معلومة

ما هي نسبة البروتينات التي تتطلب الطي بمساعدة الكفيل؟


أنا جديد في مجال الكيمياء الحيوية (أنا كيميائي في الواقع).

لقد عرفت منذ فترة طويلة أن عملية الطي هي العملية التي تؤدي إلى الحد الأدنى من تشكيل الطاقة للبروتين.

الآن ، تعرفت على المرافقين ، الذين لم أكن أعرفهم من قبل.

ما أتساءل عنه هو: وجهة نظري السابقة عن الطي ، كإجراء "التجميع الذاتي" (يطوي البروتين بدون مساعدة خارجية حيث يتم تجميعه بواسطة الريبوسوم) حقيقي ، أم أن أي عملية طي بمساعدة المرافقين؟

في حالة وجود كلتا العمليتين ، ما مدى تكرار الطي "المساعد" مقارنة بالعملية التلقائية؟


أتذكر مراجعة رائعة في Trends in Biochemical Sciences التي تناقش البروتينات المرافقة المستقلة والمعتمدة جزئيًا والمعتمدة كليًا في بدائيات النوى. كان الاستنتاج هو أن عديد الببتيدات الأصغر تقل احتمالية أن تتطلب مساعدة المرافق. هذا هو شكلهم:

لا يزال هذا المبدأ ساريًا إلى حد معين (في بدائيات النوى) ، لكن المساعدة في الطي أصبحت الآن مفهومة على نطاق أوسع لتشمل أكثر بكثير من مجرد بروتينات محددة تم تحديدها على أنها مرافقة جزيئية. قد يظل افتراض Anfinsen (أن البنية الثلاثية النهائية للبروتين يعتمد فقط على هيكله الأساسي) صامدًا للبروتينات الكروية الصغيرة ، لكن الطي في الجسم الحي يكاد يكون مؤكدًا دائما ساعد. نظرًا لأنك قادم من منظور كيميائي ، فلا تفكر في الأمر على أنه تفاعل بين جزيئين في المحلول. إنه تفاعل في هلام مليء بالسكريات المعقدة والدهون والبروتينات والأحماض النووية.

إذا كنت تشك في منظور السيتوبلازم المزدحم ، فاقرأ المراجعة التي ربطتها. إنه جانب مهم ولكن غالبًا ما لا يحظى بالتقدير الكافي في الكيمياء الحيوية في الجسم الحي. هنالك كثير اقرأ المزيد عنها. قد تحاول البحث عن Allen Minton (AP Minton) والتزاحم الجزيئي في قاعدة البيانات المفضلة لديك.


طي البروتين بمساعدة الكفيل: الطريق إلى الاكتشاف من منظور شخصي

طي البروتين هو العملية التي تكتسب من خلالها سلاسل البولي ببتيد المركبة حديثًا الهياكل ثلاثية الأبعاد اللازمة للوظيفة البيولوجية. لسنوات عديدة ، كان يُعتقد أن طي البروتين يحدث تلقائيًا ، على أساس التجارب الرائدة لكريستيان أنفينسن ، الذي أظهر في أواخر الخمسينيات من القرن الماضي أن البروتينات المنقاة يمكن أن تنثني من تلقاء نفسها بعد إزالتها من المُحول 1. اكتشف Anfinsen المبدأ الأساسي القائل بأن تسلسل الأحماض الأمينية الخطية يحتوي على جميع المعلومات اللازمة لتحديد البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين. ولكن سرعان ما أصبح واضحًا أن تجارب طي أنبوب الاختبار تعمل في الغالب مع البروتينات الصغيرة أحادية المجال ، وغالبًا فقط في ظروف بعيدة جدًا عن تلك الموجودة في الخلية. غالبًا ما تفشل البروتينات الكبيرة في الوصول إلى الحالة الأصلية في ظل هذه الظروف التجريبية ، مما يؤدي إلى تشكيل مجاميع غير وظيفية بدلاً من ذلك. على الرغم من هذه المشاكل ، لم يكن طي البروتين ذا أهمية كبيرة لعلماء الأحياء الخلوية حتى منتصف وأواخر الثمانينيات ، عندما بدأت قصة المرافقة تتكشف. نتيجة لذلك ، نحن نعلم الآن أنه في الخلايا ، تتطلب العديد من البروتينات (ربما معظمها) مرافقات جزيئية وطاقة استقلابية لتنطوي بكفاءة وبمعدل مناسب من الناحية البيولوجية. أصف هنا ، من منظور شخصي ، التطورات التي أدت إلى هذه النظرة الجديدة.


بسيطة عن طريق المقارنة

تبدو الهندسة العكسية لخاصية Hyperdrive بسيطة بالمقارنة. في عام 1994 ، بدأ أستاذ مسابقة لمتخصصي الذكاء الاصطناعي تسمى CASP: تقييم نقدي لتوقع بنية [البروتين]. كل عامين ، يحاول المتسابقون توقع ثنية البروتين من تسلسل الأحماض الأمينية وحدها ، دون معرفة الطية مسبقًا. قبل الآن ، تم تحقيق النتائج من 20 إلى 40 في اختبار المسافة العالمية (GDT) ، وهو مقياس للمسافة بين مواضع الأحماض الأمينية المتوقعة عكس المواقف البيولوجية الفعلية. حققت DeepMind متوسط ​​درجة 60 مع AlphaFold في عام 2018. وزادتها بشكل كبير هذا العام إلى 92.4. يصور إدخال المدونة مدى تطابق الطية المتوقعة مع الطية الفعلية لحالتين. يبدو أنها تتداخل بشكل وثيق للغاية.

يمثل هذا العمل الحسابي تقدم مذهل حول مشكلة طي البروتين ، وهو تحد كبير عمره 50 عامًا في علم الأحياء. لديها حدثت قبل عقود من توقع كثير من الناس في هذا المجال. سيكون من المثير رؤية الطرق العديدة التي سيغير بها البحث البيولوجي بشكل أساسي.

استلهم تحقيق هذا النجاح من علم الأحياء والفيزياء والتعلم الآلي ، جنبًا إلى جنب مع كبار الخبراء في بنية البروتين. قام الفريق ببناء شبكة عصبية للتعامل مع التحدي ، وحل مجموعات صغيرة من الأحماض الأمينية ثم استخدام طرق التعلم العميق لاستكشاف كيف يمكن أن ينضموا. ومع ذلك ، فإن مسابقة CASP تستخدم بروتينات بسيطة نسبيًا تسمى المجالات. يواجه AlphaFold صعوبة أكبر في اكتشاف البروتينات التي تتفاعل. أخبار الطبيعة يقول ،

الشبكة أيضا تكافح لنمذجة الهياكل الفردية في مجمعات البروتين، أو المجموعات ، بموجبها التفاعلات مع بروتينات أخرى تشوه أشكالها.

ومع ذلك ، فإن النجاح يمثل "قفزة هائلة" من شأنها أن "تغير كل شيء" ، كما كتب إوين كالواي. بأنهي طريقة؟ يشرح جون مولت ، الأستاذ في جامعة ماريلاند الذي شارك في تأسيس CASP ، في العالم,

هذا سوف يغير الطب. سوف يغير البحث. سوف يغير الهندسة الحيوية. سوف يغير كل شيء، "أندريه لوباس ، عالم الأحياء التطوري في معهد ماكس بلانك لعلم الأحياء التنموي في ألمانيا الذي ساعد في الحكم على المسابقة ، يقول طبيعة سجية، مضيفًا أن AlphaFold استغرق 30 دقيقة فقط لإنتاج بنية بروتين كان مختبره يحاول اكتشافه لمدة 10 سنوات.

الكتابة علم مجلة ، يضيف روبرت ف.

معرفة هذه الأشكال يساعد الباحثين ابتكار الأدوية يمكن أن تستوعب البروتينات & # 8217 الشقوق. والقدرة على تصنيع البروتينات بالبنية المرغوبة يمكن ذلك سرعة تطوير الإنزيمات لصنع الوقود الحيوي وتحطيم نفايات البلاستيك.


مقدمة

إن الكائنات الحية الدقيقة (بالمعنى الحرفي للكلمة ، الكائنات المحبة للبرد) هي في الأساس كائنات دقيقة تزدهر في البيئات الباردة بشكل دائم وحتى في درجات حرارة تحت الصفر في الماء السائل فائق البرودة. تتم مواجهة مثل هذه الظروف شديدة البرودة ، على سبيل المثال ، في المبردات المالحة عند درجة حرارة -10 درجة مئوية في التربة الصقيعية (Gilichinsky وآخرون. ، 2005) أو في عروق المحلول الملحي بين بلورات الجليد البحري القطبية عند درجة حرارة -20 درجة مئوية (دمينغ ، 2002). كما تم وصف الميكروبات غير العادية مثل الصخور المسامية في الوديان الجافة في أنتاركتيكا التي تستضيف مجتمعات ميكروبية تعيش عند درجة حرارة -60 درجة مئوية (فريدمان ، 1982 كاري. وآخرون، 2010). هذه الكائنات الحية لا تعيش فقط أو تتحمل مثل هذه الظروف القاسية للغاية ولكنها تتكيف بشكل لا رجعة فيه مع هذه البيئات ، حيث أن معظم المتقلبين النفسيين غير قادرين على النمو في درجات حرارة معتدلة (أو متوسطة). غالبًا ما يتم التغاضي عن أن غالبية الغلاف الحيوي للأرض (80٪) بارد ويتعرض بشكل دائم لدرجات حرارة أقل من 5 درجات مئوية (رودريغز وتيدجي ، 2008). ينشأ متوسط ​​درجة الحرارة المنخفضة هذا بشكل أساسي من حقيقة أن 70 ٪ من سطح الأرض مغطاة بمحيطات لها درجة حرارة ثابتة تبلغ 4 درجات مئوية تحت عمق 1000 متر ، بغض النظر عن خط العرض. تمثل المناطق القطبية 15 ٪ أخرى ، والتي يجب أن تضاف إليها مناطق الأنهار الجليدية وجبال الألب ، بالإضافة إلى التربة الصقيعية التي تمثل أكثر من 20 ٪ من التربة الأرضية (كوان وآخرون. ، 2007 Margesin وآخرون، 2008). تم استعمار كل هذه البيئات الحيوية ذات درجات الحرارة المنخفضة بنجاح بواسطة كائنات متكيفة مع البرودة ، والتي تشمل مجموعة كبيرة من الممثلين من المجالات الثلاثة: بكتيريا, العتيقة و حقيقيات النوى. ونتيجة لذلك ، فإن الأشخاص الذين يعانون من نفس المرض هم الأكثر وفرة من حيث الكتلة الحيوية والتنوع والتوزيع.

تتطلب الحياة في البيئات الباردة مجموعة واسعة من الميزات التكيفية على جميع مستويات بنية الخلية ووظيفتها تقريبًا. في الواقع ، يمارس البرد قيودًا فيزيائية كيميائية شديدة على الكائنات الحية بما في ذلك زيادة لزوجة الماء ، وانخفاض معدلات الانتشار الجزيئي ، وانخفاض معدلات التفاعل الكيميائي الحيوي ، واضطراب التفاعلات الضعيفة التي تؤدي إلى التعرف على الجزيئات والتفاعل ، وتقوية الروابط الهيدروجينية التي ، على سبيل المثال ، تثبت هياكل الأحماض النووية المثبطة ، زيادة قابلية الذوبان في الغازات واستقرار المستقلبات السامة وكذلك انخفاض سيولة الأغشية الخلوية (D'Amico وآخرون. ، 2006 جيرداي وجلانسدورف ، 2007 مارجيسين وآخرون، 2008 Rodrigues and Tiedje ، 2008). ركزت الدراسات السابقة للمركبات العقلية على المستوى الجزيئي بشكل أساسي على الإنزيمات النشطة الباردة وعلى الحفاظ على سيولة الغشاء لأن كلا العمليتين كانت تعتبر من المتطلبات الأساسية للتكيف البيئي. لقد تبين أن المستوى العالي من النشاط المحدد في درجات حرارة منخفضة من الإنزيمات المتكيفة مع البرودة هو تكيف رئيسي لتعويض الانخفاض الأسي في معدلات التفاعل الكيميائي مع انخفاض درجة الحرارة. ينشأ هذا النشاط التحفيزي الحيوي المرتفع من اختفاء تفاعلات تثبيت غير تساهمية مختلفة ، مما أدى إلى تحسين مرونة تشكيل الإنزيم (Feller and Gerday، 2003 Siddiqui and Cavicchioli، 2006 Feller، 2010). وتجدر الإشارة إلى أن هذه الميزة التكيفية مشفرة وراثيًا ضمن تسلسل البروتين وتنتج عن تكيف طويل المدى. في حين أن الهياكل الغشائية تكون صلبة في الظروف الباردة ، فإن السيولة الكافية مطلوبة للحفاظ على سلامة وظائفها الفسيولوجية. يتم تحقيق هذه اللزوجة المنزلية من خلال عوائق ستريولوجية يتم إدخالها في طبقة ثنائية الدهون عن طريق دمج رابطة الدول المستقلة- الدهون غير المشبعة والمتفرعة السلسلة ، وانخفاض متوسط ​​طول السلسلة ، وزيادة في كل من الميثيل المتفرعة ونسبة انتيسو- إلى ايزو- الامتياز (راسل ، 2007). يتضمن هذا التكيف تنظيم مسارات التخليق الحيوي الموجودة مسبقًا. في الآونة الأخيرة ، العديد من الجينومات من البكتيريا و العتيقة تم تسلسلها (Casanueva وآخرون. ، 2010) ولكن تم تحليل القليل منها فقط فيما يتعلق بالتكيف البارد (Saunders وآخرون. ، 2003 رابوس وآخرون. ، 2004 ميديج وآخرون. ، 2005 ميثي وآخرون. ، 2005 Duchaud وآخرون. ، 2007 رايلي وآخرون. ، 2008 رودريغز وآخرون. ، 2008 ألين وآخرون. ، 2009 أيالا ديل ريو وآخرون، 2010). كما تم استخدام الدراسات البروتينية والنسخية للكائنات الحية الدقيقة المتكيفة مع البرودة للبحث عن الوظائف الخلوية التي يتم تحفيزها للنمو في البرد (Goodchild وآخرون. ، 2004 2005 Qiu وآخرون. ، 2006 بكرمانز وآخرون. ، 2007 كاواموتو وآخرون. ، 2007 تشنغ وآخرون. ، 2007 بيرغولز وآخرون. ، 2009 كامبانارو وآخرون. ، 2011 تينغ وآخرون. ، 2010 وليامز وآخرون., 2010 ).

لسنوات عديدة ، تم اعتبار تخليق البروتين وطي البروتين من العمليات الخلوية الحساسة لدرجة الحرارة التي تقيد بشدة نمو الميكروبات في درجات حرارة منخفضة في غياب تكيفات محددة. على الرغم من هذا القيد المعترف به جيدًا ، لم تتم معالجة التحدي المتمثل في تخليق البروتين والطي في الكائنات النفسية إلا مؤخرًا ، بشكل رئيسي عن طريق علم الجينوم والبروتيوميات. تقنيات "omics" المختلفة (Casanueva وآخرون. ، 2010) قد أنتجت كمية هائلة من البيانات. ومع ذلك ، فقد حال هذا دون إجراء تحليل دقيق لمشكلة طي البروتين ، والتي تعتبر أساسية للتكيف الميكروبي مع البرودة. نأمل أن نقدم هنا مسحًا شاملاً ومتكاملاً لهذا الموضوع (أي الحقائق) ، من أجل تسليط الضوء على بعض القضايا الحالية واقتراح السبل المستقبلية للدراسة في هذا المجال.


مواد وطرق SI

تفاصيل إضافية للتنبؤ بالثبات الحراري للبروتين.

فيما يلي تفصيل لتعبيرات Dill و Oobatake للتنبؤ باستقرار درجة حرارة البروتين.

تمت صياغة تعبير Dill (21) بناءً على أدلة تجريبية وفيرة ودراسات نظرية تظهر كميات حرارية مثل المحتوى الحراري Δ H و entropy Δ S و C p كلها تعتمد بشكل أساسي على عدد الأحماض الأمينية في البروتين. تم تجهيز هذه التبعيات الخطية جيدًا لـ 59 بروتينًا متوسطيًا من خلال التعبيرات من المرجع. 21 Δ G (N، T) = Δ H (T h، N) + Δ C p (N) (T - T h) - T Δ S (T s، N) - T Δ C p (N) ln ( T / T s) [S1] Δ H (T = T h، N) = (4.0 N + 143) k J / mol Δ S (T = T s، N) = (13.27 N + 448) J / (مول ⋅ K) Δ C p (N) = (0.048 N + 0.85) k J / (mol ⋅ K) ، [S2] حيث تؤخذ درجات الحرارة المرجعية لتكون T h = 373.5 K و T s = 385 K.

تقوم طريقة Oobatake (46) بتقييم الطاقة الحرة التي تتكشف بشكل تجريبي مقابل القيم التجريبية بناءً على الافتراضات التي (أنا) تتناسب البيانات الديناميكية الحرارية لكل مجموعة وظيفية مع مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بالمذيب للمجموعة الكيميائية نفسها و (ثانيا) الطاقة الحرة لتكشف البروتين هي مجموع المساهمات من جميع المجموعات الفردية. بعد ملاءمة المساهمات الديناميكية الحرارية من كل نوع من الأحماض الأمينية باستخدام معلومات الهيكل المتاحة من قاعدة بيانات PDB ، يمكن التنبؤ بالطاقة الحرة المتكشفة للبروتين من المجموع المرجح للمساهمات من تسلسل الأحماض الأمينية مباشرة عند درجة الحرارة المرجعية (تي0 = 25 درجة مئوية). لجميع درجات الحرارة الأخرى ، Δ G (T) = Δ H (T 0) + Δ C p (T - T 0) - T Δ S (T 0) - T Δ C pln (T / T 0) ، بافتراض Δ C p مستقل عن درجة الحرارة.

تفاصيل إضافية لإعادة بناء النموذج.

يتم إعادة بناء FoldME بثلاثة مسارات أساسية: مسار الطي التلقائي ، ومسار الطي بمساعدة DnaK ، ومسار الطي بوساطة GroEL / ES. يتم تمكين المسارات الثلاثة لكل بروتين مؤهل في النموذج ، مما يؤدي إلى زيادة كبيرة في عدد تفاعلات النموذج. في الوقت نفسه ، يوفر هذا التكرار للشبكة مرونة كبيرة في الاستجابات البروتينية ونموًا قويًا للخلية في ظل البيئات المتغيرة. تم توضيح التفاعلات الأولية لكل مسار في الشكل 1أ، والتفاصيل الإضافية لتفاعلات الطي بمساعدة المرافقة موضحة أدناه.

يتم كتابة تدفق مسار الطي التلقائي ، بحكم التعريف ، على النحو التالي V f o l d i n g = k f (T) [U] e q ، حيث [U] e q هي وفرة التوازن الخلوي للبروتين غير المطوي. يتم تحديد تخفيف الببتيد غير المطوي بسبب النمو بواسطة V d i l u t i o n = μ [U] e q ، حيث μ هو معدل النمو. نظرًا لأن [U] eq يعتمد على استقرار البروتين وفقًا لقانون Boltzmann ، [U] eq [P] إجمالي = K eq (T) 1 + K eq (T) ، فإننا نلتقط التغير المعتمد على درجة الحرارة في الكسر غير المطوي للفرد البروتينات باستخدام قيد اقتران V التخفيف V الطي ≥ μ kf (T) + K eq (T). [S3] تمت دراسة الطي بمساعدة DnaK على نطاق واسع نظرًا لتنوع وظائفه ودوره المركزي في الحفاظ على البروتين الخلوي (18 ، 28). في بكتريا قولونية، DnaK يربط ويطلق الببتيد الركيزة عن طريق التبديل بين الحالة المرتبطة بـ ATP منخفضة التقارب والحالة المرتبطة بـ ADP عالية التقارب ، والتي يتم التحكم فيها بواسطة Cohaperone DnaJ وعامل تبادل النيوكليوتيدات GrpE. نشير إلى دورة التفاعل بثلاث خطوات أساسية (الشكل 1أ): (أنا) ارتباط الركيزة بوساطة DnaJ بـ DnaK (V K 1) ، (ثانيا) التحلل المائي لـ ATP المحفز بـ DnaJ والتغيير التوافقي من ATP- إلى الحالة المرتبطة بـ ADP لمركب DnaK الببتيد (V K 2) ، و (ثالثا) تبادل النوكليوتيدات الناجم عن GrpE وإطلاق الركيزة اللاحقة. تُستخدم معدلات التفاعل الظاهرة المقاسة من الحركية في الوقت الفعلي (29) لتقييد V K 1 (0.04 ثانية - 1) و V K 2 (1.0 ثانية - 1) ، على التوالي.

يتم بعد ذلك تكرار الخطوة الثالثة في تفاعلين متكافئين ، يمثلان حدثًا ناجحًا للطي بمساعدة DnaK (V K 3) ودورة تفاعل DnaK غير مثمرة التي تطلق الببتيد غير المطوي (V K 3). تم تصميم هذا الزوج من تفاعلات الطي المضاعفة ليعكس حقيقة أن دورة ربط مرافقة واحدة لا تكفي عادةً لإصلاح البروتين المريض بالكامل. بالنسبة لكل من HSP70 (31) ونظام chaperonin (32) ، تبين أن الدورات المتكررة للإفراج الكامل وإعادة ربط الببتيد مطلوبة حتى تصل الركيزة إلى حالتها النشطة. تم تطبيق فكرة زوج من تفاعلات الطي المكررة مسبقًا لبناء نموذج حركي لـ HSP70 (11). أظهر النموذج أن HSP70 يطوي لوسيفيراز اليراع بعامل احتمالي قدره 2.68٪ في أي دورة معينة ، أي بمعدل 38 دورة لإعادة التشكيل الناجح. اقترح المؤلف أن يكون احتمال الانعكاس "معلمة مميزة اعتمادًا على طبيعة الركيزة وتسلسلها وطيها وطاقتها الطبيعية للطي" (المرجع 11 ، ص 502). نحاول التقاط هذه الخاصية الخاصة بالبروتين مع بعض الافتراضات البديهية: (أنا) بالنسبة للبروتينات المستقرة ، يمكن لكل دورة ربط تشبيرون إصلاح تسلسل واحد معرض للتجميع على الببتيد غير المطوي ، بحيث يكون الحد الأقصى لعدد دورات ربط المرافقة لطي الببتيد مساويًا لها agg (ثانيا) للببتيدات غير المستقرة ، كل agg يمكن لدورة ربط الكفيل أن تطوي الببتيد باحتمال مساوٍ لجزء البروتين الأصلي عند التوازن P N = 1 / (1 + K e q). مجتمعة ، العدد الإجمالي لدورات ربط المرافقة اللازمة لطي البروتين المتوسط ​​هو agg ⋅ (1 + K e ⁢ q) ، مما أدى إلى قيود الاقتران التالية بين تدفقات هذا الزوج من التفاعلات: V K 3 ⋅ a g g ⋅ (1 + K e q (T)) ≤ V K 3 ′. [S4] بالنظر إلى أن معظم البروتينات مستقرة بشكل هامشي (0 & lt K e q & lt 1) وتتنوع أغراضها بين 0 و 28 ، يجب أن يكون عدد دورات ربط المرافقة المطلوبة مشابهًا لتلك المقدرة بالنسبة لـ luciferase اليراع في المرجع. 11 ولعملاء من الدرجة الأولى والثالثة GroEL في المرجع. 33. لذلك ، فإننا نعتبر أن تركيبتنا تعكس إلى حد كبير الكمية الفسيولوجية للمرافقين المطلوبة في طي الجسم الحي.

يوصف الطي بوساطة GroEL / ES بثلاث خطوات أساسية (12): (أنا) ربط الببتيد المكشوف و ATPs ثم GroES لتغليف حلقة GroEL (ثانيا) التحلل المائي ATP الذي يؤدي إلى مزيد من التغييرات التوافقية ويسمح للببتيد بالثني داخل القفص و (ثالثا) إطلاق جزيئات GroES و ADP والببتيد الموجود بالداخل. على عكس الطي بمساعدة DnaK حيث يكون إطلاق الركيزة هو خطوة تحديد المعدل ، يتم قياس التحلل المائي لـ ATP ليكون أبطأ بمقدار واحد إلى ثلاثة أوامر من حيث الحجم من التفاعلات الأولية الأخرى في دورة الطي بوساطة GroEL / ES (30). نقوم بتقييد التدفق من خلال دورة تفاعل الطي بوساطة GroEL / ES ، باستخدام معدل التحلل المائي ATP المُقاس تجريبياً والذي يبلغ 0.12 ثانية -1. وبالمثل ، يتم تكرار الخطوة الثالثة لإنتاج إما الببتيد غير المطوي أو الإنزيم الأصلي.

يوفر تجويف GroEL / ES المغلق بيئة معزولة كارهة للماء مع سطح مشحون سالبًا قد يغير مشهد طاقة البروتين وبالتالي يزيد من معدل الطي. يمكن تغليف البروتينات ذات الوزن الجزيئي 60 كيلو دالتون بالكامل والسماح لها بالثني بحرية داخل القفص حتى يتم تحلل جميع ATPs السبعة وتحرير غطاء GroES. يجب أن تسهل هذه العملية الطي بكفاءة أكبر بكثير من مرافقة DnaK. ومع ذلك ، بدون المعلومات المناسبة لمقارنة نظامي المرافقين ، نستخدم الآن عامل تحجيم واحد (الميل _ التحجيم) لربط التفاعلات المكررة VG 3 و VG 3 ′: VG 3 ⋅ agg ⋅ القابلية _ التحجيم ⋅ (1 + K eq (T)) ≤ VG 3 ′. [S5] p r o p e n s i t y _ s c a l i n g مضبوط على 0.45 في FoldME ، بحيث تستهلك كل من عمليات الطي المدعومة بـ DnaK و GroEL / ES نفس المقدار من ATPs لكل حدث طي ناجح. تباينت هذه المعلمة من 0.1 إلى 1 في سلسلة من عمليات المحاكاة ، ولم تعط أي تغيير واضح في تنبؤ النمط الظاهري.

مقارنة بين التنبؤ النموذجي مع المركبات الجزيئية وبدونها.

تحافظ شبكة المرافقة على المستوى الخلوي للجزء الإجمالي غير المطوي من البروتين. بدون مرافقين في النموذج ، تظهر المحاكاة عدم نمو الخلية. لذلك ، نقوم بشكل مستقل بأخذ عينات من معدل الطي الحركي والثبات الحراري لكل بروتين في عمليات المحاكاة. نتيجة لذلك ، لاحظنا ارتباطًا مضادًا بين معدلات النمو المحاكاة والجزء الإجمالي غير المطوي للبروتين (الشكل S1).ب). مع عمل المرافقين في الشبكة المصممة ، يتم الاحتفاظ بالجزء الإجمالي غير المطوي عند مستوى منخفض بين 0.1٪ و 1٪ بغض النظر عن كيفية تغير معدل النمو مع درجة الحرارة.

استهلاك الطاقة لتفاعلات الطي بمساعدة الكفيل.

يتم احتساب متطلبات الطاقة للطي بمساعدة الكفيل بشكل صريح في شكل تفاعلات التحلل المائي ATP (الشكل 1).أ). يستهلك الطي بمساعدة DnaK جزيء ATP واحدًا لكل دورة ، ويستهلك الطي بمساعدة GroEL / ES سبعة. يرتبط عدد دورات ربط المرافقة المطلوبة لطي البروتين بالخصائص الديناميكية الحرارية للبروتين المعني. ومن ثم ، تزداد تكلفة الطاقة للطي بمساعدة الكفيل مع زيادة ميل البروتين للتجمع و / أو انخفاض ثباته.

للحصول على فكرة تقريبية عن التكلفة الإجمالية للطاقة للطي بمساعدة المرافقة في خلية متنامية ، قمنا بمقارنة إجمالي استهلاك ATP على الطي بمساعدة DnaK و GroEL / ES مع استهلاك GTP عند الترجمة (الشكل S1ج). بالنظر إلى أن التحلل المائي لـ GTP و ATP مكافئ تقريبًا للطاقة ، فإننا نقدر أن الطي بمساعدة المرافقة يستهلك حوالي 1.6 ٪ من الطاقة المستهلكة عن طريق الترجمة عند درجة الحرارة الفسيولوجية 37 درجة مئوية. يزداد هذا الرقم بشكل كبير إلى ∼ 38٪ عند 45 درجة مئوية. نجادل بأن تكلفة الطاقة لنشاط المرافق تعدل نمو الخلية في جانبين: (أنا) تضيف تكلفة الطاقة النسبية بين أنظمة المرافقة المختلفة تعقيدًا آخر لتقسيم عبء طي البروتين و (2) إجمالي الطاقة المتضمنة في طي البروتين هي كمية كبيرة من الموارد الخلوية التي يجب تحسينها للتكيف في درجات الحرارة العالية. ومع ذلك ، لم نعثر على قياس تجريبي مباشر للتحقق من صحة هذا التقدير.

مقارنة بين التعبير الجيني التفاضلي تحت درجة الحرارة والاضطرابات الجينية.

بمعدلات نمو مماثلة ، تُظهر الضغوط المتكشفة الناتجة عن الطفرات الجينية والصدمة الحرارية تعبيرًا متحيزًا تجاه البروتينات الأكثر وفرة ، بينما تسبب الصدمة الحرارية اختلافات عامة أكبر. العديد من مسارات التخليق الحيوي للعامل المساعد التي تم تحديدها على أنها حساسة للحرارة في Chang et al. (26) (على سبيل المثال ، فلافين ، هيم) تخضع للتنظيم باستمرار. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب التنبؤ بمخطط تخصيص البروتين الذي يتم اعتماده لأي حالة معينة بدون محاكاة الشبكة متعددة المستويات. على سبيل المثال ، يشترك التركيب البروتيني لمتحول DHFR في بعض الميزات مع الخلية التي تطورت لتنمو عند 30 درجة مئوية حيث يكون الضغط المتكشف منخفضًا. من بين أشياء أخرى ، يتم تنظيم ناقلات الأيونات ومركب انشقاق الجلايسين في كلتا الحالتين ويتم تنظيم مسار التخليق الحيوي للبيريميدين deoxyribonucleotide في كلتا الحالتين. في مثال آخر ، يتم تنظيم مجموعات مماثلة من الجينات استجابةً للضغوط الناشئة عن ارتفاع درجة الحرارة (46 درجة مئوية) وطفرة DHFR المزعزعة للاستقرار (I91L + W133V). ومع ذلك ، يتم تنظيم الجينات المسؤولة عن التخليق الحيوي للهيم ورباعي البيرول عند 46 درجة مئوية ، ولكن يتم تنظيمها في الحالة الأخيرة. توضح المقارنة المقدمة هنا مدى تعقيد الاستجابة الخلوية للضغوط الجينية والبيئية التي تتكشف ، مما يشير إلى أن التحقيق على مستوى الأنظمة مطلوب لفهم نظام مراقبة جودة البروتين وشبكة الانصمام البروتيني.

تأثير الإنزيم في معدل دوران الجسم الحي على التنبؤ النموذجي.

يعد معدل دوران الإنزيم الفعال (k e f) أمرًا أساسيًا لفهمنا للعمليات البيولوجية والظواهر الخلوية. الإصدار الحالي من نموذج FoldME ورث k e f f من المرجع. 24 ، حيث نفترض أن k e f f يتناسب مع مساحة سطح الإنزيم التي يمكن الوصول إليها بواسطة المذيب (SASA). يتركز k e f f المتدرج على كفاءة إنزيم متوسطة تبلغ 65 ثانية - 1 ، بما يتوافق مع النتائج المبلغ عنها في المرجع. 54. هذا ، بالطبع ، هو أول تقدير تقريبي لتوسيع مهمة كفاءة الإنزيم في الجسم الحي على مقياس الجينوم. هناك طريقتان محتملتان لتحسين التخصيص في نموذج مقياس الجينوم هذا. أولاً ، تشير الدراسات الجارية إلى أن معدلات التحفيز القصوى في المختبر وفي الجسم الحي تتوافق عمومًا (55) ، حتى نتمكن من استخدام المعدلات المقاسة تجريبياً كلما كان ذلك ضرورياً وممكناً. في FoldME ، نقوم بتقييد الطي بمساعدة المرافقة بقياسات حركية في الوقت الفعلي ، والتي تختلف عن k e f f بحجم SASA بمقدار اثنين إلى ثلاثة أوامر من حيث الحجم. بعد هذا التصحيح ، تمكنا من إعادة إنتاج التركيزات الفسيولوجية الصحيحة للمرافقين.

ثانيًا ، تبين أن أخذ العينات على مساحة k e f f (56) يؤدي إلى تحسين تنبؤات النموذج من خلال التركيب على نطاق واسع لتحقيق توزيعات وفرة البروتين المعروفة. لسوء الحظ ، فإن نقص بيانات البروتينات المعتمدة على درجة الحرارة وحجم نموذجنا يمنع حاليًا أخذ العينات بكفاءة على عدد كبير من القيم. علاوة على ذلك ، يمثل k e f في الجسم الحي المحسوب من محاكاة أخذ العينات نتيجة تنظيم معين (من المفترض أن يشتمل على تنظيم الطي) ، دون معالجة الآلية الأساسية له. لهذه الأسباب ، نبقى مع التقدير الأساسي الأول لـ k e f f كما هو موضح أعلاه ، ومع ذلك يجب أن نكون على دراية بعدم اليقين الذي ينطوي عليه هذا الاختيار. في الشكل S7أ، نعرض مقارنة بين الكسور الكتلية لجميع البروتينات التي من المتوقع أن تعبر تحت M9 الحد الأدنى من المتوسط ​​المكمّل بالجلوكوز عند 37 درجة مئوية. بالنسبة لحوالي 70٪ من هذه البروتينات (داخل الدائرة الحمراء) ، ترتبط الوفرة جيدًا بالقيمة التجريبية. يتم التقليل من وفرة الـ 30 ٪ المتبقية من البروتينات بشكل كبير بسبب المبالغة في تقدير المقابل k e f f. بالنظر إلى أن بروتينات العميل الموصوف يتم التعبير عنها بشكل عام بشكل كبير (الشكل S7ب) ، من المحتمل أن يؤدي الخطأ في وفرة البروتين إلى التقليل من أهمية الجزء المقابل من متطلبات المرافقة للطي.

تحليل الحساسية لمعدل الطي الحركي.

للتأكد من أن معدلات الطي الحركي المحسوبة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية على مستوى البروتينات ، قمنا بمقارنة توزيع معدل الطي المقدّر باستخدام طريقة Gromiha وخوارزميتين أخريين ، طريقة Dill (21) وطريقة Ouyang (58). توزيعات معدل الطي الحركي المحسوبة من هذه الطرق الثلاث موضحة في الشكل S8أ. تعطي طريقة Gromiha أعلى معدل لطي البروتين (∼ 7.7 ثانية - 1) ، بينما تتنبأ الطريقتان الأخريان بقيم متوسطة أقل بكثير (Dill ∼ 0.000466 s - 1 و Ouyang ∼ 0.188 s - 1). نحن أيضًا نأخذ في الاعتبار معيارين آخرين للحكم على الخير العام للتنبؤ: (أنا) لا يجب أن ينثني أي بروتين أسرع من 4 نانوثانية (خطوط متقطعة خضراء في الشكل S8أ) حسب تقدير طريقة Ouyang و (ثانيا) يجب أن تنثني غالبية البروتينات داخل دورة خلية واحدة للنمو البطيء بكتريا قولونية (على سبيل المثال ، 1 ساعة ، خطوط حمراء متقطعة في الشكل S8أ). وفقًا لذلك ، تتنبأ طريقة Gromiha بأكثر من 80٪ من طيات البروتين ضمن النطاق الزمني "الطبيعي".

ثم قمنا بمحاكاة نمو الخلية باستخدام k f المحسوب باستخدام الطرق الثلاث ، على التوالي. يتبع معدل النمو فوق درجة الحرارة نفس الاتجاه مع كل من التركيبات الثلاثة (الشكل S8ب). تختلف القيمة المطلقة لمعدل النمو بنسبة 5٪ فقط بين طريقتين Dill و Gromiha ، حيث يبلغ متوسط ​​معدلات الطي خمسة أوامر من حيث الحجم. ومن ثم ، نستنتج أن التنبؤ بمعدل الطي الحركي لن يؤثر بشكل كبير على التنبؤ بالنمو. ثم اتخذنا خيارًا لاستخدام طريقة Gromiha ، والتي تعطي التوزيع الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لمعدل الطي.

في فيفو مقابل في المختبر الحرارة.

العلاقة بين الثبات الحراري للبروتين ونمو الخلايا متشابكة للغاية. من ناحية أخرى ، تعتمد استجابة درجة حرارة الخلية على توزيع الاستقرار لبروتيومها. من ناحية أخرى ، يتأثر استقرار البروتين أيضًا بشدة بالبيئة الخلوية المعقدة بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، الطي الانتقالي ، تفاعلات المرافقة ، الازدحام الجزيئي ، والتفاعلات بين الجزيئات. أثار التعقيد المتضمن هنا سؤالًا عمليًا بخصوص المعلمة الديناميكية الحرارية ، ثبات البروتين في المختبر أو في الجسم الحي ، الأكثر ملاءمة لغرض النمذجة لدينا.

يتم تركيب معلمات الطي في المختبر تجريبياً من الخصائص الكيميائية الحيوية للديناميكا الحرارية للبروتين عند التوازن في محلول مخفف مثالي. تمت دراسة هذه الكميات لعدد كبير من البروتينات بالتفصيل ويمكن الوصول إليها بسهولة. لذلك ، قمنا ببناء نموذج FoldME بناءً على التوقعات النظرية لثبات درجة حرارة البروتين في المختبر. كان توصيف الديناميكا الحرارية للبروتين في الجسم الحي صعبًا للغاية على مستوى البروتينات. في الآونة الأخيرة ، Leuenberger et al. طور (57) إستراتيجية بروتينية هيكلية عالية الإنتاجية لقياس ثبات درجة حرارة البروتين على نطاق واسع للبروتين ، مما يتيح المقارنة الأولى بين الثبات الحراري للبروتين في المختبر وفي الجسم الحي على مستوى الأنظمة. كما نوقش أعلاه ، فإن العلاقة الفردية بين درجات حرارة الانصهار (T m) من التنبؤ النظري ومقايسة الثبات الحراري في الجسم الحي محجوبة بالاختلافات في الظروف التجريبية للحصول على هذه القياسات. ومع ذلك ، فإن توزيعات T m (الشكل S9أ) تُظهر ميزة ذروتين متشابهة جدًا (واحدة حول 46-48 درجة مئوية والأخرى حوالي 56-58 درجة مئوية) للبروتينات 350 التي يتم تحديد ثباتها الحراري بواسطة طريقة Oobatake في FoldME. متوسط ​​قيم T m قريبة أيضًا ، 50.0 درجة مئوية و 53.1 درجة مئوية للتنبؤ النظري والمقايسة في الجسم الحي ، على التوالي. يكمن التناقض الرئيسي في التوزيع الأوسع للبروتينات غير المستقرة من التنبؤات النظرية. من المحتمل أن يكون هذا بسبب حقيقة أنه في البيئة الخلوية ، ستزيد عوامل مثل الازدحام والمرافقات من الاستقرار الفعال للبروتينات الأقل استقرارًا ، ولكن لها تأثير أقل على البروتينات المستقرة بالفعل في المختبر.

نوضح كذلك كيف أن الاختلافات بين الثبات الحراري في المختبر وفي الجسم الحي قد تؤثر على إعادة بناء نموذج FoldME ، باستخدام بروتينات الريبوسوم كمثال. بروتينات الريبوسوم مشحونة بشكل إيجابي للغاية وغير مستقرة في المحلول ما لم ترتبط بالـ rRNA. وبالتالي ، قد يتوقع المرء منهم أن يحتاجوا إلى مرافق للطي ، على الأقل قبل الوصول إلى الريبوسوم للتجميع. على الدوام ، لوحظ أن 32 من البروتينات الريبوزومية البالغ عددها 55 تتفاعل مع DnaK في التجربة (18). من ناحية أخرى ، في البيئة الخلوية ، يكون الريبوسوم مستقرًا للغاية كمركب سليم بمجرد تجميعه. ومن ثم فمن البديهي أيضًا أن نرى بروتينات الريبوسوم تظهر باستمرار باعتبارها البروتينات الأكثر استقرارًا في مقايسة الاستقرار الحراري على مستوى الخلية. يوضح هذا المثال أن التنبؤ النظري يميل إلى المبالغة في تقدير متطلبات المرافقة من خلال تجاهل التثبيت من مجمعات البروتين ، بينما يقلل الفحص في الجسم الحي من تقديره بتجاهل الجوانب الديناميكية المختلفة أثناء الطي. مقيدًا بفهمنا الحالي لطي البروتين في الجسم الحي وتوافر التوصيفات التجريبية الكمية ، فإن قرار اختيار الثبات الحراري في المختبر أو في الجسم الحي للنمذجة غير واضح بسبب تعقيد البيئة الخلوية ويمكن تقييمه فقط على كل حالة على حدة. أساس الحالة لعدد صغير من البروتينات.

بدون فقدان التعميم ، نتمسك باستخدام التنبؤات النظرية القائمة على الديناميكا الحرارية للبروتين في المختبر لتقييم وظيفة الطي بمساعدة الكفيل في البيئة الخلوية. We also list here a couple of practical limitations that prevent us from using the in vivo thermostability assay reported in Leuenberger et al. (57): (أنا) The assay could not cover the full proteome currently. بالنسبة إلى بكتريا قولونية cell, the assay is able to provide quantitative measurements for 2,416 peptides, mapped onto 729 unique proteins. Our model currently contains 1,554 protein-coding genes in total, among which only 485 have high-quality T m data from the experiment. (ثانيا) Leuenberger et al. (57) reported only the T m and T 90 % values. It is not clear whether the Δ G ( T ) measurement is of equal high quality and can be extended to a larger temperature range. (ثالثا) As discussed above, this in vivo thermostability assay is likely condition specific. Leuenberger et al. (57) has not provided information on whether or how much the thermo-profile of the proteome will change under different nutrient conditions. As experimental technique improves and our understanding of in vivo protein folding advances, additional descriptions of the thermodynamic parameters are expected to be incorporated to elaborate on model prediction.

Sampling Simulations and Sensitivity Analysis of Protein Thermostability.

Thermostability of the entire proteome was shown to affect cell growth significantly, especially at high temperatures. We investigated whether an (and which) individual protein’s stability may dominate phenotypic predictions by sampling the K e q value for each protein from the predicted (WT) distribution at 37 °C (Fig. S9ب, green dashed line). The result of 400 such sampling simulations showed a broad distribution of growth rate centered on 0.305 h −1 , and none outcompeted the WT (Fig. S9ج). As temperature increases, the distribution shifts to the right, showing that larger fractions of the proteome become unstable. None of the 100 samples drawn from the 45 °C distribution were calculated to be viable, although the stability distribution shift is moderate. Stability of individual proteins only weakly correlated with cellular growth, with a maximum absolute Pearson correlation lower than 0.2. We used stepwise multiple linear regressions (MLR) to narrow down 92 proteins whose stability fluctuations explain 71.5% of the variations in the simulated growth rate (Fig. S9د). With the chaperone network buffering a wide range of unfolding stresses, we no longer see single proteins or pathways limiting cell growth (26). Instead, the cell was able to survive under severe perturbations, unless a large number of proteins involved in growth-related essential functions such as RNA modification, ribosomal biogenesis, nucleotide biosynthesis, and tRNA charging failed to fold properly at the same time (Fig. S9ه).

Simulated Growth Media.

The 21 nutrient conditions simulated using FoldME are listed below: 11 single-carbon source media [glucose, fumarate, hexanoate, L-serine, 2-(alpha-D-mannosyl)-D-glycerate, sn-glycero-3-phosphocholine, trehalose, xanthine, dAMP, IMP, UMP] 5 phosphorus source media (3′-AMP, dCMP, dIMP, ن-acetyl-D-glucosamine 1-phosphate, glycerophosphoserine) 3 nitrogen source media (nitrate, putrescine, UMP) and 2 defined rich media both with supplementation of 20 aa and one of them with additional nucleotide including adenine, guanine, thymine, uracil, cytosine, adenosine, guanosine, thymidine, uridine, cytidine, AMP, GMP, IMP, UMP, and CMP.

Bacterial Strains and Growth Media.

بكتريا قولونية K-12 MG1655 (ATCC 700926) was grown in minimal M9 medium supplemented with four nutrient mixtures: (أنا) 0.2% (wt/vol) glucose (ثانيا) 0.2% (wt/vol) thymidine (ثالثا) 0.2% (wt/vol) glucose, with 50 mg/L of the 20 basic amino acids and (رابعا) 0.2% glucose, plus the nutrient mixtures including 20 basic amino acids, adenine, guanine, cytosine, and thymine (50 mg/L each). Water bath circulation and heating were performed for selected temperatures from 25 °C to 45 °C. Two additional strains were used for comparison of cell growth using glucose or thymidine as a carbon source: strain 7 from a 37 °C adaptive laboratory evolution (ALE) experiment (59) and strain 8 from a 42 °C ALE experiment (5).

RT-PCR Measurements of Chaperone Expression Level.

Cells were grown in 250-mL flasks until reaching midlog phase (OD600 = 0.5) and then transferred in triplicate into fresh media and harvested at 42 °C and 37 °C. Samples were RNA stabilized with the RNAProtect Bacterial Reagent, and total RNA was isolated with the RNeasy mini kit (Qiagen). cDNA was prepared from the total RNA, cleaned up with QIAquick PCR purification kits (Qiagen), and then quantified for subsequent RT-PCR assays. To determine the primer efficiencies, we generated a standard curve using different amounts of genomic DNA instead of cDNA with fixed primer concentrations.


Prions of Yeast and Fungi

Chaperones and Prions

Chaperones of the Hsp40, Hsp70, and Hsp104 groups, as well as Hsp90 co-chaperones, have been found to be clearly involved in prion propagation. Millimolar concentrations of guanidine are known to cure each of the amyloid-based prions, and the mechanism of action of guanidine curing has been shown to be specific inhibition of Hsp104. It is believed that at least one function of these chaperones is to break large amyloid filaments into smaller ones which can then be distributed at cell division to both daughter cells and insure the inheritance of the prion. Overexpression of some chaperones cure yeast prions, perhaps by solubilizing the filaments or perhaps by binding to the ends of filaments and preventing their elongation with new monomers. There is considerable specificity in which chaperone is needed for which prion and which chaperone can cure which prion by overexpression. The detailed mechanisms of chaperone action on prions (and amyloids in general) remain to be elucidated, but it is clear that they play an important role in these phenomena ( الشكل 4 ).

الشكل 4. Chaperones and prions. Possible roles of chaperones in prion propagation are diagrammed.


The REFOLD database: a tool for the optimization of protein expression and refolding

A large proportion of proteins expressed in Escherichia coli form inclusion bodies and thus require renaturation to attain a functional conformation for analysis. In this process, identifying and optimizing the refolding conditions and methodology is often rate limiting. In order to address this problem, we have developed REFOLD, a web-accessible relational database containing the published methods employed in the refolding of recombinant proteins. Currently, REFOLD contains >300 entries, which are heavily annotated such that the database can be searched via multiple parameters. We anticipate that REFOLD will continue to grow and eventually become a powerful tool for the optimization of protein renaturation. REFOLD is freely available at http://refold.med.monash.edu.au.

الأرقام

Web-based query interface in REFOLD.…

Web-based query interface in REFOLD. ( أ ) Both simple and advanced querying…

( أ ) Typical results of a search. Data can be sorted on…

Data deposition form, split into…

Data deposition form, split into logical sections of protein (top), expression (middle) and…


شكر وتقدير

We thank Marco Sessa for designing the graphics shown in Fig. 8, Ina Vorberg (DZNE, Bonn, Germany) for mouse L929 fibroblasts, Didier Villette (INRA, Toulouse, France) for RK13 cells, Roberto Chiesa (Mario Negri Institute in Milan, Italy) for RML brain homogenates and Dennis Burton (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) for D18-expressing CHO cells. The authors are grateful to the staff of the XRD1 beamline at Elettra (Trieste, Italy) for on-site assistance, and acknowledge a CINECA award under the ISCRA initiative, for the availability of high-performance computing resources and support. L.To. is supported by Fondazione Caritro (Bando Post Doc 2017) and Kennedy’s Disease Association (Research Grant 2018). Research of HCA was supported by the CJD Foundation, Inc. and the Alzheimer Forschung Initiative e.V. (AFI). جيه آر. was funded by a grant (BFU2017-86692-P) from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness, partially funded by FEDER funds. The work was also supported by grants from Fondazione Telethon and Provincia Autonoma di Trento to S.B. (TCP13007), from Fondazione Telethon to E.B. (TCP14009), and by a fellowship from Fondazione Telethon to G.S. S.B. and E.B. are Assistant Telethon Scientists at the Dulbecco Telethon Institute.


نتائج

Lon protease can be used to assess the translation-coupled folding status

To monitor the folding status in the translation-coupled folding assay, we chose Lon protease 16 from بكتريا قولونية for the experiment after an initial screening. We first translated MetF, an extremely aggregation-prone protein, 6, 12 using the PURE system under chaperone-free conditions in the presence of Lon [Fig. 1(a)]. When Lon was added after the translation (post-translational addition), the total amount of MetF, which was mostly aggregated, was not significantly decreased under the tested conditions, indicating that Lon cannot degrade the protein aggregates after they are formed. In contrast, when Lon was included during the translation (co-translational inclusion), we observed a dose-dependent decrease in the total amount of MetF. These results show that the Lon-mediated degradation of MetF competes with the aggregate formation.

We translated two other proteins, dihydrofolate reductase (DHFR), with over 50% spontaneous folding, and MetK, a moderately aggregation-prone protein [Fig. 1(b)]. The band intensity of DHFR did not significantly change even with the co-translational inclusion of Lon, suggesting that the rapid folding of DHFR allows it to resist Lon. This result confirmed that Lon cannot degrade a folded protein. In contrast, the total amount of MetK was drastically reduced in the presence of Lon, indicating again that the Lon effect competes with the aggregate formation of MetK. After the centrifugation of the Lon-resistant MetK, approximately half of the MetK was soluble. The centrifugation assay revealed that the undegraded MetK was composed of two subfractions: the soluble folded protein (soluble and undegradative: Sol-Undeg) and the protein aggregate (aggregation-prone and undegradative: Agg-Undeg).

Based on the above results, the co-translational inclusion of Lon monitors the folding status of synthesized proteins. We can calculate the fraction of soluble and degradative proteins (Sol-Deg) by subtracting the Sol-Undeg fraction from the soluble fraction. Likewise, we defined the aggregation-prone and degradative fraction (Agg-Deg). ال Sol-Deg fraction would be partially folded states that are sensitive to Lon. Since the proteins in the Agg-Undeg fraction quickly form protein aggregates and thus escape from Lon, the proteins in the Agg-Deg fraction would be digested during the transition to the aggregate, reflecting the slower rate of aggregate formation. Taken together, the translation-coupled folding assay in the presence of Lon [Fig. 1(c)] reveals the subcategories of synthesized proteins in terms of the folding status.

Large-scale analysis of translation-coupled folding using the Lon-based assay under chaperone-free conditions

Next, we analyzed 89 randomly chosen proteins, using the chaperone-free PURE system in the presence of Lon during the translation. Among them, 76 proteins were evaluated for their folding efficiency and relative rate of the aggregate formation (Fig. 2). Most of the soluble fractions were resistant to the degradation by Lon (Sol-Undeg) [Figs. 2 and 3(a), S1(A)], although there were some exceptions such as MetK [Fig. 1(b)]. These results suggest that the proteins in the soluble fraction obtained under the chaperone-free conditions are mainly folded, or nearly folded, into the stable structure [Fig. 3(a)]. In contrast, the proportion of the Agg-Undeg fraction to the all aggregation-prone fraction was distributed widely, suggesting that the aggregate formation rates broadly differ among the proteins tested [Fig. 3(a)].

Statistical analyses were performed to investigate which properties of the proteins determine the rate of aggregate formation. The molecular weight and the deduced isoelectric point did not correlate with the proportion of the Agg-Undeg formation [Fig. S1(B)]. However, several differences were observed in the compositions of the amino acid residues [Fig. 3(b)]. The aromatic residue content (Phe, Tyr, and Trp) showed a negative correlation [Fig. 3(b)]. In contrast, the contents of residues with positive charges (Lys, Arg, and His) and hydrophobic residues (Val, Leu, and Ile) correlated positively with this proportion, although the correlations of these two properties were neither strong nor significant [Fig. 3(b)]. These results suggest that the amino acid composition influences the rate of aggregate formation to a certain degree.

Lon-based assay reveals differences in chaperone effects

اثنين بكتريا قولونية chaperone sets, GroEL/GroES (GroEL/ES) 3, 17 and DnaK/DnaJ/GrpE (DnaKJE), 3, 18, 19 globally increase the solubility of aggregation-prone proteins in the PURE system-based folding assay. 8 The increased supernatant fraction does not always mean that the protein has adopted the native state. Indeed, we previously observed that DnaKJE drastically improved the solubility of MetK, but did not increase the enzymatic activity, 12 suggesting that the protein in supernatant fraction solubilized by DnaKJE exist in a nonnative state. We applied the assay system using Lon to monitor the folding status of proteins translated by the PURE system. We translated DHFR and MetK in the presence of either GroEL/ES or DnaKJE, with or without Lon [Fig. 4(a)]. The soluble fraction of DHFR was slightly increased in the presence of both GroEL/ES and DnaKJE [Fig. 4(b)]. In the DnaKJE assistance, we found only a slight increase of the Sol-Deg fraction for DHFR [Fig. 4(b)], suggesting that some of the soluble fraction is in a nonnative state. The subfraction in the soluble fraction, revealed by Lon, was strikingly different in the folding of MetK. GroEL/ES contributed to the folding of MetK by increasing the Sol-Undeg fraction, while DnaKJE prevented the aggregate formation of MetK by drastically increasing the Sol-Deg fraction [Fig. 4(b)]. For MetK, the soluble fraction in the DnaKJE assistance would not adopt the native state. Instead, an unstructured form of MetK would be in the soluble fraction. These results with MetK are in good agreement with our previous observations that DnaKJE improved the solubility of MetK but could not recover its enzymatic activity, while GroEL/ES can both prevent the aggregate formation and restore its activity. 12

Chaperone effects on the translation-coupled folding of a variety of proteins

We next evaluated the translation-coupled chaperone-assisted protein folding for several dozens of proteins (Figs. 5 and S2). As expected, most proteins were solubilized by each chaperone in the absence of Lon [Fig. S3(A)]. In addition, the distribution of the proportion of the Sol-Undeg fraction in the presence of GroEL/ES was biased higher, whereas the proportion in the presence of DnaKJE was distributed widely [Figs. S2 and 6(a)]. These results suggest that GroEL/ES tends to protect against the degradation by Lon while facilitating substrates folding, while DnaKJE tends to assist the folding, exposing the substrates to the risk of degradation. Another plausible explanation is that the folding assistance by DnaKJE is simply slower than that by GroEL/ES.

To investigate the relationship between the chaperone effects and the various properties of proteins, we defined the proportion of the Sol-Undeg fraction as the effect of the chaperones and performed statistical analyses between them. The comparison of protein sizes, defined as molecular weights showed that the effect of DnaKJE tended to become weaker as the protein sizes increased [Fig. 6(b)]. In addition to the fact that DnaKJE tends to prefer larger proteins, as investigated in our previous report, 8 our observations suggest that DnaKJE can solubilize larger proteins but tends to have a weaker effect on the folding completion, although this might be a consequence of the simple property that larger proteins are generally more difficult to fold. Similarly, deduced isoelectric point showed a negative correlation with the effect of GroEL/ES [Fig. 6(b)], suggesting the biased preference of GroEL/ES, as mentioned in our previous report. 8 In addition, the hydrophobic residue content (Val, Leu, and Ile) correlated weakly but positively with both chaperone effects (although the correlation with the effect of GroEL/ES was not significant), suggesting that the hydrophobicity is one of the key factors for the chaperone-assisted folding by these two chaperones [Fig. 6(b)]. The higher hydrophobicity may lead to a stronger interaction with the chaperones, or facilitate the formation of the hydrophobic core for faster protein folding. The contents of other amino acids did not show such a significant correlation [Fig. S3(B)].


ملخص

Whereas the lipid bilayer determines the basic structure of biological membranes, proteins are responsible for most membrane functions, serving as specific receptors, enzymes, transport proteins, and so on. Many membrane proteins extend across the lipid bilayer. In some of these transmembrane proteins, the polypeptide chain crosses the bilayer as a single α helix (single-pass proteins). In others, including those responsible for the transmembrane transport of ions and other small water-soluble molecules, the polypeptide chain crosses the bilayer multiple times𠅎ither as a series of α helices or as a β sheet in the form of a closed barrel (multipass proteins). Other membrane-associated proteins do not span the bilayer but instead are attached to either side of the membrane. Many of these are bound by noncovalent interactions with transmembrane proteins, but others are bound via covalently attached lipid groups. Like the lipid molecules in the bilayer, many membrane proteins are able to diffuse rapidly in the plane of the membrane. However, cells have ways of immobilizing specific membrane proteins and of confining both membrane protein and lipid molecules to particular domains in a continuous lipid bilayer.

In the plasma membrane of all eucaryotic cells, most of the proteins exposed on the cell surface and some of the lipid molecules in the outer lipid monolayer have oligosaccharide chains covalently attached to them. Plasma membranes also contain integral proteoglycan molecules with surface-exposed polysaccharide chains. The resulting sugar coating is thought to protect the cell surface from mechanical and chemical damage. In addition, some of the oligosaccharide chains are recognized by cell-surface carbohydrate-binding proteins (lectins) that help mediate cell-cell adhesion events.


شاهد الفيديو: وظائف البروتينات المتعددة (كانون الثاني 2022).