معلومة

متى يجب استخدام التثبيت بالتبريد والتثبيت الكيميائي؟


نحن نعلم أن التقنية المستخدمة في تحضير عينة TEM تتضمن خطوات متعددة ، من أهمها التثبيت.

يمكن أن يكون التثبيت من نوعين:

  1. التثبيت بالتبريد ، الذي يشير إلى أن العينة تتعرض لدرجة حرارة متجمدة للحفاظ على المادة الحية للخلية قبل أن نلاحظها.

  2. يتضمن التثبيت الكيميائي استخدام مواد كيميائية معينة ، مثل الفورمالين ، والجلوتارالدهيد ، وما إلى ذلك لنفس الغرض تقريبًا.

والسؤال متى يجب استخدام واحد منهم فقط؟ مثل ، التثبيت بالتبريد أو التركيب الكيميائي؟ في بعض الحالات ، هل احتاج الباحثون إلى استخدام كلتا الطريقتين في نفس الوقت؟


عادةً ما يحافظ التثبيت بالتبريد على العضيات داخل الخلايا بشكل أفضل ، ولكنه يتطلب مزيدًا من العمل وينتج عنه عادةً صور TEM ذات تباين أقل. التثبيت الكيميائي أسهل ويعطي تباينًا جيدًا ، ولكن من المرجح أن يدمر التفاصيل في العينات الدقيقة. عادةً ما يتم استخدام التثبيت الكيميائي ما لم يتم العثور عليه أو من المتوقع ألا يعمل بشكل جيد لعينة معينة. من الممكن خلط الطرق ، على سبيل المثال عن طريق تضمين الجلوتارالدهيد في حلول استبدال التجميد. فيما يلي مقال يصف كل ما سألت عنه بمزيد من التفصيل ، إذا كان بإمكانك الوصول إليه: مقارنة بين التثبيت بالتبريد مقابل التثبيت الكيميائي في التربة الطحالب الخضراء Jaagiella


طريقة واحدة للتثبيط بالتبريد والضوء المترابط ، والفحص المجهري الإلكتروني والتصوير المقطعي لأجنة الزرد

الزرد هو نظام فقاري قوي للدراسات الخلوية والنمائية. في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين طرق التجميد السريع ومعالجة أجنة الزرد للفحص المجهري الإلكتروني (EM). نوضح أنه في حالة عدم وجود تثبيت كيميائي أولي ، وبنية تحتية ممتازة ، والحفاظ على مضان البروتين الأخضر الفلوري (GFP) ، ووسم الذهب المناعي والتصوير المقطعي الإلكتروني ، يمكن الحصول عليها باستخدام تقنية واحدة تتضمن التجميد عالي الضغط والتضمين في راتنجات Lowicryl عند درجة حرارة منخفضة. بالإضافة إلى كونها أداة جديدة مهمة لبحوث الزرد ، فإن صيانة مضان GFP بعد التجميد السريع واستبدال التجميد ودمج الراتينج ستكون ذات استخدام عام للضوء المترابط و EM للعينات البيولوجية.

الزرد هو نظام نموذجي ممتاز لبيولوجيا الخلية والنمو. بالإضافة إلى قوة نظام الفقاريات هذا في الفحص الجيني 1 ، 2 ، فإن شفافية جنين الزرد جعلت منه نظامًا مثاليًا للفحص المجهري الضوئي الذي تم استخدامه بميزة كاملة لدراسة العمليات التشكلية أثناء التطور. يتم الآن استكمال الشاشات الجينية بشكل متزايد من خلال الأساليب الجينية العكسية ، لا سيما التي تنطوي على النهج القائمة على المورفولينو 3 ولكن في الآونة الأخيرة باستخدام نهج قوي قائم على نوكلياز إصبع الزنك 4 ، 5. تعد أجنة الزرد مثالية أيضًا للدراسات المجهرية الإلكترونية (EM) لدراسات مقطع عرضي واحد من جنين 72 ساعة يتم احتوائه بسهولة في قسم EM واحد ، ومع ذلك يمكن أن يحتوي على العديد من أنواع الخلايا والأنسجة المختلفة. ومع ذلك ، لا توفر الطرق التقليدية لـ EM الحفظ الأمثل لجميع الأنسجة وعادة ما تكون غير متوافقة مع الوسم المناعي وتصور البروتينات الموسومة الفلورية المعبر عنها. الاستثناء من ذلك هو طريقة Tokuyasu للتقطيع المجمدة ، ولكن عدم وجود الراتنج 6 ، مع توفير اكتشاف ممتاز للمستضد ، يكون أقل ملاءمة للحفاظ على الهياكل الكبيرة المملوءة بالسوائل ، مثل الحبل الظهري لجنين الزرد ، وهو هيكل أساسي وحيوي. هيكل الإشارات.

حتى وقت قريب ، تم إجراء معظم التحليلات الكهرومغناطيسية لأسماك الزرد باستخدام تقنيات قياسية تتضمن التثبيت الكيميائي. في هذه الدراسة ، كنا نهدف إلى تطوير تقنية تتجنب التثبيت الكيميائي ، مما سمح لنا باستخدام قوة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كعلامة الفلورسنت للفحص المجهري الضوئي ، مع السماح لنا أيضًا بربط الملاحظات المجهرية الضوئية مع immunogold EM على نفس الأقسام. من الناحية المثالية ، ستسمح لنا هذه التقنية أيضًا بإجراء التصوير المقطعي الإلكتروني ثلاثي الأبعاد (3D) على نفس الأقسام. نحن الآن نصف طريقة لتجميد الضغط العالي لجنين الزرد الذي يفي بهذه المعايير. الطريقة الموصوفة توفر البنية التحتية المحسنة على الطرق التقليدية. الأهم من ذلك ، باستخدام هذه الطريقة ، نظهر أن مضان GFP لا يزال محتفظًا به بعد استبدال التجميد (FS) وتضمين Lowicryl للأجنة المجمدة عالية الضغط (HPF). بالإضافة إلى اكتشاف البروتينات التي تحمل علامة GFP ، يمكن تسمية المستضدات الذاتية "في القسم" للكشف المجهري الضوئي والمسمى المناعي للكشف عن الكهرومغناطيسية في نفس الأقسام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الأقسام في التصوير المقطعي الإلكتروني.


إعداد عينة TEM

بالنسبة للفحص المجهري الإلكتروني للإرسال الروتيني (TEM) ، من المقبول عمومًا أن تكون العينات رقيقة وجافة وتحتوي على جزيئات تحيد الإلكترونات. كما أن العينات البيولوجية ، التي تكون كبيرة الحجم وتتكون من كميات كبيرة من الماء ، لا تشتت الإلكترونات وبالتالي يصعب رؤيتها في TEM. يعد تحضير العينات البيولوجية لـ TEM ، مع الحفاظ على التشكل الهيكلي للمادة ، تحديًا. ومع ذلك ، ظل الباحثون يبحثون في المواد البيولوجية لسنوات عديدة ، وهناك العديد من البروتوكولات التي تسمح لنا بالنظر إلى المواد البيولوجية بعدة طرق مختلفة. يوجد أدناه مخطط موجز لبعض الطرق الأكثر شيوعًا للنظر في العينات البيولوجية في TEM.

يتصاعد كله

يمكن فحص الأشياء الصغيرة أو الرفيعة جدًا مباشرة عن طريق تثبيتها على فيلم دعم وإدخالها مباشرة في شعاع الإلكترون. يتم توفير التباين من خلال ترسيب المعادن الثقيلة بإحدى الطرق الثلاث.

  1. تلطيخ إيجابي: الجسم ملطخ كيميائيًا بمحلول ملح معدني ويظهر داكنًا على خلفية ساطعة.
  2. تلطيخ سلبي: يبقى الجسم غير ملوث ولكنه مضمن في فيلم جاف من ملح المعدن الثقيل. تظهر العينة بضوء على خلفية مظلمة. تم استخدام طريقة التصور هذه على نطاق واسع في دراسة جزيئات الفيروس ولكنها مفيدة أيضًا لكسور الخلايا (مثل الحويصلات المغلفة). مزيد من التفاصيل يمكن العثور عليها هنا.
  3. التظليل: يتم ترسيب طبقة رقيقة من ذرات المعدن الثقيل على العينة عن طريق التبخر في غرفة مفرغة. التظليل من اتجاه واحد فقط ينتج صورة زائفة ثلاثية الأبعاد. يستخدم التظليل الدوراني ، حيث تكون العينة مغطاة بشكل موحد بالمعدن الثقيل ، لتصور الأحماض النووية والبروتينات.

تقطيع سامسونج

الأسلوب الأكثر شيوعًا لفحص المواد البيولوجية هو تضمين المادة قيد الدراسة في البلاستيك وقطع المقاطع الرقيقة جدًا التي يمكن فحصها في TEM. يتم تثبيت المادة عن طريق التثبيت الكيميائي (عادةً مع الألدهيدات مثل الفورمالديهايد أو الجلوتيرالديهيد) ، على النقيض من محاليل أملاح المعادن الثقيلة (رابع أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل) ، والمجففة في الإيثانول أو الأسيتون ، ومضمنة في البلاستيك (راتنجات الإيبوكسي). المقاطع الرقيقة (60 نانومتر) المقطوعة بالسكاكين الزجاجية أو الماسية باستخدام جهاز فائق الدقة تطفو على الماء ، وتُنقل إلى شبكات دعم العينات وتُفحص في TEM. غالبًا ما تتم مقارنة الأقسام مع أسيتات اليورانيل وسيترات الرصاص قبل الفحص بالمجهر.

في بعض الحالات ، يمكن تمييز الجزيئات الكبيرة على وجه التحديد قبل التضمين والتقسيم. على سبيل المثال ، يمكن تصور موقع بعض الإنزيمات عن طريق احتضان الأنسجة مع ركيزة يؤدي تفاعلها مع الإنزيم إلى الترسب الموضعي لمواد إلكترون معتمة. بالتناوب ، يمكن أن تقترن الأجسام المضادة بمثل هذه الإنزيمات ، ويتم استخدام منتج التفاعل المعتم للإلكترون لتحديد المستضدات التي تتعرف عليها الأجسام المضادة. تم تصميم بعض الراتنجات المتضمنة (على سبيل المثال راتنجات Lowicryl و LR White resin) لتمكين الأجسام المضادة وعلامات الإلكترون المعتم (مثل جزيئات الذهب الغروية) ليتم تطبيقها على الأقسام فائقة الرقة. بهذه الطريقة ، يمكن توطين المستضدات تحت الخلوية التي تتعرف عليها الأجسام المضادة باستخدام TEM.

تقنية التقسيم الأخرى التي تزداد شعبيتها هي التقطيع بالتبريد (تقطيع المواد المزججة والمجمدة). بعد التثبيت الكيميائي ، يتم غمر الأنسجة في مادة واقية من التجمد (عادة السكروز) ثم يتم تجميدها بسرعة في النيتروجين السائل. يسمح الواقي بالتبريد بتجميد المواد البيولوجية دون تكوين بلورات الجليد ، مما قد يؤدي إلى إتلاف البنية التحتية. هذا النوع من التجميد ، أو التزجيج ، ممكن في غياب المواد الواقية من التجميد ولكنه يتطلب الكثير من الناحية الفنية. يمكن إذابة المقاطع المقطوعة من الكتلة المزججة واحتضانها بأجسام مضادة خاصة بمولدات المضادات تحت الخلوية. تسمح علامات الإلكترون المعتمة برؤية الأجسام المضادة في TEM.

تم استخدام الذهب الغرواني المقترن بالبروتين A (بروتين من جدران الخلايا البكتيرية والذي يرتبط بجزء Fc من بعض الغلوبولين المناعي) على نطاق واسع في السنوات الأخيرة لتوطين الأجسام المضادة في الراتينج والأجزاء المجمدة من المواد البيولوجية. مكنت القدرة على إنتاج مجموعات متجانسة من الذهب الغروي بأحجام جزيئات مختلفة الباحثين من استخدام هذه المجسات لتجميع الهياكل المختلفة في نفس القسم.

التثبيت بالتبريد

من الممكن تجميد المواد البيولوجية بالسرعة الكافية لتزجيج الماء الموجود داخل الخلايا. يحدث تزجيج الماء عندما يحدث التجمد بسرعة كبيرة بحيث لا يكون لدى بلورات الجليد وقت للتكون. يمكن تقسيم المواد البيولوجية المزججة في درجات حرارة منخفضة. يمكن فحص الأغشية الرقيقة من الماء المزجج وأجزاء من مادة مزججة في مجاهر إلكترونية للإرسال مزودة بمراحل عينات يمكن حفظها باردة.

طرق التجميد السريع

هناك سبع طرق رئيسية للتجميد السريع متاحة حاليًا. هم انهم:

  1. تجميد الغمر - تغرق العينة في المبرد.
  2. تجميد (أو مرآة معدنية) - تتأثر العينة على سطح معدني مصقول مبرد بالنيتروجين السائل أو الهيليوم.
  3. تجميد الكتلة الباردة - كتلتان معدنيتان مصقولتان باردتان متصلتان بفكي زوج من الكماشة ، يضغطان على العينة.
  4. تجميد الرذاذ - يتم إطلاق رذاذ دقيق من العينة في المعلق السائل في المبرد (البروبان السائل عادة).
  5. التجميد النفاث - يتم رش نفاثة من كريوجين سائل على العينة. - تجميد العينة تحت ضغط عالٍ لتبريد الماء.
  6. تجميد الاستئصال - يتم غرس إبرة باردة في العينة ، وفي نفس الوقت يتم تجميد العينة وتشريحها.

كسر التجميد متبوعًا بحفر التجميد والنسخ المتماثل

إذا ، لسبب ما ، لا يمكن فحص الكائن المراد دراسته في TEM ، فيمكن عمل نسخة طبق الأصل رقيقة. يتم ذلك عادةً عن طريق تبخير طبقة رقيقة من معدن ثقيل (عادةً بلاتينيوم) على العينة ثم طلاءها بطبقة رقيقة من الكربون. يتم فصل الكائن والنسخة المتماثلة إما عن طريق الطفو بعيدًا عن النسخة المتماثلة أو عن طريق هضم الكائن بعيدًا. هناك أربع خطوات أساسية يجب اتباعها

  1. يتم تجميد العينة (غالبًا بغض النظر عن التزجيج).
  2. العينة مكسورة ، بينما لا تزال مجمدة ، تحت التفريغ.
  3. يمكن بعد ذلك حفر العينة المكسورة عن طريق تركها مجمدة وتحت فراغ. اعتمادًا على وقت التعرض ، تسامي المياه أكثر أو أقل من العينة (التجفيف بالتجميد).
  4. يتم عمل نسخة طبق الأصل من السطح المكسور والتي يتم فحصها بعد ذلك في المجهر الإلكتروني.

يستخدم التعديل الأخير لهذه الطريقة التجميد السريع الذي يتم تحقيقه عن طريق إغلاق الخلايا ضد كتلة نحاسية مبردة إلى -269 درجة مئوية بالهيليوم السائل. إذا تعرضت هذه الخلايا المجمدة بعد ذلك لتجفيف تجميد واسع النطاق (حفر عميق) ، يتم الكشف عن صور رائعة للغاية للبنى الداخلية للخلايا.


وكلاء التثبيت

هناك عدد من الكواشف التي يمكن استخدامها لإصلاح الأنسجة. الفورمالديهايد ، إلى حد بعيد العامل الأكثر شيوعًا المستخدم في التشريح المرضي والغلوتارالدهيد ، المستخدم على نطاق واسع في دراسات البنية التحتية التي تتطلب الفحص المجهري الإلكتروني ، موصوفة هنا. تمت مناقشة الكواشف الأخرى في الجزء 3.

الفورمالديهايد: الفورمالديهايد (CH2O) هو الألدهيد الغازي الوحيد ويتم إذابته في الماء حتى التشبع عند 37٪ - 40٪ وزن / حجم. يشار إلى هذا المحلول عمومًا باسم "الفورمالين" أو "محلول الفورمالديهايد المركز". للتثبيت ، يتم عادة تخفيف جزء واحد من الفورمالين بتسعة أجزاء من الماء أو المخزن المؤقت. ينتج عن هذا محلول فورمالين 10٪ يحتوي على حوالي 4٪ فورمالدهيد وزن / حجم ، وهو تركيز مثالي للتثبيت. يوجد الفورمالديهايد في المحاليل المركزة مثل مونوهيدرات ميثيلين جلايكول وكهيدرات بوليمرية منخفضة الوزن الجزيئي. في شكله المخفف ، تسود مونوهيدرات. يمكن ترسيب بارافورمالدهيد ، وهو شكل شديد البلمرة من الفورمالديهايد على شكل ترسب أبيض في محاليل الفورمالديهايد المركزة. لمنع ذلك ، يتم عادةً إضافة كميات صغيرة من الميثانول (تصل إلى 15٪) إلى الحلول المسجلة الملكية. يمكن شراء البارافورمالدهيد كمسحوق جاف واستخدامه لصنع محاليل نقية للغاية من الفورمالديهايد مثل تلك المطلوبة للفحص المجهري الإلكتروني. 2 ، 3

سوف يتأكسد الفورمالين غير المحشو ببطء إلى حمض الفورميك مما يؤدي إلى انخفاض الرقم الهيدروجيني. في ظل هذه الظروف ، يتفاعل حمض الفورميك مع الهيموجلوبين مكونًا حمض الفورمالديهايد الهيماتين ، وهو صبغة أثرية حبيبية بنية سوداء تترسب في الأنسجة الغنية بالدم. يعتبر هذا الصباغ مصدر إزعاج حيث يمكن الخلط بينه وبين الكائنات الحية الدقيقة أو الصبغات المرضية الأخرى. 4 على الرغم من أنه يمكن إزالة الصباغ من أقسام تحتوي على حمض بيكريك مائي مشبع قبل التلوين ، فمن الأفضل تجنب تكوينه في المقام الأول. لهذا السبب ، ولأن الفورمالديهايد يتفاعل بشكل أكثر فاعلية عند درجة حموضة محايدة ، فإن محلول الفورمالين بنسبة 10٪ يتم تخزينه عادةً إلى درجة حموضة 6.8 - 7.2.

الشكل 2: قسم بارافين ثابت بالفورمالين في الكلى يظهر الترسيب النموذجي لهيماتين الفورمالديهايد الحمضي (صبغة الفورمالين) المرتبط بخلايا الدم الحمراء. الصباغ بني إلى أسود اللون وهو ينكسر تحت الضوء المستقطب. في هذه الحالة ، ظلت العينة ثابتة لفترة طويلة قبل المعالجة.

يتفاعل الفورمالديهايد مع السلاسل الجانبية للبروتينات لتكوين مجموعات هيدروكسي ميثيل تفاعلية. يمكن أن تخترق البروتينات النووية والأحماض النووية وتثبيت قشرة البروتين الحمضي النووي وتعديل النيوكليوتيدات من خلال التفاعل مع المجموعات الأمينية الحرة. يمكن أن يتفاعل الفورمالديهايد مع بعض المجموعات في الدهون غير المشبعة خاصة إذا كانت أيونات الكالسيوم موجودة ، ولكنها تميل إلى أن تكون غير تفاعلية مع الكربوهيدرات. 5 يمكن أن يتفاعل الفورمالديهايد مع مجموعات على ليسين ، أرجينين ، سيستين ، تيروسين ، ثريونين ، سيرين وجلوتامين مكونة معقدات تفاعلية قد تتحد مع بعضها البعض مكونة جسور الميثيلين (روابط متقاطعة) أو مع مجموعات الهيدروجين. 5 من المقبول على نطاق واسع أن غسل الأنسجة بعد تثبيت الفورمالين يمكن أن يعكس بعض هذه التفاعلات ولكن لا تزال هناك روابط متقاطعة مهمة. 6 إن قدرة الفورمالديهايد على الحفاظ على ببتيدات البروتينات الخلوية هي التي جعلتها مفيدة جدًا كمثبت للأغراض العامة.

هناك مخاطر معروفة مرتبطة باستخدام الفورمالديهايد كمثبت من خلال الجلد أو ملامسة العين أو عبر الجهاز التنفسي. وهو مادة مهيجة ومسببة للتآكل وقد تسبب حساسية من الحساسية. اعتبارًا من عام 1981 ، تم إدراج الفورمالديهايد على أنه "من المتوقع بشكل معقول أن يكون مادة مسرطنة للإنسان" وفي عام 2011 تمت ترقية القائمة إلى "من المعروف أنها مادة مسرطنة للإنسان". أظهرت دراسات 7 ، 8 أن الفورمالديهايد يسبب سرطان الأنف والجيوب الأنفية وسرطان الدم النخاعي. لهذه الأسباب ، توجد في معظم البلدان إرشادات صارمة للحد من تعرض العمال للفورمالديهايد في مكان العمل. على سبيل المثال في الولايات المتحدة الأمريكية ، يبلغ حد التعرض المسموح به لـ OSHA (PEL) 0.75 جزء في المليون (8 ساعات TWA) وحد التعرض قصير المدى (STEL) بمقدار 2 جزء في المليون (15 دقيقة من التعرض) ويتم دعم هذه التوصيات من خلال برنامج مراقبة منتظم. يجب عدم تجاوز هذه المستويات المستهدفة في المختبر المجهز تجهيزًا جيدًا بمعدات شفط الدخان الحديثة. 9 ، 10

على الرغم من المخاطر في استخدام الفورمالديهايد ، فقد بنى معظم علماء التشكل معرفتهم بالأنسجة الطبيعية والمريضة من خلال النظر في عينات الفورمالين الثابتة. نظرًا لأننا ندرك الآن المخاطر السامة لهذا الكاشف ، فقد سعت العديد من المعامل ولا تزال تبحث عن بديل أكثر أمانًا. ومع ذلك ، يتم الحكم على بدائل الفورمالين عمومًا على أساس قدرتها على إنتاج صورة مورفولوجية مماثلة ، إن لم تكن أفضل ، من تلك التي ينتجها الفورمالين وتسمح بمجموعة كاملة من طرق التلوين بما في ذلك الطرق الجزيئية وتكون رخيصة بنفس القدر. تستمر معظم المعامل في استخدام الفورمالين لأنها لا تستطيع العثور على بديل مُرضٍ تمامًا لذلك من المهم أن يكون الموظفون على دراية بالمخاطر التي تنطوي عليها. تمت مناقشة بعض بدائل الفورمالديهايد في الجزء الثالث.

جلوتارالدهيد: الجلوتارالدهيد أو الديال الجلوتاريك (CHO (CHO2)3CHO) يعتبر ألدهيد ثنائي الوظيفة ، يمتلك مجموعات ألدهيد في طرفي الجزيء والتي لديها القدرة على التفاعل مع نفس المجموعات الكيميائية مثل الفورمالديهايد. سوف يشكلون مركبات إضافية وجسور الميثيلين ولكن أيضًا جزيء الجلوتارالدهيد المفرد قد يشكل روابط متقاطعة مباشرة إذا كان الترتيب الفراغي للببتيدات المجاورة يسمح بذلك. المجموعات الأمينية من اللايسين لها أهمية خاصة في هذا الصدد. ستكون الأنسجة المثبتة في الجلوتارالدهيد أكثر ارتباطًا من الأنسجة المثبتة في الفورمالين وستحتوي أيضًا على بعض مجموعات الألدهيد غير المتفاعلة والتي ، ما لم يتم حظرها كيميائيًا ، يمكن أن تتسبب في تلطيخ الخلفية بطرق مثل PAS. يؤثر الارتباط المتقاطع الواسع سلبًا على تلطيخ الكيمياء المناعية ولكنه يوفر حماية ممتازة للبنية التحتية مما يفسر استخدامه المكثف كمثبت أساسي للفحص المجهري الإلكتروني. تفاعلات الارتباط المتقاطعة للجلوتارالدهيد لا رجعة فيها إلى حد كبير. يخترق الجلوتارالدهيد ببطء شديد ويوصى بأن يكون سمك الأنسجة أقل من 1 مم في بعد واحد على الأقل. 5 ، 11

سوف يتحلل الجلوتارالدهيد ببطء ليشكل حمض الجلوتاريك وسوف يتبلمر أيضًا لتشكيل مركبات دورية وقليلة القسيمات. لذلك من الأفضل الحصول على الجلوتارالدهيد في أمبولات محكمة الغلق في شكل مناسب "مثبت للفحص المجهري الإلكتروني" ويمكن إضافته إلى مخزن مؤقت مناسب عند درجة الحموضة 7.2 - 7.4 (عادةً كاكوديلات ، فوسفات أو ماليات) لإنتاج تركيز جلوتارالدهيد بنسبة 3٪ للاستخدام. بالنسبة للفحص المجهري الإلكتروني ، عادةً ما يتبع التثبيت الأولي للجلوتارالدهيد التثبيت الثانوي في رابع أكسيد الأوزميوم. لا يستخدم الجلوتارالدهيد عادة في التشريح المرضي الروتيني. 11


مسحة أو خلايا: التحضير والتثبيت

قبل التلوين ، قم بإصلاح المادة المراد ملاحظتها فوق الشريحة. إذا لم يتم تثبيت التحضير أو لصقها فوق الشريحة ، يتم غسل الخلايا أثناء إجراء التلوين.

تحضير المسحة:

ضع قطرة صغيرة من المزرعة السائلة مع حلقة التلقيح على شريحة نظيفة. إذا كانت الثقافة مأخوذة من وسط صلب. ضع قطرة صغيرة من الماء على الشريحة وامزج معها جيدًا قدرًا صغيرًا من الثقافة. انشر القطرة على الشريحة بشكل موحد لتشكيل طبقة رقيقة من الخلايا. يُطلق على هذا الغشاء الرقيق من الخلايا مسحة والتي يجب أن تكون موحدة قدر الإمكان.

تثبيت الخلايا (مسحة) على الشرائح:

بعد تحضير اللطاخة المنتظمة ، يجب تثبيتها أو لصقها فوق الشريحة. التثبيت هو العملية التي يتم من خلالها الحفاظ على الهياكل الداخلية والخارجية للخلايا والكائنات الدقيقة وتثبيتها في موضعها. إنه يثبط نشاط الإنزيمات التي تعطل شكل الخلايا الليلي وصلابة هياكل الخلايا بحيث لا تتغير أثناء التلوين والمراقبة.

عادة ما يتم قتل الخلية وإلزامها بالانزلاق أثناء الملاحظة المجهرية.

يتم تثبيت الخلية الميكروبية بطريقتين:

التثبيت الحراري أو التثبيت الكيميائي. يستخدم التثبيت الحراري بشكل روتيني لمراقبة بدائيات النوى. يتم تسخين غشاء الخلية بلطف عندما تمر الشريحة عبر اللهب. يحافظ التثبيت الحراري على جميع الأشكال المورفولوجية ولكن ليس الهياكل داخل الخلية. يستخدم التثبيت الكيميائي لحماية البنية التحتية الخلوية الدقيقة ومورفولوجيا الكائنات الدقيقة الكبيرة والحساسة.

تخترق المثبتات الكيميائية الخلية وتتفاعل مع المكونات الخلوية ، عادة البروتينات والدهون لجعلها غير نشطة. يحتوي خليط التثبيت الشائع على الإيثانول وحمض الخليك وكلوريد الزئبق والفورمالديهايد والغلوتارالدهيد.


مراجع

  1. الإلتوم الأول ، فريدنبرغ جيه ، مايرز آر بي ، جريزل وي. مقدمة في نظرية وممارسة تثبيت الأنسجة. ي هيستوتكنول 200124173 -190.
  2. ليونغ AS-Y. التثبيت والمثبتات. في Woods AE و Ellis RC eds. التشريح المرضي للمختبر. نيويورك: تشرشل ليفينجستون ، 19944.1-1 - 4.1-26.
  3. Hopwood D. التثبيت والمثبتات. في Bancroft J و Stevens A eds. نظرية وممارسة التقنيات النسيجية. نيويورك: تشرشل ليفينجستون ، 1996.
  4. كارسون فلوريدا. تقنية النسيج. الطبعة الثانية. شيكاغو: ASCP Press ، 2007.
  5. تيتفورد مي ، هورينشتاين إم جي. التقييم النسيجي لمثبتات بدائل الفورمالين في علم الأمراض الجراحي التشخيصي. قوس باثول لاب ميد 2005129502-506.
  6. Kothmaier H ، Rohrer D ، Stacher E ، Quehenberger F ، Becker K-F ، Popper HH. مقارنة بين مثبتات الأنسجة الخالية من الفورمالين: دراسة بروتينية تختبر تطبيقها في علم الأمراض الروتيني والبحوث. قوس باثول لاب ميد 2011135744-752.

يخضع محتوى Leica Biosystems Knowledge Pathway لشروط استخدام موقع Leica Biosystems على الويب ، والمتوفر على: إشعار قانوني. الغرض من المحتوى ، بما في ذلك الندوات عبر الإنترنت والعروض التقديمية التدريبية والمواد ذات الصلة ، هو توفير معلومات عامة بشأن مواضيع معينة تهم متخصصي الرعاية الصحية ولا يُقصد منها ولا ينبغي تفسيرها على أنها استشارة طبية أو تنظيمية أو قانونية. تعكس الآراء والآراء المعبر عنها في أي محتوى تابع لجهة خارجية الآراء والآراء الشخصية للمتحدث (المتحدثين) / المؤلف (المؤلفين) ولا تمثل بالضرورة آراء أو آراء Leica Biosystems أو موظفيها أو وكلائها أو تعكسها. يتم توفير أي روابط مضمنة في المحتوى والتي توفر الوصول إلى موارد أو محتوى طرف ثالث للتسهيل فقط.

لاستخدام أي منتج ، يجب الرجوع إلى وثائق المنتج المعمول بها ، بما في ذلك أدلة المعلومات والإدخالات وأدلة التشغيل. تتنصل Leica Biosystems والمحررين بموجب هذا من أي مسؤولية تنشأ بشكل مباشر أو غير مباشر عن استخدام المحتوى ، بما في ذلك أي عقاقير أو أجهزة أو تقنيات أو إجراءات موصوفة في المحتوى.

حقوق النشر © 2021 لشركة Leica Biosystems التابعة لشركة Leica Microsystems، Inc. والشركات التابعة لها في Leica Biosystems. كل الحقوق محفوظة. LEICA وشعار Leica علامتان تجاريتان مسجلتان لشركة Leica Microsystems IR GmbH.


الملخص

يعد قياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي لوقت الرحلة (TOF-SIMS) أداة واعدة للتحليل الكيميائي تحت الخلوي للخلايا البيولوجية. ومع ذلك ، للحصول على المعلومات ذات الصلة ، فإن الطريقة المستخدمة لتحضير العينة أمر بالغ الأهمية. في هذا العمل ، استخدمنا TOF-SIMS ، والفحص المجهري الإلكتروني (SEM) ، والمجهر الانعكاسي للتداخل (IRM) لدراسة آثار طرق التثبيت والتجفيف المختلفة على التشكل والتركيب الكيميائي لخلايا الخلايا الليفية البشرية (hTERT) الملتصقة بها. سطح السيليكون. على وجه التحديد ، تم فحص طريقتين للتثبيت (التثبيت الكيميائي مع الجلوتارالدهيد والتثبيت بالتبريد عن طريق التجميد الغاطس) وتقنيتي التجفيف (التجفيف بالتجميد والتجفيف البديل للكحول). تم تحديد التثبيت بالتبريد متبوعًا بالتجفيف بالتجميد لإنتاج خلايا مجففة ذات شكل خلوي محفوظ وأغشية خلوية سليمة وتدرجات تركيز أيون الصوديوم / البوتاسيوم المحتفظ بها عبر غشاء البلازما. بغسل العينات في محلول مائي من فورمات الأمونيوم (AF) قبل التثبيت بالتبريد ، يمكن منع تراكم الأملاح على سطح العينة أثناء التجفيف. أظهرت قياسات IRM أنه تم الحفاظ على مورفولوجيا الخلية أثناء الغسيل باستخدام فورمات الأمونيوم ، على الرغم من حدوث بعض التورم. مقارنة بالتثبيط بالتبريد ، أظهرت الخلايا المثبتة بالجلوتارالدهيد هياكل أدق على سطح الخلية في SEM وتوزيعات دهنية مماثلة في TOF-SIMS ، لكن لم يتم الاحتفاظ بتدرجات أيونات الصوديوم / البوتاسيوم. تم تحديد تجفيف الكحول لإزالة الفسفوليبيدات من غشاء الخلية بشكل كبير ، على الرغم من أن استخدام رباعي أكسيد الأوزميوم كمادة مثبتة لاحقة قد أدى إلى تقليل هذا التأثير.


الملخص

يعد قياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي لوقت الرحلة (TOF-SIMS) أداة واعدة للتحليل الكيميائي تحت الخلوي للخلايا البيولوجية. ومع ذلك ، للحصول على المعلومات ذات الصلة ، فإن الطريقة المستخدمة لتحضير العينة أمر بالغ الأهمية. في هذا العمل ، استخدمنا TOF-SIMS ، والفحص المجهري الإلكتروني (SEM) ، والمجهر الانعكاسي للتداخل (IRM) لدراسة آثار طرق التثبيت والتجفيف المختلفة على التشكل والتركيب الكيميائي لخلايا الخلايا الليفية البشرية (hTERT) الملتصقة بها. سطح السيليكون. على وجه التحديد ، تم فحص طريقتين للتثبيت (التثبيت الكيميائي مع الجلوتارالدهيد والتثبيت بالتبريد عن طريق التجميد الغاطس) وتقنيتي التجفيف (التجفيف بالتجميد والتجفيف البديل للكحول). تم تحديد التثبيت بالتبريد متبوعًا بالتجفيف بالتجميد لإنتاج خلايا مجففة ذات شكل خلوي محفوظ وأغشية خلوية سليمة وتدرجات تركيز أيونات الصوديوم / البوتاسيوم المحتجزة عبر غشاء البلازما. بغسل العينات في محلول مائي من فورمات الأمونيوم (AF) قبل التثبيت بالتبريد ، يمكن منع تراكم الأملاح على سطح العينة أثناء التجفيف. أظهرت قياسات IRM أنه تم الحفاظ على مورفولوجيا الخلية أثناء الغسيل باستخدام فورمات الأمونيوم ، على الرغم من حدوث بعض التورم. مقارنة بالتثبيط بالتبريد ، أظهرت الخلايا المثبتة بالجلوتارالدهيد هياكل أدق على سطح الخلية في SEM وتوزيعات دهنية مماثلة في TOF-SIMS ، لكن لم يتم الاحتفاظ بتدرجات أيونات الصوديوم / البوتاسيوم. تم تحديد تجفيف الكحول لإزالة الفسفوليبيدات من غشاء الخلية بشكل كبير ، على الرغم من أن استخدام رباعي أكسيد الأوزميوم كمادة مثبتة لاحقة قد أدى إلى تقليل هذا التأثير.


أهمية التثبيت

الهدف العام من تثبيت الأنسجة هو الحفاظ على الخلايا ومكونات الأنسجة في "حالة شبيهة بالحياة" والقيام بذلك بطريقة تسمح بإعداد أقسام رقيقة وملطخة. 1 بالطبع أثناء التثبيت والخطوات التالية تحدث تغييرات جوهرية في تكوين ومظهر مكونات الخلايا والأنسجة وهي بعيدة كل البعد عن "الحالة الشبيهة بالحياة" المثالية. ومع ذلك ، مع الحرص ، يمكننا إنتاج خصائص كيميائية وفيزيائية متسقة في أقسام الأنسجة والتي تسمح بملاحظة الأنماط والتغيرات المورفولوجية والكيميائية التي يجب ملاحظتها وإجراء المقارنات. تتيح لنا هذه الملاحظات رؤية بيئة ديناميكية دائمة التغير "ثابتة" في نقطة زمنية معينة 2 ، وقد تمكننا من تشخيص الأنسجة المرضية.

لأغراض عملية ، يهدف التثبيت إلى منع أو إيقاف العمليات التنكسية التي تبدأ بمجرد حرمان الأنسجة من إمدادها بالدم. التحلل الذاتي ، الذي ينتج عنه هضم الأنسجة عن طريق الإنزيمات داخل الخلايا التي يتم إطلاقها عند تمزق أغشية العضية ، والتحلل البكتيري أو التعفن الناجم عن الكائنات الحية الدقيقة التي قد تكون موجودة بالفعل في العينة ، هي عمليات يجب منعها. يجب تجنب فقد وانتشار المواد القابلة للذوبان قدر الإمكان عن طريق الترسيب أو التخثر لهذه المكونات أو عن طريق ربطها بمكونات هيكلية أخرى غير قابلة للذوبان. يجب حماية الأنسجة إلى حد كبير من الآثار الضارة لمعالجة الأنسجة بما في ذلك التسلل بالشمع الساخن ، ولكن الأهم من ذلك ، يجب أن تحتفظ الأنسجة بالتفاعل مع البقع والكواشف الأخرى بما في ذلك الأجسام المضادة ومجسات الحمض النووي. 1 ، 2

من المهم أن ندرك أن المثبت سينتج في البداية عددًا من التغييرات على الأنسجة في بيئة مائية عادة. سيشمل ذلك انكماش وتورم وتصلب المكونات المختلفة. على الرغم من هذه التأثيرات الأولية ، ستخضع الأنسجة لمزيد من التغييرات أثناء المعالجة عندما يتم وضعها في بيئة غير مائية. 2 على سبيل المثال التثبيت في الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ يسبب في البداية تورمًا طفيفًا في عينات الأنسجة. أثناء المعالجة ولكن قد تتقلص العينة بنسبة 20٪ - 30٪ من حجمها. 3 سيؤثر المثبت المعين المستخدم أيضًا على درجة تلطخ العناصر الفردية بمختلف الكواشف الكيميائية النسيجية والكيميائية النسيجية المناعية. 4 وبالتالي يجب تقييم التأثير الكلي على أنسجة مثبت معين بعد معالجة الأنسجة وتقطيعها وتلطيخها لإظهار العناصر المطلوبة.

الشكل 1: قسم من البرافين في الكلى تم إصلاحه باستخدام الفورمالين المخزن المحايد. هذا مثال على أنسجة ثابتة جيدًا تُظهر مورفولوجيا نووية وحشوية جيدة مع الحد الأدنى من الانكماش الذي يظهر أغشية قاعدية وهوامش خلوية محددة بوضوح.
الشكل 2: قسم بارافين في الكلى تم إصلاحه باستخدام الفورمالين المخزن المحايد. هذا مثال على الأنسجة الضعيفة التي تظهر التشكل النووي والهيولي السفلي مع الانكماش المفرط وهوامش الخلية غير المحددة بشكل جيد. لاحظ فجوة وتفتيت كل من النواة والسيتوبلازم لخلايا النبيبات البعيدة وانكماش الكبيبة بسبب الانكماش.

مراجع

Acetarin JD، Carlemalm E، Villiger W (1986) تطورات من راتنجات Lowicryl الجديدة لدمج العينات البيولوجية في درجات حرارة منخفضة حتى. J Microsc 143: 81-88

Adrian M ، Dubochet J ، Lepault J ، McDowall AW (1984) الفحص المجهري الإلكتروني للفيروسات. طبيعة 308: 32-36

العمودي أ ، تشانغ جيه ، ليفورستر أ ، ماكدوال أ ، سالامين إل إم ، نورلين إل بي ، ريختر ك ، بلان إن إس ، ستودر د ، دوبوشيت جي (2004) الفحص المجهري الإلكتروني للأقسام الزجاجية. Embo J 23: 3583–3588

Al-Amoudi A، Dubochet J، Norlen L (2005a) البنية النانوية للفضاء خارج الخلية للبشرة كما لوحظ بالفحص المجهري الإلكتروني للجلد الزجاجي من جلد الإنسان. J إنفست ديرماتول 124: 764-777

العمودي أ ، ستودر د ، دوبوشيت ج (2005 ب) قطع المصنوعات اليدوية وعملية القطع في أقسام زجاجية للفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد. J بنية بيول 150: 109-121

Al-Amoudi A، Diez DC، Betts MJ، Frangakis AS (2007) العمارة الجزيئية للكادرينات في ديسموسومات البشرة الأصلية. طبيعة 450: 832-837

Allison DP، Daw CS، Rorvik MC (1987) بناء وتشغيل جهاز تجميد بسيط غير مكلف للاستخدام في المجهر الإلكتروني. J ميكروسكوب 147: 103-108

Batson PE ، Dellby N ، Krivanek OL (2002) دقة Sub-angstrom باستخدام بصريات الإلكترون المصححة للانحراف. طبيعة 418: 617-620

Baumeister W (2002) التصوير المقطعي الإلكتروني: نحو تصور التنظيم الجزيئي للسيتوبلازم. بنية عملة العملة بيول 12: 679-684

Baumeister W (2005) من المخزون البروتيني إلى الهندسة المعمارية. FEBS Lett 579: 933-937

بيرمان إي جيه (1984) كيمياء تثبيت رابع أكسيد الأوزميوم. في: Revel JP، Barnard T، Haggis GH (eds) علم تحضير العينات البيولوجية. شركة SEM Inc ، AMF O’Hare ، إلينوي ، الصفحات 1-5

Boggon TJ ، Murray J ، Chappuis-Flament S ، Wong E ، Gumbiner BM ، Shapiro L (2002) C-cadherin ectodomain structure وتأثيراته على آليات التصاق الخلية. Science 296: 1308-1313

Böhm J ، Frangakis AS ، Hegerl R ، Nickell S ، Typke D ، Baumeister W (2000) نحو اكتشاف وتحديد الجزيئات الكبيرة في سياق خلوي: مطابقة القالب المطبقة على التصوير المقطعي بالإلكترون. Proc Natl Acad Sci USA 97: 14245-14250

Carlemalm E, Armbruster BL, Chiovetti R, Garavito RM, Hobot JA, Villiger W, Kellenberger E (1982) Perspectives for achieving improved information by the observation of thin sections in the electron microscope. Tokai J Exp Clin Med 7(Suppl):33–42

Causton BE (1986) Does the embedding chemistry interact with tissue? In: Müller M, Becker RP, Boyde A, Wolosewick JJ (eds) The science of biological specimen preparation. SEM Inc, AMF O’Hare, Illinois, pp 209–214

Claeys M, Vanhecke D, Couvreur M, Tytgat T, Coomans A, Borgonie G (2004) High-pressure freezing and freeze substitution of gravid Caenorhabditis elegans (Nematoda: Rhabditida) for transmission electron microscopy. Nematol 6:319–327

Cope GH, Williams MA (1968) Quantitative studies on neutral lipid preservation in electron microscopy. J R Microsc Soc 88:259–277

Cope GH, Williams MA (1969a) Quantitative studies on the preservation of choline and ethanolamine phosphatides during tissue preparation for electron microscopy. I. Glutaraldehyde, osmium tetroxide, Araldite methods. J Microsc 90:31–46

Cope GH, Williams MA (1969b) Quantitative studies on the preservation of choline and ethanolamine phosphatides during tissue preparation for electron microscopy. II. Other preparative methods. J Microsc 90:47–60

Craig S, Gilkey JC, Staehelin LA (1987) Improved specimen support cups and auxiliary devices for the Balzers high pressure freezing apparatus. J Microsc 148:103–106

Drochmans P, Freudenstein C, Wanson JC, Laurent L, Keenan TW, Stadler J, Leloup R, Franke WW (1978) Structure and biochemical composition of desmosomes and tonofilaments isolated from calf muzzle epidermis. J Cell Biol 79:427–443

Dubochet J (2007) The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol 79:7–21

Dubochet J, McDowall AW, Menge B, Schmid EN, Lickfeld KG (1983) Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. J Bacteriol 155:381–390

Dubochet J, Adrian M, Chang JJ, Homo JC, Lepault J, McDowall AW, Schultz P (1988) Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys 21:129–228

Ebersold HR, Luthy P, Cordier JL, Muller M (1981) A freeze-substitution and freeze-fracture study of bacterial spore structures. J Ultrastruct Res 76:71–81

Edelmann L (1978) A simple freeze-drying technique for preparing biological tissue without chemical fixation for electron microscopy. J Microsc 112:243–248

Edelmann L (1986) Freeze-dried embedded specimens for biological microanalysis. Scan Electron Microsc 1986(Pt4):1337–1356

Eppenberger-Eberhardt M, Riesinger I, Messerli M, Schwarb P, Muller M, Eppenberger HM, Wallimann T (1991) Adult rat cardiomyocytes cultured in creatine-deficient medium display large mitochondria with paracrystalline inclusions, enriched for creatine kinase. J Cell Biol 113:289–302

Epperlein HH, Radomski N, Wonka F, Walther P, Wilsch M, Muller M, Schwarz H (2000) Immunohistochemical demonstration of hyaluronan and its possible involvement in axolotl neural crest cell migration. J Struct Biol 132:19–32

Escaig J (1982) New instruments which facilitate rapid freezing at 83 K and 6 K. J Microsc 126:221–229

Frangakis AS, Bohm J, Forster F, Nickell S, Nicastro D, Typke D, Hegerl R, Baumeister W (2002) Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proc Natl Acad Sci USA 99:14153–14158

Frotscher M, Zhao S, Graber W, Drakew A, Studer D (2007) New ways of looking at synapses. Histochem Cell Biol 128:91–96

Galway ME, Heckman JW Jr, Hyde GJ, Fowke LC (1995) Advances in high-pressure and plunge-freeze fixation. Methods Cell Biol 49:3–19

Guerquin-Kern JL, Wu TD, Quintana C, Croisy A (2005) Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochim Biophys Acta 1724:228–238

Haussinger D, Ahrens T, Sass HJ, Pertz O, Engel J, Grzesiek S (2002) Calcium-dependent homoassociation of E-cadherin by NMR spectroscopy: changes in mobility, conformation and mapping of contact regions. J Mol Biol 324:823–839

Hayat MA (2000) Principles and techniques of electron microscopy: biological applications, 4th edn. Cambridge University Press, Cambridge

He W, Cowin P, Stokes DL (2003) Untangling desmosomal knots with electron tomography. Science 302:109–113

Hess MW (1993) Cell-wall development in freeze-fixed pollen: Intine formation of Ledebouria socialis (Hyacinthaceae). Planta 189:139–149

Hohenberg H, Mannweiler K, Muller M (1994) High-pressure freezing of cell suspensions in cellulose capillary tubes. J Microsc 175:34–43

Hohenberg H, Tobler M, Muller M (1996) High-pressure freezing of tissue obtained by fine-needle biopsy. J Microsc 183:133–139

Humbel BM, Schwarz H (1989) Freeze-substitution for immunochemistry. In: Verkleij AJ, Leunissen JLM (eds) Immuno-gold labeling in cell biology. CRC Press, Boca Raton, pp 115–134

Humbel BM, Marti T, Müller M (1983) Improved structural preservation by combining freeze substitutuion and low temperature embedding. Beitr Elektronenmikroskop Direktabb Oberfl 16:585–594

Kanno H, Speedy RJ, Angell CA (1975) Supercooling of water to −92°C under pressure. Science 189:880–881

Kellenberger E, Johansen R, Maeder M, Bohrmann B, Stauffer E, Villiger W (1992) Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc 168:181–201

Koch AW, Bozic D, Pertz O, Engel J (1999) Homophilic adhesion by cadherins. Curr Opin Struct Biol 9:275–281

Kopp F (1973) Morphology of the plasmalemma of baker’s yeast خميرة الخميرة. In: Benedetti EL, Favard P (eds) Freeze-etching techniques and applications. Societé Française de Microscopie Electronique, Paris, pp 181–185

Leforestier A, Richter K, Livolant F, Dubochet J (1996) Comparison of slam-freezing and high-pressure freezing effects on the DNA cholesteric liquid crystalline structure. J Microsc 184:4–13

Linner JG, Livesey SA, Harrison DS, Steiner AL (1986) A new technique for removal of amorphous phase tissue water without ice crystal damage: a preparative method for ultrastructural analysis and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem 34:1123–1135

Lucic V, Forster F, Baumeister W (2005) Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem 74:833–865

Lucic V, Leis A, Baumeister W (2008) Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochem Cell Biol 130:185–196

Luft JH (1961) Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol 9:409–414

Matsko N, Müller M (2005) Epoxy resin as fixative during freeze-substitution. J Struct Biol 152:92–103

Maupin P, Pollard TD (1983) Improved preservation and staining of HeLa cell actin filaments, clathrin-coated membranes, and other cytoplasmic structures by tannic acid-glutaraldehyde-saponin fixation. J Cell Biol 96:51–62

McDonald KL, Morphew MK (1993) Improved preservation of ultrastructure in difficult-to-fix organisms by high pressure freezing and freeze substitution: I. ذبابة الفاكهة سوداء البطن و Strongylocentrotus purpuratus embryos. Microsc Res Tech 24:465–473

Medalia O, Weber I, Frangakis AS, Nicastro D, Gerisch G, Baumeister W (2002) Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science 298:1209–1213

Meryman HT (2007) Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion 47:935–945

Moor H (1987) Theory and practice of high pressure freezing. In: Steinbrecht RA, Zierold K (eds) Cryotechniques in biological electron microscopy. Springer, Berlin, pp 175–191

Moor H, Mühletaler K (1963) Fine structure in frozen-etched yeast cells. J Cell Biol 17:609–628

Moor H, Bellin G, Sandri C, Akert K (1980) The influence of high pressure freezing on mammalian nerve tissue. Cell Tissue Res 209:201–216

Murk JL, Posthuma G, Koster AJ, Geuze HJ, Verkleij AJ, Kleijmeer MJ, Humbel BM (2003) Influence of aldehyde fixation on the morphology of endosomes and lysosomes: quantitative analysis and electron tomography. J Microsc 212:81–90

Newman GR, Hobot JA (1987) Modern acrylics for post-embedding immunostaining techniques. J Histochem Cytochem 35:971–981

Newman GR, Jasani B, Williams ED (1983) A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens under the electron microscope. Histochem J 15:543–555

Nickell S, Kofler C, Leis AP, Baumeister W (2006) A visual approach to proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol 7:225–230

Nitta K, Kaneko Y (2004) Simple plunge freezing applied to plant tissues for capturing the ultrastructure close to the living state. J Electron Microsc (Tokyo) 53:677–680

North AJ, Bardsley WG, Hyam J, Bornslaeger EA, Cordingley HC, Trinnaman B, Hatzfeld M, Green KJ, Magee AI, Garrod DR (1999) Molecular map of the desmosomal plaque. J Cell Sci 112(Pt 23):4325–4336

Palade GE, Porter KR (1954) Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med 100:641–656

Pease DC, Porter KR (1981) Electron microscopy and ultramicrotomy. J Cell Biol 91:287s–292s

Pertz O, Bozic D, Koch AW, Fauser C, Brancaccio A, Engel J (1999) A new crystal structure, Ca 2+ dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin homoassociation. Embo J 18:1738–1747

Pfeiffer S, Krupinska K (2005) Chloroplast ultrastructure in leaves of Urtica dioica L. analyzed after high-pressure freezing and freeze-substitution and compared with conventional fixation followed by room temperature dehydration. Microsc Res Tech 68:368–376

Ravazzola M, Perrelet A, Roth J, Orci L (1981) Insulin immunoreactive sites demonstrated in the Golgi apparatus of pancreatic B cells. Proc Natl Acad Sci USA 78:5661–5664

Richter T, Biel SS, Sattler M, Wenck H, Wittern KP, Wiesendanger R, Wepf R (2007) Pros and cons: cryo-electron microscopic evaluation of block faces versus cryo-sections from frozen-hydrated skin specimens prepared by different techniques. J Microsc 225:201–207

Riehle U, Hoechli M (1973) The theory and technique of high pressure freezing. In: Benedetti EL, Favard P (eds) Freeze etching techniques and applications. Société Française de Microscopie Electronique, Paris, pp 31–61

Ripper D, Schwarz H, Stierhof YD (2008) Cryo-section immunolabelling of difficult to preserve specimens: advantages of cryofixation, freeze-substitution and rehydration. Biol Cell 100:109–123

Romano EL, Romano M (1977) Staphylococcal protein A bound to colloidal gold: a useful reagent to label antigen-antibody sites in electron miroscopy. Immunochemistry 14:711–715

Romano EL, Stolinski C, Hughes-Jones NC (1974) An antiglobulin reagent labelled with colloidal gold for use in electron microscopy. Immunochemistry 11:521–522

Roth J (1983) The colloidal gold marker system for light and electron microscopy. Theory and application. In: Bullock GR, Petrusz P (eds) “Techniques in immunocytochemistry”. Academic Press, New York II, pp 217–284

Roth J, Bendayan M, Orci L (1978) Ultrastructural localization of intracellular antigens by the use of protein A-gold complex. J Histochem Cytochem 26:1074–1081

Roth J, Bendayan M, Carlemalm E, Villiger W, Garavito M (1981a) Enhancement of structural preservation and immunocytochemical staining in low temperature embedded pancreatic tissue. J Histochem Cytochem 29:663–671

Roth J, Ravazzola M, Bendayan M, Orci L (1981b) Application of the protein A-gold technique for electron microscopic demonstration of polypeptide hormones. Endocrinology 108:247–253

Sartori N, Richter K, Dubochet J (1993) Vitrification depth can be increased more than 10-fold by high pressure freezing. J Microsc 172:55–61

Sawaguchi A, McDonald KL, Forte JG (2004) High-pressure freezing of isolated gastric glands provides new insight into the fine structure and subcellular localization of H+/K+-ATPase in gastric parietal cells. J Histochem Cytochem 52:77–86

Scala C, Cenacchi G, Ferrari C, Pasquinelli G, Preda P, Manara GC (1992) A new acrylic resin formulation: a useful tool for histological, ultrastructural, and immunocytochemical investigations. J Histochem Cytochem 40:1799–1804

Schmidt R, Wurm CA, Jakobs S, Engelhardt J, Egner A, Hell SW (2008) Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells. Nat Methods 5:539–544

Schwarz H, Humbel BM (1989) Influence of fixatives and embedding media on immunolabelling of freeze-substituted cells. Scanning Microsc Suppl 3:57–63 Discussion 63–54

Semmler K, Wunderlich J, Richter W, Meyer HW (1998) High-pressure freezing causes structural alterations in phospholipid model membranes. J Microsc 190:317–327

Shanbhag SR, Park SK, Pikielny CW, Steinbrecht RA (2001) Gustatory organs of ذبابة الفاكهة سوداء البطن: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res 304:423–437

Shapiro L, Fannon AM, Kwong PD, Thompson A, Lehmann MS, Grubel G, Legrand JF, Als-Nielsen J, Colman DR, Hendrickson WA (1995) Structural basis of cell–cell adhesion by cadherins. Nature 374:327–337

Sharp DJ, McDonald KL, Brown HM, Matthies HJ, Walczak C, Vale RD, Mitchison TJ, Scholey JM (1999) The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of ذبابة الفاكهة embryonic mitotic spindles. J Cell Biol 144:125–138

Shimoni E, Muller M (1998) On optimizing high-pressure freezing: from heat transfer theory to a new microbiopsy device. J Microsc 192:236–247

Shotton D, Thompson K, Wofsy L, Branton D (1978) Appearance and distribution of surface proteins of the human erythrocyte membrane. An electron microscope and immunochemical labeling study. J Cell Biol 76:512–531

Studer D, Michel M, Muller M (1989) High pressure freezing comes of age. Scanning Microsc Suppl 3:253–268 Discussion 268–259

Studer D, Hennecke H, Müller M (1992) High pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta 188:155–163

Studer D, Michel M, Wohlwend M, Hunziker EB, Buschmann MD (1995) Vitrification of articular cartilage by high-pressure freezing. J Microsc 179:321–332

Studer D, Chiquet M, Hunziker EB (1996) Evidence for a distinct water-rich layer surrounding collagen fibrils in articular cartilage extracellular matrix. J Struct Biol 117:81–85

Studer D, Graber W, Al-Amoudi A, Eggli P (2001) A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc 203:285–294

Sung HW, Hsu HL, Shih CC, Lin DS (1996) Cross-linking characteristics of biological tissues fixed with monofunctional or multifunctional epoxy compounds. Biomaterials 17:1405–1410

Szczesny PJ, Walther P, Muller M (1996) Light damage in rod outer segments: the effects of fixation on ultrastructural alterations. Curr Eye Res 15:807–814

Tokuyasu KT (1973) A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol 57:551–565

Tokuyasu KT (1980) Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J 12:381–403

Van Donselaar E, Posthuma G, Zeuschner D, Humbel BM, Slot JW (2007) Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic 8:471–485

Van Harreveld A, Crowell J (1964) Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. Anat Rec 149:381–385

Vanhecke D, Graber W, Herrmann G, Al-Amoudi A, Eggli P, Studer D (2003) A rapid microbiopsy system to improve the preservation of biological samples prior to high-pressure freezing. J Microsc 212:3–12

Vanhecke D, Graber W, Studer D (2008) Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol 88:151–164

Verkade P (2008) Moving EM: the rapid transfer system as a new tool for correlative light and electron microscopy and high throughput for high-pressure freezing. J Microsc 230:317–328

Walther P (2003) Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J Microsc 212:34–43

Walther P, Ziegler A (2002) Freeze substitution of high-pressure frozen samples: the visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. J Microsc 208:3–10

Wang L, Humbel BM, Roubos EW (2005) High-pressure freezing followed by cryosubstitution as a tool for preserving high-quality ultrastructure and immunoreactivity in the Xenopus laevis pituitary gland. Brain Res Brain Res Protoc 15:155–163

Waschke J (2008) The desmosome and pemphigus. Histochem Cell Biol 130:21–54

White DL, Andrews SB, Faller JW, Barrnett RJ (1976) The chemical nature of osmium tetroxide fixation and staining of membranes by X-ray photoelectron spectroscopy. Biochim Biophys Acta 436:577–592

Williams GJ, Hanssen E, Peele AG, Pfeifer MA, Clark J, Abbey B, Cadenazzi G, de Jonge MD, Vogt S, Tilley L, Nugent KA (2008) High-resolution X-ray imaging of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Cytometry A

Zeuschner D, Geerts WJ, van Donselaar E, Humbel BM, Slot JW, Koster AJ, Klumperman J (2006) Immuno-electron tomography of ER exit sites reveals the existence of free COPII-coated transport carriers. Nat Cell Biol 8:377–383

Zuber B, Nikonenko I, Klauser P, Muller D, Dubochet J (2005) The mammalian central nervous synaptic cleft contains a high density of periodically organized complexes. Proc Natl Acad Sci USA 102:19192–19197


شاهد الفيديو: Thuiswedstrijdpakket EK 2021 (كانون الثاني 2022).