معلومة

مقايسة ترسيب كبريتات الأمونيوم اعتماد الأس الهيدروجيني


بشكل عام ، هل يؤثر الرقم الهيدروجيني على الترسيب ، على سبيل المثال من شأنه أن يتسبب الرقم الهيدروجيني 6 في هطول أقل من الرقم الهيدروجيني 7.5. أم أنهم غير مرتبطين؟


أعتقد أنه سيؤثر على بعض البروتينات ، لكن ترسيب كبريتات الأمونيوم يتطلب عادةً كميات كبيرة من الملح ، بحيث يتعين عليك إضافة قطعة أرض من القاعدة لضبط الأس الهيدروجيني.

عندما أقوم بترسيب كبريتات الأمونيوم ، يكون ذلك لأخذ قطعة تقريبية من البروتينات من خلية كاملة / محلول عضو كامل - إنها أشبه بمطرقة أكثر من ملقاط فيما يتعلق بتنقية البروتين. أفضل استخدام راتينج بلاستيكي مشحون أو عمود تغيير الحجم إذا كنت مهتمًا بالتنقية الكهروضوئية.


ترسيب كبريتات الأمونيوم للفيروس الغدي المؤتلف من وسط المزرعة: طريقة سهلة لزيادة العائد الإجمالي للفيروس

في غالبية طرق تنقية الفيروسات الغدية المؤتلفة (rAds) وتركيزها ، يتم حصاد الفيروس المرتبط بالخلايا المساعدة ، بينما يتم التخلص من الفيروس الموجود في وسط زراعة الخلايا. أثناء الانتشار الروتيني لنواقل الفيروس الغدي من النوع 5 في ظروف محسّنة ، لاحظنا أنه في المتوسط ​​، يوجد 47 ٪ من إجمالي كمية الفيروس في وسط الثقافة. لاستعادة وتركيز هذه rAds من الوسط ، ابتكرنا طريقة تعتمد على كبريتات الأمونيوم ((NH4)2وبالتالي4) ترسب. بنسبة 40٪ (NH4)2وبالتالي4 التشبع ، 95 ± 6٪ من الفيروس المتاح يترسب من الوسط ، بينما غالبية البروتين (85٪) يبقى في المحلول. على عكس ترسيب الفيروس الغدي مع البولي إيثيلين جلايكول ، فإن (NH4)2وبالتالي4تسمح تقنية الترسيب بجمع rAds المترسبة عن طريق الترشيح. نوضح هنا أن (NH4)2وبالتالي4 يعتبر ترسيب rAds من وسط زراعة الخلايا تقنية بسيطة وسريعة يمكن استخدامها مع طرق عزل الفيروس القياسية لزيادة إنتاجية rAds.

منذ حوالي 30 عامًا ، وصف Winters و Russell1 طريقة لتنقية الفيروسات الغدية التي لا تزال مستخدمة كثيرًا. إنها تستخدم كلوريد السيزيوم (CsCl) تنبذ فائق متدرج الكثافة لجزيئات الفيروسات الغدية المرتبطة بالخلايا. على الرغم من أنه يمكن الحصول على دفعات من الفيروسات الغدية النقية ذات العيار العالي ، إلا أن الطريقة تستغرق وقتًا طويلاً ويصعب توسيع نطاقها. مع ظهور العلاج الجيني ، أصبحت إجراءات إنتاج وتنقية الفيروس الغدي المؤتلف على نطاق واسع ضرورية. تم استخدام gradients3 أو تدرجات CsCl المعدلة لتدرجات السكروز .45 في الدراسات اللاحقة ، تم استخدام كروماتوجرافيا العمود على أساس استبعاد الحجم ، أو تبادل الأنيون ، أو التفاعل الكارهة للماء أو راتنجات مخلبية للمعادن. الفيروس الغدي المرتبط بالخلايا المضيفة. ومع ذلك ، فإن كمية كبيرة من الفيروس لا ترتبط بالخلايا ، ولكنها توجد في وسط المزرعة. كشفت التحليلات في مرفق النواقل الفيروسية في LUMC عن وجود كميات كبيرة (25-80٪) من نواقل الفيروسات الغدية في وسط زراعة الخلايا (الجدول 1) ، حتى في ظل ظروف الإنتاج المثلى. على الرغم من اختلاف كمية الفيروس في الوسط ، في المتوسط ​​47٪ (ن = 19) من الفيروس إذا تم عزل الجزء المرتبط بالخلية فقط. يشير هذا إلى أنه في الواقع ، غالبًا ما يتم إهدار جزء مربح من العائد الكلي.

لتركيز الفيروس من الوسط ، يمكن ترسيبه باستخدام البولي إيثيلين جلايكول 6000 (PEG-6000) .89 في هذه الحالة ، ومع ذلك ، يجب جمع راسب الفيروس عن طريق الطرد المركزي. لذلك ، سعينا إلى طريقة تسمح باسترداد الفيروس من الوسط عن طريق الترشيح ، للتحايل على الطرد المركزي لكميات كبيرة نسبيًا من الوسط. في هذا التقرير ، قمنا بتقييم استخدام كبريتات الأمونيوم ((NH4)2وبالتالي4) 1011 في المحاولة الأولى ، يتراوح نطاق من 0-100٪ (NH4)2وبالتالي4 تم اختبار التشبع بخطوات زيادة قدرها 10٪ لترسيب Ad5CMVLuc ، وهو فيروس غدي مؤتلف يحمل جين لوسيفيراز من وسط المزرعة. بتركيزات تصل إلى 30٪ تشبع ، ظل الفيروس في الوسط ، ولكن عند 40٪ تشبع أو أعلى ، سرع الفيروس بالكامل تقريبًا (البيانات غير معروضة). لتحسين الظروف ، تم اختبار قيم التشبع حول نقطة 40٪. كان وسط الثقافة مشبعًا على مدى 30-42٪ نطاق تشبع بزيادات 2٪. تم تقييم وجود Ad5CMVLuc سليمة في الكسور المختلفة عبر مستوى التعبير عن جين مراسل لوسيفيراز (الشكل 1). بدأ هطول الفيروس الغدي عند 36٪ (NH4)2وبالتالي4 واكتمل التشبع بنسبة 40٪ ، مع نشاط نسبي للوسيفيراز بنسبة 130٪. خلال نطاق التشبع هذا ، انخفض نشاط اللوسيفيراز المتحصل عليه من الفيروس المتبقي في الوسط إلى 11٪. ومن اللافت للنظر أن الانتعاش الظاهر أعلى من الحد الأقصى المتوقع ويمكن تفسيره بتنقية مخزون الفيروس. تم الإبلاغ عن ملاحظات مماثلة أثناء عزل الفيروس الغدي من محللات الخلية ، 3 وعزل الفيروس القهقري من الوسط .12 في هذه الدراسات ، تم إرجاع النشاط المتزايد إلى إزالة مثبطات العدوى الفيروسية. ومع ذلك ، فإن دفعات الفيروسات الغدية التي تم ترسيبها بنسبة 40٪ (NH4)2وبالتالي4 كان للتشبع نسبة OD260 / 280 تبلغ 0.6 (البيانات غير معروضة). بالمقارنة مع النسبة 1.2-1.3 لمجموعات الفيروسات الغدية النقية 7 ، يشير هذا إلى وجود كميات كبيرة من البروتين.

نشاط Luciferase كمؤشر لمقدار Ad5CMVLuc المترسب من وسط الثقافة بنسبة 30-42٪ (NH4)2وبالتالي4 التشبع. سلسلة من 4.4 - 6.4 جم (NH4)2وبالتالي4 (تم شراؤه من JT Baker ، Deventer ، هولندا) إلى وسط استزراع سعة 25 مل لتحقيق تشبع بنسبة 30-42٪ .11 تم تحضين المحلول لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة الغرفة ، وبعد ذلك تم ترسيب الراسب بالطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 1614 جم. تم إذابة الحبيبات في 1 مل PBS تحتوي على 2٪ مصل حصان. تم إجراء غسيل الكلى بين عشية وضحاها لعينات طافية ومترسبة مذابة في 1 × TD-buffer (25 م M تريس ، 137 م M كلوريد الصوديوم ، 5 م M بوكل ، 0.73 م M Na2HPO4، 0.9 م كاكل20.5 م MgCl2 الرقم الهيدروجيني 7.45). تم استخدام هذه العينات لإصابة خلايا HepG2 ، والتي تم تحللها بعد 48 ساعة من الإصابة وتحليلها لنشاط اللوسيفيراز ، كما هو موضح سابقًا. وسط الثقافة. تمثل الأشرطة السوداء جزء Ad5CMVLuc الموجود في الأعمدة الرمادية المترسبة الكسر في المادة الطافية.

للحصول على مزيد من المعلومات حول قدرة التنقية لهذه الطريقة ، حددنا كميات البروتين التي تم ترسيبها من وسط مزرعة يحتوي على 10٪ FCS على مدى تشبع من 0 إلى 80٪ (NH4)2وبالتالي4. كما هو مبين في الشكل 2 ، عند 40٪ تشبع ، تم ترسيب 15٪ من البروتين المتاح. تم الحصول على نتائج متطابقة بشكل أساسي مع وسط من الخلايا المصابة بالفيروس. وهكذا في هذه الظروف ، يتم فصل غالبية البروتينات الموجودة في الوسط عن الفيروس.

ترسبت كسور البروتين من وسط المزرعة عند مختلف (NH4)2وبالتالي4 تركيزات. تم تشبع عينات من 25 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المحتوية على 10٪ من مصل العجل الجنيني (FCS) بالنسب المحددة: 10٪: 1.4 جرام ، 20٪: 2.9 جرام ، 30٪: 4.4 جرام ، 38٪: 5.7 جرام 40٪: 6.1 جرام ، 42٪: 6.4 جرام ، 50٪: 7.8 جرام ، 60٪: 9.8 جرام ، 70٪: 11.8 جرام ، 80٪: 14 جرام (NH4)2وبالتالي4.11 بعد 2.5 ساعة من الحضانة عند درجة حرارة الغرفة ، تم ترسيب الراسب بالطرد المركزي (15 دقيقة عند 1614 جم). تم إذابة الحبيبات في برنامج تلفزيوني ، وبعد ذلك تم تحديد الكمية المعزولة من البروتين عن طريق مقايسة بروتين برادفورد. يعتبر إجمالي كمية البروتين الموجودة في عينة سعة 25 مل 100٪.

في حالة الإنتاج واسع النطاق ، الذي يتضمن عدة لترات من الوسائط المحتوية على فيروسات ، تشكل خطوة الطرد المركزي قيدًا في إعدادات المختبر العادية. يمكن أن يكون الترشيح بديلاً عمليًا لعزل راسب rAd من الأحجام المتوسطة الكبيرة. لذلك ، قمنا بمقارنة استرداد (NH4)2وبالتالي4- والفيروس الغدي المترسب PEG-6000 بعد العزل بالطرد المركزي أو الترشيح. تم ترسيب Ad5CMVLacZ بنسبة 40٪ (NH4)2وبالتالي4 تم مسح التشبع أو 10 ٪ PEG-6000 والمترسب الناتج من الوسط عن طريق الطرد المركزي ، عن طريق الترشيح فوق مرشح غشاء 0.45 ميكرومتر ، أو عن طريق الترشيح فوق ورق ترشيح Whatman 3MM. كما هو مبين في الشكل 3 أ ، يمكن أن يترسب الفيروس المتاح بالكامل تقريبًا مع (NH4)2وبالتالي4. تم الحصول على استرداد بنسبة 90 ٪ عندما تم ترسيب الراسب بالطرد المركزي. كان التعافي من راسب PEG-6000 عن طريق الطرد المركزي أقل بقليل (84٪ انتعاش). ومع ذلك ، كشف الترشيح عن اختلاف أكثر وضوحًا بين طريقتي الترسيب. اجتاز راسب PEG-6000 المرشحات دون عوائق تقريبًا: تشكل البقايا 3-4٪ فقط من محصول البداية. ومع ذلك ، فإن (NH4)2وبالتالي4 تم الاحتفاظ بالمادة المترسبة على المرشح بكفاءة عالية. على الرغم من أن العائد من المادة المتبقية كان أقل من العائد الذي تم الحصول عليه بعد الطرد المركزي ، إلا أن الاسترداد كان لا يزال 46٪ و 61٪ من مادة البداية ، في حالة مرشح 3 مم ومرشح 0.45 ميكرومتر ، على التوالي. لا يتم تعويض الاسترداد المنخفض من الوسط عن طريق الترشيح مقارنة بالطرد المركزي من خلال ارتفاع نسبة الفيروس المتبقية في المرشح. قد يشير هذا إلى أن الخسارة لا يمكن أن تُعزى إلى قصور غير كافٍ في عامل التصفية ، بل إلى استعادة الفيروسات دون المستوى الأمثل من عامل التصفية.

الانتعاش وعائد rAd المترسب من وسط الثقافة. (أ) كفاءة الاسترداد لـ Ad5CMVLacZ المترسبة من وسط الثقافة بواسطة (NH4)2وبالتالي4 أو PEG-6000 ومعزولة بالطرد المركزي أو الترشيح. 6.1 جرام (NH4)2وبالتالي4 يذوب في وسط مستنبت 25 مل. بعد فترة حضانة 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، تم ترسيب المادة المترسبة من الخليط بخطوة طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 1614 جم ، أو عن طريق الترشيح الفراغي باستخدام إما مرشح غشاء 0.45 ميكرومتر (Schleicher & amp Schuell ، Dassel ، ألمانيا) ، أو مرشح ورقي 3 مم (Whatman International Ltd ، Maidstone ، المملكة المتحدة). تم إجراء ترسيب PEG كما هو موضح سابقًا مع تعديلات طفيفة. باختصار ، تم خلط 25 مل من 20٪ (وزن / حجم) PEG-6000 (BDH ، Poole ، المملكة المتحدة) في محلول 2.5 مولار كلوريد الصوديوم مع وسط ثقافة 25 مل. بعد الحضانة لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية ، تم ترسيب الراسب بخطوة طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 16300 جم أو عن طريق الترشيح الفراغي باستخدام إما مرشح غشاء 0.45 ميكرومتر أو مرشح 3 مم. تم إذابة عينات البقايا أو الحبيبات في 2 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2 ٪ من H2S. تم غسيل جميع العينات ، وبعد ذلك تم تحديد عيارها عن طريق فحص البلاك على 911 خلية. لحساب الاسترداد ، كانت الغلات مرتبطة بكمية الفيروس الغدي الموجود في 25 مل من الوسط الأصلي. تمثل الأشرطة السوداء الجزء الفيروسي في البقايا أو الأشرطة الرمادية الحبيبية التي تمثل الجزء الفيروسي الموجود في المرشح أو المادة الطافية. (ب) مقارنة عائدات الفيروس ، معبراً عنها بجزيئات فيروسية (vp) ، معزولة عن الجزء المرتبط بالخلية أو مترسبة من وسط الثقافة. تم تحليل العديد من العينات المذكورة في الشكل 3 أ ، بواسطة HPLC ، كما هو موضح من قبل Shabram et al. تم إجراء HPLC باستخدام وحدة Alliance Separation 2690 المجهزة بكاشف صفيف الصمام الثنائي الضوئي (PDA 996) (Waters ، Milford ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). كانت قمم الفيروس في جميع العينات بنسب OD260 / 280 بين 1.15 و 1.34. تم إجراء القياس الكمي عن طريق دمج منطقة ذروة الفيروس عند 260 نانومتر بمساعدة برنامج Millennium 32 Software (Waters). تم استقراء المحصول الذي تم الحصول عليه من وسط استنبات 25 مل إلى حجم الإنتاج بالكامل ، وعلى هذا النحو ، مقارنة مع الناتج من الجزء المرتبط بالخلايا.

تم استخدام تحليل HPLC لتحديد تركيزات الجسيمات للعينات المذكورة أعلاه وتمت مقارنة الغلة مع العائد الإجمالي لجزيئات الفيروس (vp) من محللة الخلية (الشكل 3 ب). كان العائد من محللة الخلية تقريبًا نفس العائد الذي تم الحصول عليه من الوسط بعد الترشيح باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر ، 52 ٪ عكس 48٪. وتجدر الإشارة ، مع ذلك ، إلى أنه تم شفاء 61٪ فقط من الفيروس من الوسط. كان العائد بعد الطرد المركزي ضعف العائد الذي تم الحصول عليه من محللة الخلية: لـ (NH4)2وبالتالي4 وهطول الأمطار PEG-6000 ، على التوالي ، 67٪ عكس 33٪ و 68٪ عكس 32٪. في العزلات المدروسة ، كان من vp إلى p.f.u. كانت النسبة 6-17 إلى 1.

اعتمادًا على نوع rAd وظروف الإنتاج الدقيقة ، قد تختلف كمية الفيروس الموجودة في وسط الاستنبات بشكل كبير. حتى إذا تم تحسين ظروف الإنتاج ، فإن الاختلافات الصغيرة في ، على سبيل المثال ، حالة الخلية أو اللقاح ، قد تسبب اختلافات يمكن أن تؤدي إلى فقدان جزء مربح من عائد الفيروس ، إذا تم التخلص من الوسيط (الجدول 1). في حالة إنتاج rAd على نطاق واسع (NH4)2وبالتالي4 يبدو الترسيب متبوعًا بالترشيح فوق مرشح غشاء 0.45 ميكرومتر طريقة سريعة وسهلة لاستعادة الفيروس من الوسط ، خاصة إذا كان من الممكن دمج الطريقة مع بروتوكولات التنقية القياسية. لذلك ، نقترح بروتوكول حصاد rAd (الشكل 4) يتم فيه عزل الفيروس من الخلايا وكذلك من وسط الثقافة. أولاً ، ينقسم الحصاد إلى جزأين: وسط وكسر خلية. خلال فترة حضانة وسط الاستزراع مع (NH4)2وبالتالي4، يمكن تعطيل الخلايا وإعداد التدرجات خطوة CsCl. بعد ساعتين على الأقل من بدء الحضانة ، يمكن عزل الراسب بالترشيح ويمكن تحميله على تدرج CsCl بالتوازي مع محلول الخلية. بعد ذلك ، سينتهي التدرج الثاني CsCl وغسيل الكلى من التنقية. لتوضيح جدوى الإجراء المقترح ، تمت زراعة Ad5CMVLacZ على خلايا PER.C6 وتنقيتها وفقًا للبروتوكول المقترح. يتم عرض الغلات التي تم الحصول عليها في عدة نقاط على طول التنقية في الجدول 2. وكما يمكن استنتاجه من هذه البيانات ، فإن الجزء المتوسط ​​(A) يشمل 30٪ من محصول الفيروس الخام (إجمالي الكسور A و C). بعد هطول الأمطار ، يمكن استرداد 67٪ من الوسط مع تقليل الحجم بمقدار 33 ضعفًا (B). لتقييم التحميل المباشر المشار إليه للمادة المترسبة على تدرج CsCl ، تمت مقارنة تنقية 50٪ من المادة المترسبة المستردة (B) مع 50٪ من محللة الخلية الخام (C). كان شفاء الفيروس بالنسبة للوسط (D) أعلى بمرتين (68٪) من محللة الخلية (E) (30٪). وبالتالي ، ارتفعت مساهمة الجزء المتوسط ​​في العائد الكلي إلى 40٪. العائد التراكمي للكسور المنقاة بشكل منفصل (D و E) مشابه لعوائد التنقية المشتركة للوسط والخلية المحللة (F). نظرًا لأن التنقية المدمجة فعالة بنفس القدر مثل تنقية الكسور المنفصلة ، فمن الأنسب الجمع بين محلول الخلية والترسيب. بشكل عام ، توضح هذه البيانات بشكل جيد قابلية تطبيق البروتوكول المبين في الشكل 4. ويمكن أيضًا تنقية الراسب المذاب عبر كروماتوجرافيا عمود AE دون تدخل خطوات التنقية. تم إثبات ذلك من خلال تحليل HPLC للرواسب التي تم غسيلها وغير التي تم غسيلها ، والتي كشفت عن قمم فيروسية واضحة دون أي اضطراب نتيجة لوجود (NH).4)2وبالتالي4 (البيانات غير ظاهرة).

بروتوكول عزل الفيروس الغدي المؤتلف من الخلايا المساعدة ووسط مستنبتهم في حالة الإنتاج المتوسط ​​إلى الكبير. تنقية جزء الفيروس المرتبط بالخلايا كما هو موصوف سابقًا .14 يشار إلى الكسور المتعددة بالرموز A-F وتتوافق مع العينات المذكورة في الجدول 2. RT ، درجة حرارة الغرفة.


تنقية وتوصيف إنزيم التيروزيناز الميلانين من زر الفطر

تكوين الميلانين هو مسار تخليقي حيوي لتكوين صبغة الميلانين في جلد الإنسان. يحفز الإنزيم الرئيسي ، وهو التيروزيناز ، الخطوات الأولى والوحيدة التي تحد من المعدل في تكوين الميلانين. منذ اكتشاف خصائصه الميلانينية ، كان التيروزيناز في بؤرة التركيز الرئيسية والبحث عن المصادر الميكروبية للإنزيم. Agaricus bisporus يُعرف على نطاق واسع باسم الفطر الصالح للأكل ، ويحدث بكميات كبيرة من البروتينات والإنزيمات والكربوهيدرات والألياف والمحتويات منخفضة الدهون ، والتي كثيرًا ما يتم الاستشهاد بها في الأدبيات فيما يتعلق بقيمتها الغذائية. في هذه الدراسة من التيروزيناز Agaricus bisporus تمت تنقيته بواسطة ترسيب كبريتات الأمونيوم ، ثم غسيل الكلى متبوعًا بالكروماتوجرافيا بالترشيح الهلامي على Sephadex G-100 ، وتم تنقية كروماتوجرافيا التبادل الأيوني على DEAE-Cellulose ، تمت تنقية الإنزيم ، 16.36 ضعفًا لإعطاء 26.6 ٪ من العائد على النشاط الكلي في المستخلص الخام والنهائي المحدد نشاط 52.19 وحدة / مجم. أظهر الرحلان الكهربائي SDS-PAGE وزن جزيئي لشريط بروتين مهاجر يبلغ 95 كيلو دالتون. تم تحسين التيروزيناز المنقى وأظهرت النتائج أن القيم المثلى هي درجة الحموضة 7.0 ودرجة الحرارة 35 درجة مئوية. تم الإبلاغ عن أعلى نشاط تجاه الركيزة الطبيعية ، L-DOPA ، بقيمة واضحة كم تبلغ 0.933 ملي مولار. هذا يشير إلى أن التيروزيناز المنقى من Agaricus bisporus هو مصدر محتمل للتطبيقات الطبية.

1 المقدمة

Tyrosinase (EC 1.14.18.1) هو إنزيم موجود في كل مكان يشارك في التصبغ. إنه يحفز هيدروكسيل أحادي الفينول (نشاط الكريسوليز) وأكسدة الديفينول (نشاط الكاتيكوليز) في وجود الأكسجين الجزيئي. تحويل الفينولات إلى ا-الديفينول بواسطة التيروزيناز هو قدرة تحفيزية جذابة ، وبالتالي جذب التيروزيناز الكثير من الاهتمام فيما يتعلق بتطبيق التكنولوجيا الحيوية لأن منتجات الكاتيكول مفيدة كأدوية أو توليفات دوائية ، على سبيل المثال ، L-DOPA [1]. كما أنه يلعب دورًا مهمًا في تكوين صبغة الميلانين أثناء تكوين الميلانين في الخلايا الصباغية التي تقع عند تقاطع البشرة وهي موجودة في هذه الخلايا التي تنشأ من القمة العصبية الجنينية وهي المسؤولة عن تخليق الميلانين. [2] تم تشخيصه لأول مرة في الثدييات لدوره في تطور الأورام الميلانينية وللتورط في مشاكل التصبغ مثل المهق والبهاق [3]. يرتبط الدور الفسيولوجي للتيروزينات بالتخليق الحيوي للميلانين ، وقد تم استخلاصه من مصادر مختلفة مثل الفطريات والفواكه وأورام سرطان الجلد في الثدييات [4 ، 5]. في الفطريات ، تشارك الميلانين في آليات الدفاع ضد عوامل الإجهاد مثل الأشعة فوق البنفسجية أو أشعة جاما ، والجذور الحرة ، والجفاف ، ودرجات الحرارة القصوى [٦ ، ٧]. كما يستفيد استقرار الجراثيم الفطرية من الدور الوقائي للميلانين [8]. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط التيروزينات بالتئام الجروح والاستجابة المناعية في النباتات [9 ، 10].في البشر ، يشارك التيروزيناز في تصبغ الخلايا الصباغية [11-13] ، كعلامة في مرضى سرطان الجلد [14] وكهدف لتفعيل الأدوية الأولية [15]. في العمل الحالي ، كخطوة أولية في تقييم الإمكانات الصيدلانية لتيروزيناز الفطر Agaricus bisporus، أجرينا توصيفًا أوليًا للإنزيم. أظهر التيروزيناز المميز أوجه تشابه عالية جدًا مقارنة بالتيروزيناز البشري ، مما يشير إلى أن الفطر المنقى والمميز يمكن أن يكون مصدرًا مزدهرًا للتيروزيناز للاستخدام العلاجي في تكوين الميلانين.

2. المواد والأساليب

2.1. تحضير التيروزيناز

تم إجراء استخراج الفطر تيروزيناز بطريقة Kamahldin et al. [16] ، مع بعض التعديلات. تم تجانس شرائح الفطر عن طريق الخلاط الكهربائي. تم تحضير استخراج الإنزيم باستخدام 500 مل من محلول فوسفات بارد 100 ملي مولار (درجة الحموضة 5.8) مقابل 300 جرام من الفطر. تم طرد المجانسة عند 5000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة وتم جمع المادة الطافية. تم خلط الرواسب مع محلول الفوسفات البارد وتم السماح لها بالوقوف في حالة باردة مع الاهتزاز العرضي. ثم تعرضت الرواسب المحتوية على المخزن المؤقت للطرد المركزي مرة أخرى لتجميع المادة الطافية. تم استخدام المادة الطافية كمصدر للإنزيم.

2.2. تنقية الانزيم من المستخلص الخام

تم إجراء تنقية التيروزيناز بواسطة طريقة Kamahldin et al. [16] ، مع تعديل طفيف. تم استخدام مستخلص الإنزيم الخام المنقى عن طريق ترسيب الملح ، وغسيل الكلى ، وترشيح الهلام ، وكروماتوجرافيا التبادل الأيوني ، وما إلى ذلك في سلسلة للحصول على الإنزيم في أنقى صوره. يمكن استخدام الإنزيم النقي الناتج على هذا النحو لمزيد من التحليل.

2.3 ترسيب كبريتات الأمونيوم وغسيل الكلى

تم عمل ترسيب كبريتات الأمونيوم في حمام جليدي باستخدام كبريتات الأمونيوم ذات الأرضية الدقيقة. تم وزن المسحوق وإضافته ببطء إلى المستخلص عن طريق التقليب المستمر لضمان قابلية الذوبان الكاملة ، وتم طرد المحلول عند 5000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم تنفيذ خطوات ترسيب مختلفة لترسيب إنزيم التيروزيناز (45-80٪) وتم جمع الرواسب. تم غسيل الراسب مقابل 100 ملي محلول فوسفات البوتاسيوم (درجة الحموضة 7.0) لمدة 24 ساعة عن طريق تغيير المخزن المؤقت ثلاث مرات. تم استخدام الجزء المُحلل لنشاط التيروزيناز ومحتوى البروتين.

2.4 فحص نشاط التيروزيناز

تم إجراء اختبار نشاط التيروزيناز كما ورد بواسطة Sung and Cho [17] قياسًا طيفيًا ، وقياس تحويل L-DOPA إلى دوباكروم منتج أكسدة أحمر اللون. معدل التفاعل الأولي يتناسب مع تركيز الإنزيم. تم تحضين قسامة تحتوي على التيروزيناز لمدة 5 دقائق عند 35 درجة مئوية في الوقت صفر ، 1 مل من محلول L-DOPA (4 مجم / مل) للقياس عند 475 نانومتر. بعد الحضانة لمدة 5 دقائق إضافية ، رج الخليط مرة أخرى وتم تحديد القراءة الثانية وتم قياسها لمدة 3 دقائق. كان التغيير في الامتصاص متناسبًا مع تركيز الإنزيم. تتوافق وحدة واحدة من الإنزيم مع الكمية التي حفزت تحويل 1 ميكرومترمول من الركيزة للمنتج لكل دقيقة في ظل الظروف المذكورة أعلاه وأنتج 1.35 تغيرات في الامتصاص. تم التعبير عن نشاط محدد كوحدة إنزيم لكل مليغرام من البروتين. تم تحديد محتوى البروتين في الإنزيم بطريقة لوري [18] ، مع ألبومين مصل البقر كمعيار.

2.5 Sephadex G-100 جل ترشيح

تم تطبيق جزء كبريتات الأمونيوم المُحلل على عمود Sephadex G-100 الذي تم معايرته مسبقًا باستخدام محلول فوسفات 100 ملي مولار من درجة الحموضة 7.0. تم إجراء شطف البروتين بنفس المخزن المؤقت بمعدل تدفق 5 مل / دقيقة. تم جمع الكسور عند 4 درجات مئوية. تم تقييمه للبروتين عند 280 نانومتر وكذلك لنشاط الإنزيم. تم تجميع الكسور النشطة ، ودالتها مقابل محلول فوسفات 100 ملي مولار من درجة الحموضة 7.0 ، وتركيزها.

2.6. عمود الكروماتوغرافيا DEAE- السليلوز

تم إخضاع تحضير الإنزيم المُحلل الذي تم الحصول عليه بعد ترسيب كبريتات الأمونيوم وعمود Sephadex G-100 إلى كروماتوجرافيا التبادل الأيوني باستخدام عمود DEAE-Cellulose (20 × 1 سم). تم تحميل تحضير الإنزيم المُحلل على عمود DEAE-Cellulose والذي تمت معايرته مسبقًا باستخدام محلول فوسفات البوتاسيوم (100 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.0). تم غسل العمود أولاً باستخدام محلول منظم متوازن ثم تمت إزالة البروتينات المرتبطة باستخدام التدرج الخطي من 0-100 ملي مولار كلوريد الصوديوم و 0-100 ملي مولار من فوسفات البوتاسيوم بمعدل تدفق 1 مل لكل دقيقة. تم جمع الكسور (2.5 مل لكل منهما) ومعايرتها لنشاط التيروزيناز وتم تجميع تلك التي تظهر نشاطًا عاليًا واستخدامها لتحليل SDS-PAGE.

2.7. جل دوديسيل كبريتات - بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) الرحلان الكهربائي لتيروزيناز المنقى

تم إجراء SDS-PAGE باستخدام هلام فصل 12٪ و 4٪ هلام التراص. تم تسخين العينات لمدة 5 دقائق عند 100 درجة مئوية في قوارير مغطاة بـ 1 ٪ (وزن / حجم) SDS في وجود β- مركابتوإيثانول. تم إجراء الرحلان الكهربائي عند 125 فولت لمدة 4 ساعات في محلول Tris-HCl من درجة الحموضة 8.3. بعد الرحلان الكهربائي ، أصبحت البروتينات الموجودة في هلام الفصل مرئية عن طريق التلوين باستخدام Coomassie Brilliant Blue R-250. كانت المعايير المستخدمة لعمل مخطط للوزن الجزيئي اللوغاريتمي مقابل تنقل شريط البروتين هي الليزوزيم (20 كيلو دالتون) ، الميوغلوبين (26 كيلو دالتون) ، الأنهيدراز الكربوني (38 كيلو دالتون) ، الألبومين البيضاوي (46 كيلو دالتون) ، الجلوتامات (62 كيلو دالتون) ، الأبقار مصل الألبومين (91 كيلو دالتون) ، β-جالاكتوزيداز (120 كيلو دالتون) ، والميوسين (200 كيلو دالتون).

2.8. تأثير درجة الحموضة ودرجة الحرارة على نشاط الانزيم

تم تقييم نشاط التيروزيناز بقيم مختلفة للأس الهيدروجيني في النطاق بين الرقم الهيدروجيني 3 و 10 تحت ظروف الفحص وتم تحديد كمية الدوباكروم. المحاليل المستخدمة هي فوسفات السترات (درجة الحموضة 3.0-5.0) ، فوسفات البوتاسيوم (درجة الحموضة 6.0-7.0) ، Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0-9.0) ، والجليسين- NaOH (درجة الحموضة 9.0-10). تم تحديد درجة الحرارة المثلى لنشاط الإنزيم عن طريق احتضان خليط التفاعل القياسي عند درجات حرارة تتراوح من 35 إلى 65 درجة مئوية.

2.9 التحليل الحركي

يتم تعريف حركية الإنزيم كما تم قياسها بواسطة ثابت ميكايليس (Km) على أنها تركيز الركيزة بنصف السرعة القصوى ، معدل التفاعلات الأنزيمية ، عن طريق ربط معدل التفاعل بتركيز الركيزة. تم تقدير قيمة ثابت ميكايليس (Km) للإنزيم المنقى في مجموعة من تركيزات التيروزيناز. تم حساب القيمة الظاهرة بالكيلومتر لتيروزيناز المنقى من مخططات Lineweaver-Burk المتعلقة بـ 1 / V إلى 1 / [S].

3. النتائج والمناقشة

3.1. تنقية جزئية من التيروزيناز

يحتوي الفطر على كمية كبيرة من المركبات الفينولية المختلفة ، والتي تتأكسد بسهولة أثناء عملية التجانس. عند الأكسدة والبلمرة المتعاقبة للمحتوى الفينولي لمستخلص الفطر ، يتم تكوين جزيئات كبيرة من الميلانين. تعد تنقية التيروزيناز من الفطر أكثر صعوبة إلى حد ما بسبب كمية الأنسجة الأقل المتاحة لكل جسم فطر من الفطر وكمية أكبر من الميلانين في هذه الأنسجة. يمكن إزالة الميلانين المصاحب الذي يتم تكوينه عادةً أثناء تحضير المستخلص المتجانس على نطاق واسع من خليط البروتين باستخدام مادة التبادل الأيوني. في البداية ، جربنا مبادلات الأنيون الممتز ، وكذلك طرق ترسيب كبريتات الأمونيوم لإزالة المواد الملونة أو لتركيز التيروزيناز. لم تنجح أي من هذه الطرق دون التسبب في انخفاض في استعادة نشاط الإنزيم أو عدم القدرة على إزالة كمية كبيرة من المواد الملونة.

باختصار ، تم تحضير المستخلصات الخام عن طريق التجانس في محلول فوسفات البوتاسيوم سعة 100 ملي مولار (الرقم الهيدروجيني 5.8) يحتوي على 1 ملي مولار من EDTA. بعد الطرد المركزي ، تم تطبيق المادة الطافية على ترسيب كبريتات الأمونيوم. أظهر التنقية الجزئية للتيروزيناز باستخدام ترسيب كبريتات الأمونيوم أن أفضل جزء كان 70٪ فيما يتعلق بالإنزيم الخام والكسور الأخرى. أعطت القيم القصوى للنشاط الكلي والنشاط النوعي وحاصل إنزيم التيروزيناز والتي بلغت 11.09 وحدة / ملجم ، 83.5٪ على التوالي. كانت نسبة التنقية المضاعفة للإنزيم المنقى 3.47 عند استخدام 70٪ من كبريتات الأمونيوم. كانت النتائج السابقة مطابقة لتلك التي أبلغ عنها Lee et al. [19] ، الذي وجد أن 70٪ كبريتات الأمونيوم كانت أفضل جزء والذي أعطى أعلى إنتاجية لنشاط التيروزيناز من Solanum melongena. أظهر راسب كبريتات الأمونيوم المُحلل الذي تم تطبيقه على كروماتوجرافيا عمود الترشيح الهلامي Sephadex G-100 قممًا كبيرة لنشاط التيروزيناز والتي لوحظت في الكسور النشطة وأدت إلى تنقية 9.22 ضعفًا مع نشاط محدد نهائي قدره 29.42 وحدة / مجم. كان الانتعاش العام للتنقية 35.7٪ (الجدول 1). تم تطبيق هذا الجزء النشط على عمود DEAE-Cellulose وتم التصفية التتابعية باستخدام تدرج كلوريد الصوديوم تدريجياً. تمت التصفية من الإنزيم عند 0-100 ملي مول كلوريد الصوديوم (الشكل 1). تم تمرير الكسور النشطة المزالة التي تم إعادة رسمها كروماتوجراف على نفس العمود مع التدرج الخطي لمخزن فوسفات البوتاسيوم (0-100 مم) عبر العمود (الشكل 2). نتج عن مخطط التنقية المكون من خطوتين ، كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، تحضير التيروزيناز المنقى جزئيًا ، والذي تم الحصول عليه عن طريق تجميع الكسور 25 و 26 و 27 و 28 وتمت تنقية الإنزيم بحوالي 16.36 ضعفًا مع نشاط محدد نهائي قدره 52.19 وحدة. / ملغ. وبلغ معدل الاسترداد الكلي للتنقية 26.6٪. هورويتز وآخرون. [20] ذكرت أن التيروزيناز الذي يتم إنتاجه في الجسم الثمر يمكن استعادته وتنقيته عن طريق التجانس في الخلاط ثم تمريره من خلال مكبس فرنسي متبوعًا بترسيب الأسيتون أو كبريتات الأمونيوم [21]. تمت تنقية الراسب المعلق بشكل إضافي بواسطة عمود كروماتوغرافي واحد أو أكثر. الأعمدة الأكثر استخدامًا هي هيدروكسيلاباتيت [22] ، DEAE-Cellulose [23] أو DEAE Sepharose [24] ، مختلف راتنجات الانجذاب المناعي الأخرى [25] ، وهلام استبعاد حجم Sephadex [21].


النتائج

تحديد البروتينات المتفاعلة GRASP65 في العصارة الخلوية الطورية

في دراساتنا السابقة ، استخدمنا مقايسة تجميع الخرز الدلالي لتصور قلة القلة GRASP65. قمنا بطلاء حبات مغناطيسية Dynal M-500 بـ GRASP65 المنقى وفحصنا درجة تراكم الخرزة في ظروف مختلفة (Wang وآخرون.، 2003 ، 2005 تانغ وآخرون.، 2010 ب). عندما تم تحضين الخرزات المطلية بـ GRASP65 في مخزن مؤقت فسيولوجي عند 37 درجة مئوية ، شكلت الحبيبات مجاميع إلى حد ما ، مما يشير إلى أن GRASP65 تتشكل عبر- الموليغومرات الكافية لربط الأسطح المجاورة ببعضها البعض (Wang وآخرون.، 2003). من المثير للاهتمام ، عندما تم تحضين الحبيبات مع العصارة الخلوية الخلوية الطور البيني هيلا ، تم تعزيز التجميع بقوة بالمقارنة مع المخزن المؤقت الذي يحتوي على نفس تركيز ألبومين مصل الأبقار (BSA 92.7 ± 3.5٪ مقابل 34.2 ± 2.8٪ حبات في المجاميع الشكل 1 ، A و B) ، مما يشير إلى أن العصارة الخلوية الطورية البينية تحتوي على مكونات نشطة تعزز قلة القلة GRASP65.

الشكل 1: مينا تترجم إلى رابطة الدول المستقلة- جولجي من خلال التفاعل مع GRASP65. (أ) GRASP65- حبات Dynal M-500 المقترنة تم تحضينها إما مع المخزن المؤقت الذي يحتوي على BSA أو HLa interphase cytosol (IC). بعد الحضانة ، توضع الخرزات على شرائح زجاجية ، ويتم تصوير الحقول العشوائية. شريط مقياس ، 100 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي للنسبة المئوية للخرز في المجاميع. يتم التعبير عن النتائج على أنها تعني ± SEM. تم تقييم الأهمية الإحصائية بالمقارنة مع حبات BSA المعالجة. ال ص تم تحديد القيمة بواسطة Student ر اختبار ***ص & lt 0.001. (ج) تنقية تقارب البروتينات المتفاعلة مع GRAS65. تم تحضين العصارة الخلوية البينية المجزأة بنسبة 15-30٪ ترسيب كبريتات الأمونيوم مع حبات CNBr المقترنة بـ BSA أو His-GRASP65 ، وتم تحليل البروتينات المرتبطة بواسطة SDS-PAGE وتلطيخ Coomassie الأزرق. تشير الأسهم إلى نطاقي Mena و β /-actin التي تم استئصالها وتحديدها بواسطة مطياف الكتلة. تم تحضين الحبيبات المطلية بـ BSA أو GRASP65 بـ 15-30٪ بروتينات مترسبة من كبريتات الأمونيوم من العصارة الخلوية بين الطور (I ، المدخلات) ، وتم غسلها وتحليلها بواسطة لطخة ويسترن لمنطقة الشرق الأوسط وشمال إفريقيا. (E) الترسيب المناعي (IP) إما عن طريق IgG غير محدد (ctrl) أو الأجسام المضادة لـ Mena من محللة الخلايا المنقولة عن طريق التحكم (ctrl) أو siRNA التي تستهدف Mena. (F) خلايا WT HeLa كانت مناعية بالأجسام المضادة المشار إليها لإظهار توطين Golgi لمينا الذاتية. (G) تم تحصين خلايا هيلا التي تعبر عن GFP-Mena من أجل GRASP65. (H) الخلايا المنقولة عن طريق التحكم أو GRASP65 siRNA كانت مناعية للبروتينات المشار إليها. أدى نضوب GRASP65 إلى إلغاء توطين جولجي في مينا. (I) تم تحلل الخلايا المنقولة باستخدام GFP أو GFP-Mena أو GFP-VASP وتم تحصينها من خلال الأجسام المضادة لـ GFP. (J) القياس الكمي لمقدار GFP-Mena أو GFP-VASP الذي تم ترسيبه مع GRASP65 ، مع تطبيع مستوى GFP-Mena إلى 100٪. ***ص & lt 0.001. (K) تم تحصين الخلايا التي تعبر عن GFP-Mena أو GFP-VASP لـ GRASP65. تتركز مينا وليس VASP على جولجي. شريط ، 20 ميكرومتر (F –H ، J). (L) تم تحضين أغشية كبد جولجي (RLG) المنقى لكبد الفئران مع العصارة الخلوية الطورية (IC) أو الانقسام الخلوي (MC) أو تم تحضينها بالتتابع مع MC ثم IC (MC → IC) ، وتم عزلها وتنظيفها للبروتينات المشار إليها.

لتأكيد وجود مكونات نشطة في العصارة الخلوية بين الطور ، قمنا أولاً بتجميع حبات GRASP65 المطلية بواسطة العصارة الخلوية الطورية ثم فصلناها عن طريق المعالجة باستخدام كيناز 1 المنقى المعتمد على السيكلين (Cdk1) و Polo-like kinase 1 (Plk1) ، المعروفة بفسفوريلاتها GRASP65 وتعطيل قلة القلة (Wang وآخرون.، 2003 2005) ، وعالجت الحبيبات المفردة الناتجة إما مع العصارة الخلوية الطورية البينية أو بروتين فوسفاتيز المنقى 2A (PP2A) ، والذي يزيل الفسفرة GRASP65 (Tang وآخرون.، 2008). كما هو مبين في الشكل التكميلي S1A ، تسبب كلا العلاجين في إعادة تجميع حبة ، لكن العلاج باستخدام العصارة الخلوية بين الطور أدى إلى تجميع أكبر بكثير من ذلك مع PP2A ، مما يشير بقوة إلى أن العصارة الخلوية الطورية تحتوي على مكونات نشطة لـ GRASP65 oligomerization. لتوصيف الخصائص الكيميائية الحيوية لهذه العوامل ، عالجنا العصارة الخلوية الطورية بملح عالي أو حرارة أو بروتياز. ألغت كل هذه العلاجات النشاط ، مما يشير إلى أن عوامل العصارة الخلوية هي بروتينات في الطبيعة (الشكل التكميلي S1B). أظهرت التجارب الإضافية التي تستخدم مجموعة متنوعة من النيوكليوتيدات أو نظائرها أن هذا النشاط يتطلب ATP ولكن ليس التحلل المائي لـ ATP ، لأن إضافة نظائر ATP غير القابلة للتحلل مثل ATPγS تعزز بشكل كبير التجميع المماثل لـ ATP (الشكل التكميلي S1C).

ثم حاولنا إثراء هذا النشاط بالطرق البيوكيميائية التقليدية. باستخدام ترسيب كبريتات الأمونيوم المتسلسل ، وجدنا أن النشاط قد تم إثرائه في 10-30٪ من ترسبات كبريتات الأمونيوم (الشكل التكميلي S2A). قمنا بعد ذلك بتجزئة 15-30٪ من مادة سلفات الأمونيوم المرسب من العصارة الخلوية بتدرج جلسرين بنسبة 10-35٪ ووجدنا أن الكسر 9 ، من بين إجمالي 12 جزءًا ، يحتوي على معظم النشاط (الشكل التكميلي S2B). أظهرت المقارنة مع معايير الوزن الجزيئي أن البروتينات في الكسر 9 كانت 1000 كيلو دالتون ، مما يشير إلى أنه مركب بروتيني كبير.

لتنقية المكونات النشطة ، قمنا بإذابة ترسبات كبريتات الأمونيوم بنسبة 15-30٪ ، وقمنا بتحليلها في مخزن مؤقت فسيولوجي ، وقمنا بتمريرها عبر عمود يحتوي إما على GRASP65 أو BSA متصالبًا بحبيبات تنشيط CNBr ، والتي لها سعة أعلى من الخرز الدينالي. بعد الغسيل المكثف ، تم تحليل البروتينات المرتبطة بواسطة SDS-PAGE وتلطيخ Coomassie الأزرق. تم استئصال البروتينات التي ترتبط على وجه التحديد بـ GRASP65 ولكن ليس حبات BSA وتحديدها بواسطة مطياف الكتلة. مينا ، متماثل الثدييات ذبابة الفاكهة تشتهر Ena بتعزيز استطالة خيوط الأكتين (Gertler وآخرون.، 1996) ، و-و-actin في هذه العملية (الشكل 1C والجدول التكميلي S1).

يتم تجنيد مينا في أغشية جولجي من خلال التفاعل مع GRASP65

لتأكيد التفاعل بين GRASP65 و Mena ، قمنا باحتضان قطع كبريتات الأمونيوم بنسبة 15-30 ٪ من العصارة الخلوية الطورية مع حبات CNBr المُفعَّلة بـ BSA- أو GRASP65 وتحليل البروتينات المرتبطة بواسطة لطخة غربية. كما هو مبين في الشكل 1 د ، قام GRASP65 بسحب Mena من العصارة الخلوية ، لكن BSA لم يفعل ذلك. لتأكيد هذا التفاعل في الخلايا ، قمنا بتحصين مينا من محلول خلية هيلا ووجدنا أن GRASP65 ، ولكن ليس نظيرتها GRASP55 ، تتفاعل مع مينا (الشكل 1E). لضمان خصوصية هذا التفاعل ، قمنا بإسقاط مينا باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (سيرنا). نتيجة لذلك ، كان GRASP65 غير قابل للكشف في الراسب مع الأجسام المضادة لـ Mena عندما تم استنفاد مينا (الشكل 1E).

حددنا بعد ذلك ما إذا كانت مينا قد تم تجنيدها في Golgi بواسطة GRASP65. تشير صور التألق المناعي في التقارير السابقة إلى إثراء بارز لـ Mena في التصاقات البؤرية ، و lamellipodia ، و filopodia. ومع ذلك ، تُظهر معظم الصور أيضًا توطينًا حول النواة لمينا في الخلايا (Bear وآخرون.، 2002 Loureiro وآخرون.، 2002 Joshi and Wang، 2015). باستمرار ، تم عرض خيوط Ena و actin مؤخرًا لتوطين لـ رابطة الدول المستقلة- جولجي لتنظيم اندماج وانشطار غشاء جولجي في تطوير خلايا مستقبلة للضوء في ذبابة الفاكهة (كنعان وآخرون.، 2014). من خلال الفحص المجهري المناعي ، وجدنا أن مينا الذاتية يتم إثرائها على جولجي ويتم تنسيقها باستخدام GRASP65 (الشكل 1F). وبالمثل ، ركز البروتين الفلوري الأخضر المعبر عنه خارجيًا (GFP) - مينا أيضًا على Golgi (الشكل 1G). يعتمد توطين Golgi في مينا على GRASP65 ، لأن استنفاد GRASP65 بواسطة تدخل RNA (RNAi) أدى إلى تشتيت Mena من Golgi إلى العصارة الخلوية (الشكل 1H). لتحديد ما إذا كان التفاعل بين Mena و GRASP65 محددًا ، قمنا أيضًا بفحص VASP ، وهو عضو آخر في عائلة البروتينات Ena / VASP. GFP-Mena coimmunoprecipitated مع GRASP65 الذاتية ، لكن GFP-VASP كان لديه تقارب أقل بكثير لـ GRASP65 (8.2 ± 3.3 ٪ بالنسبة إلى GFP-Mena الشكل 1 ، I و J). بالإضافة إلى ذلك ، على عكس مينا ، لم يتم إثراء GFP-VASP على Golgi (الشكل 1K) ، مما يشير إلى أن التفاعل مع GRASP65 وتوطين Golgi خاص بمينا. عندما تم تحضين أغشية Golgi المنقى مع العصارة الخلوية الطورية البينية أو الانقسامية وإعادة عزلها ، تم تنقية مينا العصاري الخلوي مع أغشية جولجي تحت كل من الطور البيني والانقسام الخيطي (الشكل 1L) ، مما يدل على أن التفاعل بين GRASP65 و Mena مستقل عن دورة الخلية.

مينا مطلوبة لتشكيل شريط جولجي بطريقة تعتمد على الأكتين

للتحقيق في وظيفة مينا في منظمة جولجي ، قمنا بإسقاط مينا في خلايا هيلا (الشكل 2). لم يكن لترنسفكأيشن مع سيرنا غير محدد التحكم تأثير معنوي على مورفولوجيا جولجي في الخلية ، كما يتضح من تلطيخ GRASP65 ، في حين تسبب استنفاد مينا في تفتيت جولجي ، مع فصل عناصر جولجي عن بعضها البعض وتشتت في السيتوبلازم (الشكل 2 ، أ-ج) ).أظهر القياس الكمي لهذه الخلايا أن جولجي تم تجزئته في 78.2 ± 1.5٪ من الخلايا المستنفدة في مينا ، وهي أعلى بكثير من الخلايا التي عولجت سيرنا (9.0 ± 0.2٪ الشكل 2C). ثم قمنا بفحص هيكل Golgi عن كثب بواسطة EM. في التحكم في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل سيرنا ، كانت مكدسات جولجي منظمة جيدًا ومتصلة بشكل جانبي في شريط (الشكل 2 د). في المقابل ، في الخلايا المستنفدة في مينا ، تم فصل مكدسات جولجي ، وتشتت في جميع أنحاء السيتوبلازم ، وأقصر بكثير مما كانت عليه في خلايا التحكم (الشكل 2E). تم تخفيض متوسط ​​طول مكدسات Golgi من 1.23 ± 0.08 ميكرون في خلايا التحكم إلى 0.72 ± 0.05 ميكرومتر في الخلايا المستنفدة في مينا (الشكل 2E) ، بينما لم يتأثر تكديس جولجي (الشكل 2F). بالإضافة إلى ذلك ، تم توسيع صهاريج جولجي في الخلايا المستنفدة في منطقة الشرق الأوسط وشمال إفريقيا بشكل معتدل ، على غرار تأثير اضطراب الأكتين ، كما ورد سابقًا (Lazaro-Dieguez وآخرون.، 2006). تشير هذه النتائج إلى أن استنفاد Mena يقلل من الاتصال بين مكدسات Golgi في الشريط.

الشكل 2: مينا تنظم سلامة جولجي من خلال بلمرة الأكتين. (أ) خلايا هيلا المعالجة بـ siRNA المشار إليه كانت ملطخة بـ Mena و GRASP65. (B) Immunoblot لخلايا هيلا من A. (C) الكمي A للنسبة المئوية للخلايا ذات Golgi المجزأة. (D) صور الممثل EM للخلايا الموصوفة في A. سهام ، أكوام Golgi. شريط ، 500 نانومتر. (هـ) القياس الكمي لـ D لمتوسط ​​الطول الحجري لمداخن Golgi. (F) القياس الكمي لـ D لمتوسط ​​عدد الصهاريج لكل مكدس Golgi. (G) تم نقل خلايا هيلا المستنفدة في Mena باستخدام (كدنا) لـ GFP أو GFP الموسومة بـ GFP أو Mena WT المقاومة لـ RNAi أو المسوخات وملطخة لـ GRASP65. بار ، 20 ميكرومتر (A ، G). (H) تم نقل الخلايا أولاً باستخدام سيرنا غير محدد (الممر 1) أو سيرنا خاص بمنطقة الشرق الأوسط وشمال إفريقيا (الممرات 2-5) ثم باستخدام بلازميد GFP (الممر 2) ، GFP الموسومة بـ GFP ، مقاومة RNAi WT (الممر 3) ، FAB (الممر 4) و ΔGAB (الخط 5) وتحليلها بواسطة لطخة ويسترن. إندو. مينا الذاتية مينا. (I) القياس الكمي للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية لـ GFP مع Golgi المجزأة في G. ***ص & lt 0.001.

للتأكد من أن النمط الظاهري لتجزئة Golgi كان محددًا لاستنفاد Mena ، فقد عبرنا عن شكل مقاوم لـ RNAi من GFP-Mena ، أو GFP كعنصر تحكم ، في الخلايا التي تم فيها هدم مينا الذاتية. كما هو مبين في الشكل 2 ، G-I ، لم يكن لتعبير GFP أي تأثير على Golgi المجزأ ، بينما في GFP-Mena معبرًا عن الخلايا ، أصبح Golgi سليمًا ومضغوطًا. ثم سألنا ما إذا كانت وظيفة Mena في سلامة Golgi هي من خلال تكوين خيوط الأكتين. لقد عبرنا عن طفرات Mena ΔFAB أو ΔGAB ، والتي لا يمكنها ربط F-actin أو G-actin ، على التوالي (Loureiro وآخرون.، 2002 بريتسبريشر وآخرون.، 2011) ، في الخلايا المستنفدة في منطقة الشرق الأوسط وشمال إفريقيا. كلا الطافرين ، على الرغم من كونهما محليين في Golgi ، فشلوا في إنقاذ شريط Golgi من التفتت (الشكل 2 ، G-I). تشير هذه النتائج إلى أن مينا مطلوبة للحفاظ على سلامة Golgi ، وأن نشاطها يعتمد على الأكتين.

قمنا أيضًا بتعيين مجالات التفاعل على كلا البروتينين باستخدام فحوصات منسدلة. مثل الأعضاء الآخرين في عائلة بروتين Ena / VASP ، تحتوي Mena على مجال N-terminal Ena / VASP homology 1 (EVH1) ، والذي يربط النموذج الغني بالبرولين لعدد من البروتينات لاستهداف الخلايا الفرعية ، وهو مجال غني بالبرولين الأوسط ، ومجال C-terminal EVH2 الذي يتفاعل مع كل من G-actin و F-actin وبالتالي يعزز استطالة F-actin. يشتمل مجال EVH2 أيضًا على مجال ملفي C- طرفي يتوسط tetramerization من Mena (Bear and Gertler، 2009 Breitsprecher وآخرون.، 2011). من ناحية أخرى ، يحتوي GRASP65 على مجال GRASP N-terminal ومجال C-terminal سيرين / البرولين الغني (SPR) (Wang وآخرون.، 2005). لتحديد ما إذا كانت مينا تتفاعل مع المجال الغني بالبرولين في GRASP65 من خلال مجالها EVH1 ، أجرينا اختبارًا منسدلاً باستخدام شظايا بشرية مؤتلفة نقية مينا EVH1 وفئران GRASP65. تم تنسيق مجال EVH1 لمنطقة الشرق الأوسط وشمال إفريقيا مع GRASP65 بالطول الكامل (الشكل 3 أ) ، وكذلك مع مجال C-terminal SPR الخاص به ، ولكن ليس مجال N-terminal GRASP (الشكل 3B) ، مما يدل على أن التفاعل يتم بوساطة مباشرة بواسطة EVH1 مجال الشرق الأوسط وشمال أفريقيا ومجال SPR لـ GRASP65 وهو مستقل عن الأكتين.

الشكل 3: تفاعل Mena-GRASP65 مطلوب لتكامل Golgi. (أ) تم تحضين حبات BSA- أو GRASP65 المطلية بـ GST-Mena EVH1 المنقى ، وغسلها وتحليلها بواسطة لطخة غربية من أجل GST. (ب) تم تحضين الخرزات المقترنة بـ BSA أو GRASP65 المنقى aa 1–201 (p65N) أو جزء 202-446 (p65C) مع His-Mena EVH1 المنقى ، وغسلها وتحليلها بواسطة لطخة ويسترن لعلامته. تم تحضين الخرز (C) المقترن بـ GST أو شظايا GRASP65 المنقى التي تحمل علامة GST باستخدام محلول خلية هيلا ، وغسلها وتحليلها بواسطة لطخة غربية لمنطقة الشرق الأوسط وشمال إفريقيا. (D) طفرات نقطة GRASP65 ، مع تحور الأحماض الأمينية المشار إليها. (هـ) محاذاة الفئران والفأر وتسلسل الأحماض الأمينية GRASP65 البشرية في المنطقة المشار إليها. تشير الخطوط الجريئة إلى المواقع التي تم فيها تحور البرولين المحفوظ في المسوخ (M1 – M6) كما هو الحال في خلايا D. (F) المنقولة باستخدام GFP ، أو GRASP65 WT الموسومة بـ GFP ، أو تم تحريض المسوخات المشار إليها بأجسام مضادة لـ GFP وتحليلها بواسطة Western لطخة. (G-J) تم نقل الخلايا المستنفدة GRASP65 باستخدام WT GRASP65 أو متحولة M2 وتحليلها بواسطة لطخة ويسترن (G) والفحص المجهري (H ، I). شريط ، 20 ميكرومتر. (J) تقدير كمية الخلايا في I مع Golgi مجزأة. ***ص & lt 0.001.

باستخدام الجلوتاثيون س-transferase (GST) - شظايا GRASP65 الموسومة بعلامة الجرذ لسحب Mena من محللة خلية هيلا ، وجدنا الأحماض الأمينية (aa) 202-320 باعتبارها الجزء الأدنى من GRASP65 لربط Mena (الشكل 3C). هناك أربع امتدادات غنية بالبرولين في هذه المنطقة محفوظة بين الأنواع. لذلك قمنا بتحويل البرولين المحفوظ إلى جلايسينات (Breitsprecher وآخرون.، 2011 الشكل 3 و D و E) ، عبروا عنها في الخلايا ، واختبروا تفاعلهم مع مينا عن طريق الترسيب المناعي المشترك. كما هو مبين في الشكل 3F ، فإن طفرة P236 / P237 / P239 / P241 إلى الجلايسينات (متحولة M2) في الفئران GRASP65 ألغت التفاعل مع مينا ، في حين أن طفرة البرولينات الأخرى لم يكن لها أي تأثير. تسلسل ربط Mena EVH1 هذا على GRASP65 ، L (الإنسان) / P (الجرذ والفأر) PPxPxP ، على الرغم من أنه قريب من تسلسل F / LPPXP المشترك المشترك بين عدة مختلفة ذبابة الفاكهة بروتينات إينا والثدييات المتفاعلة مع مينا (كرة وآخرون.، 2002) ، غير تقليدي ، مشابه لعنصر آخر مرتبط بـ Mena EVH1 في Abi البشري (Breitsprecher وآخرون., 2011).

لتحديد ما إذا كان تفاعل GRASP65 – Mena مطلوبًا لتوطين Mena Golgi وسلامة شريط Golgi ، قمنا بنقل الفئران من النوع البري (WT) الموسوم بـ GFP GRASP65 أو M2 المتحولة التي تعاني من نقص التفاعل في Mena في خلايا هيلا المستنفدة GRASP65 (الشكل 3 ، G و ي). على عكس WT GRASP65 ، فشل متحولة M2 في تجنيد Mena في Golgi (الشكل 3H) أو إنقاذ Golgi المجزأ (الشكل 3 ، I و J).

نظرًا لأن مينا تنظم بنية جولجي من خلال التفاعل مع خيوط الأكتين ، فقد سألنا بعد ذلك عما إذا كانت خيوط الأكتين المزعجة من خلال العلاج الدوائي ستؤثر على بنية جولجي. من المعروف أن السيتوشالاسين ب يقوم بغطاء خيوط الأكتين وبالتالي يمنع استطالة خيوط الأكتين ، مما يعادي مينا في منع تغطية خيوط الأكتين (Braet وآخرون.، 1996). يربط Latrunculin B مونومر الأكتين وبالتالي يزيل بلمرة خيوط الأكتين (Wakatsuki وآخرون.، 2001). في هذه التجارب ، لم نلاحظ وجود Golgi المكثف الواضح كما ورد سابقًا (Lazaro-Dieguez وآخرون.، 2006) بدلاً من ذلك ، وجدنا أن الخلايا المعالجة بالخلية الخلوية B أو اللاترونكولين B أظهرت نمطًا ظاهريًا من Golgi الرخو وغير المرتبط بالمقارنة مع Golgi السليم في خلايا معالجة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (الشكل 4 أ). بالإضافة إلى ذلك ، أدى استنفاد β- أو-actin الخلوي بواسطة siRNA إلى تجزئة Golgi (الشكل 4 ب) ، على غرار استنفاد مينا. بواسطة EM ، وجدنا أن تعطل خيوط الأكتين بواسطة العلاجات الدوائية (الشكل 4C) واستنفاد β- أو γ-actin (الشكل 4D) أدى إلى تفتيت ministacks ، على ما يبدو بسبب فك ربط شريط Golgi. مجتمعة ، كشفت هذه النتائج أن خيوط مينا والأكتين تنظم سلامة شريط جولجي.

الشكل 4: خيوط الأكتين مطلوبة لسلامة Golgi. (أ) خلايا هيلا المعالجة بـ DMSO ، السيتوكالاسين B (CytB ، 40 ميكرومتر) ، أو لاترنكولين ب (لاتب ، 0.5 ميكرومتر) لمدة ساعتين كانت ملطخة بـ α-mannosidase II (ManII) و phalloidin المسمى بالرودامين. (ب) الخلايا المصابة بالعدوى بالسيرنا المشار إليها كانت ملطخة لـ ManII و rhodamine-phalloidin. بار ، 20 ميكرومتر (أ ، ب). (C) تمت معالجة الخلايا المعالجة بـ DMSO أو السيتوشالاسين B أو اللاترونكولين B لمدة ساعتين من أجل EM وتم تصويرها. تشير الأسهم إلى مكدسات جولجي. تم قياس متوسط ​​الطول الداخلي لحزم جولجي. تم تقييم الدلالة الإحصائية بالمقارنة مع الخلايا المعالجة بـ DMSO. (D) تمت معالجة الخلايا المنقولة عن طريق التحكم ، β-actin ، أو-actin siRNA لمدة 48 ساعة من أجل EM وتحليلها كما في C. شريط ، 500 نانومتر (ج ، د). ***ص & lt 0.001.

تم تورط خيوط الأكتين في الاتجار داخل الخلايا (Campellone وآخرون.، 2008 Miserey-Lenkei وآخرون.، 2010 إيجيا وآخرون.، 2013 جوريل وآخرون.، 2014) ، وبالتالي قررنا ما إذا كان مينا كمنظم لخيوط الأكتين يؤثر أيضًا على تهريب البروتين ، باستخدام بروتين سكري لفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G) كبضائع. تم نقل الخلايا المصابة لأول مرة بالتحكم أو Mena siRNA بواسطة فيروسات غدية تم تعبئتها مسبقًا ببلازميدات VSV-G-ts045-GFP (Xiang وآخرون.، 2013). تم الاحتفاظ بالخلايا في درجة حرارة غير سائلة (40.5 درجة مئوية) طوال الليل لاحتجاز VSV-G-ts045 في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ثم نقلها إلى درجة حرارة متساهلة (32 درجة مئوية) للسماح بتصدير VSV-G من ER عبر Golgi إلى غشاء البلازما (بريسلي وآخرون.، 1997 هيرشبيرج وآخرون.، 1998). كما هو مبين في الشكل التكميلي S3 ، لم يؤثر استنفاد Mena بشكل كبير على تهريب VSV-G. وبالتالي تلعب مينا دورًا مهمًا في تشكيل شريط جولجي ولكن ليس تهريب البروتين.

تسهل خيوط مينا وأكتين تشكيل شريط جولجي بعد غسل نوكودازول

في خلايا الثدييات ، يتطلب تشكيل شريط جولجي شبكة الأنابيب الدقيقة السليمة. تؤدي إزالة البلمرة من الأنابيب الدقيقة باستخدام نوكودازول إلى ظهور أكياس جولجي الصغيرة المنتشرة في السيتوبلازم (Minin ، 1997 Thyberg and Moskalewski ، 1999). قمنا بعد ذلك بغسل nocodazole للسماح بإعادة تشكيل شريط Golgi لتقليد تجميع Golgi بعد التقلص في وجود أو عدم وجود مينا. كما هو مبين في الشكل 5 ، تأخر بشكل كبير إعادة تشكيل شريط جولجي في الخلايا المستنفدة في منطقة الشرق الأوسط وشمال إفريقيا مقارنة بخلايا التحكم (الشكل 5 أ). في كل نقطة زمنية ، كان هناك المزيد من عناصر جولجي الحرة غير المدمجة مع نواة جولجي في الخلايا المستنفدة في مينا. في 120 دقيقة بعد إزالة نوكودازول ، تركزت جميع عناصر جولجي في مركز الخلية ، وأصبح شريط جولجي سليمًا في جميع خلايا التحكم ، ومع ذلك ، في الخلايا المستنفدة في مينا ، على الرغم من نقل عناصر جولجي إلى مركز الخلية ، ظلوا غير متصلين. أظهرت نتائج التصوير المتحد البؤر والقياس الكمي أن استنفاد مينا أدى إلى زيادة عدد عناصر جولجي لكل خلية ، مما يشير إلى وجود خلل في اندماج عناصر جولجي (الشكل 5 ب). على غرار استنفاد Mena ، أدى تثبيط استطالة الأكتين بواسطة علاج السيتوشالاسين B أيضًا إلى تأخير إصلاح شريط Golgi بعد إزالة نوكودازول (الشكل 5C والشكل التكميلي S4). وبالتالي فإن استطالة خيوط مينا والأكتين ضرورية لربط مكدسات جولجي بالشريط.

الشكل 5: يؤدي استنفاد مينا إلى إعاقة إعادة تجميع جولجي بعد غسل نوكودازول. (أ) تم تحضين خلايا هيلا المنقولة عن طريق التحكم أو مينا سيرنا باستخدام نوكودازول لمدة ساعتين. بعد إزالة nocodazole للأوقات المحددة (بالدقائق) ، تم إصلاح الخلايا وتلطيخها بواسطة الأجسام المضادة phalloidin و GRASP65. شريط ، 10 ميكرومتر. (ب) تم تحليل التجارب في A عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، وتم تحديد عدد جسيمات جولجي في الخلايا المشار إليها (يعني ± SEM). *ص & lt 0.05 ***ص & lt 0.001. تم تحضين الخلايا (C) أولاً باستخدام نوكودازول لمدة ساعتين ثم إضافة DMSO أو السيتوكالاسين B لمدة 30 دقيقة أخرى. تم غسل الخلايا واحتضانها في وسط نمو يحتوي على DMSO أو السيتوكالاسين B ، ولكن بدون نوكودازول ، في الأوقات المحددة. تم تلوين الخلايا لـ GRASP65 وعن طريق phalloidin (الصور الموضحة في الأشكال التكميلية S4 و S5) وتم تحليلها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر وقياسها كما في B. نتائج القياس الكمي.

على النحو الذي اقترحه Kondylis وآخرون. (2007) ، عند تفريقها عن طريق علاج نوكودازول ، توجد مكدسات جولجي كأزواج في خلايا الثدييات ، على غرار تلك التي لوحظت في ذبابة الفاكهة خلايا S2 وخيوط الأكتين مطلوبة لتشكيل أزواج جولجي. لذلك يجب أن تؤدي إزالة بلمرة خيوط الأكتين بواسطة اللاترونكولين ب في الخلايا المعالجة بالنوكودازول إلى قطع أزواج جولجي ومضاعفة عناصر جولجي. لاختبار هذا الاحتمال ، قمنا باحتضان الخلايا مع نوكودازول في وجود DMSO ، أو السيتوشالاسين B ، أو لاترنكولين ب. أظهر التحليل المجهري متحد البؤر أن علاج نوكودازول أدى إلى تشتيت شريط جولجي في حزم صغيرة ، ومع ذلك ، فإن العلاج الإضافي باستخدام السيتوشالاسين ب لم يزيد من عدد عناصر جولجي. وبالمثل ، لم يؤثر استنفاد Mena بواسطة siRNA على عدد عناصر Golgi في الخلايا المعالجة بالنوكودازول (الشكل التكميلي S5A). تحت EM ، كانت مكدسات Golgi في الخلايا المعالجة بـ nocodazole أقصر مما كانت عليه في خلايا الطور البيني العادية وكانت دائمًا موجودة بجوار أغشية ER ، ويفترض أن مواقع خروج ER. لم يؤثر استنفاد Mena ولا العلاج الخلوي B و latrunculin B على طول وموقع حزم Golgi الصغيرة (الشكل التكميلي S5B). أشارت هذه النتائج إلى أنه من غير المرجح أن يكون الاقتران Golgi هو آلية ربط شريط مينا وربط الأكتين.

خيوط مينا وأكتين مطلوبة لدمج جولجي

أثناء إعادة تشكيل شريط Golgi بعد إزالة nocodazole ، لاحظنا غالبًا بقع أكتين مترجمة حول عناصر Golgi وبينها في خلايا التحكم (الشكل 6 أ) ، مما يسهل ربط مكدسات Golgi ببعضها البعض ، بينما في الخلايا المستنفدة في Mena ، تكون بقع الأكتين هذه نادرا ما يمكن اكتشافها (الشكل 6 ب). نظرًا لأن ربط شريط Golgi يتطلب نشاط اندماج الغشاء ، فقد حددنا ما إذا كانت استطالة الأكتين بوساطة Mena تسهل اندماج غشاء Golgi ، باستخدام اختبار إعادة تجميع Golgi في المختبر (Tang وآخرون.، 2010 أ). عالجنا أولاً أغشية جولجي المنقى باستخدام العصارة الخلوية الانقسامية لخلية هيلا للحث على تفتيت جولجي. قمنا بإعادة عزل شظايا جولجي الانقسامية الناتجة (MGFs) وعالجناها أيضًا باستخدام العصارة الخلوية الطورية للسماح للحويصلات بالانصهار. قمنا بعد ذلك بقياس نشاط اندماج غشاء Golgi عن طريق قياس الأغشية الصخرية الطويلة الناتجة من الحويصلات. لتحديد ما إذا كان مينا مطلوبًا لدمج غشاء جولجي ، قمنا باستنفاد مينا من العصارة الخلوية الطورية. عندما تم تحضينها باستخدام العصارة الخلوية المعالجة بالجلوبيولين المناعي G (IgG) ، تم إعادة تجميع شظايا جولجي الانقسامية (الشكل 6 ج) في صهاريج جولجي الطويلة والمكدسة (الشكل 6 د). ومع ذلك ، عندما تم استنفاد مينا ، مما أدى إلى إزالة 85.5٪ من مينا من العصارة الخلوية ، انخفض نشاط اندماج الغشاء إلى 35.1 ± 7.7٪ من العصارة الخلوية الضابطة (الشكل 6 ، E-G). وبالمثل ، فإن إزالة بلمرة الأكتين عن طريق إضافة السيتوشالاسين ب في رد فعل إعادة التجميع قللت من كفاءة اندماج الغشاء إلى 29.7 ± 7.1٪ بالنسبة لعنصر تحكم DMSO (الشكل 6 ح). وبالتالي فإن مينا وأكتين ضروريان لدمج غشاء جولجي.

الشكل 6: مينا تنظم اندماج غشاء جولجي من خلال استطالة F-actin. (أ ، ب) تم نقل خلايا هيلا بواسطة التحكم (أ) أو مينا (ب) سيرنا واحتضانها مع نوكودازول لمدة ساعتين. في 15 دقيقة بعد إزالة نوكودازول ، تم تلوين الخلايا بالأكتين (أحمر) و GRASP65 (أبيض) وتحليلها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. يظهر المسح الفردي لأجزاء من الصور يتم تكبيرها لإظهار بقع الأكتين بين أغشية جولجي. قضبان ، 10 ميكرومتر. (C) تم استنفاد مينا بكفاءة من العصارة الخلوية الطورية ، كما هو موضح في لطخة ويسترن. (D-F) في اختبار إعادة تجميع Golgi في المختبر. تم تفكيك أغشية RLG المنقاة عن طريق علاج العصارة الخلوية الانقسامية ، وإعادة عزلها (D) ، واحتضانها مع الطور البيني للخلايا المناعية المنبثقة عن طريق التحكم IgG (E) أو عن طريق الأجسام المضادة لـ Mena (F). تمت معالجة الأغشية من أجل EM وتصويرها. الحانات ، 500 نانومتر. (G) التحديد الكمي لكفاءة اندماج غشاء جولجي النسبية في E و F. ***ص & lt 0.001. (ح) أغشية جولجي المنقاة التي تم تفكيكها أولاً عن طريق معالجة العصارة الخلوية الانقسامية ثم حضنت مع العصارة الخلوية بين الطور في وجود DMSO أو 40 ميكرومتر من السيتوكالاسين B (CytB). تمت معالجة الأغشية من أجل EM وقياسها كما هو الحال في G.

مينا وخيوط الأكتين الممدودة تعزز قلة القلة GRASP65

نظرًا لأن مينا تتفاعل بشكل مباشر مع GRASP65 وتعزز مينا استطالة الأكتين لربط مكدسات جولجي بشريط ، فقد سألنا عما إذا كان GRASP65 يعمل فقط كمرساة غشائية لمنطقة مينا أو مينا وأن خيوط الأكتين تنظم أيضًا قلة GRASP65. تمت معالجة هذا السؤال باستخدام اختبار تجميع الخرزة ، حيث يمكن تصور قلة القلة GRASP65 بشكل مباشر (وانغ وآخرون.، 2003 2005). كما هو مبين في الشكل 7 ، A و B ، شكلت الخرزات المطلية بـ GRASP65 مجاميع كبيرة عند معالجتها بالعصارة الخلوية بين الطور ، في حين أن استنفاد مينا من العصارة الخلوية قلل بشكل كبير من هذا النشاط ، مما يشير إلى أن مينا هي على الأقل أحد المكونات الرئيسية في الطور البيني العصارة الخلوية التي تعزز قلة القلة GRASP65 (الشكل 7 ، A و B). تتطلب البلمرة المفرطة لـ GRASP65 بلمرة أكتين ، لأن إضافة السيتوشالاسين B في التفاعل قلل بشكل كبير من تجميع حبة GRASP65 مقارنةً بالتحكم في DMSO (الشكل 7 ، C و D).

الشكل 7: مينا و F- أكتين يعززان قلة القلة GRASP65. (أ ، ب) حبات GRASP65 المطلية تم تحضينها مع العصارة الخلوية الطورية البينية (IC) المناعي بواسطة IgG غير محدد أو مضاد لـ Mena IgG. تم تصوير الخرزات عن طريق الفحص المجهري (A) ، وتم تحديد النسبة المئوية للخرز في المجاميع (B). (C ، D) تم تحضين حبات GRASP65 المطلية بـ IC في وجود DMSO أو 40 ميكرومتر من السيتوتشالاسين B والنتائج محددة كمياً. (E ، F) حبات GRASP65 المغلفة المحتضنة بالبروتينات النقية المشار إليها أو IC تم تصويرها وتحديدها كمياً. (G ، H) حبات GRASP65 المغلفة المحتضنة مع العصارة الخلوية الطورية البينية أو العصارة الخلوية الطورية التي تم احتضانها مسبقًا مع BSA أو Mena EVH1 أو المجال أو مجال Mena EVH2 تم تصويرها وتحديدها كمياً. قضبان ، 50 ميكرومتر. ***ص & lt 0.001.

ربما تكون أفضل طريقة لاختبار كيفية تنظيم مينا وأكتين لقلة القلة لـ GRASP65 هي احتضان حبات مطلية بـ GRASP65 مع مينا وأكتين منقى ، ومع ذلك ، فشلت الجهود المبذولة للتعبير عن مينا كاملة الطول وتنقيتها ، وتمكنا من تنقية أجزاء من منطقة الشرق الأوسط وشمال إفريقيا فقط. لذلك قررنا أولاً ما إذا كانت شظايا مينا يمكن أن تزيد من قلة القلة لـ GRASP65.كما هو مبين في الشكل 7 و E و F ، فإن مجال EVH1 ، الذي يتفاعل مع GRASP65 (الشكل 3 أ) ولكنه لا يشجع بلمرة الأكتين بسبب عدم وجود مجال بلمرة الأكتين ، لم يزيد من تجميع حبة GRASP65. وبالمثل ، فإن مجال EVH2 ، الذي يعزز بلمرة الأكتين ولكنه لا يرتبط بـ GRASP65 ، لم يحسن أيضًا قلة القلة لـ GRASP65. قمنا بعد ذلك باختبار ما إذا كانت إضافة شظايا Mena إلى العصارة الخلوية البينية يمكن أن تثبط قلة القلة GRASP65 التي تروج لها شركة Mena. في الواقع ، فإن إضافة مجال EVH1 المنقى إلى التفاعل ، والذي يتنافس مع Mena في العصارة الخلوية لربط GRASP65 ، قلل بشكل كبير من النشاط في العصارة الخلوية الطورية في تعزيز تجميع حبة GRASP65 المغلفة. كان لمجال EVH2 ، المعروف بالتنافس على ربط الأكتين ، تأثير مماثل. كعنصر تحكم سلبي ، لم يكن لـ BSA أي تأثير على قلة القلة GRASP65 (الشكل 7 و G و H). توضح هذه النتائج أن كلاً من تفاعل GRASP65 ونشاط استطالة الأكتين مطلوبان لشركة Mena لتعزيز قلة القلة GRASP65 وربط شريط Golgi.

من خلال جمع النتائج معًا ، حددنا مينا كشريك جديد ملزم لـ GRASP65 يلعب دورًا أساسيًا في تشكيل شريط Golgi. يوضح هذا كيف يلعب GRASP65 دورًا مزدوجًا في تكوين بنية Golgi. عندما تقع بين صهاريج Golgi ، فإن أوليغومرات GRASP65 تربط الصهاريج المجاورة مباشرة إلى أكوام. عندما يقع GRASP65 على حواف مكدسات Golgi ، يقوم بتجنيد Mena في Golgi من خلال تفاعل مباشر ويؤدي إلى نمو خيوط الأكتين المحلية. بعد ذلك ، تتشابك ألياف الأكتين مع GRASP65 وتعزز قلة القلة GRASP65. تولد كل من خيوط الأكتين وأوليغومرات GRASP65 قوى لربط أكوام جولجي المجاورة بشريط (الشكل 8).

الشكل 8: نموذج تفاعل Mena-GRASP65 في ربط شريط Golgi. يتم نقل حزم Golgi الصغيرة إلى مركز الخلية على طول الأنابيب الدقيقة (1). GRASP65 oligomers zipper Golgi cisternae إلى أكوام (2) وربط أكوام Golgi القريبة في شريط (3). يتطلب تشكيل الشريط في البداية تجنيد Mena GRASP65 لجولجي ، مما يعزز استطالة خيوط الأكتين (4). ثم تربط ألياف الأكتين أكوام Golgi المتناثرة وتسحبها تجاه بعضها البعض لتشكيل شريط (5). على كل من رابطة الدول المستقلة و ال عبر وجوه المكدس ، قد تسهل خيوط الأكتين المرتبطة بغولجي تشوه الغشاء لتشكيل الحويصلة ، والانشطار والاندماج ، والحركات قصيرة المدى (6).


مقايسة ترسيب سلفات الأمونيوم اعتماد الأس الهيدروجيني - علم الأحياء

تعتبر حساسية إجراء Lowry ثابتة إلى حد ما من البروتين إلى البروتين ، وقد تم استخدامها على نطاق واسع لدرجة أن تقديرات بروتين Lowry هي بديل مقبول تمامًا لتحديد صارم مطلق في جميع الظروف تقريبًا حيث يتم استخدام مخاليط البروتين أو المستخلصات الخام.

تعتمد الطريقة على كل من تفاعل Biuret ، حيث تتفاعل روابط الببتيد للبروتينات مع النحاس في ظل ظروف قلوية تنتج Cu + ، والتي تتفاعل مع كاشف Folin ، وتفاعل Folin-Ciocalteau ، وهو أمر غير مفهوم جيدًا ولكن في جوهره يتم تقليل phosphomolybdotungstate إلى أزرق غير متجانسة بوليموليبدينوم بواسطة أكسدة النحاس المحفز للأحماض الأمينية العطرية. ينتج عن التفاعلات لون أزرق قوي ، والذي يعتمد جزئيًا على محتوى التيروزين والتربتوفان. الطريقة حساسة حتى حوالي 0.01 مجم من البروتين / مل ، وأفضل استخدام لها في المحاليل ذات التركيزات في حدود 0.01-1.0 مجم / مل من البروتين.

1. كاشف تشكيل معقد : استعد على الفور قبل الاستخدام عن طريق خلط حلول المخزون الثلاثة التالية A و B و C بنسبة 100: 1: 1 (v: v: v) ، على التوالي.
الحل أ: 2٪ (وزن / حجم) نا2كو3 في الماء المقطر.
الحل ب: 1٪ (وزن / حجم) CuSO4& middot5H2يا في الماء المقطر.
محلول ج: 2٪ (وزن / حجم) طرطرات بوتاسيوم الصوديوم في ماء مقطر.
2. 2N هيدروكسيد الصوديوم .
3. كاشف فولين (متاح تجاريا). تمييع 1: 2 في H2يا قبل الاستخدام.
4. المعايير : استخدم محلول مخزون من البروتين القياسي (على سبيل المثال ، جزء ألبومين المصل البقري V) الذي يحتوي على 4 مجم / مل بروتين في الماء المقطر المخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قم بإعداد المعايير عن طريق تخفيف محلول المخزون بالماء المقطر على النحو التالي:

حل الأسهم ، ul 0 1.25 2.5 6.25 12.5 25 62.5 125250
المياه ، ul 5004994984488475438375250
بروتوكول التحكم ، ميكروغرام / مل 0 10 20 50100200500 1000 2000

1. إلى 0.2 مل من العينة أو المعيار أضف 1 مل من كاشف تشكيل المعقد المخلوط حديثًا. دع المحلول يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق

2. أضف 0.1 مل من كاشف Folin المخفف ، باستخدام خلاط دوامة ، واترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة (لا تتجاوز 60 دقيقة)

3. اقرأ الامتصاصية عند 750 نانومتر إذا كان تركيز البروتين أقل من 500 ميكروغرام / مل أو عند 550 نانومتر إذا كان تركيز البروتين بين 100 و 2000 ميكروغرام / مل.

4. ارسم منحنى قياسي للامتصاص كدالة لتركيز البروتين الأولي واستخدمه لتحديد تركيزات البروتين غير المعروفة.

1. إذا كانت العينة متاحة على شكل راسب ، فقم بإذابة الراسب في 2N NaOH.

2. بيترسون وصف خطوة الترسيب التي تسمح بفصل عينة البروتين عن المواد المتداخلة وبالتالي تركز أيضًا عينة البروتين ، مما يسمح بتحديد البروتينات في المحلول المخفف. خطوة بيترسون لهطول الأمطار هي كما يلي:
أ. إضافة 0.1 مل من 0.15٪ deoxycholate إلى 1.0 مل من عينة البروتين.
ب. دوامة ، وانتظر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
ج. إضافة 0.1 مل من 72٪ TCA ، دوامة ، وأجهزة الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
د. صب المادة طافية ثم حل الحبيبات في 2N هيدروكسيد الصوديوم.

3. يعتمد التفاعل بشكل كبير على الرقم الهيدروجيني ، وبالتالي من المهم الحفاظ على الرقم الهيدروجيني بين 10 و 10.5. لذلك توخى الحذر عند تحليل العينات الموجودة في مخزن مؤقت قوي خارج هذا النطاق.

4. فترة الحضانة ليست حرجة ويمكن أن تختلف من 10 دقائق إلى عدة ساعات دون التأثير على الامتصاص النهائي.

5. خطوة Vortex حاسمة للحصول على نتائج قابلة للتكرار. يكون كاشف Folin تفاعليًا فقط لفترة قصيرة في ظل هذه الظروف القلوية ، كونه غير مستقر في القلويات ، ولذلك يجب توخي الحذر الشديد لضمان الخلط الشامل.

6. المقايسة ليست خطية بتركيزات أعلى. لذلك تأكد من أنك تقوم بتحليل عينتك على الجزء الخطي من منحنى المعايرة.

7. هناك حاجة إلى مجموعة من المعايير مع كل مجموعة من المقايسات ، ويفضل أن يكون ذلك في نسختين. يوصى بتكرار أو ثلاث نسخ مجهولة.

8. أحد عيوب طريقة Lowry هو حقيقة أن مجموعة من المواد تتداخل مع هذا الاختبار ، بما في ذلك المحاليل ، والعقاقير ، والأحماض النووية ، والسكريات. في كثير من الحالات ، يمكن تقليل تأثيرات هذه العوامل عن طريق تخفيفها ، بافتراض أن تركيز البروتين مرتفع بما يكفي ليتم اكتشافه بعد التخفيف. عند استخدام المركبات المتداخلة ، من المهم بالطبع تشغيل فراغ مناسب. يمكن القضاء على التداخل الناجم عن المنظفات والسكروز و EDTA عن طريق إضافة SDS. أفضل بديل في هذه الحالة هو عمل Lowry-TCA (انظر بروتوكولات ترسيب البروتين) أو Peterson.

9. تم الإبلاغ عن تعديلات على هذا الاختبار الأساسي التي تزيد من حساسية التفاعل. إذا تمت إضافة كاشف فولين على جزأين ، دوامة بين كل إضافة ، يتم تحقيق زيادة بنسبة 20٪ في الحساسية. تؤدي إضافة ديثيوثريتول 3 دقائق بعد إضافة كاشف فولين إلى زيادة الحساسية بنسبة 50٪.

10. تعتمد كمية اللون التي يتم إنتاجها في هذا الاختبار عن طريق أي بروتين معين (أو خليط من البروتينات) على تكوين الأحماض الأمينية للبروتينات (انظر المقدمة). لذلك ، يمكن لبروتينين مختلفين ، كل منهما على سبيل المثال بتركيزات 1 مجم / مل ، أن يعطيا عوائد لونية مختلفة في هذا الاختبار. لذلك يجب إدراك أن استخدام مساحة سطح الجسم (أو أي بروتين آخر لهذه المسألة) كمعيار يعطي فقط مقياسًا تقريبيًا لتركيز البروتين. المرة الوحيدة التي تعطي فيها هذه الطريقة قيمة مطلقة لتركيز البروتين هي عندما يتم استخدام البروتين الذي يتم تحليله أيضًا لإنشاء المنحنى القياسي. الطريقة الأكثر دقة لتحديد تركيز أي محلول بروتيني هي تحليل الأحماض الأمينية.

الكواشف المتداخلة لوري

العديد من المنظفات ، اليوريا ، غوانيدين حمض الهيدروكلوريك ، السكروز العالي ، كبريتات الأمونيوم ، و gt 0.1M TrisHCl ، & gt1MNa Acetate أو Na Phosphate ، EDTA ، عوامل الاختزال ، إلخ.


مشكلة مع ترسيب كبريتات الأمونيوم - ماذا أفعل؟ (أبريل / 17/2004)

ربما جرب ترشيح جل بسيط (الحجم) لتنقية البروتين الخاص بك.

أنا أعمل مع بروتين متعدد المجالات. لا يرتبط بأي عمود تقارب أو تبادل أيوني أو مسعور. لذلك حاولت كبريتات الأمونيوم pptn. بعد هطول الأمطار ، يصبح البروتين غير قابل للذوبان ولا يمكنني إعادة تعليقه في أي منطقة عازلة وجعله قابل للذوبان. كان هذا هو الحال حتى مع 10-15٪ كبريتات الأمونيوم.
لذلك تحولت إلى كبريتات الزنك بدلاً من كبريتات الأمونيوم. الآن أحصل على هذا البروتين في جزء قابل للذوبان فقط عندما أخففه كثيرًا. عندما أحاول تركيز هذا ، فإنه يترسب مرة أخرى.
الآن عندما أضع البروتين على عمود ترشيح هلامي ، فإنه يخرج قريبًا جدًا من حجم الفراغ. بالإضافة إلى أن هذا الكسر ليس نقيًا على الإطلاق.
هل يستطيع أي شخص أن يقترح بلطف كيفية تنقية هذا البروتين؟

يجب أن تذوب كبريتات الأمونيوم حتى 4.1 متر ، لذلك يجب ألا يكون محلول 4 متر في الماء المقطر مشكلة. لكنك تستخدم عادةً محلولًا مشبعًا للخلط مع محلول البروتين الخاص بك ، للحصول على النسبة المئوية المطلوبة لكبريتات الأمونيوم (أي حجم واحد من كبريتات الأمونيوم المشبعة + 1 حجم من محلول البروتين - & ترسيب كبريتات الأمونيوم بنسبة 50٪)

كنت أحاول تحضير محلول 4M من كبريتات الأمونيوم من أجل هطول الأمطار. أقوم بإضافة الماء إليه ولكنه لن يذوب تمامًا بعد ساعات طويلة من التقليب. هل يمكن لأي شخص المساعدة في تقديم بعض التفاصيل حول كيفية تحضير محلول كبريتات الأمونيوم 4M؟

أعزائي
لقد أنتجت مع إنزيم ألفا أميليز Bacillus licheniformis
بحجم 2 لتر. تم إجراء الفحص على نشاط alpha amylase وأنا متأكد من أنه يحتوي على نشاط amylase.
الآن أريد تركيز الإنزيم الخاص بي مع ترسيب كبريتات الأمونيوم ومقارنته بالترشيح الفائق ، ولكن في ثلاثة فحوصات تم إجراؤها حتى الآن لدي أي رواسب في 85 ٪ من التشبع وأيضًا أي بيليت.
لأنني أعتقد أنه يجب أن يكون لدي على الأقل 1 مليلتر من المرسب من 10-2o مل من العينة الخاصة بي ولكن لسوء الحظ ليس لدي أي مادة راسب.
أنا متوتر للغاية لأنني يجب أن أنهي عملي العملي بعد شهرين. ماذا علي أن أفعل لهذه المشكلة. ماذا تقترح ؟
شكرا لك مقدما

ماذا تعرف عن البروتين الخاص بك؟ على سبيل المثال ، هل تعرف pI؟ هل يمكنك وضع المحللة على عمود التبادل الأيوني؟ يجب أن يمكّنك هذا من التخلص من الكثير من البروتينات الأخرى وتركيز البروتين الخاص بك.

بالنسبة إلى Aparna ، هل جربت التبادل الأيوني على & quotwrong & quot pH؟ تذكر أن pI المحسوب هو نظري فقط. قد يحتوي البروتين الخاص بك على رقع مشحونة مما يعني أنه سيعمل بشكل معاكس لما & quot نصوص & quot القول. يمكنك أيضًا تجربة كروماتوغرافيا الطور العكسي المعتدل.

أنا أعمل مع بروتين متعدد المجالات. لا يرتبط بأي عمود تقارب أو تبادل أيوني أو مسعور. لذلك حاولت كبريتات الأمونيوم pptn. بعد الترسيب ، يصبح البروتين غير قابل للذوبان ولا يمكنني إعادة تعليقه في أي منطقة عازلة وجعله قابل للذوبان. كان هذا هو الحال حتى مع 10-15٪ كبريتات الأمونيوم.
لذلك تحولت إلى كبريتات الزنك بدلاً من كبريتات الأمونيوم. الآن أحصل على هذا البروتين في جزء قابل للذوبان فقط عندما أخففه كثيرًا. عندما أحاول تركيز هذا ، فإنه يترسب مرة أخرى.
الآن عندما أضع البروتين على عمود ترشيح هلامي ، فإنه يخرج قريبًا جدًا من حجم الفراغ. بالإضافة إلى أن هذا الكسر ليس نقيًا على الإطلاق.
هل يستطيع أي شخص أن يقترح بلطف كيفية تنقية هذا البروتين؟

هل جربت ترسيب الأسيتون؟ عملت بشكل جيد بالنسبة لي.

1. أضف 4 أحجام من الثلج البارد الأسيتون
2. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد أو عند -20 درجة مئوية
3. أجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة بأقصى سرعة في أجهزة الطرد المركزي منضدة. تخلص من المادة الطافية وجفف الحبيبات بالهواء.
4. اختياري: اغسل الحبيبات باستخدام 100 ميكرول من الإيثانول المثلج وجفف الحبيبات بالهواء
5. إعادة تعليق بيليه في المخزن المؤقت لتطبيق المصب.

kylvalda ما هو Buffer الذي يجب أن نستخدمه في النهاية ، لإعادة تعليق الحبيبات النهائية لتطبيق المصب؟ (عن طريق ترسيب الأسيتون كما اقترحت) ، شكرًا.

أريد فقط أن أسألك ، كيف تعرف أن ترسيب كبريتات الأمونيوم سيعمل مع البروتين بميغاواط أكثر من 20 كيلو دالتون؟
هل لديك ادب حول هذا؟
هذا من شأنه أن يساعدني ، لأنني أعمل مع إنزيم يحتوي على MW 5-10 كيلو دالتون.


سؤال: استنادًا إلى بيانات الجدول لتنقية LDH بواسطة ترسيب كبريتات الأمونيوم ، الإجابة على السؤال ، النشاط ، تركيز المستخلص غير المخفف (أومول / دقيقة * مل) إجمالي النشاط (أومول / دقيقة) خام القلب 36 5600 40٪ بيليه 120 2900 40٪ طاف 13 1700 70٪ بيليه 97 1500 70٪ طاف 1.5 200 ومن المتوقع أن يخرج LDH في 70٪ حبيبات كبريتات الأمونيوم. .

من المتوقع أن يخرج LDH في 70٪ حبيبات كبريتات الأمونيوم. سيتم تحليل جميع الكسور (طاف وكريات). • النقطة الفعلية حيث قد تختلف رواسب LDH حسب تركيز البروتين ودرجة الحرارة. سيتم تجميد بعض القسامات ، لكن لا تقم بتجميد العينات لفحص الإنزيم: قم بتخزينها عند 4 درجات مئوية. سيتم دمج الكسور ذات الكميات الكبيرة من نشاط LDH ووضعها في كيس غسيل الكلى بعد الانتهاء من ترسيب كبريتات الأمونيوم.

هل استعدت غالبية نشاط LDH في خفض الملح المتوقع (70٪ بيليه)؟

إذا كان الأمر كذلك ، توصل إلى استنتاج منطقي لخطأ قد يكون ارتكبت إذا تم العثور على البروتين الخاص بك في 70٪ طاف.

إذا لم يكن الأمر كذلك ، فأين وجدت غالبية LDH الخاص بك ، وتوصلت إلى نتيجة منطقية لخطأ ربما تكون قد ارتكبت أثناء التجربة.


مناقشة

تم تنظيم نشاط GAD في المستخلصات الخالية من الخلايا لفاكهة التفاح بواسطة كل من الأس الهيدروجيني و Ca 2+ / CaM

إن إنزيمات GAD موجودة في كل مكان في جميع الممالك ، وفي النباتات يمكن تحفيز كل من تراكم النسخ والنشاط أثناء التطور واستجابة لاضطرابات الإجهاد اللاأحيائية والحيوية [2 ، 4]. في النباتات المعرضة لضغط درجة الحرارة أو الجفاف أو الملوحة أو المعالجة الميكانيكية ، هناك زيادة في تركيز الكالسيوم 2+ داخل الخلايا [19] ، والذي من شأنه أن يعزز تحفيز GAD بواسطة Ca 2+ / CaM ، في حين أن التعرض لارتفاع ثاني أكسيد الكربون2يا2 قد يؤثر النقص والجروح على نشاط GAD عن طريق تحمض العصارة الخلوية في العديد من الأنسجة والأنواع النباتية [19 ، 20]. حيث تبين أن GABA تتراكم في ثمار التفاح أثناء التخزين في الغلاف الجوي الخاضع للرقابة ، وهذا المستوى يكون أعلى أثناء المعالجة المطولة مع ارتفاع ثاني أكسيد الكربون.2[12-14] ، افترضنا أن نشاط GAD لفاكهة التفاح يتم تحفيزه عن طريق تحمض العصارة الخلوية و / أو Ca 2+ / CaM. أظهر نشاط GAD لمستخلصات فاكهة التفاح الخالية من الخلايا نشاطًا مثاليًا عند درجة الحموضة 5.5 في وجود PLP وتشبع الغلوتامات (الجدول 1) النشاط المحدد النهائي يمكن مقارنته بـ في المختبر أنشطة الأنسجة النباتية من البطونية وفول الصويا ، أرابيدوبسيس وشتلات الصنوبر البحري [1]. تم تحفيز نشاط GAD لفاكهة التفاح بشكل كبير بواسطة Ca 2+ / CaM عند درجة الحموضة الفسيولوجية القريبة من درجة الحموضة الحمضية (الجدول 1) ، مما يشير إلى أنه يمكن تنظيمه في بلانتا بواسطة كل من Ca 2+ / CaM ودرجة الحموضة. حيث لم يكن هناك تأثير لمركب CaM ، TFP ، على في المختبر نشاط GAD ، يُقترح أن GAD لم يكن مرتبطًا بـ CaM الذاتية وأن ارتباط Ca 2+ / CaM بـ GAD يتم التحكم فيه بإحكام بواسطة معلمات ضغط جوي محددة يتم التحكم فيها. بشكل عام ، توفر الخصائص الكيميائية الحيوية لنشاط GAD في المستخلصات الخالية من الخلايا لفاكهة التفاح الدعم لوجود GAD الذي ينظمه Ca 2+ / CaM ، كما هو الحال في معظم النباتات [1]. والجدير بالذكر أن ثلاثة متجانسة جاد الجينات (ملف إضافي 1: الشكل S1) ، المعين كـ MdGAD1 ، MdGAD2 و MdGAD3، كانت موجودة في نبات التفاح (الشكل 2). MdGAD1، مثل AtGAD2، وفيرة في كل مكان ، في حين MdGAD2 و MdGAD3، مثل أتجاد 3 و AtGAD4 ، تم التعبير عنها بمستويات أقل بكثير وقد تكون مرشحة لتحريض الفاكهة من خلال الضغوط (أي ، تقشعر لها الأبدان ، O2 النقص وارتفاع ثاني أكسيد الكربون2) مفروضة أثناء التخزين في الغلاف الجوي الخاضع للرقابة (الشكل 2) [2 ، 3].

كانت GADs المؤتلفة من ثمار التفاح معتمدة على CaM ومستقلة عن CaM

من خلال استراتيجياتنا الخاصة بوضع العلامات / التنقية ، تمكنا من تأكيد هذا المؤتلف فييتم تنشيط GAD1 عند درجة الحموضة الفسيولوجية بواسطة Ca 2+ / CaM سواء تم الاحتفاظ بعلامة 6-His أم لا أثناء فحص النشاط والخصائص الطيفية (الشكلان 3 و 4). ومع ذلك ، بدت درجة التنشيط أكبر مع الشكل المؤتلف للبروتين الأصلي ، والذي يمكن أن يعزى إلى النشاط المنخفض للغاية الموجود في غياب Ca 2+ / CaM. في حين أن هذا التفسير معقد إلى حد ما بسبب الكمية المتغيرة لبروتين ملوث أصغر ، ربما منتج تحلل ، في تحضير البروتين النهائي ، فإن هذه النتائج تشير إلى أن تفسير تأثير Ca 2+ / CaM على التشكل والنشاط البيولوجي للعلامة. يجب أن يتم عمل GADs المأشوب بحذر [11].

هنا ، تم التعبير عن إصداراته ذات العلامات أو الإصدارات غير المميزة من GADs الثلاثة بالتفاح في الإشريكية القولونية ومنقى إلى التجانس أو التجانس القريب (ملف إضافي 2: الشكل S2). الوحدة الفرعية المتوقعة م ص من بروتينات التفاح الثلاثة المؤتلفة (56.6-57 كيلو دالتون) تشبه غالبية GADs النباتية ، والتي توجد على شكل سداسيات من 43-62 كيلو دالتون وحدات فرعية [1]. عرضت GADs التفاح المؤتلف ملف تعريف pH مماثل كما هو موضح لنشاط GAD في المستخلصات الخالية من الخلايا لفاكهة التفاح (الجدول 1 ، الشكل 3) ، بالإضافة إلى درجة حموضة مماثلة مثلى مع غالبية GADs النباتية ، والأنشطة مع Ca 2 + / CaM عند درجة الحموضة الفسيولوجية التي تكون مرتفعة أو أعلى من أنشطتها القصوى في الأدبيات [1]. على عكس معظم GADs النباتية ، ام ديلم يتم تنشيط GAD3 بواسطة Ca 2+ / CaM بالقرب من الأس الهيدروجيني الفسيولوجي ، على الرغم من أن التقنية / المقايسة المستخدمة في هذه الدراسة كانت قادرة بوضوح على إثبات مثل هذه العلاقة (الجدول 1 ، الشكلان 3 و 4). تاريخيًا ، تم اعتبار ارتباط CaM بالمجال الطرفي C المحفوظ ضروريًا لتخفيف التثبيط الذاتي لـ GAD عند درجة الحموضة الفسيولوجية [1]. لكن، نظام التشغيلتم العثور على GAD2 (الشكل 1) لتكون مستقلة CaM وتمتلك منطقة C- الطرفية التي هي ذاتية التثبيط [5]. ام ديGAD3 هو النبات الثاني الذي تم الإبلاغ عنه GAD والذي لا يمكن تنقيته بواسطة كروماتوجرافيا تقارب CaM والتي لا يتأثر نشاطها وخصائصها الطيفية بـ Ca 2+ / CaM. على وجه الخصوص ، ام ديGAD3 هو أول مصنع GAD يمتلك منطقة C- طرفية ليست ذاتية التثبيط (الشكل 3).

محاذاة المنطقة الطرفية C من ام ديGAD1 و ام ديأظهر GAD2 مع GADs النباتية المميزة كيميائيًا أن بقايا CaMBD الرئيسية محفوظة في إنزيمات التفاح ، وأن هذه غير موجودة في نظام التشغيلGAD2 (الشكل 1). يعتبر التربتوفان المحفوظ جيدًا وزوج من بقايا اللايسين في الطرف C ضروريًا للتفاعل مع CaM وتشكيل أوليغومرات عالية الوزن الجزيئي في دكتوراهGAD و فيGAD1 [9 ، 16 ، 21 ، 22]. بالمقارنة مع GADs النباتية المعروفة لتحفيزها بواسطة Ca 2+ / CaM ، ام دييفتقد GAD3 إلى منطقتين محاطتين موجبتين الشحنة (Lys474-Lys475 و Lys496-Lys497) وعزر Trp488-Lys489-Lys490-Phe491-Tyr492 (الشكل 1). قد يفسر استبدالها بالمخلفات غير المحفوظة نقص تحفيز Ca 2+ / CaM للمادة المؤتلفة ام ديGAD3. ومن المثير للاهتمام ، أنه يتم حفظ جميع بقايا ربط CaM تقريبًا في GADs النباتية ام ديGAD1 و ام ديGAD2 الاستثناءات الرئيسية التي لا يتم فيها حفظ الشحنة هي الاستبدالات في Lys474 و Lys 490 في ام ديGAD1 و Lys497 في ام ديGAD2 (الشكل 1).


J64419 كبريتات الأمونيوم ، عالى النقاء ، 99 +٪

كبريتات الأمونيوم عبارة عن كاشف يستخدم على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية والكروماتوغرافيا. يفيد في عزل وتنقية الانزيمات والبروتينات. يتم استخدامه لترسيب أو تجزئة البروتينات أو لتنقية الأجسام المضادة. كما أنه مفيد للتحليل البلوري للأحماض النووية والبروتينات. تستخدم كبريتات الأمونيوم أيضًا على نطاق واسع في HPLC للبروتينات ، مثل كروماتوجرافيا التفاعل الكارهة للماء. يتم استخدام كبريتات الأمونيوم في محلول PCR طويل ، وفي محلول تحلل PCR ، وفي تخليق cDNA الثاني. كما أنها تستخدم لتحليل HPLC للفوسفوليبيدات.

Примечания

Ссылки на литературу

جلعاد حاران. ريفكا كوهين. ليليانا ك بار. يشقيل بارينهولز. تدرجات كبريتات الأمونيوم عبر الغشاء في الجسيمات الشحمية تنتج فخًا فعالًا ومستقرًا للقواعد الضعيفة الأمفيباثية. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - الأغشية الحيوية. 1993, 1151 (2), 201-215.

تاج أستروب. ستين مولرتس. طريقة لوحة الفبرين لتقدير نشاط الفبرين. ارشيفات الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية. 1952, 40 (2), 346-351.

Разы опасности и предосторожности СГС

разы опасности (ЕС): H303

قد تكون ضارة إذا ما ابتلع.

разы предосторожности: P270-P301 + P312-P403-P501c

لا تأكل أو تشرب أو تدخن عند استخدام هذا المنتج. في حالة الابتلاع: اتصل بمركز السموم أو الطبيب / الطبيب إذا شعرت بتوعك. يخزن في مكان جيد التهوية. تخلص من المحتويات / الحاوية في محطة التخلص من النفايات المعتمدة


مناقشة

أظهرت الدراسات الحديثة أن الإنترفيرون من النوع الثالث (IFNs) تمتلك أنشطة بيولوجية مماثلة للأنشطة البيولوجية من النوع الأول IFNs. يمكن أن يمنع IFN-تكاثر التهاب الكبد B في الخلايا البشرية [13] وله تأثير مماثل لـ IFN-α في مرضى التهاب الكبد C (HCV) [14]. النوع الثالث IFN يمكن أن يثبط العديد من أنواع الفيروسات الأخرى ، بما في ذلك فيروس الهربس البسيط (HSV) [15] والفيروس المضخم للخلايا (CMV) [16] ، على غرار النوع الأول IFN. يشارك النوع الثالث IFN أيضًا في الاستجابة المناعية المكتسبة [17] ويمكن أن يثبط الخلايا السرطانية مع إمكانية التطبيق السريري [15].

IFN-λR1 ، وهو نوع IFN من النوع III يتم التعبير عنه بدقة بواسطة أنواع معينة من الخلايا الظهارية ومجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية ، له وحدة فرعية مستقبلية مختلفة عن نظائرها من النوع I IFN [18]. هذا يعني أن علاج IFN-قد يسبب آثارًا جانبية أقل من العلاج IFN-α ، والذي عادة ما يسبب آثارًا جانبية لا تطاق. أشارت دراسة علاج HCV إلى أن IFN-1 المرتبط له نشاط مضاد للفيروسات مماثل لـ IFN-α2b المرتبط ولكن مع آثار جانبية أقل [19]. علاوة على ذلك ، فإن خاصية التعبير المقيد للأنسجة لمستقبل IFN-تجعل IFN-1 مرشحًا واعدًا للتطبيق السريري ، خاصةً بالنسبة لبعض أمراض الأنسجة الظهارية في الجهاز التنفسي والجهاز الهضمي والتناسلية. على سبيل المثال ، هناك دليل على أن نظام IFN من النوع الثالث يلعب دورًا مهمًا في علاج الربو [20].

عبر نظام التعبير الخاص بنا في خلايا CHO عن rhIFN-λ1 بثبات وباستمرار. تحتوي خلايا Flp-In-CHO على نفس موقع FRT الكروموسومي مثل المتجه ، لذلك عندما يتم نقل pDF-IFN-λ1 المؤتلف والبلازميد المساعد pOG44 معًا إلى خلايا Flp-In-CHO ، يمكن أن يتوسط recombinase flp المشفر بواسطة pOG44 إعادة التركيب بين الجين الخارجي والحمض النووي المضيف ، مما يؤدي إلى تعبير مستقر. هنا ، تم استخدام ترسيب كبريتات الأمونيوم وثلاث خطوات كروماتوجرافيا لتنقية البروتين المستهدف لأنه لم يتم دمج rhIFN-λ1 في علامة للتنقية. وذلك لأن الأدوية البروتينية المؤتلفة للاستخدام السريري يجب ألا تحتوي على علامة. يمتلك البروتين المنقى نشاطًا عاليًا مضادًا للفيروسات. علاوة على ذلك ، يوفر نظام التعبير CHO ارتباطًا جليكوزيلًا مشابهًا لما بعد الترجمة لتلك الموجودة في البروتين البشري الداخلي [21]. تضع هذه النتائج الأساس لتطوير rhIFN-λ1 الذي يمكن تطبيقه سريريًا.


شاهد الفيديو: الاس الهيدروجيني pH (كانون الثاني 2022).