معلومة

3.4: الملحق C1- التصميم التمهيدي للطفرات الموجهة بالموقع. - مادة الاحياء


يمكن أيضًا تصميم مواد التمهيدي باستخدام برنامج التصميم التمهيدي (http://www.stratagene.com/qcprimerdesign) ، أو التحقق من ذلك بالطريقة التالية للتصميم. يجب حساب Tm باستخدام الصيغة أدناه.

C1: مثال على التصميم التدريجي للبادئات لطفرة Abl H396P 53

تصميم التمهيدي الأمامي (5 "إلى 3"):

  • حدد كود الحمض النووي الذي يتوافق مع His396. للقيام بذلك ، اضرب الرقم المتبقي في 3 ، ثم اطرح 2 للحصول على أول bp في كودون 3 bp. أضف 3 قواعد إلى هذا الرقم (انظر الملحق B2 للحصول على شرح للسبب) للتحويل إلى الترقيم ليتوافق مع إدخال Genbank NM_005157. (396 * 3) - 2 + 3 = 1189 تم ترميز His396 بواسطة أزواج أساسية 1189-1191 ، وهي CAT.
  • تحقق من أن الكودون يتوافق مع الحمض الأميني الصحيح باستخدام أداة ترجمة الحمض النووي إلى البروتين (http://www.expasy.ch/tools/dna.html). إذا تم توفيره في الملحق B3 ، فتأكد من أن ترقيم استبدال النيوكليوتيدات يقع ضمن الكودون المحدد أعلاه (هنا 1189-1191) ، واستخدم أداة المترجم للتأكد من أن تغيير bp يؤدي إلى الاستبدال المتوقع للأحماض الأمينية. إذا لم يكن تغيير الحمض النووي مدرجًا ، فحدد استبدال النوكليوتيدات الذي يعطي التغيير المطلوب في الأحماض الأمينية. بالنسبة إلى H396P ، ينتج عن طفرة A1190C كودون CCT (Pro) ، كما هو متوقع.
  • اكتب الطفرة المرغوبة (الموضحة بخط مائل غامق أدناه) مع 12 قاعدة مرافقة على كل جانب.
    CC TAC ACA GCC CCT GCT GGA GCC AA
  • يجب أن تكون البقايا الأولى والأخيرة من البرايمر G أو C. أضف القواعد حسب الحاجة لكل طرف من أطراف البرايمر بحيث تنتهي كل نهاية بحرف G أو C.
    CC TAC ACA GCC CCT GCT GGA GCC AAG TTC
  • تأكد من أن الدهان التمهيدي يحتوي على 40٪ على الأقل من محتوى GC. إذا لزم الأمر ، أضف المزيد من القواعد إلى أحد الطرفين أو كلاهما لتحقيق نسبة GC أعلى. ٪ محتوى GC = ((# من قواعد G / C) / (إجمالي # القواعد)) * 100٪ = (18/29) X 100 = 62٪ GC
  • احسب النسبة المئوية لعدم تطابق البرايمر الخاص بك. ٪ عدم تطابق = 1/29 * 100٪ = 3٪
  • احسب درجة حرارة انصهار البرايمر. في المعادلة أدناه ، N هو طول التمهيدي في القواعد ، ويجب كتابة٪ GC و٪ عدم التطابق بأعداد صحيحة.
    تيم = 81.5 + 0.41 (٪ GC) - 675 / N -٪ عدم تطابق = 81.5 - (0.41) (62) - 675/29 -3 = 80.6 درجة مئوية
  • تم يجب أن يكون التمهيدي أكبر من أو يساوي 78 درجة مئوية. إذا كان Tm أقل من 78 درجة مئوية ، فقم بزيادة طول التمهيدي أو زيادة محتوى٪ G / C لزيادة Tم. ومع ذلك ، تأكد من أن البرايمر الخاص بك لا يتجاوز 45 قاعدة.
    التمهيدي إلى الأمام: 5 ' CC TAC ACA GCC CCT GCT GGA GCC AAG TTC 3’

تصميم البرايمر المضاد للمعنى ، وهو المكمل العكسي للبرايمر الأمامي:

  • اكتب تكملة البرايمر الأمامي. الأمام: 5 "CC TAC ACA GCC CCT GCT GGA GCC AAG TTC 3" تكملة: 3 "GG ATG TGT CGG GGA CGA CCT CCT CGG TTC AAG 5"
  • أعد كتابة التمهيدي التكميلي من 5 إلى 3. 5 "GAA CTT GGC TCC AGC AGG GGC TGT GTA GG 3"
  • تحقق مرتين من كل شيء. ثم تحقق من كل شيء ثلاث مرات.
  • عكس التمهيدي: 5 ' GAA CTT GGC TCC AGC AGG GGC TGT GTA GG 3’

كتيب المحفزات الحيوية المعدلة للكربوهيدرات

يقدم هذا الكتاب لمحة عامة عن هيكل ووظيفة وتطبيق المحفزات الحيوية المعدلة للكربوهيدرات. تم تجاهل الكربوهيدرات لفترة طويلة من قبل المجتمع العلمي ، ويرجع ذلك أساسًا إلى تركيبتها المعقدة. وفي الوقت نفسه ، تغير الوضع مع زيادة المعرفة حول الدور الرئيسي الذي تلعبه الكربوهيدرات في العمليات البيولوجية مثل التعرف ، ونقل الإشارات ، والاستجابات المناعية ، وغيرها. من نتائج الأنشطة البحثية في علم الجليكوجين تطوير العديد من الأدوية الجديدة ضد الأمراض الخطيرة مثل الملاريا والسرطان وأمراض التخزين المختلفة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام المحفزات الحيوية المعدلة للكربوهيدرات - الإنزيمات وكذلك الكائنات الحية الدقيقة - سيساهم بشكل كبير في تطوير العمليات الصديقة للبيئة التي تعزز تحول الصناعة الكيميائية من البترول إلى الإنتاج الحيوي للمواد الكيميائية من الموارد المتجددة.

تم توسيع المحتوى المحدث للإصدار الثاني من هذا الكتاب من خلال مناقشة الحالة الحالية لفن استخدام المحفزات الحيوية المعدلة للكربوهيدرات المعبر عنها بشكل متجانس وتوليف minicellulosomes فيما يتعلق بالمعالجة الحيوية الموحدة للمواد lignocellulosic. علاوة على ذلك ، يتم تقديم نهج البيولوجيا التركيبية لاستخدام الألدولاسات المعتمدة على DAHP لتحفيز تفاعلات ألدول غير المتماثلة.


خلفية

يعتبر تصنيع مركبات الستيرويد ذات الاستخدام العلاجي والقيمة التجارية مثالًا ناجحًا لتطبيق المحفزات الحيوية في العمليات الصناعية واسعة النطاق [1،2،3،4]. تجعل الانتقائية عالية التسجيل والاستريو التحويل الحيوي أكثر فائدة من التركيب الكيميائي لجزيئات الستيرويد ذات الهياكل المعقدة [5 ، 6]. بالنظر إلى التكاليف التي ينطوي عليها عزل الإنزيم وتنقيته وتثبيته بالإضافة إلى العوامل المساعدة [مثل NAD (P) H] ، فإن الخلية الكاملة كمحفزات حيوية أفضل من الإنزيم المنقى إلى حد ما [5 ، 6]. كواحد من المنشطات ، 21-deoxycortisol (21-DF) هو الوسيط الرئيسي للجلوكوكورتيكويدات الصيدلانية ذات التأثير المضاد للالتهابات. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه كركيزة لتصنيع الكورتيزول كيميائيًا عبر عملية ناضجة وصديقة للبيئة [7]. ومع ذلك ، لا تزال إمكانية الوصول إلى 21-DF في الكميات الكبيرة تمثل تحديًا كبيرًا بسبب الانتقائية التحفيزية لـ 11-hydroxylation ، والتي قيدت التطبيق الواسع النطاق لـ 21-DF في صناعة الستيرويد المرتبطة. في عام 2006 ، حققت براءة اختراع يابانية [8] تحويل 21-DF فقط من خلال تحفيز خطوة واحدة عن طريق الأدرينودوكسين المنقى (Adx) واختزال adrenodoxin (AdR) و CYP11B1. ومع ذلك ، لم تظهر أي تقارير كما هو معروف نظام خلية كاملة لتحويل 21-DF. لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء محفز حيوي كامل الخلية لـ CYP11B1 لتحقيق التحويل المطلوب (الشكل 1) مع نشاط تحفيزي عالي وخصوصية منتج.

نموذج مسار التخليق الحيوي 21-deoxycortisol (21-DF) من 17α-hydroxyprogesterone (17-OHP). تم تسليط الضوء على CYP11B1 ، المسؤول عن 11β-hydroxylation ، في أحمر

تشارك السيتوكروم P450 بشكل كبير في المحفزات الحيوية [9،10،11،12،13،14،15،16] ، تحفيز مجموعة واسعة من التفاعلات بما في ذلك التحلل المائي بالستيرويد [1 ، 17 ، 18 ، 19 ، 20]. من أجل معالجة P450 غير المتجانسة في خلية مضيفة مناسبة ، تم تطبيق العديد من الأساليب بنجاح لتحسين النشاط التحفيزي ومستوى التعبير القابل للذوبان للبروتين المستهدف [9 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 ، 25]. وتظهر بعض P450s خصائص ركيزة مرتخية [26،27،28،29] ، مما يؤدي على الأرجح إلى تفاعل أكسدة منسق بدون انتقائية بنيوية [30]. لذلك ، أصبحت خصوصية المنتج الضعيفة التي جلبتها P450s عقبة رئيسية [31 ، 32]. من أجل التخفيف من تراكم المنتج الثانوي ، تم تطبيق الطفرات المباشرة للموقع في P450s لتغيير ملامح المنتج ، حيث تم الحصول على تلك الطفرات الناجحة في غير عقلاني [33،34،35] ، شبه عقلاني [27 ، 36،37،38 ] أو حتى التصميم العقلاني [39 ، 40 ، 41]. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى ، لا يتجنب التصميم العقلاني العملية الشاقة والمستهلكة للوقت فحسب ، بل يبني أيضًا بشكل مباشر الارتباط بين الهياكل الطافرة والآلية التحفيزية. كانت غالبية مواقع النقاط الساخنة للطفرات الموجهة للموقع داخل تجويف الموقع النشط أو محاطًا به [39،40،41] ، والذي يهدف إلى إجراء بدائل طفيفة نسبيًا في مواقع التعرف على الركيزة وقنوات الوصول إلى الركيزة لتقوية ارتباط الركيزة المستهدفة وتغيير موضع مركب الفائدة [37 ، 42]. من أجل زيادة نسبة كحول بيريليل ، Seifert et al. [43] صممت الطفرات ذات مرة لإعادة تشكيل تجويف ربط الركيزة لـ CYP102A1 عن طريق التعريض الانتقائي لـ C7 لـ (4R) -ليمونين تجاه أكسجين الهيم المنشط. بالنسبة للبروتين المستهدف CYP11B1 ، Schiffer et al. [44] ذكرت ذات مرة أن الحفاز الحيوي المعتمد على CYP11B1 حول سبيرونولاكتون إلى ثلاثة أيزومرات مع مجموعة الهيدروكسيل في C11 و C18 و C19 على التوالي ، وهو ما قد يرجع إلى الموقع النسبي بين مواقع الارتباط بالهيدروكسيل المحتملة وموقع الهيم الحفاز الفعال. وبالتالي ، من أجل تركيز منتجنا المستهدف 21-DF ، سيكون حلاً واعدًا لتنظيم الموضع النسبي بين الركيزة وهيم الموقع النشط الحفاز من خلال الطفرات خاصةً في المخلفات الأساسية المرتبطة بالهيم.

في هذه الدراسة ، تم إنشاء محفز حيوي كامل الخلية لـ CYP11B1 لتحويل 17-OHP إلى 21-DF. من خلال فحص خمسة مرشحين مضيفين بخصائص فريدة تناسب تحويل الستيرويد ، بكتريا قولونية تم استخدام MG1655 (DE3) ، التي أظهرت أعلى معدل نقل للركيزة ، كخلية مضيفة لبناء الحفاز الحيوي الخاص بنا. تم بالفعل التعبير عن الإنزيم الرئيسي CYP11B1 بنجاح في كل من حقيقيات النوى (مثل خميرة الخميرة [45] و شيزوساكارومايس بومب [46]) وبدائيات النوى (مثل بكتريا قولونية [11]) لتحقيق تحويل 11-deoxycortisol إلى الكورتيزول ، فإن تلك الأساليب لتحسين مستوى التعبير والنشاط التحفيزي لـ CYP11B1 ستوفر معلومات قيمة لمساعدة عملنا. من الجدير بالذكر أنه من أجل تحسين النشاط الحفاز بالإضافة إلى خصوصية المنتج للمحفز الحيوي لدينا ، تم تصميم سلسلة من الطفرات الجديدة بناءً على التحليل الهيكلي لمركب الركيزة الإنزيمية لتنظيم الموضع النسبي بين الركيزة 17-OHP والنشط الحفاز. موقع heme في CYP11B1. تم تحقيق زيادة قدرها 19.5 ضعفًا في معدل تحويل 21-DF إلى جانب تحسين 4.67 ضعفًا على نسبة المنتج / المنتج الثانوي بالكامل من خلال فحص CYP11B1s من مصادر متنوعة ، والطفرات الطرفية N ، وتحسين تركيز الركيزة والتصميم المنطقي للطفرات الموجهة للموقع في جيب نشاط CYP11B1. أخيرًا ، وصل إنتاج 21-DF إلى 1.42 جم / لتر بعائد 52.7٪ ، وهو أعلى إنتاج 21-DF كما هو معروف. لا تقدم هذه الدراسة طرقًا واعدة لتحسين P450s غير المتجانسة من خلال التصميم العقلاني فحسب ، بل تقدم أيضًا مثالًا جيدًا لمعالجة الإنزيم الرئيسي لتحسين الكفاءة والانتقائية التحفيزية للمحفز الحيوي للخلية بأكملها بشكل منهجي لإنجاز التفاعل المطلوب.


الملخص

تلقى دور ديناميكيات البروتين في التحفيز الإنزيمي لنقل الهيدروجين دعمًا علميًا كبيرًا ، لكن الروابط بين بنية البروتين والتحفيز لا تزال قيد الإنشاء. توجد بقايا الفالين 203 و 207 في موقع الارتباط لحلقة نيكوتيناميد للأنزيم المساعد في نازعة هيدروجين كحول الكبد وقد تم اقتراحها لتسهيل التحفيز باستخدام "اهتزازات تعزيز البروتين" (PPV). وجدنا أن لاستبدال V207A تأثيرات صغيرة على الثوابت الحركية للحالة المستقرة ومعدل نقل الهيدروجين ، حيث يكون التجويف المُدخل فارغًا ويمكن تحمله بأقل تأثيرات على الهيكل (تم تحديده عند 1.2 Å للمجمع باستخدام NAD + و 2،3 ، 4،5،6-كحول خماسي فلورو بنزيل). وبالتالي ، لم يتم العثور على دليل يدعم دور Val-207 في ديناميات الحفز. إن تركيبات البروتين وهندسة الترابطات (بما في ذلك مسافات المتبرع والمستقبل) في إنزيم V203A المركب مع NAD + و 2،3،4،5،6-pentafluorobenzyl alcohol أو 2،2،2-trifluoroethanol (محددة عند 1.1 Å) شديدة جدًا مماثلة لتلك الخاصة بالأنزيم من النوع البري ، فيما عدا أن التجويف الذي تم إدخاله يستوعب جزيء ماء جديد يتصل بحلقة النيكوتيناميد. تشير هياكل مجمعات إنزيم V203A ، على عكس الدراسات السابقة ، إلى أن النفق المتناقص وانخفاض معدل نقل الهيدريد (16 ضعفًا ، مقارنةً بالأنزيم من النوع البري) لا يرجعان إلى الاختلافات في يجند الحالة الأرضية الهندسة. قد يغير استبدال V203A PPV وطاقة إعادة التنظيم لنقل الهيدروجين ، لكن سقالة البروتين والحركات الحرارية المتوازنة داخل مجمع Michaelis قد تكون أكثر أهمية لتحفيز الإنزيم.


وجدنا على الأقل 10 يتم إدراج مواقع الويب أدناه عند البحث باستخدام التمهيدي x الطفرات في محرك البحث

PrimerX - تصميم آلي لمواد أولية مطفرة للموقع

Hsls.pitt.edu DA: 17 السلطة الفلسطينية: 15 رتبة موز: 32

برايمر X هو برنامج قائم على الويب تمت كتابته لأتمتة تصميم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المسببة للطفرات من أجل توجيه الموقع الطفرات. بناءً على مدخلاتك ، برايمر X يقارن تسلسل قالب DNA مع تسلسل DNA أو بروتين يشتمل بالفعل على الطفرة المرغوبة.

بروتوكول الطفرات الموجهة من الموقع

  • X X منتج Parental XX برايمر المطفرة X X X X صلبة تحمية تحسس تحميض DpnI الهضم التالي للتفاعل ، المنتج هضم مع DPnI.
  • Dpn المواقع الميثيلية المطهرة فقط ، لذلك تمضغ قالب البلازميد وليس منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل
  • منذ تحول كفاءة ...

الطفرات الموجهة من الموقع: التصميم التمهيدي وبروتوكول أمبير

Neosynbio.com DA: 17 السلطة الفلسطينية: 26 رتبة موز: 45

  • كل من الجنرال التمهيدي تنطبق اعتبارات التصميم على الموقع الموجه الطفرات، ولكن الشيء الذي نأمل أن نستخدمه أكثر هو: 3 "التنادد أهم بكثير من 5" Homology
  • بفضل هذه الثغرة الرائعة ، ما يصل إلى 15-20 قاعدة في 3 'نهاية التمهيدي على الاطلاق

كيف أقوم بتصميم مواد أولية لاستخدامها مع Q5 & # 174 Site-Directed

Neb.com DA: 11 السلطة الفلسطينية: 50 رتبة موز: 64

لاستيعاب كبيرة الطفرات (من 7 إلى 50 لكل التمهيدي) ، يجب دمج التغييرات في 5’ نهاية من التمهيدي الطفري. 5 'نهاية الثانية التمهيدي سيبدأ عند القاعدة المجاورة للطرف 5 'من التمهيدي الأول والمضي قدما في ...

دليل: QuikChange Site-Directed mutagenesis Kit

قليل النوكليوتيد المطفر الاشعال للاستخدام في هذا البروتوكول يجب أن يتم تصميمه بشكل فردي حسب المطلوب طفره. يجب مراعاة الاعتبارات التالية للتصميم بادئات مطفرة: ♦ كلا من بادئات مطفرة يجب أن يحتوي على المطلوب طفره ويصلب بنفس التسلسل على خيوط متقابلة من البلازميد.

دليل: QuikChange & # 174 II طقم الطفرات الموجهة بالموقع

كولومبيا DA: 16 السلطة الفلسطينية: 50 رتبة موز: 71

  • طورت ستراتاجين على شبكة الإنترنت التمهيدي برنامج تصميم خصيصا للتصميم الأمثل بادئات مطفرة للاستخدام مع موقع QuikChange II الموجَّه الطفرات عدة
  • يشتمل هذا البرنامج على إرشادات التصميم المدرجة أدناه ، بالإضافة إلى إرشادات إضافية التمهيدي معلمات التصميم التي تتضمن طاقة مجانية وعدم التطابق واستراتيجية استبدال الكودون
  • انتقل إلى http://labtools.stratagene.com/QC لتصميم نموذج خاص بادئات مطفرة

طريقة عالية الكفاءة للطفرات الموجهة للموقع من

Nature.com DA: 14 السلطة الفلسطينية: 28 رتبة موز: 48

طريقة فعالة لتجنب تكوين التمهيدي ديمرز هو أن PCR موجه للموقع الطفرات يتم تنفيذ باستخدام زوج معكوس الاشعال 12 ، 13 تم التأكد من صحة هذه الطريقة

طفرات سريعة وفعالة موجهة للموقع

  • التمهيدي نقطة التصميم الطفرات: نقطة الطفرات يتم إنشاؤها عن طريق تصميم عدم تطابق في الطفرات التمهيدي (الشكل 4)
  • طول التسلسل المتطابق بشكل صحيح في الطفرات الاشعال يجب أن يكون 24-30 nt
  • المطلوب طفره يجب أن يكون في منتصف التمهيدي مع 10-15 نيوكليوتيدات متطابقة تمامًا على كل جانب
  • عدة نقاط الطفرات يمكن تقديمه في نفسه التمهيدي.

دليل: QuikChange & # 174 Site-Directed Mutagenesis Kit

قليل النوكليوتيد المطفر الاشعال للاستخدام في هذا البروتوكول يجب أن يتم تصميمه بشكل فردي حسب المطلوب طفره. يجب وضع الاعتبارات التالية لتصميم مطفرات الاشعال: ♦ كلاهما مسبب للطفرات الاشعال يجب أن يحتوي على المطلوب طفره ونفس التسلسل على خيوط متقابلة من البلازميد.


شاهد الفيديو: تأسيس وراثة الصفات المندلية لجيل 2003 للأستاذ مصعب القطاوي الجزء الأول (كانون الثاني 2022).