معلومة

7.3 ب: تكرار الحمض النووي في حقيقيات النوى - علم الأحياء


أهداف التعلم

  • صف كيف يتم تكرار الحمض النووي في حقيقيات النوى

نظرًا لأن جينومات حقيقيات النوى معقدة جدًا ، فإن تكرار الحمض النووي هو عملية معقدة للغاية تتضمن العديد من الإنزيمات والبروتينات الأخرى. يحدث في ثلاث مراحل رئيسية: البدء والاستطالة والإنهاء. يحدث تكرار الحمض النووي في حقيقيات النوى على ثلاث مراحل: البدء والاستطالة والإنهاء ، والتي تساعدها عدة إنزيمات.

المبادرة

يرتبط الحمض النووي حقيقيات النوى بالبروتينات المعروفة باسم الهيستونات لتشكيل هياكل تسمى النيوكليوسومات. أثناء البدء ، يتم إتاحة الوصول إلى الحمض النووي للبروتينات والإنزيمات المشاركة في عملية النسخ المتماثل. هناك مواقع صبغية محددة تسمى أصول النسخ حيث يبدأ النسخ المتماثل. في بعض حقيقيات النوى ، مثل الخميرة ، يتم تحديد هذه المواقع من خلال وجود تسلسل محدد من القواعد الأساسية التي ترتبط بها بروتينات بدء النسخ المتماثل. في حقيقيات النوى الأخرى ، مثل البشر ، لا يبدو أن هناك تسلسلًا إجماعيًا لأصول النسخ المتماثل. بدلاً من ذلك ، قد تتعرف بروتينات بدء النسخ المتماثل وترتبط بتعديلات محددة للنيوكليوسومات في منطقة الأصل.

تتعرف بروتينات معينة على أصل التكاثر وترتبط به ، ثم تسمح للبروتينات الأخرى الضرورية لتكاثر الحمض النووي بربط نفس المنطقة. يقال إن البروتينات الأولى التي تربط الحمض النووي "تجند" البروتينات الأخرى. نسختان من إنزيم يسمى هيليكاز من بين البروتينات التي تم تجنيدها في الأصل. تسترخي كل هليكاز وتفصل حلزون الحمض النووي إلى DNA أحادي الجديلة. عندما ينفتح الحمض النووي ، تتشكل هياكل على شكل Y تسمى شوكات النسخ المتماثل. نظرًا لربط طائرتين من طائرات الهليكوبتر ، يتم تكوين شوكتي نسخ في أصل النسخ المتماثل ؛ يتم تمديدها في كلا الاتجاهين مع استمرار النسخ المتماثل لإنشاء فقاعة نسخ متماثل. هناك أصول متعددة للنسخ المتماثل على الكروموسوم حقيقيات النواة والتي تسمح بحدوث النسخ المتماثل في وقت واحد في مئات إلى آلاف المواقع على طول كل كروموسوم.

استطالة

أثناء الاستطالة ، يضيف إنزيم يسمى بوليميراز الحمض النووي نيوكليوتيدات الحمض النووي إلى الطرف 3 من حبلا polynucleotide المركب حديثًا. يحدد خيط القالب أيًا من نيوكليوتيدات الحمض النووي الأربعة (A أو T أو C أو G) تتم إضافته في كل موضع على طول السلسلة الجديدة. فقط النوكليوتيدات المكملة لنيوكليوتيدات القالب في هذا الموضع تتم إضافتها إلى الخيط الجديد.

يحتوي بوليميراز الحمض النووي على أخدود يسمح له بالارتباط بقالب DNA أحادي السلسلة والسفر على نوكليوتيد واحد في الوقت المناسب. على سبيل المثال ، عندما يلتقي بوليميراز الحمض النووي بنيوكليوتيد الأدينوزين على شريط القالب ، فإنه يضيف ثيميدين إلى الطرف 3 من الخيط المركب حديثًا ، ثم ينتقل إلى النوكليوتيدات التالية على شريط القالب. ستستمر هذه العملية حتى يصل بوليميريز الحمض النووي إلى نهاية حبلا القالب.

لا يمكن لبوليميراز الحمض النووي أن يشرع في تخليق جديلة جديدة ؛ إنها تضيف فقط نيوكليوتيدات جديدة في نهاية 3 من خيط موجود. يجب أن تبدأ جميع خيوط البولي نيوكليوتيد المُصنَّعة حديثًا بواسطة بوليميراز RNA متخصص يسمى primase. يبدأ Primase في تخليق عديد النوكليوتيد ومن خلال إنشاء خيط قصير من عديد النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي مكملًا لقالب الحمض النووي. يسمى هذا الامتداد القصير من نيوكليوتيدات الرنا التمهيدي. بمجرد تصنيع RNA التمهيدي في قالب DNA ، ومخارج Primase ، ويمتد DNA polymerase الخيط الجديد مع النيوكليوتيدات المكملة للحمض النووي النموذجي.

في النهاية ، يتم إزالة نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي في التمهيدي واستبدالها بنكليوتيدات الحمض النووي. بمجرد الانتهاء من تكرار الحمض النووي ، تتكون جزيئات الابنة بالكامل من نيوكليوتيدات الحمض النووي المستمرة ، بدون أجزاء من الحمض النووي الريبي.

الخيوط الرائدة والمتأخرة

يمكن لبوليميراز الحمض النووي أن يصنع فقط خيوطًا جديدة في اتجاه 5 إلى 3. لذلك ، ينمو الخيطان المركبان حديثًا في اتجاهين متعاكسين لأن خيوط القالب في كل شوكة نسخ متماثل غير متوازية. يتم تصنيع "الخيط الرئيسي" بشكل مستمر باتجاه شوكة النسخ المتماثل حيث تقوم هيليكاز بفك قالب الحمض النووي المزدوج الشريطة.

يتم تصنيع "الخيط المتأخر" في الاتجاه بعيدًا عن شوكة النسخ وبعيدًا عن فك هليكاز الحمض النووي. يتم تصنيع هذا الخيط المتأخر على شكل قطع لأن بوليميراز الحمض النووي لا يمكنه التوليف إلا في اتجاه 5 إلى 3 ، وبالتالي فإنه يواجه باستمرار الخيط الجديد الذي تم تصنيعه مسبقًا. تسمى القطع شظايا Okazaki ، وتبدأ كل قطعة ببادئ RNA الخاص بها.

نهاية

الكروموسومات حقيقية النواة لها أصول متعددة من النسخ المتماثل ، والتي تبدأ النسخ المتماثل في وقت واحد تقريبًا. يشكل كل أصل للنسخ فقاعة من الحمض النووي المكرر على جانبي أصل النسخ المتماثل. في النهاية ، يصل الشريط الرئيسي لفقاعة النسخ المتماثل إلى الشريط المتأخر لفقاعة أخرى ، وسيصل الشريط المتأخر إلى نهاية 5 من جزء Okazaki السابق في نفس الفقاعة.

يتوقف بوليميريز الحمض النووي عندما يصل إلى قسم من قالب الحمض النووي الذي تم نسخه بالفعل. ومع ذلك ، لا يمكن لبوليميراز الحمض النووي أن يحفز تكوين رابطة فوسفوديستر بين جزأين من خيط الدنا الجديد ، ويتساقط. تسمى هذه الأجزاء غير المرتبطة من العمود الفقري للسكر والفوسفات في خيط DNA كامل النسخ.

بمجرد أن يتم تكرار جميع نيوكليوتيدات القالب ، فإن عملية النسخ المتماثل لم تنته بعد. يجب استبدال مواد RNA الأولية بالحمض النووي ، كما يجب توصيل النكات الموجودة في العمود الفقري للسكر والفوسفات.

تشتمل مجموعة الإنزيمات الخلوية التي تزيل مواد RNA الأولية على البروتينات FEN1 (flap endonulcease 1) و RNase H. يزيل الإنزيمات FEN1 و RNase H بادئات الحمض النووي الريبي في بداية كل خيط رئيسي وفي بداية كل جزء Okazaki ، مما يترك فجوات من قالب DNA غير متماثل. بمجرد إزالة البادئات ، يهبط بوليميراز الحمض النووي العائم في نهاية 3 لجزء الحمض النووي السابق ويمد الحمض النووي فوق الفجوة. ومع ذلك ، فإن هذا يخلق شقوقًا جديدة (العمود الفقري السكر والفوسفات غير المتصل).

في المرحلة الأخيرة من تكرار الحمض النووي ، ينضم إنزيم ليجاز إلى العمود الفقري للسكر والفوسفات في كل موقع نيك. بعد أن يربط ligase جميع النكات ، يكون الخيط الجديد عبارة عن خيط DNA طويل مستمر ، وجزيء DNA الابنة مكتمل.

تكرار الحمض النووي: هذا مقطع من إنتاج برنامج تلفزيوني يسمى "DNA: The Secret of Life." يعرض تفاصيل أحدث الأبحاث (اعتبارًا من 2005) فيما يتعلق بعملية تكرار الحمض النووي.

النقاط الرئيسية

  • أثناء البدء ، ترتبط البروتينات بأصل النسخ المتماثل بينما تقوم هيليكاز بفك حلزون الحمض النووي ويتم تكوين شوكتي نسخ في أصل التكرار.
  • أثناء الاستطالة ، يتم إضافة تسلسل تمهيدي مع نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي التكميلية ، والتي يتم استبدالها بعد ذلك بنكليوتيدات الحمض النووي.
  • أثناء الاستطالة ، يتم عمل الخيط الرئيسي بشكل مستمر ، بينما يتم تصنيع الخيط المتأخر في قطع تسمى شظايا Okazaki.
  • أثناء الإنهاء ، تتم إزالة المواد الأولية واستبدالها بنكليوتيدات DNA جديدة ويتم ختم العمود الفقري بواسطة DNA ligase.

الشروط الاساسية

  • أصل النسخ المتماثل: تسلسل معين في الجينوم يبدأ عنده النسخ المتماثل
  • الساحل الرئيسي: حبلا القالب للحلزون المزدوج للحمض النووي الموجه بحيث تتحرك شوكة النسخ على طوله في اتجاه 3 إلى 5
  • حبلا متخلفة: خيط اللولب المزدوج للقالب DNA الموجه بحيث تتحرك شوكة النسخ على طوله بطريقة 5 إلى 3

التراخيص والمزايا

أضف النصوص هنا. لا تحذف هذا النص أولا.

  • كلية OpenStax ، علم الأحياء. 22 أكتوبر 2013.

آليات إنهاء تكرار الحمض النووي

يتم تنفيذ ازدواجية الجينوم عن طريق أزواج من شوكات النسخ المتماثل التي تتجمع في أصول النسخ المتماثل ثم تتحرك في اتجاهين متعاكسين. ينتهي تكرار الحمض النووي عندما تلتقي شوكات النسخ المتماثل المتقاربة. خلال هذه العملية ، التي تُعرف باسم إنهاء النسخ المتماثل ، يتم الانتهاء من تخليق الحمض النووي ، ويتم تفكيك آلية النسخ المتماثل وحل الجزيئات الوليدة. في هذه المراجعة ، نحدد الخطوات التي من المحتمل أن تكون شائعة لإنهاء النسخ المتماثل في معظم الكائنات الحية ، وهي تقارب الشوكة ، وإكمال التوليف ، والتفكيك وإعادة التفكيك. نراجع بإيجاز آلية الإنهاء في بكتيريا Escherichia coli وفي فيروس القرد 40 (SV40) ونركز أيضًا على التطورات الحديثة في إنهاء النسخ المتماثل حقيقية النواة. على وجه الخصوص ، نناقش E3 ubiquitin ligases المكتشفة مؤخرًا والتي تتحكم في التفكيك في الخميرة وحقيقيات النوى الأعلى ، وكيف يتم تنظيم نشاطها لتجنب عدم استقرار الجينوم.

الأرقام

شكل 1:. خطوات تكرار الحمض النووي

شكل 1:. خطوات تكرار الحمض النووي

توضيح عام لبدء النسخ المتماثل (A-B) والاستطالة (C-D) و ...

الشكل 2:. إنهاء النسخ المتماثل في الإشريكية القولونية

الشكل 2:. إنهاء النسخ المتماثل في الإشريكية القولونية

الشكل 3:. نموذج لفيروس القردة 40 ...

الشكل 3:. نموذج لإنهاء تكاثر الحمض النووي لفيروس القردة 40

الشكل 4:. نموذج إنهاء النسخ المتماثل حقيقية النواة

الشكل 4:. نموذج إنهاء النسخ المتماثل حقيقية النواة

المربع 1:. بدء واستطالة استنساخ حقيقيات النوى: ...

المربع 1:. بدء استنساخ حقيقيات النوى والاستطالة: الأساسيات

نقدم هنا ملخصًا موجزًا ​​...

10 nucleotide RNA Primer ثم يقوم بتوسيعه بمقدار 20-30 نيوكليوتيدات من الحمض النووي قبل أن يحدث التحول إلى Pol أو Pol الأكثر معالجة. عندما تصل نهاية 3 'جزء من جزء Okazaki إلى 5' من جزء آخر ، يقوم Pol بإجراء توليف إزاحة حبلا (الشكل 4 د). تتم إزالة السديلة الناتجة عن طريق نوكلياز داخلي 1. تتحلل السديلة الطويلة بفعل البروتين المعيب في تركيب DNA الهلياز-نوكلياز 2. يحتوي الريبليزوم أيضًا على توب إيزوميراز I ، وعوامل إعادة تشكيل الكروماتين ، وبروتينات إشارة نقطة التفتيش وعوامل إنشاء التماسك. يرتبط CMG مباشرة بـ Pol وبشكل غير مباشر بـ Pol α من خلال بروتين دقة انتقال الكروموسوم 4. لذلك ، على عكس البكتيريا ، لا يبدو أن بوليميرات الجدائل الرائدة والمتأخرة لا تشكل معقدًا مستقرًا في حقيقيات النوى.


تكاثر التيلومير

على عكس الكروموسومات بدائية النواة ، فإن الكروموسومات حقيقية النواة خطية. كما تعلمت ، يمكن أن يضيف إنزيم DNA pol النيوكليوتيدات فقط في الاتجاه 5 & # 8242 إلى 3 & # 8242. في الخيط الرئيسي ، يستمر التوليف حتى الوصول إلى نهاية الكروموسوم. على الخيط المتأخر ، يتم تصنيع الحمض النووي في امتدادات قصيرة ، كل منها يبدأ بواسطة تمهيدي منفصل. عندما تصل شوكة النسخ إلى نهاية الكروموسوم الخطي ، لا توجد طريقة لاستبدال التمهيدي في نهاية 5 'من الخيط المتأخر. وهكذا يظل الحمض النووي في نهايات الكروموسوم غير متزاوج ، وبمرور الوقت يتم استدعاء هذه النهايات التيلوميرات قد تصبح أقصر تدريجيًا مع استمرار الخلايا في الانقسام.

تتألف التيلوميرات من تسلسلات متكررة لا ترمز لأي جين معين. في البشر ، يتكرر التسلسل المكون من ستة أزواج أساسية ، TTAGGG ، من 100 إلى 1000 مرة في مناطق التيلومير. بطريقة ما ، تحمي هذه التيلوميرات الجينات من الحذف مع استمرار الخلايا في الانقسام. تتم إضافة التيلوميرات إلى نهايات الكروموسومات بواسطة إنزيم منفصل ، التيلوميراز ((الشكل)) ، والذي ساعد اكتشافه في فهم كيفية الحفاظ على نهايات الكروموسومات المتكررة. يحتوي إنزيم التيلوميراز على جزء محفز وقالب مدمج للحمض النووي الريبي. يتم إرفاقه بنهاية الكروموسوم ، ويتم إضافة نيوكليوتيدات الحمض النووي المكملة لقالب الحمض النووي الريبي على الطرف 3 & # 8242 من حبلا DNA. بمجرد استطالة الطرف 3 & # 8242 لقالب الخيط المتأخر بشكل كافٍ ، يمكن أن يضيف بوليميراز الحمض النووي النيوكليوتيدات المكملة لنهايات الكروموسومات. وهكذا ، يتم تكرار نهايات الكروموسومات.


ينشط التيلوميراز عادة في الخلايا الجرثومية والخلايا الجذعية البالغة. لا ينشط في الخلايا الجسدية البالغة. لاكتشافهم الإنزيم تيلوميراز وعمله ، حصلت إليزابيث بلاكبيرن ، وكارول دبليو جريدر ، وجاك دبليو زوستاك ((الشكل)) على جائزة نوبل في الطب وعلم وظائف الأعضاء في عام 2009.


التيلوميراز والشيخوخة

تستمر الخلايا التي تخضع للانقسام الخلوي في تقصير التيلوميرات الخاصة بها لأن معظم الخلايا الجسدية لا تصنع التيلوميراز. هذا يعني بشكل أساسي أن تقصير التيلومير مرتبط بالشيخوخة. مع ظهور الطب الحديث والرعاية الصحية الوقائية وأنماط الحياة الصحية ، زاد العمر الافتراضي للإنسان ، وهناك طلب متزايد على الناس ليبدو أصغر سناً وأن يتمتعوا بنوعية حياة أفضل مع تقدمهم في السن.

في عام 2010 ، وجد العلماء أن الإنزيم تيلوميراز يمكنه عكس بعض الحالات المرتبطة بالعمر في الفئران. قد يكون لهذا إمكانات في الطب التجديدي. تم استخدام الفئران التي تعاني من نقص التيلوميراز في هذه الدراسات ، حيث تعاني هذه الفئران من ضمور الأنسجة ، ونضوب الخلايا الجذعية ، وفشل نظام الأعضاء ، واستجابات إصابة الأنسجة الضعيفة. تسبب إعادة تنشيط التيلوميراز في هذه الفئران في تمدد التيلوميرات ، وتقليل تلف الحمض النووي ، وتنكس عصبي معكوس ، وتحسين وظيفة الخصيتين والطحال والأمعاء. وبالتالي ، قد يكون لإعادة تنشيط التيلومير إمكانية علاج الأمراض المرتبطة بالشيخوخة لدى البشر.

يتميز السرطان بانقسام الخلايا غير المنضبط للخلايا غير الطبيعية. تتراكم الخلايا الطفرات وتتكاثر بشكل لا يمكن السيطرة عليه ويمكن أن تهاجر إلى أجزاء مختلفة من الجسم من خلال عملية تسمى ورم خبيث. لاحظ العلماء أن الخلايا السرطانية لديها تقصير كبير في التيلوميرات وأن الإنزيم تيلوميراز نشط في هذه الخلايا. ومن المثير للاهتمام ، أنه فقط بعد تقصير التيلوميرات في الخلايا السرطانية ، أصبح الإنزيم تيلوميراز نشطًا. إذا كان من الممكن إعاقة عمل التيلوميراز في هذه الخلايا عن طريق الأدوية أثناء علاج السرطان ، فمن المحتمل أن يتم إيقاف الخلايا السرطانية من الانقسام الإضافي.


2. DNA Polymerases و Helicases

العمليتان الأساسيتان لتكرار الحمض النووي هما فك خيط القالب وبلمرة جدائل الابنة. لذلك ، هناك نوعان من الإنزيمات الرئيسية & # x0201cworkhorse & # x0201d في الريبليزوم ، وهليكاز التكاثر والبوليميراز. هيليكاز التكاثر مسؤولة عن فك الحمض النووي للوالدين ، وكشف اثنين من قوالب ssDNA. ثم يتم استخدام القالب بواسطة البوليميرات التكرارية لتوليد نسختين من الجينوم الأبوي. أسفرت النتائج الحديثة عن معلومات جديدة حول الدور المحدد لكل بوليميراز في شوكة النسخ وأثناء البناء على معرفتنا بهليكس التكاثر. يتيح لنا فهم اللاعبين الرئيسيين في استنساخ الحمض النووي زيادة تقدير تنظيمهم من خلال عوامل إعادة تكوين أخرى.

2.1. بوليميرات الحمض النووي التكراري: مزيد من التقسيمات الفرعية للعمل

وظيفة بوليميريز الحمض النووي عالية التخصص. من الفيروسات عبر الثدييات ، تحقق بوليمرات الحمض النووي المحددة النسخ المتماثل في قوالب محددة وفي مواقع ضيقة. في شوكة النسخ المتماثل حقيقية النواة ، تساهم ثلاثة مجمعات بوليميراز مكررة متميزة في تكرار الحمض النووي المتعارف عليه: & # x003b1 ، & # x003b4 ، و & # x003b5. هذه البوليمرات الثلاثة ضرورية لبقاء الخلية [10 & # x0201313]. نظرًا لأن بوليميرات الحمض النووي تتطلب أساسًا لبدء توليف الحمض النووي ، أولاً ، يعمل البوليميراز & # x003b1 (Pol & # x003b1) بمثابة بريماز مكرر. Pol & # x003b1 مرتبط بـ RNA primase وهذا المركب ينجز مهمة التمهيد عن طريق توليف برايمر يحتوي على قصير

تمتد 10-nucleotide RNA تليها 10 إلى 20 قاعدة DNA [14،15]. الأهم من ذلك ، يحدث هذا الإجراء الأولي عند بدء النسخ المتماثل في الأصول لبدء توليف السلسلة الرائدة وأيضًا عند نهاية 5 & # x02032 من كل جزء من أجزاء Okazaki على الشريط المتأخر (الشكل 1).

ومع ذلك ، فإن Pol & # x003b1 غير قادر على مواصلة تكرار الحمض النووي. من عند في المختبر دراسات باستخدام النسخ المتماثل المعتمد على مستضد SV40 T والمكونات المعاد تشكيلها ، لوحظ أن تكرار الحمض النووي يجب أن يتم تسليمه إلى بوليميراز آخر لمواصلة التوليف [9،16]. يتطلب تبديل البوليميراز اللوادر المشبكية (والتي ستتم مناقشتها بالتفصيل لاحقًا في هذه المقالة) [17]. في البداية ، كان يُعتقد أن Pol & # x003b4 قام بإجراء نسخ متماثل للخيوط الرائدة وأن Pol & # x003b1 أكمل كل جزء من أجزاء Okazaki على الشريط المتأخر [17،18]. باستخدام متغيرات بوليميراز الطفرات ورسم خرائط لأحداث التضمين الخاطئ للنيوكليوتيدات ، وجد Kunkel وزملاؤه أن طفرات Pol & # x003b5 و Pol & # x003b4 تؤدي إلى دمج نوكليوتيد غير متطابق فقط على السلاسل الرائدة والمتأخرة ، على التوالي [19 & # x0201321]. وبالتالي ، يتطلب تكرار الحمض النووي الطبيعي الإجراءات المنسقة لثلاثة بوليميرات DNA: Pol & # x003b1 للتوليف الأساسي ، و Pol & # x003b5 لتكرار الخيوط الرائدة ، و Pol & # x003b4 الذي يتم تحميله باستمرار لتوليد شظايا Okazaki أثناء تخليق الجديلة المتأخرة ( الشكل 2 ).

2.2. Helicases فك الحمض النووي للنسخ المتماثل

لكي تعمل بوليميرات الحمض النووي ، يجب فك اللولب المزدوج الجديلة لفضح قالب أحادي الجديلة. يتم تنفيذ هذا النشاط بواسطة هيليكاس التكاثر. في حقيقيات النوى ، هيليكاز التكاثر عبارة عن مركب سداسي يتكون من بروتينات صيانة الكروموسوم المصغر (Mcm2 & # x020137: Mcm2 ، Mcm3 ، Mcm4 ، Mcm5 ، Mcm6 و Mcm7). إن هليكاز MCM عبارة عن AAA + ATPase ، وهي فصيلة فائقة من مجمعات البروتين التي تعالج الركائز من خلال مسام مركزية باستخدام إطلاق الطاقة من التحلل المائي ATP [22].

نشاط MCM مطلوب طوال المرحلة S لتكرار الحمض النووي [23 ، 24]. يتم تجنيد بروتينات MCM لأصول النسخ المتماثل (خلال G1 المرحلة وقبل تكرار الحمض النووي) ثم إعادة توزيع الحمض النووي الجيني خلال المرحلة S ، مما يدل على توطينهم في شوكة النسخ المتماثل [25]. على الرغم من أنه كان معروفًا أن بروتينات MCM مطلوبة لبدء تكرار الحمض النووي وتطوره ، إلا أنه لم يكن واضحًا في الأصل ما يمكن أن تكون عليه الوظيفة الأنزيمية لمركب MCM [26]. في دراسة باستخدام متماثل MCM المنقى من العتائق ، تم الكشف عن نشاط هيليكاز الذي يحركه ATP في الكسور المقابلة للأشكال السداسية المزدوجة للمجمع [27]. علاوة على ذلك ، فإن المجمعات المنقاة من Mcm4 / 6/7 لها نشاط هليكاز يعتمد على ATP في المختبر، فك الحمض النووي في الاتجاه 3 & # x02032 إلى 5 & # x02032 [28،29]. هذه النتائج ، إلى جانب دراسات التوطين والضربة القاضية ، تفضل بقوة النموذج الذي يشير إلى أن Mcm2 & # x020137 hexamer هو جوهر الهيكاس المتماثل. ومع ذلك ، فإن الهليكاز التكراري الكامل المسؤول عن النسخ المتماثل في الخلايا حقيقية النواة يتطلب عوامل إضافية ، بما في ذلك مجمع go-ichi-ni-san (GINS) و Cdc45 ، اللذين يشكلان معًا مجمع Cdc45-MCM-GINS (CMG) (الشكل 2). ستتم مناقشة وظيفة مجمع CMG بالتفصيل لاحقًا في هذه المقالة.


محتويات

إن بدء تكرار الحمض النووي حقيقي النواة هو المرحلة الأولى من تخليق الحمض النووي حيث يتم فك الحلزون المزدوج للحمض النووي ويحدث حدث أولي بواسطة بوليميراز الحمض النووي α على الشريط الرئيسي. يُنشئ الحدث الأولي على الشريط المتأخر شوكة نسخ متماثل. يتكون تمهيد لولب DNA من توليف تمهيدي RNA للسماح بتوليف DNA بواسطة DNA polymerase α.يحدث التأسيس مرة واحدة في الأصل على الخيط الرئيسي وفي بداية كل جزء من أجزاء أوكازاكي على الشريط المتأخر.

يبدأ تكرار الحمض النووي من تسلسلات محددة تسمى أصول التكرار ، والخلايا حقيقية النواة لها أصول تكرار متعددة. لبدء تكرار الحمض النووي ، تتجمع البروتينات المتماثلة المتعددة وتنفصل عن هذه الأصول التكرارية. [4] تعمل العوامل الفردية الموصوفة أدناه معًا لتوجيه تكوين معقد ما قبل النسخ المتماثل (pre-Replication) ، وهو وسيط رئيسي في عملية بدء النسخ المتماثل.

تقوم رابطة معقد التعرف على الأصل (ORC) مع أصل النسخ المتماثل بتجنيد بروتين دورة انقسام الخلية 6 (Cdc6) لتشكيل منصة لتحميل البروتينات المعقدة لصيانة الكروموسوم (Mcm 2-7) ، التي يسهلها ترخيص الكروماتين والحمض النووي عامل النسخ 1 البروتين (Cdt1). مطلوب ORC و Cdc6 و Cdt1 معًا للارتباط المستقر لمجمع Mcm2-7 مع الأصول المتماثلة خلال G1 مرحلة دورة الخلية. [5]

تحرير مجمع ما قبل النسخ المتماثل

تتحكم أصول حقيقيات النوى للنسخ المتماثل في تكوين عدد من مجمعات البروتين التي تؤدي إلى تجميع اثنين من شوكات نسخ الحمض النووي ثنائية الاتجاه. يتم بدء هذه الأحداث من خلال تكوين مجمع ما قبل النسخ المتماثل (قبل RC) في أصول النسخ المتماثل. تتم هذه العملية في G1 مرحلة دورة الخلية. يتضمن تكوين ما قبل RC التجميع المنظم للعديد من عوامل النسخ بما في ذلك مجمع التعرف على الأصل (ORC) ، وبروتين Cdc6 ، وبروتين Cdt1 ، وبروتينات صيانة الكروموسوم الصغير (Mcm2-7). [6] [7] بمجرد تشكيل ما قبل RC ، يتم تنشيط تنشيط المركب بواسطة كينازين ، كيناز 2 المعتمد على السيكلين (CDK) والكيناز المعتمد على Dbf4 (DDK) الذي يساعد في نقل ما قبل RC إلى البداية معقدة قبل الشروع في تكرار الحمض النووي. يتضمن هذا الانتقال التجميع المنظم لعوامل النسخ الإضافية لفك الحمض النووي وتجميع بوليميرات الحمض النووي حقيقية النواة المتعددة حول الحمض النووي غير الملفوف. محور السؤال حول كيفية إنشاء شوكات النسخ المتماثل ثنائي الاتجاه عند أصول النسخ المتماثل هو الآلية التي يقوم من خلالها ORC بتجنيد مجمعين Mcm2-7 من الرأس إلى الرأس لكل أصل نسخ متماثل لتشكيل مجمع ما قبل النسخ المتماثل. [8] [9] [10]

مجمع التعرف على الأصل تحرير

تتمثل الخطوة الأولى في تجميع مجمع ما قبل النسخ المتماثل (pre-RC) في ربط مجمع التعرف على الأصل (ORC) بأصل النسخ المتماثل. في الانقسام المتأخر ، ينضم بروتين Cdc6 إلى ORC المرتبط متبوعًا بربط مجمع Cdt1-Mcm2-7. [11] مطلوب كل من ORC و Cdc6 و Cdt1 لتحميل مركب صيانة الكروموسوم الستة (Mcm 2-7) على الحمض النووي. إن ORC عبارة عن مجمع بروتيني مكون من ست وحدات فرعية ، Orc1p-6 ، والذي يختار مواقع الأصل المتماثل على الحمض النووي لبدء النسخ المتماثل ويتم تنظيم ارتباط ORC بالكروماتين من خلال دورة الخلية. [6] [12] بشكل عام ، يتم حفظ وظيفة وحجم الوحدات الفرعية ORC في العديد من الجينومات حقيقية النواة مع اختلاف مواقع ارتباط الحمض النووي المتباينة.

أكثر معقدات التعرف على الأصل التي تمت دراستها على نطاق واسع هو مجمع خميرة الخميرة أو الخميرة المعروف أنها ترتبط بتسلسل التكرار الذاتي (ARS). [13] إن S. cerevisiae يتفاعل ORC على وجه التحديد مع كل من العناصر A و B1 من أصول الخميرة للتكرار ، والتي تغطي منطقة من 30 زوجًا أساسيًا. [14] يتطلب الارتباط بهذه التسلسلات ATP. [6] [14]

التركيب الذري لـ S. cerevisiae تم تحديد ORC المرتبط بـ ARS DNA. [14] Orc1 و Orc2 و Orc3 و Orc4 و Orc5 يحيطون بالعنصر A عن طريق نوعين من التفاعلات ، القاعدة غير المحددة والقاعدة المحددة ، التي تثني الحمض النووي عند العنصر A. تتصل جميع الوحدات الفرعية الخمس بالعمود الفقري لفوسفات السكر عند نقاط متعددة من العنصر A لتشكيل قبضة محكمة بدون خصوصية أساسية. يتصل Orc1 و Orc2 بالأخدود الصغير للعنصر A بينما يتصل المجال الحلزوني المجنح لـ Orc4 بمجموعات الميثيل من Ts الثابت في الأخدود الرئيسي للعنصر A عبر حلزون الإدراج (IH). يفسر غياب IH في metazoans [14] عدم وجود خصوصية التسلسل في ORC البشري. [15] [16] ينثني ARS DNA أيضًا عند عنصر B1 من خلال التفاعلات مع Orc2 و Orc5 و Orc6. [14] يبدو أن ثني الحمض النووي الأصلي بواسطة ORC محفوظ تطوريًا مما يشير إلى أنه قد يكون مطلوبًا لآلية التحميل المعقدة Mcm2-7. [14] [17]

عندما يرتبط ORC بالحمض النووي عند أصول النسخ المتماثل ، فإنه يعمل كسقالة لتجميع عوامل البدء الرئيسية الأخرى لمجمع ما قبل النسخ المتماثل. [18] هذا التجمع المعقد قبل النسخ المتماثل خلال G1 مطلوب مرحلة من دورة الخلية قبل تنشيط تكرار الحمض النووي خلال المرحلة S. [19] إزالة جزء على الأقل من المركب (Orc1) من الكروموسوم في الطور الرئيسي هو جزء من تنظيم ORC للثدييات لضمان التخلص من التكوين المعقد قبل التكاثر قبل اكتمال الطور الطوري. [20]

تحرير بروتين Cdc6

يعد ربط بروتين دورة الانقسام الخلوي 6 (Cdc6) بمركب التعرف على الأصل (ORC) خطوة أساسية في تجميع مجمع ما قبل النسخ المتماثل (قبل RC) في أصول النسخ المتماثل. يرتبط Cdc6 بـ ORC على الحمض النووي بطريقة تعتمد على ATP ، مما يؤدي إلى تغيير في نمط ارتباط الأصل الذي يتطلب Orc1 ATPase. [21] Cdc6 يتطلب ORC من أجل الارتباط بالكروماتين وهو بدوره مطلوب لـ Cdt1-Mcm2-7 heptamer [11] للارتباط بالكروماتين. [22] يشكل معقد ORC-Cdc6 بنية على شكل حلقة وهو مشابه لآلات البروتين الأخرى المعتمدة على ATP. تنظم مستويات ونشاط Cdc6 التردد الذي تستخدم به أصول النسخ المتماثل أثناء دورة الخلية.

تحرير بروتين Cdt1

مطلوب ترخيص الكروماتين وعامل تكرار الحمض النووي 1 (Cdt1) لترخيص الكروماتين لتكرار الحمض النووي. [23] [24] في S. cerevisiae، Cdt1 يسهل تحميل المركب Mcm2-7 واحدًا تلو الآخر على الكروموسوم من خلال تثبيت بنية الحلقة المفتوحة اليسرى لسداسي أحادي Mcm2-7. [11] [25] [26] لقد ثبت أن Cdt1 يرتبط بالطرف C من Cdc6 لتعزيز ارتباط بروتينات Mcm بالكروماتين بشكل تعاوني. [27] يُظهر هيكل cryo-EM لمجمع OCCM (ORC-Cdc6-Cdt1-MCM) أن Cdt1-CTD يتفاعل مع Mcm6-WHD. [28] في metazoans ، يتم تنظيم نشاط Cdt1 أثناء دورة الخلية بإحكام من خلال ارتباطه بالبروتين الجيمينين ، وكلاهما يثبط نشاط Cdt1 خلال المرحلة S من أجل منع إعادة تكاثر الحمض النووي ويمنعه من الانتشار والتحلل اللاحق للبروتين. [29]

معقد بروتين صيانة الكروموسوم الصغير

تمت تسمية بروتينات صيانة الكروموسوم الصغير (Mcm) على اسم شاشة جينية لطفرات بدء تكرار الحمض النووي في S. cerevisiae التي تؤثر على استقرار البلازميد بطريقة خاصة بـ ARS. [30] Mcm2 و Mcm3 و Mcm4 و Mcm5 و Mcm6 و Mcm7 تشكل معقدًا سداسيًا له هيكل حلقة مفتوحة مع فجوة بين Mcm2 و Mcm5. [11] يتطلب تجميع بروتينات Mcm على كروماتين الوظيفة المنسقة لمركب التعرف على الأصل (ORC) و Cdc6 و Cdt1. [31] بمجرد تحميل بروتينات Mcm على الكروماتين ، يمكن إزالة ORC و Cdc6 من الكروماتين دون منع تكرار الحمض النووي اللاحق. تشير هذه الملاحظة إلى أن الدور الأساسي لمجمع ما قبل النسخ المتماثل هو تحميل بروتينات Mcm بشكل صحيح. [32]

تشكل بروتينات Mcm الموجودة على الكروماتين شكلًا سداسيًا مزدوجًا من الرأس إلى الرأس مع وجود حلقتين مائلتين قليلاً وملتويتين وبعيدًا عن المركز لإنشاء التواء في القناة المركزية حيث يتم التقاط الحمض النووي المرتبط عند واجهة الحلقتين. [33] [34] كل حلقة سداسية Mcm2-7 تعمل أولاً كسقالة لتجميع الريبليزوم ثم كقلب لطائرة CMG المحفزة (Cdc45-MCM-GINS) ، والتي تعد مكونًا رئيسيًا في إعادة التوازن. يرتبط كل بروتين Mcm ارتباطًا وثيقًا بجميع الأنواع الأخرى ، ولكن يتم حفظ التسلسلات الفريدة التي تميز كل نوع من أنواع الوحدات الفرعية عبر حقيقيات النوى. تحتوي جميع حقيقيات النوى على ستة متماثلات بروتين Mcm بالضبط تقع كل منها في إحدى الفئات الموجودة (Mcm2-7) ، مما يشير إلى أن كل بروتين Mcm له وظيفة فريدة ومهمة. [35] [9]

بروتينات صيانة الكروموسوم الصغير مطلوبة لنشاط هليكس الحمض النووي. يمنع تعطيل أي من بروتينات Mcm الستة خلال المرحلة S مزيدًا من التقدم في شوكة النسخ مما يشير إلى أنه لا يمكن إعادة تدوير الهليكاز ويجب تجميعها عند أصول النسخ المتماثل. [36] جنبًا إلى جنب مع نشاط هيليكاز المركب لبروتين صيانة الكروموسومات ، يحتوي المركب أيضًا على نشاط ATPase المصاحب. [37] تؤدي الطفرة في أي واحد من بروتينات Mcm الستة إلى تقليل مواقع ارتباط ATP المحفوظة ، مما يشير إلى أن التحلل المائي لـ ATP هو حدث منسق يشمل جميع الوحدات الفرعية الست لمركب Mcm. [38] أظهرت الدراسات أنه داخل مجمع البروتين Mcm توجد أزواج حفزية محددة من بروتينات Mcm تعمل معًا لتنسيق التحلل المائي ATP. على سبيل المثال ، يمكن لـ Mcm3 وليس Mcm6 تنشيط نشاط Mcm6. هذه الدراسات ، التي أكدتها تركيبات cryo-EM للمجمعات Mcm2-7 ، [11] [33] تشير إلى أن مجمع Mcm هو شكل سداسي مع Mcm3 بجانب Mcm7 ، و Mcm2 بجوار Mcm6 ، و Mcm4 بجوار Mcm5. يساهم كلا العضوين من الزوج الحفاز في التشكل الذي يسمح بربط ATP والتحلل المائي ، ويخلق مزيج من الوحدات الفرعية النشطة وغير النشطة نشاط ATPase منسق يسمح لمركب البروتين Mcm بإكمال ارتباط ATP والتحلل المائي ككل. [39]

يتم تنظيم التوطين النووي لبروتينات صيانة الكروموسومات الصغيرة في خلايا الخميرة الناشئة. [40] [41] توجد بروتينات Mcm في النواة في G1 المرحلة والمرحلة S من دورة الخلية ، ولكن يتم تصديرها إلى السيتوبلازم خلال G2 المرحلة والمرحلة M. مطلوب مجمع Mcm كامل وسليم من ستة وحدات فرعية للدخول في نواة الخلية. [42] في S. cerevisiae، يتم الترويج للتصدير النووي من خلال نشاط كيناز المعتمد على السيكلين (CDK). بروتينات Mcm المرتبطة بالكروماتين محمية من آلات تصدير CDK بسبب عدم إمكانية الوصول إلى CDK. [43]

بدء تحرير معقدة

خلال G1 مرحلة دورة الخلية ، عوامل بدء النسخ المتماثل ، مجمع التعرف على الأصل (ORC) ، Cdc6 ، Cdt1 ، ومركب بروتين صيانة الكروموسوم الصغير (Mcm) ، ترتبط بالتتابع مع الحمض النووي لتشكيل مجمع ما قبل النسخ المتماثل (pre-RC). في انتقال G1 إلى المرحلة S من دورة الخلية ، يحول كيناز البروتين المعتمد على السيكلين الخاص بالطور S (CDK) و Cdc7 / Dbf4 كيناز (DDK) ما قبل RC إلى شوكة النسخ المتماثل النشط. أثناء هذا التحول ، يتم تفكيك ما قبل RC مع فقدان Cdc6 ، مما يؤدي إلى إنشاء مجمع البدء. بالإضافة إلى ارتباط بروتينات Mcm ، تعد دورة انقسام الخلية 45 (Cdc45) ضرورية أيضًا لبدء تكرار الحمض النووي. [44] [45] أظهرت الدراسات أن Mcm أمر بالغ الأهمية لتحميل Cdc45 على الكروماتين وأن هذا المركب الذي يحتوي على كل من Mcm و Cdc45 يتكون في بداية المرحلة S من دورة الخلية. [46] [47] يستهدف Cdc45 مركب البروتين Mcm ، والذي تم تحميله على الكروماتين ، كمكون من ما قبل RC في أصل النسخ المتماثل خلال G1 مرحلة دورة الخلية. [48]

تحرير البروتين Cdc45

يعد بروتين دورة انقسام الخلية 45 (Cdc45) مكونًا مهمًا لتحويل مجمع ما قبل التكرار إلى مجمع البدء. يتجمع بروتين Cdc45 عند أصول النسخ المتماثل قبل البدء وهو مطلوب لبدء النسخ المتماثل خميرة الخميرة، ولها دور أساسي أثناء الاستطالة. وبالتالي ، فإن Cdc45 له أدوار مركزية في كل من مرحلتي البدء والاستطالة لتكرار الحمض النووي الصبغي. [49]

يرتبط Cdc45 بالكروماتين بعد بداية البدء في أواخر G1 المرحلة وأثناء المرحلة S من دورة الخلية. يرتبط Cdc45 جسديًا بـ Mcm5 ويعرض التفاعلات الجينية مع خمسة من ستة أعضاء من عائلة الجينات Mcm وجين ORC2. [50] [48] يعد تحميل Cdc45 على الكروماتين أمرًا بالغ الأهمية لتحميل بروتينات النسخ المختلفة الأخرى ، بما في ذلك DNA polymerase α و DNA polymerase وبروتين النسخ المتماثل A (RPA) والمستضد النووي الخلوي المتكاثر (PCNA) على الكروماتين. [47] [51] [52] [53] داخل أ Xenopus نظام خالٍ من النواة ، فقد تم إثبات أن Cdc45 مطلوب لفك DNA البلازميد. [53] إن Xenopus يوضح النظام الخالي من النواة أيضًا أن فك الحمض النووي وربط RPA المحكم بالكروماتين يحدث فقط في وجود Cdc45. [47]

يعتمد ربط Cdc45 بالكروماتين على نشاط كيناز Clb-Cdc28 بالإضافة إلى Cdc6 و Mcm2 الوظيفي ، مما يشير إلى أن Cdc45 يرتبط بـ pre-RC بعد تنشيط الكينازات المعتمدة على cyclin على شكل S (CDKs). كما يتضح من التوقيت والاعتماد على CDK ، فإن ربط Cdc45 بالكروماتين أمر بالغ الأهمية للالتزام ببدء تكرار الحمض النووي. خلال المرحلة S ، يتفاعل Cdc45 جسديًا مع بروتينات Mcm على الكروماتين ، ومع ذلك ، فإن تفكك Cdc45 عن الكروماتين يكون أبطأ من تفكك Mcm ، مما يشير إلى أن البروتينات يتم إطلاقها بواسطة آليات مختلفة. [35]

تحرير GINS

تعد بروتينات صيانة الكروموسومات الستة و Cdc45 ضرورية أثناء البدء والاستطالة لحركة شوكات النسخ وفك الحمض النووي. تعد GINS ضرورية لتفاعل Mcm و Cdc45 في أصول النسخ المتماثل أثناء البدء ثم في شوكات تكرار الحمض النووي مع تقدم الإعادة. [54] [55] يتكون معقد GINS من أربعة بروتينات صغيرة Sld5 (Cdc105) و Psf1 (Cdc101) و Psf2 (Cdc102) و Psf3 (Cdc103) ، GINS يمثل "go، ichi، ni، san" مما يعني "5 ، 1، 2، 3 'باليابانية. [56] Cdc45 ، Mcm2-7 و GINS معًا يشكلون CMG هيليكاز ، [57] هيليكاز النسخ المتماثل للريمبليزوم. على الرغم من أن مجمع Mcm2-7 وحده لديه نشاط هليكاز ضعيف [58] مطلوب Cdc45 و GINS لنشاط هليكاز قوي [59] [60]

تحرير Mcm10

يعد Mcm10 ضروريًا لتكرار الكروموسوم ويتفاعل مع صيانة الصغرى 2-7 هيليكاز التي يتم تحميلها في شكل غير نشط في أصول تكرار الحمض النووي. [61] [62] يقوم Mcm10 أيضًا بمرافقة بوليميريز الحمض النووي المحفز α ويساعد على استقرار البوليميراز عند شوكات النسخ المتماثل. [63] [64]

تعديل kinases DDK و CDK

في بداية المرحلة S ، يجب تنشيط مجمع ما قبل النسخ المتماثل بواسطة حركتين خاصتين بالطور S من أجل تكوين مجمع بدء في أصل النسخ المتماثل. أحد الكيناز هو كيناز Cdc7-Dbf4 المسمى كيناز المعتمد على Dbf4 (DDK) والآخر هو كيناز المعتمد على السيكلين (CDK). [٦٥] فحوصات ربط الكروماتين لـ Cdc45 في الخميرة و Xenopus أظهرت أن حدثًا في اتجاه مجرى النهر لإجراء CDK يتم تحميل Cdc45 على الكروماتين. [45] [46] تم التكهن بـ Cdc6 ليكون هدفًا لإجراء CDK ، بسبب الارتباط بين Cdc6 و CDK ، والتفسفر المعتمد على CDK لـ Cdc6. تم اعتبار الفسفرة المعتمدة على CDK لـ Cdc6 ضرورية للدخول إلى المرحلة S. [66]

يتم حفظ كل من الوحدات الفرعية المحفزة لـ DDK و Cdc7 والبروتين المنشط Dbf4 في حقيقيات النوى وهي مطلوبة لبدء المرحلة S من دورة الخلية. [67] [68] كل من DDK و Cdc7 مطلوبان لتحميل Cdc45 على أصول الكروماتين للنسخ المتماثل. الهدف من ربط DDK kinase هو مجمع Mcm ، وربما Mcm2. [69] [67] يستهدف DDK مجمع Mcm ، وتؤدي الفسفرة الخاصة به إلى التنشيط المحتمل لنشاط الهليكاز Mcm. [70]

تحرير بروتينات Dpb11 و Sld3 و Sld2

يتفاعل Sld3 و Sld2 و Dpb11 مع العديد من بروتينات النسخ المتماثل. يشكل كل من Sld3 و Cdc45 معقدًا مرتبطًا بـ pre-RC في الأصول المبكرة للنسخ المتماثل حتى في G11 المرحلة والأصول اللاحقة للنسخ المتماثل في المرحلة S بطريقة تعتمد على بعضها البعض Mcm. [71] [72] يتفاعل Dpb11 و Sld2 مع Polymerase وقد أوضحت تجارب الارتباط المتبادل أن Dpb11 والبوليميراز ɛ متراسبان في المرحلة S ويرتبطان بأصول النسخ المتماثل. [73] [74]

يتم فسفرة كل من Sld3 و Sld2 بواسطة CDK ، مما يمكّن البروتينين المتكاثرين من الارتباط بـ Dpb11. كان Dpb11 يحتوي على زوجين من نطاقات BRCA1 C Terminus (BRCT) والتي تُعرف باسم مجالات ربط الفوسفوببتيد. [75] يرتبط زوج N-terminal لنطاقات BRCT بالفوسفور Sld3 ، ويرتبط الزوج C- طرفي بـ Sld2 الفسفوري. كل من هذه التفاعلات ضرورية للتنشيط المعتمد على CDK لتبرعم الحمض النووي في الخميرة. [76]

يتفاعل Dpb11 أيضًا مع GINS ويشارك في خطوات البدء والاستطالة لتكرار الحمض النووي الصبغي. [55] [77] [78] GINS هي واحدة من بروتينات النسخ الموجودة في شوكات النسخ وتشكل معقدًا مع Cdc45 و Mcm.

تعد هذه التفاعلات المعتمدة على الفسفرة بين Dpb11 و Sld2 و Sld3 ضرورية للتفعيل المعتمد على CDK لتكرار الحمض النووي ، وباستخدام الكواشف المتشابكة في بعض التجارب ، تم تحديد مجمع هش يسمى مجمع التحميل المسبق (pre-LC) . يحتوي هذا المجمع على Pol ɛ و GINS و Sld2 و Dpb11. تم العثور على ما قبل LC لتتشكل قبل أي ارتباط مع الأصول بطريقة تعتمد على CDK وتعتمد على DDK وينظم نشاط CDK بدء تكرار الحمض النووي من خلال تشكيل ما قبل LC. [79]

يمثل تكوين مجمع ما قبل التكرار (pre-RC) المواقع المحتملة لبدء تكرار الحمض النووي. تمشيا مع مجمع صيانة الكروموسوم الصغير الذي يحيط بالحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، لا يؤدي تكوين ما قبل RC إلى فك الحمض النووي الأصلي أو تجنيد بوليميرات الحمض النووي. بدلاً من ذلك ، تم تشكيل ما قبل RC الذي تم تشكيله أثناء G1 يتم تنشيط دورة الخلية فقط لفك الحمض النووي وبدء النسخ المتماثل بعد مرور الخلايا من G1 إلى المرحلة S من دورة الخلية. [2]

بمجرد تكوين مجمع البدء وتمرير الخلايا إلى المرحلة S ، يصبح المجمع عندئذٍ مجددًا. إن مركب إعادة التجميد حقيقيات النوى مسؤول عن تنسيق تكاثر الحمض النووي. يتم إجراء النسخ المتماثل على السلاسل الرائدة والمتأخرة بواسطة DNA polymerase ε و DNA polymerase. العديد من عوامل إعادة التركيب بما في ذلك Claspin و And1 ومحمل المشبك C وعامل النسخ المتماثل ومركب حماية الشوكة مسؤولة عن تنظيم وظائف البوليميراز وتنسيق تخليق الحمض النووي مع فك حبلا القالب بواسطة مجمع Cdc45-Mcm-GINS. عندما يتم فك الحمض النووي ، يتناقص عدد الالتواء. للتعويض عن هذا ، يزداد عدد التلوي ، مما يؤدي إلى إدخال لفائف فائقة إيجابية في الحمض النووي. قد تتسبب هذه الملفات الفائقة في توقف تكاثر الحمض النووي إذا لم تتم إزالتها. تعتبر Topoisomerases مسؤولة عن إزالة هذه الملفات الفائقة قبل شوكة النسخ المتماثل.

إن الريبليزوم مسؤول عن نسخ الحمض النووي الجيني بأكمله في كل خلية تكاثرية. يتم تحفيز تفاعلات الاقتران الأساسي وتفاعلات تكوين السلسلة ، التي تشكل الحلزون البنت ، بواسطة بوليميراز الحمض النووي.[80] تتحرك هذه الإنزيمات على طول الحمض النووي أحادي الجديلة وتسمح بتمديد خيط الحمض النووي الناشئ عن طريق "قراءة" الشريط النموذجي والسماح بدمج القواعد النووية البيورينية المناسبة ، والأدينين والجوانين ، والقواعد النووية البيريميدين ، والثيمين والسيتوزين. توجد ديوكسي ريبونوكليوتيدات حرة نشطة في الخلية مثل ديوكسي ريبونوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTPs). تضاف هذه النيوكليوتيدات الحرة إلى مجموعة 3-هيدروكسيل مكشوفة على آخر نيوكليوتيدات مدمجة. في هذا التفاعل ، يتم تحرير بيروفوسفات من dNTP الحر ، لتوليد الطاقة لتفاعل البلمرة وتعريض 5 'أحادي الفوسفات ، والذي يتم بعد ذلك ربطه تساهميًا بالأكسجين 3. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إزالة النيوكليوتيدات التي تم إدخالها بشكل غير صحيح واستبدالها بالنيوكليوتيدات الصحيحة في رد فعل إيجابي قوي. هذه الخاصية ضرورية للتدقيق الصحيح وإصلاح الأخطاء التي تحدث أثناء تكرار الحمض النووي.

تحرير شوكة النسخ المتماثل

شوكة النسخ المتماثل هي نقطة التقاء بين خيوط القالب المنفصلة حديثًا ، والمعروفة باسم الخيوط الرائدة والمتأخرة ، والحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل. نظرًا لأن DNA مزدوج الاتجاه غير متوازي ، يحدث تكرار الحمض النووي في اتجاهات متعاكسة بين السلاسل الجديدة في شوكة النسخ المتماثل ، لكن جميع بوليمرات الحمض النووي تصنع الحمض النووي في اتجاه 5 إلى 3 فيما يتعلق بالخيط المركب حديثًا. مطلوب مزيد من التنسيق أثناء تكرار الحمض النووي. يقوم اثنان من البوليميرات التكرارية بتوليف الحمض النووي في اتجاهات معاكسة. يقوم البلمرة - بتوليف الدنا على خيط DNA "الرائد" بشكل مستمر لأنه يشير في نفس اتجاه فك الحمض النووي عن طريق إعادة التركيب. في المقابل ، يقوم بوليميراز بتوليف DNA على الخيط "المتأخر" ، وهو خيط قالب DNA المعاكس ، بطريقة مجزأة أو متقطعة.

تُعرف الامتدادات المتقطعة لمنتجات تكرار الحمض النووي على الشريط المتأخر باسم شظايا Okazaki ويبلغ طولها حوالي 100 إلى 200 قاعدة في شوكات النسخ المتماثل حقيقية النواة. عادةً ما يحتوي الشريط المتأخر على امتدادات أطول من الحمض النووي أحادي السلسلة والمغلف ببروتينات ربط أحادية السلسلة ، مما يساعد على استقرار القوالب أحادية السلسلة عن طريق منع تكوين بنية ثانوية. في حقيقيات النوى ، هذه البروتينات الرابطة أحادية السلسلة عبارة عن مركب غير متجانس يعرف باسم بروتين النسخ A (RPA). [81]

يسبق كل جزء من أجزاء أوكازاكي مادة أولية من الحمض النووي الريبي ، والتي يتم إزاحتها بواسطة موكب جزء أوكازاكي التالي أثناء التركيب. يتعرف RNase H على DNA: هجينة RNA التي تم إنشاؤها باستخدام بادئات RNA وهي مسؤولة عن إزالتها من الخيط المكرر ، تاركًا وراءها التمهيدي: تقاطع القالب. يتعرف DNA polymerase α على هذه المواقع ويطيل الفواصل التي خلفتها إزالة التمهيدي. في الخلايا حقيقية النواة ، يتم أيضًا إزاحة كمية صغيرة من جزء الحمض النووي مباشرة في بداية الطريق التمهيدي للحمض النووي الريبي ، مما يؤدي إلى تكوين هيكل رفرف. ثم يتم شق هذه السديلة بواسطة نوكليازات داخلية. عند شوكة النسخ ، يتم سد الفجوة في الحمض النووي بعد إزالة السديلة بواسطة DNA ligase I ، الذي يعمل على إصلاح النكات المتبقية بين 3'-OH و 5'فوسفات من الخيط المركب حديثًا. [82] نظرًا للطبيعة القصيرة نسبيًا لجزء Okazaki حقيقية النواة ، فإن تخليق تكرار الحمض النووي الذي يحدث بشكل متقطع على الخيط المتأخر يكون أقل كفاءة ويستغرق وقتًا أطول من تخليق الخيوط الرائدة. يكتمل تخليق الحمض النووي بمجرد إزالة جميع بادئات الحمض النووي الريبي وإصلاح النكات.

يؤدي حبلا تحرير

أثناء تكاثر الحمض النووي ، فإن الريبليزوم سوف يزيل الحمض النووي المزدوج للوالدين في شوكة تكرار قالب الحمض النووي أحادي الجديلة في اتجاه 5 'إلى 3'. الخيط الأمامي هو خيط القالب الذي يتم نسخه في نفس اتجاه حركة شوكة النسخ المتماثل. هذا يسمح للحبلا المركب حديثًا المكمّل للخيط الأصلي ليتم تصنيعه 5 'إلى 3' في نفس اتجاه حركة شوكة النسخ المتماثل. [83]

بمجرد إضافة مادة أولية من الحمض النووي الريبي بواسطة بريماز إلى الطرف 3 من الخيط الرئيسي ، سيستمر تخليق الحمض النووي في اتجاه 3 إلى 5 فيما يتعلق بالخيط الرئيسي دون انقطاع. سيضيف DNA Polymerase باستمرار نيوكليوتيدات إلى خيط القالب ، وبالتالي فإن تصنيع الخيوط الرائدة يتطلب أساسًا واحدًا فقط وله نشاط بوليميريز DNA غير متقطع. [84]

تحرير حبلا متخلفة

تكرار الحمض النووي على الخيط المتأخر غير مستمر. في تخليق الخيوط المتأخرة ، تتطلب حركة بوليميراز الحمض النووي في الاتجاه المعاكس لشوكة النسخ استخدام عدة بادئات RNA. يقوم بوليميراز الدنا بتخليق شظايا قصيرة من الحمض النووي تسمى شظايا أوكازاكي والتي تضاف إلى الطرف الثالث من التمهيدي. يمكن أن تكون هذه الشظايا في أي مكان بين 100-400 نيوكليوتيد طويلة في حقيقيات النوى. [85]

في نهاية تخليق جزء Okazaki ، يمتد DNA polymerase إلى جزء Okazaki السابق ويزيح نهايته 5 'التي تحتوي على RNA التمهيدي وقطعة صغيرة من DNA. ينتج عن هذا سديلة جدائل مفردة من الحمض النووي الريبي DNA ، والتي يجب شقها ، ويجب أن يتم ختم النك الموجود بين شظايا أوكازاكي بواسطة DNA ligase I. تُعرف هذه العملية باسم نضج جزء Okazaki ويمكن التعامل معها بطريقتين: عمليات آلية واحدة اللوحات القصيرة ، بينما تتعامل الأخرى مع اللوحات الطويلة. [86] بوليميريز الحمض النووي δ قادر على إزاحة ما يصل إلى 2 إلى 3 نيوكليوتيدات من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي قبل البلمرة ، مما ينتج عنه ركيزة "رفرف" قصيرة لـ Fen1 ، والتي يمكنها إزالة النيوكليوتيدات من السديلة ، ونيوكليوتيد واحد في كل مرة.

من خلال تكرار دورات هذه العملية ، يمكن لـ DNA polymerase δ و Fen1 تنسيق إزالة بادئات RNA وترك شق DNA عند الخيط المتأخر. [87] وقد تم اقتراح أن هذه العملية التكرارية مفضلة على الخلية لأنها منظمة بإحكام ولا تولد اللوحات الكبيرة التي يجب استئصالها. [88] في حالة عدم تنظيم نشاط Fen1 / DNA polymerase ، تستخدم الخلية آلية بديلة لتوليد ومعالجة اللوحات الطويلة باستخدام Dna2 ، والذي يحتوي على كل من الهليكاز وأنشطة نوكلياز. [89] مطلوب نشاط نوكلياز Dna2 لإزالة هذه اللوحات الطويلة ، وترك سديلة أقصر لتتم معالجتها بواسطة Fen1. تشير دراسات المجهر الإلكتروني إلى أن التحميل النووي على الخيط المتأخر يحدث بالقرب من موقع التوليف. [90] وبالتالي ، فإن نضج شظايا أوكازاكي هو عملية فعالة تحدث مباشرة بعد تصنيع الحمض النووي الناشئ.

تحرير بلمرة الحمض النووي المتماثل

بعد أن تخلص الهيليك التكاثري من حل مزدوج الحمض النووي الأبوي ، وكشف عن نموذجين للحمض النووي أحادي الجديلة ، هناك حاجة إلى بوليميرات مضاعفة لتوليد نسختين من الجينوم الأبوي. إن وظيفة بوليميراز الحمض النووي عالية التخصص وتؤدي إلى التكرار على قوالب محددة وفي مواقع ضيقة. في شوكة النسخ المتماثل حقيقية النواة ، توجد ثلاثة مجمعات بوليميراز مكررة متميزة تساهم في تكرار الحمض النووي: Polymerase α و Polymerase δ و Polymerase ε. هذه البوليمرات الثلاثة ضرورية لبقاء الخلية. [91]

نظرًا لأن بوليميرات الحمض النووي تتطلب أساسًا لبدء تخليق الحمض النووي ، فإن البوليميراز α (Pol α) يعمل بمثابة بريماز مكرر. يرتبط Pol α ببريميز RNA وهذا المركب ينجز مهمة التمهيدي عن طريق تخليق مادة أولية تحتوي على امتداد قصير من 10 نيوكليوتيدات من RNA متبوعًا بـ 10 إلى 20 قاعدة DNA. [3] الأهم من ذلك ، أن هذا الإجراء الأولي يحدث عند بدء النسخ المتماثل في الأصول لبدء تركيب الخيوط الرائدة وأيضًا في نهاية 5 'من كل جزء من أجزاء أوكازاكي على الشريط المتأخر.

ومع ذلك ، فإن Pol α غير قادر على مواصلة تكرار الحمض النووي ويجب استبداله ببوليميراز آخر لمواصلة تخليق الحمض النووي. [92] يتطلب تبديل البوليميراز تحميل المشابك وقد ثبت أن تكرار الحمض النووي الطبيعي يتطلب إجراءات منسقة لجميع بوليمرات الحمض النووي الثلاثة: Pol α للتوليف الأولي ، Polymerase لتكرار السلسلة الرائدة ، و Pol ، الذي يتم تحميله باستمرار ، لتوليد شظايا أوكازاكي أثناء تخليق الخيوط المتأخرة. [93]

  • بوليميراز α (بولي α): يشكل معقدًا مع وحدة فرعية تحفيزية صغيرة (PriS) ووحدة فرعية كبيرة غير حفزية (PriL). [94] أولاً ، يسمح تخليق مادة RNA الأولية بتكوين DNA بواسطة DNA polymerase alpha. يحدث مرة واحدة في الأصل على الخيط الأمامي وفي بداية كل جزء من أجزاء أوكازاكي على الخصلة المتأخرة. تعمل الوحدات الفرعية Pri بمثابة بريماز ، وتوليف RNA التمهيدي. يقوم DNA Pol α بإطالة التمهيدي المتشكل حديثًا باستخدام نيوكليوتيدات الحمض النووي. بعد حوالي 20 نيوكليوتيد ، يتم أخذ الاستطالة بواسطة Pol على الخيط الرئيسي و Pol على الشريط المتأخر. [95]
  • بوليميراز δ (بولي δ): معالج للغاية ومصحح لغويًا ، نشاط نوكلياز خارجي 3 '- & GT5'. في الجسم الحي ، إنه البوليميراز الرئيسي المتضمن في كل من الخيط المتأخر و الرائدة في تصنيع حبلا. [96]
  • بوليميراز ε (بولي ε): معالج للغاية ومصحح لغويًا ، نشاط نوكلياز خارجي 3 '- & GT5'. وثيق الصلة بـ pol δ ، في الجسم الحي يعمل بشكل رئيسي في فحص خطأ pol. [96]

تحرير مجمع هليكاز Cdc45 – Mcm – GINS

يجب أن تظل مروحيات الحمض النووي والبوليميراز على اتصال وثيق عند شوكة النسخ المتماثل. إذا حدث الفك قبل التوليف بوقت طويل ، فإن مساحات كبيرة من الحمض النووي أحادي الجديلة تكون مكشوفة. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تنشيط إشارات تلف الحمض النووي أو تحفيز عمليات إصلاح الحمض النووي. لإحباط هذه المشاكل ، تحتوي إعادة التجميد حقيقية النواة على بروتينات متخصصة مصممة لتنظيم نشاط الهليكاز قبل شوكة النسخ المتماثل. توفر هذه البروتينات أيضًا مواقع الالتحام للتفاعل الفيزيائي بين الهليكازات والبوليميراز ، وبالتالي ضمان أن يقترن فك اللف المزدوج بتخليق الحمض النووي. [97]

لكي تعمل بوليميرات الحمض النووي ، يجب فك حلزون الحمض النووي المزدوج الشريطة لفضح نموذجين من قوالب الحمض النووي الأحادي الجديلة للتكرار. هيليكازات الحمض النووي مسؤولة عن فك الحمض النووي مزدوج الشريطة أثناء تكرار الكروموسوم. الهليكازات في الخلايا حقيقية النواة معقدة بشكل ملحوظ. [98] يتكون القلب التحفيزي لهليكاز من ستة بروتينات صيانة للكروموسوم الصغير (Mcm2-7) ، مكونة حلقة سداسية أميركية. بعيدًا عن الحمض النووي ، تشكل بروتينات Mcm2-7 هيكسامًا متغايرًا واحدًا ويتم تحميلها في شكل غير نشط في أصول تكرار الحمض النووي مثل السداسيات المزدوجة من الرأس إلى الرأس حول الحمض النووي المزدوج الشريطة. [98] [99] يتم تجنيد بروتينات Mcm لأصول النسخ المتماثل ثم إعادة توزيعها في جميع أنحاء الحمض النووي الجيني خلال المرحلة S ، مما يدل على توطينهم في شوكة النسخ المتماثل. [48]

يمكن أن يحدث تحميل بروتينات Mcm فقط أثناء G1 من دورة الخلية ، ثم يتم تنشيط المركب المحمّل أثناء المرحلة S عن طريق توظيف بروتين Cdc45 ومركب GINS لتشكيل الهليكس النشط Cdc45 – Mcm – GINS (CMG) عند شوكات النسخ المتماثل للحمض النووي. [100] [101] نشاط Mcm مطلوب طوال المرحلة S لتكرار الحمض النووي. [36] [102] تتجمع مجموعة متنوعة من العوامل التنظيمية حول CMG هيليكاز لإنتاج "مجمع التقدم المتعاقب" الذي يرتبط ببوليميراز الحمض النووي لتشكيل إعادة تشكيل حقيقيات النوى ، والتي لا يزال هيكلها ضعيفًا تمامًا مقارنة بنظيره البكتيري . [54] [103]

يحتوي مركب CMG الهيكليز المعزول ومجمع التقدم المتطور على مجمع حلقة بروتين Mcm واحد مما يشير إلى أن السداسي المزدوج المحمل لبروتينات Mcm في الأصل يمكن تقسيمه إلى حلقتين سداسيتين مفردتين كجزء من عملية البدء ، مع تشكيل كل حلقة معقدة من البروتين Mcm قلب هليكاز CMG في شوكات النسخ المتماثل التي تم إنشاؤها من كل مصدر. [54] [100] مطلوب مجمع CMG الكامل لفك الحمض النووي ، ومركب CDC45-Mcm-GINS هو هليكس الحمض النووي الوظيفي في الخلايا حقيقية النواة. [104]

تحرير البروتينات Ctf4 و And1

يتفاعل مجمع CMG مع الإعادة من خلال التفاعل مع بروتينات Ctf4 و And1. تتفاعل بروتينات Ctf4 / And1 مع كل من مركب CMG و DNA polymerase α. [105] Ctf4 هو عامل ملحق α للبوليميراز ، وهو مطلوب لتوظيف polymerase α في أصول النسخ المتماثل. [106]

تحرير بروتينات Mrc1 و Claspin

تقترن بروتينات Mrc1 / Claspin التركيب الرائد للخيوط مع نشاط هيليكاز المركب CMG. يتفاعل Mrc1 مع polymerase وكذلك بروتينات Mcm. [107] تم التأكيد على أهمية هذا الارتباط المباشر بين الهليكاز والبوليميراز الرائد من خلال النتائج في الخلايا البشرية المستنبتة ، حيث يكون المركب Mrc1 / Claspin مطلوبًا لتقدم شوكة النسخ المتماثل بكفاءة. [108] تشير هذه النتائج إلى أن النسخ المتماثل الفعال للحمض النووي يتطلب أيضًا اقتران الهليكازات وتوليف الخيوط الرائدة.

تكاثر مستضد الخلية النووية تحرير

تتطلب بوليميرات الحمض النووي عوامل إضافية لدعم تكرار الحمض النووي. تحتوي بوليميرات الحمض النووي على بنية "يدوية" نصف مغلقة ، والتي تسمح للبوليميراز بالتحميل على الحمض النووي والبدء في الانتقال. تسمح هذه البنية لبوليميراز الحمض النووي بالاحتفاظ بقالب الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل ، ودمج dNTPs في الموقع النشط ، وإطلاق الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل حديثًا. ومع ذلك ، فإن بنية بوليميرات الحمض النووي لا تسمح بالتفاعل المستقر المستمر مع قالب الحمض النووي. [1]

لتقوية التفاعل بين البوليميراز والحمض النووي للقالب ، ترتبط المشابك المنزلقة للحمض النووي بالبوليميراز لتعزيز عملية البوليميراز المتكاثر. في حقيقيات النوى ، يكون المشبك المنزلق عبارة عن بنية حلقة متجانسة تُعرف باسم مستضد الخلية النووي المتكاثر (PCNA). تتميز حلقة PCNA بقطبية مع الأسطح التي تتفاعل مع بوليميراز الحمض النووي وتربطها بشكل آمن بقالب الحمض النووي. إن التثبيت المعتمد على PCNA لبوليميرات الحمض النووي له تأثير كبير على تكرار الحمض النووي لأن PCNAs قادرة على تعزيز عملية البوليميراز حتى 1000 ضعف. [109] [110] يعتبر PCNA عاملاً مساعدًا أساسيًا ويتميز بكونه أحد أكثر منصات التفاعل شيوعًا في repisome لاستيعاب عمليات متعددة عند شوكة النسخ المتماثل ، وبالتالي يُنظر إلى PCNA أيضًا كعامل مساعد تنظيمي لبوليميرات الحمض النووي. [111]

تحرير عامل النسخ المتماثل

يطوق PCNA تمامًا حبلا قالب الحمض النووي ويجب تحميله على DNA عند شوكة النسخ المتماثل. في الخيط الرئيسي ، يعد تحميل PCNA عملية غير متكررة ، لأن تكرار الحمض النووي على الشريط الرئيسي مستمر حتى يتم إنهاء النسخ المتماثل. ومع ذلك ، في الخيط المتأخر ، يحتاج DNA polymerase إلى التحميل المستمر في بداية كل جزء Okazaki. يتطلب هذا البدء المستمر لتخليق أجزاء Okazaki تحميل PCNA متكررًا لتكرار الحمض النووي بكفاءة.

يتم تحميل PCNA بواسطة مجمع عامل النسخ المتماثل C (RFC). يتكون مجمع RFC من خمسة ATPases: Rfc1 و Rfc2 و Rfc3 و Rfc4 و Rfc5. [112] يتعرف RFC على تقاطعات القالب التمهيدي ويحمل PCNA في هذه المواقع. [113] [114] يتم فتح أداة تجزئة PCNA بواسطة RFC بواسطة التحلل المائي ATP ثم يتم تحميلها على DNA في الاتجاه الصحيح لتسهيل ارتباطها بالبوليميراز. [115] [116] يمكن لرافعات المشابك أيضًا تفريغ PCNA من الحمض النووي ، وهي آلية مطلوبة عندما يجب إنهاء النسخ المتماثل. [116]

توقف تحرير شوكة النسخ المتماثل

يمكن إيقاف تكاثر الحمض النووي عند شوكة النسخ بنقص ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTPs) أو تلف الحمض النووي ، مما يؤدي إلى إجهاد النسخ المتماثل. [117] هذا التوقف للنسخ يوصف بأنه أ شوكة النسخ المتوقفة. يعمل مجمع حماية البروتينات على تثبيت شوكة النسخ حتى يمكن إصلاح تلف الحمض النووي أو مشاكل النسخ الأخرى. [117] يمكن أن يؤدي توقف شوكة النسخ المتماثل المطول إلى مزيد من التلف في الحمض النووي. يتم إلغاء تنشيط إشارات المماطلة إذا تم حل المشكلات التي تسبب تفرع النسخ المتماثل. [117]

يتطلب إنهاء تكرار الحمض النووي حقيقية النواة عمليات مختلفة اعتمادًا على ما إذا كانت الكروموسومات دائرية أو خطية. على عكس الجزيئات الخطية ، فإن الكروموسومات الدائرية قادرة على تكرار الجزيء بأكمله. ومع ذلك ، فإن جزيئي الحمض النووي سيظلان مرتبطين معًا. يتم التعامل مع هذه المشكلة عن طريق فك جزيئات الحمض النووي بواسطة النوع الثاني توبويزوميراز. تُستخدم الإيزوميراز من النوع الثاني أيضًا لفصل الخيوط الخطية حيث يتم طيها بشكل معقد في جسيم نووي داخل الخلية.

كما ذكرنا سابقًا ، تواجه الكروموسومات الخطية مشكلة أخرى لا تظهر في تكرار الحمض النووي الدائري. نظرًا لحقيقة أن التمهيدي RNA مطلوب لبدء تخليق الحمض النووي ، فإن الخيط المتأخر يكون في وضع غير مؤات في تكرار الكروموسوم بأكمله. في حين أن الخيط الرئيسي يمكن أن يستخدم أساسًا واحدًا من الحمض النووي الريبي لتمديد الطرف الخامس من خيط DNA المتماثل ، فإن العديد من بادئات الحمض النووي الريبي مسؤولة عن تخليق الخيوط ، مما يؤدي إلى تكوين شظايا أوكازاكي. يؤدي هذا إلى مشكلة نظرًا لحقيقة أن بوليميريز الحمض النووي قادر فقط على الإضافة إلى الطرف الثالث من خيط الحمض النووي. يترك تأثير 3'-5 'لبوليميراز الحمض النووي على طول الشريط الأم منطقة DNA قصيرة أحادية السلسلة (ssDNA) في نهاية 3' من الخيط الأصلي عندما يتم إصلاح شظايا Okazaki. نظرًا لأن النسخ المتماثل يحدث في اتجاهات متعاكسة عند الأطراف المتقابلة للكروموسومات الأصلية ، فإن كل خيط هو حبلا متخلفًا في أحد طرفيه. بمرور الوقت ، سيؤدي ذلك إلى تقصير تدريجي لكل من كروموسومات الابنة. يُعرف هذا بمشكلة نهاية النسخ المتماثل. [1]

يتم التعامل مع مشكلة النسخ المتماثل النهائي في الخلايا حقيقية النواة عن طريق مناطق التيلومير والتيلوميراز. تمد التيلوميرات الطرف 3 من الكروموسوم الأبوي إلى ما بعد الطرف 5 من حبلا الابنة. يمكن أن تعمل بنية الحمض النووي المفرد التي تقطعت بها السبل كأصل للنسخ المتماثل الذي يجند الإنزيم تيلوميراز. التيلوميراز عبارة عن بوليميراز DNA متخصص يتكون من وحدات بروتينية فرعية ومكون RNA. يصلب مكون الحمض النووي الريبي في الإنزيم تيلوميراز إلى الطرف المفرد الذي تقطعت به السبل 3 'من قالب الحمض النووي ويحتوي على 1.5 نسخة من تسلسل التيلوميرا. [85] يحتوي التيلوميراز على وحدة فرعية من البروتين وهي عبارة عن نسخة عكسية تسمى إنزيم التيلوميراز العكسي أو TERT. يقوم TERT بتركيب الحمض النووي حتى نهاية قالب تيلوميراز RNA ثم ينفصل. [85] يمكن تكرار هذه العملية عدة مرات حسب الحاجة مع تمديد الطرف الثالث من جزيء الحمض النووي الأبوي. توفر هذه الإضافة 3 نموذجًا لتمديد الطرف 5 من حبلا الابنة عن طريق تخليق الحمض النووي للضفيرة المتأخرة. يتم تنظيم نشاط التيلوميراز بواسطة بروتينات ربط التيلومير.

حواجز شوكة النسخ المتماثل تحرير

يعد تكرار الحمض النووي بدائية النواة ثنائي الاتجاه داخل الأصل التكاثر ، ويتم إنشاء مجمعات ريبليزوم في كل نهاية من أصل النسخ المتماثل وتتحرك البدائل بعيدًا عن بعضها البعض من نقطة البداية الأولية. في بدائيات النوى ، يبدأ النسخ المتماثل ثنائي الاتجاه في أصل متماثل واحد على الكروموسوم الدائري وينتهي في موقع معارضة من البداية الأولية للأصل. [118] مناطق الإنهاء هذه لها تسلسل DNA معروف باسم تير المواقع. هؤلاء تير المواقع مرتبطة ببروتين Tus. ال تير- مجمع Tus قادر على إيقاف نشاط هيليكاز ، وإنهاء النسخ المتماثل. [119]

في الخلايا حقيقية النواة ، يحدث إنهاء النسخ المتماثل عادةً من خلال اصطدام الشوكتين المتماثلتين بين أصلي النسخ المتماثل النشطين.يختلف موقع الاصطدام حسب توقيت إطلاق النار الأصلي. وبهذه الطريقة ، إذا توقفت شوكة النسخ المتماثل أو انهارت في موقع معين ، فيمكن إنقاذ النسخ المتماثل للموقع عندما تكتمل عملية إعادة الانتقال في الاتجاه المعاكس من نسخ المنطقة. توجد حواجز شوكة النسخ المتماثل المبرمجة (RFBs) المرتبطة ببروتينات RFB في مواقع مختلفة ، في جميع أنحاء الجينوم ، والتي تكون قادرة على إنهاء أو إيقاف شوكات النسخ المتماثل ، وإيقاف تقدم الريبليزوم. [118]

لقد وجد أن النسخ المتماثل يحدث بطريقة موضعية في نواة الخلية. على عكس النظرة التقليدية لتحريك شوكات النسخ المتماثل على طول الحمض النووي الراكد ، فإن مفهوم مصانع النسخ المتماثل ظهرت ، مما يعني أن شوكات النسخ تتركز نحو بعض مناطق "المصنع" المعطلة التي تمر من خلالها خيوط DNA النموذجية مثل أحزمة النقل. [120]

تكرار الحمض النووي هو عملية منظمة بإحكام يتم التحكم فيها في سياق دورة الخلية. يتم تنظيم التقدم خلال دورة الخلية وبالتالي تكرار الحمض النووي بإحكام من خلال تكوين وتفعيل المجمعات السابقة للتكرار (pre-RCs) والتي يتم تحقيقها من خلال تنشيط وتعطيل الكينازات المعتمدة على السيكلين (Cdks ، CDKs). على وجه التحديد ، فإن تفاعلات cyclins و kinases المعتمدة على cyclin هي المسؤولة عن الانتقال من G1 في المرحلة S.

خلال G1 مرحلة دورة الخلية هناك مستويات منخفضة من نشاط CDK. يسمح هذا المستوى المنخفض من نشاط CDK بتكوين مجمعات جديدة قبل RC ولكنه ليس كافيًا لبدء تكرار الحمض النووي بواسطة المنسقين السابقين الذين تم تشكيلهم حديثًا. خلال المراحل المتبقية من دورة الخلية ، توجد مستويات مرتفعة من نشاط CDK. هذا المستوى العالي من نشاط CDK مسؤول عن بدء تكرار الحمض النووي وكذلك منع تكوين معقد جديد قبل RC. [2] بمجرد بدء استنساخ الحمض النووي ، يتم تفكيك معقد ما قبل RC. نظرًا لحقيقة أن مستويات CDK تظل مرتفعة خلال المرحلة S ، فإن G2، ومراحل M من دورة الخلية لا يمكن تشكيل مجمعات جديدة قبل RC. كل هذا يساعد على ضمان عدم حدوث أي بدء حتى اكتمال انقسام الخلية.

بالإضافة إلى الكينازات المعتمدة على السيكلين ، يُعتقد أنه تم منع جولة جديدة من النسخ المتماثل من خلال تقليل التنظيم لـ Cdt1. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحلل Cdt1 وكذلك من خلال الإجراءات المثبطة للبروتين المعروف باسم geminin. يرتبط Geminin بإحكام بـ Cdt1 ويعتقد أنه المانع الرئيسي لإعادة التكرار. [2] يظهر Geminin لأول مرة في المرحلة S ويتحلل عند انتقال الطور الطوري ، ربما من خلال التواجد عن طريق معقد التعزيز الطوري (APC). [121]

توجد نقاط تفتيش مختلفة لدورة الخلية طوال دورة الخلية التي تحدد ما إذا كانت الخلية ستتقدم من خلال الانقسام بالكامل. الأهم في تكرار G1، أو التقييد ، تحدد نقطة التفتيش ما إذا كان بدء النسخ المتماثل سيبدأ أم لا أو ما إذا كانت الخلية ستوضع في مرحلة الراحة المعروفة باسم G0. الخلايا في G0 يتم منع مرحلة دورة الخلية من بدء جولة من النسخ المتماثل لأن بروتينات صيانة الصبغي الصغير لا يتم التعبير عنها. يشير الانتقال إلى المرحلة S إلى بدء النسخ المتماثل.

تحرير بروتينات نقطة تفتيش النسخ المتماثل

من أجل الحفاظ على المعلومات الجينية أثناء انقسام الخلية ، يجب إكمال تكرار الحمض النووي بدقة عالية. من أجل تحقيق هذه المهمة ، تحتوي الخلايا حقيقية النواة على بروتينات في مكانها خلال نقاط معينة في عملية النسخ المتماثل قادرة على اكتشاف أي أخطاء أثناء تكرار الحمض النووي وتكون قادرة على الحفاظ على السلامة الجينية. إن بروتينات نقاط التفتيش هذه قادرة على إيقاف دورة الخلية من الدخول في الانقسام الفتيلي من أجل إتاحة الوقت لإصلاح الحمض النووي. تشارك بروتينات نقاط التفتيش أيضًا في بعض مسارات إصلاح الحمض النووي ، بينما تعمل على تثبيت هيكل شوكة النسخ المتماثل لمنع المزيد من الضرر. تعتبر بروتينات نقاط التفتيش هذه ضرورية لتجنب نقل الطفرات أو الانحرافات الصبغية الأخرى إلى النسل.

يتم حفظ بروتينات نقطة تفتيش حقيقيات النوى جيدًا وتتضمن اثنين من كينازات مرتبطة بفوسفاتيديلينوسيتول 3 كيناز (PIKKs) و ATR و ATM. يشترك كل من ATR و ATM في تسلسل الفسفرة المستهدف ، وهو شكل SQ / TQ ، ولكن تختلف أدوارهما الفردية في الخلايا. [122]

يشارك ATR في إيقاف دورة الخلية استجابةً لانقطاعات الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل. لدى ATR شريك نقطة تفتيش ملزم ، وهو بروتين متفاعل ATR (ATRIP) ، ويستجيب هذان البروتينان معًا إلى امتدادات الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل والمغلف ببروتين النسخ A (RPA). [123] يحدث تكوين الحمض النووي أحادي السلسلة بشكل متكرر ، في كثير من الأحيان أثناء إجهاد النسخ المتماثل. ATR-ATRIP قادر على إيقاف دورة الخلية للحفاظ على سلامة الجينوم. تم العثور على ATR على الكروماتين خلال المرحلة S ، على غرار RPA و claspin. [124]

يعد إنشاء مسارات الحمض النووي المفردة الجديلة أمرًا مهمًا في بدء مسارات نقاط التفتيش في اتجاه مجرى ضرر النسخ المتماثل. بمجرد أن يصبح الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل طويلاً بما فيه الكفاية ، فإن الحمض النووي أحادي السلسلة والمغطى بـ RPA يكون قادرًا على تجنيد ATR-ATRIP. [125] من أجل أن يصبح كيناز ATR نشطًا بشكل كامل ، يعتمد على بروتينات الاستشعار التي تتحسس ما إذا كانت بروتينات نقطة التفتيش موضعية في موقع صالح لضغط تكرار الحمض النووي. المشبك RAD9-HUS1-Rad1 (9-1-1) غير المتجانسة وجرافة المشبك RFC Rad17 قادرة على التعرف على الحمض النووي المشقوق أو المكسور. تحميل المشبك RFC Rad17 9-1-1 على الحمض النووي التالف. [126] يعد وجود 9-1-1 على الحمض النووي كافيًا لتسهيل التفاعل بين ATR-ATRIP ومجموعة من البروتينات تسمى وسطاء نقاط التفتيش ، مثل TOPBP1 و Mrc1 / claspin. يتفاعل TOPBP1 مع مكون Rad9 الفسفوري ويجنده في 9-1-1 ويربط ATR-ATRIP ، الذي يفسفر Chk1. [127] مطلوب أيضًا Mrc1 / Claspin من أجل التنشيط الكامل لـ ATR-ATRIP الذي يعمل على فسفوريلات Chk1 ، وهو عامل التأثير الرئيسي لنقطة التفتيش النهائية كيناز. [128] Claspin هو أحد مكونات Repisome ويحتوي على مجال لرسو السفن مع Chk1 ، مما يكشف عن وظيفة محددة لـ Claspin أثناء تكرار الحمض النووي: تعزيز إشارة نقطة التفتيش في الريبليزوم. [129]

تعد إشارات Chk1 أمرًا حيويًا لإيقاف دورة الخلية ومنع الخلايا من الدخول إلى الانقسام مع تكرار الحمض النووي غير الكامل أو تلف الحمض النووي. يعد تثبيط Cdk المعتمد على Chk1 مهمًا لوظيفة نقطة تفتيش ATR-Chk1 ولوقف دورة الخلية والسماح بوقت كافٍ لاستكمال آليات إصلاح الحمض النووي ، والتي بدورها تمنع وراثة الحمض النووي التالف. بالإضافة إلى ذلك ، يلعب تثبيط Cdk المعتمد على Chk1 دورًا مهمًا في تثبيط إطلاق النار الأصلي أثناء المرحلة S. تمنع هذه الآلية استمرار تخليق الحمض النووي وهي ضرورية لحماية الجينوم في وجود إجهاد النسخ والظروف السمية الجينية المحتملة. [130] وبالتالي ، فإن نشاط ATR-Chk1 يمنع أيضًا مشاكل التكرار المحتملة على مستوى أصول النسخ المتماثل الفردي عن طريق تثبيط بدء النسخ المتماثل في جميع أنحاء الجينوم ، حتى يتم إيقاف تشغيل سلسلة الإشارات التي تحافظ على إيقاف دورة الخلية.

يجب ضغط الحمض النووي حقيقيات النوى بإحكام حتى يتناسب مع المساحة الضيقة للنواة. يتم تغليف الكروموسومات عن طريق لف 147 نيوكليوتيد حول ثماني من بروتينات هيستون ، لتشكيل الجسيم النووي. يشتمل ثماني النواة النووية على نسختين من كل هيستون H2A و H2B و H3 و H4. نظرًا للارتباط الوثيق بين بروتينات الهيستون والحمض النووي ، فإن الخلايا حقيقية النواة تحتوي على بروتينات مصممة لإعادة تشكيل الهيستونات قبل شوكة النسخ المتماثل ، من أجل السماح بالتقدم السلس للريمبليزوم. [131] هناك أيضًا بروتينات تشارك في إعادة تجميع الهستونات خلف شوكة النسخ لإعادة تكوين التشكل النووي. [132]

هناك العديد من مرافقي الهيستون المعروفين بمشاركتهم في تجميع النيوكليوسوم بعد النسخ المتماثل. تم العثور على مجمع FACT للتفاعل مع مجمع DNA polymerase α-primase ، وتفاعلت الوحدات الفرعية لمركب FACT وراثيًا مع عوامل النسخ. [١٣٣] [١٣٤] مركب FACT هو مغاير لا يحلل جزيء ATP ، ولكنه قادر على تسهيل "فك" الهستونات في النيوكليوزومات ، ولكن كيف يمكن لمركب FACT أن يخفف من الترابط الوثيق للهيستونات لإزالة الحمض النووي لا يزال دون إجابة . [135]

مرافقة هيستون أخرى مرتبطة بالريمبليزوم هي Asf1 ، والتي تتفاعل مع مجمع Mcm الذي يعتمد على ثنائيات هيستون H3-H4. [136] Asf1 قادر على تمرير ثنائي H3-H4 المركب حديثًا إلى عوامل الترسيب خلف شوكة النسخ وهذا النشاط يجعل ثنائيات هيستون H3-H4 متاحة في موقع ترسيب الهيستون بعد النسخ المتماثل مباشرة. [137] Asf1 (وشريكه Rtt109) متورط أيضًا في تثبيط التعبير الجيني من الجينات المنسوخة خلال المرحلة S. [138]

عامل تجميع الكروماتين الوراثي غير المتجانس 1 (CAF-1) هو بروتين تكوين الكروماتين الذي يشارك في ترسيب الهستونات على كل من خيوط الحمض النووي التي تم نسخها حديثًا لتشكيل الكروماتين. [139] يحتوي CAF-1 على نموذج ربط PCNA ، يسمى PIP-box ، والذي يسمح لـ CAF-1 بالارتباط مع Repisome من خلال PCNA ويمكنه ترسيب ثنائيات هيستون H3-H4 على الحمض النووي المركب حديثًا. [140] [141] تشارك مرافق Rtt106 أيضًا في هذه العملية ، وترتبط بـ CAF-1 و H3-H4 ثنائيات أثناء تكوين الكروماتين. [142] تقوم هذه العمليات بتحميل الهيستونات المُصنَّعة حديثًا على الحمض النووي.

بعد ترسب الهيستونات H3-H4 ، تتشكل النيوكليوسومات من خلال ارتباط هيستون H2A-H2B. يُعتقد أن هذه العملية تحدث من خلال مجمع FACT ، نظرًا لأنها مرتبطة بالفعل بالريمبليزوم وقادرة على ربط H2A-H2B الحر ، أو أن هناك احتمالًا لوجود مرافق H2A-H2B آخر ، Nap1. [143] تظهر دراسات المجهر الإلكتروني أن هذا يحدث بسرعة كبيرة ، حيث يمكن ملاحظة النيوكليوسومات مكونة بضع مئات من أزواج القواعد بعد شوكة النسخ. [144] لذلك ، فإن العملية الكاملة لتشكيل نيوكليوسومات جديدة تحدث مباشرة بعد التكاثر بسبب اقتران مرافقات هيستون مع إعادة الحشوات.

عند مقارنتها بتكاثر الحمض النووي بدائية النواة ، يكون إكمال تكرار الحمض النووي حقيقي النواة أكثر تعقيدًا وينطوي على أصول متعددة للنسخ المتماثل والبروتينات المضاعفة لتحقيقها. يتم ترتيب الحمض النووي بدائية النواة في شكل دائري ، وله أصل واحد فقط عند بدء النسخ المتماثل. على النقيض من ذلك ، فإن الحمض النووي حقيقي النواة خطي. عند التكرار ، هناك ما يصل إلى ألف أصل من النسخ المتماثل. [145]

الحمض النووي حقيقيات النواة ثنائي الاتجاه. هنا يختلف معنى كلمة ثنائية الاتجاه. الحمض النووي الخطي حقيقي النواة له أصول عديدة (تسمى O) و Termini (تسمى T). "T" موجود على يمين "O". واحد "O" وواحد "T" معًا يشكلان نسخة طبق الأصل. بعد تكوين مجمع ما قبل البدء ، عندما يبدأ استطالة أحد النسخ المتماثلة ، يبدأ البدء في النسخ المتماثل الثاني. الآن ، إذا تحركت النسخة الأولى في اتجاه عقارب الساعة ، يتحرك البليكون الثاني في عكس اتجاه عقارب الساعة ، حتى يتم الوصول إلى "T" من أول ريليكون. عند "T" ، يتم دمج كل من النسخ المتماثلة لإكمال عملية النسخ المتماثل. وفي الوقت نفسه ، يتحرك النسخ المتماثل الثاني في الاتجاه الأمامي أيضًا ، ليلتقي بالنسخة الثالثة. تسمى هذه الحركة في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة لاثنين من النسخ المتماثلة على أنها تكرار ثنائي الاتجاه.

يتطلب تكرار الحمض النووي حقيقيات النوى تنسيقًا دقيقًا لجميع بوليميرات الحمض النووي والبروتينات المرتبطة به لتكرار الجينوم بأكمله في كل مرة تنقسم فيها الخلية. يتم تحقيق هذه العملية من خلال سلسلة من خطوات تجميعات البروتين في أصول التكرار ، مع التركيز بشكل أساسي على تنظيم تكرار الحمض النووي على ارتباط هليكاز MCM بالحمض النووي. توجه أصول النسخ المتماثل هذه عدد مجمعات البروتين التي ستتشكل لبدء النسخ المتماثل. في تنظيم تكرار الحمض النووي بدائية النواة يركز على ارتباط البروتين البادئ DnaA بالحمض النووي ، مع بدء النسخ المتماثل عدة مرات خلال دورة خلية واحدة. [85] يستخدم كل من الحمض النووي بدائية النواة وحقيقية النواة ارتباط ATP والتحلل المائي لتوجيه تحميل الهلياز وفي كلتا الحالتين يتم تحميل الهليكس في الشكل غير النشط. ومع ذلك ، فإن الهليكازات حقيقية النواة هي عبارة عن سداسيات مزدوجة يتم تحميلها على الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل في حين أن الهليكازات بدائية النواة عبارة عن سداسيات مفردة يتم تحميلها على الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل. [146]

فصل الكروموسومات هو اختلاف آخر بين الخلايا بدائية النواة والخلايا حقيقية النواة. غالبًا ما تبدأ الخلايا سريعة الانقسام ، مثل البكتيريا ، في فصل الكروموسومات التي لا تزال في طور التكاثر. في الخلايا حقيقية النواة ، لا يبدأ الفصل الصبغي في الخلايا الوليدة حتى يكتمل التكرار في جميع الكروموسومات. [85] على الرغم من هذه الاختلافات ، إلا أن عملية التكاثر الأساسية متشابهة لكل من الحمض النووي بدائية النواة وحقيقية النواة.


خطوط الخلايا والثقافة ، بما في ذلك التحضير لفرز الخلايا المنشطة الفلورية واستخراج الحمض النووي الجيني

الليشمانيا الكبرى سلالة فريدلين و الليشمانية المكسيكية نمت سلالة U1103 خلايا بروماستيجوت في وسط إيجل المعدل (وسط HOMEM المعين ، GE Healthcare) مكمل بمصل العجل الجنيني بنسبة 10 ٪ (Gibco ، تقنيات الحياة) ، وتستخدم للتجارب بتركيز 5 × 10 6 خلايا / مل. لكل خط خلية ، تم جمع ما يقرب من 1 × 10 9 خلايا بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 جم ، وغسلها في 1 × محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS pH 7.2) مع 5 ملي مولار EDTA (Gibco ، تقنيات الحياة) ، ثم تم إصلاحها بتركيز 2.5 × 10 7 خلايا / مل (بأسلوب قطرة الحكمة ، أثناء التدوير بلطف) في 70٪ ميثانول في 1 × PBS مكمل بـ 5 مم EDTA. تم بعد ذلك تخزين الخلايا عند 4 درجات مئوية (من بين عشية وضحاها حتى ثلاثة أسابيع) ، محمية من الضوء. لكل جلسة فرز ، تم جمع 3 × 10 8 خلايا ثابتة بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1000 جم ، عند 4 درجات مئوية ، وغسلها مرة واحدة في 1 × برنامج تلفزيوني مكمل بـ 5 ملي مولار EDTA ، مع إعادة تعليقها حتى تركيز 2.5 × 10 7 خلايا / مل في 1 × PBS تستكمل بـ 5 ملي EDTA ، 10 ميكروغرام / مل من يوديد البروبيديوم (Sigma Aldrich) و 10 ميكروغرام / مل من RNase A (Sigma Aldrich) ، وحضنت لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، محمية من الضوء . تم بعد ذلك نقل الخلايا من خلال غطاء مصفاة خلية شبكية من النايلون 35 ميكرون إلى أنبوب BD Falcon ™ (BD Biosciences) ، وفرزها في مراحل G1 و S و S و G2 المبكرة عن طريق فرز الخلايا الفلورية المنشط (FACS) باستخدام FACSAria I ™ فارز الخلايا (BD Biosciences). تم جمع الخلايا التي تم فرزها عند 4 درجات مئوية في محلول تحلل (1 مولار كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار EDTA ، 50 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك pH 8.0 ، 0.5 ٪ SDS ، 0.4 مجم / مل بروتيناز K ، و 0.8 ميكروغرام / مل من الجليكوجين أزوارا 2006) ، حضنت لمدة ساعتين عند 55 درجة مئوية ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية. تم استخراج الحمض النووي الجينومي (gDNA) باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي للدم والأنسجة (Qiagen) ، عن طريق حذف خطوات التحلل من بروتوكول الشركة المصنعة. لكل من التسلسل والوقت الحقيقي PCR الكمي (qPCR) ، تم قياس تركيزات gDNA باستخدام Qubit® 2.0 Fluorometer (تقنيات الحياة).

إعداد مكتبة الحمض النووي ، والتسلسل ، وتحليل تردد الواسمات

تم تحضير مكتبات الحمض النووي باستخدام مجموعة Nextera® XT DNA Sample Preparation kit (Illumina) ، ثم تم ترتيبها باستخدام نظام تسلسل Illumina MiSeq المقترن 250-bp (Illumina). تم تعدد إرسال العينات ، مع كل من العينات المبكرة S و S و G1 و G2 لكل نوع / سلالة متسلسلة في نفس المسار لإزالة الاختلافات الناتجة عن تأثيرات الدُفعة. تم تحليل البيانات الناتجة لمراقبة الجودة باستخدام FastQC [41] ، ثم تم قصها باستخدام fastq-mcf (أدوات الجهاز [42]) لاستبعاد تسلسل المحول. تمت محاذاة القراءات بعد ذلك مع الجينومات المرجعية المعنية (TriTrypDB الإصدار 6.0) باستخدام Bowtie2 (الإصدار 2.2.0 - شديد الحساسية - محلي - k1) [43]. ثم تمت مقارنة القراءات المتوافقة باستخدام الطريقة الموصوفة سابقًا بشكل أساسي [9] ، ولكن تم تبسيطها لتسهيل المقارنات بين الأنواع: تم وضع القراءات في أقسام 2.5 كيلوبايت على طول كل كروموسوم ، وعدد القراءات في كل حاوية ثم تم استخدامها لحساب النسب بين عينات S في وقت مبكر مقابل G2 / G1 وأواخر S مقابل عينات G2 ، تم قياسها للحجم الإجمالي لمكتبة القراءة (عدد القراءات لكل 2.5 كيلو بايت لكل مليون قراءة معيَّنة). ثم تم تمثيل هذه البيانات في شكل رسومي باستخدام ggplot2 وحزمة R (الإصدار 3.0.2 [44]). سكربتات شل المستخدمة لتوليد هذه البيانات متاحة من [45].

تحليل تردد العلامة بواسطة qPCR

تم استخدام إستراتيجية تم استخدامها سابقًا [9] ، وتم التخطيط للمقايسات وفقًا لإرشادات MIQE [46]. تم تصميم الاشعال لعدة مناطق عبر L. الكبرى الكروموسومات 8 و 20 و 29 و 36 وكذلك L. مكسيكانا الكروموسومات 8 و 20 ، باستخدام Primer Express الإصدار 3.0 (BioRad) ، ووفقًا للإرشادات المقترحة [47] لاستخدام البادئات في qPCR. تراوحت أحجام البرايمر من 17 إلى 24 زوجًا قاعديًا ، مع درجات حرارة انصهار من 58-60 درجة مئوية ، مما ينتج عنه أمبليكونات تتراوح من 55 إلى 113 نقطة أساس مع درجات حرارة انصهار من 79 إلى 85 درجة مئوية. تم تقييم كفاءة وخصوصية التمهيدي لجميع أزواج البادئات من خلال تحليل منحنيات المعايرة وملامح الانصهار ، على التوالي ، مما أدى إلى كفاءة بنسبة 100٪ تقريبًا ، كل ذلك خلال فترة 10٪. للتطبيع ، فإن L. الكبرى الجين LmjF.36.1980 (ما يعادل LmxM.36.1980 بوصة L. مكسيكانا) باعتباره الجين المرجعي ، نظرًا لأن بيانات MFAseq تشير إلى أنه في منطقة غير أصل لم يتم تكرارها بعد في المرحلة S. لكل زوج من البادئات ، تم تشغيل ثلاث نسخ من كل عينة (مراحل S و S و G2 المبكرة) لكل لوحة (MicroAmp® Optical 96-well Reaction Plate ، Life Technologies) ، والتي تم إغلاقها بغشاء لاصق شفاف MicroAmp® (تقنيات الحياة ). تم استخدام SYBR Select Master Mix (تقنيات الحياة) ، مع 400 نانومتر من البادئات (Eurofins MWG Operon ، Ebersberg ، ألمانيا) و 0.01 نانوغرام من عينة gDNA ، بإجمالي 20 ميكرولتر لكل تفاعل. تم إجراء جميع التجارب في نظام 7500 Real Time PCR (النظم البيولوجية التطبيقية) ، باستخدام ظروف ركوب PCR التالية: 50 درجة مئوية لمدة دقيقتين و 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 40 دورة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 59 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. تم جمع بيانات شدة التألق في نهاية خطوة التمديد (72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة) ، وبعد ذلك تم تضمين خطوة التفكك النهائية لتأكيد خصوصية التفاعل. ثم تم تحليل بيانات شدة التألق الناتجة عن طريق القياس الكمي النسبي باستخدام Cر الطريقة [48] (7500 إصدار برنامج 2.3 ، النظم الحيوية التطبيقية) ، مع استخدام عينة المرحلة G2 كمعاير. تم إنشاء الرسوم البيانية باستخدام GraphPad Prism الإصدار 5.03. البادئات (الجدول 1) تستهدف مناطق الجينات التالية (معرف الجين كما هو معروض في TritrypDB [49]) في L. الكبرى (LmjF) و L. مكسيكانا تم استخدام (LmxM): LmjF.29.0810 ، LmjF.29.0930 ، LmjF.29.0030 ، LmjF.29.2060 ، LmjF.08.0090 ، LmjF.08.1000 ، LmjF.08.0260 ، LmjF.08.0360 ، LmjF.36.1900 ، LmjFm8.36.3 LmjF.36.3000، LmjF.20.0705، LmjF.20.1210، LmjF.20.1530 LmxM.08_29.0810، LmxM.08_29.0930، LmxM.08_29.0030، LmxM.08_29.2060، LmxM.08.0090، LmxM.08.1000، LmxM.08.0090، LmxM.08.1000، و LmxM.08.0360 و LmxM.36.1900 و LmxM.36.3790 و LmxM.36.2830 و LmxM.36.3000 و LmxM.20.0705 و LmxM.20.1210 و LmxM.20.1530.

تحليل حجم SSR

تم تحديد SSRs التي تحتوي على الأصول ، وعرضها على "متصفح الجينوم" باستخدام منصة قاعدة البيانات TriTrypDB الإصدار 8.0 [49]. تم قياس المسافة بين الجينين الأقرب إلى SSR (متباعد ، متقارب أو وجهاً إلى ذيل) عن طريق طرح إحداثيات إيقاف أو بدء كودون الجين على يسار SSR من إحداثيات التوقف أو ابدأ كودون الجين على اليمين. تم تنفيذ الشيء نفسه بالنسبة إلى SSRs الأخرى ، حيث لم يتم تحديد الأصول. تم بعد ذلك رسم حجم المسافة بين الجينات في SSRs على مخطط مبعثر رأسي باستخدام GraphPad Prism الإصدار 5.03. تم الاستدلال على الدلالة الإحصائية من خلال استخدام اختبار مان-ويتني غير حدودي ، وحيد الذيل ، مع ص عتبة القيمة & lt0.05.

الدخول الى البيانات

يتم استضافة بيانات MFAseq في TriTryDB [49] ومن المقرر إطلاقها حاليًا في خريف 2015. تم إيداع بيانات التسلسل في أرشيف النيوكليوتيدات الأوروبي [50] ، رقم الانضمام [ENA: PRJEB7849]).


خطوات تكرار الحمض النووي: (بدائيات النوى)

  • إذا قارنا الحمض النووي بسلسلة ، فإن الخطوة الأولى هي فك أو فك ضغط السلسلة الحلزونية.
  • يتم تنفيذ العملية بواسطة إنزيم يسمى Helicase (تستخدم هيليكاز ATP لفك ضغط الحمض النووي).
  • عندما يتم استرخاء الحمض النووي الحلزوني المزدوج ، يجب على اللولب أن يدور ، فإنه يخلق إجهادًا طوبولوجيًا عند نقطة لتحرير هذا الضغط ، يوجد إنزيم رئيسي يسمى توبويزوميراز يساعد على التخلص من التوتر.
  • يؤدي فصل اللولب إلى إنشاء ملف "نعم" هيكل هوبي المعروف باسم شوكة النسخ المتماثل.
  • ستعمل كلتا الخيوط غير المضغوطة كقالب لخيوط الحمض النووي الجديدة.
  • بمجرد سحب كلتا الخيوط ، يجب أن يكونا قد منعوا من العودة معًا. إذن ، هناك إنزيم اسمه SSB (بروتينات ربط مفردة مجدولة) التي تساعد الحمض النووي أحادي السلسلة من الالتفاف مرة أخرى وتشكيل DNA مزدوج الشريطة مرة أخرى.
  • يُعرف الخيط الموجه نحو 3`-5` باسم الساحل الرئيسي.
  • يبدأ تخليق الحمض النووي باسم إنزيم بوليميريز الحمض النووي. بوليميريز الحمض النووي غير قادر على تخليق الحمض النووي بمفرده ، لذلك يحتاج إلى 3'OH ويبدأ في إضافة نيوكليوتيدات الحمض النووي.
  • يتم ربط فوسفات 5 بوصة في كل نوكليوتيد قادم بواسطة بوليميريز الحمض النووي في نهاية 3'OH من السلسلة الصاعدة.
  • يتم إنتاج مواد التمهيدي (قطعة قصيرة من الحمض النووي الريبي) بواسطة إنزيم يسمى PRIMASE يرتبط بنهاية الشريط الرئيسي.
  • الشريط الآخر في الاتجاه 5'-3 "المعروف باسم أ حبلا متخلفة ( نماذج شظايا أوكازاكي).
  • يتطلب تخليق الخيط المتخلف عدة مواد أولية من الحمض النووي الريبي. ترتبط النيوكليوتيدات بعدة قطع قصيرة متصلة فيما بعد ، وتُعرف هذه الأجزاء القصيرة من النيوكليوتيدات شظايا OKAZAKI.

  • بمجرد الانتهاء من عملية إضافة النوكليوتيد ، يقوم إنزيم يسمى نوكلياز خارجي بشرائط التمهيدي.
  • Et the end DNA Ligase يختم التسلسلات ويشكل مرة أخرى دنا مزدوج الشريطة.
  • يوجد في بدائيات النوى 3 أنواع من بوليميراز الحمض النووي:
  1. بوليميريز الحمض النووي أنا
  2. بوليميريز DNA II
  3. بوليميريز الحمض النووي الثالث

تعبير البروتين في بدائيات النوى



1.) RNA - البوليميراز يعلق على المروج. المحفز هو منطقة على الحمض النووي ، والتي تقع في المنبع ، بالقرب من جانب بدء النسخ.

2.) بدأ النسخ.

3.) يبدأ RNA-Polymerase في تصنيع الرنا المرسال من اتجاه 5 إلى 3.

4.) يواصل RNA-Polymerase تخليق mRNA. (ملاحظة: على عكس ما هو الحال في mRNA حقيقية النواة ، فإن mRNA بدائية النواة لا يتلقى غطاء 5 بوصات)

5.) منطقة إنهاء رموز DNA تسلسل متناوب. يؤدي هذا التسلسل إلى تكوين الرنا المرسال لتشكيل بنية دبوس الشعر ذات الحلقة الجذعية. يؤدي هيكل دبوس الشعر هذا إلى تفكك الحمض النووي الريبي-بوليميراز من الحمض النووي.

6.) تم الانتهاء من النسخ ، وأصبح mRNA جاهزًا للترجمة. يمكن أن يحتوي mRNA المترجم على أكثر من جين واحد ، والذي يشفر البروتين. وبالتالي يمكن ترميز أكثر من بروتين واحد على mRNA واحد. ملاحظة: لا تحتوي الخلايا بدائية النواة على نواة. على عكس الخلايا حقيقية النواة ، لا يحتاج الرنا المرسال إلى التعديل عن طريق التضفير. وبالتالي ، فإن الرنا المرسال في الخلايا بدائية النواة جاهز للترجمة مباشرة بعد النسخ.

7.) يتم تجميع وحدات الريبوسوم 50S و 30S معًا لتشكيل مجمع الريبوسوم بأكمله (70S).

8.) بمجرد تجميع الريبوسوم ، تبدأ ترجمة الرنا المرسال من كودون البداية (AUG) على الرنا المرسال. تدخل الحمض الريبي النووي النقال المشحون بالأحماض الأمينية الريبوسومات ، حيث يتم نقل حمضها الأميني إلى سلسلة الببتيد المتنامية. بمجرد أن يتبرع الحمض النووي الريبي بالأحماض الأمينية ، فإنه يخرج من الريبوسوم. ملاحظة: يتم بناء سلسلة البولي ببتيد من الطرف N (–NH3 +) إلى الطرف C (–COO -).

قم بتنزيل ملخص نسخ الحمض النووي وترجمته في بدائيات النوى بتنسيق pdf. إضغط هنا للتحميل.


تكرار الحمض النووي في حقيقيات النوى

تعتبر جينومات حقيقيات النوى أكثر تعقيدًا وأكبر حجمًا من جينومات بدائية النواة. تحتوي حقيقيات النوى أيضًا على عدد من الكروموسومات الخطية المختلفة. يحتوي الجينوم البشري على 3 مليارات زوج قاعدي لكل مجموعة أحادية الصبغيات من الكروموسومات ، ويتم تكرار 6 مليارات زوج قاعدي خلال المرحلة S من دورة الخلية. هناك أصول متعددة للتكاثر على كل كروموسوم حقيقي النواة يمكن أن يكون لدى البشر ما يصل إلى 100000 أصل من النسخ المتماثل عبر الجينوم. معدل النسخ المتماثل حوالي 100 نيوكليوتيد في الثانية ، أبطأ بكثير من تكرار بدائيات النواة. في الخميرة ، وهي حقيقيات النوى ، توجد متواليات خاصة تُعرف باسم تسلسل النسخ الذاتي (ARS) على الكروموسومات. هذه مكافئة لأصل النسخ المتماثل في بكتريا قولونية.

عدد بوليميرات الحمض النووي في حقيقيات النوى أكبر بكثير مما هو عليه في بدائيات النوى: 14 معروفة ، منها خمسة معروفة بأدوار رئيسية أثناء التكاثر وقد تمت دراستها جيدًا. هم معروفون باسم بول α، بول β، بول γ، بول δو بول ε.

الخطوات الأساسية للنسخ هي نفسها كما في بدائيات النوى. قبل أن يبدأ النسخ المتماثل ، يجب توفير الحمض النووي كقالب. يرتبط الحمض النووي حقيقيات النوى بالبروتينات الأساسية المعروفة باسم الهيستونات لتكوين هياكل تسمى النيوكليوسومات. يجب إزالة الهستونات ثم استبدالها أثناء عملية النسخ المتماثل ، مما يساعد على حساب معدل النسخ المنخفض في حقيقيات النوى. قد يخضع الكروماتين (المركب بين الحمض النووي والبروتينات) لبعض التعديلات الكيميائية ، بحيث يمكن للحمض النووي أن ينزلق عن البروتينات أو يكون في متناول إنزيمات آلية تكرار الحمض النووي. في أصل النسخ المتماثل ، يتكون معقد ما قبل النسخ المتماثل ببروتينات بادئ أخرى. يتم بعد ذلك تجنيد Helicase والبروتينات الأخرى لبدء عملية النسخ المتماثل (الجدول).

الفرق بين النسخ المتماثل بدائية النواة وحقيقية النواة
ملكيةبدائيات النوىحقيقيات النواة
أصل النسخ المتماثلغير مرتبطةعديد
معدل التكرار1000 نيوكليوتيدات / ثانيةمن 50 إلى 100 نيوكليوتيدات / ثانية
أنواع بوليميراز الحمض النووي514
تيلوميرازغير موجودالحالي
إزالة RNA التمهيديبول أناRNase H.
استطالة حبلاDNA pol IIIبول α ، بول δ ، بول
انزلاق المشبكانزلاق المشبكPCNA

إن الهليكاز الذي يستخدم الطاقة من التحلل المائي ATP يفتح الحلزون DNA. تتشكل شوكات النسخ المتماثل في كل أصل نسخ متماثل مع فك الحمض النووي. يؤدي فتح اللولب المزدوج إلى الالتفاف المفرط ، أو الالتفاف الفائق ، في الحمض النووي قبل شوكة النسخ المتماثل. يتم حلها من خلال عمل الإيزوميراز العلوي. يتم تشكيل الاشعال بواسطة إنزيم بريماز ، وباستخدام التمهيدي ، يمكن لـ DNA pol بدء التوليف. ثم يتم تضمين ثلاثة أنواع رئيسية من بلمرة الحمض النووي: α و و ε. يضيف DNA pol α جزءًا قصيرًا (20 إلى 30 نيوكليوتيد) من الحمض النووي الريبي التمهيدي على كلا الخيطين ، ثم يسلم إلى بوليميراز ثانٍ. بينما يتم تصنيع الخيط الرئيسي بشكل مستمر بواسطة قطب الإنزيم δ، يتم تصنيع الخيط المتأخر بواسطة pol ε. إن بروتين مشبك منزلق يعرف باسم PCNA (مستضد نووي خلوي متكاثر) يحمل بولي DNA في مكانه بحيث لا ينزلق من الحمض النووي. عندما تتدفق pol إلى RNA التمهيدي على الخيط المتأخر ، فإنها تزيحه من قالب الحمض النووي. يتم بعد ذلك إزالة RNA التمهيدي بواسطة RNase H (نوكلياز رفرف AKA) واستبداله بنكليوتيدات DNA. يتم ربط شظايا أوكازاكي في الخيط المتأخر بعد استبدال البادئات RNA بالحمض النووي. يتم سد الفجوات المتبقية بواسطة DNA ligase ، الذي يشكل رابطة phosphodiester.


التيلوميراز والشيخوخة

تستمر الخلايا التي تخضع للانقسام الخلوي في تقصير التيلوميرات الخاصة بها لأن معظم الخلايا الجسدية لا تصنع التيلوميراز. هذا يعني بشكل أساسي أن تقصير التيلومير مرتبط بالشيخوخة. مع ظهور الطب الحديث والرعاية الصحية الوقائية وأنماط الحياة الصحية ، زاد العمر الافتراضي للإنسان ، وهناك طلب متزايد على الناس ليبدو أصغر سناً وأن يتمتعوا بنوعية حياة أفضل مع تقدمهم في السن.

في عام 2010 ، وجد العلماء أن الإنزيم تيلوميراز يمكنه عكس بعض الحالات المرتبطة بالعمر في الفئران. قد يكون لهذا إمكانات في الطب التجديدي. Jaskelioff et al. ، "إعادة تنشيط التيلوميراز يعكس تنكس الأنسجة في الفئران المسنة التي تعاني من نقص التيلوميراز ،" طبيعة سجية 469 (2011): 102-7. تم استخدام الفئران التي تعاني من نقص التيلوميراز في هذه الدراسات ، حيث تعاني هذه الفئران من ضمور الأنسجة ، ونضوب الخلايا الجذعية ، وفشل الجهاز العضوي ، وضعف الاستجابة لإصابة الأنسجة. تسبب إعادة تنشيط التيلوميراز في هذه الفئران في تمدد التيلوميرات ، وتقليل تلف الحمض النووي ، وتنكس عصبي معكوس ، وتحسين وظيفة الخصيتين والطحال والأمعاء. وبالتالي ، قد يكون لإعادة تنشيط التيلومير إمكانية علاج الأمراض المرتبطة بالشيخوخة لدى البشر.

يتميز السرطان بانقسام الخلايا غير المنضبط للخلايا غير الطبيعية. تتراكم الخلايا الطفرات وتتكاثر بشكل لا يمكن السيطرة عليه ويمكن أن تهاجر إلى أجزاء مختلفة من الجسم من خلال عملية تسمى ورم خبيث. لاحظ العلماء أن الخلايا السرطانية لديها تقصير كبير في التيلوميرات وأن الإنزيم تيلوميراز نشط في هذه الخلايا. ومن المثير للاهتمام ، أنه فقط بعد تقصير التيلوميرات في الخلايا السرطانية ، أصبح الإنزيم تيلوميراز نشطًا. إذا كان من الممكن إعاقة عمل التيلوميراز في هذه الخلايا عن طريق الأدوية أثناء علاج السرطان ، فمن المحتمل أن يتم إيقاف الخلايا السرطانية من الانقسام الإضافي.


شاهد الفيديو: تكنولوجيا الحمض النووي DNA (كانون الثاني 2022).