معلومة

كيف يمكنني إدخال البروتينات المؤتلفة في نواة خلايا الثدييات؟


أعلم أن هناك تسلسلات توطين نووية (NLS). يمكن أخذها من البروتينات الذاتية أو الفيروسية ودمجها في الطرف N أو C لبروتيني المؤتلف.

ما هو الأفضل؟ أيهما أفضل قصير (بحيث يمكن إضافته بسهولة باستخدام Primer)؟ هل يجب إرفاقه بالمحطة N أو C؟ هل تؤثر على التعبير؟

لقد سمعت أن الحجم مهم (لن يتناسب الحجم الكبير جدًا من خلال المسام النووية ، وسوف ينتشر صغير جدًا مرة أخرى). ما هو نطاق أحجام البروتين التي يمكن استهدافها بكفاءة؟


كيف تعمل لقاحات mRNA؟

تحتوي معظم اللقاحات على مُمْرِض مُعدٍ أو جزء منه ، لكن لقاحات الرنا المرسال تقدم التعليمات الجينية لخلايانا لصنع بروتينات فيروسية أو بكتيرية بنفسها. يستجيب نظام المناعة لدينا لهذه الأشياء ويبني المناعة.

Messenger RNA (mRNA) هو جزيء وحيد الخيط موجود بشكل طبيعي في جميع خلايانا. إنه يحمل التعليمات الخاصة بصنع البروتينات من جيناتنا ، الموجودة في نواة الخلية ، إلى السيتوبلازم ، الجسم الرئيسي لخلايانا.

تقوم الإنزيمات الموجودة في السيتوبلازم بترجمة المعلومات المخزنة في الرنا المرسال وتصنع البروتينات.

يقدم لقاح mRNA التعليمات لصنع بروتين بكتيري أو فيروسي لخلايانا. ثم يستجيب جهاز المناعة لدينا لهذه البروتينات ويطور أدوات للتفاعل مع العدوى المستقبلية بمسببات الأمراض.

تقنية لقاح mRNA ليست جديدة ، ولكن لم تكن هناك لقاحات mRNA التي تمت الموافقة على استخدامها في البشر حتى وقت قريب.

تستخدم بعض اللقاحات فيروسًا أو بكتيريا كاملة لتعليم أجسامنا كيفية بناء مناعة ضد العامل الممرض. يتم تعطيل هذه العوامل الممرضة أو إضعافها ، مما يعني إضعافها. تستخدم لقاحات أخرى أجزاء من الفيروسات أو البكتيريا.

تستخدم تقنية اللقاح المؤتلف الخميرة أو الخلايا البكتيرية لصنع نسخ عديدة من بروتين فيروسي أو بكتيري معين أو أحيانًا جزء صغير من البروتين.

تتجاوز لقاحات mRNA هذه الخطوة. يتم تصنيعها كيميائيًا دون الحاجة إلى الخلايا أو مسببات الأمراض ، مما يجعل عملية الإنتاج أبسط. تحمل لقاحات الرنا المرسال المعلومات التي تسمح لخلايانا بصنع بروتينات العامل الممرض أو شظايا البروتين بنفسها.

الأهم من ذلك ، أن لقاحات الرنا المرسال تحمل المعلومات فقط لصنع جزء صغير من العامل الممرض. من هذه المعلومات ، لا يمكن لخلايانا أن تصنع العامل الممرض بالكامل.

لا يمكن أن يتسبب كل من لقاح mRNA COVID-19 الذي طورته شركة Pfizer / BioNTech و Moderna في الإصابة بـ COVID-19. فهي لا تحمل المعلومات الكاملة لخلايانا لصنع فيروس SARS-CoV-2 ، وبالتالي لا يمكن أن تسبب عدوى.

في حين أن مفهوم لقاحات mRNA قد يبدو بسيطًا ، إلا أن التكنولوجيا متطورة إلى حد ما.

الحمض النووي الريبي جزيء معروف عنه الضعف. إن توصيل mRNA بنجاح إلى الخلايا داخل أجسامنا والتأكد من أن الإنزيمات داخل خلايانا لا تتحلل يمثلان تحديات رئيسية في تطوير اللقاح.

يمكن أن تؤدي التعديلات الكيميائية أثناء عملية التصنيع إلى تحسين استقرار لقاحات mRNA بشكل كبير.

يُعد تغليف الرنا المرسال في الجسيمات النانوية الدهنية إحدى الطرق لضمان قدرة اللقاح على دخول الخلايا بنجاح وتوصيل الرنا المرسال إلى السيتوبلازم.

لا يبقى مرنا في خلايانا لفترة طويلة. بمجرد تمرير تعليماته إلى آلية صنع البروتين في خلايانا ، تعمل الإنزيمات المسماة ribonucleases (RNases) على تحلل الرنا المرسال.

ليس من الممكن أن ينتقل الرنا المرسال إلى نواة الخلية لأنه يفتقر إلى الإشارات التي تسمح لها بدخول هذه الحيز. هذا يعني أن الحمض النووي الريبي لا يمكن أن يندمج في الحمض النووي للخلية الملقحة.

لا يوجد خطر حدوث تغييرات جينية طويلة الأمد مع لقاحات الرنا المرسال.

خضعت لقاحات mRNA COVID-19 التي تنتجها شركتا Pfizer و Moderna لاختبارات السلامة في التجارب السريرية البشرية.

منحت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) تصريح الاستخدام في حالات الطوارئ (EUA) للقاح Pfizer mRNA بعد مراجعة بيانات السلامة من أكثر من 37000 مشارك في التجربة.

وكتبت إدارة الغذاء والدواء في بيانها أن "الآثار الجانبية الأكثر شيوعًا والتي استمرت عدة أيام كانت الألم في موقع الحقن ، والتعب ، والصداع ، وآلام العضلات ، والقشعريرة ، وآلام المفاصل ، والحمى". "تجدر الإشارة إلى أن عددًا أكبر من الأشخاص عانوا من هذه الآثار الجانبية بعد الجرعة الثانية مقارنة بالجرعة الأولى ، لذلك من المهم لمقدمي التطعيم والمتلقين توقع حدوث بعض الآثار الجانبية بعد أي جرعة ، ولكن أكثر من ذلك بعد الجرعة الثانية . "

للحصول على تحديثات حية حول آخر التطورات المتعلقة بفيروس كورونا الجديد و COVID-19 ، انقر هنا.


سؤال: ينتج DNA Ligase العديد من النسخ من قطعة غير معروفة من الحمض النووي. يستخدم لإنتاج بصمات الحمض النووي للمشتبه به في مسرح الجريمة. يربط جزيئين DNA معًا. يضاعف تسلسل الحمض النووي للميتوكوندريا. يصنع نسخًا من الجينات الأجنبية لاستخدامها في صنع الحمض النووي المؤتلف. ماذا يدرس مجال البروتينات؟ التفاعل بين البروتينات الخلوية وكيف.

يستخدم لإنتاج بصمات الحمض النووي للمشتبه به في مسرح الجريمة.

يربط جزيئين DNA معًا.

يضخم تسلسل الحمض النووي للميتوكوندريا.

يصنع نسخًا من الجين الأجنبي لاستخدامها في صنع الحمض النووي المؤتلف.

ماذا يدرس مجال البروتينات؟

التفاعل بين البروتينات الخلوية وكيف تشكل الجزء الأكبر من غشاء الخلية.

هيكل ووظيفة البروتينات الخلوية وكيف تتفاعل لتساهم في السمات.

هيكل البريونات وكيف يمكن أن تؤدي إلى أمراض مختلفة داخل الجسم.

هيكل الكربوهيدرات وكيف يتم تحويلها إلى شكل صالح للاستعمال من الطاقة للجسم.

هيكل ووظيفة الدهون الخلوية وكيف تتفاعل لتساهم في السمات.

لماذا من الضروري "تجويع" الخلايا المانحة قبل الاستنساخ التناسلي؟

لإطالة التيلوميرات في نواة المتبرع

لجعل النواة "تبدأ من جديد" في المرحلة S بحيث تكون النواة أحادية العدد

لإجبار الخلايا على G 0 المرحلة بحيث تستجيب لإشارات النمو السيتوبلازمية

لجعل النواة "تبدأ من جديد" في المرحلة S بحيث تكون النواة ثنائية الصبغة

لإجبار خلية البويضة المستأصلة في G 0 المرحلة بحيث تقبل نواة المتبرع

يشتمل نظام CRISPR على إنزيم Cas9 ، الذي يحدد النيوكليوتيدات المحددة المراد قطعها باستخدام جزيء (n) ________ كدليل لتحديد تسلسل الحمض النووي المناسب لتحريره.

لماذا تستخدم الخلايا الجذعية البالغة حاليًا في الاستنساخ العلاجي استخدامات أقل من الخلايا الجذعية الجنينية؟

قد تصبح الخلايا الجذعية البالغة أي نوع من الخلايا ، في حين أن الخلايا الجذعية الجنينية قد تصبح خلايا جذعية بالغة فقط أولاً.

تحتوي الخلايا الجذعية البالغة على المزيد من القيود التي تمنعها من الدخول مرة أخرى في دورة الخلية عند G 0 المسرح.

قد تصبح الخلايا الجذعية الجنينية أي نوع من الخلايا ، في حين أن الخلايا الجذعية البالغة قد تصبح فقط عددًا محدودًا من أنواع الخلايا.

تحتوي الخلايا الجذعية الجنينية على تيلوميرات أطول وتستمر لفترة أطول بكثير من الخلايا الجذعية البالغة.

الخلايا الجذعية الجنينية قادرة على العودة إلى G. 0 المرحلة عند الجوع.


كيف يمكنني إدخال البروتينات المؤتلفة في نواة خلايا الثدييات؟ - مادة الاحياء

أدى اكتشاف البروتين الفلوري الأخضر في أوائل الستينيات إلى بداية حقبة جديدة في بيولوجيا الخلية من خلال تمكين الباحثين من تطبيق طرق الاستنساخ الجزيئي ، ودمج جزء الفلوروفور في مجموعة متنوعة من أهداف البروتين والإنزيم ، من أجل مراقبة العمليات الخلوية في الأنظمة الحية باستخدام المجهر الضوئي والمنهجية ذات الصلة. عند اقترانه بالتطورات التقنية الحديثة في التألق واسع النطاق والفحص المجهري متحد البؤر ، بما في ذلك الكاميرات الرقمية فائقة السرعة ذات الإضاءة المنخفضة وأنظمة التحكم بالليزر متعددة المسارات ، أظهر البروتين الفلوري الأخضر ومشتقاته الوراثية المتغيرة الألوان خدمة لا تقدر بثمن في عدة آلاف من تجارب التصوير بالخلايا الحية .

شكل 1 - ملصقات البروتين الفلورية في الخلايا الحية

قام أوسامو شيمومورا وفرانك جونسون ، اللذان يعملان في مختبرات فرايداي هاربور بجامعة واشنطن في عام 1961 ، بعزل بروتين حيوي يعتمد على الكالسيوم من ايكوريا فيكتوريا قنديل البحر الذي أطلقوا عليه اسم اكورين. أثناء إجراء العزل ، لوحظ وجود بروتين ثان يفتقر إلى خصائص الإضاءة الحيوية الباعثة للأزرق من aequorin ، ولكنه كان قادرًا على إنتاج مضان أخضر عند إضاءته بالضوء فوق البنفسجي. بسبب هذه الخاصية ، تم تعميد البروتين في النهاية باسم غير رسمي بروتين الفلوريسنت الأخضر (GFP). على مدى العقدين التاليين ، قرر الباحثون أن الأيكورين والبروتين الفلوري الأخضر يعملان معًا في الأعضاء الخفيفة لقنديل البحر لتحويل إشارات الإنارة المستحثة بالكالسيوم إلى خاصية التألق الأخضر المميزة للأنواع.

على الرغم من أن جين البروتين الفلوري الأخضر قد تم استنساخه لأول مرة في عام 1992 ، فإن الإمكانات الكبيرة كمسبار جزيئي لم تتحقق إلا بعد عدة سنوات عندما تم استخدام منتجات الاندماج لتتبع التعبير الجيني في البكتيريا والديدان الخيطية. منذ هذه الدراسات المبكرة ، تمت هندسة البروتين الفلوري الأخضر لإنتاج عدد كبير من المسوخات الملونة المختلفة ، وبروتينات الاندماج ، وأجهزة الاستشعار الحيوية التي يشار إليها على نطاق واسع باسم البروتينات الفلورية. في الآونة الأخيرة ، تم التعرف على البروتينات الفلورية من الأنواع الأخرى وعزلها ، مما أدى إلى مزيد من التوسع في لوحة الألوان. مع التطور السريع لتكنولوجيا البروتين الفلوري ، أصبحت فائدة هذا الفلوروفور المشفر وراثيًا لمجموعة واسعة من التطبيقات التي تتجاوز التتبع البسيط للجزيئات الحيوية الموسومة في الخلايا الحية الآن موضع تقدير كامل.

يتضح في شكل 1 مثالان على العديد من علامات البروتين الفلوريسنت في الخلايا الحية باستخدام منتجات الاندماج التي تستهدف مواقع الخلايا الفرعية (العضية). الخلية الظهارية الأبوسوم القشرة الكلوية القريبة (نعم سطر) قدم في الشكل 1 (أ) تم نقل العدوى بمزيج من المتغيرات البروتينية الفلورية المندمجة في إشارات الببتيد التي تتوسط في النقل إلى أي من النواة (بروتين فلوري سماوي محسن) ECFP) ، الميتوكوندريا (بروتين الفلورسنت DsRed DSRed2FP) ، أو شبكة الأنابيب الدقيقة (بروتين الفلوري الأخضر المحسن EGFP). عينة مماثلة تتكون من الخلايا الظهارية لسرطان عنق الرحم البشري (هيلا سطر) في الشكل 1 (ب). تم نقل خلايا هيلا بشكل مشترك مع نواقل توطين خلوية فرعية مدمجة في السماوي (مت تركواز) والأصفر (mVenus) تسلسلات ترميز البروتين الفلوري (معقد جولجي والنواة ، على التوالي) ، وكذلك بروتين "الفاكهة" ، mCherry ، الذي يستهدف شبكة الميتوكوندريا.

يتم استخدام البروتين الفلوري الأخضر ، وأشكاله الأليلية المتغيرة ، والبروتينات الفلورية الزرقاء والسماوية والأصفر لبناء بروتينات خيمرية متألقة يمكن التعبير عنها في الخلايا الحية والأنسجة والكائنات الحية بأكملها ، بعد تعداء مع ناقلات هندسية. تم عزل البروتينات الفلورية الحمراء من الأنواع الأخرى ، بما في ذلك كائنات الشعاب المرجانية ، وهي مفيدة بالمثل. تتجنب تقنية البروتين الفلوريسنت مشكلة التنقية ، ووضع العلامات ، وإدخال البروتينات المصنفة في الخلايا أو مهمة إنتاج أجسام مضادة محددة لمولدات المضادات السطحية أو الداخلية.

خصائص وتعديلات البروتين الفلوري الأخضر Aequorea victoria Green

من بين أهم جوانب البروتين الفلوري الأخضر الذي يجب تقديره هو أن بنية الببتيد الأصلية البالغة 27 كيلو دالتون بأكملها ضرورية لتطوير مضانه والحفاظ عليه. من اللافت للنظر أن مبدأ الفلوروفور الأساسي مشتق من ثلاثة توائم من الأحماض الأمينية المجاورة: بقايا السيرين والتيروزين والجليسين في المواقع 65 و 66 و 67 (يشار إليها باسم سير 65, صور 66، و Gly67 ارى الشكل 2). على الرغم من أن هذا النموذج البسيط من الأحماض الأمينية موجود بشكل شائع في جميع أنحاء الطبيعة ، إلا أنه لا يؤدي عمومًا إلى التألق. ما يميز البروتين الفلوري هو أن موقع هذا الببتيد الثلاثي يتواجد في وسط هيكل برميل مستقر بشكل ملحوظ يتكون من 11 بيتا- أوراق مطوية في أنبوب.

داخل البيئة الكارهة للماء في مركز البروتين الفلوري الأخضر ، يحدث تفاعل بين الكربون الكربوكسيل لـ Ser65 والنيتروجين الأميني لـ Gly67 الذي ينتج عنه تكوين نظام حلقة نيتروجين حلقي غير متجانس إيميدازولين -5-واحد (كما هو موضح في الشكل 2). ينتج عن المزيد من الأكسدة اقتران حلقة إيميدازولين مع Tyr66 ونضج الأنواع الفلورية. من المهم أن نلاحظ أن الفلوروفور البروتين الفلوري الأخضر الأصلي موجود في حالتين. الشكل البروتوني ، الحالة السائدة ، له حد أقصى للإثارة عند 395 نانومتر ، وشكل أقل انتشارًا غير محفز يمتص عند حوالي 475 نانومتر. بغض النظر عن الطول الموجي للإثارة ، فإن انبعاث التألق له أقصى طول موجي عند 507 نانومتر ، على الرغم من أن الذروة واسعة وغير محددة جيدًا.

الشكل 2 - نضوج البروتين الفلوري الأخضر

هناك سمتان سائدتان لبروتين الفلورسنت الفلوري لهما آثار مهمة على فائدته كمسبار. أولاً ، الخصائص الفيزيائية الضوئية للبروتين الفلوري الأخضر باعتباره فلوروفور معقدة للغاية ، وبالتالي ، يمكن للجزيء أن يستوعب قدرًا كبيرًا من التعديل. ركزت العديد من الدراسات على ضبط مضان البروتين الفلوري الأخضر الأصلي لتوفير مجموعة واسعة من المسابير الجزيئية ، ولكن لا يمكن التقليل من الإمكانات الأكثر أهمية والواسعة لاستخدام البروتين كمواد أولية لبناء الفلوروفورات المتقدمة. الميزة الثانية المهمة للبروتين الفلوري الأخضر هي أن التألق يعتمد بشكل كبير على التركيب الجزيئي المحيط بالفلور ثلاثي الببتيد.

يؤدي تمسخ البروتين الفلوري الأخضر إلى تدمير الفلورة ، كما هو متوقع ، ويمكن أن تؤدي الطفرات إلى المخلفات المحيطة بالفلوروفور ثلاثي الببتيد إلى تغيير خصائص التألق بشكل كبير. تعبئة بقايا الأحماض الأمينية داخل بيتا البرميل مستقر للغاية ، مما ينتج عنه عائد كمي مضان عالي جدًا (يصل إلى 80 بالمائة). يمنح هذا الهيكل البروتيني المحكم أيضًا مقاومة للاختلافات الفلورية بسبب التقلبات في درجة الحموضة ودرجة الحرارة ومحوّلات الطبيعة مثل اليوريا. يتم تغيير المستوى العالي من الاستقرار بشكل عام بطريقة سلبية من خلال الطفرات في البروتين الفلوري الأخضر الذي يزعج التألق ، مما يؤدي إلى تقليل العائد الكمي وزيادة الحساسية البيئية. على الرغم من أنه يمكن التغلب على العديد من هذه العيوب من خلال طفرات إضافية ، إلا أن البروتينات الفلورية المشتقة تكون عمومًا أكثر حساسية للبيئة من الأنواع المحلية. يجب مراعاة هذه القيود بجدية عند تصميم التجارب مع المتغيرات الجينية.

من أجل تكييف البروتينات الفلورية للاستخدام في أنظمة الثدييات ، تم إجراء العديد من التعديلات الأساسية للبروتين الفلوري الأخضر من النوع البري وتوجد الآن في جميع المتغيرات الشائعة الاستخدام. كانت الخطوة الأولى هي تحسين نضج الفلورة إلى بيئة 37 درجة مئوية. نضج الفلوروفور من النوع البري فعال للغاية عند 28 درجة ، ولكن زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة يقلل بشكل كبير من النضج الكلي ويؤدي إلى تقليل التألق. تحور بقايا فينيل ألانين في الموضع 64 (Phe64) إلى نتائج leucine في تحسين نضج التألق عند 37 درجة ، وهو ما يعادل على الأقل تلك الملاحظة عند 28 درجة. توجد هذه الطفرة في الأنواع الأكثر شيوعًا من البروتينات الفلورية المشتقة منها ايكوريا فيكتوريا، ولكنها ليست الطفرة الوحيدة التي تحسن الطي عند 37 درجة كما تم اكتشاف متغيرات أخرى.

بالإضافة إلى تحسين النضج عند 37 درجة ، أدى تحسين استخدام الكودون للتعبير عن الثدييات أيضًا إلى تحسين السطوع الكلي للبروتين الفلوري الأخضر المعبر عنه في خلايا الثدييات. إجمالاً ، تم إدخال أكثر من 190 طفرة صامتة في تسلسل الترميز لتعزيز التعبير في الأنسجة البشرية. موقع بدء ترجمة كوزاك (يحتوي على تسلسل النوكليوتيدات أ / GCCAT) عن طريق إدخال حمض أميني ثانٍ. هذه ، إلى جانب مجموعة متنوعة من التحسينات الأخرى (التي تمت مناقشتها أدناه) ، أدت إلى تحقيق مفيد للغاية لتصوير الخلايا الحية لخلايا الثدييات وهي شائعة في جميع المسابير الفلورية المستخدمة حاليًا والمشتقة من بروتين قنديل البحر الأصلي.

لوحة ألوان البروتين الفلورية

تم تطوير مجموعة واسعة من المتغيرات الجينية لبروتين الفلورسنت التي تتميز بملفات طيفية لانبعاث الفلورة تغطي تقريبًا طيف الضوء المرئي بأكمله (انظر الجدول 1). جهود الطفرات في الأصل ايكوريا فيكتوريا أدى البروتين الفلوري الأخضر لقنديل البحر إلى تحقيقات الفلورسنت الجديدة التي يتراوح لونها من الأزرق إلى الأصفر ، وهي من أكثر المسابير استخدامًا على نطاق واسع في الجسم الحي مراسل الجزيئات في البحوث البيولوجية. تم تطوير البروتينات الفلورية ذات الطول الموجي الأطول ، المنبعثة في المناطق الطيفية البرتقالية والحمراء ، من شقائق النعمان البحرية ، المرقص المخططوالشعاب المرجانية التي تنتمي إلى الطبقة أنثوزوا. لا يزال تم تعدين أنواع أخرى لإنتاج بروتينات مماثلة لها انبعاث مضان أزرق وأخضر وأصفر وبرتقالي وأحمر عميق. جهود البحث التنموي جارية لتحسين سطوع واستقرار البروتينات الفلورية ، وبالتالي تحسين فائدتها الإجمالية.

الجدول 1 - خصائص البروتين الفلوريسنت

بروتين
(اختصار)
الإثارة
أقصى
(نانومتر)
انبعاث
أقصى
(نانومتر)
مولار
انقراض
معامل في الرياضيات او درجة
الكم
أثمر
في الجسم الحي
بنية
نسبيا
سطوع
(٪ من EGFP)
GFP (بالوزن)395/47550921,0000.77أحادي المعدن*48
البروتينات الفلورية الخضراء
EGFP48450756,0000.60أحادي المعدن*100
زمرد48750957,5000.68أحادي المعدن*116
Superfolder GFP48551083,3000.65أحادي المعدن*160
أعظمي جرين49250555,0000.74أحادي المعدن121
mWasabi49350970,0000.80أحادي المعدن167
تاججفب48250558,2000.59أحادي المعدن*110
TurboGFP48250270,0000.53ثنائيات102
أكجفب48050550,0000.55أحادي المعدن*82
ZsGreen49350543,0000.91تيترامير117
T- الياقوت39951144,0000.60أحادي المعدن*79
البروتينات الفلورية الزرقاء
EBFP38344529,0000.31أحادي المعدن*27
EBFP238344832,0000.56أحادي المعدن*53
أزوريت38445026,2000.55أحادي المعدن*43
mTagBFP39945652,0000.63أحادي المعدن98
بروتينات فلورية سماوية
ECFP43947632,5000.40أحادي المعدن*39
مكفب43347532,5000.40أحادي المعدن39
سيرولين43347543,0000.62أحادي المعدن*79
مت تركواز43447430,0000.84أحادي المعدن*75
CyPet43547735,0000.51أحادي المعدن*53
AmCyan145848944,0000.24تيترامير31
ميدوري إيشي سماوي47249527,3000.90ثنائيات73
تاجكفب45848037,0000.57أحادي المعدن63
mTFP1 (أزرق مخضر)46249264,0000.85أحادي المعدن162
البروتينات الفلورية الصفراء
EYFP51452783,4000.61أحادي المعدن*151
توباز51452794,5000.60أحادي المعدن*169
كوكب الزهرة51552892,2000.57أحادي المعدن*156
سترين51652977,0000.76أحادي المعدن174
YPet517530104,0000.77أحادي المعدن*238
تاجيفب50852464,0000.60أحادي المعدن118
PhiYFP525537124,0000.39أحادي المعدن*144
ZsYellow152953920,2000.42تيترامير25
m الموزة5405536,0000.7أحادي المعدن13
بروتينات البرتقال الفلورية
كوسابيرا أورانج54855951,6000.60أحادي المعدن92
كوسابيرا أورانج 255156563,8000.62أحادي المعدن118
م البرتقال54856271,0000.69أحادي المعدن146
mOrange254956558,0000.60أحادي المعدن104
دتوماتو55458169,0000.69ثنائيات142
dTomato-Tandem554581138,0000.69أحادي المعدن283
TagRFP555584100,0000.48أحادي المعدن142
TagRFP-T55558481,0000.41أحادي المعدن99
DSRed55858375,0000.79تيترامير176
DSRed256358243,8000.55تيترامير72
DsRed-Express (T1)55558438,0000.51تيترامير58
DSRed- مونومر55658635,0000.10أحادي المعدن10
m اليوسفي56858538,0000.30أحادي المعدن34
بروتينات فلورية حمراء
روبي558605112,0000.35أحادي المعدن117
أبل56859275,0000.49أحادي المعدن109
م الفراولة57459690,0000.29أحادي المعدن78
AsRed257659256,2000.05تيترامير8
mRFP158460750,0000.25أحادي المعدن37
JRed58461044,0000.20ثنائيات26
مشيري58761072,0000.22أحادي المعدن47
هكريد 158861820,0000.015ثنائيات1
أم التوت59862586,0000.15أحادي المعدن38
dKeima-Tandem44062028,8000.24أحادي المعدن21
HcRed-Tandem590637160,0000.04أحادي المعدن19
mPlum59064941,0000.10أحادي المعدن12
AQ14359565590,0000.04تيترامير11
* ديمر ضعيف

المقدمة في الجدول 1 عبارة عن تجميع للخصائص التي يعرضها العديد من متغيرات البروتين الفلوريسنت الأكثر شيوعًا وفائدة. إلى جانب الاسم الشائع و / أو الاختصار لكل بروتين فلورسنت ، وأطوال موجات ذروة الامتصاص والانبعاث (المعطاة بالنانومتر) ، ومعامل الانقراض المولي ، والعائد الكمي ، والسطوع النسبي ، و في الجسم الحييتم سرد الجمعيات الهيكلية. تم اشتقاق قيم السطوع المحسوبة من ناتج معامل الانقراض المولي والعائد الكمي ، مقسومًا على قيمة EGFP. تم إنشاء هذه القائمة من مصادر الأدبيات العلمية والتجارية ولا يُقصد منها أن تكون شاملة ، ولكنها تمثل بدلاً من ذلك مشتقات البروتين الفلورية التي حظيت باهتمام كبير في الأدبيات وقد تثبت قيمتها في الجهود البحثية. علاوة على ذلك ، تم تسجيل أطياف الامتصاص والانبعاثات الفلورية المدرجة في الجداول والموضحة أدناه في ظل ظروف خاضعة للرقابة وتم تطبيعها لأغراض المقارنة والعرض فقط. في التحقيقات المجهرية الفلورية الفعلية ، قد تختلف الملامح الطيفية والحد الأقصى لطول الموجة بسبب التأثيرات البيئية ، مثل الأس الهيدروجيني والتركيز الأيوني وقطبية المذيب ، وكذلك التقلبات في تركيز المسبار الموضعي. لذلك ، قد تختلف معاملات الانقراض المدرجة والعوائد الكمومية عن تلك التي لوحظت بالفعل في ظل الظروف التجريبية.

البروتينات الفلورية الخضراء

على الرغم من أن البروتين الفلوري الأخضر الأصلي ينتج تألقًا كبيرًا ومستقرًا للغاية ، فإن الحد الأقصى للإثارة يكون قريبًا من نطاق الأشعة فوق البنفسجية. نظرًا لأن الضوء فوق البنفسجي يتطلب اعتبارات بصرية خاصة ويمكن أن يتلف الخلايا الحية ، فهو غير مناسب بشكل عام لتصوير الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري البصري. لحسن الحظ ، يتم تحويل الحد الأقصى من الإثارة لبروتين الفلورسنت الأخضر بسهولة إلى 488 نانومتر (في المنطقة السماوية) عن طريق إدخال طفرة نقطة واحدة تغير السيرين في الموضع 65 إلى بقايا ثريونين (S65T). تظهر هذه الطفرة في أكثر أنواع البروتينات الفلورية الخضراء شيوعًا ، والتي يطلق عليها  المحسن GFP (EGFP) ، والذي يتوفر تجارياً في مجموعة واسعة من النواقل التي تقدمها شركة BD Biosciences Clontech ، إحدى الشركات الرائدة في تكنولوجيا البروتينات الفلورية. علاوة على ذلك ، يمكن تصوير النسخة المحسّنة باستخدام مجموعات المرشحات المتاحة بشكل شائع والمصممة للفلوريسين وهي من بين ألمع البروتينات الفلورية المتوفرة حاليًا. جعلت هذه الميزات بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن أحد أكثر التحقيقات شيوعًا وأفضل خيار لمعظم تجارب البروتين الفلوري أحادي التسمية. العوائق الوحيدة لاستخدام EGFP هي حساسية طفيفة للأس الهيدروجيني وميل ضعيف للتقليل.

بالإضافة إلى البروتين الفلوري الأخضر المحسن ، يتم حاليًا استخدام العديد من المتغيرات الأخرى في تصوير الخلايا الحية. قد يكون أحد أفضل هذه العناصر من حيث الثبات الضوئي والسطوع هو زمرد متغير ، ولكن عدم وجود مصدر تجاري حد من استخدامه. توفر العديد من المصادر متغيرات البروتين الفلوري الأخضر المتوافقة مع البشر والتي توفر مزايا مميزة لنقل طاقة الرنين الفلوري (أقلق) التجارب. استبدال بقايا فينيل ألانين في الموضع 64 لليوسين (F64L GFP2) ينتج طفرة تحافظ على ذروة الإثارة البالغة 400 نانومتر ويمكن أن تقترن كشريك فعال لبروتين الفلورسنت الأصفر المحسن. هناك نوع مختلف من S65C تم تقديم طفرة (استبدال السيستين عادة للسيرين) ذات ذروة الإثارة عند 474 نانومتر تجاريًا كشريك FRET أكثر ملاءمة لبروتين الفلورسنت الأزرق المعزز من النسخة الخضراء المحسنة ذات اللون الأحمر. أخيرًا ، يسمى بروتين الشعاب المرجانية ZsGreen1 وله ذروة انبعاث عند 505 نانومتر ، تم إدخاله كبديل لبروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. عندما يتم التعبير عنها في خلايا الثدييات ، يكون ZsGreen1 ساطعًا جدًا بالنسبة إلى EGFP ، ولكن له فائدة محدودة في إنتاج طفرات الاندماج ، وعلى غرار بروتينات الشعاب المرجانية الأخرى ، يميل إلى تكوين رباعي الأبعاد.

البروتينات الفلورية الصفراء

بدأت عائلة البروتينات الفلورية الصفراء بعد أن أظهر التركيب البلوري للبروتين الفلوري الأخضر أن بقايا الثريونين 203 (Thr203) كان بالقرب من chromophore. تم إدخال تحور هذه البقايا إلى التيروزين لتحقيق الاستقرار في حالة الإثارة ثنائية القطب للحامل الصبغي وأدت إلى تحول 20 نانومتر إلى أطوال موجية أطول لكل من أطياف الإثارة والانبعاثات. أدت التحسينات الأخرى إلى تطوير  المحسن بروتين أصفر فلوري (EYFP) ، وهو أحد ألمع بروتينات الفلورسنت وأكثرها استخدامًا. يتحد طيف الانبعاث الفلوري والسطوع لبروتين الفلورسنت الأصفر المحسن لجعل هذا المسبار مرشحًا ممتازًا لتجارب التصوير متعدد الألوان في الفحص المجهري الفلوري. يعد البروتين الفلوري الأصفر المحسن مفيدًا أيضًا في تجارب نقل الطاقة عند إقرانه ببروتين الفلورسنت السماوي المحسن (ECFP) أو GFP2. ومع ذلك ، فإن البروتين الفلوري الأصفر يمثل بعض المشاكل من حيث أنه حساس للغاية لدرجة الحموضة الحمضية ويفقد ما يقرب من 50 في المائة من مضانه عند درجة الحموضة 6.5. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أيضًا أن EYFP حساس لأيونات الكلوريد والتبييض الضوئي بسهولة أكبر بكثير من البروتينات الفلورية الخضراء.

الشكل 3 - الملامح الطيفية للبروتينات الفلورية الشائعة

أدى التطوير المستمر لبنية البروتين الفلوري للانبعاثات الصفراء إلى حل العديد من المشكلات المتعلقة بالمجسات الصفراء. ال السترين متغير البروتين الفلوري الأصفر شديد السطوع بالنسبة إلى EYFP وقد ثبت أنه أكثر مقاومة للتبييض الضوئي ودرجة الحموضة الحمضية والتأثيرات البيئية الأخرى. مشتق آخر اسمه كوكب الزهرة، هو الأسرع نضجًا وأحد ألمع المتغيرات الصفراء التي تم تطويرها حتى الآن. بروتين الشعاب المرجانية ، ZsYellow1، المستنسخة في الأصل من أ زوانثوس الأنواع الأصلية في المحيطين الهندي والهادئ ، وتنتج انبعاث أصفر حقيقي وهي مثالية للتطبيقات متعددة الألوان. مثل ZsGreen1 ، هذا المشتق ليس مفيدًا في إنشاء عمليات اندماج مثل EYFP ويميل إلى تكوين رباعي الأبعاد. كان العديد من متغيرات البروتين الفلوري الأصفر الأكثر قوة مهمًا للنتائج الكمية في دراسات FRET ومن المحتمل أن تكون مفيدة في التحقيقات الأخرى أيضًا.

يتضح في الشكل 3 هي الملامح الطيفية للامتصاص والانبعاث للعديد من البروتينات الفلورية شائعة الاستخدام والمتاحة تجاريًا ، والتي تمتد على الطيف المرئي من السماوي إلى الأحمر البعيد. المتغيرات مشتقة من ايكوريا فيكتوريا قنديل البحر ، بما في ذلك البروتينات الفلورية السماوية والأخضر والأصفر المحسنة ، تظهر أطوال موجات انبعاث قصوى تتراوح من 425 إلى 525 نانومتر. تنبعث البروتينات الفلورية المشتقة من الشعاب المرجانية ، DsRed2 و HcRed1 (التي تمت مناقشتها أدناه) ، أطوال موجية أطول ولكنها تعاني من آثار قليلة القلة في خلايا الثدييات.

البروتينات الفلورية الزرقاء والسماوية

نتجت المتغيرات الزرقاء والسماوية للبروتين الفلوري الأخضر عن التعديل المباشر لبقايا التيروزين في الموضع 66 (صور 66) في الفلوروفور الأصلي (انظر الشكل 2). ينتج عن تحويل هذا الحمض الأميني إلى الهيستيدين انبعاث أزرق له طول موجي أقصى يبلغ 450 نانومتر ، بينما ينتج عن التحويل إلى التربتامين ذروة مضان كبيرة حوالي 480 نانومتر إلى جانب كتف يبلغ ذروته حوالي 500 نانومتر. كلا المجسين يتألقان بشكل ضعيف ويتطلبان طفرات ثانوية لزيادة كفاءة الطي والسطوع الكلي. حتى مع التعديلات ، فإن الإصدارات المحسّنة في هذه الفئة من البروتينات الفلورية (EBFP و ECFP) حوالي 25 إلى 40 في المائة فقط من السطوع مثل البروتين الفلوري الأخضر المحسن. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إثارة البروتينات الفلورية الزرقاء والسماوية هي الأكثر فعالية في المناطق الطيفية التي لا يتم استخدامها بشكل شائع ، لذلك يلزم وجود مجموعات مرشحات متخصصة ومصادر ليزر.

على الرغم من عيوب البروتينات الفلورية الزرقاء والسماوية ، فإن الاهتمام الواسع النطاق بوضع العلامات متعدد الألوان و FRET قد شاع تطبيقهما في عدد من التحقيقات. هذا ينطبق بشكل خاص على البروتين الفلوري السماوي المحسن ، والذي يمكن تحفيزه خارج الذروة بواسطة ليزر الأرجون أيون (باستخدام خط طيفي 457 نانومتر) وهو أكثر مقاومة للتبييض الضوئي من المشتق الأزرق. على عكس البروتينات الفلورية الأخرى ، لم يكن هناك مستوى عالٍ من الاهتمام بتصميم تحقيقات أفضل في المنطقة الزرقاء من طيف الضوء المرئي ، وقد ركزت غالبية الأبحاث التنموية على الفلوروفور في هذه الفئة على المتغيرات السماوية.

الشكل 4 - الملامح الطيفية لمتغيرات البروتين الفلوريسنت FRET Pail

من بين البروتينات الفلورية السماوية المحسنة التي تم إدخالها ، AmCyan1 ومتغير سماوي محسن يسمى سيرولين إظهار الوعد الأكبر. مستمدة من الشعاب المرجانية ، أنيمونيا ماجانو، تم تحسين متغير البروتين الفلوري AmCyan1 مع الكودونات البشرية لتوليد مستوى سطوع نسبي مرتفع ومقاومة لتبييض الصور عند مقارنتها ببروتين الفلورسنت السماوي المحسن أثناء تعبير الثدييات. على الجانب السلبي ، على غرار معظم بروتينات الشعاب المرجانية الأخرى ، يميل هذا المسبار إلى تكوين مركبات رباعية. تم تطوير مسبار Cerulean الفلوري من خلال الطفرات الموجهة بالموقع لبروتين الفلورسنت السماوي المعزز لإنتاج معامل انقراض أعلى وتحسين العائد الكمي. يعتبر Cerulean أكثر إشراقًا مرتين على الأقل من بروتين الفلورسنت السماوي المحسن وقد ثبت أنه يزيد بشكل كبير من نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند اقترانه ببروتينات الفلورسنت الصفراء ، مثل فينوس (انظر الشكل 4) ، في تحقيقات FRET.

بروتينات فلورية حمراء

أصبح الهدف الرئيسي لتطوير البروتين الفلوري هو بناء مشتق ينبعث منه اللون الأحمر والذي يعادل أو يتجاوز الخصائص المتقدمة لبروتين الفلوريسنت الأخضر المحسن. من بين مزايا البروتين الفلوري الأحمر المناسب التوافق المحتمل مع المجاهر متحد البؤر وعريض المجال (ومجموعات المرشحات الخاصة بهم) ، إلى جانب زيادة القدرة على تصوير حيوانات بأكملها ، والتي تكون أكثر شفافية للضوء الأحمر. لأن بناء المسوخ الأحمر من ايكوريا فيكتوريا أثبت البروتين الفلوري الأخضر لقنديل البحر خارج المنطقة الطيفية الصفراء أنه غير ناجح إلى حد كبير ، وقد حول الباحثون بحثهم إلى الشعاب المرجانية الاستوائية.

تم اشتقاق أول بروتين فلوري مشتق من المرجان يتم استخدامه على نطاق واسع من المرقص المخطط ويشار إليه عادة باسم DSRed. بمجرد النضج الكامل ، يتميز طيف الانبعاث الفلوري لـ DsRed بقمة تبلغ 583 نانومترًا بينما يبلغ طيف الإثارة ذروة كبيرة عند 558 نانومتر وذروة ثانوية تبلغ حوالي 500 نانومتر. ومع ذلك ، ترتبط العديد من المشكلات باستخدام DsRed. نضوج مضان DsRed يحدث ببطء ويستمر خلال فترة زمنية عندما يكون انبعاث التألق في المنطقة الخضراء. يطلق عليه دولة خضراء، أثبتت هذه القطعة الأثرية أنها تمثل مشكلة بالنسبة لتجارب وضع العلامات المتعددة مع البروتينات الفلورية الخضراء الأخرى بسبب التداخل الطيفي. علاوة على ذلك ، DsRed هو رباعي ملزم ويمكن أن يشكل مجاميع بروتينية كبيرة في الخلايا الحية. على الرغم من أن هذه الميزات غير مهمة لاستخدام DsRed كمراسل للتعبير الجيني ، فإن فائدة DsRed كعلامة حلقية محدودة للغاية. على عكس البروتينات الفلورية لقنديل البحر ، والتي تم استخدامها بنجاح لتمييز مئات البروتينات ، أثبتت اقترانات DsRed أنها أقل نجاحًا وغالبًا ما تكون سامة.

تم التغلب على عدد قليل من مشاكل البروتينات الفلورية DsRed من خلال الطفرات. الجيل الثاني من DsRed ، المعروف باسم DSRed2، يحتوي على العديد من الطفرات في نهاية الببتيد الأمينية التي تمنع تكوين مجاميع البروتين وتقلل من السمية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل وقت نضج الفلوروفور مع هذه التعديلات. لا يزال بروتين DsRed2 يشكل رباعي الأبعاد ، ولكنه أكثر توافقًا مع البروتينات الفلورية الخضراء في تجارب وضع العلامات المتعددة بسبب النضج الأسرع. تم تحقيق المزيد من التخفيضات في وقت النضج مع الجيل الثالث من طفرات DsRed ، والتي تعرض أيضًا مستوى سطوعًا متزايدًا من حيث ذروة التألق الخلوي. انبعاث مضان أحمر من DsRed- اكسبريس يمكن ملاحظتها في غضون ساعة بعد التعبير ، مقارنة بحوالي ست ساعات لـ DsRed2 و 11 ساعة لـ DsRed. متغير خميرة محسّن ، يُطلق عليه نجمة حمراء، تم تطويره بحيث يحتوي أيضًا على معدل نضج محسّن وزيادة سطوع. إن وجود الحالة الخضراء في DsRed-Express و RedStar ليس واضحًا ، مما يجعل هذه البروتينات الفلورية هي الخيار الأفضل في المنطقة الطيفية البرتقالية الحمراء لتجارب وضع العلامات المتعددة. نظرًا لأن هذه المجسات تظل ملزمة رباعي الأبعاد ، فهي ليست الخيار الأفضل لوصف البروتينات.

الشكل 5 - الملامح الطيفية للبروتينات الفلورية البرتقالية والحمراء

تم عزل العديد من البروتينات الفلورية الحمراء الإضافية التي تظهر قدرًا كبيرًا من الوعود من الكائنات المرجانية في الشعاب المرجانية. واحدة من أولى التطبيقات التي يتم تكييفها لتطبيقات الثدييات هي هكريد 1التي كانت معزولة عن مغاير كريسبا وهو متوفر الآن تجاريًا. تم اشتقاق HcRed1 في الأصل من بروتين كروموبروتين غير فلوري يمتص الضوء الأحمر من خلال الطفرات لإنتاج ثنائيات إجبارية ضعيفة الفلورسنت لها أقصى امتصاص عند 588 نانومتر وبحد أقصى للانبعاث يبلغ 618 نانومتر. على الرغم من أن طيف الانبعاث الفلوري لهذا البروتين مناسب للفصل عن DsRed ، إلا أنه يميل إلى التجميع المشترك مع DsRed ويكون أقل سطوعًا. تم إنتاج بنية HcRed مثيرة للاهتمام تحتوي على جزيئين مترادفين للتغلب على التباين الذي يحدث ، من حيث المبدأ ، بشكل تفضيلي داخل الاقتران الترادفي لإنتاج علامة أحادية. ومع ذلك ، نظرًا لأن السطوع الكلي لهذا البروتين المزدوج لم يتحسن بعد ، فهو ليس خيارًا جيدًا للتطبيقات الروتينية في الفحص المجهري للخلية الحية.

تطوير متغيرات البروتين الفلورية الأحادية

في حالتها الطبيعية ، توجد معظم البروتينات الفلورية على شكل ثنائيات ، أو رباعيات ، أو أوليغومرات عالية المستوى. بطريقة مماثلة، ايكوريا فيكتوريا يُعتقد أن البروتين الفلوري الأخضر يشارك في مركب رباعي مع aequorin ، ولكن لوحظت هذه الظاهرة فقط عند تركيزات عالية جدًا من البروتين ، كما أن ميل البروتينات الفلورية لقنديل البحر إلى التضاؤل ​​يكون ضعيفًا جدًا بشكل عام (وجود ثابت تفكك أكبر من 100 ميكرومولار). وبالتالي لم يتم ملاحظة تناقص البروتينات الفلورية بشكل عام عندما يتم التعبير عنها في أنظمة الثدييات. ومع ذلك ، عندما يتم استهداف البروتينات الفلورية لمقصورات خلوية معينة ، مثل غشاء البلازما ، يمكن أن يصبح تركيز البروتين الموضعي من الناحية النظرية مرتفعًا بدرجة كافية للسماح بالثنائيات. هذا مصدر قلق خاص عند إجراء تجارب FRET ، والتي يمكن أن تسفر عن مجموعات بيانات معقدة يمكن اختراقها بسهولة عن طريق القطع الأثرية ثنائية الأبعاد.

أثبت إنشاء متغيرات DsRed الأحادية أنها مهمة صعبة. كانت هناك حاجة إلى أكثر من 30 تعديلاً على الأحماض الأمينية في الهيكل لإنشاء الجيل الأول من بروتين DsRed أحادي (يسمى طلب تقديم العروض 1). ومع ذلك ، فإن هذا المشتق يقلل بشكل كبير من انبعاث التألق مقارنة بالبروتين الأصلي وتبيض الصور بسرعة كبيرة ، مما يجعله أقل فائدة بكثير من البروتينات الفلورية الخضراء والصفراء الأحادية. تستمر جهود أبحاث الطفرات ، بما في ذلك التقنيات الجديدة مثل فرط الحركة الجسدية ، في البحث عن متغيرات البروتين الفلوري الأصفر والبرتقالي والأحمر والعميق الأحمر التي تقلل بشكل أكبر من ميل هذه المجسات البيولوجية التي يحتمل أن تكون فعالة إلى الارتباط الذاتي مع دفع الحد الأقصى للانبعاثات في نفس الوقت. نحو أطوال موجية أطول.

يجري تطوير بروتينات فلورية أحادية مُحسَّنة أدت إلى زيادة معاملات الانقراض ، والعوائد الكمومية ، والثبات الضوئي ، على الرغم من عدم وجود متغير واحد قد تم تحسينه بكل المعايير. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التغلب على مشاكل التعبير مع البروتينات الفلورية الحمراء الرباعية الملزمة من خلال الجهود المبذولة لتوليد متغيرات أحادية ، والتي أسفرت عن مشتقات أكثر توافقًا مع الوظيفة البيولوجية.

ربما كان التطور الأكثر إثارة على هذه الجبهة هو إدخال حصاد جديد من البروتينات الفلورية المشتقة من بروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي من خلال الطفرات الموجهة التي تستهدف س 66 و Y67 بقايا. سميت بالفواكه التي تعكس ألوانًا مشابهة لملف طيف انبعاث التألق (انظر الجدول 1 و الشكل 5) ، يعرض هذا الكادر من البروتينات الفلورية الأحادية الحد الأقصى بأطوال موجية تتراوح من 560 إلى 610 نانومتر. أدى التوسع الإضافي لهذه الفئة من خلال فرط الحركة الجسدي التكراري إلى إنتاج بروتينات فلورية بأطوال موجية انبعاثية تصل إلى 650 نانومتر. تملأ هذه البروتينات الجديدة بشكل أساسي الفجوة بين البروتينات الفلورية لقنديل البحر ذات الانزياح الأحمر الأكثر (مثل فينوس) ، والبروتينات الفلورية الحمراء للشعاب المرجانية. على الرغم من أن العديد من هذه البروتينات الفلورية الجديدة تفتقر إلى السطوع والاستقرار اللازمين للعديد من تجارب التصوير ، إلا أن وجودها مشجع لأنه يشير إلى احتمالية وجود بروتينات فلورية أحادية اللون ساطعة ومستقرة عبر الطيف المرئي بأكمله.

محددات بصرية

كان أحد أكثر التطورات إثارة للاهتمام في أبحاث البروتين الفلوري هو تطبيق هذه المجسات على شكل جزيئي أو محددات بصرية (ارى الجدول 2) ، والتي تغير اللون أو شدة الانبعاث نتيجة لتحفيز الفوتون الخارجي أو مرور الوقت. على سبيل المثال ، تؤدي طفرة نقطة واحدة إلى ببتيد قنديل البحر الأصلي إلى إنشاء نسخة قابلة للنشاط الضوئي من البروتين الفلوري الأخضر (المعروف باسم PA-GFP) التي تتيح التحويل الضوئي لقمة الإثارة من الأشعة فوق البنفسجية إلى اللون الأزرق عن طريق الإضاءة بالضوء في نطاق 400 نانومتر. يحتوي PA-GFP غير المحول على ذروة إثارة مماثلة في المظهر الجانبي لتلك الخاصة بالبروتين من النوع البري (حوالي 395 إلى 400 نانومتر). بعد التحويل الضوئي ، تزيد ذروة الإثارة عند 488 نانومترًا بمقدار 100 ضعف تقريبًا. يثير هذا الحدث اختلافات تباين عالية جدًا بين المجمعات غير المحولة والمحولة لـ PA-GFP وهو مفيد لتتبع ديناميكيات المجموعات السكانية الفرعية الجزيئية داخل الخلية. يتضح في الشكل 6 (أ) هي خلية ثديية حية منقولة تحتوي على PA-GFP في السيتوبلازم التي يتم تصويرها بإثارة ليزر أرجون أيون 488 نانومتر من قبل (الشكل 6 (أ)) و بعد (الشكل 6 (د)) التحويل الضوئي باستخدام ليزر ديود أزرق بحجم 405 نانومتر.

الجدول 2 - خصائص محددات التظليل الضوئية المختارة

بروتين
(اختصار)
الإثارة
أقصى
(نانومتر)
انبعاث
أقصى
(نانومتر)
مولار
انقراض
معامل في الرياضيات او درجة
الكم
أثمر
في الجسم الحي
بنية
نسبيا
سطوع
(٪ من EGFP)
PA-GFP (G)50451717,4000.79أحادي المعدن41
PS-CFP (C)40246834,0000.16أحادي المعدن16
PS-CFP (G)49051127,0000.19أحادي المعدن15
PA-mRFP1 (R)57860510,0000.08أحادي المعدن3
كورال هيو كايدي (G)50851898,8000.88تيترامير259
كورال هو كايدي (على اليمين)57258060,4000.33تيترامير59
wtKikGR (G)50751753,7000.70تيترامير112
wtKikGR (R)58359335,1000.65تيترامير68
mKikGR (G)50551549,0000.69أحادي المعدن101
mKikGR (R)58059128,0000.63أحادي المعدن53
dEosFP- ترادفي (G)50651684,0000.66أحادي المعدن165
dEosFP- ترادفي (R)56958133,0000.60أحادي المعدن59
mEos2FP (G)50651956,0000.84أحادي المعدن140
mEos2FP (R)57358446,0000.66أحادي المعدن90
Dendra2 (G)49050745,0000.50أحادي المعدن67
Dendra2 (R)55357335,0000.55أحادي المعدن57
كورال هوو درونبا (G)50351895,0000.85أحادي المعدن240
Kindling (KFP1)58060059,0000.07تيترامير12

يمكن أيضًا استخدام البروتينات الفلورية الأخرى كمظلات ضوئية. إن الإثارة ثلاثية الفوتونات (عند أقل من 760 نانومتر) من البروتين الفلوري DsRed قادرة على تحويل التألق الأحمر الطبيعي إلى اللون الأخضر. من المحتمل أن يكون هذا التأثير بسبب التبييض الضوئي الانتقائي للكروموفور الأحمر في DsRed ، مما أدى إلى تألق يمكن ملاحظته من الحالة الخضراء. ال الموقت يتحول متغير DsRed تدريجياً من اللون الأخضر اللامع (انبعاث 500 نانومتر) إلى اللون الأحمر الفاتح (انبعاث 580 نانومتر) على مدار عدة ساعات. يمكن بعد ذلك استخدام النسبة النسبية من التألق الأخضر إلى الأحمر لجمع البيانات الزمنية لتحقيقات التعبير الجيني.

أداة تمييز بصرية قابلة للتحويل ، تسمى PS-CFP، المشتق عن طريق الطفرات لمتغير البروتين الفلوري الأخضر ، وقد لوحظ أنه ينتقل من السماوي إلى التألق الأخضر عند الإضاءة عند 405 نانومتر (لاحظ التحويل الضوئي للخلية المركزية في الشكلان 6 (ب) و 6 (هـ)). معبراً عنه كمونومر ، من المحتمل أن يكون هذا المسبار مفيدًا في تحقيقات التبييض الضوئي والتحويل الضوئي والتنشيط الضوئي. ومع ذلك ، فإن الإسفار من PS-CFP أضعف بمقدار 2.5 ضعفًا تقريبًا من PA-GFP وهو أدنى من أدوات التمييز الأخرى من حيث كفاءة التحويل الضوئي (التحول 40 نانومتر في انبعاث التألق عند التحويل الضوئي أقل مما لوحظ مع تحقيقات مماثلة). الطفرات الإضافية لهذا البروتينات الفلورية أو ذات الصلة لديها القدرة على إنتاج المزيد من المتغيرات المفيدة في منطقة الطول الموجي هذه.

الشكل 6 - البروتينات الفلورية للضوء الضوئي

تم تطوير أدوات التظليل الضوئية أيضًا في بروتينات الفلورسنت المستنسخة من أنواع المرجان وشقائق النعمان. كايدي، وهو بروتين فلوري معزول من المرجان الصخري ، يتحول من الأخضر إلى الأحمر في وجود الضوء فوق البنفسجي. على عكس PA-GFP ، يحدث تحويل الفلورة في Kaede عن طريق امتصاص الضوء الذي يختلف طيفيًا عن الإضاءة. لسوء الحظ ، هذا البروتين هو رباعي ملزمة ، مما يجعله أقل ملاءمة لاستخدام الفراء كعلامة حلقية من PA-GFP. مرجان آخر رباعي الحجر (لوبوفيليا hemprichii) متغير البروتين الفلوري ، يسمى EosFP (ارى الجدول 2) ، ينبعث منها فلور أخضر ساطع يتحول إلى أحمر برتقالي عند إضاءته بالأشعة فوق البنفسجية عند 390 نانومتر تقريبًا. في هذه الحالة ، يتم إنتاج التحول الطيفي عن طريق تعديل ناتج عن الصورة يتضمن انقطاعًا في العمود الفقري للببتيد المجاور للكروموفور. أدت الطفرات الإضافية لبروتين EosFP "النوع البري" إلى مشتقات أحادية ، والتي قد تكون مفيدة في بناء بروتينات الاندماج.

ثالث غير-ايكوريا هايلايتر بصري تألق بروتين الفلوريسنت (KFP1) من بروتين كروموبروتين غير فلوري معزول في Anemonia sulcata، وهو متوفر الآن تجاريًا (Evrogen). لا يُظهر بروتين التألق الفلوري انبعاثًا حتى يضيء بالضوء الأخضر. ينتج عن الضوء منخفض الشدة وميض أحمر عابر يتحلل خلال بضع دقائق (انظر الميتوكوندريا في الشكل 6 (ج)). تعمل الإضاءة بالضوء الأزرق على إخماد الفلورة المشتعلة على الفور ، مما يسمح بالتحكم الصارم في وضع العلامات الفلورية. في المقابل ، ينتج عن الإضاءة عالية الكثافة إشعال لا رجعة فيه ويسمح بإبراز ثابت مشابه لـ PA-GFP (الشكل 6 (و)). تعد القدرة على التحكم الدقيق في التألق مفيدة بشكل خاص عند تتبع حركة الجسيمات في بيئة مزدحمة. على سبيل المثال ، تم استخدام هذا النهج بنجاح لتتبع مصير خلايا الصفائح العصبية في التطور Xenopus الأجنة وحركة الميتوكوندريا الفردية في خلايا PC12.

مع استمرار تطوير أدوات التظليل الضوئية ، يجب أن تتطور البروتينات الفلورية المفيدة لوضع العلامات الضوئية نحو المتغيرات الأحادية السطوع التي يمكن تحويلها ضوئيًا بسهولة وعرض مجموعة واسعة من ألوان الانبعاث. إلى جانب هذه التطورات ، ستصبح المجاهر المجهزة للتنسيق السلس بين أوضاع الإضاءة لمراقبة التألق ووضع العلامات الإقليمية شائعة في مختبرات بيولوجيا الخلية. في نهاية المطاف ، هذه الابتكارات لديها القدرة على تحقيق إنجازات كبيرة في الديناميات المكانية والزمانية لأنظمة تحويل الإشارة.

نواقل البروتين الفلوريسنت ونقل الجينات

تعد البروتينات الفلورية متعددة الاستخدامات وقد تم استخدامها بنجاح في كل تخصص بيولوجي تقريبًا من علم الأحياء الدقيقة إلى فسيولوجيا الأنظمة. كانت هذه المسابير في كل مكان مفيدة للغاية كمراسلين لدراسات التعبير الجيني في الخلايا والأنسجة المستزرعة ، وكذلك الحيوانات الحية. في الخلايا الحية ، يتم استخدام البروتينات الفلورية بشكل شائع لتتبع توطين وديناميكيات البروتينات والعضيات والمقصورات الخلوية الأخرى. تم تطوير مجموعة متنوعة من التقنيات لبناء منتجات انصهار البروتين الفلوري وتعزيز تعبيرها في الثدييات والأنظمة الأخرى. المركبات الأولية لإدخال تسلسل الجينات الوراثية البروتينية الفلورية في الخلايا هي البلازميدات الجرثومية والناقلات الفيروسية المعدلة وراثيًا.

يمكن إدخال منتجات الانصهار الجيني للبروتين الفلوري في خلايا الثدييات وغيرها باستخدام الناقل المناسب (عادةً البلازميد أو الفيروس) إما بشكل عابر أو مستقر. في تجارب نقل الجينات العابرة أو المؤقتة (يشار إليها غالبًا باسم تعداء عابر) أو البلازميد أو الحمض النووي الفيروسي الذي يتم إدخاله في الكائن الحي المضيف لا يندمج بالضرورة في الكروموسومات ، ولكن يمكن التعبير عنه في السيتوبلازم لفترة قصيرة من الزمن. التعبير عن منتجات الاندماج الجيني ، التي تتم مراقبتها بسهولة من خلال مراقبة انبعاث الفلورة باستخدام مجموعة مرشح متوافقة مع البروتين الفلوري ، يحدث عادةً على مدى عدة ساعات بعد تعداء العدوى ويستمر لمدة 72 إلى 96 ساعة بعد إدخال DNA البلازميد في خلايا الثدييات . في كثير من الحالات ، يمكن دمج DNA البلازميد في الجينوم في حالة دائمة لتشكيل خطوط خلوية متغيرة بشكل ثابت. يعتمد اختيار تعداء عابرة أو مستقرة على الأهداف المستهدفة للتحقيق.

الشكل 7 - ناقل توطين الشبكة الإندوبلازمية EYFP

يحتوي التكوين الأساسي لمتجه البلازميد المفيد في تجارب نقل جينات البروتين الفلوري على العديد من المكونات المطلوبة. يجب أن يحتوي البلازميد على تسلسلات نيوكليوتيدات بدائية النواة مشفرة لأصل تكاثر جرثومي للحمض النووي وجين مقاوم للمضادات الحيوية. غالبًا ما يطلق على هذه العناصر خدمة النقل متواليات ، تسمح بانتشار واختيار البلازميد داخل مضيف بكتيري لتوليد كميات كافية من الناقل لانتقال الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يحتوي البلازميد على واحد أو أكثر من العناصر الجينية حقيقية النواة التي تتحكم في بدء نسخ الحمض النووي الريبي المرسال ، وإشارة تعدد الأدينيل للثدييات ، وإنترون (اختياري) ، وجين للاختيار المشترك في خلايا الثدييات. تعد عناصر النسخ ضرورية لمضيف الثدييات للتعبير عن منتج اندماج الجينات الذي يهم ، وعادة ما يكون جين الانتقاء مضادًا حيويًا يمنح مقاومة للخلايا التي تحتوي على البلازميد. تختلف هذه الميزات العامة وفقًا لتصميم البلازميد ، والعديد من النواقل لها طيف واسع من المكونات الإضافية المناسبة لتطبيقات معينة.

يتضح في الشكل 7 هو إنزيم التقييد والخريطة الجينية لمشتق بلازميد بكتيري متوفر تجاريًا (BD Biosciences Clontech) يحتوي على تسلسل الترميز لبروتين الفلورسنت الأصفر المحسن المنصهر في الشبكة الإندوبلازمية لتسلسل استهداف الكالريتيكولين (بروتين مقيم). ينتج عن التعبير عن هذا المنتج الجيني في خلايا الثدييات الحساسة ببتيد خيمري يحتوي على EYFP المترجمة إلى شبكة الغشاء الشبكي الإندوبلازمي ، المصمم خصيصًا لوضع العلامات الفلورية لهذه العضية. متجه المضيف هو مشتق من pUC رقم نسخة عالية (حوالي 500) بلازميد يحتوي على أصل التكاثر البكتيري ، مما يجعله مناسبًا للتكاثر المتخصص بكتريا قولونية سلالات. يتم التعبير عن جين المضاد الحيوي كانامايسين بسهولة في البكتيريا ويمنح مقاومة ليكون بمثابة علامة انتقائية.

الميزات الإضافية لمتجه EYFP المعروضة أعلاه هي الفيروس المضخم للخلايا البشري (CMV) محفز لدفع التعبير الجيني في خطوط الخلايا البشرية والثدييات الأخرى المنقولة ، و و 1 أصل تكاثر الجراثيم لإنتاج الحمض النووي أحادي الجديلة. يحتوي العمود الفقري المتجه أيضًا على فيروس قرد 40 (SV40) أصل النسخ المتماثل ، والذي ينشط في خلايا الثدييات التي تعبر عن مستضد SV40 T. اختيار المطهرات المستقرة مع المضاد الحيوي G418 يتم تمكينه مع شريط مقاومة النيومايسين يتكون من مروج مبكر SV40 ، وجين مقاومة النيومايسين (aminoglycoside 3’-phosphotransferase) ، وإشارات تعدد الأدينيل من فيروس الهربس البسيط thymidine kinase (HSV-TK) لاستقرار الرسول. ستة مواقع فريدة لإنزيم التقييد (انظر الشكل 7) على العمود الفقري للبلازميد ، مما يزيد من تعدد استخدامات هذا البلازميد.

التكاثر ، والعزل ، وترنسفكأيشن من البروتين الفلوريسنت البلازميدات

تعتمد تجارب تعداء الثدييات الناجحة على استخدام نواقل دنا عالية الجودة أو بلازميد فيروسية خالية نسبيًا من السموم الداخلية البكتيرية. في الحالة الأصلية ، تظهر جزيئات DNA البلازميد الدائرية الدرجة الثالثة ملفوف التشكل الذي يلف الحلزون المزدوج حول نفسه عدة مرات. لسنوات عديدة ، كانت الطريقة المفضلة لتنقية الحمض النووي للفيروس والبلازميد الفائق الالتفاف هي الطرد المركزي المتدرج لكثافة كلوريد السيزيوم في وجود عامل إقحام (مثل بروميد الإيثيديوم أو يوديد البروبيديوم). تعمل هذه التقنية ، المكلفة من حيث المعدات والمواد ، على فصل الحمض النووي (DNA) فائق الالتفاف من الكروموسومات الخطية والحمض النووي الدائري المكسور وفقًا لكثافة الطفو ، مما يتيح جمع DNA البلازميد عالي النقاء. في الآونة الأخيرة ، طرق كروماتوغرافيا عمود التبادل الأيوني المبسطة (يطلق عليها عادة أ مصغرة الإعداد) إلى حد كبير محل بروتوكول الطرد المركزي المرهق والمستهلك للوقت لإنتاج كميات كبيرة من DNA البلازميد الخالي من السموم الداخلية في فترة زمنية قصيرة نسبيًا.

تسمى الطفرات البكتيرية المتخصصة مختص الخلايا ، من أجل تضخيم ملائم ورخيص نسبيًا لناقلات البلازميد. تحتوي البكتيريا على مجموعة من الطفرات التي تجعلها عرضة بشكل خاص لتكاثر البلازميد ، وقد تم نفاذها كيميائيًا لنقل الحمض النووي عبر الغشاء وجدار الخلية في إجراء يُعرف باسم تحويل. بعد التحول ، يتم إنماء البكتيريا إلى الطور اللوغاريتمي في وجود اختيار المضاد الحيوي الذي يمليه البلازميد. تتركز الثقافة البكتيرية عن طريق الطرد المركزي ويتم تعطيلها عن طريق التحلل بمحلول منظف قلوي يحتوي على إنزيمات لتحطيم الحمض النووي الريبي الملوث. ثم يتم ترشيح المحلول ووضعه على عمود التبادل الأيوني. يتم غسل المواد غير المرغوب فيها ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات ، تمامًا من العمود قبل التصفية من الحمض النووي البلازميدي باستخدام محلول ملح عالي. يركز ترسيب الكحول (الأيزوبروبانول) على الحمض النووي البلازميدي ، الذي يتم جمعه بالطرد المركزي ، وغسله ، وإعادة إذابته في المخزن المؤقت. DNA البلازميد المنقى جاهز للعمل في تجارب تعداء.

الشكل 8 - تعداء الخلايا الدهنية في خلايا الثدييات

يجب أن تكون خلايا الثدييات المستخدمة في ترنسفكأيشن في حالة فسيولوجية ممتازة وأن تنمو في الطور اللوغاريتمي أثناء الإجراء. تم تطوير مجموعة واسعة من كواشف تعداء الخلايا تجاريًا لتحسين امتصاص البلازميد DNA بواسطة الخلايا المستنبتة. تتراوح هذه التقنيات من ترسيب فوسفات الكالسيوم البسيط إلى عزل DNA البلازميد في الحويصلات الدهنية التي تلتحم بغشاء الخلية وتوصيل المحتويات إلى السيتوبلازم (كما هو موضح في الشكل 8). جماعيا التهاب الشحوم، لاقت التكنولوجيا القائمة على الدهون قبولًا واسعًا نظرًا لفعاليتها في عدد كبير من خطوط الخلايا الشائعة ، وهي الآن الطريقة المفضلة لمعظم تجارب تعداء العدوى.

على الرغم من أن العدوى العابرة العابرة عادة ما تؤدي إلى فقدان منتج الجين البلازميد خلال فترة زمنية قصيرة نسبيًا (عدة أيام) ، تستمر خطوط الخلايا المنقولة بشكل ثابت في إنتاج البروتينات الضيفة على أساس مستمر طويل الأجل (يتراوح من أشهر إلى سنوات). يمكن اختيار خطوط الخلايا المستقرة باستخدام علامات المضادات الحيوية الموجودة في العمود الفقري البلازميد (انظر الشكل 7). أحد أكثر المضادات الحيوية شيوعًا لاختيار مضادات العدوى المستقرة في خطوط خلايا الثدييات هو عقار G418 المانع لتخليق البروتين ، لكن الجرعة المطلوبة تختلف اختلافًا كبيرًا وفقًا لكل خط خلوي. المضادات الحيوية الشائعة الأخرى ، بما في ذلك هيدرومايسين ب و بوروميسين، تم تطويره أيضًا من أجل الانتقاء المستقر للخلايا ، وكذلك العلامات الجينية. الطريقة الأكثر فعالية للحصول على خطوط خلوية مستقرة هي استخدام تقنية عالية الكفاءة للترنسفكأيشن الأولي. في هذا الصدد، التفريد الكهربي أثبتت قدرتها على توليد مواد انتقالية مستقرة مع بلازميدات خطية وجينات نقية. يطبق Electroporation نبضات قصيرة وعالية الجهد على تعليق خلوي للحث على تكوين المسام في غشاء البلازما ، مما يسمح لاحقًا للحمض النووي للعدوى بدخول الخلية. تعد المعدات المتخصصة ضرورية للتثقيب الكهربائي ، ومع ذلك ، فإن هذه التقنية قابلة للمقارنة من حيث التكلفة مع كواشف إزالة الدهون عند إجراء عدد كبير من عمليات التحويل.

مستقبل البروتينات الفلورية

يتركز تركيز تطوير البروتين الفلوري الحالي على هدفين أساسيين. الأول هو إتقان وضبط اللوحة الحالية من البروتينات الفلورية الصفراء إلى الزرقاء المشتقة منها ايكوريا فيكتوريا قنديل البحر ، بينما الهدف الثاني هو تطوير بروتينات فلورية أحادية تنبعث من اللون البرتقالي إلى مناطق حمراء بعيدة من طيف الضوء المرئي. كان التقدم نحو هذه الأهداف مثيرًا للإعجاب ، وليس من المستبعد أن تلوح في الأفق البروتينات الفلورية القريبة من الأشعة تحت الحمراء.

نجح أحدث جيل من أنواع قنديل البحر في حل معظم أوجه القصور في الجيل الأول من البروتينات الفلورية ، خاصةً بالنسبة للمشتقات الصفراء والخضراء. نتج عن البحث عن بروتين فلورسنت أحمر أحادي اللون ومشرق وسريع النضج عدة فئات جديدة ومثيرة للاهتمام من البروتينات الفلورية ، لا سيما تلك المشتقة من الأنواع المرجانية. سيؤدي تطوير البروتينات الفلورية الموجودة ، جنبًا إلى جنب مع التقنيات الجديدة ، مثل إدخال الأحماض الأمينية غير الطبيعية ، إلى زيادة توسيع لوحة الألوان. نظرًا لتطور تقنيات الفصل الطيفي البصري بشكل أفضل وانتشارها ، فإن هذه الأنواع الجديدة ستكمل اللوحة الحالية ، خاصة في المناطق الصفراء والحمراء من الطيف.

الاتجاه الحالي في تكنولوجيا المسبار الفلوري هو توسيع دور الأصباغ التي تتألق في الأشعة الحمراء البعيدة والأشعة تحت الحمراء القريبة. في خلايا الثدييات ، يتم تقليل كل من التألق الذاتي وامتصاص الضوء بشكل كبير في الطرف الأحمر من الطيف. وبالتالي ، فإن تطوير مجسات الفلورسنت الحمراء البعيدة سيكون مفيدًا للغاية لفحص العينات السميكة والحيوانات بأكملها. بالنظر إلى نجاح البروتينات الفلورية كمراسلين في الأنظمة المعدلة وراثيًا ، فإن استخدام البروتينات الفلورية الحمراء البعيدة في الكائنات الحية الكاملة سيصبح ذا أهمية متزايدة في السنوات القادمة.

أخيرًا ، يتم الآن تحقيق الإمكانات الهائلة في تطبيقات البروتين الفلوريسنت لهندسة المستشعرات الحيوية. عدد بنيات جهاز الاستشعار الحيوي يتزايد بسرعة. باستخدام المعلومات الهيكلية ، أدى تطوير هذه المجسات إلى تحسين الحساسية وسيستمر في القيام بذلك. يشير نجاح هذه المساعي بالتأكيد إلى أن أي معلمة بيولوجية تقريبًا ستكون قابلة للقياس باستخدام جهاز الاستشعار الحيوي المناسب القائم على البروتين الفلوري.

المؤلفون المساهمون

ديفيد دبليو بيستون - قسم الفسيولوجيا الجزيئية والفيزياء الحيوية ، جامعة فاندربيلت ، ناشفيل ، تينيسي ، 37232.

جورج اتش باترسون و جينيفر ليبينكوت شوارتز - فرع بيولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي ، المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، ماريلاند ، 20892.

ناثان س و مايكل دبليو ديفيدسون - مختبر المجال المغناطيسي الوطني العالي ، 1800 East Paul Dirac Dr. ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي ، فلوريدا ، 32310.

منتجات نيكون ذات الصلة

مكعبات الفلورسنت الفلورية

تقدم نيكون مجموعة كبيرة من مكعبات مرشح التألق بكفاءة عالية في اكتساب الفلورة لدعم تصوير مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات الفلورية والبروتينات الفلورية.

مصادر الاضاءة

توفر نيكون مصادر ضوء لمجموعة واسعة من احتياجات التصوير ، بدءًا من الأنظمة المحورية للتنظير المجسم إلى أجهزة الإضاءة القائمة على LED لتطبيقات epi-fluorescence ووحدات الليزر القوية لتطبيقات التصوير المتقدمة. تتضمن العديد من حلول الإضاءة لدينا تطبيقات فريدة ويمكن تشغيلها للتحكم عالي السرعة.


بدائية النواة مقابل التعبير الجيني حقيقي النواة

لفهم كيفية تنظيم التعبير الجيني ، يجب علينا أولاً أن نفهم كيف يرمز الجين لبروتين وظيفي في الخلية. تحدث العملية في كل من الخلايا بدائية النواة وخلايا حقيقية النواة ، ولكن بطريقة مختلفة قليلاً.

الكائنات بدائية النواة هي كائنات وحيدة الخلية تفتقر إلى نواة محددة ، لذلك يطفو دناها بحرية داخل سيتوبلازم الخلية. لتجميع البروتين ، تحدث عمليتا النسخ (DNA to RNA) والترجمة (RNA إلى البروتين) في وقت واحد تقريبًا. عندما لا تكون هناك حاجة للبروتين الناتج ، يتوقف النسخ. وبالتالي ، فإن تنظيم النسخ هو الطريقة الأساسية للتحكم في نوع البروتين ومقدار كل بروتين يتم التعبير عنه في خلية بدائية النواة. تحدث جميع الخطوات اللاحقة تلقائيًا. عندما يتطلب الأمر المزيد من البروتين ، يحدث المزيد من النسخ. لذلك ، في الخلايا بدائية النواة ، يكون التحكم في التعبير الجيني في الغالب على مستوى النسخ.

على النقيض من ذلك ، تحتوي الخلايا حقيقية النواة على عضيات داخل الخلايا تزيد من تعقيدها. في الخلايا حقيقية النواة ، يتم احتواء الحمض النووي داخل الخلية ونواة rsquos حيث يتم نسخه إلى RNA. ثم يتم نقل الحمض النووي الريبي المركب حديثًا من النواة إلى السيتوبلازم حيث تقوم الريبوسومات بترجمة الحمض النووي الريبي إلى بروتين. يتم فصل عمليات النسخ والترجمة ماديًا عن طريق نسخ الغشاء النووي الذي يحدث فقط داخل النواة ، ولا تحدث الترجمة إلا خارج النواة داخل السيتوبلازم. يمكن أن يحدث تنظيم التعبير الجيني في جميع مراحل العملية.قد يحدث التنظيم عندما يكون الحمض النووي غير ملفوف ويتم فكه من النيوكليوسومات لربط عوامل النسخ (علم التخلق) ، عندما يتم نسخ الحمض النووي الريبي (مستوى النسخ) ، عندما تتم معالجة الحمض النووي الريبي وتصديره إلى السيتوبلازم بعد نسخه (مستوى ما بعد النسخ) ، عندما يتم ترجمة الحمض النووي الريبي إلى بروتين (مستوى متعدية) ، أو بعد صنع البروتين (مستوى ما بعد الترجمة).

الشكل ( PageIndex <1> ): بدائية النواة مقابل التعبير الجيني حقيقية النواة: يحدث النسخ والترجمة بدائيات النواة في وقت واحد في السيتوبلازم ، ويحدث التنظيم على مستوى النسخ. يتم تنظيم التعبير الجيني حقيقيات النوى أثناء النسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي ، والتي تحدث في النواة وأثناء ترجمة البروتين ، والتي تحدث في السيتوبلازم. قد يحدث المزيد من التنظيم من خلال التعديلات اللاحقة للترجمة للبروتينات.


الوظيفة الرئيسية للحمض النووي هي صنع البروتينات التي تحتاجها الكائنات الحية لتنمو. لذلك دعونا ننظر عن كثب إلى البروتينات.

البروتينات هي جزيئات كبيرة تتكون من جزيئات أصغر تسمى الأحماض الأمينية. البروتينات لها أشكال خاصة تساعدها على الارتباط بإحكام بجزيئات أخرى معينة في الخلية.

لا تبدأ البروتينات بهذا الشكل. يبدأون كسلسلة طويلة.

الحمض النووي هو التعليمات لبناء السلسلة.

هذه هي خطوات بناء البروتين.

الخطوة 1 - نسخ الحمض النووي

يظل الحمض النووي مختبئًا بأمان في النواة ، لذلك نحتاج إلى نسخة عملية من المعلومات. يتم فك ضغط الحمض النووي ونسخه. هذا يسمي النسخ. (يمكنك تذكر ذلك من خلال التفكير في العابرة كما في النقل والسيناريو كما هو مكتوب.)

الخطوة 2 - إخراج النسخة من النواة

يحمل الحمض النووي الريبي نسخة من الحمض النووي من النواة إلى الريبوسومات. يسمى نوع RNA الذي يحمل الرسالة رسول RNA أو mRNA للاختصار.

الخطوه 3 - ترجمة الرسالة

الحمض النووي عبارة عن تسلسل من 4 قواعد مختلفة ، A و T و G و C. يحل Messenger RNA محل U بدلاً من T عند إنشاء النسخة ، ولكن لا يزال لديك 4 خيارات فقط ممكنة في التعليمات البرمجية الخاصة بك.

A و U و G و C.

تتكون البروتينات من 20 جزيءًا رئيسيًا من الأحماض الأمينية.

Ala، Arg، Asn، Asp، Cys، Gln، Glu، Gly، His، Ile، Leu، Lys، Met، Phe، Pro، Ser، Thr، Trp، Tyr، Val

للانتقال من 4 إلى 20 ، تتم قراءة mRNA في مجموعات من ثلاثة. هذا يسمي ترجمة.

الخطوة 4 - أضعاف البروتين

تحقق من هذه الرسوم المتحركة لوضع الخطوات معًا:

من الحمض النووي إلى البروتين (نوفا عبر مجال المعلم)

ترجمة mRNA (Dolan DNA Learning Center)

تفاعل حيوي (مركز هوارد هيوز الطبي)


لقاحات الأنفلونزا الخلوية

لا يتطلب إنتاج لقاح الإنفلونزا القائم على الخلايا بيض الدجاج لأن فيروسات اللقاح المستخدمة في صنع اللقاح تزرع في خلايا حيوانية.

ما هي لقاحات الانفلونزا الخلوية؟

& lsquoCell-based & rsquo يشير إلى كيفية صنع لقاح الإنفلونزا. يتم إنتاج معظم لقاحات الأنفلونزا المعطلة عن طريق زراعة فيروسات الإنفلونزا في البيض. تُزرع فيروسات الإنفلونزا المستخدمة في اللقاحات القائمة على الخلايا في خلايا مستنبتة من الثدييات بدلاً من الدجاج والبيض.

Flucelvax Quadrivalent هو لقاح الإنفلونزا المعطل الوحيد المستند إلى الخلايا والذي تم ترخيصه من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية للاستخدام في الولايات المتحدة.

من يمكنه الحصول على Flucelvax Quadrivalent؟

تم ترخيص Flucelvax Quadrivalent للاستخدام في الأشخاص الذين تبلغ أعمارهم 4 سنوات فما فوق.

لماذا تم تطوير لقاح الأنفلونزا القائم على الخلايا؟

لا يستخدم إنتاج لقاح الإنفلونزا الخلوي فيروسات الإنفلونزا المزروعة في البيض ، وبالتالي لا يعتمد على إمداد البيض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن لقاحات الإنفلونزا المستندة إلى الخلايا والتي تستخدم فيروسات اللقاح المرشحة المستندة إلى الخلايا (CVVs) لديها القدرة على توفير حماية أفضل من لقاحات الإنفلونزا التقليدية القائمة على البيض. قد تكون الفيروسات المستخدمة في صنع اللقاحات القائمة على الخلايا أكثر تشابهًا مع فيروسات الإنفلونزا المنتشرة و ldquowild & rdquo من الفيروسات المستخدمة في صنع اللقاحات القائمة على البيض. في إحدى الدراسات المنشورة في مجلة الأمراض المعدية ، الرمز الخارجي بين المستفيدين من برنامج ميديكير 65 عامًا فما فوق ، قدم اللقاح القائم على الخلايا حماية أكبر ضد الاستشفاء المرتبط بالإنفلونزا من اللقاح المعتمد على البيض بالجرعة القياسية.

بالنسبة لموسم الأنفلونزا 2020-2021 ، فإن جميع فيروسات الإنفلونزا الأربعة المستخدمة في Flucelvax Quadrivalent مشتقة من الخلايا ، مما يجعل اللقاح خاليًا من البيض.

كيف تختلف عملية تصنيع اللقاح القائم على الخلايا عن عملية التصنيع التقليدية القائمة على البيض؟

تستخدم عملية تصنيع اللقاح القائم على الخلايا الخلايا الحيوانية (خلايا Madin-Darby Canine Kidney ، أو خلايا MDCK) كمضيف لفيروسات الإنفلونزا المتزايدة بدلاً من بيض الدجاج المخصب. بالنسبة لموسم 2020-2021 ، فإن الفيروسات المقدمة إلى الشركة المصنعة لتنمو في زراعة الخلايا مشتقة من الخلايا وليست مشتقة من البيض. تعرف على المزيد حول عملية تصنيع لقاح الإنفلونزا المستند إلى الخلايا على صفحة الويب الخاصة بمراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها وكيفية تصنيع لقاحات الإنفلونزا.

ما أهمية موافقة إدارة الغذاء والدواء على فيروسات اللقاح المرشحة القائمة على الخلايا لاستخدامها في لقاحات الإنفلونزا الخلوية Flucelvax الرباعية التكافؤ؟

يمكن أن يؤدي تزايد فيروسات الإنفلونزا في البيض إلى إحداث تغييرات (تسمى تغييرات تتكيف مع البيض) يمكن أن تسبب اختلافات بين الفيروسات الموجودة في اللقاح والفيروسات المنتشرة. قد يكون لهذه التغييرات آثار مهمة على استجابة الجسم المناعي للتطعيم. على سبيل المثال ، يمكن أن تتسبب التغييرات المتكيفة مع البيض في إنتاج الجسم والجهاز المناعي rsquos لأجسام مضادة تكون أقل فعالية في الوقاية من الأمراض التي تسببها فيروسات الإنفلونزا المحددة في الدورة الدموية. يمكن أن تؤدي موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ورسكووس على استخدام لقاحات الأنفلونزا المستندة إلى الخلايا إلى تحسين فعالية لقاحات الإنفلونزا المستندة إلى الخلايا.

ما هي الفوائد المحتملة لاستخدام لقاحات الأنفلونزا المستندة إلى الخلايا؟

أظهرت الدراسات القائمة على الملاحظة حماية أكبر ضد الإنفلونزا أو الأمراض الشبيهة بالإنفلونزا بين الأشخاص الذين تلقوا Flucelvax مقارنة بأولئك الذين تلقوا جرعة قياسية من اللقاحات القائمة على البيض.

من المزايا المحتملة لتكنولوجيا زراعة الخلايا أنها قد تسمح ببدء أسرع في عملية تصنيع اللقاح في حالة حدوث جائحة. يتم الاحتفاظ بالخلايا المستخدمة في تصنيع Flucelvax Quadrivalent مجمدة ومخزنة. & rdquo تضمن الخدمات المصرفية الخلوية توفير إمدادات كافية من الخلايا بسهولة لإنتاج اللقاح. إن زراعة فيروسات الأنفلونزا في مزرعة الخلايا لتصنيع Flucelvax Quadrivalent لا تعتمد على إمداد البيض. لقاحات الإنفلونزا المستندة إلى الخلايا والتي يتم إنتاجها باستخدام CVVs لديها القدرة على أن تكون أكثر فعالية من لقاحات الأنفلونزا التقليدية القائمة على البيض.

ما هي نتائج التجارب السريرية باستخدام التكنولوجيا القائمة على الخلايا؟

أظهرت تجربة سريرية للتركيبة الثلاثية السابقة لـ Flucelvax الفعالية والسلامة بين الأشخاص الذين تتراوح أعمارهم بين 18 و 49 عامًا. في دراسات المناعة بين الأشخاص الذين تتراوح أعمارهم بين 18 عامًا وأكبر ومن 4 إلى 17 عامًا ، وجد أن Flucelvax Quadrivalent ينتج استجابة مناعية مماثلة للتركيبة ثلاثية التكافؤ. كانت أعراض ما بعد التطعيم نموذجية لتلك التي شوهدت مع لقاحات الأنفلونزا الأخرى عن طريق الحقن.

هل تم استخدام التكنولوجيا القائمة على الخلايا من قبل؟

تم استخدام تقنية زراعة الخلايا لإنتاج لقاحات أخرى مرخصة من الولايات المتحدة ، بما في ذلك لقاحات فيروس الروتا وشلل الأطفال والجدري والتهاب الكبد والحصبة الألمانية وجدري الماء.

تمت الموافقة على استخدام لقاحات الإنفلونزا المستندة إلى الخلايا في العديد من البلدان الأوروبية.


كيف يمكنني إدخال البروتينات المؤتلفة في نواة خلايا الثدييات؟ - مادة الاحياء

مراجعة شاملة لـ siRNAs و shRNAs كأدوات لإسكات الجينات.

تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) هو العملية التي يتم من خلالها إسكات التعبير عن الجين المستهدف بشكل فعال أو إسقاطه عن طريق التعطيل الانتقائي لمركب الحمض النووي الريبي المقابل بواسطة الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة (dsRNA). يتم تنشيط RNAi بواسطة أنواع الرنا المزدوج الجديلة التي يتم توصيلها إلى سيتوبلازم الخلايا. يمكن أن تؤدي آليات الإسكات إما إلى تدهور مرنا مستهدف ، على النحو الناجم عن تدخل RNAs صغير (siRNAs) أو RNAs قصير الشعر (shRNAs) ، أو قمع ترجمة mRNAs معينة ، على النحو الناجم عن microRNA (ميرنا). سيكون تركيز هذه المراجعة على الكيفية التي تؤدي بها shRNAs و siRNAs إلى ضربة قاضية للبروتين. من خلال نشاط العديد من البروتينات (التي تمت مناقشتها أدناه) ، يؤدي استهداف mRNA الخلوي بواسطة الأحماض النووية القصيرة المضادة للحس (siRNAs و shRNAs) إلى تدهورها اللاحق. هذا ، بدوره ، يمنع المزيد من التعبير / تراكم البروتينات ، مما يؤدي إلى انخفاض في مستوياتها ، وضربة قاضية في نهاية المطاف.

في وقت مبكر من عام 1984 ، لوحظ أن الحمض النووي الريبي المضاد للحس كان قادرًا على تثبيط التعبير الجيني. في عام 1993 ، اقترح Nellen و Lichtenstein نموذجًا لشرح هذه الملاحظة. ومع ذلك ، لم ينشر Fire et al حتى عام 1998 نتائج عن RNAi في Caenorhabditis elegans لتحديد الرنا المزدوج الجيني باعتباره أكثر فاعلية في تثبيط التعبير الجيني من RNA أحادي الشريطة. تم تحديد في النهاية أن مسار ميرنا يشتمل على العديد من مكونات البروتين نفسها مثل مسار الحمض النووي الريبي.

يتم تلخيص المكونات الرئيسية لآلية RNAi في الجدول 1. وهي تشمل dsRNA الذي يستهدف الجين (الجينات) المستهدفة (إما siRNA أو shRNA) ، Dicer ، عائلة البروتينات Argonaute (على وجه التحديد Ago-2) ، Drosha ، RISC ، TRBP و PACT. يمتلك Drosha و Dicer أيضًا وظائف أخرى غير قانونية [2].

شرط وصف
سيرناالرنا الصغير المتداخل (سيرنا). dsRNA مع 2 nt 3 'end overhangs التي تنشط RNAi ، مما يؤدي إلى تدهور mRNAs بطريقة محددة التسلسل تعتمد على الارتباط التكميلي لمرنا الهدف.
shRNARNA قصير الشعر (shRNA) يحتوي على بنية حلقة تتم معالجتها إلى siRNA ويؤدي أيضًا إلى تدهور mRNAs بطريقة محددة التسلسل تعتمد على الارتباط التكميلي لـ mRNA الهدف.
دروشاإنزيم RNase III الذي يعالج pri-miRNAs و shRNAs في النواة.
مقامرإنزيم Ribonuclease (RNase) III الذي يعالج dsRNAs إلى 20-25 bp siRNAs تاركًا 2 nt متدلية في نهاية 3. تشق ذبابة الفاكهة Dicer-2 dsRNAs الطويلة ، بينما Dicer-1 مهم لمعالجة ميرنا.
RISCيتكون الحد الأدنى من معقد الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) من بروتين Argonaute و siRNA المرتبط به. قد يحتوي أيضًا على PACT و TRBP و Dicer. وتجدر الإشارة إلى أن التركيب الدقيق لـ RISC لم يتم وصفه بعد.
TRBPمطلوب لانقسام الرنا المزدوج الجديلة بواسطة Dicer والمرور اللاحق إلى RISC.
حلفبروتين R (PKR) - بروتين منشط (PACT). شركاء مع Dicer و TRBP لانقسام الرنا المزدوج الجديلة.
عائلة Argonaute من البروتيناتإلى جانب siRNA أحادي الخيط ، تتجمع هذه لتشكيل RISC. ربط 21-35 nt RNAs بما في ذلك miRNAs و siRNAs ، والهدف المرتبط بها من الرنا المرسال ثم تشقهم من خلال وظيفة التحلل الداخلي. ينشق بين النيوكليوتيدات 10 و 11 من الرنا المضاد للحس (أو الدليل).

طريقتان رئيسيتان لـ RNAi اللتان اكتسبتا اهتمامًا كبيرًا لاستخدامها في إسكات الجينات هما RNAs صغير التداخل المزدوج الشريطة (siRNAs) و RNAs قصيرة الشعر المستندة إلى ناقلات (shRNAs). بينما يمكن استخدام كل من siRNAs و shRNAs (الشكل 1) لضربة قاضية للبروتين ، هناك اختلافات في آليات عملها (الشكل 2). يمكن إدخال إما dsRNAs طويلة أو مزدوجة قصيرة من حوالي 21 زوجًا أساسيًا (bps) مباشرة في الخلايا في زراعة الأنسجة (انظر آليات التسليم لمزيد من التفاصيل). في حين أن هناك بعض التقارير عن نقل siRNAs إلى النواة عند تعداء الخلايا ، فمن المقبول عمومًا أنها تتراكم في السيتوبلازم. عند إدخال الخلية ، تشكل الرنا المزدوج الجديلة الطويلة معقدًا مع Dicer [3] ، وهو إنزيم RNase III خاص بـ dsRNA الذي يعالجها في 21-23 نيوكليوتيد (nt) siRNAs مع خصائص متدرجة 2 nt 3 '. يتم بعد ذلك دمج المنتجات المشقوقة في RISC ، الذي يتكون من بروتين Argonaute-2 (Ago-2) و Dicer و TAR-RNA-ملزم (TRBP). يتم فصل RNA المزدوج ، وإزالة حبلا واحد من المجمع. يتم اختيار الخيط الذي يحتوي على أقل استقرار مزدوج عند نهايته 5'من أجل دمج مستقر في RISC.

يتم تصنيع shRNAs في نواة الخلايا المنقولة / المنقولة وتشكل هياكل دبوس الشعر التي تتكون من منطقة جذعية من خيوط متطابقة ومضادة للحواس متصلة بواسطة نيوكليوتيدات غير مقترنة تشكل حلقة (الشكل 1 ب و 1 ج). يتم تحويلها إلى siRNAs بواسطة نفس آلية RNAi التي تعالج miRNAs. يتم إدخال shRNAs في نوى الخلايا المستهدفة باستخدام نواقل بكتيرية أو فيروسية يمكن في بعض الحالات الاندماج بشكل ثابت في الجينوم. يتم نسخ shRNAs إما بواسطة RNA polymerase II أو III ، اعتمادًا على المروج الذي يقود تعبيرها. تتم معالجة هذه السلائف الأولية بواسطة Drosha وشريكها المرتبط بـ dsRNA DGCR8 ، مما ينتج عنه أنواع تعرف باسم pre-shRNAs ، قبل تصديرها إلى السيتوبلازم بواسطة Exportin-5. يتم بعد ذلك شق الـ pre-shRNA بواسطة Dicer و TRBP / PACT ، وإزالة دبوس الشعر وإنشاء siRNA مزدوج الشريطة 20-25 nt مع 2 nt 3 'متدلية في كل نهاية. ثم يتم تحميل هذا siRNA النشط على مجمع RISC.

بمجرد تحميلها على RISC ، تكون عملية التعرف على الرنا المرسال المستهدف وتدهورها بواسطة كل من shRNA و siRNA هي نفسها بشكل أساسي. باعتبارها جزءًا من RISC ، ترتبط siRNA بالمرنا المستهدف بطريقة محددة التسلسل يتم توسطها عن طريق الاقتران الأساسي التكميلي ، مما يؤدي إلى انقسام العمود الفقري للفوسفات RNA المستهدف بالقرب من مركز الازدواج عبر عمل RNase- H مثل نشاط Ago-2. ميزة مثيرة للاهتمام لهذا النظام في بعض الكائنات الحية هي أن تلدين siRNA إلى mRNA الهدف يسمح لـ siRNA بالعمل كأساس ، بينما يعمل mRNA الهدف كقالب لـ RNA المعتمد على RNA-polymerase. يؤدي هذا إلى إنشاء dsRNA جديد ، والذي تتم معالجته بعد ذلك بواسطة Dicer ، مما يؤدي إلى إنشاء حلقة تغذية مرتدة إيجابية تزيد من مجموعة siRNAs. وتجدر الإشارة إلى أن siRNAs تتطلب عادةً تجانسًا مثاليًا للحث على التدهور. هذه العملية موضحة في الشكل 2.

العملية التي يتم من خلالها العثور على mRNA المستهدف بواسطة RISC ليست مفهومة جيدًا. ومع ذلك ، كشف تقرير صادر عن Ameres et al أن إمكانية الوصول إلى التسلسل المستهدف للـ mRNA الخلوي أثرت على انشقاقه. كما أشاروا إلى أن RISC غير قادر على الكشف عن RNAs. لقد اقترحوا نموذجًا يتلامس فيه RISC مع ssRNAs بطريقة غير محددة عن طريق الانتشار العشوائي ، مع إجراء الاقتران الأساسي للنهاية 5 بشكل أكثر كفاءة من الطرف 3. يبدو أن هذا يحدد الارتباط المستقر بين RISC و mRNA الهدف.

تشمل مزايا shRNA عبر siRNA القدرة على استخدام النواقل الفيروسية للتسليم للتغلب على صعوبة نقل أنواع معينة من الخلايا ، وخيار التحكم في تعبير shRNA باستخدام محفزات محفزة ، والقدرة على التعبير عنها بشكل مشترك مع الجين المراسل. بالإضافة إلى ذلك ، قد تسبب تأثيرات أقل خارج الهدف (ستتم مناقشتها بمزيد من التفصيل أدناه).

نشرت العديد من المعامل استراتيجيات لإنشاء جزيئات الحمض النووي الريبي الطويلة لتجارب تعداء العدوى. ومع ذلك ، فإن فعالية كل نهج يعتمد على النظام. أيضا ، الرنا المزدوج الجديلة الطويلة تنشط الاستجابة المناعية الفطرية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا. تشمل العوامل التي تؤثر على نشاط shRNAs بنية الحلقة ، والخصائص الديناميكية الحرارية لدبوس الشعر ، والبنية الثانوية ، والتسلسلات المحيطة. عند الاختيار بين siRNAs أو shRNAs ، عامل مهم يجب مراعاته هو طول التجربة. يتم التعبير عن siRNAs بشكل عابر في الخلايا ، بينما يمكن دمج shRNAs بشكل ثابت من خلال التنبيغ بوساطة الفيروس.

  • تسلسل siRNA بين 19-29 nt هي الأكثر فعالية بشكل عام. يمكن أن تؤدي التسلسلات التي يزيد طولها عن 30 نانومتر إلى إسكات غير محدد.
  • المواقع المثالية التي يجب استهدافها تشمل AA ثنائي النوكليوتيدات و 19 nt 3 'منها في تسلسل mRNA المستهدف. عادةً ما تكون siRNAs ذات 3 'dUdU أو dTdT ثنائي النوكليوتيد أكثر فعالية. تشير البيانات الأكثر حداثة إلى أن العناصر المتراكمة للديوكليوتيدات الأخرى تحافظ على النشاط ، ومع ذلك يمكن تشقق siRNAs بواسطة RNase في بقايا G أحادية الجديلة وبالتالي يجب تجنب تراكمات GG.
  • اختر ما لا يقل عن 2-4 متواليات مستهدفة في مواقع مختلفة لأن mRNAs تميل إلى أن تكون عالية التنظيم ومقيدة بالبروتينات المنظمة. تجنب تصميم siRNAs ذات 4-6 بولي (T) ، لأنها تعمل كإشارة إنهاء لـ RNA pol III.
  • تحقق للتأكد من أن تسلسلات siRNA الخاصة بك لا تحتوي على تماثل مع تسلسلات الترميز الأخرى.
  • يجب أن تحتوي التسلسلات على محتوى G / C بين 35-55٪.
مجموعة شركة إسم البرنامج وصف مرجع عينة
الحرارية العلميةسيديزاينأداة تصميم siRNA سهلة الاستخدام. يسمح لك باختيار المنطقة التي تستهدفها siRNA (5 'أو 3' UTR أو ORF) ، ونسبة G / C ، وإذا كنت تريد بلاست البحث في التسلسل.
نايتو وآخرونsiDirectيحدد أهداف siRNA بناءً على تسلسل النيوكليوتيدات. يوفر الموقع ضمن التسلسل ، ودرجة حرارة الانصهار لمزدوج البذرة ، والحد الأدنى من حالات عدم التطابق مع التسلسلات غير المستهدفة.
إنفيتروجينمصمم BLOCK-IT RNAiيحدد أهداف siRNA و shRNA و miRNA داخل تسلسل النيوكليوتيدات. يحول أيضًا تسلسل siRNA إلى تسلسلات shRNA.
InvivoGenمعالج سيرنايبحث في تسلسل ترميز عن siRNAs ، ويصمم التسلسلات المختلطة وإدخالات دبوس الشعر بناءً على تسلسل siRNA الخاص بك.
ارتباط الجيناتأداة تصميم shRNAأداة تصميم shRNA التي تسمح لك بالاختيار بين ثلاثة تسلسلات حلقات أو إدخال تسلسل مخصص ، بالإضافة إلى تحديد مواقع التقييد للنهايات 5 و 3 ، وتعيين محتوى GC ، والطول.
عابر الذراتأداة تصميم shRNAshERWOOD-UltramiR shRNAs "تستند إلى الاختبار الوظيفي لأكثر من 250000 تسلسل shRNA باستخدام اختبار مستشعر عالي الإنتاجية (Knott et al 2014) واستخدام خصائص التسلسل الرئيسية للتنبؤ بفاعلية shRNA لتحديد تصميمات shRNA النادرة التي تكون فعالة في نسخة واحدة التمثيل في الجينوم ". [4, 5]

يجب أن تتكون shRNAs من متواليات الإحساس ومضادات المعنى (كل 19–21 nt في الطول) مفصولة ببنية حلقة ، و 5 'AAAA overhang. عند تصميم بنية الحلقة ، يوصي علماء Ambion وآخرون باستخدام فاصل 9 nt (TTCAAGAGA) ، بينما يستخدم Invivogen حلقة 7 nt (TCAAGAG) لبعض النواقل ، على الرغم من أن هذا قد يختلف اعتمادًا على نظامك. تم إثبات فعالية تسلسل الحلقات التي يتراوح طولها من 3 إلى 9 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، عند إنشاء شريط shRNA ، يقترحون أن يأتي خيط الإحساس أولاً ، يليه الفاصل ثم الشريط المضاد. يجب تجنب 5 'المتراكمات في بناء shRNA ، لأنها يمكن أن تؤدي إلى إسكات shRNA. بالإضافة إلى تصميم siRNA أو shRNA يدويًا ، هناك أيضًا العديد من برامج التصميم المتاحة. يتم تضمين عدد قليل منها في الجدول 2. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من الشركات التي تقدم siRNAs و shRNAs مسبقة الصنع (يتم عرض أمثلة تمثيلية في الجدول 3).

يتم نسخ معظم shRNAs من النواقل. غالبًا ما يكون تعبيرهم مدفوعًا إما بمروج Pol III U6 ، الذي يقود مستويات عالية من التعبير التأسيسي ، أو محفز H1 الأضعف. الميزة الرئيسية ل shRNA على أنظمة siRNA هي أن shRNAs يمكن تصميمها لتكون محفزة. هناك أنظمة محفزة Tet-on و Tet-off متاحة تجارياً ، بالإضافة إلى التركيبات التي تحتوي على محفز U6 المعدل الذي يسببه هرمون تساقط الحشرات الستيرويد ecdysone. تم استخدام نظام إعادة التركيب Cre-Lox لتحقيق التعبير الخاضع للرقابة في الفئران.هناك أيضًا shRNAs الاصطناعية المتاحة والتي ، على عكس الجزيئات التي تنقلها ناقلات الفيروس ، يمكن تعديلها كيميائيًا للتأثير على نشاطها واستقرارها كما هو موضح أعلاه لجزيئات siRNA.

مجموعة شركة اسم البرنامج وصف ما يقدمونه
ثيرمو فيشر العلميةكاتم الصوت [6] متاح لجميع أهداف الجينات البشرية والفأر والجرذان في قاعدة بيانات RefSeq
معهد برود منصة الاضطراب الجيني [7] جهد عام-خاص مع مهمة إنشاء مكتبة shRNA مصدق عليها والأدوات ذات الصلة التي يمكن استخدامها لتحديد وظيفة جينات الإنسان والفأر.
ميليبور سيغماالمهمة [8] تقدم shRNAs كمخزون الجلسرين البكتيري أو DNA البلازميد أو جزيئات الفيروسة البطيئة
هورايزون دارماكوناختيار ذكي
SMARTpool [9]
أكسل [10]
على الهدف TARGETplus siRNA [11]
يقدم shRNAs مثل الفيروسات البطيئة ، من بين أمور أخرى
سيليكتاديسيفير [12] مكتبات مجمعة لفحص الإنتاجية العالية

للتأكد من أن التأثيرات التي لوحظت بعد علاج RNAi هي نتيجة إسكات الجينات وليس مجرد إدخال siRNA / shRNA أو من تنشيط مسارات RNAi ، من المهم تضمين عناصر التحكم المناسبة (الجدول 4). أكثر ضوابط التحكم شيوعًا هي الضوابط المختلطة وغير المستهدفة. إن عنصر التحكم المختلط هو بالضبط ما يبدو عليه ، فهو يتضمن أخذ تسلسل siRNA أو shRNA وإعادة ترتيب تسلسل النيوكليوتيدات بشكل عشوائي. AddGene plasmid 1864 pLKO.1 التحكم في التدافع shRNA من D. Sabatini في معهد وايتهيد ، كامبريدج ، ماساتشوستس هو عنصر التحكم الأكثر استخدامًا. من ناحية أخرى ، فإن عنصر التحكم غير المستهدف هو تسلسل siRNA / shRNA مصمم بحيث لا يستهدف أي جينات معروفة في الكائن المستهدف. تعمل عناصر التحكم هذه على تنشيط آلية RNAi وتسمح بتحديد خط الأساس لتأثير إدخال الحمض النووي الريبي المزدوج على التعبير الجيني. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه حتى عناصر التحكم في siRNA غير المستهدفة تحفز استجابة الإجهاد داخل الخلايا. بينما سيتم دمج كلا النوعين من تسلسل التحكم في Dicer وتنشيط مسار RNAi ، فمن الممكن أن يستهدف التحكم المشوش مرنا غير مقصود. على هذا النحو ، يجب توخي الحذر عند تصميم تسلسل التدافع للتأكد من أنه يتبع الإرشادات المذكورة أعلاه ، ولا يستهدف تسلسل mRNA آخر.

بالنسبة إلى shRNAs ، تشتمل عناصر التحكم المهمة الأخرى على عنصر تحكم ناقل فارغ ، والذي لا يحتوي على إدراج shRNA ، مما يسمح بتحديد آثار تعداء / تحويل على التعبير الجيني واستجابة الخلية. أخيرًا ، توفر الخلايا غير المعالجة (بدون ترنسفكأيشن أو نقل) مرجعًا للخلايا المعالجة وستسمح لك بتحديد السمية الخلوية لطريقة توصيل سيرنا معينة.

مجموعة شركة وصف
ميليبور سيغماالتحكم في عدم استهداف shRNA ، عناصر التحكم غير المستهدفة في siRNA (على سبيل المثال ، SIC001 [13])
مكافحة ناقلات فارغة
ThermoFisher / Invitrogenالتحكم الإيجابي في shRNA (أهداف eGFP)
التحكم في المتجهات الفارغة
التحكم في سيرنا المخفوق
التحكم الإيجابي في الأكتين أو GAPDH أو GFP
QIAGENدفعات مزدوجة سيرنا مخلوطة [14 ، 15]

سيعتمد البروتوكول الدقيق لإيصال siRNA أو shRNA على نوع الخلية التي تعمل معها ، نظرًا لأن أنواع الخلايا المختلفة لها حساسيات متفاوتة لإدخال الأحماض النووية ، وما إذا كنت تستخدم ضربة قاضية بوساطة siRNA أو shRNA ، أيضًا بطول الفحص الذي تقوم به. تعد ترنسفكأيشن ، والتثقيب الكهربائي ، وبعض طرق توصيل الفيروس عابرة ، بينما يدمج التنبيغ الفيروسي أو الفيروسي الارتجاعي بشكل ثابت shRNA في جينوم الخلية ، مما يسمح بالتعبير المستمر. كما تم استخدام النواقل القائمة على الينقولات ، مثل الجمال النائم [16] أو piggyBac [17]. يلخص الجدول 5 السمات الرئيسية لطرق التسليم المختلفة.

  • تعداء الدهون. تتفاعل الدهون الكاتيونية التي تحتوي على سلاسل طويلة كارهة للماء مع مجموعات رأس موجبة الشحنة مع سيرنا سالب الشحنة ، وتحيط بها في طبقة ثنائية الدهون ، والتي يتم بعد ذلك توطينها بالخلية.
  • الجسيمات النانوية القائمة على البوليمر الموجبة. هذه تسمح بتقليل السمية وزيادة الكفاءة ، فضلاً عن السماح بإيصال siRNAs المعدلة.
  • اقتران الببتيد المخترق للدهون أو الخلايا (CPP). يتضمن هذا اقتران siRNA مع جزء كاره للماء (مثل الكوليسترول) أو CCP كاتيوني (على سبيل المثال ، ترانسبورتين أو بنتاتراتين) ، مما يعزز التوصيل إلى الخلايا المستهدفة.

في التثقيب الكهربائي (على سبيل المثال ، نبضة مفردة 1500 فولت ، 30 مللي ثانية في تعليق بلعم الفأر لمدة 10 ميكرومتر سيرنا [18]) ، يتم تطبيق مجال كهربائي على غشاء الخلية ، والذي يتكون من جزيئات الفوسفوليبيد مع مجموعات رأس سالبة الشحنة . يتسبب النبض الكهربائي في إعادة توجيه الدهون الفسفورية ، مما يؤدي إلى إنشاء مسام في الغشاء ، مما يسمح بدخول siRNAs. يشيع استخدام Electroporation للخلايا التي يصعب نقلها. ومع ذلك ، يجب تحسين الإعدادات المحددة (الجهد وعدد النبضات وطول النبضات) لكل نوع خلية.

الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) هو فيروس صغير منفردة DNA (ssDNA) غير قادر على التكاثر دون مساعدة من فيروس مساعد مصاب بالعدوى ، مثل فيروس الهربس البسيط أو الفيروس الغدي. يصيب AAV العديد من أنواع الخلايا ، حيث يدخل إلى النواة ويخضع إما لدورة حياة lytic (في وجود فيروس مساعد) أو دورة حياة lysogenic (في حالة عدم وجود فيروس مساعد). أثناء الإصابة في حالة عدم وجود فيروس مساعد ، يتم دمج AAV في كروموسوم الخلية المضيفة ، مما يؤدي إلى حدوث عدوى كامنة. عند الإصابة بفيروس مساعد ، يتم تنشيط دورة حياة AAV وينتج فيروس جديد. AAV2 هو النمط المصلي النموذجي المستخدم في تكوين نواقل AAV المؤتلفة.

طريقة كفاءة توصيل الجينات تقسيم الخلايا خلايا غير مقسمة اندماج السيتوبلازم أو النواة السلامة والاعتبارات التجريبية
تعداءيعتمد على نوع الخلية ، والصحة ، والتجمع ، وكذلك كمية الحمض النووينعمانخفاض الكفاءةلاRNA-Cytoplasm Plasmid Nucleusقابلة للتكرار. كفاءة منخفضة في الخلايا الأولية والخلايا غير المنقسمة وفي الجسم الحي.
التفريد الكهربيمرتفع (على الرغم من أن هذا يعتمد على أنواع الخلايا)نعمنعملاالنواة والسيتوبلازمجيد للاستخدام على الخلايا التي يصعب نقل العدوى. مطلوب موت خلايا مرتفع وتحسين كبير.
الفيروس الغدي المؤتلف100%نعمنعملاالسيتوبلازمتصيب معظم أنواع الخلايا. نقص النسخ المتماثل. قادرة على التعامل مع المدخلات الكبيرة (8 كيلو بايت). صناعة ثقيلة.
Lentivirus& lt30٪نعمنعمنعمنواةالحد الأدنى من فرصة حدوث طفرات ناتجة عن التكامل. يمكن أن تصيب العديد من أنواع الخلايا. مصممة لإصابة الخلايا البشرية ، لذا يجب التعامل معها بحذر.
الفيروسات القهقرية& lt30٪نعملانعمنواةفرصة حدوث طفرات ناتجة عن الاندماج. مصممة لإصابة الخلايا البشرية ، لذا يجب التعامل معها بحذر.
فيروس Adeno-Associateقليلنعمنعملانواةغير مسببة للأمراض. مطلوب ارتفاع التتر

يتمثل أحد قيود RNAi في أنه قد لا يكون مناسبًا للاستخدام في جميع أنواع الخلايا. على سبيل المثال ، فإن وجود الرناوات الخاصة بالـ dsRNA يجعلها فعالة بشكل طفيف فقط في الخلايا العصبية لـ C. elegans. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يكون تسليم siRNA أو shRNA ممكنًا في أنواع خلايا معينة. بعض الخلايا لا تتسامح مع ترنسفكأيشن وقد لا تكون عرضة للتسليم عن طريق ناقلات فيروسية.

عامل مهم في الاختيار بين طريقتين إسكات الجينات بوساطة siRNA و shRNA هو طول كل من المقايسة ونصف عمر البروتين المستهدف. بينما لم تكن هناك دراسات واسعة النطاق تقارن مدة ومستوى ضربة قاضية للبروتين التي حققتها بنيات siRNA و shRNA ، أشارت التقارير الأولية باستخدام siRNAs المنقولة والبلازميدات التي تعبر عن shRNAs إلى أن shRNAs متفوقة فيما يتعلق بهذه المعايير. للمقايسات الأطول ، أو عند محاولة ضرب التعبير عن البروتينات التي لها عمر نصفي طويل ، مثل p300 (10-22 ساعة حسب نوع الخلية وظروفها) ، قد يكون من الضروري التعبير المستقر عن shRNA.

يجب تقييم مستويات البروتين لتحديد درجة وحركية ضربة قاضية. الطريقة الأكثر مباشرة لتحديد ما إذا كان إسكات الصوت ناجحًا هو إجراء لطخة غربية. باختصار ، يتضمن ذلك جمع الخلايا المعالجة (كل من التعبير عن RNAi وعناصر التحكم المختلفة) ، وتحللها ، وتحديد كمية البروتين ، وتشغيل العينات على هلام SDS-PAGE الذي يفسد طبيعة الخلايا. بعد الكشف عن جسم مضاد محدد ، يمكن مقارنة مستويات البروتين في الخلايا المعالجة بـ RNAi مع عناصر التحكم ويمكن تحديد كفاءة الضربة القاضية. يمكن العثور على شرح مفصل للنشاف الغربي وكمية البروتين في Labome.

إذا لوحظ عدم كفاية أو عدم وجود ضربة قاضية ، يمكن قياس مستويات الحمض النووي الريبي لضمان تحقيق ضربة قاضية فعالة لمرنا الهدف. باختصار ، يتم جمع خلايا التحكم وخلايا الضربة القاضية ويتم حصاد الحمض النووي الريبي ، ونسخه العكسي ، وتحديد كميته أو تطبيعه لعنصر تحكم داخلي (مثل GAPDH). إذا تم تخفيض مستويات الحمض النووي الريبي ، فقد تكون هناك حاجة إلى فترة زمنية أطول لتحقيق انخفاض في مستويات البروتين ، خاصةً إذا كان البروتين موجودًا بكميات وفيرة أو له عمر نصف طويل. في بعض الحالات ، عندما يتم ملاحظة ضربة قاضية غير كاملة للبروتين ولا يتم تقليل مستويات الرنا المرسال تمامًا ، يمكن إدخال siRNAs المجمعة (تسلسلات متعددة تستهدف شرائح مختلفة من الرنا المرسال المستهدف) في الخلايا. يمكن العثور على أوصاف تفصيلية لـ PCR في Labome.

في حين أن RNAi ربما يكون أدق آلية متاحة لإسكات الجينات ، إلا أنه لا يزال له تأثيرات محددة وغير محددة خارج الهدف. هذا الأخير ناتج عن تكامل التسلسل الجزئي إما لخيوط siRNA المعنى أو المضاد للتأثير إلى mRNAs غير المستهدفة. هذه مشكلة لكل من siRNAs و shRNAs ولا تعتمد على طريقة التسليم. ما لا يقل عن 7 nt مكمل قادر على إنتاج قمع بعيد عن الهدف ويعتمد على سياق التسلسل المحيط بالمنطقة التكميلية ، وموضع التسلسل في mRNA ، ورقم نسخة التسلسل داخل mRNA.

بسبب هذه التأثيرات المحددة خارج الهدف ، من المهم اختبارها من خلال فحوصات مثل تحليل التعبير الجيني القائم على ميكروأري. يمكن تعديل siRNAs كيميائيًا لتقليل التأثيرات غير المستهدفة. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي إضافة مجموعات الميثيل إلى الموضع 2 'من حلقة الريبوسيل للقاعدة الثانية من siRNA إلى تقليل التأثيرات غير المستهدفة. ومع ذلك ، فإن هذه الأنواع من التعديلات الكيميائية ممكنة فقط مع أوليغومرات سيرنا. بدلاً من ذلك ، يمكن أن تقلل siRNAs المجمعة ضد نفس الجين ، كما في شكل siPOOL ، التأثيرات غير المستهدفة [19]. ومن المثير للاهتمام أن الأدلة تشير إلى أن shRNAs ليس لها تأثيرات بعيدة عن الهدف مثل siRNAs. في حين أنه ليس من الواضح سبب حدوث ذلك ، يُعتقد أنه قد يكون بسبب حقيقة أن shRNAs يتم نسخها في النواة ، وقد تكون عرضة لمزيد من المعالجة. أيضًا ، قد تتعرض siRNAs للتدهور في السيتوبلازم ، مما يؤدي إلى تأثيرات خارج الهدف.

تتضمن التأثيرات غير المحددة غير المستهدفة تنشيط الإنترفيرون والاستجابات المناعية الأخرى للحمض الريبي النووي النقال ، والسميات الخلوية التي يسببها تركيب النيوكليوتيدات ، والتأثيرات الناتجة عن طريقة التوصيل. تسبب الحمض النووي الريبي الطويل المدى تحريضًا قويًا للاستجابة المناعية الفطرية ، على غرار ما لوحظ أثناء العدوى الفيروسية ، مما يؤدي إلى تدهور الرنا المرسال العالمي. من ناحية أخرى ، تحفز siRNAs و shRNAs استجابة جزئية للإنترفيرون. نظرًا لأن بعض هذا التنشيط يعتمد على التسلسل ، فإن تعديلات التسلسل يمكن أن تقلل من مناعة shRNA أو siRNA. كما هو الحال مع آثارها المحددة خارج الهدف ، يمكن أن يؤدي التعديل الكيميائي لأوليجومرات siRNA إلى تقليل قدرتها على تحفيز الاستجابات المناعية. ومع ذلك ، يمكن أن تقلل هذه التعديلات أيضًا من قدرتها على إسكات الجينات.

خصوصية الهدف التي توفرها siRNAs و shRNAs جعلتها واعدة في التطبيقات الطبية كأدوات علاجية وتشخيصية. في عام 2018 ، وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على أول دواء سيرنا ، وهو عقار أونباترو (باتيسيران) من شركة Alnylam Pharmaceuticals ، لعلاج مرض الأعصاب المحيطية الناجم عن الداء النشواني الوراثي بوساطة ترانستريتين ، والمعروف أيضًا باسم hATTR ، عند البالغين. باتيسيرانت هو سيرنا مزدوج الشريطة ضد كل من ترانستيريتين من النوع البري والمتحور. لقد تم استخدامها لاستهداف الجينات المسرطنة مثل Bcl-2 و p53 ، بالإضافة إلى k-ras التي تحمل طفرة فالين 112 المسرطنة. كما أظهرت مجموعات من siRNAs ضد أهداف متعددة داخل الخلايا السرطانية نتائج واعدة. أثبتت علاجات siRNA أيضًا فعاليتها في نماذج الفئران للأمراض العصبية ، مثل مرض هنتنغتون. بالإضافة إلى الاضطرابات الوراثية ، يتم اختبار RNAi في العلاجات المحتملة للعدوى الفيروسية. التجارب السريرية جارية لعلاج الضمور البقعي ، واعتلال الشبكية السكري ، والتهاب الكبد سي. ومع ذلك ، لا تزال هناك عقبات يجب التغلب عليها. كما لوحظ في المختبر ، لا يزال هناك قلق من أن تنشيط الاستجابة المناعية عند إدخال الحمض الريبي النووي النقال قد يُظهر سمية مفرطة ويثبط الفعالية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تحسين الأنظمة الفعالة لضمان توصيل الأنسجة المستهدفة.

يمكن الحصول على كواشف ترنسفكأيشن تجاريًا أو صياغتها في المختبر. وتجدر الإشارة إلى أنه بالإضافة إلى أكثر كواشف تعداء العدوى شيوعًا المتوفرة (ليبوفيكتامين ، فوجين ، فوسفات الكالسيوم ، كبريتات البروتامين [20] ، إلخ) ، هناك أيضًا العديد من المجموعات المصنعة تجاريًا والتي تم تحسينها من أجل ترنسفكأيشن معينة أنواع الخلايا (مثل مجموعة Amaxa Human Monocyte Nucleofactor Kit من Lonza [9] أو Silencer (R) siRNA Transfection II Kit بواسطة Invitrogen / Ambion أو خصيصًا في الجسم الحي - على سبيل المثال ، في الجسم الحي- jetPEI من ترنسفكأيشن Polyplus [21] أو Transit-TKO من Takara Bio [22] قام Butler AA وزملاؤه بحقن Lincode SMARTpool siRNAs المترافق مع في الجسم الحي-jetPEI في مناطق حصين الفئران لتقييم دور lncRNA Neat1 في تكوين الذاكرة [21].

الكواشف تعد متاحة تجارياً. بالإضافة إلى تلك التي تمت مناقشتها أدناه ، تم نقل خلايا Hela من Batie M وآخرون باستخدام INTERFERin من Polyplus-Transfection مع siRNAs المشتراة من MWG [23]. استخدم Wang L et al نفس INTERFERin لنقل عدوى RAW264.7 خلايا [24]. سايتو تي وزملاؤه خلايا HepG2 المنقولة بواسطة SMARTpool siRNAs باستخدام Dharmafect 1 من Thermo Fisher [25].

تسمح هذه الصيغة لكاشف Lipofectamine بتحويل سريع ومتسق لـ siRNAs إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، على سبيل المثال ، خلايا RF / 6A [22] ، بكفاءة عالية. وقد تم استخدامه لتوصيل siUch-L1 من Ambion إلى خلايا HEK-293 [26] ، و SMARTpool ON-TARGETplus و Accell siRNA oligonucleotides إلى خلايا الإنسان والفأر [10 ، 11] ، أو Qiagen siRNAs إلى خلايا HK2 [14]. Lee J وآخرون المنقولة عن طريق خلايا عضلة القلب المشتقة من iPSC مع إما سيرنا تدافع أو سيرنا ضد PDGFRB باستخدامها [27]. استخدم Yang J وآخرون Lipofectamine RNAiMAX لتحويل مكتبة siRNA مخصصة تستهدف 2725 بروتينًا متعدد الكتلة عبر الغشاء لتحديد قناة الكلوريد المنشط بالبروتين [15]. Genet G وآخرون نقلوا FlexiTube و SMARTpool siRNAs إلى خلايا HUVEC باستخدام RNAiMax [28].

تسمح هذه الصيغة لكاشف Lipofectamine بنقل العدوى لناقلات siRNAs و shRNA إلى خطوط الخلايا الملتصقة والمعلقة. تم استخدام Lipofectamine 2000 للعدوى ، على سبيل المثال ، في خلايا HEK293T [13 ، 29] أو Hela [29]. ليبوفيكتامين 3000 ، إلى 498 خلية [29].

Lipofectamine هو دهون كاتيونية مع مجموعة رأس موجبة الشحنة وسلاسل هيدروكربونية 1-2. تتفاعل مجموعة الرأس مع العمود الفقري للفوسفات في الحمض النووي. تسمح الشحنة السطحية الموجبة للجسيمات الشحمية المكونة من مخاليط Lipofectamine / RNA بدمج معقدات الجسيمات الشحمية / الأحماض النووية مع الخلية سالبة الشحنة.

Oligofectomine عبارة عن تركيبة مسجلة الملكية تشكل مجمعات مستقرة مع الأحماض النووية للسماح بنقل عدوى siRNAs إلى الخلايا حقيقية النواة. إنه محدد وغير سام.

يسمح MISSION® siRNA Transfection Reagent بإيصال siRNAs إلى الخلايا حقيقية النواة ، مما يؤدي إلى كفاءة إسكات بنسبة تزيد عن 90٪. يؤدي استخدام تركيزات منخفضة من siRNAs إلى تقليل التأثيرات غير المستهدفة.

يسمح هذا النظام بنقل العدوى من siRNAs إلى أنواع الخلايا التي يصعب نقلها ، بما في ذلك الخلايا العصبية والأولية والخلايا المتمايزة وغير المنقسمة. يعتمد على كاشف تعداء الببتيد.

يستخدم H Hu وآخرون العديد من جزيئات shRNA lentiviral من التكنولوجيا الحيوية في سانتا كروز للتحقيق في دور RAK1 في نضوج الناسور الشرياني الوريدي [30]. قامت Freeman SA وآخرون بالكهرباء 100 pM mTPCN1 stealth siRNA من Thermo Fisher (MSS217431) إلى 2x10 6 خلايا بلعم الفئران في التعليق وحققت انخفاضًا بنسبة 60-90 ٪ في مستوى TPCN1 mRNA كما هو محدد بواسطة qPCR [18]. تقدم MilliporeSigma مجموعات من 3 مزدوجات siRNA تستهدف فأرًا معينًا أو جينًا بشريًا ، مع ضمان أن 2 ستوفر كفاءة ضربة قاضية بنسبة 75 ٪ على الأقل. تقدم العديد من الشركات أيضًا بلازميدات تعبير shRNA وكذلك أنظمة ناقلات فيروسية معبرة عن shRNA (الجدول 6). طلب ليون RD وآخرون من TRC lentiviral shRNAs التي تستهدف عددًا من الجينات من MilliporeSigma [31]. حصل Zhou R et al على الفيروس الغدي الذي يعبر عن CHC shRNA من مختبرات SignaGen وتلك التي تعبر عن TrkB أو FGFR1 أو calpain-2 shRNA من Vector BioLabs [32]. استخدم Kitchen P وآخرون pGFP-C-shLenti-AQP4 و pGFP-C-shLenti-Control من OriGene لإصابة الخلايا العصبية بالعمود الظهري في الفئران [33]. حصل دمينغ وآخرون على MS4A4A shRNA pGFP-C-shLenti (TL303135B) و hRNA pGFP-C-shLenti Scrambled (TR30021) من OriGene لتحويل الخلايا الضامة المشتقة من الخلية الوحيدة المستزرعة [34]. حصل Chakraborty AA et al على بلازميدات shRNA المستندة إلى pLKO والتي تستهدف Kdm6a و Kdm6b من GPP ، Broad Institute [35]. استخدم Lee YR et al وحدات MilliporeSigma siRNA المزدوجة وتركيبات shRNA المستندة إلى Dharmacon lentivirus لاستهداف جين WWP1 و Dharmacon SMARTpool siRNA لاستهداف MYC [36]. اشترى Huang H وآخرون من Dharmacon shRNA lentiviral vectors ضد SETD2 ، METTL3 ، METTL14 ، WTAP ، Mettl14 والتحكم (shCtrl) لضرب تعابيرهم في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر ، هيلا و / أو خلايا HepG2 [29]. هدم Moro A et al تعبير DROSHA في HUVEC باستخدام Dharmacon shRNA SMARTvectors من GE Healthcare [37].

شركة يستخدم المروج العمود الفقري محدد قابل للتحديد المرجعي
ميليبور سيغماتعبير shRNApLKO.1-CMV PLKO.1-UbCeGFP و tGFP و TagCFP و TagYFP و TagRFP و TagFP635 و TurboGFP و TagFP635 Puromycin و neomycin
تعبير shRNA المحرضpLKO-puro-IPTG-1xLacOبوروميسين
pLKO-puro-IPTG-3xLacOبوروميسين
تعداء shRNA العابر أو المستقر وإنتاج الفيروس البطيءTRC2-pLKOبوروميسين
العلوم البيولوجية لنظام SBIالعمود الفقري / المروج لـ shRNApSIH1-H1 pSIF-HI pGreenPuro pFIV-H1GFP و RFP و Puromycin و Hygromycin و Neomycin و Zeocin
العمود الفقري / المروج لـ microRNApCDH-CMV-MCS-EF1 pMIF-cGFP-ZeoGFP و RFP و Puromycin و Hygromycin و Neomycin و Zeocin
آدجينناقلات الفيروسات القهقرية للتعبير عن shRNApMKO.1 و pMKO.1بوروميسين ، نيومايسين ، زيوسين ، GFP
تعبير lentiviral shRNApLKO.1بوروميسين ، هيجرومايسين ، نيومايسين ، بلاستيدين [38, 39]
تعبير shRNA lentiviral الذي يحفزه TetTet-pLKO
تعبير shRNA الشرطي تحت تحكم Cre-Lox.بيكوGFP (على الرغم من أنه يمكن إزالة الكاسيت واستبداله بسهولة)

يعد Addgene مستودعًا غير ربحي للبلازميدات ويقدم مجموعة متنوعة من ناقلات الفيروس البطيئة والفيروسات الرجعية [40 ، 41]. كما أنه يوفر العديد من بلازميدات shRNA الجاهزة مثل pLKO-RB1-shRNA63 و pLKO-RB1-shRNA19 من T. والدمان (Addgene plasmids 25641 و 25640) [42]. تشمل بلازميدات AddGene shRNA الشعبية GFP shRNA [43] و Rictor_1 shRNA [44] و beta-catenin shRNA [45] و Raptor_1 shRNA [46].


الأخبار: علاجات الوهن العضلي الشديد

من فضلك ، هل يمكنك إعطاء مقدمة موجزة عن الوهن العضلي الشديد؟
الوهن العضلي الوبيل (MG) هو أحد أمراض المناعة الذاتية الذي ينتج عنه ضعف العضلات وإرهاقها. يصيب ما بين 1 و 7 أشخاص لكل 10000 ، وفقًا لأفضل الإحصائيات.

عادة ، قد يبدأ بالرؤية المزدوجة والجفون المتدلية. ثم يتطور الضعف غالبًا ليشمل الوجه والذراعين والساقين والعضلات المعنية بالتنفس والبلع. الاسم & # 8220myasthenia gravis & # 8221 يعني ضعف عضلي خطير (خطير).

قبل تطوير العلاجات الحالية للجهاز المناعي ، كان أداء حوالي ثلثي مرضى الوهن العضلي الوبيل سيئًا جدًا أو ماتوا. مع العلاج الحالي ، يمكن إعادة جميع مرضى MG تقريبًا إلى حياة طبيعية أو طبيعية تمامًا ، على الرغم من أنه قد تكون هناك مشاكل مع الآثار الجانبية للعلاجات.

ما هو معروف عن أسباب الوهن العضلي الشديد؟
MG ناتج عن الاستجابة الخاطئة للجهاز المناعي الذي يهاجم مستقبلات أستيل كولين في العضلات. تتطلب كل حركة عضلية إطلاق جهاز الإرسال أستيل كولين (ACh) من الأعصاب الحركية ، والذي يعبر بعد ذلك فجوة ضيقة جدًا للوصول إلى مستقبلات ACh (AChRs) ، ويؤدي إلى تقلص العضلات. يؤدي عدم انتقال العدوى إلى الضعف أو الشلل.

في MG ، هناك هجوم من قبل جهاز المناعة & # 8217s الأجسام المضادة على AChRs ، والتي انخفض عددها. ينتج عن هذا الضعف والتعب وقد يسبب الشلل والوفاة.

السبب الحقيقي لخطأ الجهاز المناعي غير معروف ، ولكن هناك دليل على أن توليفة من القابلية الوراثية بالإضافة إلى بعض المحفزات البيئية تؤدي إلى هجوم المناعة الذاتية. من المحتمل أن تكون غدة التوتة متورطة في أصل MG.

ما هي العلاجات المتوفرة حاليًا للوهن العضلي الشديد؟
يوجد الآن عدد من العلاجات لـ MG. العلاج الفوري هو دواء (بيريدوستيغمين ، ميستينون) الذي يمنع إنزيم أستيل كولينستراز الذي يتحلل عادة ACh بعد حدوث النقل العصبي. يسمح هذا الدواء لـ ACh بالاستمرار لفترة أطول ، والتفاعل بشكل متكرر مع العدد المنخفض من AChRs. له تأثير مفيد مؤقت ، ويعتبر نوعًا من & # 8220band-aid & # 8221 لـ MG.

يتم استخدام العوامل التي تثبط جهاز المناعة ككل لعلاج مشكلة المناعة الذاتية الكامنة في MG. وتشمل هذه الكورتيكوستيرويدات الكظرية (بريدنيزون) ، وعوامل أخرى مثبطة للمناعة العامة ، مثل الآزوثيوبرين ، والتاكروليموس ، والسيكلوسبورين. تعمل هذه العوامل على قمع الجهاز المناعي بأكمله إذا تم استخدامها بشكل صحيح فهي فعالة للغاية. ومع ذلك ، قد يكون لها آثار جانبية ضارة ، بما في ذلك زيادة التعرض للعدوى ، ونادرًا الأورام الخبيثة ، فضلاً عن الآثار الجانبية الأخرى.

كيف نشأ بحثك في تطوير علاج قائم على الجينات لإيقاف مكافئ القوارض للوهن العضلي الوبيل؟ ماذا تضمن بحثك؟
الهدف من بحثي هو تطوير علاج يقضي على الشذوذ المحدد المسؤول عن مشكلة المناعة الذاتية دون التأثير على جهاز المناعة.

لتحقيق ذلك ، من الضروري استهداف تلك الخلايا التي تشارك بشكل خاص في استجابة المناعة الذاتية. شرعت في استهداف الخلايا الليمفاوية التائية التي تساعد في إنتاج الأجسام المضادة لـ AChR. لذا فإن الجانب الأول من بحثنا تضمن الهندسة الوراثية لخلايا تقديم مستضد (وأكثرها كفاءة هي الخلايا المتغصنة) بحيث تستهدف الخلايا التائية التي تتفاعل على وجه التحديد مع AChRs.

هناك مشكلة خاصة تتعلق بهذا الأمر وهي أن كل فرد (أو لكل فأر) مع MG لديه مجموعته الفريدة من الخلايا التائية الخاصة بجوانب مختلفة من مستضد AChR (حواتم مختلفة). للتعامل مع هذا التعقيد ، سنستخدم الخلايا التغصنية من نفس الفرد ، والتي بالطبع قادرة على استهداف الذخيرة الكاملة لهذا الفرد & # 8217s الخلايا التائية الخاصة بـ AChR. يتكون معقد الجين المستهدف من جين لأهم جزء من AChR مرتبط بمركب يوجهه إلى حجرة المعالجة الداخلية ، بحيث يتم تقديمه على سطح الخلية المتغصنة.

بمجرد أن نتقن طريقة الاستهداف ، اخترنا & # 8220warhead & # 8221 لتدمير الخلايا التائية ، ولهذا الغرض قمنا بتزويد الخلايا التغصنية بجين Fas Ligand (FasL). يتفاعل FasL مع & # 8220Fas & # 8221 ، وهو بروتين موجود على سطح الخلايا التائية المنشطة ، مما يتسبب في الموت بسبب موت الخلايا المبرمج.

كانت الخطوة التالية هي اختبار الخلايا المتغصنة المهندسة في المختبر. لقد وجدنا أنهم بالفعل استهدفوا وقتلوا الخلايا التائية الخاصة بـ AChR ، ولكن ليس الخلايا التائية التي كانت مخصصة لمستضد آخر غير ذي صلة. بعد أن تمكنا من إثبات خصوصية هذه الخلايا المتغصنة & # 8220 الموجهة & # 8221 ، قمنا بعد ذلك باختبار قدرتها على قتل الخلايا التائية الخاصة بـ AChR في الفئران الحية.

لقد قمنا بتحصين الفئران باستعمال مستضدين - AChR ومستضد غير مرتبط (KLH). قمنا بحقن الفئران بالصاروخ & # 8220 الموجه & # 8221 الخلايا المتغصنة المصممة هندسيًا ، وقمنا بتقييم الخلايا التائية من الفئران ، وإنتاج الأجسام المضادة في الفئران. تم تقليل الخلايا التائية الخاصة بـ AChR من الفئران المعالجة بشكل ملحوظ ، في حين لم يتم تقليل الخلايا التائية الخاصة بـ KLH على الإطلاق. وبالمثل ، كانت الأجسام المضادة ضد AChR أقل بكثير في الفئران المعالجة بالقذائف الموجهة مقارنة بتلك التي لم يتم علاجها بالخلايا المتغصنة بالصواريخ الموجهة ، في حين أن استجابة الجسم المضاد لـ KLH لم تتأثر بالصواريخ الموجهة الخاصة بـ AChR.

هناك العديد من الميزات الخاصة لهذه النتائج:

من المهم أن تكون قادرًا على استخدام الخلايا التغصنية الفردية & # 8217s ، وذلك لاستهداف الذخيرة الكاملة لهذا الفرد & # 8217s الخلايا التائية ذاتية التنشيط.
يجب أن يتم التعبير عن كل من مجمع الاستهداف و & # 8220warhead & # 8221 بواسطة جميع الخلايا التغصنية. إذا كانت آلية الاستهداف موجودة فقط ، فإن الخلايا المتغصنة ستحفز الخلايا التائية بدلاً من القضاء عليها. من ناحية أخرى ، إذا كان & # 8220warhead & # 8221 موجودًا فقط بدون المركب الاستهدافي ، فإن الخلايا المتغصنة يمكن أن تلحق الضرر بالخلايا التائية الأخرى ، وتتلف الأنسجة الأخرى ، مثل الكبد أو الرئتين.
ما هو التأثير الذي تعتقد أنه سيكون لبحثك على علاجات الوهن العضلي الشديد وهل تعتقد أن أبحاثك سيكون لها أي تأثير على علاجات أمراض المناعة الذاتية الأخرى؟
لقد أظهرت تجاربنا & # 8220proof من حيث المبدأ & # 8221 أي أنها أظهرت أن استراتيجية & # 8220Guided Missile & # 8221 للعلاج المناعي المحدد يمكن تنفيذها في الجسم الحي لعلاج استجابة المناعة الذاتية في نموذج MG.

في الواقع ، يمكن استخدام نهج مماثل لأي مرض مناعي ذاتي يُعرف به المستضد. آمل أن تتم ترجمة هذه الاستراتيجية أو استراتيجية مماثلة لعلاج MG البشري وأمراض المناعة الذاتية الأخرى. بالطبع ، يجب تطوير كل جزء من العملية وفقًا لمعايير & # 8220 أفضل الممارسات السريرية & # 8221 ، الأمر الذي يتطلب تطويرًا كبيرًا.

هل لديك أي خطط لمزيد من البحث في هذا المجال؟
نحن ندرس حاليًا علم الوراثة لـ MG من خلال إجراء دراسة ارتباط الجينوم على نطاق واسع (GWAS). لقد جمعنا الحمض النووي من 1100 مريض MG وحوالي 3000 فرد غير مصاب من أصول عرقية مماثلة.

بالتعاون مع الدكتور براين ترينور في المعاهد الوطنية للصحة ، نقارن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) من مرضى MG مع تلك الموجودة في الضوابط. لقد وجدنا حتى الآن 3 تعدد الأشكال التي تختلف اختلافًا كبيرًا في مجموعة MG لدينا ، والعديد من الأشكال الأخرى الواعدة. يجري تسلسل هذه الجينات ، ويبدو أنها تتضمن جينات وثيقة الصلة بالموضوع.

أين يمكن للقراء الحصول على مزيد من المعلومات؟
تم نشر المقال الأصلي في J. Neuroimmunology 2012 251: 25 - 32.


أطقم استخراج البروتين من BioChain

مجموعة استخراج البروتين الجزئي CNMCS : تم تحضير هذه المجموعة المختبرة بدقة بأعلى معايير المواد الكيميائية النقية. تحتوي مجموعة BioChain على كواشف كافية لاستعادة البروتينات من 5 جرامات من الأنسجة أو 125 مليون خلية. تم اختبار المجموعة من حيث الكفاءة باستخدام SDS-PAGE وطرق التكتل المناعي على أنواع مختلفة من بروتينات الواسم الموجودة في البشر. بالإضافة إلى ذلك ، تخضع جميع الكسور الأربعة للبروتينات المستخرجة لمزيد من الرحلان الكهربائي والتخثر المناعي لضمان الجودة. تستخرج العدة أربعة أنواع من البروتينات:

  • السيتوبلازم: توجد هذه البروتينات في العصارة الخلوية للسيتوبلازم الخلوي. هذه المنطقة السائلة مسؤولة عن عمليات مثل تحلل السكر أو انقسام الخلايا.
  • نووي: يشير إلى البروتينات الموجودة داخل نواة الخلية ، بما في ذلك تلك التي تشكل الكروموسومات.
  • الغشاء: تشكل هذه البروتينات الطبقات الخارجية للخلايا والأنسجة. تشمل وظائفها النقل / الاتصال بين البيئة الداخلية والخارجية للخلية ، والتعلق بالطبقة الدهنية الثنائية للبروتينات الأخرى.
  • الهيكل الخلوي: تتكون بروتينات هذه الحيز من بنية الخلية ، مثل الدعم والنقل والانقسام.

غالبًا ما يكون فصل مخاليط البروتين المعقدة عملية صعبة وشاقة. تعمل هذه المجموعة على تبسيط العملية باستخدام الكواشف الجاهزة للاستخدام وبروتوكول سهل الاستخدام يتسم بالكفاءة. توفر هذه الطريقة الفعالة من حيث التكلفة عمليات استخراج متسقة عالية الجودة يمكن استخدامها في العديد من تطبيقات المصب ، بما في ذلك SDS-PAGE و Western Blotting و IP وجل التنقل الهلامي وفحوصات البروتين.

يساعد بروتوكول الملكية الخاص بـ BioChain في الاتساق والتوحيد القياسي ، ويمكن استخدامه مع الخلايا الطازجة أو المجمدة. يتضمن نموذج سير العمل لمجموعة CNMCS عادةً العديد من الخطوات التي تم تبسيطها ، نظرًا لأن استخراج أنواع مختلفة من البروتينات يحتاج إلى مستويات فريدة من المعالجة.

مجموعة CNMCS: الاستخراج من الأنسجة . نظرًا للتركيز غير المتكافئ للبروتينات عبر المناطق ، من المهم اختيار الأنسجة التي سيكون لها توزيع أعلى للبروتينات لتحقيق أقصى استخلاص. الخطوة الأولى عند الاستخراج من الأنسجة هي قطع الأنسجة وتجانسها قبل التحلل. هذا الاضطراب الميكانيكي يكسر سطح الأنسجة وهيكلها. بعد الطرد المركزي للنسيج ، يكون أول بروتين متاح السيتوبلازم . بعد ذلك ، باستخدام المحاليل الكيميائية في درجات حرارة الجليد الباردة والمزيد من الطرد المركزي ، نووي تصبح البروتينات متاحة. يتم إضافة المزيد من العازلة الكيميائية ، ويوفر الدوران الثالث لجهاز الطرد المركزي غشاء البروتينات. أخيرًا ، بمساعدة المخزن المؤقت الإضافي ، يمكن طرد الحبيبات المتبقية في المرة الأخيرة الهيكل الخلوي البروتينات.

CNMCS: استخراج من خلايا الثقافة . تختلف هذه الطريقة عن الاستخراج من الأنسجة لأن الخلايا تتطلب فقط تحلل الغشاء الخارجي لاستخراج البروتينات مما يقلل من بعض الخطوات. أولاً ، يتم الطرد المركزي لخلايا المزرعة باستخدام عازل بارد مثلج ، ثم يتم تمريرها عبر قاعدة إبرة لتعطيل غشاء الخلية وإطلاق نوى الخلية. يجب استخدام مجهر لمراقبة مستوى الاضطراب. بعد ذلك ، قم بتدوير مزيج الخلية لتحريره السيتوبلازم البروتينات. يتم تعليق بيليه الخلية مرة أخرى في المخزن المؤقت للثلج ويتم طرده عدة مرات للإفراج عنه نووي البروتينات. باستخدام مخزن مؤقت مختلف وطرد مركزي ، غشاء البروتينات متوفرة. أخيرًا ، يؤدي استخدام المخزن المؤقت الدافئ والدوران في درجة حرارة الغرفة إلى تحرير الهيكل الخلوي البروتينات.

تبسيط التحديات في استخلاص البروتين. يعد استخراج البروتينات عملية صعبة تتطلب غالبًا إدارة من أجل الدقة. في كثير من الأحيان أثناء عملية تحلل الخلايا ، قد يتم تغيير طبيعة البروتينات من المحاليل الكيميائية ، وقد يؤدي ذلك إلى بروتينات عديمة الفائدة تفشل في إعادة طيها أو طيها إلى أشكال غير صحيحة. قد يؤدي وجود البروتينات أيضًا إلى هضم البروتين الذي يجب أن يؤخذ في الاعتبار أثناء التنقية. يميل التلوث المتبادل أيضًا إلى أن يكون مشكلة كبيرة. تم تصميم BioChain CNMCS Kit بعناية واختبار الجودة لتجنب هذه المشكلات ، مع تضمين استكشاف الأخطاء وإصلاحها بالتفصيل في الدليل.

مجموعة استخلاص البروتين الكلي : تأتي هذه المجموعة مع بروتوكول شامل مصمم لتحقيق أقصى استخلاص للبروتين. تشمل التطبيقات النهائية للبروتين عالي الجودة SDS-PAGE ، وفصل الهلام ثنائي الأبعاد ، والتركيز الكهروضوئي ، والنشاف الغربي ، وتحليل تحول حركة الهلام ، ودراسات تفاعل بروتين الحمض النووي ، وإنتاج الأجسام المضادة ، ومقايسات النشاط الأنزيمي ، ودراسات تفاعل البروتين والبروتين ، IP ، وتحليل تعبير البروتين الخاص بالأنسجة.

يمكن أن يكون الحد الأدنى للعينة الموصى بها للاستخراج أقل من 0.1 جم من الأنسجة أو 2.5 مليون خلية ، ولكن في بعض الحالات ، يمكن أن يكون استخدام كاشف أقل فعالًا مع عينة أصغر. تأتي مجموعة استخراج البروتين الشامل مع كوكتيل مثبط للبروتياز لمنع تدهور البروتين. البروتينات المستخرجة من العدة سليمة ويمكن أن يزيد وزنها عن 200 دينار كويتي. لا يلزم التجميد أو الذوبان أو الصوتنة.

دكتور بي كيت: عزل الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين : BioChain's Dr.P Kit هو نظام فعال يمكنه عزل الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين من نفس قطعة الأنسجة في وقت واحد حتى 150 مرة. يمكن استخدام هذه المجموعة لاستخراج ما يصل إلى 5 جرامات من الأنسجة وتوفر البروتين الكلي الذي يمكن استخدامه في النشاف الغربي.


شاهد الفيديو: الية تركيب بروتين في الخلية - الاستنساخ و الترجمة (كانون الثاني 2022).