معلومة

تثبيط Doxorubicin interalant و topoisomerase في ابيضاض الدم؟


أفكر في دور مسارات دوكسوروبيسين في السرطانات مثل اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية:

  • مثبط توبويزوميراز ويمنع نشاط الحمض النووي
  • interalant - قواعد الحمض النووي المتداخلة وتمنع نشاط الحمض النووي

أنا مهتم بأي من هذه الآليات هي الأكثر صلة بسرطان الدم والأورام اللمفاوية.

كيف يعمل دوكسوروبيسين في اللوكيميا والأورام اللمفاوية؟


دوكسوروبيسين هو جزء من أدوية العلاج الكيميائي. يستهدف معظمهم تكاثر الخلايا ، على سبيل المثال عن طريق منع انقسام الخلايا أو تكرار الحمض النووي.

تعتبر المواد المتداخلة ومثبطات توبويزوميراز قوية في التدخل في تكرار الحمض النووي (لا نشاط الحمض النووي). قد تمنع الأدوية الكيماوية الأخرى التشغيل السليم لآلات تقسيم الخلايا ، مثل التدخل في وظائف الهيكل الخلوي.


ليس لدي إجابة كاملة ، لكن الروابط أدناه قد تكون مفيدة.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2748742/

تقول المقالة أعلاه أن إيتوبوسيد ، وهو مثبط ثاني أعلى وفعال ضد السرطان ، ليس قاطعًا.

http://www.ingentaconnect.com/content/ben/cpd/2001/00000007/00000017/art00004؟crawler=true

ستجد الوصف أدناه في المقالة. أنا فقط اقتبس وصفهم هنا.

"كما هو الحال مع العديد من الأدوية الأخرى التي تعمل على تقاطع الحمض النووي ، يُعتقد أن انقسام الحمض النووي المعتمد على توبويزوميراز II هو الحدث الحاسم المسؤول عن النشاط المضاد للسرطان ، [101] في حين أن انقسام الحمض النووي بوساطة الجذور الحرة ربما يكون أكثر ارتباطًا بالآثار الجانبية السامة للقلب [118]. "

http://www.degruyter.com/view/j/aiht.2013.64.issue-4/10004-1254-64-2013-2371/10004-1254-64-2013-2371.xml

تم تصميم المادة الكيميائية MLN944 (XR5944) الموصوفة في الرابط أعلاه كمثبط Topo ، لكن التأثيرات المثبطة للتوبو كانت أقل بغض النظر عن النشاط المضاد للورم.

هناك نوع آخر من الأدوية المضادة للسرطان التي تتداخل في الحمض النووي: سيسبلاتين. يؤدي تفاعل الحمض النووي مع سيسبلاتين إلى تكوين مقاربات الحمض النووي. لذلك ، قد يكون من الصعب تفسير التأثيرات المضادة للسرطان من خلال الإقحام فقط. لمرجع سيسبلاتين: http://en.wikipedia.org/wiki/Cisplatin


Doxorubicin و etoposide كلاهما مثبطات DNA topoisomerase II.

عندما تتكاثر الكروموسومات عندما تنقسم الخلية ، ينتج عن الطبيعة الحلزونية للحمض النووي DNA تشابك جزيئات الابنة (متسلسلة). توبو 2 هو إنزيم مذهل. إنه يرتبط بالحمض النووي ، ويقطع فجوة في كلا الخيطين ، ثم يمرر جزيء دنا آخر عبر الفجوة. وبالتالي فإنه يفك تشابك الحمض النووي.

إذا قمت بتثبيط Topo II ، فسيحدث شيئان. أولاً ، يحدث التثبيط عادةً بعد قطع جزيء الحمض النووي الأول. وبالتالي فإن تثبيط Topo II يسبب تلفًا شديدًا في الحمض النووي مزدوج الشريطة ، والذي يصعب على الخلية السرطانية إصلاحه ، ويموت. ثانيًا ، يوقف التشابك المادي المتبقي الفصل النظيف للكروموسومات أثناء الانقسام. اعتمادًا على مثبط Topo II قيد الاستخدام ، يمكن أن يؤدي ذلك إلى تشغيل نقطة تفتيش لدورة الخلية والتي توقف الخلية عن تقسيم Downes وآخرون، 1994 ، أو يمكن أن يتسبب في تمزيق الخلية للكروموسومات إلى أجزاء بينما تحاول فصلها على أي حال. عملت في نفس معمل داونز وآخرون، أعلاه ، وقمنا بهذه التجربة مع العديد من مثبطات Topo II ، بما في ذلك etoposide و doxorubicin. إنه أمر مذهل للغاية.


مثبط توبويزوميراز

مثبطات توبويزوميراز هي مركبات كيميائية تمنع عمل الإيزوميراز العلوي ، والتي تنقسم إلى نوعين فرعيين واسعين: النوع الأول من الإيزوميراز العلوي (TopI) والنوع الثاني (TopII). [1] [2] [3] يلعب Topoisomerase أدوارًا مهمة في التكاثر الخلوي وتنظيم الحمض النووي ، حيث يتوسطان في انقسام الحمض النووي المفرد والمزدوج لتهدئة اللفائف الفائقة ، وفك تشابك الكاتينينات ، وتكثيف الكروموسومات في الخلايا حقيقية النواة. [1] [2] [3] تؤثر مثبطات توبويزوميراز على هذه العمليات الخلوية الأساسية. تمنع بعض مثبطات توبويزوميراز التوبويزوميراز من إجراء فواصل حبلا DNA بينما البعض الآخر ، الذي يعتبر سموم توبويزوميراز ، يرتبط بمجمعات توبويزوميراز- DNA ويمنع خطوة إعادة ربط آلية توبويزوميراز. [3] هذه المجمعات مثبطات توبويزوميراز- DNA هي عوامل سامة للخلايا ، حيث يمكن أن تؤدي تكسير الحمض النووي المفردة والمزدوجة التي لم يتم إصلاحها والتي تسببها إلى موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا. [2] [3] بسبب هذه القدرة على إحداث موت الخلايا المبرمج ، اكتسبت مثبطات توبويزوميراز اهتمامًا كعلاجات ضد الخلايا المعدية والسرطانية.


الملخص

السرطان هو السبب الرئيسي الثاني للوفيات بعد أمراض القلب والأوعية الدموية ، وهو مرض متعدد العوامل غير متجانس ومشكلة صحية عامة متنامية في جميع أنحاء العالم. بسبب الآثار الضارة الشديدة للعلاجات المتاحة حاليًا ، هناك اهتمام متزايد بالمركبات الطبيعية الموجودة في نظامنا الغذائي اليومي. من بين المنتجات الطبيعية المختلفة ، جذبت مركبات الفلافونويد - بوليفينول الكثير من الاهتمام وتم توثيقها جيدًا لأنشطتها البيولوجية. قد تمنع بعض مركبات الفلافونويد تكاثر الخلايا السرطانية عن طريق تعديل عمل الإنزيمات المختلفة ومسارات نقل الإشارة. في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم تأثير pinostrobin ، وهو فلافونويد طبيعي ، على النشاط التحفيزي لـ topoisomerase I ، وهو إنزيم أساسي لتكرار الحمض النووي الطبيعي. قد يؤدي التثبيط التحفيزي لنشاط توبويزوميراز 1 إلى إعاقة تكرار الحمض النووي للخلايا السرطانية سريعة الانقسام وبالتالي يمنع تقدم الورم. تم تقييم تفاعل Pinostrobin مع topoisomerase I و DNA في السيليكو أشار إليها لتشكيل معقد ثلاثي مع كليهما. في السيليكو اقترحت البيانات أيضًا أن يكون البينوستروبين مثبطًا فعالاً للتباين في التوبويزوميراز 1. في المختبر استقصاءات مثل مقايسة إزاحة بروميد الإيثيديوم ودعم الدراسات الطيفية في السيليكو نتائج على ارتباط بينوستروبين في واجهة توبويزوميراز I و DNA. قام Pinostrobin بتثبيط نشاط Topoisomerase I بشكل فعال في المختبر مما يؤكد لنا في السيليكو و في المختبر الموجودات. نظرًا لأن Topoisomerase I ضروري لتكرار الحمض النووي ، فإن تثبيط نشاطه بواسطة البينوستروبين يسلط الضوء على الإمكانات العلاجية للبينوستروبين كعامل مضاد للتكاثر.


Bjornsti M-A و Benedetti P و Viglianti GA و Wang JC (1989) التعبير عن DNA topoisomerase I البشري في خلايا الخميرة التي تفتقر إلى الخميرة DNA topoisomerase I: استعادة حساسية الخلايا للدواء المضاد للأورام camptothecin. دقة السرطان 49: 6318

Castora FJ ، Kelly WG (1986) يمنع ATP النوع الأول من الأيزوميراز النووي والميتوكوندريا من خلايا سرطان الدم البشرية. Proc Natl Acad Sci USA 83: 1680

كول SPC ، Chanda ER ، Dicke FP ، Gerlach JH ، Mirski SE (1991) المقاومة المتعددة للأدوية غير P-glycoprotein في خط خلايا سرطان الرئة صغير الخلايا: دليل على انخفاض القابلية للتلف الذي يسببه الدواء للحمض النووي وانخفاض مستويات توبويزوميراز الثاني. دقة السرطان 51: 3345

Davis LG، Dibner MD، Battey JF (1986) تحضير DNA البلازميد: طريقة triton-lysozyme: الطرق الأساسية في البيولوجيا الجزيئية. إلسفير ، أمستردام ، ص 93

Deffie AM ، Batra JK ، Goldenberg GJ (1989) الارتباط المباشر بين نشاط DNA topoisomerase II والسمية الخلوية في خطوط خلايا سرطان الدم P388 الحساسة والمقاومة للأدرياميس. الدقة السرطان 49:58

Fairfield FR ، Bauer WR ، Simpson MV (1979) تحتوي الميتوكوندريا على DNA topoisomerase متميز. J بيول كيم 254: 9352

Foglesong PD، Bauer WR (1984) تأثيرات ATP والعوامل المثبطة على نشاط فيروس اللقاح من النوع الأول topoisomerase. J فيرول 49: 1

Gupta RS، Gupta R، Eng B، Lock RB، Ross WE، Hertzberg RP، Caranfa MJ، Johnson RK (1988) طفرات مقاومة للكامبتوثيسين لخلايا مبيض الهامستر الصيني التي تحتوي على شكل مقاوم من topoisomerase I. السرطان 48: 6404

Horio M ، Gottesman MM ، Pastan I (1988) النقل المعتمد على ATP لـ vinblastine في الحويصلات من الخلايا البشرية المقاومة للأدوية المتعددة. Proc Natl Acad Sci USA 85: 3580

Hsiang Y-H، Hertzberg R، Hecht S، Liu LF (1985) يستحث Camptothecin فواصل الحمض النووي المرتبط بالبروتين عبر DNA topoisomerase للثدييات I J Biol Chem 260: 14873

Jong S de، Zijlstra JG، Vries EGE de، Mulder NH (1990) انخفاض نشاط DNA topoisomerase II ونشاط انشقاق الحمض النووي الناجم عن الأدوية في خط خلايا سرطان الرئة ذات الخلايا الصغيرة البشرية المقاومة للأدرياميسين. دقة السرطان 50: 304

سموم Liu LF (1989) DNA topoisomerases كأدوية مضادة للأورام. Annu Rev Biochem 58: 351

Maxwell A ، Gellert M (1986) الجوانب الميكانيكية لأيزوميراز الحمض النووي. في: Anfinsen CB، Epsall JT، Richards FM (eds) Advances inprotein chemistry، vol 38. Academic Press، San Diego، p69

Pommier Y، Kerrigan D، Schwartz RE، Swack JA، McCurdy A (1986) تغيير نشاط DNA topoisomerase II في خلايا الهامستر الصينية المقاومة لمثبطات توبويزوميراز II. الدقة السرطان 46: 3075

Shaffer R، Traktman P (1987) يغلف فيروس اللقاح التوبويزوميراز الجديد بخصائص إنزيم حقيقي النواة من النوع الأول. ي بيول كيم 262: 9309

Sugimoto Y، Tsukahara S، Oh-Hara T، Isoe T، Tsuruo T (1990) انخفاض التعبير عن DNA topoisomerase I في خطوط الخلايا السرطانية المقاومة للكامبتوثيسين كما هو محدد بواسطة الجسم المضاد أحادي النسيلة. دقة السرطان 50: 6925

Tewey KM ، Rowe TC ، Yang L ، Halligan BD ، Liu LF (1984) تلف الحمض النووي الناجم عن Adriamycin بوساطة الحمض النووي للثدييات topoisomerase II. Science 226: 466

فوسبيرج إتش بي (1986) إيزوميراز الحمض النووي: الإنزيمات التي تتحكم في تكوين الحمض النووي: في: Cooper M، Eisen H، Goebel W، Hofschneider PH، Koprowski H، Melchers F، Oldstone M، Rott R، Schweiger HG، Vogt PK، Wilson I (eds ) Currenttopics in microbiology and immunology، vol 114. Springer، Berlin Heidelberg New York، p 19

وانج جي سي (1985) DNA topoisomerases. Annu Rev Biochem 54: 665

Wasserman K، Markovits J، Jaxel C، Capranico G، Kohn K، Pommier Y (1990) تأثيرات مورفولينيل دوكسوروبيسين ، دوكسوروبيسين ، وأكتينوميسين د على الحمض النووي للثدييات توبويزوميراز الأول والثاني. مول فارماكول 38:38

Zwelling LA ، Michaels S ، Erikson LC ، Ungerleider RS ​​، Nichols M ، Kohn KW (1981) تكسر حبلا حمض الديوكسي ريبونوكلييك المرتبط بالبروتين في خلايا L1210 المعالجة بعوامل تقاطع الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين 4 ′ - (9-acridinylamino) ميثان سلفون-م- أنيسيديد وأدرياميسين. الكيمياء الحيوية 20:6553


يحث مثبط كالموديولين trifluoperazine بالاشتراك مع دوكسوروبيسين على اختيار الخلايا السرطانية مع النمط الظاهري المقاوم للأدوية المتعددة.

Trifluoperazine (TFP) فعال في تعديل تلف / إصلاح الحمض النووي في الخلايا المعالجة بالدوكسوروبيسين (DOX). في هذه الدراسة ، قمنا بتمييز النمط الظاهري للمقاومة لخلايا سرطان الدم L1210 الفأرية الحساسة للوالدين (L1210 / S) التي تكيفت لتنمو في وجود 0.017 ميكرون DOX + 5 microM TFP (L1210 / DT). على الرغم من التعرض لفترات طويلة ، أنتج 0.017 microM DOX بمفرده & # x0003c 35 ٪ قتل الخلايا في خلايا L1210 / S ، تم تحقيق سمية خلوية مماثلة عند 0.43 ميكرو مولار DOX في خلايا L1210 / S المختارة في وجود 0.017 ميكرو متر DOX + 5 ميكرو متر TFP. كانت خلايا L1210 / DT & # x0003e 30 ضعفًا مقاومة لـ DOX بعد التعرض للدواء لمدة 3 ساعات في اختبار مستعمرة أجار ناعمة. في المقابل ، كانت حساسية DOX في الخلايا التي تم تكييفها لتنمو في 5 ميكرو إم TFP وحدها مماثلة لخلايا L1210 / S. كانت المقاومة لمثبطات أخرى من توبويزوميراز II في خلايا L1210 / DT & # x0003e 30 ضعفًا للإيتوبوسيد و & # x0003e 6 أضعاف للأمساكرين. كانت مستويات الأشكال الإسوية 170 كيلو دالتون و 180 كيلو دالتون من توبويزوميراز II في طخة مناعية قابلة للمقارنة بين الخلايا L1210 / S و L1210 / DT. ترافقت المقاومة المتقاطعة للفينكريستين في خلايا L1210 / DT مع الإفراط في التعبير عن غشاء البلازما P-glycoprotein. على الرغم من وجود انخفاض بمقدار 1.5-2 ضعفًا في تراكم الإيتوبوسيد و DOX في خلايا L1210 / DT ، إلا أن مستويات الأدوية الخاصة بتلف الحمض النووي المكافئ في اختبار الشطف القلوي كانت & # x0003e أعلى بمقدار 5 أضعاف في L1210 / DT مقابل L1210 / خلايا S. لم يكن هناك أي إلغاء في التأثيرات المعدلة لـ TFP على DOX أو VP-16 أو السمية الخلوية التي يسببها amsacrine في خلايا L1210 / DT. تشير النتائج إلى أن: (أ) TFP بالاقتران مع التركيزات المنخفضة يمكن لـ DOX أن يحفز اختيار الخلايا ذات النمط الظاهري المقاوم للأدوية المتعددة و (ب) خصائص الخلايا المختارة لمقاومة DOX أو DOX plus TFP قابلة للمقارنة.


الملخص

ينفذ دوكسوروبيسين موت الخلايا المبرمج ، وهي عملية معروفة بإحداث تسرب السيتوكروم ج وفتح المسام الانتقالية نفاذية الميتوكوندريا. لتحديد فقدان وظيفة الميتوكوندريا عن طريق موت الخلايا المبرمج ، قمنا بمراقبة التنفس الخلوي أثناء التعرض المستمر لدوكسوروبيسين. تم استخدام محلل الفسفور قادر على قياسات مستقرة على الأقل 5 ساعات لقياس [O2]. في المحاليل التي تحتوي على الجلوكوز والخلايا ، [O2] انخفض خطيًا بمرور الوقت ، مما يدل على أن حركية استهلاك الأكسجين كانت صفرية الترتيب. أشار التثبيط الكامل لاستهلاك الأكسجين بواسطة السيانيد إلى حدوث الأكسدة في السلسلة التنفسية. ظهر انخفاض في معدل التنفس في خلايا Jurkat و HL-60 المعرضة للدوكسوروبيسين. كان الانخفاض مفاجئًا ، حيث حدث بعد حوالي ساعتين من الحضانة. كان التثبيط يعتمد على التركيز وتم حظره تمامًا بواسطة مثبط عموم كاسبيز benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone. لم يتم تثبيط التنفس في خلايا HL-60 / MX2 المقاومة ، التي تتميز بتغير نشاط توبويزوميراز II ، بواسطة دوكسوروبيسين. تم قياس انخفاض في ATP الخلوي في خلايا Jurkat بعد 2−4 ساعة من الحضانة مع 20 ميكرومتر من دوكسوروبيسين ، بالتوازي مع الانخفاض في معدل التنفس. وهكذا ، فإن الخلايا المحتضنة مع دوكسوروبيسين تظهر تثبيط كاسباس بوساطة الفسفرة التأكسدية.


شكر وتقدير

دعم المنح: مجلس البحوث الأسترالي (SM Cutts and DR Phillips) ، ومركز ماركوس للصيدلة والكيمياء الطبية ، وصندوق برونيا وصمويل هاكر للأجهزة العلمية في جامعة بار إيلان ، ومنحة الدراسات العليا بجامعة لاتروب (LP Swift) ، وزمالة الأبحاث الأسترالية التابعة لمجلس الأبحاث الأسترالي (SM Cutts).

تم تحمل تكاليف نشر هذه المقالة جزئيًا عن طريق دفع رسوم الصفحة. لذلك يجب تمييز هذه المقالة بموجب هذا الإعلانات وفقًا لـ 18 U.S.C. القسم 1734 فقط للإشارة إلى هذه الحقيقة.

نشكر البروفيسور جون هارتلي (قسم الأورام ، كلية لندن الجامعية) للمساعدة في فحص المذنب والبروفيسور جيف بيترس والدكتور دودي بونيوتيس للمساعدة في تجارب التشعيع.


أساليب

ظروف ثقافة الخلية

تم الحصول على خطوط الخلايا MCF-7 (HTB-22 ™) و MDA-MB-231 (HTB-26 ™) المستخدمة في هذه الدراسة من مجموعة American Type Culture Collection. تم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تتضمن 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في مادة DMEM / F12 خالية من الفينول مع 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (تقنيات الحياة).

فحوصات ثقافة الخلية ثنائية وثلاثية الأبعاد

تم إجراء فحوصات ثقافة الخلية كما تم نشرها مسبقًا [11 ، 14]. باختصار ، بالنسبة لمزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد ، تم زرع 1000 خلية MDA-MB-231 أو 5000 خلية MCF-7 في 384 صفيحة دقيقة (CellCarrier PerkinElmer) فوق 7.6 مجم / مل عامل النمو المخفض (GFR) Matrigel ™ أو 7.5 مجم / مل PuraMatrix ™ (Becton Dickinson Biosciences). بمجرد الوصول إلى متوسط ​​حجم كروي يبلغ قطره حوالي 50-100 ميكرومتر (حتى فترة حضانة لمدة 6 أيام) تم تطبيق الدواء لمدة 6 أيام. بالنسبة للمقايسات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد ، تم بذر 600 خلية لكل بئر في 384 صفيحة ميكروية من CellCarrier جيدًا. بعد فترة حضانة لمدة 24 ساعة ، تم تعريض الخلايا لدوكسوروبيسين واحتضانها لمدة 6 أيام. تم إجراء منحنى الاستجابة للجرعة للدوكسوروبيسين بتركيزات نهائية لكل بئر بين 0.0002 ميكرومتر و 200 ميكرومتر (ثلاثي الأبعاد: منحنى استجابة جرعة 12 نقطة ، 2D: منحنى استجابة جرعة 20 نقطة). تم تخزين Doxorubicin (Tocris Bioscience) بتركيز 50 ملي مولار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) عند -20 درجة مئوية.

في ختام كلا الاختبارين ، تمت إضافة تركيز نهائي قدره 600 ميكرومتر ريسازورين (Sigma-Aldrich) إلى كل بئر وحضنت لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية. تم الكشف عن شدة التألق باستخدام قارئ لوحة متعدد العلامات EnVision ™ (إثارة 530 نانومتر ، انبعاث 595 نانومتر PerkinElmer). بالإضافة إلى ذلك ، تم تصوير مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد باستخدام نظام التصوير عالي المحتوى Operetta ™ (PerkinElmer) في نتيجة الفحص مع وبدون إضافة صبغة AM كالسين 2 ميكرومتر (تقنيات الحياة).

تكاثر الخلايا

تم تقييم معدلات الانتشار الخلوي لخطوط خلايا سرطان الثدي المزروعة في 2D و 3D عن طريق مقايسة اختزال resazurin عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة (5 ٪ ثاني أكسيد الكربون). تمت إضافة تركيز نهائي قدره 600 ميكرومتر ريسازورين إلى كل اختبار جيدًا في كل فترة زمنية محددة طوال مدة الفحص ، وتم اكتشاف التألق على قارئ لوحة EnVision متعدد الملصقات. تم استخدام قيم شدة الفلورسنت لحساب معدلات الانتشار الخلوي (بناءً على علاقة خطية بين عدد الخلايا ووحدات الفلورسنت الإجمالية).

انتشار دوكسوروبيسين

لدراسة انتشار دوكسوروبيسين في الأشكال الكروية ثلاثية الأبعاد لثقافة الخلايا ، تم تطبيق نطاق 0.5-2 ميكرومتر من تركيزات دوكسوروبيسين الفلورية بطبيعتها على الخلايا في ثقافات ثلاثية الأبعاد وتم تصويرها. كان إجمالي وقت التعرض لمزارع خلايا سرطان الثدي ثلاثية الأبعاد لدوكسوروبيسين قبل تصوير الخلية الحية بين 6 و 72 ساعة. تم تلطيخ النوى بـ Hoechst 33،342 وحضنت لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون. باستخدام هدف 10 × على نظام فحص المحتوى العالي Opera ™ (PerkinElmer) ، تم التقاط شرائح Z على فترات 10 ميكرومتر عبر الأجسام الشبه الكروية. تم إجراء تحليل لشريحة Z المركزية لشكل كروي باستخدام ملحق الملف الشخصي الشعاعي في ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/radial-profile.html). تم رسم القيم التي تم إنشاؤها من ImageJ باستخدام Graphpad Prism.

الحصول الآلي على الصور وتحليلها

لتقييم التعبير البروتيني المؤيد للبقاء في الخلايا المستزرعة في ظروف ثنائية وثلاثية الأبعاد ، تم تحضير المقايسات كما هو موضح أعلاه. تم تطبيق Doxorubicin (2D: 90 nM 3D: 720 nM) أو التحكم في السيارة على الخلايا لمدة 24 و 48 و 72 ساعة. بالنسبة للتلوين المناعي ، تم إصلاح مزارع الخلايا ثنائية وثلاثية الأبعاد لمدة 10-20 دقيقة باستخدام 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA Sigma-Aldrich) متبوعًا بالغسيل بمحلول ملحي مخزون بالفوسفات (PBS Life Technologies). تم حظر الثقافات الخلوية باستخدام 2 ٪ من الألبومين المصل البقري (BSA Sigma-Aldrich) و 0.5 ٪ Triton X-100 (Sigma-Aldrich) في برنامج تلفزيوني. تمت إضافة الأجسام المضادة الأولية المضادة لـ Bcl-xL (إشارات الخلية) ومضادات Bcl-2 (تقنيات الحياة) في محلول منع التسرب إلى الآبار وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 16-20 ساعة. تم شطف الآبار باستخدام PBS ، متبوعًا بإضافة Hoechst 33،342 (Life Technologies) ، والأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor® (Life Technologies) و Alexa Fluor® phalloidin (300 وحدة Life Technologies) أو Cell Mask (Life Technologies) في محلول المنع لمدة 2 ح في درجة حرارة الغرفة. ثم تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني قبل التصوير.

تم الحصول على صور الفلورسنت متحد البؤر من كل فحص جيد باستخدام نظام فحص محتوى عالي أوبرا. تم إجراء تحليل الصورة باستخدام برنامج كولومبوس لتحليل الصور وإدارة البيانات (PerkinElmer). في مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد ، تم قياس مستويات التعبير عن البروتين المعني عن طريق حساب متوسط ​​الشدة (في منطقة الاهتمام) لطائرة صورة واحدة من خلال خلية أحادية الطبقة بتكبير عدسة 20 ×. في مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد ، تم قياس مستويات التعبير عن البروتين محل الاهتمام عن طريق حساب متوسط ​​الشدة (في منطقة الاهتمام) إما لشريحة مركزية واحدة أو صورة إسقاط قصوى مبنية من مكدس صور متحد البؤر 10 ميكرومتر عند تكبير العدسة 10 ×. تم الحصول على صور تمثيلية عالية التكبير للثقافات ثلاثية الأبعاد بتكبير 20 × لتصور توطين البروتين. تم إجراء جميع عمليات القياس الكمي من بروتوكولات تحليل الصور على ملفات غير معدلة.

تثبيط β1- إنتيجرين

تم تحديد توصيف التعبير β1- إنتجرين والخصائص المورفولوجية للكرة الكروية بعد التثبيط. تم خلط الجسم المضاد الذي يحجب وظيفة β1-intel (أنظمة P5D2 R & ampD) والجسم المضاد المكافئ للنمط المتماثل للاستخدام في آبار التحكم (أنظمة R & ampD) في GFR Matrigel بتركيز 1.5 ميكروغرام / مل وطبقة في صفيحة ميكروية 384 بئر. سبق أن تم إثبات أن الجسم المضاد P5D2 يثبط وظيفة β1- إنتجرين بتركيز 1.5 ميكروغرام / مل [15]. تم زرع خلايا سرطان الثدي في الآبار كما هو موضح أعلاه. تعرضت الخلايا لدوكسوروبيسين (تركيز نهائي 720 نانومتر) لمدة 72 ساعة بمجرد أن وصل متوسط ​​حجم الأجسام الشبه الكروية إلى 50-100 ميكرومتر في القطر. تم إجراء التحليل المناعي والتصوير المتحد البؤر والتحليل كما هو موضح أعلاه باستخدام الجسم المضاد لـ β1- إنتجرين (أنظمة R & ampD) لتجارب التعبير β1- إنتيجرين. تم إجراء تصوير تباين تباين الخلايا الحية (DIC) على مجهر CellR (أوليمبوس لعلوم الحياة) مع استكمال تحليل الصورة عبر ImageJ الإصدار 1.46 ساعة (تم تصحيح صور المنطقة بالمجال المسطح ثم تحليلها [14] وبرنامج AxioVision ™ (القطر الأطول) "أداة الطول").

تمت إضافة خمسة عشر ميكرولترًا من 7.6 مجم / مل من GFR Matrigel مع 1.5 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة التي تحجب وظيفة β1- إنتجرين أو الجسم المضاد المكافئ للنمط المتماثل للاستخدام في آبار التحكم (أنظمة R & ampD) إلى آبار صفيحة ميكروسكوبية 384 بئر. تمت إضافة ألف خلية MDA-MB-231 إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تتضمن 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 6 أيام (تغيرت الوسائط بعد 3 أيام من الحضانة). تم تطبيق Doxorubicin (0.07-5 ميكرومتر) لمدة 72 ساعة. في خاتمة الفحص ، تمت إضافة تركيز نهائي قدره 600 ميكرومتر ريسازورين إلى كل بئر وحضنت لمدة 6-14 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. تم قياس شدة التألق بواسطة قارئ لوحة متعدد العلامات EnVision. تم الحصول على صور DIC التمثيلية على مجهر CellR.

تحاليل احصائية

تم الانتهاء من التحليلات الإحصائية لهذه الدراسة في Graphpad Prism باستخدام اختبار t غير مزدوج أو ANOVA أحادي الاتجاه ، متبوعًا بـ Bonferroni أو Tukey بعد المخصص اختبار.


الملخص

تتم مقارنة آلية دوكسوروبيسين مع دوكسازوليدين ، دوكسوروبيسين - فورمالديهايد متقارن. IC50 لتثبيط نمو 67 خطًا من الخلايا السرطانية البشرية ، ولكن ليس خلايا عضلة القلب ، يكون أقل بمقدار 32 ضعفًا مع دوكسازوليدين مقارنة بالدوكسوروبيسين. يرتبط تثبيط النمو بواسطة دوكسازوليدين بشكل أفضل بتثبيط النمو بواسطة عوامل ربط الحمض النووي أكثر من تثبيط النمو بواسطة دوكسوروبيسين. يحفز دوكسوروبيسين توقيف G2 / M في خلايا سرطان القولون HCT-116 وخلايا سرطان الدم HL-60 من خلال آلية موثقة جيدًا تعتمد على توبويزوميراز II. فشل دوكسازوليدين في إحداث توقيف G2 / M في خلايا HCT-116 ولكنه يحفز موت الخلايا المبرمج 4 أضعاف أفضل من دوكسوروبيسين. IC50 لتثبيط نمو دوكسازوليدين لخلايا HL-60 / MX2 ، وهو مشتق ناقص في توبويزوميراز II من خلايا HL-60 ، أقل بمقدار 1420 ضعفًا من IC50 بالنسبة لدوكسوروبيسين ، فإن دوكسازوليدين يحفز موت الخلايا المبرمج بشكل أفضل بمقدار 15 ضعفًا. علاوة على ذلك ، فإن دوكسازوليدين له تأثير ضئيل في اختبار نشاط توبويزوميراز II. تشير هذه البيانات إلى أن دوكسوروبيسين ودوكسازوليدين يحفزان موت الخلايا المبرمج عبر آليات مختلفة وأن دوكسازوليدين السمية الخلوية مستقل عن توبويزوميراز II.

قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية.

قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية والتنموية.

لمن ينبغي أن تعالج المراسلات. هاتف: 303-492-6193. الفاكس: 303-492-5894. البريد الإلكتروني: [email & # 160protected]

الاختصارات: DOX ، دوكسوروبيسين DOXAZ ، دوكسازوليدين KDNA ، كينيتوبلاست DNA N ، N ، زوج قاعدة DNA غير محدد NCIDTP ، المعهد الوطني للسرطان ، برنامج العلاج النمائي ROS ، أنواع الأكسجين التفاعلية.


العنوان الحالي: مستشفى الأطفال المرضى ، جامعة تورنتو ، تورنتو ، كندا

الانتماءات

Centre de recherche du CHU de Québec-Université Laval، Ax des maladies infectieuses et immunitaires، Québec، Canada

دليلة ناجي ، سفيان برزوان ، فريديريك بارابي وأمبير فوزي أوجيت

دائرة الطب ، كلية الطب ، جامعة لافال ، كيبيك ، كندا

Département de Microbiologie-infectiologie et Immunologie ، كلية الطب ، جامعة لافال ، كيبيك ، كندا

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

شارك د.ن. في تصميم البروتوكولات التجريبية ، وإجراء التجارب ، وتحليل البيانات ، والمشاركة في صياغة المخطوطة. س. أجرى تجارب وحلل البيانات وساعد في صياغة المخطوطة. ف. شارك في تصميم التجارب وتحليل البيانات وصياغة المخطوطة وقراءتها النقدية. تصور FA الدراسة ، وشارك في تصميمها وتنسيقها ، وتحليل البيانات ، وصياغة المخطوطة النهائية والموافقة عليها. كل الكتاب قراءة وافقت على المخطوط النهائي.

المؤلف المراسل