معلومة

ما هي الطرق المجسمة ، المشابهة لتحليل منطقة Saltykov ، ولكن بشكل خاص لشرائح الأنسجة المتوازية والمتساوية البعد؟


لقد قرأت علم ستيريولوجيا الكمي لأندروود ، ويعمل تحليل منطقة Saltykov بشكل جيد لبحثي ، لكنني مندهش من عدم وجود أي شيء لشرائح الأنسجة المتوازية متساوية الأبعاد. هل هناك طرق خاصة بهذه الحالة؟


تحقيقات الصمام الثنائي للتحكم البصري الزماني المكاني للعديد من الخلايا العصبية في الحيوانات التي تتحرك بحرية

عنوان طلبات إعادة الطباعة والمراسلات الأخرى: E. Stark ، مركز علم الأعصاب الجزيئي والسلوكي ، جامعة روتجرز ، 197 جامعة. Ave.، Newark، NJ 07102 (البريد الإلكتروني: [email & # 160protected]).

مركز علم الأعصاب الجزيئي والسلوكي ، جامعة روتجرز ، نيوارك ، نيو جيرسي

مركز علم الأعصاب الجزيئي والسلوكي ، جامعة روتجرز ، نيوارك ، نيو جيرسي


شكر وتقدير

نشكر بريتا زوغنماير على التدقيق اللغوي وزملاء مركز والتر بريندل للطب التجريبي (Ludwig ‐ Maximilians ‐ Universität München ، ألمانيا) ، ولا سيما Franz Singer لدعمه الفني فيما يتعلق بالمعدات الجراحية ، ومهدي شكارامي ، رئيس مرفق الحيوان ، ومهدي شاكارامي موظفين للكفاءة في سكن الحيوانات. على وجه الخصوص ، نحن ممتنون لسفين ريس (معهد التشريح وعلم الأنسجة وعلم الأجنة ، Ludwig ‐ Maximilians ‐ Universität München ، ألمانيا) للحصول على المشورة الإحصائية ومقدمة لطريقة إحصائيات حجم التأثير وفقًا لكوهين.

مصادر التمويل

كان هذا العمل مدعومًا جزئيًا من قبل مركز البحوث التعاونية (SFB-TR) 127 ، ونظام التميز للقلب والرئة (ECCPS) التابع لجامعة Justus Liebig ‐ ، في Giessen (ألمانيا) ، والمنحة الفردية FI ‐ 543/2 ‐2 ، كلها ممولة من مؤسسة الأبحاث الألمانية (Deutsche Forschungsgemeinschaft ، بون ، ألمانيا) ، وكذلك من مؤسسة فون بيرينغ رونتجن (ماربورغ ، ألمانيا) و LOEWE ‐ Priority Program "Medical RNomics" (Wiesbaden ، ألمانيا) .


ما هي الطرق المجسمة ، المشابهة لتحليل منطقة Saltykov ، ولكن بشكل خاص لشرائح الأنسجة المتوازية والمتساوية البعد؟ - مادة الاحياء

تقييم كمي للخصائص المورفولوجية لخلايا BeWo كنموذج في المختبر لخلايا الأرومة الغاذية البشرية


Una Evaluaci & oacuten Cuantitativa de las Caracter & iacutesticas Morfol & oacutegicas de las C & eacutelulas BeWo como un Modelo in vitro de las C & eacutelulas de Trofoblasto Humano

* سي. عبيدو ** م. أ.وارن ** ص. دبليو أندروز وأمبير *** ك. أ. بواتينج

* قسم التشريح ، كلية العلوم الطبية ، جامعة كوامي نكروما للعلوم والتكنولوجيا ، كوماسي ، غانا.

** قسم العلوم الطبية الحيوية ، جامعة شيفيلد ، شيفيلد ، S10 2TN ، المملكة المتحدة.

*** قسم علم الأمراض ، كلية العلوم الطبية ، جامعة كوامي نكروما للعلوم والتكنولوجيا ، كوماسي ، غانا.

ملخص: من أجل دراسة التشكل التفصيلي لخلايا الأرومة الغاذية أثناء الزرع البشري ، تمت زراعة خلايا BeWo كأجسام كروية في الثقافة المعلقة. ثم تمت معالجة هذه الثقافات للفحص المجهري الضوئي والإلكتروني. أظهرت الدراسة الحالية أن الأجسام الشبه الكروية BeWo تتكون من نوعين من الخلايا التي تشبه الأرومة الغاذية للخلايا وتشبه الأرومة الغاذية المخلوية. تشكل الخلايا ذات القطر النووي الأكبر حوالي 1 ٪ فقط من تعداد الخلايا ويبدو أنها خلايا الأرومة الغاذية المخلوية. لذلك يبدو أن نوع الخلية السائد من الأجسام الشبه الكروية BeWo غير متمايزة نسبيًا وتشبه الأرومة الغاذية الخلوية. كانت حوالي 10٪ من خلايا BeWo في هذه الدراسة انقسامية ، مما يشير إلى وجود عدد كبير من السكان التكاثري. زاد العدد الإجمالي للخلايا حوالي 12 مرة خلال فترة الاستنبات من 107 & plusmn 9 في اليوم 1 إلى 1211 & plusmn 145 في اليوم السابع بينما زاد الحجم لكل خلية حوالي مرتين ، من 1300 & microm3 في اليوم 1 إلى 2400 & microm3 في اليوم 7. لذلك بشكل عام نمو الأجسام الشبه الكروية BeWo يرجع إلى كل من تضخم وتضخم. ومع ذلك ، يبدو أن تكاثر الخلايا يفوق النمو الحجمي. تظهر هذه البيانات الكمية أن خلايا BeWo تنمو أساسًا عن طريق تضخم وتوفر قيمًا أساسية لمزيد من الدراسات. بالإضافة إلى ذلك ، تُظهر النتائج أن مورفولوجيا خلية BeWo قد لاحظت أوجه تشابه مع تلك التي تم الإبلاغ عنها بالنسبة للأرومة الغاذية البشرية ، مما يجعلها نموذجًا مفيدًا للدراسات اللاحقة في المختبر.

الكلمات الأساسية: BeWo Trophoblast Morphometry Spheroids.

استئناف: En un Cultivo de Suspensi & oacuten se estudi & oacute la morfolog & iacutea de las c & eacutelulas durante la implantaci & oacuten del trofoblasto humano، c & eacutelulas BeWo. زراعة المحاصيل وفحصها أثناء التنقل والجهد المجهري و iacutea de luz y elect & oacutenica. El estudio mostr & oacute que los esferoides BeWo constan de dos Tipos de c & eacutelulas ، citotrofoblasto y sincitiotrofoblasto. Las c & eacutelulas con amor di & aacutemetro النووي parecen ser los sincitiotrofoblasto que Representativeaban s & oacutelo el 1٪ de la poblaci & oacuten celular. Por tanto، el tipo celular predominante de los esferoides BeWo parec & iacutean ser relativamente indiferenciados como citotrofoblasto. Alrededor del 10٪ de las c & eacutelulas BeWo fueron mit & oacuteticas، lo que indica una poblaci & oacuten altamente proliferativa. El n & uacutemero de c & eacutelulas totales aument & oacute alrededor de 12 veces durante el per & iacuteodo de Cultivo de 107 & plusmn 9 d & iacuteas en el d & iacutea 1 a 1211 & plusmn 145 en el d & iacutea 7، mientras que & volumen d & iacutea 1 hasta 2400 mm3 el d & iacutea 7. Por lo tanto، el Crecimiento global de esferoides BeWo se debe tanto a la hiperplasia como a la hipertrofia. حظر الخطيئة ، parece que la proliferaci & oacuten celular supera al crecimiento volum & eacutetrico. استوعبت البيانات الحالية التي تم الحصول عليها من أماكن تواجدها في مناطق متفرقة من التنسج المتضخم والدعامة للرجوع إلى الاستوديوهات اللاحقة. Adem & aacutes ، los resultados muestran que la morfolog & iacutea celular BeWo ha marcado similitudes con los reportado para el trofoblasto humano، por lo que es un modelo & uacutetil para posteriores estudios in vitro.

Palabras clave: BeWo Trofoblasto Morfometr & iacutea Esferoides.

المقدمة

يعتمد الانغراس البشري على سلسلة من التفاعلات المحددة بين خلايا الأرومة الغاذية المبكرة في الكيسة الأريمية وبطانة الرحم. ومع ذلك ، نظرًا لأن الدراسات المنهجية في الجسم الحي تكاد تكون مستحيلة في الإنسان ، فهناك حاجة متزايدة لنماذج مناسبة لزراعة الأنسجة. نظرًا لأن الأحداث الرئيسية للزرع تحدث في الجزء الأول من الحمل ، فمن المرجح أن تكون أنسجة المشيمة في الأثلوث الأول هي المصدر الأكثر فائدة لخلايا الأرومة الغاذية للدراسات في المختبر (Aplin ، 1996). لسوء الحظ ، فإن استعادة كميات كافية من المشيمة البشرية الطبيعية في الثلث الأول من الحمل لمثل هذه الدراسات يطرح مشاكل أخلاقية وكذلك تقنية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن نشر خلايا الأرومة الغاذية الخلوية المعزولة من الأشهر الثلاثة الأولى من الحمل بسهولة في المزرعة (Irving et al. ، 1995 Frank et al. ، 2001 Abaidoo & amp Warren ، 2008).

نهج بديل هو فحص ، في المختبر ، تفاعل & quotspare & quot أجنة التلقيح الاصطناعي مع بطانة الرحم.

بينما قد يُسمح باستخدام & quotspare & quot أجنة التلقيح الاصطناعي في الدراسات القائمة على الملاحظة ، لا تزال هناك صعوبات أخلاقية وعملية كبيرة في استخدامها. على سبيل المثال ، غالبًا ما يتم تصنيف & quotspare & quot الأجنة على أنها أقل من الأمثل (حيث لم يتم استخدامها / اختيارها للاستبدال). كما قد يكون بعضها قد تم تجميده لسنوات عديدة ، مما قد يؤثر على سلوكهم. من المحتمل أيضًا أن يكون هناك عدد قليل جدًا من البحث الكمي المطلوب. أدت هذه المشكلات وغيرها إلى الحد من دراسة خلايا الأرومة الغاذية البشرية المبكرة في عملية الانغراس. ومع ذلك ، فإن تشابه خلايا سرطان المشيمة البشرية في الثقافة أحادية الطبقة مع خلايا الأرومة الغاذية البشرية الطبيعية من حيث التشكل وإنتاج الهرمونات (باتيلو وآخرون ، 1971) قد مكّن بعض الباحثين من استخدام هذه الخلايا لدراسة بعض خصائص الأرومة الغاذية في المختبر.

تم إنشاء خط خلية ورم ورم الأرومة الغاذية البشرية BeWo في الثقافة في عام 1966 (باتيلو وأمب جي ، 1968) من سرطان المشيمة بعد الولادة والذي تم زرعه بشكل متسلسل في كيس خد الهامستر بواسطة Hertz (1959). تم الإبلاغ عن مورفولوجيتها الأساسية وتمايزها في ثقافة أحادية الطبقة بواسطة Gr & uumlmmer et al. (1994). تم اقتراح أن خط خلية BeWo يتكون من خلايا تشبه الأرومة الغاذية للخلايا وخلايا عملاقة متعددة النوى تشبه الأرومة الغاذية المخلوية (Gr & uumlmmer et al. ، 1990). Gr & Uumlmmer et al. (1990 ، 1994) أنشأت BeWo الأجسام الشبه الكروية متعددة الخلايا في الثقافة التي لها بعض الخصائص المورفولوجية والإفرازات الهرمونية المشابهة لمزارع BeWo أحادية الطبقة وخلايا الأرومة الغاذية الخلوية البشرية الطبيعية في الجسم الحي.

قد توفر الدراسات في المختبر على خطوط الخلايا الأرومة الغاذية البشرية هذه بعض المعلومات حول المراحل المبكرة من انغراس الإنسان. في حين أن هناك عددًا كبيرًا من التقارير التي تتناول الإفرازات الهرمونية لخلايا BeWo ، يبدو أن هناك القليل من المعلومات المنشورة حول البنية التحتية الدقيقة وخصائص النمو لهذه الخلايا ، ولا سيما البيانات الشكلية الموضوعية. لذلك ، من أجل توفير فهم أفضل للتغييرات في حجم خلية BeWo ، ومكمل العضيات (وبالتالي وظيفة الخلية) التي تحدث أثناء النمو الكروي ، تم تصميم الدراسة الحالية لإنشاء بيانات أساسية مفصلة حول مورفولوجيا خلايا BeWo التي تزرع في ثقافة التعليق باستخدام المجهر الضوئي الكمي. وبشكل أكثر تحديدًا ، تم التحقيق في خصائص نمو الأجسام الشبه الكروية BeWo باستخدام تقنيات كمية موضوعية كجزء من التحقيق في نموذج محتمل في المختبر لخلايا الأرومة الغاذية البشرية وأيضًا لإجراء مقارنات بين الأساليب الشكلية القائمة على النموذج والقائمة على التصميم لتقدير الحجم والأرقام من أجل إجراء مقارنات مع البيانات المنشورة.

المواد وطريقة

مزارع خلية BeWo. تمت زراعة خلايا سرطان المشيمة (BeWo ، Human CCL ، American Type Culture Collection Pattillo and Gey ، 1968) بشكل روتيني كطبقة أحادية من خلال المرور التسلسلي في Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM ، Gibco Life Technologies Limited ، Paisley ، Scotland) عند 37 درجة مئوية في 1٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ هواء في قوارير سعة 25 مل لزراعة الخلايا (كوستار ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت زراعة الخلايا عن طريق التشتت باستخدام 0.5٪ التربسين / الإيثيلين ثنائي أمين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) (شركة سيغما للكيماويات ، المملكة المتحدة) عند درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين و 3 دقائق مع اضطراب ميكانيكي متقطع للمساعدة في عملية التفكك. تم استخدام مجهر تباين طوري (Cambridge Instruments ، المملكة المتحدة) لمراقبة انفصال خلايا BeWo. في غضون دقيقتين ، انفصلت الخلايا عن القارورة وخمسة مليمترات من Dulbecco's Modified Eagle's Medium مع Hams F12 (DMEM-F12 ، Gibco Life Technologies Limited ، بيزلي ، اسكتلندا) تمت إضافة وسائط الزراعة لوقف المزيد من تفكك الخلايا. تم بذر 2 ملي ليتر من المعلق ذو الخلية المفردة في كل قارورة سعة 25 مل لزراعة الخلايا تحتوي على 5 مل من وسط زراعة DMEM-F12 ، تم إيقاف القوارير بشكل غير محكم واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ و 95٪ هواء. تم تغيير وسائط الثقافة كل 48 & خجول 72 ساعة. تم تنفيذ الإجراءات المذكورة أعلاه في ظل ظروف معقمة في خزانة زراعة الأنسجة من الدرجة الثانية (Gelaire BSB4 A ، Gelman SPA ، Flow General ، Rickmansworth ، إنجلترا).

تحضير الأجسام الشبه الكروية الخلية BeWo. لبدء الثقافة الكروية ، تم حصاد الخلايا النامية باستخدام 0.5 ٪ التربسين / EDTA في درجة حرارة الغرفة (على النحو الوارد أعلاه). تم تعليق الخلايا في وسط زراعة DMEM-F12 وتم إضافة ما يقرب من 7 × 105-1 × 106 خلايا في 10-15 مل من DMEM F12 إلى أطباق بتري المعقمة من غير الأنسجة (قطر 90 مم) ووضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ هواء لمدة 16 & خجولة 24 ساعة. تم تغيير الوسائط كل 48 ساعة. نتج عن اللقاح الكبير تطور أسرع للأجسام الكروية بينما يستغرق استخدام أعداد أقل وقتًا أطول لنمو الأجسام الشبه الكروية.

معالجة الأنسجة للفحص المجهري الضوئي. تم نقل تعليق خلية BeWo الكروية إلى أنابيب طرد مركزي ولفها عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي على مقاعد البدلاء (جوان ، فرنسا). تمت إزالة المادة الطافية وحوالي 5 مل من الجلوتارالدهيد المسخن مسبقًا بنسبة 3٪ في محلول فوسفات 0.1 مولار (الرقم الهيدروجيني 7.4) تمت إضافته إلى الحبيبات المتبقية التي تحتوي على الأجسام الشبه الكروية BeWo لمدة 4-6 ساعات. تم بعد ذلك تجفيف الأجسام الشبه الكروية خلية BeWo من خلال محاليل إيثانول متسلسلة (70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 100٪) لمدة عشرين دقيقة كل تغيير عن طريق الطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة وإزالة المادة الطافية في كل خطوة. تمت إزالة الأجسام الشبه الكروية ، مع بعض الإيثانول ، إلى قوالب بلاستيكية. تم جمع الإيثانول باستخدام ماصة Pasteur ذات طرف ناعم جدًا ثم تمت إضافة محلول التضمين JB4 إلى الأجسام الشبه الكروية. طفت الأجسام الشبه الكروية لفترة ثم استقرت في قاعدة القالب. تمت تغطية القوالب بحوامل معدنية وتركت للبلمرة لمدة 24 ساعة تحت ظروف لاهوائية. تم إزالة بعض الأجسام الشبه الكروية المجففة في الكلوروفورم لمدة 30 دقيقة ، ثم تسللت في الشمع لمدة ساعة وغرست في الشمع طوال الليل.

تم قطع ما يقرب من 2 ميكروم من المقاطع السميكة من كل كتلة JB4 باستخدام سكاكين زجاجية جافة. تم تسطيح المقاطع بالطفو على سطح الماء في درجة حرارة الغرفة ، وتجميعها على شرائح مجهرية نظيفة وتجفيفها على لوح تسخين عند 60 درجة مئوية. تم تلطيخ الشرائح إما في 1٪ حمض مائي Fuschin ملطخة بمضاد 0.05٪ أزرق تولويدين أو 1٪ تولويدين أزرق وحده. تم فحص جميع الشرائح بالمجهر الضوئي.

تم تقطيع كتل الشمع في حوالي 5 ميكروم وصبغها في 1 ٪ يوزين مائي.

معالجة الأنسجة بالمجهر الإلكتروني. تمت معالجة بعض الأجسام الشبه الكروية الثابتة كما هو موضح أعلاه من أجل الفحص المجهري الإلكتروني عن طريق التضمين في Epon باستخدام الإجراءات القياسية (Warren & amp Bedi ، 1984). تم قطع المقاطع فائقة الرقة الملونة بالتداخل الفضي والذهبي (حوالي 50-70 نانومتر) من نفس الكتل الموصوفة أعلاه باستخدام سكاكين زجاجية وتم جمعها على شبكات نحاسية شبكية 3.05 مم 200 ملطخة بخلات اليورانيل وسيترات الرصاص. تم فحصها والتقاط الصور المجهرية باستخدام مجهر Philips 301 للإرسال الإلكتروني بجهد تسارع 60 كيلو فولت. تم عرض السلبيات باستخدام مجهر الإسقاط.

قياس سماكة القسم. تم قياس سماكة بعض المقاطع شبه الرقيقة المقطوعة باستخدام الجسيمات الدقيقة باستخدام مقياس التداخل الدقيق (مجهر تداخل Vickers Patholux). باستخدام هذه الأداة ، تم تمرير شعاع من الضوء أحادي اللون بطول موجة 546 نانومتر عبر القسم وقياس فرق المسار البصري (OPD) بالإشارة إلى منطقة الخلفية الفارغة.

تم العثور على سمك المقطع (t) من:

t = OPD l / & micro m - & micro a (Goldstein & amp Hartmann-Goldstein ، 1974)

OPD = فرق المسار البصري في جزء من الطول الموجي

l = الطول الموجي للضوء المستخدم

& micro m = معامل الانكسار للوسائط (1.51)

& micro a = معامل الانكسار للوسط الذي تُجرى فيه القياسات (1.00)

تم استخدام القيمة التي تم الحصول عليها من كل قسم في الحسابات المناسبة للكثافات العددية وحساب الحجم كما هو موضح أدناه.

قياس قطر الأجسام الشبه الكروية BeWo. تم الحصول على الأقطار الرئيسية والثانوية لكل كروي عن طريق أخذ قياسات عمودية لقطر كروي على كل من 8 أجسام كروية تم اختيارها عشوائيًا باستخدام مجهر ضوئي مقلوب متباين الطور مزود بمصباح عيني معاير. على فترات 24 ساعة تم قياس الأجسام الشبه الكروية وإعادتها إلى الثقافة. تم إصلاح الأجسام الشبه الكروية بعد سبعة أيام ، ومعالجتها وتقسيمها كما هو موضح أعلاه. تم قياس الأقطار الرئيسية والثانوية للجزء المركزي من كل جسم كروي على المقاطع شبه الرقيقة. تم العثور على حجم العينة 8 ليكون الأمثل من دراسة تجريبية.

قياس الشكل

تقديرات حجم الكسر. تم تقدير الكسر الحجمي (Vv) من النواة إلى الخلية باستخدام تقنية عد النقاط (Williams ، 1977) وشبكة شعرية مربعة 5 & ميكروم (فصل النقاط على النسيج هو 6.2 ميكروم) بمساعدة أنبوب رسم متصل بأولمبوس (BH-2) مجهر. تم فحص ما لا يقل عن خمسة مجالات عرض عشوائية عشوائية غير متداخلة بشكل منهجي لكل شريحة من الأنسجة. تم تثبيت الشبكة المربعة على صورة النسيج وتم تسجيل عدد النقاط التي تقع على النواة والعدد الإجمالي للنقاط التي تقع على الخلايا بأكملها (Weibel ، 1979). تم حساب الكسر الحجمي من نواة إلى خلية باستخدام الصيغة:

Pn = العدد الإجمالي للنقاط على النوى ، و

الكمبيوتر = إجمالي عدد النقاط على الخلايا.

تقدير أقطار الملف النووي لخلية BeWo. تم قياس الأقطار الرئيسية والثانوية لملفات BeWo النووية باستخدام أنبوب رسم متصل بمجهر أوليمبوس (BH-2) ولوح محول رقمي مرتبط بجهاز كمبيوتر صغير باستخدام برنامج مكتوب مسبقًا (Warren & amp Bedi). تم إجراء القياسات تحت الغمر بالزيت بتكبير X 810 ، تم تحديده باستخدام ميكرومتر المرحلة. تم حساب متوسط ​​قطر الملف النووي ونسبة المحور من قيم المحورين باستخدام المعادلات:

متوسط ​​القطر = & قسمة (أ & ين ب) (وارن & أمبير بيدي) ،

حيث أ = قطر الملف الشخصي الرئيسي و

ب = قطر جانبي صغير.

النسبة المحورية = (قطر الملف الشخصي الرئيسي) / (قطر الملف الشخصي الصغرى)

حيث 1.0 = ملف تعريف دائري.

تقدير مساحة خلية BeWo وحجمها. تم تقدير حجم الأجسام الشبه الكروية BeWo باستخدام مبدأ Cavalieri (Mayhew ، 1991). تم قطع كومة من المقاطع المتوازية من خلال الأجسام الشبه الكروية مع فصل 5 ميكروم تقريبًا (إعداد مشراح) بين الأقسام المتعاقبة. تم قياس سمك كل قسم من الأقسام التسلسلية باستخدام قياس التداخل. تم اختيار الأقسام بشكل منهجي من كومة المقاطع ، مع أخذ كل قسم عشر من البداية العشوائية (Mayhew). تم تحديد جزء أخذ العينات مسبقًا من دراسة تجريبية. بمساعدة أنبوب رسم متصل بالمجهر ، تم تقدير مناطق الأجسام الشبه الكروية BeWo بتكبير X 810 باستخدام تقنية عد النقاط وشبكية مربعة 5 مم (كان فصل النقاط على الأنسجة 6.2 ميكروم). تم تسجيل عدد النقاط التي تقع على كل خلية كروية وتم حساب مساحات وأحجام الأجسام الشبه الكروية باستخدام المعادلة التالية (مايهيو):

SP = العدد الإجمالي لنقاط الاختبار التي تقع على الكرة الكروية ، و a (p) = المكافئ المساحي لنقطة اختبار واحدة (المسافة بين النقاط على الشبكة / التكبير) ،

د = الفاصل / المسافة بين المقاطع التي تم الحصول عليها من جمع سماكة المقطع للمقاطع بينهما.

تقدير الكثافة العددية لنواة خلية BeWo باستخدام:

طريقة Disector. تم تقدير الكثافة العددية للنواة في الأجسام الشبه الكروية لخلية BeWo باستخدام طريقة الكاشف. تتطلب هذه الطريقة سلسلة من المقاطع المتوازية ، مع وجود مسافة معروفة لقطعها في العينة (Sterio، 1984 Gundersen، 1986). تم قطع كومة من المقاطع شبه الرقيقة من خلال عينة من الأجسام الشبه الكروية التي تم اختيار أزواج من المقاطع (Disectors) منها. داخل كل Disector ، تم تعيين القسم الأول كقسم مرجعي والقسم الثاني باسم "البحث". تم جمع البيانات للأجسام الكروية على محلل الصور Quantimet 970 (Cambridge Instruments Ltd).

تم استخدام اثني عشر زوجًا من المقاطع شبه الرقيقة الملطخة بالتولويدين والأزرق لكل جسم كروي. تم استخدام ما مجموعه 6 من الأجسام الشبه الكروية. تم أخذ الـ 12 جهاز كشف من الأقسام التسلسلية في نمط أخذ عينات عشوائي منهجي. تم عرض صورة القسم المرجعي (على سبيل المثال ، القسم 2) على شاشة وتم تتبع الملامح النووية لجميع النوى داخل إطار أخذ العينات على صفائح الأسيتات باستخدام قلم قابل للذوبان في الماء. نظرًا لوجود نواة واحدة لكل خلية ، تم استخدام النواة كوحدة عد للخلية. تم تكرار العملية لقسم "البحث" (على سبيل المثال ، القسم 3). تم تركيب ورقة الأسيتات مع الخطوط العريضة للملفات النووية من القسم المرجعي على صورة قسم "البحث" وكان عدد الملفات الشخصية لكل نواة تم رؤيتها في القسم المرجعي ولكن لم يتم رؤيتها في قسم البحث. تحسب وتمثل كـ Q-. من أجل تحسين كفاءة الإجراء ، تم تكرار العد على نفس القسمين ولكن في الاتجاه العكسي من العد الأول: هذا هو حساب عدد الملفات الشخصية المفقودة في القسم 3 (الآن القسم المرجعي) من 'look- قسم المتابعة (القسم 2) (Gundersen ، 1986). في هذه الدراسة ، تم استخدام 12 جهازًا في كل اتجاه مما يجعل إجمالي 24 جهازًا. تم تحديد عدد الأمراض المعدية مسبقًا من دراسة تجريبية. تم تقدير الكثافة العددية لنواة خلية BeWo (Nv) باستخدام الصيغة (المعدلة من Sterio ، 1984):

SQ- = مجموع ملفات التعريف النووية الموجودة في قسم المراجع ولكنها مفقودة من قسم "البحث" ،

أ = متوسط ​​مساحة ملف التعريف كروي ،

Sh = مجموع المسافة بين قسم المرجع وقسم "البحث" لكل جهاز كشف

طريقة Dehoff & amp Rhines. كما تم تقدير الكثافة العددية للنوى في الأجسام الشبه الكروية لخلية BeWo باستخدام طريقة DeHoff & amp Rhines (1961) ، وهي طريقة تقليدية قائمة على النموذج. تم استخدام قسم واحد نصفين ، ملطخ باللون الأزرق من كل من الأجسام الشبه الكروية BeWo. تم فرض إطار عد غير متحيز لمنطقة معروفة (Gundersen ، 1977 Weibel) فوق صورة كروي وتم تسجيل عدد الملامح الموجودة في إطار العد وتحديد الرقم لكل وحدة مساحة. تم حساب ملامح الجسيمات التي لا تلامس خطوط الاستبعاد فقط (Calverley et al. ، 1988). تم الحصول على قياسات متوسط ​​القطر لمحات BeWo النووية باستخدام digitzer ، كما هو موضح سابقًا. تعطي تقديرات متوسط ​​قطر المظهر الجانبي التي تم الحصول عليها أعلاه تقديرًا أقل من المتوسط ​​الحقيقي لقطر المظهر الجانبي ، لذلك تم تطبيق إجراء تصحيح قطر شوارتز-سالتيكوف (Williams ، 1977) وتم الحصول على متوسط ​​قطر الجسيمات المصحح. تم الحصول على الكثافة العددية باستخدام الصيغة التالية:

Na = عدد الملفات الشخصية لكل وحدة مساحة

H = متوسط ​​قطر المسماك

ر = سمك القسم (انظر أدناه)

تم حساب الكثافة العددية لخلايا BeWo بثلاث طرق باستخدام (1) سمك المقطع المقاس ، (2) سمك القسم المفترض 0.5 مم ، و (3) بافتراض أن السُمك لا يكاد يذكر (ويليامز).

تقدير رقم خلية BeWo بناءً على:


المطهر. تم حساب ملفات التعريف النووية المفقودة (Q-) كما هو موضح أعلاه. تم تقدير الكثافة العددية من الصيغة المعطاة سابقًا وضرب Nv في حجم الكرة الكروية (Vs) لإعطاء العدد الإجمالي للخلايا في الكرة الكروية.

إجمالي عدد الخلايا = Nv x Vs

المجزئ. تم تقدير رقم خلية BeWo لكل جسم كروي باستخدام المجزئ (Mayhew). تم حساب ملفات التعريف النووية المفقودة على نفس أزواج الأقسام المستخدمة للكاشف. تم إجراء تعداد الخلايا في كلا الاتجاهين كما هو موضح سابقًا. المسافة h بين الأقسام المتوازية وحجم الأجسام الشبه الكروية غير مطلوبة لهذه الطريقة لأن جميع الخلايا الموجودة في الكرة الكروية كانت متاحة لأخذ العينات. تم استخدام جزء أخذ العينات من 1/5. تم استخدام مخطط أخذ العينات المستخدم في هذه الدراسة فقط في المستوى الأول من التجزئة نظرًا لأن الأجسام الشبه الكروية كانت صغيرة بما يكفي لتقسيمها بشكل كامل بشكل متسلسل دون الحاجة إلى أخذ عينات فرعية. تم الحصول على تقدير العدد (N) من:

f = مقلوب جزء أخذ العينات.

العد المباشر لخلايا الأجسام الشبه الكروية. تمت إزالة الأجسام الشبه الكروية في نقاط زمنية مختلفة من الثقافة ، وتم قياسها باستخدام غراتيكول العينية وتصنيفها حسب الحضانة بنسبة 0.25 ٪ التربسين / EDTA. تم ببساطة حساب عدد الخلايا في هذه المعلقات أحادية التشتت مباشرة بمساعدة مجهر تشريح (Wild M32 ، Heerbrugg ، سويسرا). تم تكرار الإجراء عن طريق تقدير رقم الخلية باستخدام مقياس الدم (تحسين Neubauer ، Hausser Scientific Partnership ، Horsham ، الولايات المتحدة الأمريكية) بالطريقة القياسية.

تحديد أرقام الخلايا الانقسامية. تم إجراء التعداد البسيط لمحات الخلايا الانقسامية بتكبير يقارب X 1000 بإطار عد غير متحيز (Gundersen ، 1977). تم تركيب إطار العد على صورة الكرة الكروية. تم حساب وتسجيل عدد ملفات تعريف الخلية الانقسامية والعدد الإجمالي لملفات تعريف الخلية في الإطار. تم أخذ عينات من كل جسم كروي بشكل منهجي. ثم تم حساب نسبة الخلايا الانقسامية. تم الحصول على مؤشرات الانقسامية لكل كروي ، ثم تم تجميعها وتم حساب المتوسطات والأخطاء المعيارية لكل تجربة.

تحليل احصائي. تم تجميع القيم الفردية داخل المجموعات والوسائل وتم حساب الأخطاء المعيارية لكل مجموعة. خضعت بيانات الكسر الحجمي والنسبة المحورية للملف النووي لتحولات لوغاريتمية لجعل القيم مناسبة للتحليل الإحصائي. تم اختبار البيانات الخاصة بأقطار الملف النووي والحجم والكثافة العددية مباشرة. تم تحليل البيانات باستخدام اختبارات t للطلاب المزدوجة أو غير المزاوجة حسب الاقتضاء لمقارنة الاختلافات بين مجموعتين وتم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لفحص الاختلافات في قطر كروي بمرور الوقت في الثقافة.

تم إخضاع تقديرات الأرقام التي تم الحصول عليها بواسطة Fractionator وتلك التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين مبدأ Cavalieri وطريقة Disector لاختبار الارتباط. يتم عرض البيانات غير المحولة في الجداول.

جزء الحجم (Vv) للخلية التي تحتلها النواة. يتم إعطاء كسور الحجم لخلية BeWo التي تشغلها النواة في الجدول الأول. كان V أكبر عدديًا في الأجسام الشبه الكروية BeWo (D7) التي يبلغ عمرها 7 أيام من الأجسام الشبه الكروية التي يبلغ عمرها يوم واحد (D1) ، ولكن هذا لم يكن مهمًا عند P 0.05. كان معامل الاختلاف لهذه الميزة في مجالات D1 (5٪) مشابهًا لمجموعة D7 (4٪).

أبعاد الملف النووي والنسبة المحورية للملف النووي. كانت أبعاد الملف الشخصي النووي لخلايا D7 أكبر (P & lt 0.001) من الأجسام الشبه الكروية D1 (الجدول الأول). كانت النسبة المحورية للملف النووي للمجموعتين متشابهة بشكل ملحوظ. كانت معاملات اختلاف النسبة المحورية لـ D1 و D7 هي نفسها (3 ٪).

متوسط ​​قطر الأجسام الشبه الكروية. خلال فترة الاستزراع ، زاد قطر الأجسام الشبه الكروية (المقاس مباشرة) (P & lt 0.001 ، ANOVA) خطيًا من متوسط ​​103 & plusmn 26 & microm في اليوم الأول إلى 361 & plusmn 33 & microm في اليوم 7. متوسط ​​القطر بعد التثبيت والمعالجة من الأجسام الشبه الكروية البالغة من العمر 7 أيام كان 315 & plusmn 28 & microm. كان هذا أقل بكثير (P & lt 0.001) (بنسبة 13٪) من متوسط ​​القطر الكروى البالغ 361 & plusmn 33 & microm الذي تم الحصول عليه عن طريق القياس المباشر. كان هناك ارتباط إيجابي قوي (r = 0.998 P & lt 0.01) بين قطر كروي من الطريقتين.

حجم الأجسام الشبه الكروية. تقديرات الحجم للأجسام الشبه الكروية التي يبلغ عمرها 1 و 7 أيام لكل من الأساليب القائمة على التصميم والطرق القائمة على النموذج ترد في الجدول II. كان متوسط ​​حجم الأجسام الشبه الكروية التي يبلغ عمرها 7 أيام 2.6 وأكثر من 0.4 × 10-3 مم 3. كان هذا أكبر بشكل ملحوظ (P & lt 0.01) من متوسط ​​حجم الأجسام الشبه الكروية التي يبلغ عمرها يوم واحد (1.4 & plusmn 0.2 x 10-4 mm3). زادت تقديرات الحجم الكروية التي تم الحصول عليها بالطريقة القائمة على النموذج بشكل ملحوظ (P & lt 0.01) من 1.7 & plusmn 0.6 x 10-3 mm3 إلى 2.9 & plusmn 1.0 x 10-2 mm3. كانت معاملات الاختلاف في هذه الميزة للتقديرات المستندة إلى النموذج حوالي ضعف تلك الخاصة بالتقديرات القائمة على التصميم.

تقديرات الكثافة العددية. كان متوسط ​​الكثافة العددية للأجسام الكروية الثابتة بعد 7 أيام في الثقافة أقل بكثير (P & lt 0.001) من كثافة الأجسام الشبه الكروية D1 (الجدول II). تتم مقارنة القيم المتوسطة للأجسام الشبه الكروية التي يبلغ عمرها 1 و 7 أيام من طرق DeHoff & amp Rhines و Disector في الجدولين الثالث والرابع. كان متوسط ​​الكثافة العددية للأجسام الكروية D1 التي تم الحصول عليها بطريقة DeHoff & amp Rhines 2.96 & plusmn 0.19 x 105 mm-3. كان هذا أقل بشكل ملحوظ (P & lt 0.001) (بنسبة 63 ٪) من قيمة Disector البالغة 7.95 & plusmn 0.59 × 105 مم -3 (الجدول الثالث). لم يكن هناك ارتباط بين البيانات من التقنيتين (الجدول الثالث).

بالنسبة للأجسام الشبه الكروية التي يبلغ عمرها 7 أيام ، تم الحصول على الكثافة العددية بواسطة طريقة Disector ، باستخدام قسم مفترض.

كانت سماكة 0.5 ميكروم (3.21 & plusmn 0.25 × 105 مم -3) أقل بشكل ملحوظ (P & lt 0.01) من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام سمك المقطع المقاس (4.96 & plusmn 0.34 x 105 mm-3) (الجدول الرابع). وبالمثل ، فإن Nv من الأجسام الشبه الكروية D7 التي تم الحصول عليها بطريقة DeHoff & amp Rhines ، باستخدام سمك المقطع المقاس كان أقل بشكل ملحوظ (P & lt 0.001) (1.56 & plusmn 0.14 x 105 mm-3) ، مقارنة بقيمة Disector 4.96 & plusmn 0.34x 105 ملم -3 (الجدول الرابع). كان Nv الذي تم الحصول عليه بواسطة طريقة DeHoff & amp Rhines باستخدام سمك مقطع مفترض 0.5 ميكروم (1.54 & plusmn 0.14 x 105 mm-3) أيضًا أقل بشكل ملحوظ (P & lt 0.01) من طريقة Disector (3.21 & plusmn 0.25 x 105 mm- 3) ولكن لم يكن هناك ارتباط بين هذه النتائج (الجدول الرابع).

متوسط ​​الكثافة العددية المشتقة من طريقة DeHoff & amp Rhines بافتراض أن سمك القسم ضئيل ، وسمك المقطع المقاس ، وسماكة المقطع المفترضة هي 1.60 & plusmn 0.14 x 105 mm-3 ، 1.56 & plusmn 0.14 x 105 mm-3 و 1.54 & plusmn 0.14 × 105 ملم -3 على التوالي (الجدول الخامس). أدى ذلك إلى انخفاض معنوي (P & lt 0.001) بنسبة 68٪ و 69٪ و 69٪ مقارنةً بقيمة Disector 4.96 & plusmn 0.34 x 105 mm-3.

تقديرات العدد. كانت تقديرات العدد التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين طريقة Disector ومبدأ Cavalieri لتحديد الحجم في D1 و D7 هي 107 & plusmn 9 و 1211 & plusmn 145 على التوالي (الجدول السادس) وكانت القيم مختلفة بشكل كبير (P & lt 0.001). كانت تقديرات الأرقام التي تم الحصول عليها بطريقة Fractionator هي 108 & plusmn 9 (D1) و 1070 & plusmn 60 (D7) والتي كانت أيضًا مختلفة بشكل كبير (p & lt 0.001). بالنسبة لكل من الأجسام الشبه الكروية التي يبلغ عمرها 1 و 7 أيام ، لم تختلف تقديرات الأرقام التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقتين بشكل كبير (P) وكان هناك ارتباط إيجابي قوي (r = 0.850 P & lt 0.05) بين نتائج الطريقتين. ومع ذلك ، كانت تقديرات الأرقام المشتقة من طريقة DeHoff & amp Rhines أقل بكثير من تلك التي تم الحصول عليها بالطرق القائمة على التصميم (43 & plusmn 8 لـ D1 و 415 & plusmn 86 لـ D7). كانت معاملات التباين في هذه الميزة للتقديرات المستندة إلى النموذج حوالي ضعف تلك الخاصة بالتقديرات القائمة على التصميم.

فحصت الدراسة الحالية التشكل التفصيلي لخط خلية سرطانية مشيمية BeWo باستخدام نظام زراعة حيث تنمو الخلايا في الأجسام الشبه الكروية. يبدو أن هذه هي الدراسة الأولى لحجم خلية BeWo وتحديد عددها باستخدام طرق قياس الشكل القائمة على التصميم. تم إجراء مقارنات بين أساليب قياس الشكل القائمة على التصميم والقائمة على النموذج. شوهدت اختلافات كبيرة بين التقديرات التي تم الحصول عليها من خلال هاتين الطريقتين المورفومترية.

أظهرت النتائج الكمية والنوعية للدراسة الحالية أن الأجسام الشبه الكروية BeWo تتكون من نوعين من الخلايا ، تشبه الخلايا الأرومة الغاذية الخلوية والخلايا الشبيهة بالأرومة الغاذية المخلوية مع الخلايا ذات القطر النووي الأكبر والتي تشكل حوالي 1٪ فقط من تعداد الخلايا. These appear to be syncytiotrophoblast-like cells. The predominant cell type of the BeWo spheroids appeared to be relatively undifferentiated and cytotrophoblast-like. This finding is in agreement with previously published reports although their conclusions were based on qualitative analyses. Aplin reported that the BeWo cell line is heterogenous with a population of approximately 1% multinuclear giant cells.

About 10% of the BeWo cells in the present study were mitotic indicating a highly proliferative population. Grümmer et al. (1990) used the bromo-deoxyuridine anti-bromo-deoxyuridine technique to detect proliferating cells in BeWo spheroids. The authors reported that proliferating cells were distributed all over spheroids at all stages of cell division and in class sizes of spheroids up to 520 µm in diameter. Cell proliferation in human trophoblast cells (Genbacev et al., 1993) has been assessed using proliferative cell nuclear antigen (PCNA) antibodies specific for dividing cells (Waseem & Lane, 1990). Genbacev et al. (1993) have shown that cytotrophoblast cells of the cell columns or clusters, some villous cytotrotrophoblast cells, and migrating extravillous trophoblast (EVT) cells from tissue explants of anchoring villi are PCNA positive. However, nuclei of syncytiotrophoblast and EVT cells outside the cell columns remained unstained (Okudaria et al., 1991). The proliferative capacity of cyto-trophoblast cells has also been assessed using a different antibody raised against dividing cell nuclear antigen Ki67 (Castellucci et al., 1991 Genbacev et al., 1992). The localization and distribution of Ki67 antigen in first trimester placentae has been reported to be the same as that for PCNA (Genbacev et al., 1993 Hermes et al., 2008). Therefore, it appears that under both in vivo and in vitro conditions migrating cytotrophoblast cells, cytotrophoblast cells in clusters, and BeWo cells retain proliferative activity.

The volume fraction of BeWo cells occupied by nucleus was not significantly different in the D7 and D1 spheroids although the nuclear profile dimensions were significantly larger in D7 cells compared with D1 cells. This was due to a corresponding increase in cytoplasmic volume during 7 days in culture as confirmed by cell volume estimates. Increased nuclear profile diameter often reflects increased transcription in the nucleus (Junqueira et al., 1992).

In the present study, determination of nuclear profile dimensions was made in order to assess the changes in size and shape of the BeWo cells during the culture period. In addition, it was used in combination with volume fraction estimates to make comparisons about both nuclear changes and alterations in other parts of the cell, such as in relative cytoplasmic or overall cell volume. While it is recognized that the nuclear profile diameter has its limitations as a direct estimator of nuclear dimensions, it was found in the present study that it was useful for interpreting Vv data. Grümmer et al. (1990) reported a "high nuclear to cytoplasm ratio" when BeWo cells were put in suspension culture compared with monolayer BeWo cultures. Their conclusions were made on purely qualitative basis whereas in the present study Vvs were estimated by point counting techniques and the nuclear profile dimensions measured directly.

The present data show a significant increase in diameter between the D1 and D7 spheroids. These results are in agreement with some published reports. Grümmer et al. (1990) reported on the effect of time in culture on the diameter of BeWo spheroids grown in suspension culture. The sizes of the spheroids in their study were bigger (226 ± 49 µm on day 1 and 524 ± 117 µm on day 9) than those of the present study. In another study Grümmer et al. (1994) reported that after 11 days in culture the mean diameter was 500 µm for BeWo, 660 µm for Jeg-3, and 1000 µm for JAr spheroids. White et al. (1988) grew JAr cells in suspension culture and reported that the diameter of the spheroids increased with time in culture from a mean of 125.1 ± 8.8µm on day 5 to a mean of 841.3 ± 76µm on day 15. The differences between values obtained in these studies and the present study was probably due to differences in content of FCS, 10% (White et al. 1988) and 15% (Grümmer et al., 1990, 1994) compared with 2.5% used in the present study. However, Yuhas & Li (1978) reported that multicellular spheriod growth rates remained identical when the FCS concentration of the medium was varied between 2 and 10%.

Other investigators (Yuhas & Li Landry et al., 1982) have reported that spheroids from other cell types such as fibrosarcoma induced by methylcholanthrene in a C3H mouse (FSA) and a radiation induced mammary carcinoma from a BALB/c mouse (MCa-11) enlarge exponentially for a few days and then continue on a linear growth curve before reaching a critical diameter beyond which there is no further increase in size.

Some necrotic cells were found scattered in the spheroids in the present study, but there was no evidence of a central zone of necrosis. In addition the BeWo spheroids had small cavities which were devoid of cells adjacent to and surrounded by areas of viable cells. It is likely that the diffusion of nutrients and metabolites was still sufficient to support all cells at this stage and so few cells died by necrosis. The observation of intercellular cavities within the spheroids together with the scarce scattered pattern of necrosis formation are similar to the findings of Grümmer et al. (1990) and White et al., although in the latter study JAr cells and not BeWo cells were used. Development of central necrosis has been shown to vary considerably in spheroids of different cell lines although in most spheroid systems a central necrotic core begins to develop at diameters greater than 250 µm (Soranzo et al., 1986 White et al.). For example, V79 spheroids of more than 250 µm in diameter develop a necrotic core (Grümmer et al., 1990) while spheroids of other cell lines such as spheroids of human bladder carcinoma origin could reach diameters of about 500 µm or even 700 µm before central necrosis occurred in them (Erlichman & Tannock, 1986 Hermes et al.).

Various cellular and extracellular processes such as hyperplasia, cellular hypertrophy, and interstitial growth may contribute to BeWo spheroid growth. Changes in spheroid diameter are not adequate for the detection of subtle changes in spheroids. Therefore, BeWo spheroid volume was estimated using a design-based morphometric method. A simple model-based method was also used in order to compare the results obtained in the present study to published reports. Spheroid volume estimates using Cavalieri's method increased, about 20 times between 1 and 7 days in culture, from 1.4 ± 0.2 x 10-4 mm3 to 2.57 ± 0.4 x 10-3 mm3. These were about 10 times lower than the estimates derived by the model-based method (1.7 ± 0.6 x 10-3 mm3 to 2.9 ± 1.0 x 10-2 mm3). Model-based volume estimates obtained in the present study are in broad agreement with those of earlier studies (White et al. Grümmer et al., 1990, 1994), but differ in detail there was a general increase in spheroid volume and spheroid growth was linear over the culture period. However, model-based volume estimates obtained in the present study (1.7 ± 0.6 x 10-3 mm3 to 2.9 ± 1.0 x 10-2 mm3) are lower than those of previous studies (6 x 10-3 mm3 to 7.5 x 10-2 mm3, reported by Grümmer et al., 1990). In these reports, unfixed spheroids were used and measurements were obtained from a phase contrast microscope fitted with an eyepiece graticule.

The reliability of model-based methods depends on how closely the model mimics the real object. The traditional model-based volume methods used by these investigators as a means of quantifying the growth of BeWo, Jar, and Jeg-3 spheroids rely on perpendicular measurements of spheroid diameter and calculation of the volume using the equation V = 4/3pr3, which assumes that the spheroids are perfect spheres. However, BeWo spheroids differ in shape and often deviate considerably from sphericity. In addition, since the formula used for the volume estimates used the radius as part of the product, it is sensitive to even small changes in diameter. Therefore, the results obtained by this method are likely to be, at least to some extent, inaccurate and unreliable.

In order to make improved estimates of volume, it is necessary to use appropriate stereological methods of proven reliability and accuracy (Mayhew et al., 1990). The Cavalieri principle as used in this study combines a point counting technique with section thickness measurements and does not require assumptions about object shape or spatial orientation (Mayhew). The great advantage of this method is that it is design-based and not model-based and offers unbiased estimates free of simplistic and often erroneous assumptions. Application of the Cavalieri principle to a wide variety of tissues and organs has demonstrated high efficiency and reliability, although it has been reported to be time-consuming and labour-intensive (Mayhew et al., 1990).

Mayhew, 1991 and others have shown that the volume of anything which can be recognized unequivocally from its profiles can be determined by generating slices and estimating volumes from the slices. The two requirements of the Cavalieri principle are (i) a complete set of parallel sections through the entire object and the mean distance between the sections must be available, (ii) the slices are selected in a systematic random manner. The Cavalieri principle has been used to estimate the volume of brain (Mayhew et al., 1990) multicellular colon carcinoma spheroids (Bauer et al., 1995) and breast tumor volume (Ladekarl et al., 1997). These authors reported that the Cavalieri principle is an efficient, reproducible and unbiased method.

Mayhew et al. (1990) have shown that, for physical slices, the volume obtained by fluid displacement correlates extremely well with Cavalieri volume estimates. Weibe & Laursen (1995) estimated the volume of human lung using both the Cavalieri's principle and fluid displacement. They concluded that both methods are reliable, with Cavalieri's principle being superior. Therefore the Cavalieri-based volume estimates from the present study are likely to be reliable and accurate.

The growth within BeWo spheroids were also assessed using design-based stereological methods. The results of the present study show that the volume of the spheroids increased with time in culture. The question then arises as to whether the increase is due to hypertrophy of the cells or hyperplasia. Growth within the spheroids was monitored as total number of nuclei (a measure of nuclear proliferation) and volume per nucleus (a measure of hypertrophy). The latter was estimated by calculating the volume of the spheroid associated with each nucleus qualitative light and electron microscopic studies showed cells to be mononuclear.

There was a significant decrease (38%) in the numerical density of BeWo cell nuclei after 7 days in culture. It is likely that an increase in the overall volume containing the cells contributed to the observed decrease in numerical density of the day 7 BeWo spheroids compared with the day 1 spheroids.

The results of the present study demonstrate that total cell number increased about 12 times during the culture period whereas the volume per cell increased about 2 times, from 1300 µm3 on day 1 to 2400 mm3 on day 7 (combining spheroid Cavalieri volume estimates and total cell number obtained by the Fractionator method). Therefore overall growth of BeWo spheroids is due to both hyperplasia and hypertrophy. However, it appears that cell proliferation outstrips volumetric growth. The present study shows that BeWo cells proliferate and that some of the cells are lost by necrosis. However, this loss is replaced by mitosis and that the total number of cells actually increases.

Grümmer et al. (1990) used a haemocytometer to determine the cell number in BeWo multicellular spheroids. They reported that the number of cells per spheroid increased from 813 at a volume of 6 x 10-3 mm3 to 8913 cells at a volume of 7.5 x 10-2 mm3. Simpson et al. (1992) and Mayhew et al. (1994) using human placentae, also showed that trophoblast, stroma, and endothelial cells proliferate from the first trimester of pregnancy to term. They concluded that placental growth occurs, wholly or in part, by hyperplasia. Therefore the present study appears to support the notion that during gestation, cytotrophoblast cells proliferate thereby contributing to the increasing volume of the placenta.

So far nothing appears to have been reported in the literature about the use of quantitative techniques to estimate the number of cells present in BeWo spheroids. Estimates of the number of cells obtained by the Fractionator method was numerically lower for D1 spheroids and higher for D7 spheroids when compared with those obtained by the haemocytometer and the dissecting microscope. However, the estimates obtained by combining the Disector method and the Cavalieri's principle for volume estimation were not significantly (P 0.05) different from the Fractionator values.

The great advantage of the combined Cavalieri principle and the Disector method is that they are both design-based and not model-based. Mayhew et al. (1994) studied the growth of the human placenta during gestation using numerical density estimates based on the Disector and the corresponding volume estimates. West & Gundersen (1990) used this technique to estimate the number of neurons in the human hippocampus. Ladekarl et al. (1997) estimated the total number of cancer cell nuclei in breast cancer tumors using the optical Disector and the volume of the tumor (estimated by the Cavalieri principle). They concluded that the estimates obtained by this technique are unbiased and highly reproducible.

There was no correlation between the results obtained by the Disector and the model-based method in the present study. The reasons for this remain unclear but it appears to suggest that as well as producing different absolute values, the two methods are different in distribution estimates. Similar results were obtained by Akbar (1991) in the nervous system.

Comparison of numerical density values for D7 spheroids obtained by the Disector was made using both assumed (0.5µm) and measured section thicknesses. These results showed that the numerical density estimates based on the assumed section thickness were consistently lower, compared with values based on the measured section thickness. Since the measured section thickness was found to be consistently less than the assumed section thickness, the lower numerical density estimates was as predicted. The importance of accurately determining section thickness is therefore apparent, especially for the Disector where it contributes to the product in the denominator. In contrast, the Fractionator does not require the thickness of the individual sections.

As above, the results for the DeHoff & Rhines method showed estimates using measured section thickness to be consistently lower than those where t = 0 but numerically marginally higher compared with values based on the assumed section thickness. This was entirely to be expected from the formula used for the numerical density estimation. Also the correlation of the data based on the three section thicknesses was excellent.

As mentioned above, the Disector and the Cavalieri methods for volume estimation both require serial sectioning and knowledge of the distance between the sections, usually found from the true section thickness. It is therefore necessary to measure the exact thickness of the sections being used for both methods. In the present study section thicknesses were measured by interferometry. This method was chosen because of its accuracy and reproducibility (Goldstein & Hartmann-Goldstein Williams). A drawback of this method, however, is that sections have to be measured before staining and mounting. A solution to this problem was reported by Bedi (1987). He showed that a light vertical cut can be made on one side of the face of the block dividing it into small and large portions. The smaller piece is collected and its thickness measured while the larger one is stained and mounted for the appropriate measurement.

It is well documented that the true thickness of sections is often different from the microtome setting (Bedi Akbar, 1991 Warren, 1992). Such differences may be due to variations in mechanical and thermal changes and compression during sectioning (Mori & Christensen, 1980 Ohno, 1980). Using interferometry, the measured section thickness of semi-thin Araldite-embedded sections (mean 0.44µm, range 0.16-0.80µm) and ultra-thin (mean 54.4 nm, range 43.4-71.2 nm) were found to be an underestimate of the microtome setting (0.5 µm) (Warren, 1992). The estimation of section thickness from interference colours has also been reported to be subject to large and inconsistent errors (Williams, 1977). Neither the advance setting of the ultramicrotome nor the evaluation of section thickness by observing the reflected light interference colour can be relied upon. Therefore the actual section thickness of sections for quantitative studies must be verified by measurement.

In conclusion, these quantitative data show that BeWo cells grow mainly by hyperplasia and provide baseline values for further studies. In addition, the results show that BeWo cell morphology has marked similarities to that reported for human trophoblast, making it a useful model for subsequent in vitro studies. Furthermore results of the present study reinforce the need to base conclusions on objective unbiased estimates rather than traditional model-based methods.


Abaidoo, C. S. & Warren, M. A. Morphological And Behavioural Features Of BeWo Cells Grown On Matrigel Offers A Model For Human Cytotrophoblast Cells During Early Implantation. J. of Science and Technology, 28(1):4-16, 2008. [ Links ]

Akbar, G. N. K. A quantitative histological study on the brain morphology of rats reared artificially and subjected to different environmental conditions. Ph.D Thesis. The University of Sheffield, 1991. [ Links ]

Aplin, J. D. The cell biology of human implantation. Placenta, 17(5-6):269-75, 1996. [ Links ]

Bauer, J. Gries, W. & Bahmer, F. A. Volume estimation of multicellular colon carcinoma spheroids using Cavalieri's principle. Pathol. الدقة. Pract., 191(12):1192-7, 1995. [ Links ]

Bedi, K. S. A simple method of measuring the thickness of semi-thin and ultra-thin sections. J. Microsc., 148(1): 107-12, 1987. [ Links ]

Calverley, R. K. S. Bedi, K. S. & Jones, D. G. Estimation of the numerical density of synapses in rat neocortex. J. نيوروسسي. Methods, 23:195-205, 1988. [ Links ]

Castellucci, M. Classen-Linke, I. Mülhauser, J. Kaufmann, P. Zardi, L. & Chiquet-Ehrismann, R. The human placenta: a model for tenascin expression. Histochemistry, 95(5):449-58, 1991. [ Links ]

DeHoff, R. T. & Rhines, F. N. Determination of the number of particles per unit volume from measurements made on random plane sections: the general cylinder and the and the ellipsoid. أكون. إنست. دقيقة. and Met. Eng., 221:975-96, 1961. [ Links ]

Erlichman, C. & Tannock, I. F. Growth and characterization of multicellular tumor spheroids of human bladder carcinoma origin. In vitro Cell Dev. Biol., 22:449-56, 1986. [ Links ]

Frank, H. G. Morrish, D. W. Pötgens, A. Genbacev, O. Kumpel, B. & Caniggia, I. Cell culture models of human trophoblast: primary culture of trophoblast--a workshop report. Placenta, 22:S107-9, 2001. [ Links ]

Genbacev, O. Schubach, S. A. & Miller, R. K. Villous culture of first trimester human placenta-model to study extravillous trophoblast (EVT) differentiation. Placenta, 13:439-61, 1992. [ Links ]

Genbacev, O. Jensen, K. D. Powlin, S. S. & Miller, R. K. In vitro differentiation and ultrastructure of human extravillous trophoblast (EVT) cells. Placenta, 14:463-75, 1993. [ Links ]

Goldstein, D. J. & Hartmann-Goldstein, L. J. Accuracy and precision of a scanning and integrating microinterferometer. J. Microsc., 102:143-64, 1974. [ Links ]

Grümmer, R. Hohn, H. P. & Denker, H.W. Choriocarcinoma cell spheroids: an in vitro model for the human trophoblast. Trophoblast. Res., 4:97-111, 1990. [ Links ]

Grümmer, R. Hohn, H. P. Mareel, M. M. & Denker, H. W. Adhesion and invasion of three human choriocarcinoma cell lines into human endometrium in a three-dimensional organ culture system. Placenta, 15(4):411-29, 1994. [ Links ]

Gundersen, H. J. G. Notes on the estimation of the numerical density of arbitrary profiles: the edge effect. J. Microsc., 111:219-223, 1977. [ Links ]

Gundersen, H. J. Stereology of arbitrary particles. A review of unbiased number and size estimators and the presentation of some new ones, in memory of William R. Thompson. J. Microsc., 143:3-45, 1986. [ Links ]

Hermes, C. Azevedo, J. F. Araujo, E. J. A. & Santana, D. M. G. Intestinal Ascending Colon Morphometrics in Rats Submitted to Severe Protein Malnutrition. كثافة العمليات J. Morphol., 26(1):5-11, 2008. [ Links ]


Abaidoo, C. S. Warren, M. A. Andrews, P. W. & Boateng, K. A. A quantitative assessment of the morphological characteristics of BeWo cells as an in vitro model of human trophoblast cells. كثافة العمليات J. Morphol., 28(4):1047-1058, 2010. [ Links ]

Hertz, R. Choriocarcinoma of women maintained in serial passage in hamster and rat. بروك. شركة إكسب. بيول. Med., 102:77-80, 1959. [ Links ]

Irving, J. A. Lysiak, J. J. Graham, C. H. Hearn, S. Han, V. K. & Lala, P. K. Characteristics of trophoblast cells migrating from first trimester chorionic villus explants and propagated in culture. Placenta, 16(5):413-33, 1995. [ Links ]

Junqueira, L. C. Carneiro, J. & Kelley, R. O. Basic Histology. 7th ed. Norwalk, Appleton and Lange, 1992. pp.25-6. [& # 160 روابط & # 160]

Ladekarl, M. Jensen, V. & Nielsen, B. Total number of cancer cell nuclei and mitoses in breast tumors estimated by the optical disector. شرجي. كمية. Cytol. Histol., 19(4):329-37, 1997. [ Links ]

Landry, J. A. Freyer, J. P. & Sutherland, R. M. A model for the growth of multicellular spheroids. Cell Proliferation, 15:585-94, 1982. [ Links ]

Mayhew, T. M. Mwamengele, G. L. M. & Dantzer, V. Comparative morphometry of the mammalian brain: estimates of cerebral volumes and cortical surface areas obtained from macroscopic slices. J. Anat., 172:191-200, 1990. [ Links ]

Mayhew, T. M. The new stereological methods for interpreting functional morphology from slices of cells and organs. إكسب. Physiol., 76:639-65, 1991. [ Links ]

Mayhew, T. M. Wadrop, E. & Simpson, R. A. Proliferative versus hypertrophic growth in tissue subcompartments of human placental villi during gestation. J. Anat., 184:535-43, 1994. [ Links ]

Mori, H. & Christensen, K. Morphometric analysis of Leydig cells in the normal rat testis. J. Cell Biol., 84:340-54, 1980. [ Links ]

Ohno, S. Morphometry for determination of size distribution of peroxisomes in thick sections by high voltage electron microscopy. In: studies of section thickness. J. Electron Microsc., 29:230-5, 1980. [ Links ]

Okudaria, Y. Matsui, Y. & Kanoh, H. Morphological variability of human trophoblasts in normal and neoplastic conditions. In: Soma, H. (Ed). Placenta: Basic Research for Clinical Application. International conference on Placenta, Tokyo, Basel - Karger, 1991. pp.171-87. [& # 160 روابط & # 160]

Pattillo, R. A. & Gey, G. O. The establishment of a cell line of human hormone-synthesizing trophoblastic cells in vitro. Cancer Res., 28:1231-6, 1968. [ Links ]

Pattillo, R. A. Gey, G. O. Delfs, E. Huang, W. Y. Hause, L. Garancis, J. Knoth, M. Amatruda, J. Bertino, J. Friesen, H. G. & Mattingly, R. F. The hormone-synthesizing trophoblastic cell in vitro: A model for cancer research and placental hormone synthesis. آن. N. Y. Acad. Sci., 172:288-98, 1971. [ Links ]

Simpson, R. A. Mayhew, E. & Barnes, P. R. From 13 weeks to term, the trophoblast of human placenta grows by the continous recruitment of new proliferative units: A study of nuclear number using the Disector. Placenta, 13:501-12, 1992. [ Links ]

Soranzo, D. C. Della Torre, G. & Ingrosso, A. Formation growth and morphology of multicellular tumor spheroids from human colon carcinoma cell line (LoVo). Tumori., 72:459-67, 1986. [ Links ]

Sterio, D. C. The unbiased estimation of the number and sizes of arbitrary particles using the disector. J. Microsc., 134:127-36, 1984. [ Links ]

Warren, M. A. & Bedi, K. S. A quantitative assessment of the development of synapses and neurons in visual cortex of control and undernourished rats. J. كومب. Neurol., 227:104-8, 1984. [ Links ]

Warren, M. A. Simple morphometry of the nervous system. In: Quantitative methods in neuroanatomy. Stewart, M. G. (Ed). England, Chichester, 1992. pp.211-47. [& # 160 روابط & # 160]

Waseem, N. & Lane, D. P. Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Structural conservation and the detection of a nucleolar form. J. Cell Sci., 96:121-9, 1990. [ Links ]

Weibel, E. R. Stereological Methods. New York, Academic Press, 1979. [ Links ]

West, M. J. & Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the number of neurons in the human hippocampus. J. كومب. Neurol., 296:1-22, 1990. [ Links ]

White, T. E. Saltzman, R. A. Di Sant'Agnese, P. A. Keng, P. C. Sutherland, R. M. & Miller, R. K. Human choriocarcinoma (Jar) cells grown as multicellular spheroids. Placenta, 9(6):583-98, 1988. [ Links ]

Weibe, B. M. & Laursen, H. Human lung volume, alveolar surface area, and capillary length. مجهر. الدقة. Tech., 32(3):255-62, 1995. [ Links ]

Williams, M. A. Quantitative methods in biology. In: Practical Methods in Electron Microscopy. Glauert, A. M. (Ed.). Amsterdam, North-Holland, 1977. [ Links ]

Yuhas, J. M. & Li, A. P. Growth fraction as the major determinant of multicellular tumor spheroid growth rates. Cancer Res., 38:1528-32, 1978. [ Links ]

Dr. Chrissie Stansie Abaidoo
Department of Anatomy
School of Medical Sciences
Kwame Nkrumah University of Science and Technology
Kumasi
GHANA

Received: 01-06-2010
Accepted: 23-09-2010

/> Todo o conteúdo deste periódico, exceto onde está identificado, está licenciado sob uma Licença Creative Commons


شاهد الفيديو: شرح أداة تحليل المسافة المعيارية Standard Distance في Arc map (كانون الثاني 2022).