معلومة

8C: ATP والفسفرة المؤكسدة - علم الأحياء


أهداف التعلم

  • شرح أسباب التحلل المائي المفرط للطاقة لأنهيدريدات حمض الكربوكسيل ، أنهيدريدات حمض الفوسفوريك ، أنهيدريدات مختلطة ، والتركيبات المماثلة وإعطاء قيم تقريبية لـ ΔG0 من التحلل المائي لها ؛
  • تحديد جزيئات من هياكل لويس التي يكون انقسامها مائي شديد القوة ؛
  • شرح كيف يمكن أن يقترن الانقسام المفرط للطاقة لروابط الفوفوهيدريد في ATP بالتوليف endergonic للجزيئات الكبيرة مثل البروتينات ؛
  • رسم آليات لإظهار كيفية اقتران تفاعلات الأكسدة والفسفرة في التمثيل الغذائي اللاهوائي من خلال إنتاج أنهيدريد مختلط محفز بواسطة إنزيم محلل السكر glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ؛
  • شرح كيف يمكن للزرنيخات أن تتضاعف تفاعلات الأكسدة والفوسفور في تحلل السكر
  • شرح كيف يمكن تجديد NAD + من NADH في حالة لاهوائية للسماح باستمرار تحلل السكر ؛
  • شرح التدفق العام للإلكترونات من NADH إلى dioxgen من خلال سلسلة من مستقبلات الإلكترون المتنقلة والبروتين الغشائي في نقل الإلكترون في عضو الميتوكوندريا الداخلي.
  • شرح بمخططات الصور كيف تقترن تفاعلات الأكسدة والفسفرة (لإنتاج ATP) في التمثيل الغذائي الهوائي من خلال توليد وانهيار تدرج بروتوني في الميتوكوندريا ؛
  • ارسم مخططات صور توضح بنية F1F0ATPase في عضو الميتوكوندريا الداخلي واشرح باستخدام الصورة كيف يقترن تخليق ATP بانهيار التدرج البروتيني
  • اكتب معادلة للإمكانات الكهروكيميائية واستخدمها لحساب ΔG0 المتاح لإنتاج ATP عند انهيار التدرج البروتوني ، مع إعطاء القيم النموذجية لـ ΔpH و E عبر الغشاء

تخدم تفاعلات الأكسدة البيولوجية وظيفتين:

  1. يمكن أن ينتج عن أكسدة الجزيئات العضوية جزيئات جديدة بخصائص مختلفة (على سبيل المثال ، لوحظ زيادة في قابلية الذوبان على هيدروكسيل الركائز العطرية بواسطة السيتوكروم P450) وبالمثل ، يمكن أكسدة الأحماض الأمينية لإنتاج الناقلات العصبية.
  2. تحدث معظم تفاعلات الأكسدة البيولوجية ، مع ذلك ، لإنتاج الطاقة لدفع العمليات البيولوجية غير المرغوبة من الناحية الديناميكية الحرارية مثل تخليق البروتين والحمض النووي ، أو الحركة.

لا يتم إطلاق الطاقة الكامنة الكيميائية فقط في تفاعلات الأكسدة البيولوجية. بدلا من ذلك ، يتم تحويله إلى شكل أكثر فائدة من الطاقة الكيميائية في جزيء ATP (أدينوزين ثلاثي الفوسفات). سيناقش هذا الفصل الخصائص التي تجعل ATP مفيدًا جدًا من الناحية البيولوجية ، وكيف تقترن تفاعلات الأكسدة البيولوجية المفرطة الطاقة بتركيب ATP.

  • C1. ATP
    تخدم تفاعلات الأكسدة البيولوجية وظيفتين. يمكن أن ينتج عن أكسدة الجزيئات العضوية جزيئات جديدة بخصائص مختلفة. على سبيل المثال ، لوحظ زيادة في قابلية الذوبان على الهيدروكسيل للركائز العطرية بواسطة السيتوكروم P450. وبالمثل ، يمكن للأحماض الأمينية أن تتأكسد لإنتاج الناقلات العصبية. تحدث معظم تفاعلات الأكسدة البيولوجية ، مع ذلك ، لإنتاج الطاقة لدفع العمليات البيولوجية غير المرغوبة من الناحية الديناميكية الحرارية مثل تخليق البروتين والحمض النووي ، أو الحركة.
  • C2. الاقتران اللاهوائي للأكسدة وتوليف ATP
  • ج 3. اقتران هوائي للأكسدة وتوليف ATP
  • ج 4. نظرة عامة على النقل الإلكتروني للميتوكوندريا
  • C5. المركب الأول - NADH-quinone oxidoreductase
  • ج 6. المجمع الثالث
    المركب الثالث عبارة عن بروتين معقد متعدد الوحدات. الوحدات الفرعية المشاركة في نقل الإلكترون هي السيتوكروم ب ، السيتوكروم c1 وبروتين الكبريت الحديدي ريسك (ISP). السيتوكروم ب له نصفي.
  • ج 7. المركب الرابع - أوكسيديز السيتوكروم C (CCOx)
  • ج 8. أكسدة اقتران الكلي وتوليف ATP
  • ج 9. سينسيز ATP
  • ج 10. انهيار التدرج البروتوني وتوليف ATP - الهيكل
  • ج 11. انهيار التدرج البروتوني وتوليف ATP - الديناميكا الحرارية
  • ج 12. احتياجات التمثيل الغذائي في الخلايا غير المتكاثرة والمنتشرة
  • ج 13. PPARs وتنظيم الأيض
    في حالة التغذية الجيدة (مستويات عالية من الكربوهيدرات والدهون) ، يجب تنشيط تخليق الجليكوجين وثلاثي الجليسريد والأحماض الدهنية ، بينما يجب تقليل تحلل الجليكوجين (تحلل الجليكوجين) وتعبئة احتياطيات الدهون الثلاثية وأكسدة الأحماض الدهنية. في حالة الصيام يجب تفعيل السبل المعاكسة. إن التحكم التنظيمي في هذه العمليات المتعارضة معقد ، لكن ثبت أن PPARs (مستقبلات تنشيط البيروكسيسوم) لها دور رئيسي.
  • ج 14. الروابط والمراجع

المقدمة والأهداف

سيصف هذا البرنامج التعليمي الآليات المشاركة في تخليق ATP أثناء التنفس الخلوي. تحدث المرحلة الأخيرة من التنفس الخلوي في الميتوكوندريا ، حيث تقل ناقلات الإلكترون (NADH و FADH2) التبرع بإلكتروناتهم للأكسجين عبر سلسلة نقل الإلكترون. أثناء انتقال الإلكترونات ، يتم إنشاء تدرج كهروكيميائي للهيدروجين عبر أحد أغشية الميتوكوندريا. تُستخدم طاقة هذا التدرج الكهروكيميائي للبروتون في تصنيع ATP.

في نهاية هذا البرنامج التعليمي ، يجب أن تعرف:

  • طبيعة اقتران التناضح الكيميائي لنقل الإلكترون وتوليف ATP
  • ملامح الميتوكوندريا
  • معنى إمكانات الأكسدة والاختزال وكيف تحدد تدفق الإلكترونات
  • آليات نقل الإلكترون (بما في ذلك دور ناقلات الإلكترون المخفضة NADH و FADH2والأكسجين)
  • كيف يتم تشكيل التدرج الكهروكيميائي للهيدروجين
  • كيف يتم استخدام التدرج الكهروكيميائي للهيدروجين لتخليق ATP

الكيمياء الحيوية. الطبعة الخامسة.

شكل

الميتوكوندريا ، ملون باللون الأخضر ، تشكل شبكة داخل خلية الخلايا الليفية (يسار). تعمل الميتوكوندريا على أكسدة الوقود الكربوني لتكوين طاقة خلوية. يتطلب هذا التحول نقل الإلكترون من خلال عدة مجمعات بروتينية كبيرة (أعلاه) ، وبعضها يضخ (أكثر.)

NADH و FADH2 تشكلت في تحلل السكر وأكسدة الأحماض الدهنية ودورة حمض الستريك جزيئات غنية بالطاقة لأن كل منها يحتوي على زوج من الإلكترونات ذات إمكانات نقل عالية. عندما يتم استخدام هذه الإلكترونات لتقليل الأكسجين الجزيئي إلى الماء ، يتم تحرير كمية كبيرة من الطاقة الحرة ، والتي يمكن استخدامها لتوليد ATP. الفسفرة المؤكسدة هي العملية التي يتكون فيها ATP نتيجة لانتقال الإلكترونات من NADH أو FADH 2 جدا 2 بواسطة سلسلة من ناقلات الإلكترون. هذه العملية ، التي تحدث في الميتوكوندريا ، هي المصدر الرئيسي لـ ATP في الكائنات الهوائية (الشكل 18.1). على سبيل المثال ، ينتج عن الفسفرة المؤكسدة 26 جزيءًا من 30 جزيءًا من ثلاثي فوسفات الأدينوسين تتشكل عندما يتأكسد الجلوكوز تمامًا إلى ثاني أكسيد الكربون.2 و ح2س.

الشكل 18.1

صورة مجهرية إلكترونية للميتوكوندريا. [بإذن من الدكتور جورج باليد.]

الفسفرة المؤكسدة بسيطة من الناحية النظرية ومعقدة ميكانيكيا. في الواقع ، كان تفكك آلية الفسفرة المؤكسدة واحدة من أصعب مشاكل الكيمياء الحيوية. تدفق الإلكترونات من NADH أو FADH2 جدا2 من خلال مجمعات البروتين الموجودة في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا يؤدي إلى ضخ البروتونات من مصفوفة الميتوكوندريا. ينتج عن التوزيع غير المتكافئ للبروتونات تدرجًا في الأس الهيدروجيني وإمكانات كهربائية عبر الغشاء تخلق a بروتون القوة الدافعة. يتم تصنيع ATP عندما تتدفق البروتونات عائدة إلى مصفوفة الميتوكوندريا عبر مركب إنزيم. هكذا، يقترن أكسدة الوقود وفسفرة ADP بتدرج بروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي (الشكل 18.2).

الشكل 18.2

جوهر الفسفرة التأكسدية. يقترن الأكسدة وتخليق ATP بواسطة تدفقات البروتون عبر الغشاء.

الفسفرة المؤكسدة هي تتويج لسلسلة من تحولات الطاقة التي تسمى التنفس الخلوي أو ببساطة التنفس في مجملها. أولاً ، يتأكسد وقود الكربون في دورة حامض الستريك لإنتاج إلكترونات ذات إمكانات نقل عالية. بعد ذلك ، يتم تحويل هذه القوة الدافعة للإلكترون إلى قوة دافعة للبروتون ، وأخيراً ، يتم تحويل القوة الدافعة للبروتون إلى إمكانية نقل الفوسفوريل. يتم إجراء تحويل القوة المحركة للإلكترون إلى قوة دافعة بروتون بواسطة ثلاث مضخات بروتون مدفوعة بالإلكترون & # x02014NADH-Q oxidoreductase ، Q-cytochrome ج أوكسيوردوكتاز ، والسيتوكروم ج أوكسيديز. تحتوي مجمعات الغشاء الكبيرة هذه على العديد من مراكز تقليل الأكسدة ، بما في ذلك الكينونات ، والفلافينات ، ومجموعات الحديد والكبريت ، والهيمات ، وأيونات النحاس. يتم تنفيذ المرحلة النهائية من الفسفرة المؤكسدة سينسيز ATP ، مجموعة تخليق ATP مدفوعة بتدفق البروتونات مرة أخرى إلى مصفوفة الميتوكوندريا. تدور مكونات هذا الإنزيم الرائع كجزء من آليته التحفيزية. يظهر ذلك بوضوح الفسفرة المؤكسدة التدرجات البروتونية هي عملة قابلة للتحويل من الطاقة الحرة في الأنظمة البيولوجية.

التنفس & # x02014

عملية لتوليد ATP يعمل فيها مركب غير عضوي (مثل الأكسجين الجزيئي) كمستقبل نهائي للإلكترون. يمكن أن يكون المتبرع بالإلكترون مركبًا عضويًا أو غير عضوي.

  • 18.1. الفسفرة المؤكسدة في حقيقيات النوى تأخذ مكانها في الميتوكوندريا
  • 18.2. تعتمد الفسفرة التأكسدية على نقل الإلكترون
  • 18.3. تتكون السلسلة التنفسية من أربعة مجمعات: ثلاث مضخات بروتون ووصلة فيزيائية لدورة حامض الستريك
  • 18.4. يقوم التدرج البروتوني بتوليف ATP
  • 18.5. تسمح العديد من الحافلات بالحركة عبر أغشية الميتوكوندريا
  • 18.6. تنظيم التنفس الخلوي تحكمه في المقام الأول الحاجة إلى ATP
  • ملخص
  • مشاكل
  • قراءات مختارة

بالاتفاق مع الناشر ، يمكن الوصول إلى هذا الكتاب من خلال ميزة البحث ، ولكن لا يمكن تصفحه.


تغيير التاريخ

واربورغ ، أو. حول أصل الخلايا السرطانية. علم 123, 309–314 (1956).

Vander Heiden، M.G، Cantley، L.C & amp Thompson، C.B. فهم تأثير واربورغ: متطلبات التمثيل الغذائي لتكاثر الخلايا. علم 324, 1029–1033 (2009).

Ward، P. S. & amp Thompson، C.B. إعادة البرمجة الأيضية: سمة مميزة للسرطان لم يتوقعها واربورغ. الخلايا السرطانية 21, 297–308 (2012).

DeBerardinis، R. J.، Lum، J. J.، Hatzivassiliou، G. & amp Thompson، C.B. بيولوجيا السرطان: إعادة البرمجة الأيضية تغذي نمو الخلايا وانتشارها. ميتاب الخلية. 7, 11–20 (2008).

Locasale ، J.W. & amp Cantley ، L.C. التدفق الأيضي وتنظيم نمو خلايا الثدييات. ميتاب الخلية. 14, 443–451 (2011).

Gatenby، R.A & amp Gillies، R.J. لماذا السرطانات تحتوي على نسبة عالية من التحلل الهوائي؟ نات. القس السرطان 4, 891–899 (2004).

Aslakson ، C.J & amp Miller ، F. R. أحداث انتقائية في العملية النقيلية المحددة من خلال تحليل الانتشار المتسلسل للمجموعات السكانية الفرعية من ورم ثديي في الفئران. الدقة السرطان. 52, 1399–1405 (1992).

Kalluri، R. & amp Weinberg، R. A. أساسيات الانتقال بين الظهارة واللحمة المتوسطة. J. كلين. استثمار. 119, 1420–1428 (2009).

تيري ، جي بي التحولات الظهارية واللحمية المتوسطة في تطور الورم. نات. القس السرطان 2, 442–454 (2002).

وو ، زد وآخرون. آليات التحكم في التولد الحيوي للميتوكوندريا والتنفس من خلال المنشط الحراري PGC-1. زنزانة 98, 115–124 (1999).

Puigserver ، P. وآخرون. مُنشِط مُحفّز على البارد للمستقبلات النووية المرتبطة بالتوليد الحراري التكيفي. زنزانة 92, 829–839 (1998).

Girnun ، G.D. الدور المتنوع لعائلة PPARgamma coactivator 1 لمحفزات النسخ في السرطان. سيمين. تطوير الخلية. بيول. 23, 381–388 (2012).

بهالا ، ك وآخرون. يعزز PGC1α نمو الورم عن طريق تحفيز برامج التعبير الجيني التي تدعم تكوين الدهون. الدقة السرطان. 71, 6888–6898 (2011).

دي إيريكو ، آي وآخرون. عامل تنشيط مستقبلات جاما 1-ألفا (PGC1α) هو منظم استقلابي لمصير الخلايا الظهارية المعوية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 108, 6603–6608 (2011).

Guy ، C. T. ، Cardiff ، R.D & amp Muller ، W.J. تحريض أورام الثدي بالتعبير عن الجين الورمي للفيروس التورامي الأوسط T: نموذج فأر معدّل وراثيًا للمرض النقيلي. مول. خلية بيول. 12, 954–961 (1992).

كوك ، في.جي وآخرون. ينتج عن استنفاد البريستي انتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة المرتبطة بنقص الأكسجة والورم الخبيث بوساطة مسار الإشارات التقى. الخلايا السرطانية 21, 66–81 (2012).

Rae ، J.M ، Creighton ، C.J ، Meck ، J.M ، Haddad ، B. R. & amp Johnson ، M.D MDA-MB-435 الخلايا مشتقة من خلايا سرطان الجلد M14 - خسارة لسرطان الثدي ، ولكنها نعمة لأبحاث سرطان الجلد. الدقة سرطان الثدي. يعامل. 104, 13–19 (2007).

Yuan، M.، Breitkopf، S.B، Yang، X. & amp Asara، J.M. منصة الأيض القائمة على مقياس الطيف الكتلي لسوائل الجسم والخلايا والأنسجة الطازجة والثابتة. نات. بروتوك. 7, 872–881 (2012).

Schreiber، S.N، Knutti، D.، Brogli، K.، Uhlmann، T. & amp Kralli، A. ينظم المنشط النسخي PGC-1 تعبير ونشاط المستقبل النووي اليتيم ذي الصلة بالإستروجين ألفا (ERRα). J. بيول. تشيم. 278, 9013–9018 (2003).

Woelfle، U. et al. التوقيع الجزيئي المرتبط بتورم نخاع العظم المجهري في سرطان الثدي البشري. الدقة السرطان. 63, 5679–5684 (2003).

Jose ، C. ، Bellance ، N. & amp Rossignol ، R. الاختيار بين تحلل السكر والفسفرة المؤكسدة: معضلة الورم؟ بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1807, 552–561 (2011).

Koppenol، W. H.، Bounds، P. L. & amp Dang، C.V Otto Warburg's مساهمات في المفاهيم الحالية لعملية التمثيل الغذائي للسرطان. نات. القس السرطان 11, 325–337 (2011).

Hu ، J. et al. يثير العلاج بمضادات الأنتيلوميراز آليات تكيف ALT والميتوكوندريا في السرطان. زنزانة 148, 651–663 (2012).

سانت بيير ، جيه وآخرون. قمع أنواع الأكسجين التفاعلية والتنكس العصبي بواسطة منشطات النسخ PGC-1. زنزانة 127, 397–408 (2006).

لين ، إم تي أند بيل ، إم.إف خلل وظائف الميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي في الأمراض التنكسية العصبية. طبيعة سجية 443, 787–795 (2006).

يانج إم هـ وآخرون. التنظيم المباشر للالتواء بواسطة HIF-1α يعزز الانبثاث. نات. خلية بيول. 10, 295–305 (2008).

يو ، م وآخرون. تظهر خلايا ورم الثدي المنتشرة تغيرات ديناميكية في التركيب الظهاري واللحمة المتوسطة. علم 339, 580–584 (2013).

جونز ، إيه دبليو ، ياو ، زد ، فيسينسيو ، جي إم ، كاركوسينسكا-فيكوفسكا ، إيه & أمبير زابادكاي ، جي. ميتوكوندريا 12, 86–99 (2012).

Gibbins ، J.R. حركية الخلايا الظهارية: تأثير 2-deoxyglucose على هجرة الخلايا ، وإنتاج ATP ، وهيكل المادة الأرضية السيتوبلازمية في lamellipodia للخلايا الظهارية في الثقافة. خلية موتيل. 2, 25–46 (1982).

Schafer ، Z.T et al. مضادات الأكسدة والجينات الورمية للعيوب الأيضية الناتجة عن فقدان ارتباط المصفوفة. طبيعة سجية 461, 109–113 (2009).

Schumacher، D.، Strilic، B.، Sivaraj، K. K.، Wettschureck، N. & amp Offermanns، S. تعزز النيوكليوتيدات المشتقة من الصفائح الدموية هجرة الخلايا السرطانية عبر البطانة والانبثاث عبر مستقبل P2Y2. الخلايا السرطانية 24, 130–137 (2013).

سوزوكي ، ت. وآخرون. المستقبل المرتبط بالإستروجين α في سرطان الثدي البشري كعامل تنبؤي قوي. الدقة السرطان. 64, 4670–4676 (2004).

أوكونيل ، جي تي وآخرون. تعتبر VEGF-A و Tenascin-C التي تنتجها الخلايا اللحمية S100A4 + مهمة للاستعمار النقيلي. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 108, 16002–16007 (2011).

كاسل ، جي سي وآخرون. استغلال الطفرة في التطعيم ضد الورم. الدقة السرطان. 72, 1081–1091 (2012).

Barretina ، J. et al. تتيح موسوعة خط الخلايا السرطانية النمذجة التنبؤية لحساسية الأدوية المضادة للسرطان. طبيعة سجية 483, 603–607 (2012).

Boehm، E. A.، Jones، B. E.، Radda، G. K.، Veech، R. L. & amp Clarke، K. أكون. J. Physiol. سيرك القلب. فيسيول. 280، H977-H983 (2001).

ولفل ، يو وآخرون. التوقيع الجزيئي المرتبط بتورم نخاع العظم المجهري في سرطان الثدي البشري. الدقة السرطان. 63, 5679–5684 (2003).

براون ، إس وآخرون. الخلايا الإيجابية للسيتوكيراتين في نخاع العظام وبقاء المرضى المصابين بسرطان الثدي في المرحلة الأولى أو الثانية أو الثالثة. إنجل. جيه ميد. 342, 525–533 (2000).

فيهم ، ت. وآخرون. مفهوم للكشف الموحد عن الخلايا السرطانية المنتشرة في نخاع العظام من مرضى سرطان الثدي الأولي وتنفيذه السريري. سرطان 107, 885–892 (2006).

هوفمان ، في وآخرون. التحليل المورفولوجي للخلايا السرطانية المنتشرة في المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة باستخدام طريقة العزل حسب حجم خلية الورم الظهارية (ISET). علم الأمراض الخلوي 23, 30–38 (2012).

بالاكريشانان ، N. & amp Rao ، C. R. كتيب الاحصاء المجلد. 23، الطبعة الأولى (شمال هولندا ، 2004).


مناقشة

لقد أثبتنا أن الإجهاد التأكسدي الخفيف الناجم عن معالجة PQ أو بالضربة القاضية SOD1 يقلل من اقتران الفسفرة المؤكسدة في الجسم الحي ويعطل طاقة العضلات والهيكل العظمي. توفر هذه النتائج في الجسم الحي اختبار & # x0201cuncoupling للبقاء على قيد الحياة & # x0201d فرضية ، والتي تقترح أن الإجهاد التأكسدي ينشط تسرب بروتون الميتوكوندريا ويقلل من اقتران الفسفرة المؤكسدة [26]. يرتبط إنتاج كل من ATP و ROS بإمكانية غشاء الميتوكوندريا الداخلية (& # x00394 & # x003c8) ، والتي يتم إنشاؤها عندما يتم ضخ البروتونات من المصفوفة إلى حيز الغشاء الداخلي عن طريق تفاعلات الأكسدة والاختزال المستهلكة للأكسجين في سلسلة نقل الإلكترون [ 27] ، [28]. تشير الفرضية & # x0201cuncoupling للبقاء على قيد الحياة & # x0201d إلى أن الإجهاد التأكسدي يؤدي إلى زيادة في تسرب بروتون الميتوكوندريا ، وبالتالي تقليل & # x00394 & # x003c8 ، كآلية ردود فعل سلبية تخفف من إنتاج المزيد من الميتوكوندريا ROS [19]. نتيجة لتسرب البروتون هذا ، تسبب F1F0يتم تجاوز ATPsynthase والنتيجة الصافية هي انخفاض في ATP المنتج لكل أكسجين مستهلك (انخفاض P / O).

في الجسم الحي تم تخفيض قيم P / O بشكل كبير في كل من الطرز قصيرة المدى (علاج PQ لمدة أسبوعين) والمزمن (SOD1 & # x02212 / & # x02212). كانت 10 مجم / كجم من PQ المعطاة مرة أو مرتين في الأسبوع في هذه الدراسة كافية للحث على زيادة علامات الإجهاد التأكسدي ، ولكن جرعة PQ هذه أقل بكثير من LD50 البالغ 70 مجم / كجم المبلغ عنه بالنسبة للفئران عند إذابة PQ في المالحة وتدار داخل الصفاق [29]. وبالتالي فإن عدم وجود تأثير حاد على توصيل الأكسجين إلى العضلات الهيكلية أو خلل شديد في الميتوكوندريا ليس مفاجئًا. وبدلاً من ذلك ، لاحظنا تحكمًا كبيرًا في استقلاب الميتوكوندريا والطاقة. تقلب معدل إنتاج ATP في الميتوكوندريا أثناء الراحة أقل من 15 & # x00025 مع علاج PQ مما يشير إلى أن هذا المستوى من الإجهاد التأكسدي لم يغير بشكل كبير طلب ATP المريح للعضلات الهيكلية. ومع ذلك ، زاد استهلاك الأكسجين بنسبة 43 & # x00025 في PQ1 و 71 & # x00025 في PQ2 لتلبية هذا الطلب غير المتغير على ATP نتيجة لانخفاض اقتران الأكسدة بالفسفرة. هذه النتائج مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من الميتوكوندريا والخلايا المعزولة ، حيث يمكن إحداث زيادة في تسرب البروتون عن طريق إضافة مؤكسدات خارجية للمقايسة [21] ، [30].

استخدمنا ألياف عضلية نفاذة لاختبار ما إذا كان في الجسم الحي كانت التأثيرات على وظيفة الميتوكوندريا ناتجة عن تغييرات جوهرية في الميتوكوندريا أو كانت نتيجة للتفاعل بين الميتوكوندريا والبيئة الخلوية. لا يوجد فرق في تنفس الميتوكوندريا في EDL المنفصل بين مجموعات التحكم والمعالجة PQ ، بما في ذلك التنفس الناتج عن تسرب البروتون ، يشير إلى أن الاقتران المنخفض الذي لوحظ في الجسم الحي لم يكن بسبب الضرر التأكسدي أو تغيير في تكوين الميتوكوندريا. ستكون هذه التغييرات جوهرية في الميتوكوندريا وتستمر بعد أن يتم نفاذ الألياف واستبدال بيئة الخلية بمخزن التنفس. علاوة على ذلك ، كشف تحليل التعبير الجيني والبروتيني في عضلة المعدة المختلطة عن عدم وجود فروق في منظمات التكوُّن الحيوي للميتوكوندريا (PGC1 & # x003b1 و TFAM) ، أو محتوى الميتوكوندريا (DCR والمجمعات I ، II ، و IV) ، أو مفكك الميتوكوندريا (UCP3 و ANT1) في الفئران المعالجة بـ PQ. لذلك ، نستنتج أن انخفاض في الجسم الحي يرجع P / O إلى التحكم المباشر في وظيفة الميتوكوندريا بواسطة ROS أو منتج ثانوي ذي صلة.

انخفاض في الجسم الحي الاقتران مع PQ لم يكن بسبب تنظيم تعبير UCP3 أو ANT1 في العضلات. قد يكون الاختلاف بين نتائجنا والتقارير السابقة التي تشير إلى أن UCP3 و ANT1 قد تم تنظيمهما استجابةً للإجهاد التأكسدي بسبب الاختلافات في حجم الإجهاد التأكسدي أو قصر مدة العلاج. قامت الدراسات السابقة في زراعة الخلايا بقياس مستويات التعبير بعد ساعات من الإجهاد التأكسدي الحاد بجرعة عالية [8] ، بينما تضمن علاج PQ المستخدم في هذه الدراسة مستوى منخفض نسبيًا من الإجهاد الناجم على مدى أسبوعين. لا يمنع عدم وجود اختلاف في مستويات التعبير عن UCP3 و ANT1 دورًا لهذه البروتينات في انخفاض P / O في الميتوكوندريا في الجسم الحي. تنشيط تسريب البروتون بوساطة UCP3 أو ANT1 بواسطة الإجهاد التأكسدي أو بيروكسيدات الدهون [20] ، [21] ، [31] في الجسم الحي يوفر آلية محتملة لشرح الفرق بين في الجسم الحي ونتائج الألياف المنفصلة. سيؤدي تبادل بيئة الخلية وفقدان المنشطات المحتملة لـ UCP3 أو ANT1 أثناء عملية النفاذية إلى عكس زيادة تسرب البروتون المقاس في الجسم الحي مع علاج PQ.

كما قلل الإجهاد التأكسدي المزمن الناجم عن عدم وجود SOD1 من كفاءة الفسفرة المؤكسدة. في الدراسات السابقة ، تم تقليل نسب التحكم في الجهاز التنفسي (الحالة 3 / الحالة 4 للتنفس) في الميتوكوندريا المعزولة بشكل كبير في الفئران SOD1 & # x02212 / & # x02212 البالغة من العمر 20 شهرًا ، المرتبطة بانخفاض إنتاج ATP في الميتوكوندريا ، وفقدان كتلة العضلات الهيكلية ، وزيادة الميتوكوندريا H2ا2 إنتاج [5] ، [32]. في هذه الدراسة ، يشير ارتفاع ATPmax وزيادة التعبير عن بروتينات ونصوص الميتوكوندريا في الفئران SOD1 & # x02212 / & # x02212 إلى أن الإجهاد التأكسدي وفك الاقتران في الفئران البالغة SOD1 & # x02212 / & # x02212 تؤدي إلى زيادة تعويضية في قدرة الميتوكوندريا . من المحتمل أن تكون التأثيرات الأكثر شدة على الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا التي تم الإبلاغ عنها في SOD1 & # x02212 / & # x02212 الفئران في الأعمار الأكبر ناتجة عن تراكم الأضرار التأكسدية للميتوكوندريا وانخفاض ATP المنتج لكل ميتوكوندريا [32]. يتم دعم الزيادة في بروتينات الميتوكوندريا في الفئران SOD1 & # x02212 / & # x02212 من خلال الأدلة المتزايدة على أن ROS هي منظمات مهمة للتكوين الحيوي للميتوكوندريا. علاج الخلايا الأنبوبية القريبة من الكلى والخلايا العصبية مع H2ا2 في الثقافة يحث على التكوين الحيوي للميتوكوندريا وتنظيم مضادات الأكسدة الميتوكوندريا [7] ، [8]. قد يكون غياب تأثير علاج PQ على التكوُّن الحيوي للميتوكوندريا في هذه الدراسة بسبب انخفاض مستوى الإجهاد أو قصر مدته.

يرتبط انخفاض P / O بتعطيل توازن الطاقة كما هو مبين في نسب PCr / ATP المنخفضة في الفئران المعالجة بـ PQ. توفر إمكانات غشاء الميتوكوندريا رابطًا ميكانيكيًا بين حالة طاقة الخلية واقتران الفسفرة المؤكسدة وتفرض حدًا ديناميكيًا حراريًا على نسبة ATP / ADP التي يمكن الحفاظ عليها [33]. لذلك ، مع انخفاض إمكانات غشاء الراحة بسبب زيادة تسرب البروتون عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، تنخفض أيضًا نسبة ATP / ADP في الراحة مما يؤدي إلى انخفاض مستوى PCr / ATP ومستويات AMP المرتفعة من خلال تفاعلات الكرياتين كيناز وأدينيلات كيناز [34]. وهكذا نجد أن الإجهاد التأكسدي الخفيف مرتبط بزيادة إجهاد الطاقة وزيادة استهلاك الأكسجين أثناء الراحة في عضلات الهيكل العظمي.

على الرغم من الحفاظ على نسبة PCr / ATP في الفئران SOD1 & # x02212 / & # x02212 ، فإن الانخفاض الكبير في تركيز ATP يوفر دليلاً على إجهاد الطاقة في حالة الإجهاد التأكسدي المزمن. لقد أبلغنا سابقًا عن فقدان مستويات ATP أثناء الراحة في الجسم الحي يرتبط بانخفاض P / O في العضلات الهيكلية المسنة من الفئران [35] والبشر [36]. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد احتمال أن تكون تركيزات ATP المنخفضة ناتجة عن عدم تجانس صحة الخلية وتركيز ATP داخل العضلات الهيكلية للطرف الخلفي. لنا في الجسم الحي يتم أخذ قياسات MR و HPLC لـ ATP على الطرف الخلفي البعيد بأكمله ، لذلك لا يمكننا حساب الاختلافات المحلية أو فقدان ATP في الألياف التالفة بشدة. قد تقلل هذه الأنواع من التباين متوسط ​​الحجم الذي يستريح مستويات ATP وتوفر تفسيرًا بديلاً لانخفاض ATP في الفئران SOD1 & # x02212 / & # x02212.

يعد الحفاظ على توازن طاقة الخلية محددًا مهمًا لصحة الخلية وبقائها [37]. وبالتالي فإن إجهاد الطاقة هو إشارة تكيفية رئيسية تعدل التعبير الجيني والبروتيني من خلال جزيئات إشارات استشعار الطاقة المتعددة مثل AMPK والكينازات ذات الصلة [38]. فسفرة AMPK حساسة لنسبة ATP / AMP الخلوية [39] ، والتي ترتبط كيميائيًا حيويًا بنسبة PCr / ATP من خلال تفاعلات كيناز الكرياتين وأدينيلات كيناز [40] ، [41]. يؤدي تنشيط AMPK من خلال زيادة الفسفرة إلى التحكم في مسارات المصب لتقليل استخدام الطاقة [42] وزيادة إنتاج الطاقة [43] لاستعادة توازن الطاقة [39] ، [43]. ومع ذلك ، فقد ثبت أيضًا أن زيادة تنشيط AMPK يساهم في زيادة موت الخلايا وضمور العضلات [44] ، [45] ، [46]. لذلك ، فإن الاستجابة التكيفية الأولية من قبل الخلية لاستعادة توازن الطاقة قد يكون لها في النهاية نتائج مرضية في وجود طاقة مزمنة أو إجهاد مؤكسد.

في الختام ، نوضح أن الإجهاد التأكسدي الخفيف يؤدي إلى تقليل اقتران الميتوكوندريا وإجهاد طاقة الخلية في الجسم الحي. وبالتالي خفضت في الجسم الحي قد يوفر P / O آلية تربط الإجهاد التأكسدي الخفيف بتنشيط عمليات الإشارات الحساسة للطاقة. نوضح أن فصل الميتوكوندريا هذا وضغط الطاقة يسبقان عيوبًا شديدة في وظيفة الميتوكوندريا أو ضعف إنتاج ATP وقد يكون بمثابة علامة بيولوجية مبكرة لتعطيل وظيفة الميتوكوندريا الطبيعية عن طريق الإجهاد التأكسدي.


التنفس

يتكون التنفس الهوائي من أربع مراحل: تحلل السكر، ال رد فعل الارتباط، ال دورة كريبس و الفسفرة التأكسدية. أثناء التنفس الهوائي ، يتم حرق الجلوكوز بشكل فعال داخل أجسامنا (يتفاعل مع الأكسجين) لإنتاج ثاني أكسيد الكربون والماء والكثير من الطاقة في شكل ATP. ال المعادلة الشاملة للتنفس الهوائي:

تحلل السكر

المرحلة الأولى من التنفس الهوائي تحلل السكر، والتي تجري في السيتوبلازم. تحلل السكر الجلوكوز، جزيء من ستة كربون ، إلى جزئين أصغر من ثلاثة كربون يسمى البيروفات. هذه المرحلة لا تتطلب أكسجين لذا فهي عملية لاهوائية ويشارك في كل من مسارات التنفس الهوائية واللاهوائية.

الجلوكوز فسفرة باستخدام مجموعات الفوسفات من جزيئين من ATP. يتحلل ATP بالماء إلى ADP والفوسفات غير العضوي. هذا يشكل جزيء غير مستقر وينقسم على الفور إلى جزيئين من ثلاثة كربون يسمى ثلاثي الفوسفات (TP). تتم إزالة الهيدروجين من TP لتحويله إلى البيروفات. يتم نقل الهيدروجين إلى مساعد الانزيم مسمى NAD لتشكيل خفض NAD (NADH). إزالة الهيدروجين من TP يؤكسده. يتم استخدام NAD المخفّض في المرحلة الأخيرة من التنفس الهوائي ، الفسفرة المؤكسدة ، بينما ينتقل البيروفات إلى الميتوكوندريا للمرحلة التالية من التنفس ، تفاعل الارتباط.

أنتج تحويل ثلاثي الفوسفات إلى بيروفات أربعة جزيئات من ATP. نظرًا لأنه تم استخدام جزيئين من أجل فسفرة الجلوكوز في الخطوة الأولى ، فهذا يعني وجود a صافي ربح اثنين من ATP الجزيئات في تحلل السكر.

تفاعل الارتباط

يحدث تفاعل الارتباط في مصفوفة الميتوكوندريا.

ال رد فعل الارتباط يحدث في مصفوفة الميتوكوندريا ويحول البيروفات إلى جزيء يسمى أسيتيل أنزيم أ (أسيتيل CoA). لا تنتج هذه المرحلة أي طاقة على شكل ATP ولكنها تنتج خفض NAD و أسيتيل CoA. سيتم استخدام NAD المخفض في الفسفرة المؤكسدة بينما سيتم استخدام الأسيتيل CoA في المرحلة التالية من التنفس الهوائي ، دورة كريبس.

أثناء تفاعل الارتباط ، تتم إزالة ذرة كربون من البيروفات ، وتشكيلها نشبع. هذا يحول البيروفات إلى جزيء ثنائي الكربون يسمى خلات. يُزال الهيدروجين أيضًا من البيروفات في عملية التحويل إلى أسيتات ، والتي يتم التقاطها بواسطة الإنزيم المساعد NAD لتشكيل خفض NAD. الأسيتات هو جنبا إلى جنب مع أنزيم أ (CoA) لتشكيل أسيتيل CoA.

نظرًا لأنه يتم تحويل جزيء جلوكوز واحد إلى 2x بيروفات ، يحدث تفاعل الارتباط مرتين لكل جزيء جلوكوز. هذا يعني أن كل جزيء من الجلوكوز ينتج جزيئين من الأسيتيل CoA (جنبًا إلى جنب مع 2x ثاني أكسيد الكربون و 2x NADH).

دورة كريبس

ال دورة كريبس (تُعرف أيضًا باسم دورة حمض الستريك) هي سلسلة من التفاعلات التي تولد خفض NAD وجزيء مشابه يسمى خفض FAD وهي ضرورية للفسفرة المؤكسدة. أسيتيل CoA من تفاعل الارتباط يتفاعل مع جزيء رباعي الكربون يسمى أوكسالو أسيتات. تتم إزالة الإنزيم المساعد أ جزء من الأسيتيل CoA ويعود إلى تفاعل الارتباط لإعادة استخدامه. يسمى جزيء 6-كربون سترات ويتم إنتاج. تتم إزالة الكربون والهيدروجين من السترات وتشكيلها نشبع و خفض NAD. يتم تحويل السترات إلى مركب مكون من 5 كربون. نزع الكربوكسيل و نزع الهيدروجين تحدث مرة أخرى ، مما يحول المركبات المكونة من 5 كربون إلى جزيء 4 كربون أوكسالو أسيتات الذي بدأنا به. ATP ، جزيئين من NAD المختزل ، جزيء واحد من FAD وثاني أكسيد الكربون يتم تشكيلها أيضًا في هذه الخطوة. هذه الدورة تحدث مرتين لكل جلوكوز الجزيء الذي يتنفس هوائيًا.

الفسفرة التأكسدية

الفسفرة التأكسدية هي المرحلة الأخيرة من التنفس الهوائي وهي الجزء الذي يوجد فيه معظم يتكون ATP. يستخدم الإلكترونات التي يتم حملها خفض NAD و خفض FAD التي تم إنشاؤها في المراحل الثلاث الأولى. يتم ذلك عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي ويتضمن عمليتين - ال سلسلة نقل الإلكترون و كيميائي.

الإنزيمات خفض NAD و خفض FAD تطلق ذرات الهيدروجين التي تنقسم إلى أيونات وإلكترونات الهيدروجين. يتم تمرير الإلكترونات عليها ناقلات الإلكترون التي يتم تضمينها داخل غشاء الميتوكوندريا الداخلي وتنتقل عبر سلسلة من ناقلات الإلكترون المعروفة باسم سلسلة نقل الإلكترون. وهم يسافرون بين حاملات الإلكترون تفقد الطاقة. يتم استخدام هذه الطاقة من قبل شركات النقل ل ضخ أيونات الهيدروجين من مصفوفة الميتوكوندريا عبر الغشاء الداخلي. تتراكم أيونات الهيدروجين في الفضاء بين الغشاء وهذا يولد a التدرج البروتوني (يشار إليه أحيانًا بالتدرج الكهروكيميائي) عبر الغشاء. ثم تتدفق أيونات الهيدروجين مرة أخرى إلى المصفوفة من خلال الإنزيم سينسيز ATP الذي يستخدم حركة أيونات الهيدروجين ( بروتون القوة الدافعة) لإضافة مجموعة فوسفات إلى ADP شكل ATP. تسمى العملية التي تنتج بها حركة أيونات الهيدروجين ATP كيميائي. بمجرد وصول الإلكترونات إلى نهاية سلسلة نقل الإلكترون ، يتم تمريرها الأكسجين، والذي يشار إليه باسم "متقبل الإلكترون النهائي". يتحد الأكسجين مع الإلكترونات وأيونات الهيدروجين لتكوينها ماء، أحد منتجات التنفس الهوائي.

السموم الأيضية، مثل السيانيد ، يعطل الفسفرة المؤكسدة عن طريق الارتباط بحاملات الإلكترون و إعاقة حركة الإلكترونات على طول سلسلة نقل الإلكترون. هذا يقلل من الانقسام الكيميائي حيث لم يتم إنشاء التدرج البروتوني ويثبط أيضًا دورة كريبس حيث لا يتم تجديد NAD و FAD. توقف إنتاج ATP ، لذا لا يمكن أن تحدث العمليات التي تتطلب طاقة (مثل تقلص عضلة القلب) ، والتي يمكن أن تكون مميتة للكائن الحي الذي ابتلع السم.

إجمالي إنتاج ATP

ينتج التنفس الهوائي ما مجموعه 38 ATP جزيئات لكل جزيء واحد من الجلوكوز تتنفس. فيما يلي تفصيل لإنتاج ATP في كل مرحلة من المراحل المختلفة. ينتج كل جزيء من NAD المختزل 3 ATP وكل جزيء من FAD المنخفض ينتج 2 ATP. تذكر أن تفاعل الارتباط ودورة كريبس يحدثان مرتين لكل جزيء من الجلوكوز ، لأنه يتم تحويله إلى 2x بيروفات.

تحلل السكر: الإنتاج المباشر لـ 2 ATP

تحلل السكر: يتم تحويل 2 مخفض NAD إلى 6 ATP (2 × 3) في الفسفرة المؤكسدة

تفاعل الارتباط: يتم تحويل 2 مخفض NAD إلى 6 ATP (2 × 3) في الفسفرة المؤكسدة

دورة كريبس: الإنتاج المباشر لـ 2 ATP

دورة كريبس: 6 مخفضة يتم تحويلها إلى NAD 18 ATP (6 × 3) في الفسفرة المؤكسدة

دورة كريبس: يتم تحويل 2 مخفضة FAD إلى 4 ATP (2 × 2) في الفسفرة المؤكسدة

مجموع ATP = 2 + 6 + 6 + 2 + 18 + 4 = 38 ATP

قياس معدل التنفس

يتم قياس معدل التنفس باستخدام قطعة من الجهاز تسمى أ مقياس التنفس ويعمل عن طريق قياس إما كمية الأكسجين المستخدمة بواسطة كائن حي أو إنتاج كمية ثاني أكسيد الكربون. كلما زادت كمية الأكسجين المستهلكة ، زادت سرعة التنفس.

يمكنك إعداد مقياس التنفس كما هو موضح في الرسم التخطيطي ، باستخدام الكائنات الحية (مثل قمل الخشب) في أنبوب اختبار واحد متصل بأنبوب اختبار آخر بواسطة أ مقياس ضغط الدم. يحتوي مقياس ضغط الدم على سائل ملون يتحرك بالقرب من أنبوب اختبار التنفس أثناء استهلاك الأكسجين. أنبوب الاختبار الموجود على اليمين هو أ مراقبة أنبوب اختبار يحتوي على مادة لا تنفث مثل الخرز الزجاجي. The purpose of the control tube is to ensure that only respiration is causing the movement of liquid in the manometer. The control tube should be as similar as possible to the test tube e.g. the glass beads should be the same mass as the woodlice. In each test tube you need to add the same volume of potassium hydroxide solution which absorbs carbon dioxide - this ensures that the movement of the liquid is only affected by the decreasing levels of oxygen.

Once the apparatus has been set up, it is left for a certain period of time (e.g. 30 minutes). This will allow for the potassium hydroxide to absorb all of the carbon dioxide in the test tubes. You then record the distance moved by the liquid in the manometer in a given time, using the calibrated scale and a stopwatch. You then calculate the volume of oxygen taken in by the woodlice per minute. Repeat the experiment at least three times and calculate a mean.

Anaerobic respiration

Respiration can also occur in the absence of oxygen - this is called anaerobic respiration. In mammals, glucose can be converted into اللاكتات (aka lactic acid) which releases a small amount of energy in the form of ATP.

The first step of anaerobic respiration is the same as aerobic respiration: glycolysis. Glucose is converted into pyruvate with the net release of 2 ATP molecules. 2 molecules of reduced NAD are also formed. In the second step, reduced NAD donates hydrogen (and electrons) to pyruvate, producing lactate and NAD. هذه regenerates more oxidised NAD for glycolysis. This enables anaerobic respiration to continue and ensures that small amounts of energy can still be made in the absence of oxygen, allowing biological reactions to keep ticking over.

Continued anaerobic respiration results in the build up of lactate, which needs to be broken down. Cells can convert lactate back into pyruvate, which is then able to enter aerobic respiration at the Krebs cycle. بالإضافة الى، liver cells have the ability to convert lactate into glucose, which can then be respired aerobically (if oxygen is now present) or stored for later use.


8C: ATP and Oxidative Phosphorylation - Biology

الفسفرة التأكسدية , incorporating two interdependent processes – the flow of electrons through سلسلة نقل الإلكترون down to the oxygen and chemiosmotic coupling -, is the final stage of cellular respiration.

Highly energetic electrons that are extracted during the decomposition of food molecules by cellular metabolic pathways are stored in electron carriers – NADH and FADH2. Energy stored in these molecules is converted into cellular energy currency (i.e. ATP) only via oxidative phosphorylation . Actually, most of the ATP production during cellular respiration happens here. Take a look at the diagram below that shows the interconnectedness between cellular energy pathways.

In the mitochondrial matrix, the electron carriers NADH and FADH2 deposit the electrons they gained from glycolysis and the citric acid cycle in the electron transport chain – a series of proteins embedded in the inner mitochondrial membrane. In the electron transport chain, electrons are passed from one molecule to another as a series of redox reactions. The energetically “downhill” movement of electrons through the chain causes pumping of protons into the intermembrane space by the first, third, and fourth complexes. As a result, the electrochemical gradient (i.e. proton gradient) forms across the inner membrane of mitochondria.

This gradient is used by chemiosmotic coupling to make ATP through phosphorylation of ADP. In this process, protons flow down their concentration gradient into the matrix through the membrane protein ATP synthase, causing it to spin (like a water wheel) and catalyze conversion of ADP to ATP. Take a look at the diagram below which summarizes oxidative phosphorylation.

You may wonder where the oxygen takes role in cellular “respiration”? As electrons complete their flow through electron transport chain elements, oxygen accepts them. Also taking up protons from the environment, oxygen forms water in this process. If oxygen isn’t there to accept electrons (for instance, because a person is not breathing in enough oxygen), the electron transport chain will stop running, and ATP will no longer be produced by chemiosmosis. Without enough ATP, cells can’t carry out the reactions they need to function, and, after a long enough period of time, may even die.


The electron transport chain or ETC is tightly coupled to the process of oxidative phosphorylation via the atp synthase system for the production of useful energy for metabolism in the form of ATP. These coupled processes are present in all mitochondria, which are present in all plant and animal life above the level of microbes. Even in the microbes, there are ETCs embedded in the cell membranes, even though they don't possess mitochondria.

A normal animal cell will have on the order of a thousand mitochondria, and each mitochondrion has on the order of a thousand ETCs, so a cell has something on the order of a million of these coupled energy tools! (Ahern)


Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements

Partitioning of ATP generation between glycolysis and oxidative phosphorylation is central to cellular bioenergetics but cumbersome to measure. We describe here how rates of ATP generation by each pathway can be calculated from simultaneous measurements of extracellular acidification and oxygen consumption. We update theoretical maximum ATP yields by mitochondria and cells catabolizing different substrates. Mitochondrial P/O ratios (mol of ATP generated per mol of [O] consumed) are 2.73 for oxidation of pyruvate plus malate and 1.64 for oxidation of succinate. Complete oxidation of glucose by cells yields up to 33.45 ATP/glucose with a maximum P/O of 2.79. We introduce novel indices to quantify bioenergetic phenotypes. The glycolytic index reports the proportion of ATP production from glycolysis and identifies cells as primarily glycolytic (glycolytic index > 50%) or primarily oxidative. The Warburg effect is a chronic increase in glycolytic index, quantified by the Warburg index. Additional indices quantify the acute flexibility of ATP supply. The Crabtree index and Pasteur index quantify the responses of oxidative and glycolytic ATP production to alterations in glycolysis and oxidative reactions, respectively the supply flexibility index quantifies overall flexibility of ATP supply and the bioenergetic capacity quantifies the maximum rate of total ATP production. We illustrate the determination of these indices using C2C12 myoblasts. Measurement of ATP use revealed no significant preference for glycolytic or oxidative ATP by specific ATP consumers. Overall, we demonstrate how extracellular fluxes quantitatively reflect intracellular ATP turnover and cellular bioenergetics. We provide a simple spreadsheet to calculate glycolytic and oxidative ATP production rates from raw extracellular acidification and respiration data.

الكلمات الدالة: ATP ECAR OCR bioenergetics energy metabolism glycolysis metabolic index mitochondria oxidative phosphorylation.

© 2017 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

بيان تضارب المصالح

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article


مناقشة

Major thrombotic and hemorrhagic events are associated with changes in platelet metabolism and function including aggregation [6,8–10,41–44]. Understanding these metabolic changes is important in designing new therapeutic approaches to modulate platelet function, and assessing the impact of current interventions for cancer or other diseases on platelet bioenergetic capacity. Although it is clear that both glycolysis and oxidative phosphorylation are active metabolic pathways in platelets, the metabolic plasticity in the use of oxidative substrates for platelet aggregation remains unexplored [6,11–15]. The focus of this study is to elucidate how fatty acids and Gln interact with glucose in regulating the metabolic changes that accompany thrombin mediated platelet aggregation. The advantage of the approach taken here is that the changes in platelet metabolism can be followed over time, and mitochondrial function can be determined in intact and permeabilized platelets, thereby avoiding artifacts introduced by disruptive isolation techniques.

Using platelets isolated from healthy human volunteers, we simultaneously measured mitochondrial function and glycolysis after exposing platelets to thrombin and found a rapid stimulation of both metabolic pathways (Fig 1). Interestingly, thrombin increases ATP-linked respiration which is direct evidence for the contribution of the mitochondrion to the energetic demand associated with thrombin stimulated aggregation. Other oxygen consuming processes such as the cyclooxygenases were probably below the limit of detection. It has been suggested that high levels of thrombin can lead to opening of the mitochondrial permeability transition pore during platelet aggregation, leading to decreased mitochondrial membrane potential and reduced ATP output [45,46]. However, we have shown that over the first 30 min after thrombin exposure there is no change in proton leak (Fig 1C and 1D). This indicates that the mitochondrial permeability transition pore has not opened under these conditions, since it would increase proton leak and decrease ATP linked respiration. Further, measurement of mitochondrial function after thrombin exposure revealed only minor changes in RCR and oxidation of complex I and II linked substrates, which suggests that a major mitochondrial dysfunction is not normally associated with the early stages of platelet aggregation (Fig 2). There is a decrease in total ATP and ADP levels in thrombin treated platelets indicative of granule release (Fig 3A), but bioenergetic parameters such as the energy charge and ATP/ADP ratio are maintained indicating that the energy demand of the platelet can be met under these conditions of increased demand (Fig 3).

It is not known which substrates support the rapid and sustained stimulation of mitochondrial respiration and glycolysis upon addition of thrombin in platelets. The XF DMEM media used in these experiments did not contain free fatty acids. The source of fatty acids for oxidative phosphorylation is likely derived from endogenous free fatty acids and triglycerides stores that release fatty acids upon lipase activity [47,48]. It is important to note that fatty acid oxidation also occurs in the peroxisomes and with enzymes such as cyclooxygenase [49,50]. However, the oxygen consumption rate reported here can largely be ascribed to mitochondrial oxidative phosphorylation, since it is inhibited by antimycin A. Exogenous supplementation with the fatty acid palmitate, increased basal and maximal respiration, indicating that platelets are able to transport extracellular fatty acids and utilize them for respiration (Fig 4). Fatty acid supplementation also increases proton leak, which has been described previously [51–53]. However, supplementation of fatty acids do not change thrombin stimulated respiration, indicating that the platelets are not relying on exogenous fatty acids to support the metabolic requirements for thrombin stimulation (Fig 4). To elucidate the contribution of endogenous stores of fatty acids to platelet bioenergetics, using etomoxir, an inhibitor of CPT-1, we found that fatty acid oxidation is making a major contribution to basal respiration and is required for the thrombin stimulated oxygen consumption (Fig 5B). Using TMZ which inhibits 3-ketoacyl-CoA thiolase, we similarly found that fatty acid oxidation is required for thrombin linked increase in OCR, albeit to a lower extent than etomoxir (Fig 5D). The reasons for this difference are not clear, and could be due to an off-target effect of etomoxir or compensation in the presence of TMZ.

Gln depletion from the media or inhibition of glutaminase with Aza resulted in a small but significant effect on platelet bioenergetics (Fig 6A and 6E). Further, a Gln concentration dependent effect was found on bioenergetic parameters in the presence of thrombin (Fig 6D). In the absence of thrombin, bioenergetic parameters showed minimal dependence on Gln, with the exception of maximal respiration which exhibited an EC50 of 367 μM (data not shown). Since the physiological concentrations of Gln in plasma of healthy subjects are 500–750 μM [54], then Gln could become limiting for platelet bioenergetics. This may be important under conditions of Gln deficiency, which have been reported to occur after infections or injury [55]. Interestingly, although glucose oxidation is substantially increased on addition of thrombin it is not making a significant contribution to the thrombin-dependent stimulation of mitochondrial function (Fig 7).

An interesting feature of these studies is the plasticity of platelet metabolism. For example, Gln depletion and inhibition of fatty acid oxidation both caused a compensatory increase in basal ECAR (Fig 5C and 6C). The acidification of the media, measured as an increase in ECAR, is potentially derived from several sources including proton production during glycolysis and from mitochondrial respiration derived CO2 that forms carbonic acid [56]. Using 2DG, an inhibitor of hexokinase, the contribution of glycolysis to ECAR was confirmed, since in resting platelets, 36% of the ECAR and in thrombin stimulated platelets 90% of the ECAR, was inhibitable by 2DG (Fig 7C) Further, inhibition of mitochondrial fatty acid oxidation also causes a compensatory increase in thrombin stimulated glycolysis, but this effect is not observed in the absence of Gln (Fig 5C and 6C). As expected, inhibiting glycolysis decreased basal and thrombin stimulated ECAR (Fig 7C).

The mitochondrial metabolism inhibitors antimycin A, etomoxir, TMZ, Gln depletion, Aza alone or in combination do not prevent platelet aggregation (Fig 8B). We ascribe this effect to a switch to glycolytic metabolism, to compensate for the decrease in oxidative phosphorylation. However, it appears that platelets have a requirement for glucose oxidation which cannot be compensated for by mitochondrial function, since hexokinase inhibition with 2DG and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase inhibition with koningic acid, significantly inhibit platelet aggregation (Fig 8A). The mechanisms underlying these effects are not clear, since both compounds act on different steps in glycolysis, it is likely that the pentose phosphate pathway, which is inhibited by 2DG but not koningic acid, is not playing a major role regulating the energetics of platelets. The combined effects of 2DG or koningic and antimycin are synergistic in the inhibition of platelet aggregation consistent with published studies (Fig 8A) [10]. In contrast, combining inhibition of glycolysis, with etomoxir and/or Gln depletion, or TMZ and/or Aza, decreases aggregation by a further 10%, compared to glycolytic inhibition alone, providing further evidence for multiple oxidative substrate usage in platelet metabolism (Fig 8C).

In summary, we have used a novel approach to measure the oxidative and glycolytic changes that occur with thrombin stimulation of platelets. Here, we show that fatty acids and Gln are required for the rapid thrombin-dependent stimulation of oxidative phosphorylation but not for thrombin-dependent aggregation. Thrombin-dependent activation of platelets initiates a metabolic reprogramming of the platelet towards aerobic glycolysis, increased fatty acid oxidation and glutaminolysis, which is fully capable of meeting the energetic demand imposed by aggregation and underlines the metabolic plasticity of the platelet.


شاهد الفيديو: #7 Mitochondria الميتوكوندريا. Biology (كانون الثاني 2022).