDNA) تتكرر جنبًا إلى جنب بأعداد نسخ عالية ويتم حفظها بدرجة عالية داخل الأنواع [37]. لقد صممنا بادئات PCR `` عالمية '' تضخم منطقة قصيرة ولكن متغيرة إلى حد ما من 28S rDNA من جميع حقيقيات النوى التي تم اختبارها. لقد صممنا أيضًا ثلاثة مواد أولية مانعة للالتصاق بـ Euphausia superba تضخيم التسلسل بواسطة الاشعال العالمي. يتم إعطاء الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1 وتظهر متماشية مع تسلسل الكريل في الشكل 2.

الاشعال. منطقة 203 نقطة أساس من Euphausia superba يوضح تسلسل 28S موقع مختلف الاشعال المطبقة في هذه الدراسة.

التمهيدي المانع ، 'Short28SR-blkKrill3'c3' متداخل مع الطرف 3 'من التمهيدي العالمي العكسي ، ولكنه امتد إلى تسلسل خاص بالكريل وتم تعديله باستخدام مباعد C3 في الطرف 3' (الشكل 2). لقد احتجنا إلى تعديل تم تصنيعه بنسبة 100٪ (أي لم يكن هناك oligos مفقودًا) وكان مستقرًا (أي لا يوجد تدهور أو إزالة إنزيمية للتعديل بعد التوليف). حتى لو كانت نسبة صغيرة فقط من بادئات الحجب تقوم بتضخيم الحمض النووي للمفترس نتيجة عدم وجود تعديل 3 ، فإن هذا سيجعل الإجراء غير عملي. فاصل C3 (3 هيدروكربونات) CPG هو تعديل تمهيدي قياسي متاح من معظم موردي قليلات النوكليوتيدات المخصصة. تؤدي إضافة هذا التعديل إلى الطرف 3'من قليل النوكليوتيد إلى منع الاستطالة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل دون التأثير بشكل ملحوظ على خصائص التلدين. نظرًا لأنه يتم تصنيع oligos من اتجاه 3 إلى 5 ، فسيتم تعديل جميع الجزيئات باستخدام التعديل 3. تعديل 3'- نهاية مع مجموعة الفوسفات (كما اختار من قبل Liles et al. [35]) ، إستر الفوسفات ، أو استخدام رابط 3'-3 'مقلوب من شأنه أيضًا منع الاستطالة. ومع ذلك ، قد تؤدي التفاعلات الجانبية أثناء نزع الحماية من قليل النوكليوتيد أو الشوائب الأنزيمية إلى تحرير مجموعة 3'-hydroxyl إلى حد صغير ، وهذه الطرق ليست فعالة في منع فواصل C3 CPG [38 ، 39].

نظرًا لأن العثور على موقع ربط مناسب لطبقة التمهيدي الخاصة بالأنواع بجوار موقع الربط الخاص بالبادئة الشاملة غالبًا ما يكون أمرًا صعبًا ، فإن التمهيدي الخاص بالكريل ، وهو Short28SF-DPO-blkKrill يتداخل مع النهاية 3 من التمهيدي العالمي الأمامي وله طبقة داخلية تم أيضًا تصميم تعديل خمسة جزيئات deoxyinosine (dI) بالإضافة إلى تعديل فاصل C3 (الشكل 2). غالبًا ما لا تعمل قليل النوكليوتيدات التقليدية الطويلة جدًا. بشكل عام ، نادرًا ما تستخدم البادئات الأطول من 25 قاعدة نظرًا لأن Tms الخاصة بها يمكن أن تزيد عن 70 درجة مئوية ، وهي نسبة عالية جدًا لدورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الفعال [40]. غالبًا ما تولد البادئات الطويلة أيضًا العديد من النطاقات غير المحددة الناتجة عن التلدين غير المحدد. يحتوي قليل النوكليوتيد الأولي المزدوج (DPO) [41] على منطقتين تحضير منفصلتين متصلتين بواسطة رابط بولي ديوكسيينوساين. لا تعاني DPOs من قيود Tm العالية لأن الرابط يفترض بنية تشبه الفقاعة مما ينتج عنه جزأين أوليين بخصائص تلدين مميزة. علاوة على ذلك ، فإن البنية الشبيهة بالفقاعات للرابط تمنع بشكل فعال تكوين بنية دبابيس الشعر التمهيدي [41].

تم تصميم كل من الاشعال Short28SR-blkKrill3'c3 و Short28SF-DPO-blkKrill لمنع تلدين النسخة غير المعدلة من التمهيدي العالمي على تسلسلات الكريل. علاوة على ذلك ، تم اختبار تمهيدي منع محدد ثالث من الكريل يقع بين البادئين العالميين (الشكل 2). كان هذا بمثابة "توقف استطالة" التمهيدي ([42] الشكل 1) وكان به أيضًا فاصل C3 في نهايته 3.

أخذ العينات واستخراج الحمض النووي

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الجيني من عينات محفوظة بالإيثانول من اللافقاريات البحرية في أنتاركتيكا أو أنواع الطحالب المستزرعة (الجدول 2).

تم جمع الكريل خلال رحلتين بحريتين في مياه القطب الجنوبي الشرقية باستخدام RSV أورورا أوستراليس. تمت الرحلة البحرية الأولى خلال فصل الخريف في أستراليا والثانية في أواخر فصل الشتاء في أستراليا (الجدول 2). تم جمع الكريل باستخدام شبكة Midwater Trawl-8 المستطيلة بواسطة جر مزدوج مائل قياسي من السطح حتى 200 متر أو عن طريق السحب المستهدف على أعماق مستهدفة تبلغ 100 متر أو 16-60 مترًا (الجدول 2). تم الحفاظ على سرعة السفينة أثناء السحب الصافي عند 2 عقدة. مباشرة بعد الالتقاط ، تم وضع الكريل في مرطبانات تحتوي على 80٪ من الإيثانول على النحو الموصى به من قبل Passmore et al. [26].

بعد 1-6 أشهر تخزين الكريل معدة (مقدمة) من الكريل المغسول بالإيثانول تم تشريحها تحت مجهر تشريح في أطباق بتري المعقمة باستخدام ملقط معقم باللهب. تم الحرص على عدم اتصال المعدة بأي أجزاء خارجية من الهيكل الخارجي للكريل. تم بعد ذلك شطف المعدة لفترة وجيزة بالإيثانول الطازج ووضعها في أنبوب إيبندورف الخالي من الحمض النووي المعقم ومملوء بمخزن ATL (Qiagen). تم تجانس العينة باستخدام مدقة بلاستيكية معقمة قبل استخلاص الحمض النووي.

تم استخراج جميع الحمض النووي باستخدام مجموعة DNeasy Blood & amp Tissue (Qiagen) باتباع تعليمات الشركة المصنعة للأنسجة الحيوانية وتم تحديد إجمالي إنتاجية الحمض النووي وجودة الاستخراج النهائي (100 ميكرولتر) باستخدام Picofluor 8000-004 (تصاميم تيرنر) والعينات الملطخة بالكمية -iT PicoGreen ds كاشف DNA (مجسات جزيئية).

اختبار البادئات الحاصرة

لتقييم كفاءة الأنواع المختلفة والكميات المختلفة من البادئات الحاصرة ، تم إنشاء مخاليط rDNA الاصطناعية. تم إجراء أول تضخيم PCR على الكريل و بيراميموناس الحمض النووي مع الاشعال 28S rDNA العالمي Short28SF و Short28SR (الجدول 1) مثل تفاعلات 25 ميكرولتر مع 0.25 ميكرولتر من كل قليل (10 ميكرومتر) ، 0.25 ميكرولتر dNTP ، 2.5 ميكرولتر 10 × ، 0.1 ميكرولتر بلاتين طق بوليميراز DNA عالي الدقة (Invitrogen) 5 U. ميكرولتر -1 ، 1 ميكرولتر ملغ 2+ و 5 ميكرولتر DNA (

تم بعد ذلك استنساخ منتجات PCR باستخدام الخلايا المختصة بنظام الاستنساخ TOPO TA (Invitrogen). تم فحص المتحولات باستخدام اختيار أزرق / أبيض على LB-agar المحتوي على X-Gal و 10 مجم. مل -1 أمبيسلين أو كاناميسين. تم اختيار المستعمرات البيضاء أو الزرقاء الفاتحة لعزل البلازميد ، وأعيد احتضانها طوال الليل في وسط LB المحتوي على المضادات الحيوية والبلازميدات ثم تم استخلاصها باستخدام مجموعة استخراج Ultraclean miniplasmid (Mo Bio ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم خطي البلازميدات باستخدام هند إنزيم التقييد III والمحصول الكمي باستخدام Picofluor 8000-004 (تصاميم تيرنر) والعينات الملطخة باستخدام كاشف DNA Quant-iT PicoGreen ds (مجسات جزيئية).

وهكذا تم خلط العينات لاحتواء 100 ضعف وفائض 1000 مرة من rDNAs المستهدفة (krill 28SrDNA) مقارنة مع rDNAs غير المستهدفة (بيراميموناس ص). تم استخدام عينة تحتوي فقط على DNA الكريل كعنصر تحكم.

تم إجراء التضخيم باستخدام الاشعال الحجب على شكل تفاعلات 25 ميكرولتر مع 0.25 ميكرولتر من كل من البادئات العامة 28S rDNA Short28SF (10 ميكرومتر) و Short28SR (10 ميكرومتر) ، 0.25 ميكرولتر dNTP ، 2.5 ميكرولتر 10 × ، 0.1 ميكرولتر بلاتين طق بوليميراز DNA عالي الدقة (Invitrogen) 5 U. ميليلتر -1 ، 1 ميكرولتر ملغ 2+ وكمية متغيرة من عرقلة التمهيدي و rDNA. كانت ظروف ركوب الدراجات الحرارية PCR: دقيقتان عند 94 درجة مئوية و 40 دورة من 10 ثوانٍ عند 94 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 59 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 68 درجة مئوية ، وأخيراً 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.

تم تقييم كفاءة الحجب عن طريق تحليل تجزئة منتجات PCR ذات العلامات الفلورية. يفصل تحليل الشظايا مزيجًا من شظايا الحمض النووي وفقًا لأحجامها وهو أكثر حساسية بكثير من الرحلان الكهربائي للهلام القياسي. تم إجراء التحليل على محلل جيني أبلايد سيستمز 3130 xl الكهربائي الشعري (CE) وتم تحليل النتائج باستخدام برنامج Peak Scanner 1.0 (النظم الحيوية التطبيقية).

تضخيم PCR للحمض النووي للفريسة من معدة الكريل

بعد تحديد خليط البادئة الأكثر فاعلية ، تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على عزلات معدة الكريل. تم تحضير PCRs باستخدام معدات ومواد استهلاكية معقمة بالأشعة فوق البنفسجية وتم دائمًا تشغيل عناصر التحكم السلبية (بدون قالب) جنبًا إلى جنب مع العينات. تم إجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل على محرك MJ Research DNA محرك التدرج (مكافئ Chromo 4) وتم إجراء التسلسل على محلل DNA 3730 xl (Applied Biosystems). تم فحص منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام الاغاروز 1.3٪ ملطخ بصبغة هلام SYBR® Safe DNA gel (Invitrogen). تم قطع الأشرطة المرئية وتنقيتها باستخدام أعمدة الدوران المستخرجة من Bio-Rad Quantum Prep Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction.

تمت إعادة احتضان منتجات PCR بعد ذلك لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية مع حجم تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على 2 ميكرولتر 10 × ، 1 ميكرولتر Mg 2+ ، 0.2 ميكرولتر Biotaq TM DNA Polymerase (Bioline) و 0.2 ميكرولتر dNTP لإضافة 3 أدينينات واستنساخ باستخدام الخلايا المختصة بنظام الاستنساخ TOPO TA (Invitrogen). تم اختيار المحولات من أجل PCR وتم إجراء التضخيم باستخدام الاشعال TOPO_F و TOPO_R مثل تفاعلات 25 ميكرولتر مع 0.25 ميكرولتر من كل oligo (10 ميكرومتر) ، 0.25 ميكرولتر dNTP ، 2.5 ميكرولتر 10 × ، 0.1 ميكرولتر من البلاتين طق بوليميراز DNA عالي الدقة (Invitrogen) 5 U. ميكرولتر -1 و 1 ميكرولتر ملغ 2+. كانت ظروف ركوب الدراجات الحرارية PCR: دقيقتان عند 94 درجة مئوية و 40 دورة من 10 ثوانٍ عند 94 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 65 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 68 درجة مئوية ، وأخيراً 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.

تم إنشاء التسلسلات من منتجات PCR هذه باستخدام التمهيدي الأمامي M13 وتفاعلات التسلسل BigDye Terminator v3.1 (ABI).

تم إجراء التضخيم لتسلسل الأنواع غير المتوفرة في GenBank على أنها تفاعلات 25 ميكرولتر مع 0.25 ميكرولتر من كل من الاشعال العالمي 28S rDNA Short28SseqF و Short28SseqR (10 ميكرومتر) (الجدول 1) المصممة لتغطية مساحة أكبر من الاشعال Short28SF / Short28SR ، بما في ذلك مواقع الربط التمهيدي ، 0.25 ميكرولتر dNTP ، 2.5 ميكرولتر 10 × ، 0.1 ميكرولتر من البلاتين طق بوليميراز DNA عالي الدقة (Invitrogen) 5 U. ميكرولتر -1 و 1 ميكرولتر ملغ 2+. لم يتم تعديل ظروف التدوير الحراري لـ PCR باستثناء زيادة خطوة الاستطالة إلى 60 ثانية.

تحديد الاستنساخ

تم تحديد الحيوانات المستنسخة مبدئيًا من خلال إيجاد أقرب تطابق لها في قاعدة بيانات GenBank باستخدام خوارزمية BLASTN [43]. تمت محاذاة جميع المتواليات (الحيوانات المستنسخة وأقرب التطابقات) في MEGA 4 [44] وتم إنشاء شجرة تشابه باستخدام مسافات Tamura-Nei [45] وخوارزمية التطور الأدنى مع معالجة الفجوة عن طريق الحذف الزوجي.


3. مناقشة

السيطرة اللاجينية ل KEAP1 تم الإبلاغ عن التعبير عن طريق المثيلة على نطاق واسع في الأورام الصلبة ، ويمثل في العديد من السياقات علامة تنبؤية متعددة الأوجه لنتائج المرض [7]. في مرضى الورم الدبقي ، يحدث فرط الميثيل المتزامن لـ KEAP1 و MGMT يتنبأ بانخفاض خطر التقدم للمرضى المعالجين بالعلاج الإشعاعي وتيموزولوميد [28]. في مرضى سرطان الثدي الثلاثي السلبي KEAP1 المثيلة ، لوحظ وجود مخاطر وفاة أعلى من المرضى غير المصابين بسرطان الثدي الثلاثي السلبي. على النقيض من ذلك ، فإن KEAP1 ارتبط المثيلة بتحسين البقاء على قيد الحياة بدون تقدم في المرضى الذين عولجوا مع epirubicin / cyclophosfamide و docetaxel كعلاج كيميائي متسلسل [30]. ضلال KEAP1 تم الإبلاغ عن المثيلة أيضًا في سرطان القولون والمستقيم وأنسجة سرطان الرأس والعنق ، وتم ربطها بأسوأ تشخيص لهذه الأورام [32 ، 36]. في سرطان الخلايا الكلوية الصافي (ccRCC) ، اقترح تحليل بيانات TCGA أن الإسكات اللاجيني عن طريق المثيلة قادر على التنبؤ بقوة ببقاء المريض [27].

على الرغم من التأثير الموثق جيدًا لـ KEAP1 و NFE2L2 الطفرات في NSCLCs و LCNEC [34] ، الدور الإنذاري لـ KEAP1 لم يتم توضيح المثيلة في سرطان الرئة. التثبيط الانتقائي لـ KEAP1 الميثيل المحفز الجيني بواسطة genistein ، الذي لوحظ في خلايا A549 ، اقترح طريقة KEAP1 يمكن أن يمثل نزع الميثيل علامة على تأثيرات التحسس الإشعاعي في سرطان الرئة [37]. في أنسجة سرطان الرئة ، وجود شذوذ فوق جيني في KEAP1 تطابق الجين بالإضافة إلى طفراته النقطية / LOH مع انتشار التراكم النووي NRF2 في أنسجة NSCLC وكان مرتبطًا بزيادة خطر الإصابة بسرطان الرئة في المرضى الخاضعين للاستئصال جراحيًا [31]. على النقيض من ذلك ، في أنسجة NSCLCs ، فإن KEAP1 لا يبدو أن المثيلة وحدها التي تم تقييمها من قبل QMSP هي علامة تنبؤية مستقلة لنتائج المرض.

يهدف عملنا أولاً إلى تقييم نمط المثيلة لمنطقة المروج KEAP1 في الأنماط النسيجية المختلفة لخطوط خلايا سرطان الرئة عن طريق إجراء تقييم QMSP مقابل تقييم التسلسل الحراري لأول مرة. KEAP1 تم الكشف عن فرط الميثيل في 50 ٪ من خطوط الخلايا NSCLC (على حد سواء ADCs و SqCCs) ، في السرطانات غير النمطية ووصف لأول مرة في 42 ٪ من خطوط الخلايا SCLC. لم يتم الإبلاغ عن النتيجة الأخيرة بعد وكانت مفاجئة ، لأنها تعطي المؤشر الأول للآفات اللاجينية لـ KEAP1 الجين في SCLC. حتى لو كانت هناك مؤشرات مهمة قليلة KEAP1 جاءت التغيرات الجينية في أورام الرئة العصبية الصماوية عالية الدرجة (LCNEC) ذات السمات المشابهة للغدية من عملين حديثين [35،38] ، طفرات نقطة SCLC في KEAP1 و NFE2L2 تبقى الجينات ظاهرة نادرة ، والتشكيل اللاجيني لـ KEAP1 لم يتم توضيح التعبير بعد.

مستويات متغيرة للغاية من KEAP1 تمت ملاحظة مثيلة المروج بواسطة QMSP حتى مستوى القطع في كل خط خلايا الرئة ، بشكل مستقل عن الأنسجة مع عدم وجود ارتباط خطي بين قيم QMSP وقيم التسلسل الحراري (ص = 0.19 لعلاقة بيرسون). ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن العينات التي تمت ميثيلها فوق QMSP وقطوع التسلسل الحراري كانت متداخلة تمامًا تقريبًا ، وفي حالة واحدة فقط (خط خلية H1581) كانت النتيجة غير متوافقة.

حاليًا ، لا يوجد إجماع على أفضل تقنية لـ KEAP1 تقييم المثيلة وعدد مواقع CpG وأي مواقع لها KEAP1 ينبغي تحليل المروجين تبقى قضية مثيرة للجدل في سياق متعدية [7]. هناك العديد من أدوات التشخيص الجزيئي التي يمكن استخدامها لتقييم حالة المثيلة للتأثير على معلومات دقة النوكليوتيدات المفردة حول المناطق الميثيلية من الحمض النووي بعد معالجة بيسلفيت وترجمة هذه النتائج إلى الإعداد السريري [39]. يقوم برنامج QMSP بتضخيم الحمض النووي الميثلي وتحديد مستوى مثيلة الهدف بالنسبة لجينات حفظ المنزل (على سبيل المثال ، ب أكتين). من ناحية أخرى ، يضخم Pyrosequencing الحمض النووي الجيني المحول إلى ثنائي السلفيت باستخدام بادئات مستقلة عن حالة المثيلة ، ويحدد النسبة المئوية لـ CpGs الميثيل بدقة قاعدة واحدة. تمثل كلتا الطريقتين تقنيات بسيطة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة يمكن تنفيذها بسهولة في الممارسة السريرية ، ومع ذلك ، فإن دراسة المثيلة لكل CpG بشكل منفصل يجب أن تكشف عن الاختلافات المفترضة في نمط المثيلة في سرطان الرئة مع أنسجة مختلفة من شأنها أن تفسر عدم وجود علاقة بين QMSP مستويات ومتوسط ​​مثيلة CpG لنفس المنطقة من نفس حالة العينات عن طريق التسلسل الحراري.

الأكثر إثارة للاهتمام ، تحليلنا لنمط وكثافة KEAP1 أظهر مثيلة المروج في خطوط خلايا سرطان الرئة أن مواقع CpG السبعة الأولى (1 & # x020137 ، منطقة P1a) بدت أكثر ميثلة بشكل ملحوظ من مجموعة CpG الستة الأخيرة (8 & # x0201313 ، منطقة P1b) من منطقة المروج P1. بناءً على هذه النتائج ، يكون لها تأثير وتأثير أقوى على KEAP1 يجب افتراض مستوى التعبير من خلال مواقع CpG 1-7 الموجودة في المنطقة الفرعية الحرجة الأقرب إلى موقع بدء النسخ (TSS) للجين (P1a). تفسير محتمل مثير للفضول هو أنه في منطقة P1a تم تعيين موقعين مفترضين للربط لـ Sp1 و AP2 [29،40] ، وهما عاملان لنسخ إصبع الزنك يساهمان في نشاط النسخ الحاسم لهذا الجين [41]. نتيجة لذلك ، افترضنا أن فرط الميثيل P1 KEAP1 قد يؤدي المروج إلى فقدان ارتباط SP-1 و AP-2 عن طريق تثبيط تعبيره في أول موقعين و 4 و 5 من CpG في خلايا سرطان الرئة التي تم تحليلها ، على التوالي [29 ، 40].

في هذه الدراسة أكدنا أيضًا أن الإسكات اللاجيني لـ KEAP1 بواسطة مثيلة المروج يلعب دورًا حاسمًا في تعديل KEAP1 نشاط النسخ. علاقة عكسية بين KEAP1 تم توضيح مستويات mRNA ومستويات المثيلة من خلال العلاج في المختبر 5 & # x02032-azacytidine على خلايا carcinoid و SCLC و ADC ، مما يدعم الفكرة العامة بأن تسلسل الإجماع للعديد من مواقع النسخ قد تم تمييزه في التحكم اللاجيني لـ KEAP1.

يفتح هذا التحليل النقاش حول عدد مواقع CpG الخاصة بـ KEAP1 يجب تحليل المروج لوضع حد للقطع السريري في المرضى المصابين بسرطان الرئة. المزيد من التحليلات المستقبلية في أنسجة سرطان الرئة جارية لتحديد ما إذا كانت بعض مواقع CpG المحددة KEAP1قد يكون لهما دور تنبؤي أو تنبؤي أفضل في مرضى سرطان الرئة ، سواء كان مزيجًا منهم حتى لو لم يكن متتاليًا.


نتائج ومناقشة

كان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها مع التقنيات المعتمدة على الثقافة والمستقلة عن الثقافة. تأكدنا من أن العينات المختبرة كانت غير متجانسة ، من خلال جمع العنب من ثلاثة أنظمة إنتاج مختلفة لتحليلها باستخدام هذه التقنيات.

التنوع البيولوجي لخمائر العنب

إجمالاً ، قمنا بعزل 1200 مستعمرة ، 1121 منها تمكنا من تحديدها: تبين أن العزلات تنتمي إلى عشرة أنواع مختلفة بواسطة طريقة PCR-ITS-RFLP المعتمدة على الثقافة [14] (الجدول 4). كانت الأنواع الأكثر تحديدًا يوفاروم / ك. قمة (66.5٪ من جميع العزلات) و جيم زيمبلينينا (23.55٪ من مجموع العزلات). الآخر غير-السكريات الأنواع الموجودة كانت Kluyveromyces thermotolerans ، Cryptoccocus magnus ، Sporobolomyces roseus ، Aureobasidium pullulans ، Bulleromyces albus ، M. pulcherrima، و Rhodoturula nothofagi. هذه الأنواع هي الأكثر وصفًا في الدراسات المنشورة ، ولكن تم الإبلاغ عن وجودها بترددات مختلفة جدًا [10 ، 20]. خميرة الخميرة لم يكن معزولا عن أي من حصد العنب. تتوافق هذه النتيجة مع الندرة الشديدة المبلغ عنها لـ S. cerevisiae على العنب [24].

لمحات PCR-DGGE لـ 26S rRNA المضخم من العينات التي تم جمعها من البيئة البيئية (ه)، عضوي (ا) والتقليدية (ج) مزارع الكروم قبل التخمير الكحولي (T1) ، في منتصف الطريق (T2) ، وثلثي الطريق من خلال (T3) التخمير. استند تحديد الهوية إلى مقارنة BLASTn للتسلسلات التي تم الحصول عليها من نطاقات PCR-DGGE مع GenBank: Hanseniaspora uvarum (H.u) Candida zemplinina (C.z) ، Botryotinia fuckeliana (B.) Aureobasidium pullulans (A.p). Cladosporium sp. (cl.). Saccharomyces cerevisiae (S.c) Alternaria sp (A.). العصابات المشتركة بين جميع العزلات (المسمى ssDNA) هي قطع أثرية من الحمض النووي أحادي الجديلة

لمحات PCR-DGGE لـ 26S rRNA المضخم من العينات التي تم جمعها من البيئة البيئية (ه)، عضوي (ا) والتقليدية (ج) مزارع الكروم قبل التخمير الكحولي (T1) ، في منتصف الطريق (T2) ، وثلثي الطريق من خلال (T3) التخمير. استند تحديد الهوية إلى مقارنة BLASTn للتسلسلات التي تم الحصول عليها من نطاقات PCR-DGGE مع GenBank: Hanseniaspora uvarum (H.u) Candida zemplinina (C.z) ، Botryotinia fuckeliana (B.) Aureobasidium pullulans (A.p). Cladosporium sp. (cl.). Saccharomyces cerevisiae (S.c) Alternaria sp (A.). العصابات المشتركة بين جميع العزلات (المسمى ssDNA) هي قطع أثرية من الحمض النووي أحادي الجديلة

في المجموع ، تم إنشاء 57،048 قراءة أولية أطول من 250 نقطة أساس من خلال 454 تحليل تسلسل حراري. تمت إزالة القراءات التي لا تفي بمعايير الجودة (راجع "المواد والأساليب") تم الاحتفاظ بـ 32.527 قراءة متسلسلة عالية الجودة للتحليلات اللاحقة. تم الحصول على ما بين 1582 و 9404 قراءات تسلسلية عالية الجودة لكل عينة (الجدول 3). تم إجراء التطبيع للحصول على نفس عدد القراءات لكل عينة للتقدير الكمي للتنوع. قمنا بعد ذلك بتجميع القراءات عالية الجودة وفقًا لتشابهها ، مع إعطاء 87-387 وحدة OTU لكل عينة (الجدول 3).

ملخص لـ 454 من بيانات التسلسل الحراري ، وثراء OTU التقديري ، وتغطية العينة ، والمؤشرات (Chao1 ، و ACE ، و Shannon) لمكتبات الحمض النووي الريبي 18S الفطرية من عينات عنب شاردونيه

نظام الزراعة. عضوي . ايكوفيتو. عادي .
وقت الحصول على العينات . T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
يقرأ الخام 5,660 4,446 2,817 5,512 6,745 13,456 6,370 4,952 7,090
يتم الاحتفاظ بقراءات عالية الجودة بعد خطوات التصفية 3,295 2,390 1,582 3,091 3,217 9,404 3,308 2,836 3,404
يتم الاحتفاظ بقراءات عالية الجودة بعد خطوة التجانس 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582
عدد OTUs (مستوى المسافة 3٪) - مستوى الجنس 330 124 102 387 146 87 285 90 95
مؤشر التنوع شانون 3.85 1.72 1.59 4.08 1.31 1.31 3.65 1.90 1.89
مؤشر ثراء Chao1 1,023 359 287 1,273 408 301 913 405 326
مؤشر ثراء إيس 1,130 416 250 1,450 489 351 1,017 370 298
خروج 0.27 0.60 0.65 0.26 0.61 0.67 0.36 0.60 0.58
نظام الزراعة. عضوي . ايكوفيتو. عادي .
وقت الحصول على العينات . T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
يقرأ الخام 5,660 4,446 2,817 5,512 6,745 13,456 6,370 4,952 7,090
يتم الاحتفاظ بقراءات عالية الجودة بعد خطوات التصفية 3,295 2,390 1,582 3,091 3,217 9,404 3,308 2,836 3,404
يتم الاحتفاظ بقراءات عالية الجودة بعد خطوة التجانس 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582
عدد OTUs (مستوى المسافة 3٪) - مستوى الجنس 330 124 102 387 146 87 285 90 95
مؤشر التنوع شانون 3.85 1.72 1.59 4.08 1.31 1.31 3.65 1.90 1.89
مؤشر ثراء Chao1 1,023 359 287 1,273 408 301 913 405 326
مؤشر ثراء إيس 1,130 416 250 1,450 489 351 1,017 370 298
خروج 0.27 0.60 0.65 0.26 0.61 0.67 0.36 0.60 0.58

خروج: ج x = 1 − (ن x/ن)، أين ن x هو عدد القراءات الفريدة عالية الجودة و ن هو العدد الإجمالي للقراءات عالية الجودة

خروج تغطية العينة المقدرة ، OTU وحدة التصنيف التشغيلية

ملخص لـ 454 من بيانات التسلسل الحراري ، وثراء OTU التقديري ، وتغطية العينة ، والمؤشرات (Chao1 ، و ACE ، و Shannon) لمكتبات الحمض النووي الريبي 18S الفطرية من عينات عنب شاردونيه

نظام الزراعة. عضوي . ايكوفيتو. عادي .
وقت الحصول على العينات . T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
يقرأ الخام 5,660 4,446 2,817 5,512 6,745 13,456 6,370 4,952 7,090
يتم الاحتفاظ بقراءات عالية الجودة بعد خطوات التصفية 3,295 2,390 1,582 3,091 3,217 9,404 3,308 2,836 3,404
يتم الاحتفاظ بقراءات عالية الجودة بعد خطوة التجانس 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582
عدد OTUs (مستوى المسافة 3٪) - مستوى الجنس 330 124 102 387 146 87 285 90 95
مؤشر التنوع شانون 3.85 1.72 1.59 4.08 1.31 1.31 3.65 1.90 1.89
مؤشر ثراء Chao1 1,023 359 287 1,273 408 301 913 405 326
مؤشر ثراء إيس 1,130 416 250 1,450 489 351 1,017 370 298
خروج 0.27 0.60 0.65 0.26 0.61 0.67 0.36 0.60 0.58
نظام الزراعة. عضوي . ايكوفيتو. عادي .
وقت الحصول على العينات . T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
يقرأ الخام 5,660 4,446 2,817 5,512 6,745 13,456 6,370 4,952 7,090
يتم الاحتفاظ بقراءات عالية الجودة بعد خطوات التصفية 3,295 2,390 1,582 3,091 3,217 9,404 3,308 2,836 3,404
يتم الاحتفاظ بقراءات عالية الجودة بعد خطوة التجانس 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582 1,582
عدد OTUs (مستوى المسافة 3٪) - مستوى الجنس 330 124 102 387 146 87 285 90 95
مؤشر التنوع شانون 3.85 1.72 1.59 4.08 1.31 1.31 3.65 1.90 1.89
مؤشر ثراء Chao1 1,023 359 287 1,273 408 301 913 405 326
مؤشر ثراء إيس 1,130 416 250 1,450 489 351 1,017 370 298
خروج 0.27 0.60 0.65 0.26 0.61 0.67 0.36 0.60 0.58

خروج: ج x = 1 − (ن x/ن)، أين ن x هو عدد القراءات الفريدة عالية الجودة و ن هو العدد الإجمالي للقراءات عالية الجودة

خروج تغطية العينة المقدرة ، OTU وحدة التصنيف التشغيلية

منحنيات التخلخل لإجمالي قراءات 18S rDNA عالية الجودة من عينات عنب شاردونيه (عضوي ا، ecophyto ه، والتقليدية ج) عند مستوى مسافة 3٪ (أ) ومنحنيات الندرة التي تم تطبيعها فيما يتعلق بأحجام مكتبة 18S rDNA عالية الجودة على مستوى مسافة 3٪ (ب)

منحنيات التخلخل لإجمالي قراءات 18S rDNA عالية الجودة من عينات عنب شاردونيه (عضوي ا، ecophyto ه، والتقليدية ج) عند مستوى مسافة 3٪ (أ) ومنحنيات الندرة التي تم تطبيعها فيما يتعلق بأحجام مكتبة 18S rDNA عالية الجودة على مستوى مسافة 3٪ (ب)

مقارنة بين التقنيات الجزيئية المختلفة المستخدمة لوصف التنوع الفطري لثلاثة أنظمة مختلفة لإنتاج العنب (عضوي ، بيئي ، وتقليدي)

نظام الزراعة. عضوي . ايكوفيتو. عادي .
وقت الحصول على العينات . T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
التقنيات. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE.
Hanseniaspora uvarum56.7 85.00 + 80.3 51.00 ++ 79.4 73.50 ++ 6.4 62.00 + 92.0 96.00 +++ 48.8 88.00 ++ 29.3 43.00 + 50.2 5.00 + 40.7 +
المبيضات زيمبلينينا10.6 13.00 + 19.4 8.50 + 18.2 26.50 + 0.8 + 3.3 0.8 49.0 52.00 ++ 49.8 57.50 ++ 59.3 100.00 ++
خميرة الخميرة 0.4 0.9 + 34.5 12.00 ++
Aureobasidium pullulans20.3 + 52.6 7.40 + 14 +
Metschnikowia pulcherrima3.5 1.70 0.1 2.4 26.00 3 4.70
Sporobolomyces roseus2.1 18.50 7.2 3.70 4.00 20.00
Bulleromyces ألبوس 21.00 17.50
Torulaspora delbrueckii0.5 0.3 1.5 3.7 15.9
المستخفية العظمى6.1 1.40 30.5 5
نظام الزراعة. عضوي . ايكوفيتو. عادي .
وقت الحصول على العينات . T1. T2. T3. T1. T2. T3. T1. T2. T3.
التقنيات. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE. PYRO (٪). PCR ITS (٪). DGGE.
Hanseniaspora uvarum56.7 85.00 + 80.3 51.00 ++ 79.4 73.50 ++ 6.4 62.00 + 92.0 96.00 +++ 48.8 88.00 ++ 29.3 43.00 + 50.2 5.00 + 40.7 +
المبيضات زيمبلينينا10.6 13.00 + 19.4 8.50 + 18.2 26.50 + 0.8 + 3.3 0.8 49.0 52.00 ++ 49.8 57.50 ++ 59.3 100.00 ++
خميرة الخميرة 0.4 0.9 + 34.5 12.00 ++
Aureobasidium pullulans20.3 + 52.6 7.40 + 14 +
Metschnikowia pulcherrima3.5 1.70 0.1 2.4 26.00 3 4.70
Sporobolomyces roseus2.1 18.50 7.2 3.70 4.00 20.00
Bulleromyces ألبوس 21.00 17.50
Torulaspora delbrueckii0.5 0.3 1.5 3.7 15.9
المستخفية العظمى6.1 1.40 30.5 5

PYRO 454 تسلسل حراري لجينات الرنا الريباسي 18S ، PCR ITS PCR-5.8S-ITS –RFLP ، DGGE PCR- DGGE من جينات الرنا الريباسي 26S

Comparison of the various molecular techniques used to characterize the fungal diversity of three different grape production systems (organic, ecophyto, and conventional)

Farming system . Organic . Ecophyto . Conventional .
Sampling time . T1 . T2 . T3 . T1 . T2 . T3 . T1 . T2 . T3 .
Techniques . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE .
Hanseniaspora uvarum56.7 85.00 + 80.3 51.00 ++ 79.4 73.50 ++ 6.4 62.00 + 92.0 96.00 +++ 48.8 88.00 ++ 29.3 43.00 + 50.2 5.00 + 40.7 +
Candida zemplinina10.6 13.00 + 19.4 8.50 + 18.2 26.50 + 0.8 + 3.3 0.8 49.0 52.00 ++ 49.8 57.50 ++ 59.3 100.00 ++
خميرة الخميرة 0.4 0.9 + 34.5 12.00 ++
Aureobasidium pullulans20.3 + 52.6 7.40 + 14 +
Metschnikowia pulcherrima3.5 1.70 0.1 2.4 26.00 3 4.70
Sporobolomyces roseus2.1 18.50 7.2 3.70 4.00 20.00
Bulleromyces albus 21.00 17.50
Torulaspora delbrueckii0.5 0.3 1.5 3.7 15.9
Cryptococcus magnus6.1 1.40 30.5 5
Farming system . Organic . Ecophyto . Conventional .
Sampling time . T1 . T2 . T3 . T1 . T2 . T3 . T1 . T2 . T3 .
Techniques . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE . PYRO (%) . PCR ITS (%) . DGGE .
Hanseniaspora uvarum56.7 85.00 + 80.3 51.00 ++ 79.4 73.50 ++ 6.4 62.00 + 92.0 96.00 +++ 48.8 88.00 ++ 29.3 43.00 + 50.2 5.00 + 40.7 +
Candida zemplinina10.6 13.00 + 19.4 8.50 + 18.2 26.50 + 0.8 + 3.3 0.8 49.0 52.00 ++ 49.8 57.50 ++ 59.3 100.00 ++
خميرة الخميرة 0.4 0.9 + 34.5 12.00 ++
Aureobasidium pullulans20.3 + 52.6 7.40 + 14 +
Metschnikowia pulcherrima3.5 1.70 0.1 2.4 26.00 3 4.70
Sporobolomyces roseus2.1 18.50 7.2 3.70 4.00 20.00
Bulleromyces albus 21.00 17.50
Torulaspora delbrueckii0.5 0.3 1.5 3.7 15.9
Cryptococcus magnus6.1 1.40 30.5 5

PYRO 454 pyrosequencing of 18S rRNA genes, PCR ITS PCR-5.8S-ITS –RFLP, DGGE PCR- DGGE of 26S rRNA genes

Relative abundances, based on the taxonomic assignation of high-quality 18S rDNA reads of fungi from Chardonnay grape samples (organic ا, ecophyto ه, and conventional ج), for the 16 major genera detected before alcoholic fermentation (T1), and midway (T2), and two-thirds of the way through (T3) alcoholic fermentation

Relative abundances, based on the taxonomic assignation of high-quality 18S rDNA reads of fungi from Chardonnay grape samples (organic ا, ecophyto ه, and conventional ج), for the 16 major genera detected before alcoholic fermentation (T1), and midway (T2), and two-thirds of the way through (T3) alcoholic fermentation

Relative abundances, based on the taxonomic assignment of high-quality 18S rDNA reads for the fungi in Chardonnay grape samples (organic ا, ecophyto ه, and conventional ج), for the first 17 minor genera detected before alcoholic fermentation (T1), and midway (T2), and two-thirds of the way through (T3) alcoholic fermentation

Relative abundances, based on the taxonomic assignment of high-quality 18S rDNA reads for the fungi in Chardonnay grape samples (organic ا, ecophyto ه, and conventional ج), for the first 17 minor genera detected before alcoholic fermentation (T1), and midway (T2), and two-thirds of the way through (T3) alcoholic fermentation

Changes in biodiversity during alcoholic fermentation

Although results should be taken with cautious since no duplicate have been performed, all three methods showed a decrease in biodiversity during alcoholic fermentation, consistent with previous reports [ 28]. Indeed, as fermentation progresses, the biodiversity of the yeast community decreases as shown by the richness indices (Table 3), with the emergence of a dominant species [ 15, 33]. However, differences were observed in the results obtained with the different techniques (Table 4). For example, for all three sampling times, the culture-dependent method showed C. zemplinina to be the dominant species in conventional production system samples. High-throughput sequencing results indicated that, for this production system, H. uvarum accounted for 49.47 and 40.01 % of the total yeast population at T2 and T3, respectively (Table 4). DGGE also confirmed the presence of Hanseniaspora at T2 and T3. This suggests that culture-dependent identification approaches may lead to incorrect interpretation.

For the organic production system, we identified five species at T2, and only two at T3 (H. uvarum و C. zemplinina) by PCR-ITS-RFLP. The sequencing of amplified 18S rRNA gene fragments resulted in the identification of three species at T2 and five at T3. The two major species were identified by all three techniques, but pyrosequencing also identified minority species occurring at T3, such as S. cerevisiae, Torulaspora delbrueckii، و M. pulcherrima, which were not detected by either PCR-ITS-RFLP or DGGE.

For the ecophyto production system, only two species were identified by PCR-ITS-RFLP at T2. One of these species, S. roseus, was not detected by DGGE or pyrosequencing. High-throughput sequencing revealed the presence of three minor species (C. zemplinina, S. cerevisiae, T. delbrueckii) two of which were undetectable with the two other techniques, the remaining species, S. cerevisiae, being detected by DGGE. At T3, S. cerevisiae was detected, but was present at low levels, with H. uvarum identified as the majority species by PCR-ITS-RFLP. Based on the sequencing results, السكريات accounts for up to one-third of the total population, whereas Torulaspora accounts for 15 % of the total population. لكن، Torulaspora was not identified by the other two methods. For the conventional production system, no H. uvarum was detected by PCR-ITS-RFLP at T3, with C. zemplinina considered to account for 100 % of the population at this time point, in analyses carried out with this technique. By contrast, both DGGE and 454 pyrosequencing techniques revealed the presence of H. uvarum at this time point.

Grape samples from the three production systems considered differed in terms of yeast biodiversity, with potential effects on population dynamics during alcoholic fermentation, consistent with previous findings [ 11, 12, 25]. However, firm conclusions about the influence of production system on yeast biodiversity would require the analysis of a very large number of samples. Indeed, the trends observed may reflect sample variation rather than differences due to the production system [ 36], and it would be very difficult to draw any firm conclusions on the effect of production system from our data. Nevertheless, it would be of considerable interest to test this hypothesis in future studies.

The three methods gave different results. This was not unexpected, as such differences have already been reported for comparisons between DGGE and isolation by culture [ 30], and between culture-dependent methods and ARISA [ 36].

Our results demonstrate that culture-dependent identification methods detect fewer species than other methods. Indeed, the number of species identified by the ITS-RFLP analysis of isolates was similar to the number of species identified by DGGE, but far lower than that identified by the high-throughput sequencing of amplicons (Figs. 3, 4). The metagenomic approach based on the 454 pyrosequencing of amplified 18S rRNA genes revealed much greater fungal diversity than previously described, particularly for mold species, although some of the species identified were present at very low densities (Figs. 3, 4). This detection of greater community diversity than documented by other methods indicates the superiority of metagenomic approaches.

The findings of this study suggest that culture-dependent methods are not the most appropriate methods for studies of yeast biodiversity. Indeed, yeasts differ considerably in their ability to grow on standard media and this may lead to the unintentional selection of certain species. PCR-DGGE is not suitable for use in biodiversity studies either because it is not quantitative. Nevertheless, the profile of yeasts determined with this technique was very similar to that obtained by the high-throughput sequencing technique. Our results suggest that DGGE cannot detect yeast species present at a frequency of <8 % of the total population. The results of this study also demonstrate that metagenomic sequencing is a very powerful method for studies of the biodiversity of yeasts in musts and during alcoholic fermentation. Indeed, high-throughput sequencing makes it possible to analyze large numbers of samples rapidly and may therefore be a good approach for further investigations of the recently reported variability between vineyards [ 36].


شاهد الفيديو: مستويات التنظيم في الكائن الحي (كانون الثاني 2022).