معلومة

3.3E: الفحص المجهري متحد البؤر - علم الأحياء


أهداف التعلم

  • قارن وقارن بين الفحص المجهري متحد البؤر والفلورة

الفحص المجهري متحد البؤر هو تقنية تصوير فلورية غير جراحية تستخدم أشعة الليزر بألوان مختلفة للمسح عبر عينة بمساعدة مسح المرايا. يتم وضع نقطة الإضاءة للتركيز في العينة بواسطة العدسة الموضوعية. تستخدم عملية المسح جهازًا يخضع لتحكم الكمبيوتر. يتم الكشف عن تسلسل نقاط الضوء من العينة بواسطة أنبوب مضاعف ضوئي من خلال ثقب. يتم تضمين الإخراج في صورة ويتم نقله إلى شاشة كمبيوتر رقمية لمزيد من التحليل. تستخدم التقنية التقسيم البصري لأخذ شرائح متسلسلة من الصورة. يتم بعد ذلك تكديس الشرائح (Z-stack) لإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد للعينة البيولوجية. التقسيم البصري مفيد في تحديد توطين الخلايا للأهداف. العينة البيولوجية المراد دراستها ملطخة بأجسام مضادة مرتبطة كيميائيا بأصباغ فلورية مشابهة للطريقة المستخدمة في الفحص المجهري الفلوري. على عكس الفحص المجهري التقليدي حيث ينبعث التألق على طول المخروط المضيء بالكامل مما يخلق صورة ضبابية ، في الفحص المجهري متحد البؤر ، تتم إضافة الثقب ذي الثقب للسماح بمرور الضوء الذي يأتي من نقطة بؤرية محددة على العينة وليس الأخرى. ينشئ الضوء المكتشف صورة في بؤرة العينة الأصلية. الفحص المجهري متحد البؤر له تطبيقات متعددة في علم الأحياء الدقيقة مثل دراسة الأغشية الحيوية وسلالات البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. تم تسريع تطوير المجاهر البؤرية الحديثة من خلال التطورات الجديدة في تكنولوجيا الكمبيوتر والتخزين ، وأنظمة الليزر ، وأجهزة الكشف ، ومرشحات التداخل ، وفلوروفور لأهداف محددة للغاية.

النقاط الرئيسية

  • يتطلب الفحص المجهري متحد البؤر تلطيخ المناعي للعينات البيولوجية.
  • يعمل الفحص المجهري متحد البؤر على التحكم في عمق المجال ، والقضاء على الخلفية ، وجمع المقاطع البصرية.
  • توسع استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لدراسة كل من الخلايا الثابتة والحية مع القدرة على تحديد الأهداف.

الشروط الاساسية

  • أنبوب مضاعف ضوئي: أنبوب مفرغ يكتشف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية والقريبة من الأشعة تحت الحمراء ويضاعفها 100 مليون مرة.

الفحص المجهري بالرنين المغناطيسي النووي

ميشال نيمان ، لوريل أو.سيلرود ، في الرنين المغناطيسي النووي في علم وظائف الأعضاء والطب الحيوي ، 1994

II الدقة والحساسية في مجهر الرنين المغناطيسي النووي

تتمثل عوامل الجذب الرئيسية في الفحص المجهري بالرنين المغناطيسي النووي في عدم توغلها ، والقدرة على فحص الطبقات الداخلية للعينات المعتمة التي لا يمكن الاقتراب منها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، وحساسيتها للمعلمات الفريدة مثل الانتشار ، والتروية ، والتدفق ، والتمثيل الغذائي. تقع دقة الفحص المجهري بالرنين المغناطيسي النووي في الطرف السفلي من الطرق المجهرية الضوئية ، مع عرض أفضل الصور التي تم الحصول عليها حتى الآن بدقة مستوية تبلغ حوالي 5 ميكرومتر. في هذا القسم ننظر إلى القيود الحالية على دقة الصورة والسبل الممكنة لتحقيق اختراق.

يتم الحصول على الترميز المكاني في الفحص المجهري بالرنين المغناطيسي النووي عن طريق وضع علامات على الدورات باستخدام تحول طور يعتمد على الموضع من خلال تطبيق تدرجات مجال مغناطيسي متعامدة تعتمد على الوقت. على عكس الفحص المجهري للضوء والإلكترون ، فإن الدقة لا تتعلق بالطول الموجي للإشعاع الكهرومغناطيسي. يعتمد القرار على أصغر تحول طور يمكن قياسه. ومع ذلك ، فإن فرق إزاحة الطور بين نقطتين يعتمد على تدرج المجال المغناطيسي المطبق. وبالتالي ، من خلال زيادة تدرج المجال المغناطيسي ، من الممكن تحسين الدقة المكانية.

هل هناك حد أساسي للدقة المكانية في الفحص المجهري بالرنين المغناطيسي النووي؟ الحساسية هي الحد العملي السائد للاستبانة المكانية. يفرض فقدان الدقة بسبب توسيع الخط عن طريق الاسترخاء ، وقابلية الحجم الأكبر ، والانتشار حدًا أساسيًا أكثر للقرار ولكنه يحدث بشكل أبطأ من الفقد غير القابل للانعكاس للإشارة بسبب تقليل حجم البكسل وتشتت الطور عن طريق الانتشار في وجود تدرجات مجال كبيرة (Ahn وتشو ، 1989 تشو وآخرون. ، 1988 McFarland ، 1992 Callaghan and Eccles ، 1987 ، 1988 Callaghan ، 1990). يعتمد معدل فقدان الإشارة بشكل كبير على تتابع النبضة التجريبية ويكون بشكل عام أعلى لتشفير التردد منه لتشفير الطور. وبالتالي ، ربما يكون ترميز الطور ثلاثي الأبعاد هو الطريقة الأكثر حساسية التي تعد بأعلى دقة مكانية وإن كان ذلك على حساب أوقات الاستحواذ الأطول.

تنبأت حسابات حد الانتشار الأساسي للقرار بقيمة حوالي 10 ميكرومتر للمياه المجانية (Callaghan and Eccles ، 1987). تجاهل هذا التوقع تحسين الدقة الواضح بسبب الانتشار المعوق أو المقيد في معظم الحالات التي يكون فيها القرار له أي معنى عملي. لقد أثيرت هذه النقطة المهمة في عدد من الدراسات (Hyslop and Lauterbur، 1991 Zawodzinski وآخرون. ، 1992). في التطبيقات البيولوجية والطبية ، نحن مهتمون بحل الهياكل "المختلفة" جسديًا. قد يعني ذلك تغييرًا في الاسترخاء ، أو الانتشار ، أو التركيب الكيميائي ، أو وجود غشاء بين الهيكلين. ستؤثر أي من هذه التغييرات على الصورة فورًا بطريقة تعزز التمييز بين الهيكلين. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي المياه داخل الخلايا على معاملات انتشار أقل بكثير من تلك الخاصة بالمياه المجانية التي تقلل من تأثير "تلطيخ" الانتشار بشكل أكبر.

نظرًا لأن الحساسية هي القيد العملي السائد على الدقة المكانية ، يمكننا أن نرى اتجاهًا إلى مجالات مغناطيسية أعلى. يتم فقدان مكاسب الدقة الناتجة عن زيادة شدة الإشارة إلى حد ما بسبب زيادة الحساسية المغناطيسية. يمكن التغلب على تأثير توسيع الخط هذا جزئيًا عن طريق تطبيق تدرجات مجال مغناطيسي أعلى على حساب مزيد من إزالة الطرح وتخفيف الإشارة بسبب الانتشار الجزيئي.

يشير تطبيق المجالات المغناطيسية العالية جنبًا إلى جنب مع أحجام العينات الصغيرة وملفات الترددات الراديوية الصغيرة إلى أن الضوضاء الناتجة عن ملف الاستقبال والإلكترونيات تهيمن ، على عكس ضوضاء العينة الكبيرة في التصوير السريري. وبالتالي يمكن الحصول على تحسن كبير في الإشارة إلى الضوضاء عن طريق تقليل الضوضاء الناتجة عن ملف الترددات اللاسلكية. قد يكون أحد الأمثلة الممتازة لاختراق محتمل في هذا الاتجاه هو تطبيق ملفات التردد الراديوي ذات التوصيل الفائق البارد ذات درجة الحرارة العالية. لقد أظهر هذا النهج بالفعل تحسنًا بمقدار 10 أضعاف مقارنة بالملفات النحاسية التقليدية بدرجة حرارة الغرفة (أسود وآخرون., 1993 ).

دقة الصورة محدودة أيضًا بالقدرة على حل الهياكل ذات التباين الكافي. بهذا المعنى ، يوفر لنا NMR مجموعة واسعة من آليات التباين الممكنة. التباين بسبب الاختلافات في كثافة الدوران وبسبب تي1 و تي2 يؤثر الاسترخاء على الفحص المجهري بالرنين المغناطيسي النووي بطريقة مشابهة لتأثيراتها في التصوير بالرنين المغناطيسي التقليدي ولا تتم مناقشتها هنا. نظرًا لتدرجات المجال المغناطيسي الكبيرة المستخدمة في الفحص المجهري بالرنين المغناطيسي النووي والتغيرات الكبيرة في حرية الحركة للأنظمة البيولوجية ، يعد الانتشار آلية تباين سائدة ويتم التعامل معها بالتفصيل في القسم التالي. التدرجات المستخدمة في معظم دراسات الفحص المجهري بالرنين المغناطيسي النووي من 10-50 جم / سم تسبب توهينًا كبيرًا في شدة الإشارة في مناطق الماء الحر ، مثل الفراغ الخلالي والفجوات. من ناحية أخرى ، تظهر المناطق ذات الانتشار البطيء للماء مشرقة. وتجدر الإشارة إلى أن الطريقة الروتينية ل تي2- التصوير الموزون أي طويل تيه، يؤدي في كثير من الأحيان أيضًا إلى زيادة وزن الانتشار. آثار ال تي2 والانتشار يمكن أن يكونا معاكسين ويجب توخي الحذر لمنع فقدان التباين بسبب توهين الإشارة للأنواع غير المتحركة تي2 وفقدان الإشارة من الأنواع المتنقلة بالانتشار.

شعرنا أن حساسية إشارة الرنين المغناطيسي النووي للانتشار الجزيئي توفر فرصة فريدة لدراسة الأنظمة التي يلعب فيها الانتشار دورًا حيويًا. لتحقيق هذه الغاية ، نظرنا بالتفصيل في تأثيرات الانتشار على شدة إشارة الرنين المغناطيسي النووي في أنظمة أحادية ومتعددة الأجزاء وفي الأنظمة ذات الانتشار متباين الخواص.


مرفق الفحص المجهري والتصوير

يقع في الطابق الأول من Langley Hall ، مرفق الفحص المجهري والتصوير التابع للقسم مجهز بأحدث التسهيلات للضوء ، متحد البؤر ، والمجهر الإلكتروني للصور الرقمية والتلاعب بالفيديو والطباعة كبيرة الحجم. يضم الجناح كلاً من المجاهر الإلكترونية للمسح الضوئي والإرسال بالإضافة إلى نظام كامل للمسح المجهري متحد البؤر بالليزر مع إعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد باستخدام محطة عمل رسومية. يعمل في هذا المرفق متخصص في الميكروسكوب بدوام كامل ، السيد توم هاربر ، لمساعدة الطلاب والباحثين في مشاريعهم ، ويقع في الطابق الأول من لانجلي هول.

مجهر Leica TCS SP5 متحد البؤر ومتعدد الفوتونات هو أحدث مجهر مسح بالليزر يتميز بضبط الطول الموجي واسع النطاق لأطوال موجات الانبعاث والكشف ، بالإضافة إلى سرعات مسح عالية وتصوير متعدد الفوتونات. يعتبر mciroscope مثاليًا للعينات الحية وتصوير الفلورسنت الأعمق.

مجهر أوليمبوس FV1000 فلوفيو المسح بالليزر البيولوجي هي عبارة عن نظام أساسي متحد البؤر متطور للغاية يستخدم مجموعة من ليزرات الصمام الثنائي المستقرة والباردة ، وقنوات متعددة للتصوير الصبغي المتزامن ، والبصريات عالية الجودة. يوفر المجهر دقة ممتازة وحساسية عالية وتقدير دقيق.


قسم علم الأحياء

يقع مرفق الفحص المجهري متحد البؤر التابع لـ UNCG في SSB 353. يوفر المرفق الوصول إلى معدات الفحص المجهري متحد البؤر وموارد معالجة الصور. الوصول على أساس رسوم للاستخدام.

تم شراء هذا المجهر متحد البؤر ودعمه بمنحة DBI-0319021 من National Science Foundation ، ومنحة 2003-IDG-1011 من مركز نورث كارولينا للتكنولوجيا الحيوية ، وبتمويل من قسم البيولوجيا التابع لـ UNCG ومكتب وكيل الجامعة.

موارد المرافق

الأهداف المتاحة:
الموضع 1: UPlanApo 10x / 0.40 infinity 8 / 0.17
موقف 2: UPlanApo 20x / 0.70 infinty 8 / 0.17
الموضع 3: UPlanFL 40x / 1.30 Oil infinity 8 / 0.17
الموضع 4: PlanApo 60x / 1.40 Oil infinity 8 / 0.17
موقف 5: فتح
الموضع 6: UPlanApo 40x / 0.85 ما لا نهاية 8 0.11-0.23
متاح للاستخدام عند الطلب:
UplanApo 60x / 1.20 Water infinity 8 0.13-0.21

وحدات مرآة الإسفار UIS:
DICT ، TRITC ، DAPI ، CY5 ، FITC

الليزر المتاح:
ليزر الأرجون متعدد الخطوط (457 نانومتر ، 488 نانومتر ، 514 نانومتر)
ليزر هيليوم نيون أخضر (543 نانومتر)
ليزر الهيليوم الأحمر النيون (633 نانومتر)
ليزر ديود أزرق (405 نانومتر)

برنامج التحليل التكميلي:
أوليمبوس مايكروليت فايف

محطة عمل تصوير منفصلة مع برنامج مراجعة Fluoview وبرنامج Microsuite متاح للاستخدام.

سياسات

سياسات التسجيل للمستخدمين الداخليين والخارجيين:
جميع السياسات عرضة للتغيير دون إشعار.

يتعين على جميع المستخدمين الخارجيين إجراء ترتيبات الدفع وترتيبات الحجز وتقديم اتفاقية استخدام قبل جلستهم الأولى. يجب التفاوض على كل وقت المستخدم خارج أسواره قبل الحجز الأول.

سوف تتفاوض اللجنة المبنية على جميع مشاكل الاستخدام.

يمكن للمستخدمين الداخليين والخارجيين الاشتراك في الفترات الزمنية المتاحة بحد أقصى 48 ساعة قبل الاستخدام. قم بالتسجيل للحصول على فترة زمنية عن طريق الاتصال بمدير المنشأة لطلبك. إذا كنت غير قادر على الاستفادة من وقتك المحجوز ، فيرجى إبلاغ مدير المنشأة على الفور حتى تتم إزالتك من الجدول الزمني.

عند الحجز في الفترات الزمنية المتاحة ، يرجى تضمين اسمك واسم PI الخاص بك (إن وجد) ورقم الهاتف حيث يمكن الوصول إليك لتأكيد موعدك.

يجب على جميع الطلاب والباحثين إكمال جلسة (جلسات) تدريبية خاصة بمنشآتنا حتى تتم الموافقة على استخدام المرفق ، بالإضافة إلى الحصول على موافقة من مدير المنشأة قبل طلب الوقت.

ساعات عمل المنشأة هي من الاثنين إلى الجمعة من 8:00 صباحًا إلى 5:00 مساءً. المرفق مغلق خلال جميع الإجازات الجامعية المعترف بها. بعد ساعات الوصول إلى المرفق متاح للمستخدمين المعتمدين فقط.

يتحمل أعضاء هيئة التدريس في UNCG وجميع الباحثين الخارجيين المسؤولية الكاملة عن طلابهم و / أو الموظفين الفنيين الذين يستخدمون المنشأة.

يرجى الإبلاغ عن أي مشكلات ميكانيكية أو فنية تتعلق بمعدات المنشأة إلى مدير المنشأة على الفور عبر البريد الصوتي. هذا ينطبق على جميع حالات الطوارئ التي تحدث في أي وقت. اطلب (336) 256-0574 (6-0574)

بعض المرافق البؤرية العامة ، ما يجب أن تمارسه وما يجب أن تمارسه:

لاتفعل المس أي شيء على الرف الذي يجلس عليه الليزر متعدد الخطوط
يفعل تغطية النطاق بعد الاستخدام! لاتفعل تغطية وحدة epifluorescent حتى تبرد تماما!
لاتفعل قم بتغيير أي إعدادات أداة في البرنامج والتي لن تتم إعادة تعيينها إلى القيمة الافتراضية بعد إغلاق البرنامج
يفعل كن حذرا عند استخدام زيت الغمر. إن كل من 40x و 60x الموجود في الموضعين 3 و 4 على الأنف هما هدفان لغمر الزيت. 40x في الموضع 6 هو درجة جفاف عالية.
يفعل اترك مروحة تبريد ليزر الأرجون متعددة الخطوط قيد التشغيل. هذا سوف يقطع نفسه بعد 3 دقائق. ثم قد يتم إيقاف تشغيل مفتاح التبديل.
لو سمحت اترك المرفق كما وجدته. نظيفة ومستقيمة

إذا لم تكن متأكدًا من الاستخدام الصحيح لأي من المعدات في مرفق الفحص المجهري متحد البؤر ، فيرجى طرح سؤال قبل أن تقوم بافتراض مكلف.

رسوم موارد المنشأة

يجب على جميع المستخدمين الخارجيين اتخاذ الترتيبات للجدولة والفواتير والدفع قبل استخدام المرفق.
يتم فرض جميع الرسوم على أساس ربع ساعة.
الرسوم المذكورة أدناه تُفرض على حسابات مستخدمي UNCG كل ثلاثة أشهر اعتبارًا من 01/01/2010

مستخدم المعدل بالساعة لكي يتضمن:
UNCG داخلي $30.00 التعليمات الفنية والإشراف المحدود
UNCG داخلي $60.00 المساعدة التقنية
مستخدم خارج أسوار $110.00 التعليمات الفنية والإشراف المحدود
مستخدم خارج أسوار $170.00 المساعدة التقنية

حجز الموارد

إذا كنت مستخدمًا داخليًا مهتمًا بموعد الحجز ، فيرجى الاتصال بمدير المنشأة للقيام بذلك.

عند حجز المواعيد المتاحة من خلال Calcium ، يرجى تضمين اسمك واسم PI الخاص بك (إن أمكن) ورقم الهاتف حيث يمكن الوصول إليك لتأكيد موعدك.

اتصالات المنشأة

رئيس اللجنة المتحد البؤر: جون تومكيل دين ، دكتوراه.

الكادر الفني / مدير المرافق / الاتصال في حالات الطوارئ
لي جريفين
هاتف المكتب (336) 334-4976


3.3E: الفحص المجهري متحد البؤر - علم الأحياء

يوفر الفحص المجهري متحد البؤر العديد من المزايا على الفحص المجهري البصري التقليدي ، بما في ذلك عمق المجال الذي يمكن التحكم فيه ، والقضاء على المعلومات الخارجة عن نطاق التركيز المهينة للصورة ، والقدرة على جمع المقاطع البصرية التسلسلية من العينات السميكة. مفتاح النهج المتحد البؤر هو استخدام التصفية المكانية للتخلص من الضوء الخارج عن التركيز أو التوهج في العينات التي تكون أكثر سمكًا من مستوى التركيز. كان هناك انفجار هائل في شعبية الفحص المجهري متحد البؤر في السنوات الأخيرة ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى السهولة النسبية التي يمكن من خلالها الحصول على صور عالية الجودة للغاية من العينات المعدة للفحص المجهري البصري التقليدي ، وفي عدد كبير من التطبيقات في العديد مجالات الاهتمام البحثي الحالي. قم بزيارة التعابير الجزيئية ومقالات Nikon MicroscopyU والمعارض والبرامج التعليمية التفاعلية ومراجع الويب باستخدام الروابط المتوفرة أدناه.

محاكى مجهر متحد البؤر المسح بالليزر - ربما كان أهم تقدم في الفحص المجهري البصري خلال العقد الماضي هو تحسين تقنيات المجهر متحد البؤر الماسح بالليزر (LSCM) باستخدام مجسات الفلورسنت الاصطناعية المحسنة والبروتينات المهندسة وراثيا ، طيف أوسع من مصادر ضوء الليزر المقترنة من أجل التحكم في المرشح القابل للضبط الصوتي والبصري عالي الدقة ، والجمع بين حزم البرامج الأكثر تقدمًا مع أجهزة الكمبيوتر الحديثة عالية الأداء. يستكشف هذا البرنامج التعليمي التفاعلي التصوير متحد البؤر متعدد الليزر والتداخل التفاضلي (DIC) باستخدام واجهة برنامج مجهر متحد البؤر Olympus FluoView FV1000 كنموذج.

مقدمة في الفحص المجهري متحد البؤر - يوفر الفحص المجهري متحد البؤر العديد من المزايا مقارنة بالمجهر البصري ذي المجال الواسع التقليدي ، بما في ذلك القدرة على التحكم في عمق المجال ، وإزالة أو تقليل معلومات الخلفية بعيدًا عن المستوى البؤري (الذي يؤدي إلى تدهور الصورة) ، والقدرة على جمع المسلسلات المقاطع البصرية من العينات السميكة. المفتاح الأساسي للنهج المتحد البؤر هو استخدام تقنيات التصفية المكانية للتخلص من الضوء أو الوهج البؤري في العينات التي يتجاوز سمكها المستوى المباشر للتركيز. كان هناك انفجار هائل في شعبية الفحص المجهري متحد البؤر في السنوات الأخيرة ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى السهولة النسبية التي يمكن من خلالها الحصول على صور عالية الجودة للغاية من العينات المعدة للفحص المجهري الفلوري التقليدي ، والعدد المتزايد من التطبيقات في بيولوجيا الخلية التي تعتمد على تصوير كل من الخلايا والأنسجة الثابتة والحية. في الواقع ، أثبتت التكنولوجيا البؤرية أنها واحدة من أهم التطورات التي تم تحقيقها على الإطلاق في الفحص المجهري البصري.

المفاهيم الأساسية - تم تطوير الأدوات الحالية بشكل كبير من الإصدارات الأقدم ، ولكن مبدأ التصوير المتحد البؤر الذي طوره مارفن مينسكي ، وحصل على براءة اختراع في عام 1957 ، يتم استخدامه في جميع المجاهر متحد البؤر الحديثة. في مجهر وايدفيلد التقليدي ، تغمر العينة بأكملها في الضوء من الزئبق أو مصدر الزينون ، ويمكن رؤية الصورة مباشرة بالعين أو عرضها على جهاز التقاط صورة أو فيلم فوتوغرافي. في المقابل ، تختلف طريقة تكوين الصورة في مجهر متحد البؤر اختلافًا جوهريًا. يتم تحقيق الإضاءة عن طريق مسح واحد أو أكثر من حزم الضوء المركزة ، عادة من مصدر الليزر أو تفريغ القوس ، عبر العينة. يتم وضع نقطة الإضاءة هذه للتركيز في العينة بواسطة العدسة الموضوعية ، ويتم مسحها ضوئيًا بشكل جانبي باستخدام شكل من أشكال جهاز المسح تحت سيطرة الكمبيوتر. يتم الكشف عن تسلسل نقاط الضوء من العينة بواسطة أنبوب مضاعف ضوئي (PMT) من خلال ثقب (أو في بعض الحالات ، شق) ، ويتم تضمين الإخراج من PMT في صورة ويتم عرضه بواسطة الكمبيوتر. على الرغم من أنه يمكن عرض العينات غير الملوثة باستخدام الضوء المنعكس من العينة ، إلا أنه يتم تمييزها عادةً بواحد أو أكثر من مجسات الفلورسنت.

أوضاع التصوير - يتم استخدام عدد من أوضاع التصوير المختلفة في تطبيق الفحص المجهري متحد البؤر على مجموعة متنوعة من أنواع العينات. تعتمد جميعها على قدرة التقنية على إنتاج صور عالية الدقة ، تسمى أقسام بصرية ، بالتسلسل من خلال أقسام سميكة نسبيًا أو عينات كاملة التركيب. استنادًا إلى القسم البصري كوحدة الصورة الأساسية ، يمكن جمع البيانات من العينات الثابتة والملطخة في أوضاع إضاءة أحادية أو مزدوجة أو ثلاثية أو متعددة الأطوال الموجية ، وستكون الصور التي تم جمعها باستخدام استراتيجيات الإضاءة والتسمية المختلفة مسجلة مع بعضهم البعض. من الممكن تصوير الخلية الحية وتسلسل الفاصل الزمني ، وتسمح طرق معالجة الصور الرقمية المطبقة على تسلسل الصور بتمثيل العينات من السلسلة z وثلاثي الأبعاد ، بالإضافة إلى عرض التسلسل الزمني للبيانات ثلاثية الأبعاد كتصوير رباعي الأبعاد. كان التصوير بالضوء المنعكس هو الوضع المستخدم في الأدوات البؤرية المبكرة ، ولكن يمكن استخدام أي من أوضاع التصوير بالضوء المنقولة المستخدمة بشكل شائع في الفحص المجهري في المجهر متحد البؤر المسح بالليزر.

تحضير العينات والتصوير - إجراءات تحضير وتصوير العينات في المجهر متحد البؤر مشتق إلى حد كبير من تلك التي تم تطويرها على مدى سنوات عديدة لاستخدامها مع مجهر المجال الواسع التقليدي. في العلوم الطبية الحيوية ، يتضمن التطبيق الرئيسي للفحص المجهري متحد البؤر تصوير الخلايا والأنسجة الثابتة أو الحية التي عادةً ما يتم تمييزها بواحد أو أكثر من مجسات الفلورسنت. يتوفر عدد كبير من المجسات الفلورية التي ، عند دمجها في بروتوكولات بسيطة نسبيًا ، تلطخ على وجه التحديد عضيات وهياكل خلوية معينة. من بين عدد كبير من المجسات المتاحة الأصباغ التي تسمي النوى ، وجهاز جولجي ، والشبكة الإندوبلازمية ، والميتوكوندريا ، وكذلك الأصباغ مثل phalloidins المسمى الفلوريسنت التي تستهدف الأكتين المبلمر في الخلايا. بغض النظر عن بروتوكول إعداد العينات المستخدم ، فإن الميزة الأساسية للطريقة التي يتم بها إجراء الفحص المجهري متحد البؤر هي المرونة في عرض الصور وتحليلها الذي ينتج عن الجمع المتزامن للصور المتعددة ، في شكل رقمي ، في الكمبيوتر.

Fluorophores من أجل الفحص المجهري متحد البؤر - يعتمد الفحص المجهري المتحد البؤر للمسح البيولوجي بالليزر بشكل كبير على التألق كطريقة تصوير ، ويرجع ذلك أساسًا إلى درجة الحساسية العالية التي توفرها التقنية إلى جانب القدرة على استهداف المكونات الهيكلية والعمليات الديناميكية على وجه التحديد في التثبيت الكيميائي وكذلك الحي الخلايا والأنسجة. يتم إنشاء العديد من مجسات الفلورسنت حول مواد كيميائية عضوية عطرية اصطناعية مصممة للارتباط بجزيء كبير بيولوجي (على سبيل المثال ، بروتين أو حمض نووي) أو للتوطين داخل منطقة هيكلية معينة ، مثل الهيكل الخلوي ، والميتوكوندريا ، وجهاز جولجي ، والشبكة الإندوبلازمية ، و نواة. يتم استخدام مجسات أخرى لمراقبة العمليات الديناميكية والمتغيرات البيئية المحلية ، بما في ذلك تركيزات الأيونات المعدنية غير العضوية ، ودرجة الحموضة ، وأنواع الأكسجين التفاعلية ، وإمكانات الغشاء. تعد الأصباغ الفلورية مفيدة أيضًا في مراقبة السلامة الخلوية (الحية مقابل الميتة وموت الخلايا المبرمج) ، والتطعيم الخلوي ، وإخراج الخلايا ، وسيولة الغشاء ، وتهريب البروتين ، ونقل الإشارات ، والنشاط الأنزيمي. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق مجسات الفلورسنت على نطاق واسع لرسم الخرائط الجينية وتحليل الكروموسوم في مجال علم الوراثة الجزيئي.

التسييل الطيفي من خلال القطع الأثرية في الفحص المجهري متحد البؤر - يعتبر النزف الطيفي لانبعاث التألق (غالبًا ما يطلق عليه التقاطع أو الحديث المتبادل) ، والذي يحدث بسبب عرض النطاق الترددي الواسع للغاية والملامح الطيفية غير المتماثلة التي تظهر من قبل العديد من الفلوروفورات الشائعة ، وهي مشكلة أساسية يجب أن يتم تناولها في كل من الفحص المجهري مضان متحد البؤر والمسح الضوئي بالليزر. تتجلى هذه الظاهرة عادةً من خلال انبعاث فلوروفور واحد يتم اكتشافه في قناة المضاعف الضوئي أو من خلال مجموعة المرشح المحجوزة للحامل الفلوري الثاني. غالبًا ما تعقد القطع الأثرية التي يتم تمريرها من خلال تفسير النتائج التجريبية ، خاصةً إذا كان التوحيد الخلوي للفلور قيد التحقيق أو كانت القياسات الكمية ضرورية ، كما هو الحال في دراسات نقل طاقة الرنين (FRET) والتبييض الضوئي (FRAP).

اختيار مجموعات فلوروفور للفحص المجهري متحد البؤر - عند التخطيط لبروتوكولات متعددة لتلطيخ الفلورة للتجارب المجهري متعدد البؤر والمسح الضوئي بالليزر ، يعد الاختيار الحكيم للمسبارات أمرًا بالغ الأهمية في الحصول على أفضل إشارة هدف مع تقليل النزف من خلال القطع الأثرية في نفس الوقت. تم تصميم هذا البرنامج التعليمي التفاعلي لاستكشاف مطابقة الفلوروفورات المزدوجة مع خطوط الإثارة بالليزر الفعالة ، وحساب قيم التداخل الطيفي للانبعاثات ، وتحديد مستوى التسييل التقريبي الذي يمكن توقعه كدالة لملفات تعريف الطول الموجي لنافذة الكشف.

أنظمة الليزر للفحص المجهري البصري - الليزر المستخدم عادة في الفحص المجهري البصري هي مصادر ضوء أحادية اللون عالية الكثافة ، وهي مفيدة كأدوات لمجموعة متنوعة من التقنيات بما في ذلك الالتقاط البصري ، ودراسات التصوير مدى الحياة ، واستعادة التبييض الضوئي ، وإجمالي الانعكاس الداخلي. بالإضافة إلى ذلك ، يعد الليزر أيضًا مصدر الضوء الأكثر شيوعًا لمسح مجهر مضان متحد البؤر ، وقد تم استخدامه ، على الرغم من أنه أقل تواترًا ، في تحقيقات الفلورة واسعة النطاق التقليدية.

أمان الليزر - يتمثل الشاغلان الرئيسيان في التشغيل الآمن لليزر في التعرض للشعاع والمخاطر الكهربائية المرتبطة بالجهد العالي داخل الليزر وإمدادات الطاقة الخاصة به. على الرغم من عدم وجود حالات معروفة لإشعاع الليزر الذي يساهم في وفاة شخص ما ، فقد كانت هناك حالات عديدة للوفيات التي تُعزى إلى ملامسة المكونات ذات الصلة بالليزر ذات الجهد العالي. يمكن للحزم ذات الطاقة العالية أن تحرق الجلد ، أو في بعض الحالات تخلق خطرًا عن طريق حرق مواد أخرى أو إتلافها ، ولكن الشاغل الأساسي فيما يتعلق بشعاع الليزر هو الضرر المحتمل للعينين ، وهما الجزء الأكثر حساسية من الجسم. للضوء.

مرشحات ضبط الصوت البصري (AOTFs) - تتحد العديد من مزايا AOTF لتعزيز تنوع أحدث جيل من الأدوات البؤرية ، وقد أصبحت هذه الأجهزة شائعة بشكل متزايد للتحكم في نطاقات الطول الموجي للإثارة وكثافتها. السمة الأساسية التي تسهل كل ميزة تقريبًا لـ AOTF هي قدرتها على السماح بالتحكم المجهري في الكثافة و / أو الطول الموجي للإضاءة على أساس بكسل تلو الآخر مع الحفاظ على معدل مسح عالٍ. تُترجم هذه الميزة الفردية إلى مجموعة متنوعة من أدوات الفحص المجهري التحليلي المفيدة ، والتي يتم تحسينها بشكل أكبر في المرونة عند استخدام إضاءة الليزر.

الدقة والتباين في الفحص المجهري متحد البؤر - جميع المجاهر الضوئية ، بما في ذلك أدوات المجال الواسع التقليدية ، والأدوات البؤرية ، والثنائية الفوتون مقيدة بعوامل فيزيائية أساسية في الدقة التي يمكنها تحقيقها. في نظام بصري مثالي ، تكون الدقة محدودة بفتحة عددية للمكونات الضوئية وطول موجة الضوء ، سواء الحادث أو المكتشف. لا يمكن فصل مفهوم القرار عن التباين ، ويتم تعريفه على أنه الحد الأدنى للفصل بين نقطتين ينتج عنه تباين معين بينهما. في مجهر مضان حقيقي ، يتم تحديد التباين من خلال عدد الفوتونات التي تم جمعها من العينة ، والنطاق الديناميكي للإشارة ، والانحرافات البصرية لنظام التصوير ، وعدد عناصر الصورة (البكسل) لكل وحدة مساحة.

مصادر الضوء غير المتماسكة للفحص المجهري متحد البؤر - يستخدم نظام الإضاءة التقليدي في مجهر المجال الواسع الحديث مصدر هالوجين من التنجستن للضوء المنقول ومصباح قوس قصير لإثارة التألق. تم استخدام العديد من أنواع الليزر كمصدر للضوء لمراقبة المجال الواسع من قبل عدد قليل من الباحثين ، ولكن ظهور المجهر متحد البؤر زاد بشكل كبير من استخدام الليزر في الفحص المجهري. تستعرض هذه المناقشة مزايا وقيود مصادر الضوء غير المتماسكة (أو غير الليزر) في الفحص المجهري متحد البؤر ، كمصادر ضوئية للإضاءة متحد البؤر وكمصادر ثانوية للفحص المجهري واسع النطاق في المجاهر متحد البؤر. غالبًا ما تنشأ مشكلتان أوليتان عند النظر في أنظمة الإضاءة للمجاهر متحد البؤر ، ولهما تأثير مباشر على اختيار مصادر الضوء لجهاز معين.

أهداف المجهر متحد البؤر - لأي تكوين مجهر بصري تقليدي ، يكون الهدف هو العنصر الأكثر أهمية في النظام في تحديد محتوى المعلومات للصورة. يتم تحديد تباين ودقة تفاصيل العينة الدقيقة ، والعمق داخل العينة التي يمكن الحصول على المعلومات منها ، والمدى الجانبي لحقل الصورة من خلال تصميم الهدف وأدائه في ظل الظروف المحددة المستخدمة للملاحظة. يتم فرض متطلبات إضافية على الهدف في تقنيات المسح البؤري ، حيث يعمل مكون التصوير الحاسم هذا أيضًا كمكثف للإضاءة وغالبًا ما يكون مطلوبًا للعمل بدقة عالية على نطاق واسع من الأطوال الموجية وعند مستويات إضاءة منخفضة جدًا دون إدخال صورة غير مقبولة- ضوضاء مهينة.

أنظمة المسح المجهر متحد البؤر - يعتمد التصوير المتحد البؤر على المجموعة المتسلسلة للضوء من نقاط العينات الفردية التي تمت تصفيتها مكانيًا ، متبوعة بمعالجة الإشارات الإلكترونية ، وفي النهاية ، العرض المرئي كنقاط صورة مقابلة. تتطلب عملية جمع الإشارات نقطة بنقطة آلية لمسح الحزمة المضيئة المركزة من خلال حجم العينة تحت الملاحظة. يتم استخدام ثلاثة اختلافات رئيسية في المسح بشكل شائع لإنتاج صور مجهرية متحد البؤر. يمكن تحقيق عملية (كنفوكل) مكافئة بشكل أساسي من خلال استخدام مرحلة عينة الترجمة الأفقية المقترنة بشعاع ضوئي مضيء ثابت (مسح المرحلة) ، أو شعاع ضوئي ممسوح بمرحلة ثابتة (مسح الحزمة) ، أو عن طريق الحفاظ على كل من المرحلة ومصدر الضوء ثابتًا أثناء مسح العينة بمجموعة من النقاط الضوئية التي تنتقل عبر الفتحات في قرص Nipkow الدوار. تحتوي كل تقنية على ميزات أداء تجعلها مفيدة لتطبيقات متحد البؤر محددة ، ولكنها تحد من فائدتها في الآخرين.

اعتبارات الإشارة إلى الضوضاء - في أي تقييم كمي لقدرات التصوير باستخدام تقنيات الفحص المجهري الرقمي ، بما في ذلك الأساليب البؤرية ، يجب مراعاة تأثير أخذ عينات الإشارة على التباين والدقة. لا تمثل قيم مستوى الإشارة المقاسة بشكل مباشر عدد الفوتونات المنبعثة أو المتناثرة بواسطة العينة ، ولكنها تتناسب مع هذا الرقم. علاوة على ذلك ، فإن كل عينة فردية من شدة الإشارة ليست سوى تقريب لعدد الفوتونات التي تم جمعها ، وستختلف مع القياس المتكرر. يُضفي الاختلاف ، المشار إليه بالضوضاء ، عدم يقين في القياس الكمي للكثافة ، وبالتالي في تباين ودقة بيانات الصورة.

كاشفات الضوء الإلكترونية: المضاعفات الضوئية - في مجهر ضوئي متحد البؤر ومسح ضوئي حديث بالليزر ، يمكن تحقيق جمع وقياس الانبعاثات الثانوية التي تم جمعها بواسطة الهدف من خلال عدة فئات من أجهزة الكشف الحساسة للضوء ، بما في ذلك المضاعفات الضوئية ، والصمامات الضوئية ، وحالة الشحن الصلبة المقترنة أجهزة (CCDs). في الفحص المجهري متحد البؤر ، يتم توجيه انبعاث التألق من خلال فتحة الثقب الموضوعة بالقرب من مستوى الصورة لاستبعاد الضوء من الهياكل الفلورية الموجودة بعيدًا عن المستوى البؤري الموضوعي ، وبالتالي تقليل كمية الضوء المتاحة لتشكيل الصورة. نتيجة لذلك ، تستلزم مستويات الإضاءة المنخفضة للغاية التي يتم مواجهتها غالبًا في الفحص المجهري متحد البؤر استخدام كاشفات الفوتونات شديدة الحساسية التي لا تتطلب تمييزًا مكانيًا ، ولكنها تستجيب بدلاً من ذلك بسرعة كبيرة بمستوى عالٍ من الحساسية لتدفق مستمر متفاوت شدة الضوء.

الجوانب الحرجة للفحص المجهري متحد البؤر - غالبًا ما يكون التصوير الكمي ثلاثي الأبعاد في الفحص المجهري الفلوري معقدًا من خلال القطع الأثرية بسبب إعداد العينة أو المتغيرات التجريبية التي يمكن التحكم فيها والتي لا يمكن السيطرة عليها أو مشاكل التكوين مع المجهر. هذا المقال ، الذي كتبه الدكتور جيمس ب. باولي ، يقوم بفهرسة العوامل الخارجية الأكثر شيوعًا والتي غالبًا ما تعمل على إخفاء النتائج التي تم جمعها في مجال التألق والفحص المجهري متحد البؤر. من بين الموضوعات التي تمت مناقشتها نظام الليزر ، ومحاذاة المكونات البصرية ، والتكبير الموضوعي ، والتبييض ، والانحرافات ، وزيت الغمر ، وسمك الغطاء ، وكفاءة الكم ، ووسط تضمين العينة.

الانحرافات في الفحص المجهري متعدد الألوان متحد البؤر - أدت التحسينات في التصميم إلى تبسيط الفحص المجهري متحد البؤر إلى الحد الذي أصبح فيه أداة بحث قياسية في بيولوجيا الخلية. ومع ذلك ، نظرًا لأن المجاهر البؤرية أصبحت أكثر قوة ، فقد أصبحت أيضًا أكثر تطلبًا من مكوناتها البصرية. In fact, optical aberrations that cause subtle defects in image quality in widefield microscopy can have devastating effects in confocal microscopy. Unfortunately, the exacting optical requirements of confocal microscopy are often hidden by the optical system that guarantees a sharp image, even when the microscope is performing poorly. Optics manufacturers provide a wide range of microscope objectives, each designed for specific applications. This report demonstrates how the trade-offs involved in objective design can affect confocal microscopy.

Three-Color Imaging for Confocal Microscopy - The laser scanning confocal microscope ( LSCM ) is routinely used to produce digital images of single-, double-, and triple-labeled fluorescent samples. The use of red, green and blue ( RGB ) color is most informative for displaying the distribution of up to three fluorescent probes labeling a cell, where any colocalization is observed as a different additive color when the images are colorized and merged into a single three-color image. In this section we present a simplified version of a previously published method for producing three-color confocal images using the popular image manipulation program, Adobe Photoshop. In addition, several applications of the three-color merging protocol for displaying confocal images are discussed. Note that these digital methods are not confined to images produced using the LSCM and can be applied to digital images imported into Photoshop from many different sources.

Basics of Confocal Reflection Microscopy - Confocal reflection microscopy can be utilized to gather additional information from a specimen with relatively little extra effort, since the technique requires minimum specimen preparation and instrument re-configuration. In addition, information from unstained tissues is readily available with confocal reflection microscopy, as is data from tissues labeled with probes that reflect light. The method can also be utilized in combination with more common classical fluorescence techniques. Examples of the latter application are detection of unlabeled cells in a population of fluorescently labeled cells and for imaging the interactions between fluorescently labeled cells growing on opaque, patterned substrata.

Applications in Confocal Microscopy - The broad range of applications available to laser scanning confocal microscopy includes a wide variety of studies in neuroanatomy and neurophysiology, as well as morphological studies of a wide spectrum of cells and tissues. In addition, the growing use of new fluorescent proteins is rapidly expanding the number of original research reports coupling these useful tools to modern microscopic investigations. Other applications include resonance energy transfer, stem cell research, photobleaching studies, lifetime imaging, multiphoton microscopy, total internal reflection, DNA hybridization, membrane and ion probes, bioluminescent proteins, and epitope tagging. Many of these powerful techniques are described in these reviews.

Confocal Microscopy Image Gallery - The Nikon MicroscopyU Confocal Image Gallery features digital image sequences captured using a Nikon PCM-2000 confocal microscope scanning system coupled to an Eclipse E-600 upright microscope. Successive serial optical sections were recorded along the optical axis of the microscope over a range of specimen planes. These sequences are presented as interactive Java tutorials that allow the visitor to either "play" the series of sections automatically, or to utilize a slider to scroll back and forth through the images.

Olympus FluoView Laser Scanning Confocal Microscopy - The new Olympus FluoView TM FV1000 is the latest in point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscopes designed for today's intensive and demanding biological research investigations. Excellent resolution, bright and crisp optics, and high efficiency of excitation, coupled to an intuitive user interface and affordability are key characteristics of this state-of-the-art optical microscopy system.

Marvin Lee Minsky (1927-Present) - While at Harvard University, Marvin Minsky made his primary contribution to the field of optics by inventing the confocal scanning microscope. Despite the theoretical benefits of the confocal approach for biological purposes, Minsky's microscope originally generated little interest. In hindsight it has become apparent that the technology of the period limited Minsky's demonstration of the potential of the confocal approach. Yet, years later, with the advent of such applicable devices as lasers, sensitive low-noise photodetectors, and fast microcomputers with image processing capabilities, Minsky's microscopy technique has become widespread in biological research.

Interactive Java Tutorials

Laser Scanning Confocal Microscopy - (approximately a 30 second download on 28.8K modems) Several methods have been developed to overcome the poor contrast inherent with imaging thick specimens in a conventional microscope. Specimens having a moderate degree of thickness (5 to 15 microns) will produce dramatically improved images with either with confocal or deconvolution techniques. The thickest specimens (20 microns and above) will suffer from a tremendous amount of extraneous light in out-of-focus regions, and are probably best-imaged using confocal techniques. This tutorial explores imaging specimens through serial z-axis optical sections utilizing a virtual confocal microscope.

Comparing Confocal and Widefield Fluorescence Microscopy - Confocal microscopy offers several distinct advantages over traditional widefield fluorescence microscopy, including the ability to control depth of field, elimination or reduction of background information away from the focal plane (that leads to image degradation), and the capability to collect serial optical sections from thick specimens. The basic key to the confocal approach is the use of spatial filtering techniques to eliminate out-of-focus light or glare in specimens whose thickness exceeds the dimensions of the focal plane. This interactive tutorial explores and compares the differences between specimens when viewed in a confocal versus a widefield fluorescence microscope.

Colocalization of Fluorophores in Confocal Microscopy - Two or more fluorescence emission signals can often overlap in digital images recorded by confocal microscopy due to their close proximity within the specimen. This effect is known as colocalization and usually occurs when fluorescently labeled molecules bind to targets that lie in very close or identical spatial positions. This interactive tutorial explores the quantitative analysis of colocalization in a wide spectrum of specimens that were specifically designed either to demonstrate the phenomenon, or to alternatively provide examples of fluorophore targets that lack any significant degree of colocalization.

Reflected Confocal Microscopy: Integrated Circuit Inspection - Examine individual layers on the surface of integrated circuits with this interactive tutorial. Digital images for the tutorial were collected with a Nikon Optiphot C200 reflected light confocal microscope. For each sequence, a series of z-axis optical sections was recorded as the microscope was successively focused (at 1-micrometer steps) deeper within the patchwork of circuitry on the surface of the silicon chips.

Excitation Photobleaching Patterns - Multiphoton fluorescence microscopy utilizes diffraction-limited focusing by a high numerical aperture objective to localize the spatial concentration of excitation light to narrow region near the focal point. In contrast, the excitation region of a laser scanning confocal microscope is similar to that of a widefield microscope. This tutorial compares excitation-induced photobleaching patterns that occur near the focal region in both multiphoton and confocal microscopy systems.

Olympus FluoView Resource Center Interactive Java Tutorials - Explanations for many of the exceedingly complex concepts in laser scanning confocal microscopy can significantly benefit from the assistance of interactive tutorials that enable the student to obtain instanteous (real-time) response to changes in variables. The tutorials in section address the basic aspects of confocal microscopy instrumentation, laser systems, detectors, image processing, resolution, contrast, and many other aspects of the technique. All interactive Java tutorials require the Java Virtual Machine, which is available without cost as a browser plug-in from Sun Microsystems.

المراجع والموارد

Recommended Books on Confocal Microscopy - A surprisingly limited number of books dealing with various aspects of laser scanning and spinning disk confocal microscopy and related techniques are currently available from the booksellers. This section lists the FluoView Resource Center website development team's top 12 recommended books. Although the volumes listed in this section deal pricipally with confocal microscopy and related methodology, there exist a number of additional books that contain focused treatments of the materials described below, and these should also be consulted for specific techniques and timely review articles.

ZEISS Campus Confocal Microscopy Reference Library - A majority of the literature pertaining to review articles on laser scanning confocal microscopy has been published in textbooks, edited article collections, and symposia, with only an intermittent sprinkling of papers in the scientific journals. The reviews listed in this section should be available to students and investigators who have access to subscriptions through their host institutions.

Confocal Microscopy Web Resources - Laser scanning confocal microscopy ( LSCM ), a tool that has been extensively utilized for inspection of semiconductors, is now becoming a mainstream application in cell biology. The links provided in this section from the Molecular Expressions web site offer tutorials, instrumentation, application notes, technical support, glossaries, and reference materials on confocal microscopy and related techniques.

Basic Concepts in Laser Scanning Confocal Microscopy (PDF 2.8 Mb) - Laser scanning confocal microscopy has become an invaluable tool for a wide range of investigations in the biological and medical sciences for imaging thin optical sections in living and fixed specimens ranging in thickness up to 100 micrometers. Modern instruments are equipped with 3-5 laser systems controlled by high-speed acousto-optic tunable filters (AOTFs), which allow very precise regulation of wavelength and excitation intensity. Coupled with photomultipliers that have high quantum efficiency in the near-ultraviolet, visible and near-infrared spectral regions, these microscopes are capable of examining fluorescence emission ranging from 400 to 750 nanometers. Download this review article to learn more.

Kenneth W. Dunn and Exing Wang - Department of Medicine, Indiana University, School of Medicine, 1120 South Drive, FH115, Indianapolis, Indiana 46202-5116.

John M. Murray - Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, 19104.

Stephen W. Paddock , Eric J. Hazen , and Peter J. DeVries - Laboratory of Molecular Biology, Howard Hughes Medical Institute, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin 53706.

James B. Pawley - Department of Zoology, 1117 W. Johnson Dr., University of Wisconsin, Madison, Wisconsin 53706.

David W. Piston - Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 702 Light Hall, Nashville, Tennessee, 37212.

Kenneth R. Spring - Scientific Consultant, Lusby, Maryland, 20657.

Matthew J. Parry-Hill , Thomas J. Fellers , and Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.


دلائل الميزات

See More of the Specimen

Whole mouse bladder optically cleared with iDISCO and acquired at 8192 x 8192 pixels using a 2x Plan Apo objective, effective pixel size 0.6 μm (over 5x the spatial resolution of a typical monochrome CMOS camera).
Courtesy of Dr. Gerry Apodaca, Integrative Systems Biology, Department of Medicine, University of Pittsburgh in collaboration with Dr. Alan Watson at the Center for Biological Imaging, University of Pittsburgh.

With the largest field-of-view on both inverted and upright microscope stands available (25mm diagonal), more specimens fit in one FOV with more objective lens choices than ever before.

Coupled with scanning sizes up to 8192 x 8192 pixels, sampling beyond the optical diffraction limit is possible even at low magnifications with the AX/AX R.

Using lower magnifications with longer working distances and high numerical apertures enables more flexible specimen preparations to be used, while the large FOV allows simultaneous high resolution in one image. Collect more data in every image, and at faster rates.

The AX/AX R has a 25mm diagonal FOV, much larger than other confocal instruments.

Cleared adult mouse brain acquired with 1x objective in one acquisition of one FOV*

ذبابة الفاكهة ص. Embryo development easily fits within the FOV using a high NA 25x SIL 1.05 NA objective*

* It would not be possible to capture this sample in one FOV or at this resolution with other commercial confocal systems

Observe with Minimal Disturbance

Laser scanning confocal imaging is principally challenging on specimen viability, as it applies focused laser illumination point by point on a sample.

The AX R’s high speed resonant scanning, which decreases the illumination time by more than 20x typical confocal scanning times, greatly reduces biases caused by merely acquiring images. Reducing the acquisition time also allows for extremely high-speed imaging (up to 720 fps @ 2048 x 16).

The result: longer imaging and/or more frequent imaging at high speed of living samples which allows capture of dynamic events, but also allows longer time-lapse imaging or significantly faster collection times on fixed specimens.

Time-lapse Z series maximum intensity projection images of a developing ذبابة الفاكهة embryo expressing PLC-PH::GFP (PIP2) acquired every 10 minutes for 12 hours at 2K x 1K pixels using a 25x silicone immersion objective.
Courtesy of Yang Hong Laboratory, Department of Cell Biology, University of Pittsburgh in collaboration with the Center for Biological Imaging.

Acquire More Rapidly

Confocal imaging, notoriously slow because of its point-scanning requirement for high quality 3-dimensional imaging at high resolution, is greatly changed by fast imaging with the AX R’s resonant scanning capabilities.

Utilizing 2048 x2048 pixel resonant scanning and a 25mm FOV on a large intestinal sample montage, acquiring 25 high-resolution images and merging them in under 2 minutes.

Ultrafine Detail

With a full 25mm FOV, up to 8192 x 8192 pixels, and the capability for supravideo frame rates, the AX/AX R allows for spectacular imaging with high resolution, at both low and high magnifications.

The entire range of a whole organism or system biology down to intracellular imaging is achievable on one instrument.

Mouse muscle acquired with a 25x SIL immersion objective using 2048 x 2048 pixel resonant scanning

Detectors In Tune with Labels

Maximum intensity projection of Z stack images of marmoset brain acquired with a 60x 1.27 NA water immersion objective using 2048 x 2048 pixel resonant scanning and a DUX-VB detector with user-defined emission bands.

The AX/AX R’s all new DUX-VB detector custom-tunes emission bandwidths to a library of labels and probes, and provides the freedom to fine-tune emission bands to minimize unwanted fluorescence.

Simply select the number of labels in your specimen and their catalog names. Alternatively, you can define the desired emission ranges, or even simply the emission color: the AX/AX R and NIS-Elements software does the rest, including optimizing the dichroic mirror and laser excitation choices best suited for imaging. Or, acquire hyperspectral images in up to 66 emission channels for unmixing.

Optionally, the AX/AX R’s base DUX-ST detector allows up to 12 discreet bandpasses of emission, upgradable to 18.

And all detector systems can be customized with high sensitivity and low noise GaAsP or Multi-alkali PMT detectors to provide the best detector for sensitivity and wavelength response requirements as well as budgets.

Superior optical technologies to support all confocal applications

Nikon provides a broad range of high-NA objectives with unrivaled optical quality to redefine the boundaries of confocal imaging. Options include silicone oil immersion objectives for thick live cell imaging, large-FOV low-magnification objectives and easy-to-use dry objectives. Chromatic aberrations are corrected from ultraviolet to near infrared range, enabling excellent multicolor imaging.

Maximum intensity projection of Z stack images, color-coded by depth, of vascular development in embryonic zebrafish acquired with a 10X 0.45 NA Plan Apo Lambda S objective using 1024x2048 pixel resonant scanning. Courtesy of Erika Driekorn and Dr. Beth Roman, Department of Human Genetics, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health.

مكونات اختيارية

Water Immersion Dispenser

A software-controlled, automatic water dispenser enables long-term time-lapse imaging using refractive-index matching water immersion objectives in any environment, including incubation.

Automatic Correction Collar

Moves the objective correction collar to the optimum position for best resolution both remotely and by software control. Motorized collars allow users to adjust the correction collar without disturbing the specimen position, even in incubated enclosures or environmental chambers.

Multiple Modalites

Ti2-LAPP Modular Illumination System

The Ti2-E microscope supports up to 5 episcopic illumination sources, which can be used in tandem with AX/AX R confocal imaging: total internal reflection fluorescence (TIRF), point, raster or field stimulation devices, and fluorescence light sources can all be integrated onto the same microscope stand, and used in the same experiments.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)

The incident angle of a laser and corresponding penetration depth of the evanescent field can be controlled via NIS-Elements software. When multiple TIRF modules are mounted, the penetration depth can be independently set for each wavelength.

Photostimulation: Point and Raster Scanner

The XY galvano scanning unit can stimulate the desired area of a sample using laser point scanning. It allows simultaneous photostimulation and confocal imaging.

Photostimulation: Digital Micromirror Device (DMD)

The DMD module enables photoactivation of user-specified patterns rather than photoactivation of a single spot. This allows stimulation of multiple points and tracking of their behavior. The DMD module can be used with either laser illumination or less phototoxic LED illumination.


Confocal Microscopy

In Confocal Microscopy Methods and Protocols, Stephen Paddock and a highly skilled panel of experts lead the researcher using confocal techniques from the bench top, through the imaging process, to the journal page. They concisely describe all the key stages of confocal imaging-from tissue sampling methods, through the staining process, to the manipulation, presentation, and publication of the realized image. Written in a user-friendly, nontechnical style, the methods specifically cover most of the commonly used model organisms: worms, sea urchins, flies, plants, yeast, frogs, and zebrafish.

Centered in the many biological applications of the confocal microscope, the book makes possible the successful imaging of both fixed and living specimens using primarily the laser scanning confocal microscope. The powerful hands-on methods collected in Confocal Microscopy Methods and Protocols will help even the novice to produce first-class cover-quality confocal images.

"This book is an essential reference for anyone who is involved in the production of laser scanning confocal (LSCM) images. . . Exceptionally useful information on a great variety of methodologies that can be employed with LSCM is provided. . . In consideration of the vast quantity of useful information on all aspects of LSCM that is presented in this volume, and the fact that it is the first comprehensive book on this topic, it is highly recommended."-Quarterly Review of Biology

". almost every research institute has a confocal microscope, and many are developing much larger multi-user biomedical imaging facilities. The publication of this collection of methods and protocols for confocal microscopy is therefore very timely. The tips and tricks used on the various systems should prove useful to a diverse range of confocal microscope users and would be a beneficial reference volume for any imaging unit and reasonable value for money."-Cell Biology International

" This is an excellent source for anyone who wants to explore techniques in confocal microscopy. It is a practical manual with many gems that will help both new and experienced users. The principles are efficiently and accessibly explained and there is a useful chapter on fluorescent probes. there is a wealth of ideas here waiting to be applied to prokaryotic biology and many would be equally useful for simple fluorescence rather than confocal studies. I would certainly recommend it to any lab that uses fluorescence microscopy extensively."-Microbiology Today

". The texts are aimed at the biological user. for the user for whom they are intended, these essays contain a wealth of down-to-earth practical information. The book is well-produced and contains colour illustrations. "-Ultramicroscopy

". excellent information as an introductory basis for confocal microscopy."-Cellular and Molecular Biology


  • Microscope stand: Nikon Ti Eclipse inverted
  • سمات:
    • Motorized XY Stage, allowing mosaic images and multi-point time-lapse imaging
    • Fast live imaging with resonant scanner and piezoelectric focus
    • Spectral unmixing of overlapping fluorophores or autofluorescence
    • Autofocus using the Perfect Focus System
    • Tokai Hit stage-top incubator and objective heater
    • Targeted photobleaching, FRAP, FRET and FLIP capability
    • 2-photon microscopy with non-descanned detector: Best for deep (up to 1mm) or long-term imaging
    • Spectral fingerprinting, multiphoton excitation fingerprinting, unmixing of multiple fluorophores/autofluorescence sources
    • 1-photon: 458, 488, 514, 561, 639 nm
    • 2-photon: Software-tunable Chameleon II laser (680-1040 nm)
    • 1-photon: Similar to DAPI, DyLight 405, CFP, FITC, YFP, mOrange, TRITC, Cy5
    • 2-photon: Compatible with most red, green and blue fluorophores
    • 1-photon: Nikon Objectives
    • 2-photon: 25x/1.10 coverslip-corrected water-immersion IR lens
    • Microscope standNikon Ti Eclipse inverted
    • سمات:
      • SIM provides double the resolution of the conventional confocal microscope (lateral

      Confocal 1 - Zeiss LSM 880 with Airyscan on an Axio Observer.Z1 invert (B/K035)

      • Airyscan detector for high resolution imaging
      • fully automated microscope
      • 4 independent lasers, 6 laser lines including (405, 458, 488, 514, 561, and 633 nm)
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • an array of lenses ranging from 100 x oil down to 10 x air to suit most needs
      • stage adapted for use with Incubator S system for live cell imaging
      • ZEN 2.1 software

      Confocal 2 - Zeiss LSM 780 multiphoton on an Axio Observer.Z1 invert (B/K029)

      • fully automated microscope
      • Coherent Chameleon pulsed Ti:Sa IR Laser (range 690-1040nm)
      • 4 independent lasers, 6 laser lines including (405, 458, 488, 514, 561 and 633 nm)
      • 4 external non-descanned detectors (NDD) for increased sensitivity at greater depth
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • Objective lenses ranging from 10x air through to 63x oil as well as 40x/1.1 and 63x/1.2 water immersion and 20x/1.0 and 40x/0.8 water dipping objectives ideal for deep tissue imaging
      • Solent light tight incubation chamber with full temperature and CO2 مراقبة
      • ZEN 2010 software

      Zeiss LSM 780 multiphoton

      Confocal 3 - Zeiss LSM 710 on an AxioImager.M2 (B/K034)

      • fully automated upright microscope
      • 5 independent lasers, 7 laser lines including (405, 458, 488, 514, 561, 594 and 633 nm)
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • an array of lenses ranging from 100 x oil down to 10 x air to suit most needs
      • stage adapted for use with Incubator S system for live cell imaging
      • ZEN 2011 software

      Confocal 4 - Zeiss LSM 510 meta on an Axiovert 200M (B/K037)

      • fully automated microscope
      • 3 independent lasers, 6 laser lines including (458, 477, 488, 514, 543 and 633 nm)
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • an array of lenses ranging from 100 x oil down to 10 x air to suit most needs
      • stage adapted for use with Incubator S system for live cell imaging
      • LSM510 and ZEN 2009 software

      Zeiss LSM 510 meta invert

      Zeiss on-stage incubation system


      Confocal Microscope

      The UCA Department of Biology received a National Science Foundation grant in June 2002 to equip the facilities with a confocal laser scanning microscope (CLSM). This system provides the new means for research in biochemistry, cell biology and neuroscience for faculty and students.

      Various avenues of research include studies of the neural networks in mammalian brains, monitoring intracellular pH in cancer cells, and tracking mitochondrial proteins in yeast and slime mold. Visiting researchers from the University of Arkansas for Medical Sciences have been studying effects of ethanol on early neural development. As of spring 2005 we have started working with the “Saturdays with SEM” program to introduce high school students and educators to confocal microscopy. Here, visitors spend the day working with both the Scanning Electron Microscope (SEM) and the CLSM. During the day, they are taught the principles microscope operation and are allowed to visualize samples with the equipment.