معلومة

أول بوليميراز


بمعرفة أن بروتين البوليميراز ضروري لنسخ الجينات ، ما هو البوليميراز المستخدم في نسخ بروتين البلمرة نفسه؟


في حقيقيات النوى ، بوليميراز الحمض النووي الريبي II. في البكتيريا هو بوليميريز الحمض النووي الريبي الطبيعي. على الرغم من صحة أن البوليميرات مطلوبة الآن لنسخ المزيد من البوليميرات ، فقد لا تكون هذه الآلية موجودة دائمًا. في فرضية العالم RNA ، RNA مشفر للبروتينات وليس DNA ، لذلك مع ظهور DNA ، قد تكون بوليميرات RNA قد تكونت أيضًا. لإنتاج بروتينات من الحمض النووي الريبي ، تستخدم الكائنات الحية مجمعات تسمى الريبوسومات ، وهي عبارة عن ريبوزيمات (إنزيمات RNA) ، والتي خضعت لجولات عديدة من التطور من الريبوسومات الأصلية ، لذلك لم تكن هناك مشكلة في إنتاج البروتينات من الحمض النووي الريبي وطوال مسار التطور ، ثم تم تطوير البوليميرات ، لكنها كانت ضرورية فقط مع ظهور الحمض النووي.


تاريخ تفاعل البلمرة المتسلسل

ال تاريخ تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) تم وصفه بشكل مختلف بأنه "Eureka!" لحظة ، [1] أو كمثال على العمل الجماعي التعاوني بين الباحثين المختلفين. [2] فيما يلي قائمة بالأحداث قبل وأثناء وبعد تطورها:


نسخ mtDNA ، والصيانة ، والتنظيم النووي

مارا دويمو. Sjoerd Wanrooij ، في جينوم الميتوكوندريا البشري ، 2020

1.2.3 استطالة تكرار mtDNA

بعد تحضير توليف mtDNA ، يتم تحفيز استطالة أساس النسخ المتماثل بواسطة POL γ المشفر نوويًا ، والذي كان أول بوليميراز معزول من الميتوكوندريا لخلايا هيلا البشرية [71]. يحتاج POL إلى مساعدة mtDNA Helicase Twinkle و mtSSB لتكرار mtDNA في الخلايا البشرية. معًا ، تشكل POL γ و Twinkle و mtSSB الحد الأدنى من إعادة تركيب mtDNA (الشكل 1.3) وهي ضرورية لإعادة تكوين تكرار الميتوكوندريا في المختبر [72].

الشكل 1.3. بروتينات شوكة تكرار الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA).

هليكاز توينكل (أزرق) يتحرك في اتجاه 5 إلى 3 أثناء فك dsDNA. بروتين mtSSB (أخضر غامق) يستقر في التشكل أحادي الجديلة للحمض النووي ويحفز تخليق الحمض النووي بواسطة POLγ (أحمر (أ) و رمادي (ب)). بولرمت (اخضر فاتح) توليف RNA التمهيدي (الخط الأصفر) اللازمة لتخليق الحمض النووي المتأخر.

1.2.3.1 بوليميريز DNA الميتوكوندريا POL

تم وصف POL لأول مرة على أنه بوليميريز DNA المعتمد على الحمض النووي الريبي [73]. يتكون الإنزيم الهولندي من وحدة فرعية تحفيزية بقدرة 140 كيلو دالتون POL γA ووحدتان فرعيتان ملحقة بقدرة 55 كيلو دالتون POL γB [74-76]. تمتلك الوحدة التحفيزية بوليميريز DNA وأنشطة نوكلياز خارجية 3-5-5 بالإضافة إلى نشاط لياز فوسفات 5′-deoxyribose [77،78]. بشكل عام ، يعمل نشاط نوكلياز خارجي جوهري لـ POL γ كآلية تدقيق أثناء النسخ المتماثل ، مما يضمن دقة البوليميراز من خلال انتقائية عالية للنيوكليوتيدات وتمديد بطيء لعدم التطابق [79]. يمكن لـ POL التبديل بين أنشطة البوليميراز والنوكلياز الخارجي دون الانفصال عن قالب الحمض النووي لأنه يمكن أن ينقل الحمض النووي الناشئ من موقع البوليميراز إلى موقع نوكلياز خارجي والعودة من خلال آلية نقل حبلا داخل الجزيء [80]. مع معدل خطأ أقل من 1 × 10 6 لكل نيوكليوتيد ، يعد POL γ أحد أكثر البوليمرات دقة [79].

تُعرف الوحدة الفرعية الملحقة POL γB أيضًا بعامل المعالجة لأنها تزيد من قابلية معالجة POL γA من خلال زيادة تقارب ربط الحمض النووي الخاص بها. بالإضافة إلى ذلك ، يحفز POL γB كلاً من أنشطة نوكلياز خارجية وبوليميراز ، ويمكنه أيضًا تحسين ارتباط النيوكليوتيدات ودمجها ، وبالتالي زيادة معدل بلمرة الإنزيم الهولندي [81،82]. في المحلول ، تشكل ثنائيات POL γB قاطرة غير متجانسة مع الوحدة الفرعية الحفزية POL γA من خلال الربط المحكم لثنائي POL γB مع مونومر POL γA [75]. كل وحدة POL γB في holoenzyme لها وظيفة محددة: المونومر القريب من POL γA في holoenzyme يزيد من التفاعل مع DNA ، في حين أن مونومر POL γB البعيد مسؤول عن تعزيز معدل التفاعل [83]. تشير نمذجة ربط POL إلى DNA إلى أن POL A يربط ما يقرب من 10 نقاط أساس من قالب DNA وأن التفاعل مع POL γB يزيد من أثر POL γA على الحمض النووي إلى 25 نقطة أساس. على الرغم من أن POL γB له نشاط ربط dsDNA [84] ، فإنه لا يتفاعل مع قالب DNA التمهيدي [85]. في حين أنه ليس ضروريًا لتحفيز POL A ، فإن نشاط ربط dsDNA لـ POL γB مطلوب لوظيفة إعادة تشكيل mtDNA على قالب dsDNA من خلال تنسيق POL γ و Twinkle عند شوكة النسخ المتماثل [86].

1.2.3.2 الحمض النووي للميتوكوندريا هيليكس توينكل

Twinkle (بروتين يشبه T7 gp4 مع توطين نوكليويد داخل الميتوكوندريا) هو هيليكاز التكاثر الميتوكوندريا المشفر نوويًا. تشترك في التشابه الهيكلي مع Phage T7 primase / hellicase وتنطوي مع mtDNA في مجمعات البروتين النووي [87]. مطلوب وميض لفك قالب DNA مزدوج الشريطة قبل POL الذي يمكنه فقط استخدام ssDNA كقالب [72]. وهي عبارة عن مروحية DNA تعتمد على NTP والتي تفك الحمض النووي في اتجاه 5 3 وتحتاج إلى بنية تشبه الشوكة مع موقع تحميل أحادي الجديلة 5′-DNA وذيل قصير 3′ لبدء التفكيك [88] . يتم تحفيز نشاط الهلياز في Twinkle إلى حد كبير بواسطة mtSSB [88] ، ولكنه لا يمكنه سوى فك امتدادات dsDNA الأطول في وجود POL γ [72]. أشارت تقارير سابقة إلى أن Twinkle هو سداسي أمريكا [87،89] ، بينما كشف التحليل الأحدث بواسطة المجهر الإلكتروني عن دليل على كل من الأشكال السداسية والسباعية [90،91].

1.2.3.3 بروتين ربط الحمض النووي أحادي السلسلة في الميتوكوندريا

mtSSB البشري هو بروتين 15 كيلو دالتون يشترك في تشابه التسلسل مع الإشريكية القولونية SSB [92] ، ويشكل رباعي الأبعاد يربط 59 nt من ssDNA [93]. يلتف الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل مرة واحدة حول رباعي mtSSB [94،95]. يحفز MtSSB نشاط POL γ polymerase بالإضافة إلى نشاط Twinkle Helicase [88،96،97]. تم اقتراح التأثير التحفيزي على نشاط بوليميريز بوليميريز دون أي تفاعل مباشر بين البروتينات ، من خلال قدرة mtSSB على تنظيم قالب ssDNA وإزالة أي هياكل DNA ثانوية [98]. دراسات على ذبابة الفاكهة أظهر mtSSB أن mtSSB يزيد ذبابة الفاكهة توليف POL بشكل أساسي عن طريق زيادة التعرف على التمهيدي والربط ، ونتيجة لذلك ، يزيد معدل بدء تخليق الحمض النووي [99،100]. بالإضافة إلى تحفيز نشاط POL γ polymerase ، ذبابة الفاكهة يمكن أن يحفز mtSSB نشاط نوكلياز خارجي لـ POL γ [101].

1.2.3.4 تعويض الحمض النووي للميتوكوندريا

في المقايسات البيوكيميائية ، لا يستطيع POL وحده استخدام dsDNA كقالب ، ولكن إضافة Twinkle يحسن بشكل كبير البلمرة بواسطة POL على قالب دائرة صغيرة معدة ويسمح بتوليف امتدادات واسعة من الحمض النووي في وضع تكرار الدائرة المتدحرجة [ 72]. يسمح تفاعل Twinkle-POL أيضًا لـ Twinkle بفك امتدادات أطول من dsDNA على الرغم من أن البروتينات لا يبدو أنها تشكل معقدًا مستقرًا [72]. تؤدي إضافة mtSSB إلى تحسين تخليق الحمض النووي مما يسمح بتكوين ما يصل إلى طول الجينوم من منتجات DNA [72]. في الختام ، يشكل mtDNA polymerase POL مع Twinkle و mtSSB الآلية الأساسية اللازمة لتكرار mtDNA في الخلايا البشرية. يتم التأكيد على أهمية هذه البروتينات في الحفاظ على mtDNA في الجسم الحي من خلال حقيقة أن العيوب في هذه المكونات الأساسية من تعويض mtDNA تؤدي إلى عدم استقرار mtDNA ومرض الميتوكوندريا [87102-106].


عملية النسخ

يبدأ النسخ بربط إنزيم RNAP بجزء محدد من الحمض النووي ، المعروف أيضًا باسم منطقة المروج. يتطلب هذا الارتباط وجود عدد قليل من البروتينات الأخرى - عامل سيجما في بدائيات النوى وعوامل النسخ المختلفة في حقيقيات النوى. مجموعة واحدة من البروتينات تسمى عوامل النسخ العامة ضرورية لجميع أنشطة النسخ حقيقية النواة وتشمل عامل بدء النسخ II A و II B و II D و II E و II F و II H. يتم استكمالها بجزيئات إشارات محددة تنظم التعبير الجيني من خلال امتدادات من الحمض النووي غير المشفر الموجود في المنبع. غالبًا ما يتم إجهاض البدء عدة مرات قبل بلمرة امتداد من عشرة نيوكليوتيدات. بعد ذلك ، ينتقل البوليميراز إلى ما وراء المحفز ويفقد معظم عوامل البدء.

يتبع ذلك تفكيك الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، والمعروف أيضًا باسم & # 8216 ذوبان & # 8217 ، لتشكيل نوع من الفقاعة حيث يحدث النسخ النشط. يبدو أن هذه & # 8216 فقاعة & # 8217 تتحرك على طول حبلا DNA بينما يستطيل بوليمر RNA. بمجرد اكتمال النسخ ، يتم إنهاء العملية ومعالجة حبلا RNA. تتطلب RNAP بدائية النواة وبوليمرات الحمض النووي الريبي حقيقية النواة الأول والثاني بروتينات إضافية لإنهاء النسخ. ينهي RNAP III النسخ عندما يكون هناك امتداد لقواعد الثايمين على الشريط غير القوالب للحمض النووي.


7.1: نظرة عامة على تفاعل البلمرة المتسلسل

  • بمساهمة من Clare M. O & rsquoConnor
  • أستاذ مشارك فخري (علم الأحياء) في كلية بوسطن

أحدث تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ثورة في البيولوجيا الجزيئية. باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كان لدى الباحثين أداة لتضخيم تسلسل الحمض النووي ذي الأهمية من كميات صغيرة للغاية
لقالب الحمض النووي. في الواقع ، يمكن تصنيع مليارات النسخ من جزيء DNA واحد في تفاعل PCR نموذجي. نشأ تطور تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) نتيجة البحث الذي أُجري على بوليميراز الحمض النووي واكتشاف بوليميرات الحمض النووي المقاومة للحرارة القادرة على تحمل المعالجات الحرارية الممتدة التي تفسد طبيعة معظم البروتينات (ساكاي) وآخرون.، 1988). اليوم ، يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أسلوبًا قياسيًا يستخدم على نطاق واسع لتحليل جزيئات الحمض النووي وإنشاء جزيئات مؤتلفة جديدة.

تعد بوليميرات الحمض النووي الثابتة حرارياً مركزية في تفاعل البوليميراز المتسلسل. أول وصف لاستخدام PCR
بوليميريز DNA من بكتريا قولونية، والتي تم تغيير طبيعتها ويجب استبدالها بعد كل جولة
تخليق الحمض النووي (ساكاي وآخرون.، 1985). تم تحسين الإجراء كثيرًا عن طريق استبدال ملف E.
القولونية
بوليميراز مع بوليميريز DNA من ثيرموس أكواتيكوس، وهي بكتيريا تنمو
في الينابيع الحرارية في حديقة يلوستون الوطنية. ال T. aquaticus بوليميريز DNA ، أو طقالبوليميراز ، يعمل بشكل أفضل في درجات حرارة 70-75 & # 778 درجة مئوية ويمكنه تحمل الحضانة لفترات طويلة (ولكن ليس إلى أجل غير مسمى) في درجات حرارة أعلى من 90 & # 778 درجة مئوية دون تمسخ. في غضون بضع سنوات ،طق تم استنساخ البوليميراز وإفراط في التعبير عنه بكتريا قولونية، إلى حد كبير توسيع توافرها. اليوم ، زاد اختيار البوليميرات المتاحة لـ PCR بشكل كبير ، حيث تم التعرف على بوليمرات DNA جديدة في الكائنات الحية الأخرى المحبة للحرارة وتم إدخال تعديلات وراثية في طق البوليميراز لتحسين خصائصه.

يتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل جولات متعددة من تخليق الحمض النووي من طرفي مقطع الحمض النووي الذي يتم تضخيمه. تذكر ما يحدث أثناء تخليق الحمض النووي: إن التمهيدي قليل النوكليوتيد أحادي الشريطة يرتبط بالتسلسل التكميلي في الحمض النووي. توفر هذه المنطقة المزدوجة التي تقطعت بهم السبل
مرساة لبوليميراز الحمض النووي ، الذي يمد التمهيدي ، دائماالسفر في الاتجاه 5 و rsquo 3 و rsquo. يتحكم المحققون في مواقع البدء لتكرار الحمض النووي عن طريق توفير أليغنوكليوتيدات لتكون بمثابة مواد أولية للتفاعل (كما هو موضح أدناه من أجل الجين المفضل لديك Yfg). لتصميم بادئات PCR ، يحتاج الباحثون إلى معلومات تسلسل دقيقة لمواقع الربط التمهيدي في الحمض النووي المستهدف. (ملاحظة: معلومات التسلسل ليست مطلوبة للتسلسل الكامل الذي سيتم تضخيمه. غالبًا ما يتم استخدام PCR لتحديد التسلسلات التي تحدث بين موقعين معروفين للربط التمهيدي.) مطلوب اثنين من البادئات من أجل PCR. واحد التمهيدي يرتبط بكل خيط من حلزون الحمض النووي.

يبدأ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بفترة تمسخ لعدة دقائق ، يتم خلالها تحضين خليط التفاعل عند درجة حرارة عالية بما يكفي لكسر الروابط الهيدروجينية التي تمسك شريطي حلزون الحمض النووي معًا. يعتبر التمسخ الفعال أمرًا بالغ الأهمية ، لأن بوليميراز الحمض النووي يتطلب DNA أحادي الجديلة كقالب. يكون الجزء الأولي من التمسخ أطول من خطوات التمسخ اللاحقة ، لأن القوالب البيولوجية لـ PCR ، مثل الحمض النووي الجيني ، غالبًا ما تكون جزيئات طويلة ومعقدة مرتبطة ببعضها البعض بواسطة العديد من الروابط الهيدروجينية. في دورات PCR اللاحقة ، تصبح المنتجات (الأقصر) للدورات السابقة هي القوالب السائدة.

بعد التمسخ الأولي ، يتضمن PCR سلسلة من 30 إلى 35 دورة مع ثلاثة أجزاء ، يتم إجراؤها في درجات حرارة مختلفة. يتم تحضين تفاعلات PCR في معالجات حرارية تقوم بضبط درجة حرارة كتلة التفاعل المعدني بسرعة. تتضمن الدورة النموذجية:

  • خطوة تمسخ - عادة 94 & # 778C
  • خطوة التلدين التمهيدي - عادة 55 & # 778C
  • خطوة تمديد - عادة 72 & # 778C

تتضمن تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل دورات متعددة من التمسخ والصلب والتمديد.

تسلسل التمهيدي. تصبح بوليمرات الحمض النووي أكثر نشاطًا عند درجة حرارة الامتداد ، والتي تكون أقرب إلى درجة الحرارة المثلى. يقوم المحققون بتكييف درجات الحرارة وتوقيت الخطوات المذكورة أعلاه لاستيعاب مختلف البادئات والقوالب وبوليمرات الحمض النووي.

تتراكم منتجات PCR بالحجم المقصود بشكل كبير

يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الواقع تفاعلًا متسلسلًا ، حيث يتضاعف تسلسل الحمض النووي محل الاهتمام تقريبًا
مع كل دورة. في عشر دورات ، سيتم تضخيم التسلسل

1000 أضعاف (2 10 = 1024). في عشرين دورة ، سيتم تضخيم التسلسل

مليون ضعف. في ثلاثين دورة ، يمكن تضخيم التسلسل نظريًا

مليار ضعف. تتضمن تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في المختبر عادةً 30-35 دورة من التمسخ والصلب والتمديد. لفهم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من المهم التركيز على الدورات القليلة الأولى. تظهر منتجات PCR بالحجم المقصود أولاً في الدورة الثانية. يبدأ التضخيم الأسي لمنتج PCR المقصود في الدورة الثالثة.

خلال الدورة الأولى ، تقوم بوليميرات الحمض النووي بالحرارة بتجميع الحمض النووي ، مما يمدد نهايات 3 & rsquo من الاشعال. إن بوليميرات الحمض النووي هي إنزيمات معالجة تستمر في تصنيع الحمض النووي حتى تسقط حرفياً من الحمض النووي. وبالتالي ، فإن جزيئات الدنا التكميلية المركبة في الدورة الأولى لها أطوال متنوعة. ومع ذلك ، فقد حدد كل منتج موضع البداية ، لأنه يبدأ بالتسلسل التمهيدي. ستصبح هذه المتواليات & ldquoanchored & rdquo قوالب لتخليق الحمض النووي في الدورة التالية ، عندما تظهر منتجات PCR بالطول المقصود لأول مرة. سيستمر نسخ نموذج البداية لـ PCR في كل دورة لاحقة من PCR ، مما ينتج عنه منتجان جديدان & ldquoored & rdquo مع كل دورة. نظرًا لأن أطوال منتجات & ldquoanchored & rdquo متغيرة تمامًا ، ومع ذلك ، فلن يمكن اكتشافها في المنتجات النهائية لتفاعل PCR.

تظهر خيوط الحمض النووي ذات الطول المقصود أولاً خلال الدورة الثانية. النسخ المتماثل من أجزاء & ldquoanchored & rdquo يولد منتجات PCR بالطول المقصود. سيتضاعف عدد هذه الأجزاء ذات الطول المحدد في كل دورة جديدة وتصبح بسرعة المنتج السائد في التفاعل.

تتضمن معظم بروتوكولات PCR 30-35 دورة تضخيم. في الدورات القليلة الماضية ، لم تعد منتجات PCR المرغوبة تتراكم بشكل كبير لعدة أسباب. كما هو الحال في أي تفاعل إنزيمي ، استنفدت ركائز تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وبدأت جولات الحضانة المتكررة عند 94 درجة مئوية و 778 درجة مئوية في التآكل. طق بوليميراز.

التلدين التمهيدي أمر بالغ الأهمية لخصوصية PCR

يعد التصميم التمهيدي الجيد أمرًا بالغ الأهمية لنجاح PCR. يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل أفضل عندما تكون البادئات محددة للغاية للتسلسل المستهدف في قالب DNA. يحدث الخطأ في الفهم عندما ترتبط البادئات بتسلسلات مكملة جزئيًا فقط ، مما يتسبب في نسخ بوليميراز الحمض النووي لتسلسل الحمض النووي الخاطئ. لحسن الحظ ، عادة ما يكون المحققون قادرين على ضبط المعلمات التجريبية لزيادة احتمالية تهجين البادئات مع الأهداف الصحيحة.

عادة ما تكون بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عبارة عن أليغنوكليوتيدات اصطناعية يتراوح طولها بين 18 و 25 قاعدة. عند تصميم البرايمر ، يأخذ الباحثون في الاعتبار T.م، درجة الحرارة التي يتشكل عندها نصف الهجينة بين التمهيدي والقالب سوف تذوب. بشكل عام ، يزيد الاستقرار الحراري للهجين مع طول التمهيدي ومحتوى GC. (تذكر أن زوج GC-base قد استقر بثلاثة روابط H ، مقارنة باثنين لزوج AT.) توفر الصيغة التالية تقديرًا تقريبيًا لـ Tم من الهجينة قليل النوكليوتيد. في هذه الصيغة ، ن يشير إلى عدد النيوكليوتيدات ، ويتم التعبير عن تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ بوحدات المولي (M).


تطبيقات PCR

صحة الإنسان ومشروع الجينوم البشري

PCR هي أداة أساسية يمكن استخدامها لتحسين صحة الإنسان وحياته. في العلوم الطبية ، يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن الكائنات المعدية واكتشاف الطفرات في الجينات المختلفة. في حالة الكشف عن أمراض مثل الإيدز ، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لدراسة الحمض النووي للفيروس مباشرة وهو أكثر تحديدًا من الاكتشاف القياسي الذي تقوم به ELISA. علاوة على ذلك ، يتمتع تفاعل البوليميراز المتسلسل بإمكانيات عالية في تطبيق الكشف عن أمراض مثل مرض لايم ، حيث يمكنه تحديد وجود الحمض النووي البكتيري في علاج المفاصل بشكل مباشر. يستخدم PCR أيضًا للكشف عن هيليكوباكتيريوم بيلوري والأمراض الفيروسية المنقولة جنسيا. يشير مشروع الجينوم البشري إلى دراسة جميع الجينات البشرية. يلعب تفاعل البوليميراز المتسلسل دورًا مهمًا في هذا المشروع لأنه يساعد على تحديد جينات معينة إلى جانب الطفرات ومعدلات الطفرات في تلك الجينات.

البصمات الجينية

تُستخدم هذه التقنية في علم الطب الشرعي لمقارنة الحمض النووي لشخص ما بعينة معينة مثل عينة الدم الموجودة في مسرح الجريمة. قد تحتوي العينة على كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي. يأتي تطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل في هذا الجزء لتضخيم الكمية الصغيرة من الحمض النووي من عينات مثل الدم ، والسائل المنوي ، واللعاب ، والشعر ، وما إلى ذلك. يتم تحليل شظايا الحمض النووي المتضخم بعد ذلك بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام.

الكشف عن مرض وراثي

من الصعب فهم الأمراض الوراثية بسبب ارتباطها المباشر بالجينوم. يمكن تحليل هذه العملية المعقدة والصعبة بسهولة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن لـ PCR تضخيم الحمض النووي وباستخدام علامة محددة ، يمكن اكتشاف الجين المسؤول عن المرض. بصرف النظر عن ذلك ، يمكن أيضًا تحليل معدل الطفرة في هذا الجين المحدد باستخدام PCR.

لاستنساخ الجينات تطبيقات مختلفة في المقياس الصناعي والمختبر ويمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لاستنساخ جينات معينة. عندما يحتاج جين معين إلى الاستنساخ ، يتم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الجين. ثم يتم إدخاله في ناقل ثم يتم نقل الجين إلى مزيد من الجين داخل الخلية. لذلك ، يلزم PCR لإكمال دراسات استنساخ الجينات.

تحليل الحمض النووي القديم

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في تحليل الحمض النووي القديم. على سبيل المثال ، يمكن تضخيم الحمض النووي المعزول من المومياوات المصرية في تفاعل البوليميراز المتسلسل لمزيد من الدراسات وتحديد هوية الشخص. يمكن استخدام الجين للمقارنة مع الجين في الآونة الأخيرة ويمكن أيضًا إجراء التحليل التطوري.


هيكل بوليميراز الحمض النووي ζ: التقاط السائق المهرب

أثناء توليف translesion ، ينفذ بوليميريز DNA حقيقي النواة ζ التمديد من مجموعة واسعة من آفات الحمض النووي. يوضح توضيح بنية البوليميراز المبردة ζ كيف يحفز الإنزيم تخليق خيوط الحمض النووي خارج الآفة.

توليف التحويل (TLS) هو مسار معرض للخطأ في الغالب تستخدمه الخلايا لتجاوز تلف الحمض النووي الذي يمنع تكرار الحمض النووي الطبيعي 1،2،3،4،5،6. أثناء TLS ، يتم استبدال بوليميراز الحمض النووي المتكاثر المتوقف بواحد أو أكثر من بوليميرات TLS المتخصصة ، والتي تنفذ النسخ المتماثل من خلال آفة الحمض النووي. في كثير من الحالات ، تتطلب TLS اثنين من البوليمرات المتخصصة: "الواصل" ، لدمج النيوكليوتيد عبر آفة الحمض النووي ، و "الموسع" ، لتحفيز المزيد من تركيب خيوط الحمض النووي. إن بوليميراز "الموسع" الأساسي في حقيقيات النوى هو بوليميريز DNA (Pol) ζ 7. بينما تم تنقية هذا الإنزيم لأول مرة منذ ما يقرب من خمسة وعشرين عامًا 8 ، إلا أن الدراسات الهيكلية لم تنجح ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى عدم القدرة على الحصول على كميات كافية من البروتين لتصوير البلورات بالأشعة السينية. الآن ، مالك وآخرون. 9 تقرير عن بنية cryo-EM لـ Pol from خميرة الخميرةه ووصف الميزات الهيكلية التي تسمح لها بتحفيز خطوة تمديد TLS.


وظيفة بوليميراز الحمض النووي الريبي

بوليميراز الحمض النووي الريبي هو أهم إنزيم في عملية النسخ. تذكر أن النسخ هو عملية نسخ الحمض النووي مزدوج الشريطة إلى خيط واحد من الحمض النووي الريبي. قد يبدوان مختلفين قليلاً ، لكن كلاهما مكتوب بلغة النيوكليوتيدات. لكي يبدأ بوليميراز الحمض النووي الريبي عمله ، يجب أن يجد أولاً المناسب منطقة المروج. يمكن استهداف هذه المنطقة بواسطة عوامل النسخ في حقيقيات النوى. ترتبط هذه البروتينات بالموقع ، مما يخلق ترتيبًا مناسبًا لـ RNA polymerase لربط وبدء النسخ. في البكتيريا ، يوجد مروج واحد فقط ، وهو عامل بدء سيجما. يمكن رؤية هذه العملية مع جزيء بلمرة RNA المعمم الموضح أدناه نسخ DNA. لا تظهر عوامل النسخ.

عندما يرتبط RNA polymerase بالحمض النووي DNA ، فإنه يتغير التشكل، أو الشكل. يبدأ هذا التفاعل المتسلسل الإنزيمي الذي ينمي سلسلة جديدة من النيوكليوتيدات إلى جزيء RNA قائم على النموذج المقدم. بعد أن ينتج RNA polymerase هذا الجزيء الجديد ، يجب معالجة RNA وإطلاقه من نواة. ينادى الآن رسول RNA، أو mRNA ، سيواجه الريبوسوم الذي يمتلك الآليات المناسبة لعملية ترجمة.

مثل الترجمة من الإنجليزية إلى الإسبانية ، يجب على الريبوسوم "قراءة" تسلسل الحمض النووي الريبي وتحويل الرسالة إلى لغة أحماض أمينية. تشكل هذه الجزيئات الصغيرة سلاسل طويلة ، والتي تنثني إلى أشكال معقدة لتصبح بروتينات نشطة كيميائيًا حيويًا. تقوم هذه البروتينات بدورها بإنشاء أجزاء من الحمض النووي والحفاظ عليها ، فضلاً عن تكرار الحمض النووي. تقوم أجزاء من الحمض النووي بتخزين المعلومات الجينية لبروتين RNA polymerase نفسه ، والذي يتم فك تشفيره أولاً بواسطة جزيء RNA polymerase. هذا الموقف هو حقًا أساس الدجاجة والبيضة إذا فكرت في الأمر.


مرحلة الإنجاز من النسخ المتماثل: DNA Polymerase I

بمجرد أن يزاوج DNA Polymerase III غالبية النوكليوتيدات D التكميلية على الخيط المتطور والمتأخر ، لا تزال بادئات RNA موجودة. إنزيم بوليميريز DNA آخر ، بوليميريز الحمض النووي أنا يقرأ كل من السلاسل الرائدة والمتأخرة من 5 "إلى 3" من السلاسل الأبوية لتحل محل النيوكليوتيدات R مع نيوكليوتيدات D. بينما يتم تصنيع الخيط الرئيسي بشكل مستمر ، لا يزال هناك RNA تمهيدي في أصل فقاعة النسخ. يتم استبداله أيضًا بـ DNA Polymerase I.

مرحلة الإنجاز من النسخ المتماثل: ليجاس

بعد استبدال DNA Polymerase I ببادئات RNA ، لا يوجد ارتباط فسفوديستر بين شظايا Okazaki. إنزيم آخر يجاز، ينتقل عبر الخيط المتأخر مكونًا رابط الفوسفوديستر الذي يربط شظايا أوكازاكي.

يربط Ligase شظايا Okazaki معًا.

مرحلة الإنجاز من النسخ المتماثل: تيلوميراز

في بدائيات النوى ، بمجرد الانتهاء من توصيل الليغاز بشظايا أوكازاكي ، يتم تكرار الحمض النووي بنجاح. هذا يرجع إلى الشكل الدائري للحمض النووي الخاص بهم. ومع ذلك ، فإن الحمض النووي حقيقي النواة خطي. وهذا يمثل مشكلة في الخيط المتأخر. في نهاية الكروموسومات ، والمعروفة باسم التيلوميرات، لا يوجد مكان للاتصال DNA Polymerase III بسبب عدم وجود RNA التمهيدي. إذا تركت هذه النيوكليوتيدات D الموجودة في التيلوميرات غير مركبة ، فإن خيوط الحمض النووي ستصبح في النهاية أقصر مع كل تكرار. يُعتقد أن الشيخوخة هي نتاج خلل في الإنزيم تيلوميراز.

يمتد التيلوميراز نهايات (التيلوميرات) من الخيط المتأخر.

التيلوميراز هو إنزيم يرتبط بالطرف غير المركب من الخيط المتأخر ويحفز تخليق الحمض النووي من قالب الحمض النووي الريبي الخاص به ، على غرار الهندسة العكسية. في أحد طرفي الإنزيم تيلوميراز ، تتحد بضع نيوكليوتيدات R مع نهاية الخيط غير المتماثل. ثم يضيف تيلوميراز D-nucleotides إلى نهاية الخيط المتأخر.

الأطراف المقابلة للإنزيم تيلوميراز متطابقة. ينتهي الجانب الآخر من الإنزيم تيلوميراز (إذا قرأت من اليسار إلى اليمين) بنفس نيوكليوتيدات R (AUU). يستخدم التيلوميراز هذه الظاهرة للفصل بمجرد تمديد الخيط المتأخر ثم إعادة ربطه مرة أخرى بنهاية الشريط المتأخر الممتد. يقوم الإنزيم تيلوميراز المعاد توصيله بتكرار نسخة مطابقة أخرى إلى الشريط المتأخر. تحدث هذه العملية عدة مرات ويتم إزالة الإنزيم تيلوميراز في النهاية.

بمجرد أن يطيل الإنزيم تيلوميراز الخيط الأبوي المتأخر ، يربط بريماز توليف تمهيدي RNA ، والذي يسمح لـ DNA Polymerase III بتكرار النيوكليوتيدات D المتبقية على الشريط غير المكرر. يدمج Ligase الجزء الأخير المتبقي من خلال إنشاء رابط الفوسفوديستر النهائي. ينتج عن هذا نسختان دقيقتان من الحمض النووي الأصلي مع تيلوميرات أطول قليلاً.

اصلاح الاخطاء

إن DNA Polymerase III دقيق للغاية. يعمل بوليميراز DNA آخر كقارئ إثبات ، بوليميريز DNA II. بمجرد اكتمال النسخ المتماثل ، ينتقل DNA Polymerase II عبر الرابط الكامل لخيوط DNA الأبوية بحثًا عن أزواج قاعدة غير متطابقة. بمجرد اكتشاف عدم التطابق ، يقوم DNA Polymerase II بإزالة D-nucleotide من خيط DNA الجديد واستبداله بـ D-nucleotide المكمل للشريط الأبوي.

ومع ذلك ، حتى خطوة التدقيق اللغوي هذه ليست دقيقة تمامًا ، فقد يحدث فقدان زوج أساسي غير متطابق تقريبًا مرة واحدة كل مليار مرة. تؤدي هذه الأخطاء إلى حدوث طفرات على مستوى النوكليوتيدات. هذه الطفرات هي الطريقة الوحيدة التي يتم من خلالها تكوين الأليلات الجديدة ، وعادة ما تكون محايدة أو ضارة بالنسبة إلى اللياقة. في بعض الأحيان ، ستخلق هذه الطفرات أنماطًا ظاهرية مفيدة تسمح لهذه الكائنات الحية باحتمال أكبر للبقاء والتكاثر. تميل هذه الطفرات إلى التضخيم في الأجيال القادمة بسبب الانتقاء الطبيعي.


تفاعل البلمرة المتسلسل

سيراجع محررونا ما قدمته ويحددون ما إذا كان ينبغي مراجعة المقالة أم لا.

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، وهي تقنية تستخدم لعمل نسخ عديدة من جزء معين من الحمض النووي بسرعة وبدقة. يتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل للباحثين الحصول على كميات كبيرة من الحمض النووي اللازمة للتجارب والإجراءات المختلفة في البيولوجيا الجزيئية ، وتحليل الطب الشرعي ، وعلم الأحياء التطوري ، والتشخيص الطبي.

تم تطوير PCR في عام 1983 من قبل Kary B. Mullis ، عالم الكيمياء الحيوية الأمريكي الحائز على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993 لاختراعه. قبل تطوير تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كانت الطرق المستخدمة لتضخيم أو إنشاء نسخ من شظايا الحمض النووي المؤتلف تستغرق وقتًا طويلاً وتتطلب جهدًا كثيفًا. في المقابل ، يمكن لآلة مصممة لتنفيذ تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أن تكمل عدة جولات من النسخ ، وتنتج مليارات النسخ من جزء من الحمض النووي ، في غضون ساعات قليلة فقط.

تعتمد تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل على العمليات الطبيعية التي تستخدمها الخلية لتكرار خيط DNA جديد. هناك حاجة إلى عدد قليل من المكونات البيولوجية فقط لـ PCR. المكون المتكامل هو قالب الحمض النووي - أي الحمض النووي الذي يحتوي على المنطقة المراد نسخها ، مثل الجين. يمكن لجزيء DNA واحد أن يعمل كقالب. المعلومات الوحيدة اللازمة لتكرار هذا الجزء هي تسلسل منطقتين قصيرتين من النيوكليوتيدات (الوحدات الفرعية للحمض النووي) في أي من طرفي منطقة الاهتمام. يجب أن يكون هذان التسلسلان القصيران للقالب معروفين بحيث يمكن تصنيع اثنين من البادئات - امتدادات قصيرة من النيوكليوتيدات التي تتوافق مع تسلسل القالب -. ترتبط المواد الأولية بالقالب الموجود في مواقعها التكميلية أو تصلبها وتكون بمثابة نقطة انطلاق للنسخ. يتم توجيه تخليق الحمض النووي في أحد التمهيديين نحو الآخر ، مما يؤدي إلى تكرار التسلسل المتداخل المطلوب. هناك حاجة أيضًا إلى النيوكليوتيدات الحرة المستخدمة لبناء خيوط DNA الجديدة و DNA polymerase ، وهو إنزيم يقوم بالبناء عن طريق الإضافة المتسلسلة للنيوكليوتيدات الحرة وفقًا لتعليمات النموذج.

PCR هي عملية من ثلاث خطوات يتم تنفيذها في دورات متكررة. الخطوة الأولى هي تمسخ أو فصل خيطي جزيء الحمض النووي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تسخين مادة البداية إلى درجات حرارة تبلغ حوالي 95 درجة مئوية (203 درجة فهرنهايت). كل خصلة عبارة عن قالب يُبنى عليه خصلة جديدة. في الخطوة الثانية ، تنخفض درجة الحرارة إلى حوالي 55 درجة مئوية (131 درجة فهرنهايت) بحيث يمكن أن تصلب المواد الأولية إلى القالب. في الخطوة الثالثة ، يتم رفع درجة الحرارة إلى حوالي 72 درجة مئوية (162 درجة فهرنهايت) ، ويبدأ بوليميريز الحمض النووي في إضافة نيوكليوتيدات إلى نهايات البادئات الملدنة. في نهاية الدورة التي تستغرق حوالي خمس دقائق ، ترتفع درجة الحرارة وتبدأ العملية مرة أخرى. يتضاعف عدد النسخ بعد كل دورة. عادة ما تنتج 25 إلى 30 دورة كمية كافية من الحمض النووي.

في إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الأصلي ، كانت إحدى المشكلات تتمثل في ضرورة تجديد بوليميريز الحمض النووي بعد كل دورة لأنه غير مستقر عند درجات الحرارة المرتفعة اللازمة للتمسخ. تم حل هذه المشكلة في عام 1987 باكتشاف بوليميراز DNA مستقر الحرارة يسمى طق ، إنزيم معزول من البكتيريا المحبة للحرارة ثيرموس أكواتيكوسالتي تسكن الينابيع الساخنة. طق أدى البوليميراز أيضًا إلى اختراع آلة PCR.

نظرًا لأنه يمكن تضخيم الحمض النووي من مجموعة واسعة من المصادر ، فقد تم تطبيق هذه التقنية في العديد من المجالات. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتشخيص الأمراض الوراثية واكتشاف المستويات المنخفضة من العدوى الفيروسية. في الطب الشرعي ، يتم استخدامه لتحليل الآثار الدقيقة للدم والأنسجة الأخرى من أجل التعرف على المتبرع من خلال "بصمة الإصبع" الجينية. تم استخدام هذه التقنية أيضًا لتضخيم شظايا الحمض النووي الموجودة في الأنسجة المحفوظة ، مثل تلك الموجودة في ماموث صوفي مجمد عمره 40 ألف عام أو لإنسان عمره 7500 عام تم العثور عليه في مستنقع الخث.

تمت مراجعة هذه المقالة وتحديثها مؤخرًا بواسطة Erik Gregersen ، محرر أول.


ما هي وظيفة DNA بوليميراز؟

يتطلب تكرار الحمض النووي تفكيك البنية التكميلية ثنائية الشريطة للحمض النووي. يتم التوسط في هذه العملية من خلال فصل الروابط الهيدروجينية التي تربط القواعد معًا ، والنتيجة هي تكوين خيطين منفصلين.

يُطلق على المظهر الناتج على شكل Y في هذه المنطقة من الحمض النووي شوكة النسخ المتماثل. يحدث بدء النسخ المتماثل في مواقع محددة تسمى أصل النسخ المتماثل (ORI). بعد إنشاء مفترق النسخ المتماثل هو repisome ، العديد من العوامل التي تمكن النسخ المتماثل.

تعد بوليميرات الحمض النووي أحد هذه العوامل الحاسمة. إنها إنزيمات متعددة الوحدات الفرعية تشارك في عملية تكرار الحمض النووي في الخلية. إنها تحفز إضافة النيوكليوتيدات إلى خيوط الحمض النووي الموجودة. هناك العديد من عائلات بوليميراز الحمض النووي التي تلعب دورًا في تكرار الحمض النووي ، وهناك ما لا يقل عن 15 في البشر وهي مطلوبة في نقاط مختلفة أثناء العملية.

وظيفة البوليميراز أثناء تكرار الحمض النووي

تعمل إنزيمات بوليميريز الحمض النووي عادةً بطريقة زوجية ، حيث يقوم كل إنزيم بتكرار أحد الخيطين اللذين يشتملان على الحلزون المزدوج للحمض النووي. وتسمى هذه الخيط الرئيسي والخيط المتأخر ويتم تسميتها وفقًا للسرعة النسبية التي يتم تكرارها بها.

يتم تصنيع الخيوط المنسوخة باستخدام السلاسل الأولية والمتأخرة كقوالب. وبالتالي ، فإن جزيئي الحمض النووي الجديد مزدوج الشريطة المنتجين يتكونان من خيط واحد من اللولب الأصلي (إما الشريط الرئيسي أو المتأخر) وخيط واحد جديد. تسمى هذه العملية النسخ شبه المحافظ وهي ضرورية لأنها تسمح بنقل المعلومات الجينية من جيل إلى جيل.

يتم تنسيق أنشطة كل من بوليميراز الحمض النووي بواسطة هيكلين يسمى محمل المشبك المنزلق والمشبك المنزلق. The sliding clamp loader contacts single-stranded binding proteins that coat the separated helix as well as the sliding clamp.

Two sliding clamps encircle the two strands of DNA, and together with accessory proteins called the clamp loader complex, provide a stable binding site for the two DNA polymerases. The unwound single-stranded DNA templates move toward the complex the behavior of the clamp loader on the leading and lagging strand differ because of a property called directionality.

This is determined by the orientation of the phosphate bond and characterized by the conventions 5’ to 3’ and 3’ to 5’. Each of the two strands of the helix necessarily possess opposite directionality this is essential for base pairing to occur. Their pairing is also referred to as antiparallel.

DNA polymerase synthesizes only in a 5′ to 3′ direction. Consequently, the strand with the complementary 3’ to 5’ directionality, the leading strand, is synthesized as one continuous piece. Conversely, the strand with 5’ to 3’ directionality is synthesized as a series of small fragments called Okazaki fragments.

The lagging strand orientation of 5’ to 3’ is incompatible with DNA polymerase to accommodate this requirement, the clamp loader must continually release and reattach at a new location. This requires the lagging strand to bubble out from the replisome.

Polymerases for DNA repair

Several polymerases exist in both prokaryotes and eukaryotes. They provide polymerase activity under two broad categories normal replication and repair. Under conditions of normal replication, DNA polymerase corrects errors by 3′ → 5′ exonuclease activity.

Outside of normal replicative events, DNA repair is an ongoing process that is necessary to maintain the integrity of the genome. Both endogenous and exogenous insults result in damaged DNA for example, single-strand and double-strand breaks, strand cross-linking, base loss, and base modification.

Multiple pathways exist to repair these DNA damage events in a selective manner. These include mismatch repair, nucleotide excision repair, base excision repair, double-strand break repair, and inter-strand cross-link repair. The biochemical difference that exists between these polymerases allows them to fulfill distinct roles under these specific conditions of repair.


شاهد الفيديو: الوحدة الاولى: تركيب البروتين #4#دورانزيم ARN بوليميراز3علوم تجريبية. الاستاذ:رزقي رابح (كانون الثاني 2022).