معلومة

الجينات المنظمة لدورة الخلية و mRNA


أنا عالم رياضيات ومعرفتي بالبيولوجيا قريبة من الصفر. أنا أقرأ ورقة معلوماتية حيوية وأود أن أفهم المزيد عن مهمة البيولوجيا التي يتحدثون عنها. أستشهد هنا بالفقرة الأولى من الورقة:

يعد تحديد الجينات المنظمة لدورة الخلية من خلال دورية الرنا المرسال في الدراسات على مستوى الجينوم مهمة صعبة بسبب وجود ضوضاء داخلية وخارجية في بيانات المصفوفات الدقيقة. علاوة على ذلك ، فإن التحليل معقد أيضًا بسبب فقدان التزامن الذي يحدث في تجارب دورة الخلية ، مما يؤدي غالبًا إلى ضوضاء خلفية إضافية.
[دي سانتيس ، ماريانا ، وآخرون. "الجمع بين تقنيات التحسين والتعلم الآلي للتنبؤ على مستوى الجينوم بالجينات المنظمة لدورة الخلية البشرية." المعلوماتية الحيوية (2013): btt671.]

لقد بحثت عبر الإنترنت عن بعض الشرح لهذا الموضوع وأدرك أن دورة الخلية عبارة عن مجموعة من الأحداث التي تمر بها الخلايا لتكرار نفسها. أفهم أيضًا أن هناك بعض الجزيئات المسؤولة عن تنظيم دورة الخلية. أعلم أن mRNA هي فئة من الحمض النووي المسؤولة عن نقل المعلومات من الحمض النووي داخل النواة إلى الريبوسومات من أجل البدء في تخليق الأحماض الأمينية. المصفوفات الدقيقة هي مصفوفات تم الحصول عليها بواسطة تسلسل الحمض النووي داخل بعض الرقائق.

ما هي دورية مرنا؟ كيف ترتبط بدورة الخلية؟

أنا فقط بحاجة إلى شرح بسيط للغاية ، دون أي تفاصيل ، لأنه ليس مجال عملي ولكني مهتم بفهم الخلفية.


من المفترض أنه لكي تنقسم الخلية ، يجب أن تتقدم خلال سلسلة من المراحل التدريجية. في كل مرحلة من هذه المراحل ، يجب تصنيع بروتينات معينة من خلال mRNA و / أو تعديلها بعد النسخ من أجل خدمة دور معين تكاثري أو مضاد للتكاثر ، والذي ينظم بشكل عام الانتقال إلى المرحلة اللاحقة.

تقليديا ، تتكون دورة الخلية من 3 مراحل "interphase" قبل تنفيذ الانقسام الخيطي نفسه: G1 (النمو ، نشط التمثيل الغذائي) ، S (تخليق الحمض النووي لمضاعفة المادة الوراثية استعدادًا لتقسيمها إلى خليتين ابنتيتين) ، و G2 ( مرحلة الفجوة حيث يتم إجراء العديد من فحوصات مراقبة الجودة في شكل مراقبة الحمض النووي المنتج حديثًا على سبيل المثال لضمان بقاء السلالات).

في ظل هذه الأماكن ، من المتوقع أن يدور محتوى البروتين في الخلية في مرحلة معينة أو يتأرجح وفقًا لمتطلباتها ، وهذا مرتبط بدورة mRNA باعتبارها أكثر العمليات المسؤولة بشكل مباشر عن تعديل وفرة البروتين. ثم يرتبط بدورة الخلية بمعنى أنه من أجل الانتقال من المرحلة G1 على سبيل المثال ، يجب إنتاج البروتينات المشاركة في تخليق الحمض النووي ، وبالتالي يتم إطلاق عوامل البروتين لنسخ تلك الرنا المرسال المعينة.

من الناحية التجريبية ، يعد هذا التشريح للجينات المنظمة لدورة الخلية أمرًا صعبًا. يعد استخراج mRNA من مجموعات فرعية نقية من الخلايا في مراحل محددة من الانقسام الخلوي أمرًا صعبًا لأن عزل هذه المجموعات الفرعية للخلايا يتم عادةً من خلال التخصيب الكيميائي وإجراءات التزامن دون المستوى الأمثل. نسبة الإشارة إلى الضوضاء ليست مثالية في ظل هذه الظروف.

باختصار ، تدور الخلية عبر مراحل من أجل الانقسام ، ومثل هذا التدوير في حد ذاته يرجع إلى دوران بعض البروتينات ، ويطلق على أكثرها شهرة "الأعاصير" ، وهي علامات بروتينية لانقسام الخلايا. تسود Cyclin D و E و A و B بشكل مختلف في مراحل مختلفة من دورة الخلية نتيجة للمعادلة المتوازنة لنسخ الرنا المرسال وتعديلات البروتين بعد النسخ (أحداث الفسفرة تحددها للتحلل على سبيل المثال). بشكل عام عملية متداخلة ومنسقة بشكل جيد.

*** تعديل

للحصول على اختيار مناسب لبعض المراجع الأساسية حول هذا الموضوع ، ومصادر قوية تغطي الموضوع بدقة (أقل تحديدًا وكثافة من مقالات المجلات التي أعلق عليها أدناه) ، يرجى الرجوع إلى الروابط التالية:

وحتى استعراض الأخير هنا.

HTH


يتطلب تنظيم دورة الخلية لنسخ الجين هيستون H4 عامل الورم IRF-2

تعرض جينات الهيستون ذروة في النسخ في مرحلة S المبكرة وهي نماذج مثالية للتعبير الجيني المنظم لدورة الخلية. لقد أظهرنا سابقًا أن عامل النسخ التنظيمي للإنترفيرون 2 (IRF-2) يمكن أن ينشط التعبير الجيني هيستون H4. في هذا التقرير ، أثبتنا أن جين H4 هيستون الفأر وجينه البشري المتماثل يفقدان التحكم الصارم في دورة الخلية في الخلايا الليفية الجنينية المتزامنة التي تم فيها استئصال IRF-2. نظهر أيضًا أن هناك مستويات منخفضة من الرنا المرسال لجين هيستون الفأري الداخلي H4 في خلايا IRF-2 (- / -). اللافت للنظر ، أن مستوى الرنا المرسال الشامل وتنظيم دورة الخلية لنسخ هيستون H4 يتم استعادتهما عند إعادة إدخال IRF-2 إلى هذه الخلايا. IRF-2 هو منظم سلبي للاستجابة للإنترفيرون وله إمكانات مسببة للأورام ، ولكن لا يُعرف سوى القليل عن آلية هذه الأنشطة. تشير نتائجنا إلى أن IRF-2 هو لاعب نشط في التعبير الجيني المنظم لدورة الخلية المستقلة E2F في انتقال المرحلة G1 / S. كان IRF-2 يُعتبر سابقًا مضادًا سلبيًا لقمع الورم IRF-1 ، لكن يمكنه الآن الانضمام إلى عوامل أخرى مُسببة للأورام مثل c-Myb و E2F1 التي يُتوقع أن تتوسط في قدراتها التحويلية من خلال تنظيم الجينات اللازمة لتطور دورة الخلية.


تحديد شامل للجينات المنظمة لدورة الخلية في الخميرة Saccharomyces cerevisiae عن طريق تهجين المصفوفات الدقيقة

سعينا إلى إنشاء كتالوج شامل لجينات الخميرة التي تختلف مستويات نسخها بشكل دوري في دورة الخلية. تحقيقا لهذه الغاية ، استخدمنا المصفوفات الدقيقة للحمض النووي وعينات من مزارع الخميرة متزامنة بثلاث طرق مستقلة: إيقاف عامل α ، والتخفيض ، وإيقاف متحولة حساسة لدرجة الحرارة cdc15. باستخدام خوارزميات الدورية والارتباط ، حددنا 800 جين تفي بمعيار الحد الأدنى الموضوعي لتنظيم دورة الخلية. في تجارب منفصلة ، مصممة لفحص تأثيرات تحفيز G1 cyclin Cln3p أو B-type cyclin Clb2p ، وجدنا أن مستويات الرنا المرسال لأكثر من نصف هذه الجينات الـ 800 تستجيب لأحد هذه الأعاصير أو كليهما. علاوة على ذلك ، قمنا بتحليل مجموعتنا من الجينات المنظمة لدورة الخلية لعناصر محفز معروفة وجديدة وأظهرنا أن العديد من العناصر المعروفة (أو أشكالها) تحتوي على معلومات تنبؤية لتنظيم دورة الخلية. يتوفر وصف كامل ومجموعات بيانات كاملة على http://cellcycle-www.stanford.edu.


يتقلب CDC6 mRNA بشكل دوري في دورة خلية الخميرة.

باستخدام الثقافات المتزامنة بواسطة إجراءين مستقلين ، إيقاف عامل ألفا والتصفية بالطرد المركزي ، قمنا بالتحقيق في التعبير عن جين CDC6 Saccharomyces cerevisiae خلال دورة الخلية. تظهر نتائجنا أن جين CDC6 يتم التعبير عنه بشكل دوري في دورة خلية الخميرة. يزداد مستوى نصوص CDC6 في أواخر G1 ، ليصل إلى الذروة (حوالي 10-20 ضعفًا فوق المستوى الأولي) عند حدود المرحلة G1 / S تقريبًا. لوحظ أن ذروة CDC6 mRNA تتداخل أو تسبق قليلاً رسالة CDC8 ، ومن الواضح أنها تسبق رسالة هيستون H2A بحوالي 25 دقيقة. على عكس هيستون H2A mRNA ، لم يتأثر CDC6 mRNA وكذلك CDC8 mRNA بمعالجة هيدروكسي يوريا. تشير هذه النتائج إلى أن تنظيم H2A mRNA يختلف عن تنظيم CDC6 أو CDC8. لقد درسنا المناطق المرافقة 5 & # x27 من CDC6 وغيرها من الجينات المنظمة لدورة الخلية. كشف تحليل تسلسل الحمض النووي لمروج CDC6 عن تسلسلين ، 5 & # x27-C / GACGCGNC / G-3 & # x27 و 5 & # x27-PuGNAGAAA-3 & # x27 (حيث Pu هو البيورين ، و N هو أي نيوكليوتيد) ، وهما يتكرر ثلاث مرات لكل منهما. تم العثور على عناصر تسلسل مماثلة أيضًا بين العديد من الجينات المنظمة لدورة الخلية ، بما في ذلك جين CDC8 ، ولكن لم يتم العثور عليها في بداية جينات هيستون. تمت مناقشة الأهمية المحتملة لهذه العناصر.


الجينات المنظمة لدورة الخلية و mRNA - علم الأحياء

يعد التعبير الجيني المنظم آلية مهمة للتحكم في تقدم دورة الخلية في الخميرة والثدييات ، وغالبًا ما تُظهر الجينات المشاركة في العمليات المتعلقة بانقسام الخلية تنظيمًا للنسخ يعتمد على موضع دورة الخلية. تم إعاقة تحليل عمليات دورة الخلية في النباتات بسبب عدم وجود معلقات خلية متزامنة لـ أرابيدوبسيس، وعدد قليل من الجينات المنظمة لدورة الخلية معروفة. باستخدام نظام تزامن تم وصفه مؤخرًا ، قمنا بتحليل الحمض النووي الريبي من عينات متسلسلة منأرابيدوبسيس تتقدم الخلايا خلال دورة الخلية باستخدام المصفوفات الجينية Affymetrix. نحدد ما يقرب من 500 جين تعرض بقوة تقلبًا كبيرًا في التعبير ، مما يمثل أول تحليل جيني للتعبير الجيني المنظم لدورة الخلية في أي نبات. بالإضافة إلى العدد المحدود من الجينات التي تم تحديدها سابقًا على أنها منظمة لدورة الخلية في النباتات ، نجد أيضًا أنماطًا محددة من التنظيم للجينات المعروفة أو المشتبه في مشاركتها في نقل الإشارات وتنظيم النسخ والتنظيم الهرموني ، بما في ذلك الجينات الرئيسية لاستجابة السيتوكينين . تمثل الجينات المحددة المسارات التي يتم تنظيمها في دورة الخلية في الكائنات الحية الأخرى وتلك التي تشارك في العمليات الخاصة بالنبات. يُظهر نطاق وعدد الجينات المنظمة لدورة الخلية التكامل الوثيق لدورة الخلية النباتية في مجموعة متنوعة من مسارات التحكم والاستجابة الخلوية.


المواد والأساليب

ثقافة الخلية ، والتزامن ، وإعداد الحمض النووي الريبي

تم تمرير خلايا هيلا و U2OS في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية في DMEM مع 10 ٪ من مصل بقري جنيني و 100 وحدة من البنسلين - الستربتومايسين باتباع البروتوكولات القياسية.

تمت مزامنة خلايا U2OS باستخدام بروتوكول ثيميدين مزدوج أو بروتوكول ثيميدين- نوكودازول. باختصار ، تم طلاء 3.0 × 10 5 خلايا في 16 مل من DMEM. بعد 24 ساعة من النمو ، تمت إضافة الثيميدين إلى تركيز نهائي قدره 2.5 ملي مولار. بعد 18 ساعة في وسط ثيميدين ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام ثاني أكسيد الكربون المُدفأ مسبقًا2- محلول ملحي متوازن بالفوسفات (PBS) ويُسمح له بالنمو لمدة 8 ساعات في ثاني أكسيد الكربون المُسخَّن مسبقًا2 تمت معايرته DMEM. مرة أخرى تمت إضافة الثيميدين إلى تركيز نهائي قدره 2.5 ملي مولار لمدة 18 ساعة أخرى. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني وتم إطلاقها في DMEM. بالنسبة لمزامنة ثيميدين - نوكودازول ، تم طلاء خلايا U2OS (5.0 × 10 5 خلايا) وتم السماح لها بالنمو لمدة 24 ساعة. تمت إضافة الثيميدين (2.5 ملي مولار) لمدة 18 ساعة قبل غسل الخلايا مرتين باستخدام ثاني أكسيد الكربون المُسخَّن مسبقًا2- برنامج تلفزيوني متزن قبل العلاج بـ DMEM مكمل بـ 100 نانوغرام / مل نوكودازول لمدة 12 ساعة. تم جمع الخلايا العائمة ولفها ، وغسلها مرتين باستخدام ثاني أكسيد الكربون المُسخَّن مسبقًا2-معايرة PBS ، وتعليقها في أول أكسيد الكربون المُسخن مسبقًا2معادلة DMEM. تم غسل الخلايا غير الطافية مرتين باستخدام ثاني أكسيد الكربون المُسخَّن مسبقًا2- تمت معايرته في برنامج تلفزيوني وإطلاقه في ثاني أكسيد الكربون المُسخَّن مسبقًا2- تمت معايرتها DMEM ، وتمت إضافة الخلايا العائمة المعلقة مرة أخرى إلى كل لوحة. تم جمع الخلايا كل ساعتين لمدة لا تقل عن 36 ساعة باستخدام RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا). تم جمع عينات لمدة ساعة صفرية بينما كانت الخلايا لا تزال في ظروف الاعتقال.

تمت مراقبة التزامن عن طريق تحليل فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) للخلايا المسمى بروبيديوم يوديد (DartLab ، مدرسة جيزل للطب في كلية دارتموث) وحالة الفسفرة FOXM1 أو تعبير cyclin B1 عبر البقع الغربية (انظر الوصف لاحقًا). تم جمع العينات لتحليل اللطخة الغربية باستخدام المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE.

تم عزل الحمض النووي الريبي المرجعي من خلايا U2OS المتزايدة بشكل غير متزامن باستخدام مجموعة RNeasy Plus Mini Kit. تم استخدام نفس المرجع لجميع تجارب التهجين.

تحليل وتهجين المصفوفات الدقيقة

تم تشغيل المصفوفات الدقيقة كما هو موضح سابقًا (Grant وآخرون.، 2012). باختصار ، تم تضخيم الحمض النووي الريبي الخلوي وتم تمييز Cy3 (U2OS RNA غير المتزامن) أو Cy5 (عينة) باستخدام مجموعة ملصقات الأمبير السريع (Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة ، باستثناء أنه تم تقليل أحجام التفاعل بمقدار واحد- نصف. تم تهجين cRNA المسمى إلى صفائف Oligonucleotide للجينوم البشري Agilent (4 × 44 كيلو) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. تم فحص المصفوفات الدقيقة باستخدام ماسح ضوئي GenePix 4000B (الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale ، CA). تم تحديد شدة البكسل الموضعي باستخدام برنامج GenePix Pro 5.1. تم تحديد المواقع ذات الجودة الرديئة وتمييزها يدويًا واستبعادها من التحليل اللاحق. تم تخزين المصفوفات في قاعدة بيانات ميكرواري بجامعة نورث كارولينا (تشابل هيل ، نورث كارولاينا UMD). تتوفر بيانات المصفوفة الدقيقة الأولية الكاملة من GEO على رقم المدخل GSE50988 (جزء من SuperSeries GSE52100).

في كل مرة تم استرجاع الدورة من UMD بشكل مستقل عن كل دورة زمنية أخرى مع الشروط التالية. تم استخدام البقع فقط ذات نسبة الشدة على الخلفية & gt1.5. الجينات المفقودة و gt 30٪ من بياناتها تم استبعادها من التحليل الإضافي. تم تطبيع الجينات باستخدام تطبيع Lowess.

تحديد النصوص المعبر عنها بشكل دوري

تم تحديد النصوص المعبر عنها بشكل دوري باستخدام نفس الطريقة كما في Whitfield وآخرون. (2002). باختصار ، تم احتساب البيانات المفقودة باستخدام ملف ك-أقرب خوارزمية الجيران (Troyanskaya وآخرون.، 2001) باستخدام ك = 12. ثم في كل مرة تم توسيط الدورة عن طريق إزالة eigengene الأول (Alter وآخرون.، 2000). تمت إزالة البيانات المزعومة من مجموعة البيانات كخطوة أخيرة في التحليل.

تم الحصول على تقديرات تقريبية لدورة خلية U2OS مبدئيًا من تحليل لطخة غربية للفسفرة المنظمة لدورة الخلية لتحليل FOXM1 و FACS لكل دورة زمنية. تم تنقيح هذا التقدير بعد ذلك عن طريق إجراء تحويل فورييه على كل جين في كل دورة زمنية (ويتفيلد وآخرون.، 2002 ، مكافئ. 1-3) بقيم متباعدة متساوية للوقت (كل 15 دقيقة) لطول دورة الخلية المقدرة ± ساعتين.

تعويض (φ ويتفيلد وآخرون.، 2002 ، مكافئ. تم تحديد 1 و 2) لكل دورة زمنية تتعلق بالدورة الأولى. ثم تكرر تحويل فورييه لكل دورة زمنية باستخدام القيم التالية لـ T و: Thy-Thy 1 (تي = 17.65 ، φ = 0.0) ، خاصتك 2 (تي = 18.6، φ = 0.0)، Thy-Thy 3 (تي = 18 ، φ = 0.0) ، و Thy-Noc (تي = 23.95 ، φ = 2.3). تم بعد ذلك جمع المتجهات لكل مجموعة بيانات وترتيب الجينات حسب حجم نواقلها المجمعة (ج). للتعويض عن التطابق غير الكامل لمنحنيات الجيب أو جيب التمام ، تم قياس كل جين من خلال ارتباطه بمتجه مثالي. تم تحديد المتجه المثالي لكل مرحلة من مراحل دورة الخلية (G1 / S و S و G2 و G2 / M و M / G1) من خلال متوسط ​​ملامح التعبير للجينات المشار إليها في الشكل 1. وباستخدام ارتباط بيرسون القياسي ، تلقى كل جين درجة ارتباط الذروة ، والتي كانت أكبر ارتباط للقيمة المطلقة مع كل من المتجهات المثالية. ثم تم استخدام درجة ذروة الارتباط هذه لقياس كل جين ج، وتوليد نتيجة دورية لكل جين.

ثم تم استخدام البيانات العشوائية لتعيين قيمة قطع للحد الأدنى من درجة دورية ليتم اعتبارها منظمة لدورة الخلية. تم اختيار عشوائي للبيانات 10 مرات إما داخل الصفوف فقط أو في الصفوف والأعمدة. تم إجراء خط أنابيب التحليل الكامل لكل من هذه التوزيعات العشوائية باستخدام نفس المعلمات الخاصة بالبيانات غير العشوائية. لقد اخترنا درجة دورية لا تقل عن 2.65 ، مما أعطانا 3568 جينًا بمعدل إيجابي كاذب أولي قدره 3.67٪ عند التوزيع العشوائي للصفوف فقط. أدى تضمين الدورة الزمنية الخاصة بـ Thy-Noc إلى تحسين معدلات إيجابية كاذبة وسلبية كاذبة ، على الرغم من وجود درجة تزامن أقل من دورات وقتك (الشكل التكميلي S9)

لحساب الجينات التي حصلت على درجة فورييه عالية ولكن لم يكن لديها نمط تعبير جيبي طوال كل دورة زمنية ، قمنا بحساب درجات الارتباط التلقائي (ويتفيلد وآخرون.، 2002 ، مكافئ. 5). حسبنا ولخصنا درجات الارتباط الذاتي لكل دورة زمنية ، تاركين 2878 جينًا. لإزالة أي جينات كان لها تحيز واضح في التاريخ من المشكلات الفنية أثناء تهجين الصفيف ، وجدنا أطياف قوتها باستخدام تحويل فورييه لكل دورة زمنية. ثم تمت إزالة الجينات المتحيزة للتاريخ عن طريق إسقاط أطياف الطاقة على أول مكونين رئيسيين لها وتجميعها بواسطة ك-يعني (ك = 2 الشكل التكميلي S2). أعطتنا إزالة هذه الجينات مجموعة بيانات نهائية من 2830 مسبارًا. تتوافق المجسات 2830 مع 2140 Entrez GeneIDs مع 1871 معرفًا جينيًا فريدًا.

تسلسل رقاقة والتحليل

تم تنفيذ FOXM1 ChIP-seq كما هو موصوف سابقًا (Lupien وآخرون.، 2008 منحة وآخرون.، 2012) باستخدام الجسم المضاد FOXM1 sc-502 (C20 Santa Cruz Biotechnology ، سانتا كروز ، كاليفورنيا). باختصار ، تم إصلاح خلايا هيلا غير المتزامنة باستخدام 1٪ فورمالدهايد قبل صوتنة لإنتاج أطوال أجزاء الحمض النووي من 200-600 زوج قاعدي مع Bioruptor (Diagenode ، Sparta ، NJ). كان Anti-FOXM1 مرتبطًا بمزيج من البروتين A والبروتين G Dynabeads (Life Technologies ، Grand Island ، NY) قبل الحضانة لمدة 18 ساعة عند 4 درجات مئوية مع الحمض النووي المجزأ. تم غسل الحمض النووي المرتبط وعكس الروابط المتقاطعة قبل تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية QIAquick PCR (Qiagen). تم قياس تركيزات الحمض النووي باستخدام Quant-iT PicoGreen (تقنيات الحياة). تم تنفيذ إنشاء المكتبة وتسلسلها لكل تشغيل ChIP-seq بشكل مستقل في مرفق التسلسل عالي الإنتاجية في جامعة نورث كارولينا (تشابل هيل ، نورث كارولاينا) باستخدام محلل جينوم Illumina II. تم تعيين ملفات Fastq إلى الجينوم البشري باستخدام Bowtie (الإصدار 0.12) باستخدام علامة "الأفضل" لتقييد المحاذاة مع تلك التي تتمتع بأفضل جودة قراءة وأقل حالات عدم تطابق. نتج عن أول تشغيل لـ ChIP-seq 17.1 مليون قراءة متسلسلة (8.4 قراءات متسلسلة معينة) ، وأسفر تشغيل ChIP-seq الثاني عن 17.0 مليون قراءة (8.4 مليون قراءة مخطط لها بناء الجينوم البشري Hg18). تم تحديد القمم الغنية بشكل مستقل لكل عملية تشغيل باستخدام MACS ، الإصدار 1.3 (التشغيل 1 ، mfold 32 ، ص & lt 1.0 × 10 5 تشغيل 2 ، mfold 25 ، ص & lt 1.0 × 10 −5 تشانغ وآخرون.، 2008). نتج عن ذلك 5727 قمة في الجولة الأولى و 2849 قمة في الثانية. كتقدير متحفظ لربط FOXM1 ، قمنا بتحليل تقاطع التسلسلات تحت القمم التي تم العثور عليها في كل من عمليات ChIP-seq ، مما أدى إلى 2215 موقع جينومي مشترك FOXM1. ثم حددنا توزيع المواقع الجينومية المشتركة FOXM1 باستخدام رابطة الدول المستقلة-نظام التعليق التوضيحي للعنصر التنظيمي (CEAS http://liulab.dfci.harvard.edu/CEAS/Zhang وآخرون.، 2008 شين وآخرون.، 2009) في Cistrome (www.cistrome.com/). تتوفر بيانات ChIP-seq الأولية وملفات BED من GEO في رقم الانضمام GSE52098 (جزء من SuperSeries GSE52100).

فحوصات لوسيفيراز في الوقت الحقيقي

تم طلاء خلايا U2OS بكثافة 20-25٪ في أطباق 30 مم وتركها تنمو لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، تم استبدال وسيط النمو بوسط الفحص (الفينول الأحمر الخالي من L15 [تقنيات الحياة] ، 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1- بيبرازين عازلة حمض إيثان سلفونيك ، و 0.1 ملي لوسيفيرين). تم بعد ذلك نقل الخلايا بكميات متساوية من البلازميد (عادة 250 نانوغرام من كل بلازميد) باستخدام FuGENE 6 (تقنيات الحياة) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. تم ختم أطباق زراعة الأنسجة بأغطية زجاجية وشحوم السيليكون ونقلها إلى LumiCycle (Actimetrics ، Wilmette ، IL) عند 36 درجة مئوية. تم إجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل LumiCycle (Actimetrics).

البقع الغربية

تم شراء الأجسام المضادة لـ FoxM1 C-20 (1: 500) و cyclinB1 H-433 (1: 2000) من Santa Cruz Biotechnology. تم شراء نازعة الهيدروجين المضاد للجليسرالديهيد -3 فوسفات من شركة American Research Products (Belmont، MA). تم تشغيل اللطخات الغربية باتباع البروتوكولات القياسية.

البناء البلازميد

تم وصف متجهات التعبير FOXM1 و ACAP3 / CENTB5 وبنى المروج RPS6KB1 مسبقًا (منحة وآخرون.، 2012). حصلنا على تركيبات المروج المتاحة تجاريًا لـ PLK1 (S119035) و CENPE (S118567) و TOP2A (S118760) و RMI1 (S113323) من Switchgear Genomics (مينلو بارك ، كاليفورنيا).

تم استنساخ بنية المروج الهدف FOXM1 ، pGL3-MCM8 ، بناءً على مواقع ChIP-seq كما هو محدد بواسطة MACS. تم تصميم البرايمر باستخدام Primer 3 (Rozen and Skaletsky، 2000) لتوفير طول أمبليكون بين 800 و 1000 زوج قاعدي. تم تضخيم شظايا الحمض النووي عبر PCR واستنساخها في Zero Blunt TOPO (تقنيات الحياة) قبل استنساخها في pGL3-basic (Promega ، Madison ، WI) باستخدام الطرق القياسية. تم التحقق من جميع البلازميدات عن طريق التسلسل (مرفق أساسي في البيولوجيا الجزيئية والبروتيوميات ، كلية دارتموث).

شرح وظيفي

تم إجراء التعليق التوضيحي الوظيفي للجينات باستخدام DAVID (Dennis وآخرون.، 2003 هوانغ دا وآخرون., 2009).

ملفات تعريف الارتباط على مستوى دورة الخلية

لقد درسنا توزيع الجينات المستهدفة لعامل النسخ في دورة الخلية. أولاً ، حددنا قائمة تضم 2830 مجسًا لدورة الخلية في خلايا U2OS وفرزناها وفقًا لوقت التعبير الذروة في دورة الخلية. ثم قمنا بفحص إثراء الجينات المستهدفة لعامل نسخ معين في كل نافذة منزلقة من دورة الخلية. استخدمنا نافذة بحجم 30 درجة مع تداخل 10 درجات بين النوافذ المجاورة. استخدمنا اختبار فيشر الدقيق لتحديد أهمية تخصيب الجينات المستهدفة لعامل النسخ في كل نافذة دورة خلية.

تم تحديد الجينات المستهدفة لـ E2F1 و E2F4 و E2F6 في خلايا HeLa من بيانات ChIP-seq التي تم إنشاؤها بواسطة مشروع ENCODE (Gerstein وآخرون.، 2012). تم تحديد الجينات المستهدفة FOXM1 من سلسلة ChIP-seq المعروضة هنا.


نتائج

توقيت.

تُظهر بيانات تعبير YMC الأخيرة (14) تعديلًا قويًا للجينات المنظمة لدورة الخلية في ثقافة الخميرة الناشئة (انظر SI الشكل 5). عند فحص ملفات تعريف التعبير الزمني لمجموعة بيانات YMC ، حسبنا (15) أن متوسط ​​نسبة التعبير من الذروة إلى الحضيض لـ 108 جينات منظمة لدورة الخلية معروفة جيدًا (انظر الجدول 3 في الملحق SI ) هو 21 مقارنةً بـ & lt9 للمزامنة السابقة بواسطة مؤتمر نزع السلاح 15 أو مؤتمر نزع السلاح 28 المسوخات الحساسة للحرارة أو فرمون ألفا (1 ، 5). على عكس البيانات السابقة (1 ، 3 ، 5) ، المستمدة من الخميرة سريعة النمو ، يتم جمع بيانات YMC من ثقافة خميرة مستمرة ومتزامنة للغاية وتنمو ببطء (14) ، مما يتيح لنا التمييز بشكل أفضل بين قمم بعض دورة الخلية الرئيسية الجينات (الشكل 2). علاوة على ذلك ، فإن المزامنة الأولية للخلايا التي تخضع لـ YMC يتم تحقيقها ببساطة عن طريق تجويع مجموعة الخلايا بعد أن تصل إلى كثافة عالية ، ولا يعتمد هذا النهج على استخدام المسوخات الحساسة لدرجة الحرارة ، وإضافة الفيرومون ، وما إلى ذلك. ) وهكذا تظل مستقرة بشكل ملحوظ فقد استمرت لمدة 100 دورة ، في حين أن المزامنة التي تحققت بواسطة طرق أخرى تتدهور بشكل ملحوظ خلال الدورات الثلاث الأولى (5). يعد التكرار المستقر لأنماط التعبير الزمني على مدار دورات متتالية مطلبًا أساسيًا لتطبيق أسلوب التوقيت الدقيق القائم على التفكك. لذلك ، اخترنا أن نؤسس التوقيت عالي الدقة فقط على بيانات YMC (14) ، بينما تم استخدام مجموعات البيانات الأخرى (1 ، 3 ، 5) لتحديد مجموعة الجينات المنظمة نسبيًا لدورة الخلية (CCTR).

مقارنة أنماط التعبير عن الجينات المنظمة لدورة الخلية الرئيسية في النمو البطيء [YMC (14) ، اليسار] مقابل مزارع الخميرة سريعة النمو [cdc15 و alpha و cdc28 (1، 5)]. (العلوي) ز2 سايكلين CLB1، عامل النسخ الانقسامي SWI5، و G1 سايكلين CLN3. (أدنى) سيكلين ميتوتيك PCL9 والوحدة الفرعية MCM مليون متر مكعب 3. المعتمد على البيئة G1 تعد المرحلة أطول بمقدار ≈10 مرات في YMC مما تم العثور عليه في الدراسات السابقة (مزامنة cdc15 و alpha و cdc28) ، مما يسمح بالتعبير عن جينات دورة الخلية الرئيسية بدقة أعلى.

لاحظنا أن معظم الجينات المعروفة بأنها منظمة نسبيًا أثناء دورة الخلية تشترك في شكل ملف تعريف مميز في بيانات YMC (الشكل 1). على أساس تحليل فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لتكرار الحمض النووي ومراقبة مظهر البرعم (14) ، نستنتج أن الاتساع الملحوظ للملف الشخصي لا ينتج عن عمر النسخ الطويل ولكن بسبب دخول الخلايا الفردية إلى دورة الخلية في أوقات مختلفة. لتصحيح تأثير هذا الانتشار على تركيزات الرنا المرسال المقاسة ، قمنا بنمذجة توزيع التحول الزمني للخلايا التي تدخل دورة الخلية (انظر الملحق SI ). يتشابه شكل هذا التوزيع بشكل لافت للنظر مع توزيع عدد الخلايا المتبرعم من الثقافات الأخرى المتزامنة مع دورة الخلية (1) ، مما يشير إلى أن هذا الشكل هو خاصية متأصلة في دورة الخلية ، والتي من المحتمل أن تكون ناتجة عن الخلايا الوليدة التي تحتاج إلى وقت أطول من الخلايا الأم إلى تنمو بشكل كبير بما يكفي لتقسيمها مرة أخرى (16 ، 17).

لاستعادة تركيز mRNA في الخلية الفردية النموذجية ، قمنا بفك الملف الشخصي المقاس باستخدام الشكل المشترك. الضجيج الجوهري في التعبير الجيني للخميرة الناشئ منخفض (18) ، لذلك نتوقع أن يكون متوسط ​​توقيت التعبير عن الخلية الفردية المقدر لدينا يعكس غالبية الخلايا المفردة الفعلية. قمنا بتنفيذ خوارزمية deconvolution التي تم تكييفها لتحليل بيانات المصفوفات الدقيقة (انظر الملحق SI ) ، مع التنظيم على أساس مبدأ الانتروبيا القصوى (19). وبالتالي ، فقد حددنا بدقة لحظة ذروة التعبير الجيني عن طريق محاذاة دورات الخلية للثقافة بأكملها عن طريق تفكيك ملفات تعريف التعبير المرصودة (انظر الملحق SI ). تسمح هذه الطريقة باستعادة ملفات تعريف التعبير للخلية المفردة ، والتي يتم تشويهها في قياس المصفوفة الدقيقة بسبب متوسط ​​مستويات الرنا المرسال للخلايا المتزامنة بشكل غير كامل (الشكل 3).

تختلف ملفات تعريف التعبير المقاسة للثقافة بأكملها بشكل كبير عن ملفات تعريف mRNA أحادية الخلية. ينتج عن التزامن غير الكامل للخلايا توسيع ملفات تعريف التعبير المقاسة في الثقافة (حق) ، مقارنةً بملفات التعريف أحادية الخلية (اليسار). ملفات تعريف التعبير الأصلي أحادي الخلية (أ, ج، و ه) يمكن إعادة بنائها من الملفات الشخصية المرصودة (ب, د، و F، على التوالي) باستخدام deconvolution. يمكن أيضًا تطبيق هذه الطريقة عندما يكون ملف تعريف التعبير أحادي الخلية معقدًا (ج و ه) بدلاً من نبضة واحدة قصيرة العمر (أ).

قمم التعبير.

لكل نسخة ، قمنا بحساب ملفات التعريف المفككة (انظر SI الشكل 7) وحددنا قمم التعبير (انظر الملحق SI ). يسمح تفكيك ملفات تعريف التعبير الجيني باكتشاف قمم التعبير الثانوية ، حتى عندما لا تكون واضحة في البيانات الأولية. في الواقع ، وجدنا أن العديد من جينات CCTR قد تصل إلى ذروتها مرتين في كل دورة. على سبيل المثال ، تُظهر ملامح مفككة لجينات هيستون أن جميع الهستونات باستثناء HTB2 يتم التعبير عنها في رشقتين منفصلتين لكل دورة (SI الشكل 8): تحدث الأولى في المرحلة S وتتعلق بتكرار الحمض النووي والثانية في G2/ M المرحلة (الأهمية الوظيفية لهذه الموجة الثانية غير معروفة) (الشكل 4 ج). مثال آخر هو CDC28، تمت مناقشته أدناه (SI الشكل 10). تشير القمم الثانوية لجينات CCTR إلى أنها قد تعمل في لحظات متعددة من دورة الخلية أو أن واحدة فقط من القمم الملحوظة مرتبطة بدورة الخلية. أمثلة على القمم المحسوبة موضحة في الشكل 4 د وفي الجدول 4 من الملحق SI (للحصول على القائمة الكاملة ، انظر الجدول 6 في الملحق SI أو http://cellcycle.info).

برنامج النسخ لدورة خلية الخميرة. (أ و ب) البروتينات المشاركة في بدء تكرار الحمض النووي ، مشفرة بالألوان وفقًا لتوقيت التعبير عنها. يخضع مركب ما قبل النسخ (pre-RC) للعديد من التغييرات قبل أن يتم تكوين مجمع الاستطالة (EC) ، القادر على بدء تخليق الحمض النووي (24). ترتيب التعبير (أ) يتفق مع الترتيب الذي تحتاجه المنتجات الجينية (ب). في أ، تشير الخطوط العريضة المنقطة إلى الجينات غير CCTR. لاحظ مجموعتي وحدات MCM الفرعية ، كل منها تحتوي على إشارة توطين نووي واحدة (NLS). في B ، تشير الخطوط العريضة الصلبة إلى ذروة التعبير الأساسي المتقطع تشير إلى ذروة ثانوية (تسجيل أقل). الاستثناء الوحيد للنسخ في الوقت المناسب هو ORC1. (ج) توقيت المجمعات CCTR. DSE ، برنامج التعبير الخاص بخلية الابنة ، قانون APC ، تنشيط APC SPB ، تشكيل الأقمار الصناعية لجسم المغزل SPB sep ، نسخ وفصل جسم عمود الدوران. (د) قمم جينات CCTR المختارة. (ه) مراحل ومراحل فرعية لدورة الخلية. لاحظ G Prereplicative الجديد1 (ف) المرحلة. (F) رسم بياني لقمم التعبير عن جينات CCTR. (جي) قمم النصوص التي تنظمها عوامل نسخ دورة الخلية المختارة (11 ، 20 ، 21 ، 29 ، 30). لاحظ الاختلافات في التعبير عن أهداف MBF و SBF. (ح) الرسوم البيانية لقمم جينات CCTR المشاركة في وظائف دورة الخلية المختارة. قارن بين قمم أهداف Cdc28p المتوقعة (26) مقابل قمم CDC28 (د).

جينات CCTR.

لا يمكن تفسير نتائج التوقيت إلا في سياق التعبير المنظم لدورة الخلية إذا كان الجين هو CCTR. لتحديد جينات CCTR ، قمنا بفحص مجموعات بيانات الجينوم الكامل المتاحة التي عرضت فيها الجينات المعروفة المنظمة لدورة الخلية تعديلًا (1 ، 3 ، 5 ، 14). لكل نسخة ، قمنا ببناء درجة احتمالية بناءً على النسبة المئوية للجينات المقترحة سابقًا (1 ، 5) التي تم تنظيمها نسبيًا من بين أكثر 100 جينات ارتباطًا في كل مجموعة بيانات (1 ، 3 ، 5 ، 14) (انظر الملحق SI ). حددت هذه النتيجة مجموعة CCTR عالية الثقة تتكون من 694 جينًا ومجموعة ممتدة من 1129 جينًا (انظر الجدول 6 في الملحق SI ). لقد تحققنا من صحة مجموعات CCTR هذه باستخدام بيانات ربط عامل النسخ التجريبي (11 ، 20 ، 21) ، بالإضافة إلى نماذج ربط عامل النسخ المحفوظة بين أنواع الفطريات ذات الصلة (22 ، 23). أظهر كلا الاختبارين أن مجموعات CCTR الخاصة بنا أكثر اتساقًا مع بيانات تنظيم النسخ المستقلة من المجموعات المشتقة من مجموعات أصغر من التجارب (3 ، 5) (انظر الجدولين 1 و 2 في الملحق SI ). من الآن فصاعدًا ، يشير مصطلح "جينات CCTR" إلى مجموعة الثقة العالية.

تقدير الخطأ.

لتقدير متانة إجراء التوقيت ، قمنا بالتحقيق في مدى تأثر أوقات الذروة التي تم الحصول عليها بالأخطاء المتوقعة في تركيزات الرنا المرسال المقاسة (انظر الملحق SI ). لقد أكدنا أن طريقة التوقيت قوية جدًا ، حيث تبلغ القيمة المتوسطة للخطأ الإجمالي المقدر لأوقات الذروة المتوقعة دقيقتين (انظر الجدول 6 في الملحق SI ). يسمح هذا التوقيت عالي الدقة بتعليق كل نص على جزء صغير من مرحلة دورة الخلية ويكشف عن اختلافات غير قابلة للاكتشاف في أوقات التعبير الجيني. القائمة الكاملة لجينات CCTR ، إلى جانب ذروات التعبير وتقديرات الخطأ ، متاحة عبر الإنترنت على http://cellcycle.info.

تعيين المرحلة والمرحلة الفرعية.

حددنا الفترات الزمنية المقابلة لمراحل دورة الخلية الرئيسية (الشكل 4 ه) باستخدام قمم التعبير عن جينات دورة الخلية المعروفة (انظر الجدول 5 في الملحق SI ). الرسم البياني لقمم التعبير عن جينات CCTR (الشكل 4 F) عن موجتين رئيسيتين من النسخ ، مفصولة بفواصل زمنية من عدم وجود نشاط نسخ CCTR تقريبًا ، بين أواخر S وأواخر G2 في معظم مراحل G1 مرحلة. لم يتم وصف هذا الاختلاف الدراماتيكي في نشاط النسخ بين مراحل دورة الخلية سابقًا (5) (SI الشكل 6). ما وراء موجات التعبير البارزة في G1/ S – S و G2/ M - M ، الرسم البياني في الشكل 4 F يكشف عن موجة تعبير مميزة غير محددة سابقًا (1 ، 3 ، 5) تسبق بداية تكرار الحمض النووي. في YMC ، تمتد هذه الموجة 45 دقيقة وتشمل 19٪ من جينات CCTR. لأنه يتم التعبير عن غالبية الوحدات الفرعية لمجمع ما قبل التكاثر في هذه المرحلة (الشكل 4 أ) ، نقترح تسميتها "prereplicative" أو "G1 (ف) ". الجينات الأخرى المعبر عنها في G1 (ع) يشاركون في التحضير للتبرعم (على سبيل المثال ، RSR1, BUD13, GIC2, RAX1, PEA2، و BNI4) وفي تركيب مكونات جدار الخلية (على سبيل المثال ، FKS1, غاز 1، و غاز 5). في الدراسات السابقة ، G1 ربما تم تعيين الجينات (P) بشكل غير صحيح لمراحل دورة الخلية المختلفة (1 ، 5). تم شرح أكثر من الثلث كما يتم التعبير عنه في الانقسام أو M / G1 (1 ، 5) ، بما في ذلك جميع الوحدات الفرعية لمجمع MCM و G1 سايكلين CLN3 (15). Our timing places expression of these genes at the beginning of the new cycle, suggesting involvement in preparation for a round of division rather than for entry into extended G1 phase, which is more consistent with their known biological function (6, 24).

Another gene expressed in G1 (P) phase is CDC28, the catalytic subunit of the main yeast cyclin-dependent kinase, which drives progress through the cell cycle (25). Our study, which classifies CDC28 as periodic, challenges the established view (3, 5, 8, 12, 25) that CDC28 is constitutively expressed. We determined that CDC28 expression peaks twice per cycle, first in G1 (P) phase and again in early mitosis (Fig. 4 ج), precisely coinciding with expression waves of its predicted targets (26) (Fig. 4 ح). The periodicity of CDC28 expression in YMC is strikingly clear (SI Fig. 10 ص < 0.00003) it also is not an artifact of metabolic regulation, because a similar profile of CDC28 had been earlier observed under different cell cycle synchronization (1) (SI Fig. 5). The lack of earlier acceptance of CDC28 as transcriptionally regulated seems to be rather an artifact of the Fourier methods used (3, 5, 8), which, although convenient, are unable to deal appropriately with genes expressed twice per cycle (see الملحق SI ).

Our timing results have also clarified when some key cell cycle genes are expressed. For instance, on the basis of experiments with rapidly growing yeast (1, 5), CLB1, SWI5، و CLN3 have all been thought to be expressed during mitosis (1, 5), whereas our data suggest that G2 cyclin CLB1 is expressed in G2, SWI5 in G2/M, and CLN3 upon reentry to the cell cycle, in G1 (P) (see Fig. 2). Similarly, we find that the Swi5-activated cyclin, PCL9, is expressed in mitosis and MCM3 is expressed in G1 (P), and consequently their expression can be delayed by an arbitrarily long G1 phase, although, on the basis of experiments with rapidly growing yeast (1, 5), they were both believed to be expressed in M/G1 (Fig. 2). Our timing results consistently place the expression of these key genes just before the time their products are needed within the cell cycle (6, 24).

Initiation of DNA Replication.

The initiation of DNA replication occurs at the beginning of S phase and requires the prior assembly and subsequent modifications of the prereplicative complex (24), which starts in G1 (P) (Fig. 4 ب). Strikingly, our timing of the expression peaks of CCTR subunits of MCM, replicative complex and elongation complex, corresponds with the exact order in which their gene products are needed (Fig. 4 أ و ب). The subunits of the origin of replication complex, ORC2–6, have not previously been classified as transcriptionally regulated, nor did they pass the stringent criteria of being accepted as CCTR in this study. Still, applying the deconvolution timing to their expression profiles reveals that these genes have expression peaks ≈10 min before the MCM subunits, exactly when their products are needed. This observation raises the possibility that the transcription of ORC2–6 is regulated as a function of the cell cycle, contrary to established beliefs (1, 3, 5, 8) (Fig. 4 أ).

A more detailed view reveals that subunits of the MCM complex are expressed in two groups of three, separated by an ≈8-min interval, with each predicted expression group containing one MCM subunit with a nuclear localization signal (27) (Fig. 4 أ). These results may provide insight into the dynamics of MCM complex assembly and transport from cytoplasm into nucleus (28).

The precision of our timing data reveals that the SBF- and MBF-activated expression programs, thought to be identically timed during the mitotic cell cycle (29), actually differ (Fig. 4 جي). Unlike MBF, whose targets peak predominantly in G1/S phase, targets of SBF are also activated in G1 (P) phase and are generally characterized by a broader time distribution (Fig. 4 جي). This conclusion holds, independent of whether SBF and MBF targets are defined based on evolutionary analysis of conserved binding sites in 17 related fungus species or on various experimental studies (29, 30).

Cell Cycle-Regulated Complexes.

We also timed expression of several other complexes, such as the spindle pole body (SPB) (Fig. 4 ج) (see Table 5 in الملحق SI ). We observed especially tight transcriptional coregulation for complexes active in late G1 and S phase the elapsed time between expression peaks of the first and last CCTR subunits of a complex is between 5 min (RFA) and 22 min (histones) (Fig. 4 ج). Transcription of many non-CCTR subunits of the cell cycle complexes also exhibits variability, allowing for timing, albeit weak. For example, only three subunits of RFC are CCTR, although expression of all five subunits occurs in the same 12-min interval (Fig. 4 ج). ORC2–6 exhibit even weaker modulation, but interestingly their expression timing is nevertheless very consistent with the time in which they function (Fig. 4 أ و ب). The anaphase-promoting complex (APC) contains only two CCTR subunits, although the expression peaks of most of its 16 subunits appear in a time interval broadly corresponding to mitosis (Fig. 4 ج). However, some APC subunits, e.g., Cdh1, seem to be only posttranscriptionally regulated (31).

We generally find more subunits of the cell cycle-involved complexes to be CCTR than was the case in previous studies (2, 5, 8) (Fig. 4 and see الملحق SI and http://cellcycle.info). This difference may be explained by the increased quantity and improved accuracy of cell cycle expression data, together with our comprehensive approach to identifying CCTR genes. In addition to the examples discussed above and complexes involved in DNA replication initiation, we find more components of the septin ring of the mother-bud neck to be CCTR. Previous studies (2, 3, 5, 8) each classified only one septin (either CDC11 أو CDC10) as cell cycle-regulated, whereas we classify three components of the septin ring (CDC11, CDC12، و CDC3) as CCTR. Our classification of CDC11, CDC12، و CDC3 as coregulated is independently supported by timing results (not used for classification), which places their expression peaks within an ≈6-min interval in late S phase.


Data availability

  1. Cho RJ
  2. Campbell MJ
  3. Winzeler EA
  4. Steinmetz L
  5. Conway A
  6. Wodicka L
  7. Wolfsberg TG
  8. Gabrielian AE
  9. Landsman D
  10. Lockhart DJ
  11. Davis RW
  1. Jensen LJ
  2. Kuhn M
  3. Stark M
  4. Chaffron S
  5. Creevey C
  6. Muller J
  7. Doerks T
  8. Julien P
  9. Roth A
  10. Simonovic M
  11. Bork P
  12. von Mering C
  1. Kozar K
  2. Ciemerych MA
  3. Rebel VI
  4. Shigematsu H
  5. Zagozdzon A
  6. Sicinska E
  7. Geng Y
  8. Yu Q
  9. Bhattacharya S
  10. Bronson RT
  11. Akashi K
  12. Sicinski P
  1. Lamond AI
  2. Uhlen M
  3. Horning S
  4. Makarov A
  5. Robinson CV
  6. Serrano L
  7. Hartl FU
  8. Baumeister W
  9. Werenskiold AK
  10. Andersen JS
  11. Vorm O
  12. Linial M
  13. Aebersold R
  14. Mann M
  1. Luber CA
  2. Cox J
  3. Lauterbach H
  4. Fancke B
  5. Selbach M
  6. Tschopp J
  7. Akira S
  8. Wiegand M
  9. Hochrein H
  10. O’Keeffe M
  11. Mann M
  1. Matys V
  2. Kel-Margoulis OV
  3. Fricke E
  4. Liebich I
  5. Land S
  6. Barre-Dirrie A
  7. Reuter I
  8. Chekmenev D
  9. Krull M
  10. Hornischer K
  11. Voss N
  12. Stegmaier P
  13. Lewicki-Potapov B
  14. Saxel H
  15. Kel AE
  16. Wingender E
  1. Ohta S
  2. Bukowski-Wills JC
  3. Sanchez-Pulido L
  4. Alves Fde L
  5. Wood L
  6. Chen ZA
  7. Platani M
  8. Fischer L
  9. Hudson DF
  10. Ponting CP
  11. Fukagawa T
  12. Earnshaw WC
  13. Rappsilber J
  1. Olsen JV
  2. Vermeulen M
  3. Santamaria A
  4. Kumar C
  5. Miller ML
  6. Jensen LJ
  7. Gnad F
  8. Cox J
  9. Jensen TS
  10. Nigg EA
  11. Brunak S
  12. Mann M
  1. Ramaswamy S
  2. Tamayo P
  3. Rifkin R
  4. Mukherjee S
  5. Yeang CH
  6. Angelo M
  7. Ladd C
  8. Reich M
  9. Latulippe E
  10. Mesirov JP
  11. Poggio T
  12. Gerald W
  13. Loda M
  14. Lander ES
  15. Golub TR
  1. Su AI
  2. Cooke MP
  3. Ching KA
  4. Hakak Y
  5. Walker JR
  6. Wiltshire T
  7. Orth AP
  8. Vega RG
  9. Sapinoso LM
  10. Moqrich A
  11. Patapoutian A
  12. Hampton GM
  13. Schultz PG
  14. Hogenesch JB
  1. Subramanian A
  2. Tamayo P
  3. Mootha VK
  4. Mukherjee S
  5. Ebert BL
  6. Gillette MA
  7. Paulovich A
  8. Pomeroy SL
  9. Golub TR
  10. Lander ES
  11. Mesirov JP
  1. Tian Q
  2. Stepaniants SB
  3. Mao M
  4. Weng L
  5. Feetham MC
  6. Doyle MJ
  7. Yi EC
  8. Dai H
  9. Thorsson V
  10. Eng J
  11. Goodlett D
  12. Berger JP
  13. Gunter B
  14. Linseley PS
  15. Stoughton RB
  16. Aebersold R
  17. Collins SJ
  18. Hanlon WA
  19. Hood LE
  1. Uhlen M
  2. Oksvold P
  3. Fagerberg L
  4. Lundberg E
  5. Jonasson K
  6. Forsberg M
  7. Zwahlen M
  8. Kampf C
  9. Wester K
  10. Hober S
  11. Wernerus H
  12. Björling L
  13. Ponten F
  1. Whitfield ML
  2. Sherlock G
  3. Saldanha AJ
  4. Murray JI
  5. Ball CA
  6. Alexander KE
  7. Matese JC
  8. Perou CM
  9. Hurt MM
  10. Brown PO
  11. Botstein D
  1. Zhu J
  2. Heyworth CM
  3. Glasow A
  4. Huang QH
  5. Petrie K
  6. Lanotte M
  7. Benoit G
  8. Gallagher R
  9. Waxman S
  10. Enver T
  11. Zelent A

المواد والأساليب

Strains, Plasmids, Growth Conditions, and Genetic Methods

Yeast strains and plasmids are described in Table and Table. Standard yeast genetic procedures and media (Rose et al. 1990) were used, unless specified. For producing a bud3 deletion, plasmid pJC15 (Chant et al. 1995) carrying the bud3 deletion was linearized with BamHI and EcoRI and transformed into strain JC1030. Ura + transformants that exhibited the bipolar pattern were isolated.

Plasmid Construction

PJC16 (prom GAL1 -BUD3).

An EcoRI/BamHI GAL1 promoter fragment was liberated from pRS316-GAL (E. Bi, University of Pennsylvania Medical School, Philadelphia, PA). An isolate of BUD3 in YCp50, p35-1 (Chant et al. 1995), was digested with BamHI and SalI to liberate the BUD3 منطقة. The linearized YCp50 was then digested with EcoRI. ال GAL1 promoter fragment and the BUD3 fragment were then double ligated into the EcoRI/SalI YCp50 to yield BUD3 under the control of the GAL1 promoter.

PJC117 (prom MET3 -hemagglutinin [HA]-BUD3).

A 700-bp MET3 promoter region was amplified from JC1030 genomic DNA with Pfu polymerase (Stratagene) using primers: MET3promoter (prom) 1 -BamHI-5′ (5′-GCGCGCGGATCCAATACCCGTCAAGATAAGAG-3′) and MET3prom-HindIII-3′ (5′-GCGCGCAAGCTTGTTAATTATACTTTATTCTTG-3′). ال MET3 promoter was ligated into pAD5 via the BamHI and HindIII sites of the primers, replacing the alcohol dehydrogenase promoter of pAD5. ال BUD3 sequence was PCR amplified with Pfu polymerase from p35-1, and the fragment was ligated into MET3 promoter-containing pAD5 via SalI and SacI sites present in the vector and the primers. Primers were BUD3-SalI-5′ (5′-CTATGTCGACTATGGA-GAAAGACCTGTCGTC-3′) and BUD3-SacI-3′ (5′-GACTGAGCT-CTCCGATAATTCTCACAGG-3′).

PJC1869 (prom MET3 -BUD10-HA).

623 bp of the 5′ portion of the BUD10 coding region were amplified from pJC246 with Pfu polymerase using the primers BUD10-KpnI-5′ (5′-CCCCCCGGTACCATGACACAGCTTCAGATTT-3′) and BUD10-AgeI-3′(5′-GAAAATCCTTCAATGTCTGTAGCG-3′). pJC246 was linearized by KpnI and AgeI, which resulted in excision of the BUD10 promoter and 623 bp of the BUD10 open reading frame up to the unique AgeI site. This linearized plasmid was gel purified and ligated with the 5′ BUD10 PCR product that had been digested with KpnI and AgeI. The resulting construct (pJC255) contained BUD10-HA lacking the BUD10 promoter. BUD10-HA was excised from pJC255 by digestion with KpnI and SpeI, gel purified, and ligated into KpnI/SpeI linearized pJC1830 to yield pJC1869 carrying BUD10-HA تحت MET3 promoter.

PJC256 and pJC257 (prom BUD3 -BUD10-HA).

600 bp of BUD3 upstream sequence were amplified from p35-1 with Pfu polymerase using the primers BUD3prom-EcoRI-KpnI-5′ (5′-GGGGAATTCGGTACCCCGGATCCTGTATTATATCCAGTAA-3′) and BUD3prom-EcoRI-KpnI-3′ (5′-GGGGAATTCGGTACCTGGTGAGGTGTAAATATACTCTTT-3′). The PCR product was ligated into pBluescript via the EcoRI sites of the primers. Ligation products were digested with KpnI to liberate the BUD3 promoter, which was ligated into the KpnI site of pJC255. Two resulting constructs (pJC256 and pJC257) were sequenced (Harvard Medical School, DNA Core Facility), and it was confirmed that the constructs carried BUD10 تحت BUD3 promoter.

Overexpression of BUD3

ال BUD3-overexpression construct (pJC16) and YCp50 (control vector) were transformed into EJY301. Ura + colonies carrying the plasmids were selected. Each transformant was grown overnight in Ura − glucose complete synthetic medium (CSM). The cultures were divided into two samples, harvested, washed twice, and resuspended in either Ura − glucose or Ura − galactose CSM for 24 h. Morphological analysis of cells was performed by counting normally dividing cells versus cells producing elongated buds. For each sample, 600 cells were scored. Visualization of Cdc3-HA in all samples was performed by immunofluorescence, as described below.

Preparation of RNA Samples from Synchronized Cell Cultures

JC1362 (containing wild-type copies of BUD3 و BUD10) in rich medium, JC2123 carrying pJC117 (prom MET3 -BUD3) in Leu − Met − CSM, JC2133 carrying pJC256 (prom BUD3 -BUD10) in Trp − CSM, and JC2133 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) in Trp − Met − CSM were grown up overnight in 500-ml cultures at 25°C. When cultures reached an optical density at 600 nm (OD600) of ∼0.15, they were harvested and resuspended in 500 ml of their respective growth media that had been prewarmed to 37°C. cdc15-2 ts –based arrest was attained by incubation of cultures at 37°C for 4.5 h. Arrest was confirmed microscopically and cells were chilled on ice for 5–10 min before resumption of growth at 25°C (0 min after release from arrest). Samples (25 ml) were harvested every 15 min (for JC1362) or 30 min (for all others), frozen in liquid nitrogen, and stored at −80°C at time points from 0–240 min after arrest. These 25-ml samples were used for subsequent RNA sample preparation. The Hot Phenol Method of total RNA preparation (Köhrer and Domdey 1991) was used. In addition, at every time point, 1 ml of culture was fixed in 4% formaldehyde for 30 min at 30°C. These samples were used to determine the budding index (the number of budded cells versus unbudded cells). For the initial portions of the synchronizations (60 min for Fig. 1, Fig. 3, and Fig. 4, and 90 min for Fig. 2 and Fig. 6) a modification of this basic method was used. Cells were scored as small budded versus other, due to the fact that cells recovering from the cdc15-2 block are delayed in completing cell separation. Cultures synchronized in identical fashion were used to correlate budding index with spindle morphology.

Northern Blotting

Standard methods were employed (Sambrook et al. 1989) with the following modifications. 5 μl of RNA samples were mixed with 10 μl of RNA loading buffer (Ambion) and run on 1% agarose-MOPS gels containing 6% formaldehyde. Running buffer was 1× MOPS. Gels were washed five times in 0.1% diethyl pyrocarbonate–treated water then by a 45-min equilibration in 20× SSC. RNA was subjected to capillary transfer overnight onto Zeta Probe (Bio-Rad Laboratories) nylon membranes. Membranes were washed for 5 min in 6× SSC and dried at room temperature for 30 min on paper towels before baking them in a vacuum oven at 80°C for 1.5 h. Membranes were prehybridized for 1 h in UltraHyb (Ambion) at 55°C then hydridized overnight at 55°C with the appropriate radioactively labeled probes. 0.5–1.5 kb of BUD3, BUD10, LEU2، أو ACT1 were PCR amplified, gel purified, and used as templates for the manufacture of probes through the use of the “Prime-a Gene” Labeling System (Promega). After hybridization, membranes were washed twice at 55°C for 15 min in 2× SSC/0.1% SDS, and then by two washes for 30 min in 0.1× SSC/0.1% SDS. Blots were exposed to a BAS-III Imaging Plate (Fuji) for appropriate times. The Imaging Plate was processed by a Fujix BAS 2000 Imager (Fuji). Images were analyzed by MacBAS V2.5 (Fuji). Blots were stripped for reprobing by washing three times for 20 min in 0.1× SSC/0.5% SDS at 95°C.

Immunofluorescence and Calcofluor Staining

JC1997 carrying pJC117 (prom MET3 -BUD3) was grown overnight in Leu − Met − CSM. JC1296 carrying pJC246 (prom BUD10 -BUD10) or pJC256 (prom BUD3 -BUD10) was grown in Trp − CSM overnight. JC1296 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) was grown in Trp − Met − CSM overnight. At an OD600 of 0.3–0.5, cells were fixed in 4% formaldehyde at 30°C for 30–60 min and washed three times in PBS. Indirect immunofluorescence was performed as described by Pringle et al. 1991. A mouse anti-HA epitope monoclonal antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) or rabbit anti-Bud3p antibody (Chant et al. 1995) was used to visualize the two proteins. The secondary antibodies used were CY3-conjugated goat anti–mouse IgG and FITC-conjugated goat anti–rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Microtubule staining was performed as described in Chant et al. 1995. Budding patterns were scored by staining bud scars with Calcofluor and observing with fluorescence microscopy (Pringle 1991) 200–300 cells were scored for each set of counts. Fluorescence microscopy was performed using a Nikon Microphot SA microscope with a 63× Plan-apo objective.

Western Blot Analysis

15 OD600 units of cells were harvested and washed with distilled water. Cells were resuspended in 150 μl lysis buffer (1% SDS, 2 mM PMSF plus protease inhibitors) and lysed with glass beads by vortexing on ice for a total of 6 min. 100 μl of lysis buffer was added to the extracts that were then centrifuged at 500 g for 2 min. Lysates were decanted and stored at −80°C if they were not required immediately. The protein concentrations of the lysates were determined using Pierce Coomassie Plus protein reagent (Pierce Chemical Co.). Equal protein levels from each lysate were loaded onto an SDS-PAGE gel and immunoblotted by standard methods (Sambrook et al. 1989). Mouse anti-HA epitope monoclonal primary antibodies (Jackson ImmunoResearch Laboratories) were used at a dilution of 1:500. Secondary antibodies were goat anti–mouse antibodies conjugated to horseradish peroxidase (Sigma–Aldrich) used at a dilution of 1:2,500. Blots were developed using the ECL Western blotting detection system (Amersham Pharmacia Biotech). Autoradiographs were scanned and the protein bands were quantitated using the MacBAS V2.5 program.

Pulsed Expression Experiments

Unsynchronized Cells.

JC1296 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) was grown in repressing conditions (4 mM methionine, Trp − CSM) overnight. At an OD600 of ∼0.25, cells were spun down and washed three times in inducing medium (Trp − Met − CSM), and followed by a 30 min incubation in the same medium. Induction of BUD10 expression was terminated by the addition of 4 mM methionine. Samples were harvested and fixed in formaldehyde (as described above) at 0, 60, and 120 min after cells were removed from inducing conditions. All samples were washed three times in PBS. Samples were subjected to analysis by immunofluorescence, as described above. Typically, 100 cells were scored per sample.

Synchronized Cells.

JC2133 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) was grown up at 25°C in repressing conditions (4 mM methionine, Trp − CSM) overnight. Cell synchronization was achieved as described earlier using the cdc15-2 ts mutation. The synchronized culture was divided in two: one half for late G1 induction and the other half for S/G2 induction. All subsequent incubations were performed at 25°C. 35 min after release from cell cycle arrest, late G1 induction was performed by the following method: cells were washed three times in inducing medium (Trp − Met − CSM) and incubated 45 min in the same medium. Induction was terminated by addition of 4 mM methionine and an additional brief incubation. At 90 min after release from arrest, cell samples were taken and fixed (as performed above). Cells were washed three times in PBS and subjected to analysis by immunofluorescence. S/G2 induction was performed in identical fashion, but 110 min after release from cell cycle arrest.


Cell cycle-regulated genes and mRNA - Biology

View Figures
View figures from the paper

بحث
Search the complete dataset

Download Data
Download images and primary data tables

معلومة
Information on how to use this site and scientific methods

الروابط
Useful sites relating to microarrays and the cell cycle

Contacts
Contact information for individuals involved with the cell cycle project

The yeast cell cycle analysis project's goal is to identify all genes whose mRNA levels are regulated by the cell cycle. This site complements the published information from:

Spellman وآخرون., (1998). Comprehensive Identification of Cell Cycle-regulated Genes of the Yeast خميرة الخميرة by Microarray Hybridization. Molecular Biology of the Cell 9, 3273-3297.

Full text of the paper is available from the Journal's website here .


Request permission to reuse content from this site

Partial table of contents:

RNA Structure (E. Puglisi & J. Puglisi).

Transcription and Transcriptional Control: An Overview (I. Olave,et al.).

Constitutive and Alternative mRNA Splicing (S. Bernstein & D.Hodges).

mRNA Polyadenylation: Functional Implications (E. Baker).

RNA Export from the Nucleus (L. Maquat).

The Intracellular mRNA Sorting System: Postal Codes, Zip Codes,Mail Bags and Mail Boxes (O. Steward & R. Singer).

The Fundamentals of Translation Initiation (H. Huang & T.Donahue).

Mechanisms of mRNA Turnover in Eukaryotic Cells (S. Tharun & R.Parker).

Control of mRNA Decay in Plants (A. van Hoof & P. Green).

mRNA Metabolism and Cancer (M. Korth & M. Katze).

Translational Regulation in Animal Virus-Infected Cells (R.Schneider).

RNA Decay by the Interferon-Regulated 2-5A System as a Host DefenseAgainst Viruses (R. Silverman & N. Cirino).


شاهد الفيديو: كيف تحمي نفسك من التشوه الجيني و الوراثي (كانون الثاني 2022).