معلومة

ارتفاع معدل دوران البروتين ومثبطات الأنزيم البروتيني؟


أنا أعمل مع الفئران ، وأريد أن أرى ما يحدث لبعض البروتينات المحددة في دماغ الفأر بعد حقن IL-1b (داخل البطيني).

لدي مشكلة: عندما أقيس مستويات الرنا المرسال والبروتين ، أرى أن هناك بعض الاختلافات بينهما.

يمكن أن يكون مثل: بروتين مرنا (منظم) (لا فرق)

هل من الممكن أن يكون لهذه البروتينات معدل دوران مرتفع؟ إذا كان الأمر كذلك ، كيف يمكنني منع ذلك؟

هل يمكنني (إذا كان ذلك ممكنًا) حقن IL-1b (داخل البطيني) ممزوجًا بمثبطات الأنزيم البروتيني؟


وجد العلماء مؤخرًا (أو يقبلون الفكرة) أن تعبير الرنا المرسال ، على الأقل في حقيقيات النوى ، مرتبط بشكل ضعيف بتعبير البروتين. هناك العديد من العوامل التي تؤثر على تنظيم الترجمة ، مثل siRNA أو microRNAs ، وعزل mRNAs أثناء نقلها إلى حجرات خلوية مختلفة ، وغيرها. حتى بعد تصنيع البروتين ، يمكن أن تكون هناك عوامل تتداخل مع مراسل التعبير الخاص بك. وكما ذكرت ، قد يتحلل بشكل أسرع مما تتوقع. تحاول الخلايا الحفاظ على البروتينات عند مستويات تعبير معينة ، لذلك إذا كان IL-1b يعزز التعبير دون تثبيط مسار التحلل ، فقد يؤدي التحلل إلى زيادة السرعة لإعادة المستويات إلى وضعها الطبيعي.

تجربة بعض مثبطات الأنزيم البروتيني تستحق التجربة ، لأنها بسيطة جدًا بحد ذاتها. يجب أن يزيد أيضًا من تعبير البروتين الخاص بك بغض النظر عما إذا كان تدهور البروتين هو العامل المحدد لك. إذا لم يفلح ذلك ، أو إذا كان التضحية بالفئران أمرًا باهظًا للغاية أثناء العمل على بروتوكول (وعادة ما يكون كذلك) ، فسأنتقل إلى مزارع الخلايا وأحاول تمييز المكان الذي يتم حظره. هذا النوع من المعلومات سوف يصنع عمومًا ورقة PNAS لائقة في حد ذاته.


الأدوية المثبطة للبروتيازوم

البروتيازومات عبارة عن مجمعات بروتينية كبيرة متعددة التحفيز تشق البروتينات الخلوية إلى ببتيدات. هناك العديد من الأشكال المتميزة من البروتيازومات التي تختلف في الوحدات الفرعية النشطة تحفيزيًا والوحدات الفرعية التنظيمية والبروتينات المرتبطة بها. تُعد مثبطات البروتوزوم فئة مهمة من الأدوية لعلاج الورم النقوي المتعدد وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح ، ويتم فحصها بحثًا عن أمراض أخرى. كان Bortezomib (Velcade) أول مثبط للبروتوزوم تمت الموافقة عليه من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية. تمت الموافقة مؤخرًا على Carfilzomib (Kyprolis) و ixazomib (Ninlaro) ، وهناك المزيد من الأدوية قيد التطوير. في حين أن الآلية الأساسية للعمل هي تثبيط البروتيازوم ، فإن الأحداث النهائية التي تؤدي إلى موت الخلايا الانتقائي ليست واضحة تمامًا. تم العثور على مثبطات البروتوزوم تؤثر على دوران البروتين ولكن بتركيزات أعلى بكثير من تلك التي تم تحقيقها سريريًا ، مما يزيد من احتمال أن بعض تأثيرات مثبطات البروتوزوم يتم توسطها بواسطة آليات أخرى.


الملخص

يتم تنظيم التنوع الوظيفي والمكاني والزمني الهائل للبروتين النباتي من خلال عوامل متعددة تعمل باستمرار على تعديل وفرة البروتين والتعديلات والتفاعلات والتوطين والنشاط لتلبية الاحتياجات الديناميكية للنباتات. يجذب تشريح التعقيد البروتيني والتنوع الجيني الكامن وراءه اهتمامًا متزايدًا بالبحث. أصبحت البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) نهجًا قويًا في الدراسة العالمية لوظائف البروتين وعلاقاتها على مستوى الأنظمة. هنا ، نراجع الإنجازات والاستراتيجيات الحديثة المعتمدة لكشف تنوع البروتينات ، مع التركيز بشكل خاص على الطرق المستخدمة لتحليل تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) ، وتوطين البروتين ، وتنظيم البروتينات في وحدات وظيفية. نحن نعتبر أيضًا تداخل PTM والعديد من PTMs التي تنظم مؤقتًا دورة حياة البروتينات. أخيرًا ، نناقش الدراسات الكمية الحديثة باستخدام MS لقياس معدلات دوران البروتين ودراسة الاتجاهات المستقبلية في دراسة البروتين النباتي.


نتائج

تأثير الأدوية المعطلة للأكتين في الخميرة

اختبرنا تأثير ستة عقاقير معطلة للأكتين على نمو النوع البري S. cerevisiae عن طريق سحب تركيزات مختلفة من الأدوية على أقراص الترشيح التي تم وضعها بعد ذلك على المروج الوليدة لخلايا الخميرة من النوع البري. Cytochalasin B (انظر Cooper ، 1987 ، والمراجع الواردة فيه) ، و jasplakinolide (Bubb et al. ، 1994 Senderowicz et al. ، 1995) ، و swinholide-A (Bubb et al. ، 1995) لم تتسبب في مناطق من النمو المثبط في أي مكان. تم اختبار التركيز (1 ميكرومتر - 1 ملي مولار الجدول الثاني). ومع ذلك ، فإن الخلايا التي يكون فيها ملف ERG6 تم حذف الجين (Δerg6) لزيادة نفاذية الخلية (Gaber et al. ، 1989) ، كانت حساسة لـ swinholide-A (الجدول 3). بالإضافة إلى ذلك ، عندما يكون ملف Δerg6 تم تعريض الخلايا لـ 500 ميكرومتر من swinholide-A في التعليق ، فُقدت جميع الهياكل الخيطية الأكتين (F-actin) التي يمكن اكتشافها بواسطة تلطيخ رودامين-فالويدين بسرعة (البيانات غير معروضة).

تسبب كل من LAT-A و LAT-B و mycalolide-B في مناطق من النمو المثبط في مروج الخلايا من النوع البري (الجدول الثالث) وكلها عطلت الهيكل الخلوي الأكتين (غير موضح). استخدمنا LAT-A للدراسات اللاحقة لأن آليتها المبلغ عنها لتثبيط تجميع الأكتين ، عبر ربط مونومر الأكتين وعزله (Coué et al. ، 1987) ، كانت الأنسب لأهداف دراساتنا (انظر أدناه) ، ولأن الخميرة كانت أكثر حساسية. إلى LAT-A من LAT-B. الخلايا ثنائية الصبغية أكثر حساسية بقليل (1.7 ضعفًا) من الخلايا أحادية الصيغة الصبغية المتجانسة إلى LAT-A (البيانات غير معروضة) ، وتظهر كل من الخلايا أحادية الصيغة الصبغية والمزدوجة الصبغية اختلافًا بنسبة 15٪ في الحساسية تجاه LAT-A بين 14 درجة مئوية و 37 درجة مئوية. أخيرًا ، تسبب كل من LAT-A و LAT-B و mycalolide B في تثبيط نمو الخميرة الانشطارية شيزوساكارومايس بومب (الجدول الثالث).

تأثير LAT-A على الهيكل الخلوي أكتين في S. cerevisiae

لتحديد تأثير LAT-A على الأكتين نفسه بدلاً من تأثيره على نمو الخلايا على الصفائح ، أضفنا الدواء إلى الخلايا المعلقة عند أدنى تركيز تتشكل به الهالة. تم استخدام الخلايا ثنائية الصبغة لهذا التوصيف لأنها أكبر حجمًا ، مما يسهل تصور هياكل الأكتين. بعد 15 دقيقة أو ساعتين من حضانات خلايا طور السجل في 200 ميكرومتر LAT-A (أو حجم مكافئ من DMSO ، مذيبنا لـ LAT-A ، كعنصر تحكم) عند 25 درجة مئوية ، تم إصلاح عينات لـ Rd-phalloidin تلطيخ الهياكل الأكتينية الخيطية. لم تشاهد أي هياكل أكتين في الخلايا في أي من النقطتين الزمنيتين (انظر الشكل 1 من أجل ر = 2 ح ر = 15 دقيقة ، البيانات غير معروضة) مما يشير إلى أن LAT-A قد تسبب في حدوث اضطراب كامل في الهيكل الخلوي للأكتين. قمنا أيضًا بتلوين هذه الخلايا بالأجسام المضادة للتوبيولين ولاحظنا المغازل الانقسامية الطبيعية والأنابيب الدقيقة السيتوبلازمية في الخلايا المعالجة بـ LAT-A مما يشير إلى أن الهيكل الخلوي التوبولين لم يتأثر بشكل كبير بالدواء (البيانات غير معروضة).

تشير حركيات تأثير LAT-A إلى ارتفاع معدل دوران خيوط الأكتين

لتحديد معدل اضطراب الهيكل الخلوي للأكتين ، تمت إضافة LAT-A إلى الخلايا وتم تثبيت العينات في نقاط زمنية من 1-15 دقيقة بعد الإضافة. تم تلطيخ الخلايا بعد ذلك باستخدام Rd-phalloidin لمراقبة هياكل F-actin. تم تحديد النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على كبلات الأكتين أو بقع الأكتين القشرية (الشكل 1 ،ج). كما لوحظ ما إذا كانت الهياكل القشرية مستقطبة داخل الخلية. اختفت كبلات الأكتين بسرعة مع وجود 5 ٪ فقط من الخلايا التي تحتوي على أي كبلات يمكن ملاحظتها بعد دقيقة واحدة. لم يتم رؤية أي كابلات بعد دقيقتين. لوحظ وجود بقع قشرية في 5٪ فقط من الخلايا بعد 5 دقائق وفي 1٪ من الخلايا بعد 10 دقائق. ومن المثير للاهتمام ، أن العديد من البقع بدت وكأنها خالية من الاستقطاب قبل أن يتم تفكيكها بالكامل. تبين أيضًا أن تأثير LAT-A قابل للعكس تمامًا مع الخلايا التي تتطلب 60 دقيقة لاستعادة الهيكل الخلوي الطبيعي للأكتين المستقطب (الشكل 1). د).

تشير السرعة التي تتفكك بها خيوط الأكتين في الخميرة المعالجة بـ LAT-A إلى أن خيوط الأكتين تتحول بسرعة كبيرة في خلايا الخميرة الحية. ومع ذلك ، يستند هذا الاستنتاج إلى افتراض أن LAT-A يثبط التجميع عن طريق الارتباط بمونومرات الأكتين وليس عن طريق التسبب في التفكيك من خلال آلية مثل قطع الشعيرات. تم الإبلاغ عن سطرين من الأدلة بواسطة Coué et al. (1987) اقترح أن LAT-A يرتبط بمونومرات أكتين لتشكيل مجمع غير كفء. الأول كان ملاحظة التأخر الحركي في البلمرة الذي زاد مع زيادة تركيز LAT-A. والثاني هو أنه في الحالة المستقرة ، كانت مستويات F-actin المجمعة في وجود تركيزات متفاوتة من LAT-A متسقة مع تكوين 1: 1 LAT-A: مجمع أكتين غير قادر على التجميع.

كررنا تحليل Coué et al. (1987) مع أكتين الخميرة وحصلت على نتائج مماثلة (غير معروضة). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا باحتضان خيوط F-actin أسفل التركيز الحرج للبلمرة في وجود LAT-A (أو DMSO) ورصدنا مستويات F-actin عن طريق تشتت الضوء. إذا كان LAT-A قادرًا على تعزيز التفكيك بنشاط عبر آلية مثل القطع ، لكنا نتوقع أن ينخفض ​​مستوى F-actin بشكل كبير عند احتضانه مع الدواء بموجب بروتوكولنا التجريبي (انظر Bubb et al. ، 1995) ، ولكن لم نلاحظ هذا. بدلاً من ذلك ، اكتشفنا انخفاضًا تدريجيًا في مستويات F-actin ، بمعدل أكبر قليلاً فقط من عنصر التحكم (البيانات غير معروضة). أكدت هذه البيانات أن LAT-A يثبط التجميع عن طريق تكوين مركب غير كفء مع أكتين الخميرة الأحادية ، وأنه لا يشجع التفكيك بنشاط.

خصوصية تأثير LAT-A

نظرًا لأن LAT-A أتاح الفرصة لأول مرة لتحديد عواقب النقص التام في الأكتين الخيطي في الخميرة ، كان من الضروري أولاً إثبات خصوصية الدواء في خلايا الخميرة الحية. لإثبات خصوصية LAT-A ، استفدنا من مجموعة متجانسة من طفرات الأكتين التي تم إنشاؤها بواسطة مسح الطفرات المشحونة إلى الألانين لـ قانون 1، جين الأكتين التقليدي الوحيد الخميرة (ويرتمان وآخرون ، 1992). يعبر كل أليل في المجموعة عن شكل متحور من الأكتين باعتباره المصدر الوحيد للأكتين في الخلية. تم استخدام المجموعة ، التي تضم 23 سلالة قابلة للحياة ، سابقًا لرسم خرائط لمواقع الربط على سطح الأكتين من أجل phalloidin (Drubin et al. ، 1993) ، من أجل خميرة فيمبرين (Holtzman et al. ، 1994) ، ولعدة أخرى مرتبطة بالأكتين. البروتينات (Amberg et al. ، 1995). تمت مقارنة حساسيات LAT-A لجميع السلالات في المجموعة باستخدام اختبار الهالة. الصورة 2، ميلادي يُظهر فحوصات الهالة للعديد من السلالات في المجموعة لتوضيح الاختلاف في الحساسية بين الأليلات. بالإضافة إلى ذلك ، تمت مقارنة حساسية LAT-A لكل أليل بحساسية الخلايا التي تحتوي على أكتين من النوع البري. تظهر هذه المقارنة بيانياً في الشكل 2 ه.

يوضح الرسم البياني بوضوح أن هناك تباينًا كبيرًا في استجابة الأليلات المختلفة لـ LAT-A. الملاحظة الأولى هي أن حساسية LAT-A لا ترتبط بحساسية الملح أو الحرارة (الأنماط الظاهرية التي وصفها Wertman et al. ، 1992). لذلك ، ليس الأمر ببساطة أن السلالات الأكثر مرضًا هي الأكثر حساسية تجاه LAT-A. في الواقع ، واحدة من أكثر السلالات المرضية في المجموعة ، قانون 1-112، التي يمكن أن تنمو فقط بين 20 درجة مئوية و 30 درجة مئوية ، ولها نمو محدود للغاية على الوسائط المحتوية على الملح ، فهي في الواقع مقاومة لـ LAT-A. إجمالاً ، كانت هناك أربع سلالات في مجموعة الطفرات التي أظهرت بعض المقاومة لـ LAT-A. قانون 1-119 كان مقاومًا جزئيًا ، بينما قانون 1-112, قانون 1-113، و قانون 1-117 أظهر مقاومة كاملة على جميع مستويات LAT-A التي تم اختبارها. أظهرت المسوخات الثلاثة التي كانت مقاومة تمامًا لـ LAT-A تباينًا في الخصائص المظهرية الإجمالية الأخرى. كما ذكرنا سابقًا ، فإن الخلايا التي تحمل قانون 1-112 الطفرة مريضة للغاية مع نطاق محدود للغاية من درجات الحرارة للنمو. سلالة أخرى ، معربا عن الطفرة قانون 1-113، يُظهر حساسية طفيفة لدرجات الحرارة ويُظهر أيضًا حساسية للملح في درجات حرارة منخفضة. السلالة الثالثة معبرة قانون 1-117، سلالة من النوع البري الزائف لأنها يمكن أن تنمو تحت نفس ظروف درجة الحرارة وتركيز الملح مثل خلايا النوع البري (Wertman et al. ، 1992).

كان وجود أليلات الأكتين التي تظهر مقاومة LAT-A في خلفية متجانسة دليلًا قويًا جدًا على أن LAT-A كان يعمل بطريقة محددة جدًا على الأكتين في خلايا الخميرة. ومع ذلك ، كان التحذير الأخير هو أن طفرات الأكتين الثلاثة هذه قد تضعف آليات الامتصاص العامة لعقاقير مثل LAT-A. أشارت فحوصات هالو التي أجريت باستخدام عقارين آخرين ، mycalolide-B و swinholide-A ، إلى أنه من غير المحتمل أن يكون هذا هو الحال. مع mycalolide-B ، قانون 1-113 و قانون 1-117 أظهرت الخلايا حساسية مماثلة للخلايا من النوع البري ، و قانون 1-112 كانت الخلايا في الواقع أكثر حساسية (البيانات غير معروضة). تقاوم الخلايا من النوع البري swinholide-A على جميع المستويات التي تم اختبارها ، ومع ذلك ، فإن جميع الطفرات الثلاثة المقاومة لـ LAT-A كانت حساسة لهذا الدواء (البيانات غير معروضة) مما يدل على أن افتقارها للحساسية تجاه LAT-A من غير المرجح يكون بسبب ضعف آليات الامتصاص.

وهكذا ، كانت نتائج فحص الهالة مؤشرا بشكل كبير على تفاعل معين من LAT-A مع الأكتين في خلايا الخميرة. للتحقيق في احتمال أن المقاومة كانت بسبب تعطيل موقع ارتباط LAT-A الطبيعي على جزيء الأكتين ، نظرنا في موضع الأليلات الثلاثة المقاومة داخل بنية بلورية الأكتين. كما هو مبين في الشكل 3 ، تحدد الأليلات رقعة صغيرة على الأكتين المجاورة لشق ربط النيوكليوتيدات. المخلفات التي تحورت في الأليلات الثلاثة (قانون 1-112 = K213A، E214A، K215A قانون 1-113 = R210A، D211A قانون 1-117 = R183A، D184A) يُعتقد أنها إما تتصل مباشرة من خلال جسور الملح أو روابط الهيدروجين ، النيوكليوتيد نفسه ، أو لتشكيل جسور الملح لوضع بقايا أخرى تربط نفسها بالنيوكليوتيدات (Kabsch et al. ، 1990). لذلك قررنا تأثير LAT-A على تبادل النيوكليوتيدات.

اختبرنا خصائص تبادل النوكليوتيدات لأكتين الخميرة من النوع البري في وجود تركيزات متزايدة من LAT-A من خلال مراقبة الزيادة في التألق الملحوظ عندما يرتبط ε-ATP بالأكتين. كما هو مبين في الشكل 4 ، فإن إضافة LAT-A يثبط تبادل النيوكليوتيدات في الأكتين بطريقة تعتمد على الجرعة.

كاختبار نهائي لخصوصية LAT-A ، قمنا بتنقية الأكتين من سلالتين من سلالات LAT-A المقاومة ، قانون 1-113 و قانون 1-117. لم نحاول عزل الأكتين عن قانون 1-112 الخلايا لأنها مريضة جدًا ، وبالتالي اعتقدنا أن احتمالية إنتاجها لأكتين مستقر بدرجة كافية للسماح بالتحليل في المختبر كانت منخفضة. في الواقع ، أكتين من قانون 1-113 الطفرة المبلمرة سيئة للغاية في المختبر (& lt10٪ يمكن أن تكون حبيبات في ظل ظروف تقريبًا من الناحية الكمية تبلمر الأكتين من النوع البري) ، على الرغم من قانون 1-113 سلالات صحية أكثر بكثير من قانون 1112 سلالات. نظرًا لأنه كان من الصعب تحليل البيانات من تجميع قانون 1-113 أكتين ، شرعنا فقط قانون 1-117 الأكتين. G- أكتين من قانون 1 أو قانون 1-117 تم السماح للسلالات بالبلمرة في غياب أو وجود LAT-A. تم تكوير F-actin ، وتم تحليل المواد الطافية والكريات الناتجة بواسطة SDS-PAGE (الشكل 5 ،أ). تم تحليل نطاقات بروتين الأكتين الموجودة على هذا الجل عن طريق قياس الكثافة (الشكل 5 ،ب). تظهر نتائج هذه التجارب أن حضانة LAT-A بتركيز متساوي الأضلاع من الأكتين من النوع البري ، ولكن ليس الأكتين من قانون 1117 الخلايا ، مما أدى إلى تثبيط تجميع الخيوط. ال قانون 1-117 يبدو أن الطفرة نفسها تؤثر على قدرة الأكتين على تكوين الخيوط. فقط ∼40٪ من قانون 1-117 تم تكوير الأكتين باستخدام الظروف التي أدت إلى تكوير & gt90٪ للأكتين من النوع البري. ومع ذلك ، فإن إضافة LAT-A إلى هذا الأكتين لم يؤثر بشكل كبير على قدرته على البلمرة. للتحقق من أن تكوير الأكتين الطافر كان ناتجًا عن تكوين خيوط ، بدلاً من تجميع مونومرات الأكتين ، لاحظنا خيوط الأكتين الطافرة ، المسمى بـ Rh-phalloidin ، مباشرة عن طريق الفحص المجهري الفلوري (الشكل 5). ج) ووجدت أن كلا من النوع البري و قانون 1-117 الأكتين كانت قادرة على تشكيل خيوط ، ولكن فقط قانون 1-117 كان الأكتين قادرًا على تكوين خيوط في وجود LAT-A.

آثار LAT-A على النمو والجدوى والتشكل والتضخم

بعد أن قررنا أن تأثيرات LAT-A على الأكتين في خلايا الخميرة سريعة وقابلة للانعكاس ومحددة ، حددنا بعد ذلك كيف سيؤثر الاضطراب الكلي لخيوط الأكتين على العمليات الخلوية. تمت مراقبة نمو الخلايا في الوسط الغني عن طريق عد الخلايا بعد إضافة LAT-A (الشكل 6 ،أ). بعد إضافة الدواء لم يكن هناك تقريبا زيادة في عدد الخلايا. ومع ذلك ، عندما تم تقييم نمو الخلية عن طريق قياس التعكر (OD 600 نانومتر) ، كانت هناك زيادة بعد إضافة LAT-A إلى حوالي 2.5 ضعف قراءة OD الأصلية (الشكل 6 ،ب). يشير هذا إلى نمو في حجم الخلية لا يقابله زيادة عدد الخلايا. الأليلات الطافرة قانون 1-113 و قانون 1-117 تم أيضًا تقييم النمو في وجود LAT-A. لم تظهر أي من السلالتين تغيرًا يمكن اكتشافه في معدل نموها في وجود الدواء (الشكل 6 ، ج و د). بالإضافة إلى كلاهما قانون 1-113 و قانون 1-117 تم تلوين المسوخ لـ F-actin في وجود LAT-A. كانت بقع الأكتين القشرية موجودة بوضوح في هذه الخلايا طوال الدورة الزمنية لمدة ساعة واحدة (البيانات غير معروضة).

تم تقييم جدوى الخلايا بعد العلاج بـ 100 ميكرومتر LAT-A من خلال حساب عدد الخلايا المعالجة التي يمكن أن تشكل مستعمرات بعد فترة حضانة محددة (الشكل 6). ه). عولجت الخلايا باستخدام LAT-A في التعليق ، وضربت على لوحة ، وتم تشريح 120 خلية من هذه المجموعة باستخدام معالج دقيق. تم تقييم قدرة كل خلية تم التلاعب بها على تكوين مستعمرة. لم تنخفض قابلية بقاء الخلايا بعد إضافة LAT-A بشكل ملحوظ خلال الدورة الزمنية لمدة 4 ساعات ، حيث عولجت 93 ٪ من الخلايا لمدة 4 ساعات باستخدام LAT-A قادرة على تكوين مستعمرات طبيعية على ما يبدو عند الطلاء. في المجموعة الضابطة للخلايا التي لم يتم علاجها باستخدام LAT-A ، كانت جميع المستعمرات التي تشكلت متساوية في الحجم تقريبًا. في كل نقطة زمنية بعد إضافة LAT-A ، كانت 2-5٪ من المستعمرات أصغر بكثير مما كانت عليه في حالة التحكم ، وكانت مرئية بالعين فقط (البيانات غير معروضة).سبب المستعمرات الصغيرة غير واضح. من الممكن أن يكونوا صغار الحجم مع فقدان مؤقت في F-actin يؤثر بطريقة ما على وراثة جينوم الميتوكوندريا.

بعد إثبات أن قابلية الخلية للنمو ظلت عالية لفترات طويلة في LAT-A ، يمكننا الآن استخدام الدواء لتحليل التأثيرات على فسيولوجيا الخلية. وهكذا ، بحثنا أولاً عن التأثيرات على تشكل الخلية ولاحظنا أنه أثناء الحضانة في خلايا LAT-A يزداد حجمها بشكل كبير لكنها لم تتوقف مع التشكل الموحد. عند التقييم على مدار 4 ساعات ، لوحظ أن النسبة المئوية للخلايا غير المزروعة تزداد من 38٪ غير مزدحمة في غياب LAT-A (39٪ برعم صغير و 23٪ كبير مزدحم) إلى 77٪ غير مزعجة في وجود LAT- أ (12٪ برعم صغير ، 11٪ برعم كبير) يدل على عيوب في تكوين البراعم. بالإضافة إلى ذلك ، احتوت العديد من الخلايا الموقوفة على براعم لا تزال مرتبطة بالخلية الأم. يمكن فصل هذه البراعم عن الخلايا الأم عن طريق الهضم الإنزيمي لجدار الخلية مما يشير إلى أن الأكتين ليس مطلوبًا للحركة الخلوية ، ولكنه ضروري للتدهور الكامل لمواد الحاجز بين خلايا الأم وابنتها.

ثبت أن الالتقام الخلوي في الخميرة يعتمد على وجود هيكل خلوي أكتين سليم (Kübler and Riezman ، 1993). قمنا بتقييم الالتقام الخلوي من خلال مراقبة امتصاص سائل علامة المرحلة الصفراء لوسيفر الأصفر (LY Dulic et al. ، 1991). في غياب LAT-A ، هناك امتصاص محدد لـ LY في الفجوات. ومع ذلك ، في وجود LAT-A ، بينما كانت الفجوات لا تزال مرئية بواسطة بصريات نومارسكي ، لم يكن هناك امتصاص لـ LY ، مما يشير إلى تثبيط الالتقام الخلوي (البيانات غير معروضة).

الحساسية تجاه سلالات LAT-A مع هيكل خلوي أكتين معطل

لاكتساب رؤى جديدة حول دور بروتينات الهيكل الخلوي الأكتين في تعديل سلامة الهيكل الخلوي ووظيفته ، قمنا بدراسة التأثير على حساسية LAT-A للطفرات في الجينات التي تشفر البروتينات المختلفة المهمة لوظيفة الهيكل الخلوي للأكتين. أجرينا فحوصات الهالة على كل سلالة متحولة ، وكذلك على سلالة الوالد المتجانسة. كان هذا التحكم ضروريًا لأننا لاحظنا بعض الاختلاف في حساسية LAT-A بين سلالات من النوع البري لخلفيات سلالات مختلفة. كان هناك مجموعة من الحساسيات للخلايا الطافرة لـ LAT-A عند تقييمها بواسطة فحوصات الهالة. أظهر اثنان من المسوخ مقاومة طفيفة لـ LAT-A. حملت هذه حذف SLA1 الجين وطفرة في END3 الجين (النهاية3-1) ، بنسب من الحساسيات الظاهرة مقارنة بعناصر التحكم 0.5 و 0.3 ، على التوالي (انظر المواد والطرق). تم إظهار حساسية متزايدة لـ LAT-A من قبل العديد من المسوخات بما في ذلك Δsrv2, Δcap2, Δtpm1، Δsac6p، و Δsla2 بنسب حساسيات ظاهرة 2.9 و 4.0 و 2.8 و 1.8 و 2.6 على التوالي. سلالات تحمل Δabp1 أظهرت الطفرة زيادة في المقاومة بالكاد يمكن اكتشافها. تسلط هذه النتائج الضوء على الاختلافات بين بروتينات الهيكل الخلوي في مساهماتها في استقرار الهيكل الخلوي.

دور الأكتين في تطوير القطبية في موقع البراعم الافتراضي

استخدمنا الحساسية لـ LAT-A لتحديد أي من البروتينات التسعة عشر التي يتم توطينها عادةً في موقع البرعم المفترض تعتمد على هيكل خلوي أكتين سليم للتوطين. استخدمنا الخلايا ثنائية الصبغيات لأنها أكثر حساسية من الأحادية الصبغية لـ LAT-A ، ويسهل حجمها الأكبر الملاحظات التي يتم إجراؤها بواسطة الفحص المجهري المناعي ولها شكل بيضاوي يسمح بتمييز نهايات الخلية. تعد القدرة على تحديد نهايات الخلية أمرًا مهمًا حتى يتمكن المرء من تحديد ما إذا كان موقع البرعم قد تشكل في الموضع الصحيح (انظر Drubin and Nelson ، 1996). تم إطلاق الخلايا من G0، كما هو موضح في المواد والطرق ، في وجود أو عدم وجود LAT-A. في كل نقطة زمنية ، تم استخدام الفلورة المناعية لتوطين البروتينات ذات الأهمية.

الأكتين مطلوب لتكوين البرعم في الخلايا الخارجة من G0

لإنشاء خط أساس للمقارنات ، حددنا المعدل الذي تحقق به استقطاب الأكتين في الخلايا الخارجة من G0. تم أخذ النقاط الزمنية بالساعة من G0 تم إطلاق الخلايا في وسائط جديدة في وجود أو عدم وجود LAT-A. الشكل 7 ،أ يوضح النسبة المئوية للخلايا ذات تلطيخ الأكتين المستقطب التي تم الحصول عليها من خلال هذا الإجراء. كان استقطاب تلطيخ الأكتين في غياب LAT-A واضحًا بعد ساعتين وزاد إلى ذروة 80 ٪ من الخلايا مع تلطيخ مستقطب بعد 4 ساعات. في الدورات التي تستغرق وقتًا أطول ، لم يرتفع عدد الخلايا ذات التلوين المستقطب عن 80٪ ، ويُفترض أن مستوى التزامن في الخلايا لم يكن مرتفعًا بدرجة كافية (أي الخلايا المتبقية في وقت مبكر G1 أو أواخر G2/ الانقسام ، المراحل التي يكون فيها الهيكل الخلوي للأكتين القشري غير مستقطب). الشكل 7 ،ج يُظهر نمط التلوين المناعي المضاد للأكتين للخلايا بعد 4 ساعات من النمو بعد G0 الافراج في حالة عدم وجود LAT-A. خلال فترة 4 ساعات ، تم أيضًا مراقبة مورفولوجيا الخلية. على الرغم من أن النمو في الثقافة بعد الإطلاق لم يكن متزامنًا تمامًا ، إلا أنه كان هناك إثراء كبير للخلايا صغيرة الحجم بعد 2-3 ساعات من إطلاقها ، وللخلايا متوسطة إلى كبيرة التبرعم عند 4 ساعات بعد الإطلاق (الشكل 7). ب).

في وجود LAT-A لم يكن هناك استقطاب ملحوظ للهيكل الخلوي أكتين في أي وقت (الشكل 7 ، أ و د). في النقاط الزمنية المبكرة (0-1 ساعة) ، لم تشاهد أي هياكل أكتين. ومع ذلك ، بعد هذه المرحلة ، احتوى عدد متزايد من الخلايا على قضبان أكتين (الشكل 7 د). تم الإبلاغ عن قضبان مماثلة سابقًا في سلالات متحولة بها عيوب أكتين (Johnston et al. ، 1991 Holtzman et al. ، 1993 Welch and Drubin ، 1993). لا تلطخ قضبان الأكتين بصبغة F-actin المصبوغة rhodamine-phalloidin ولذا فقد اقترح أن تكون مجاميع من الأكتين الأحادي. في النقاط الزمنية اللاحقة ، يمكن أيضًا رؤية نقاط أصغر من تلطيخ الأكتين والتي تبدو مماثلة في الحجم للبقع القشرية. ومع ذلك ، فإن هذه المجاميع لا تسمي بـ Rd-phalloidin ، ولا تظهر في معظم الحالات وكأنها في القشرة ، مما يشير إلى أن هذه الهياكل هي على الأرجح مجاميع من الأكتين الأحادي. بالإضافة إلى ذلك ، في نسبة صغيرة من الخلايا (& lt5٪) ، لوحظ أن الأكتين يصبغ داخل النواة.

نظرًا لعدم إمكانية اكتشاف أكتين خيطي في الخلايا المعالجة بـ LATA ، فإن أي بروتينات كانت قادرة على تحقيق نمط تلطيخ مستقطب في وجود LAT-A يمكن استنتاج أنها تقوم بذلك في غياب F-actin.

بروتينات التأسيس القطبية ، Cdc42p و Bem1p

لتحديد ما إذا كان الهيكل الخلوي للأكتين له أي دور في المرحلة المبكرة من إنشاء القطبية التي تتضمن توطين Cdc42p و Bem1p في قشرة الخلية ، قمنا بتحليل توطين Cdc42p و Bem1p عند الخروج من G0 في وجود أو عدم وجود LAT-A. كما هو مبين في الشكل 8 ، أ و د، في حالة عدم وجود LAT-A ، أصبح Cdc42p و Bem1p مستقطبين بحركية مشابهة للأكتين. كما ورد في الأدبيات (Ziman et al. ، 1993 Pringle et al. ، 1995) ، أظهر كلا البروتينين تلطيخًا موضعيًا للغاية في موقع البرعم المفترض وعند طرف البراعم الصغيرة (الشكل 8 ، ب و ه). في الخلايا ذات البراعم الأكبر ، كان التلوين أكثر انتشارًا ولكنه لا يزال مستقطبًا. شوهد تلطيخ أيضًا في عنق برعم الأم قبل التحلل الخلوي.

في غياب أو وجود LAT-A ، حقق Cdc42p و Bem1p توطينًا خلويًا مستقطبًا وفعلوا ذلك باستخدام حركيات مماثلة (الشكل 8). في الخلايا المعالجة بـ LAT-A ، كان التلوين على شكل نقطة مضيئة في أحد طرفي الخلية ثنائية الصبغة الإهليلجية (الشكل 8 ، ج و F) وهو الموضع المناسب لتشكيل موقع البراعم. في حالة توطين Cdc42p في وجود LAT-A ، بالإضافة إلى النقطة المضيئة للتلطيخ في نهاية الخلية ، يمكن أيضًا رؤية مستوى منخفض من التلوين القشري المنتشر. لمزيد من معالجة ما إذا كان التوطين المستقطب لـ Bem1p و Cdc42p يعكس عناصر المسار الطبيعي لتجميع موقع البرعم المفترض ، أجرينا وضع العلامات المزدوجة بالأجسام المضادة على بروتين موقع برعم افتراضي آخر ، Cdc11p (انظر القسم التالي للحصول على وصف توطين Cdc11p في LAT- أ). تختلف أنماط تلطيخ البروتينات ، ويلاحظ وجود بقعة صغيرة من التلطيخ في Cdc42p أو Bem1p ، بينما لوحظ وجود حلقة لتلطيخ Cdc11p ، لذلك يمكن تمييز أنماط التلوين. في وجود LAT-A ، يمكن ملاحظة أن التلوين متزامن (حلقة Cdc11p تحيط بالرقعة Cdc42p أو Bem1p) في 99 ٪ من الخلايا (تم حساب 400 خلية) مما يشير إلى أن Cdc42p و Bem1p و Cdc11p قد تم ترجمتها إلى ما كان موقع برعم طبيعي باستثناء غياب الأكتين والبروتينات المرتبطة به.

البروتينات والبروتينات المرتبطة بالأكتين المتورطة وراثيًا في وظيفة الأكتين

توطين الاستقطاب لبروتينات ربط الأكتين Abp1p و cofilin في الخلايا المنطلقة من G0 وجد أنه يعتمد على وجود هياكل F- أكتين. تم تحديد النسبة المئوية للخلايا ذات التلوين المستقطب في وجود وغياب LAT-A لكل بروتين وتم توضيح هذه البيانات بيانياً في الشكل 13. وعلى النقيض من ذلك ، فإن كلا من Sla1p و Sla2p اللذان يتحدان أيضًا مع هياكل الأكتين القشرية (Holtzman et al. . ، 1993 Ayscough ، K. ، و S. Yang ، ملاحظات غير منشورة) ، كانوا قادرين على التوطين في قشرة الخلية وكانوا في هياكل شبيهة بالرقعة في غياب F-actin (البيانات غير معروضة). في مجموعة صغيرة من الخلايا ، يبدو أن هذه البروتينات لها توزيع مستقطب.

في غياب LAT-A و Aip3p / Bud6p ، حقق البروتين الذي يتفاعل مع أكتين الخميرة في شاشة ثنائية الهجين والذي يتمركز في المواقع القشرية (Amberg et al. ، 1996) ، نمط تلطيخه الطبيعي المستقطب مع ملاحظة تلطيخ في موقع البرعم المفترض ، عند طرف البراعم ، وفي الخلايا الكبيرة المتبرعمة ، عند عنق برعم الأم (انظر أعلاه الشكل 13). في وجود LAT-A ، تم تقليل عدد الخلايا التي تظهر تلطيخًا موضعيًا. ومع ذلك ، كان من الواضح أنه في عدد كبير من الخلايا ، كان Aip3p / Bud6p لا يزال قادرًا على التوطين في قشرة الخلية ، وفي كثير من الحالات أظهر توطينًا مستقطبًا. أظهرت 22٪ من الخلايا تلطيخًا مستقطبًا في نهايات الخلية (الشكل 13) بينما في حالات أخرى ، اقتصر التلوين على بقع منفصلة لم تكن في نهاية الخلايا الإهليلجية (3.5٪) ، أو كانت هناك بقعتان في القشرة مع وجود رقعة واحدة على الأقل ليست في نهاية الخلية (9.5٪).

اقترح Kelleher (1995) أن مغاير Arp2 / Arp3 قد يكون بمثابة نواة لبلمرة الأكتين. لذلك كان من المهم تحديد ما إذا كان Arp2 في الخميرة يمكن أن يعمل بشكل مستقل عن الأكتين وتحقيق توطينه القطبي الطبيعي في غياب الأكتين التقليدي. في غياب LAT-A ، يحتوي Arp2p على نمط تلطيخ شبيه بالرقعة القشرية المستقطبة (Moreau et al. ، 1996) مع حركية توطين مشابهة للأكتين. ومع ذلك ، في وجود LAT-A ، لم يستقطب Arp2p ، على الرغم من أنه أظهر توزيعًا مختلفًا عن الأكتين (انظر الشكل 13 للحصول على ملخص البيانات). في وجود LAT-A ، يتم ترجمة الأكتين ، وليس Arp2p ، إلى الهياكل العارضة ، وفي بعض الحالات ، إلى النواة. على عكس الأكتين ، يبدو أن كمية كبيرة من تلطيخ Arp2 مرتبطة بقشرة الخلية حيث كان تلطيخها منتشرًا. كان هذا واضحًا بشكل خاص في النقاط الزمنية المبكرة (1-2 ساعة) بعد إطلاق الخلايا من G0.

البروتينات المشاركة في العمليات الإفرازية

قمنا بترجمة العديد من البروتينات (Sec4p و Sec8p و Myo2p و calodulin و Smy1p) المتورطة في الإفراز في غياب ووجود LAT-A. Sec4p هو عضو في عائلة بروتينات Rab-GTPase ويعمل في مرحلة متأخرة من المسار الإفرازي بين جهاز جولجي وغشاء البلازما (Salminen and Novick ، ​​1987). يتم ترجمة Sec4p إلى موقع البرعم المفترض وطرف الخلايا الصغيرة (Novick and Brennwald ، 1993). Sec8p هو أحد مكونات مركب البروتين الذي يتم توطينه في موقع البرعم المفترض وطرف البرعم ، وقد يشارك في الالتحام الحويصلات في غشاء البلازما (TerBush and Novick ، ​​1995 TerBush ، D. ، الاتصال الشخصي). Myo2p عبارة عن ميوسين غير تقليدي مع كالمودولين كوحدة فرعية مرتبطة (Johnston et al. ، 1991 Brockerhoff et al. ، 1994). يمكن أن تتسبب الطفرات في Myo2p و calodulin في تراكم الحويصلة ، وتخليق جدار الخلية غير الموضعي ، وترسب الكيتين وغالبًا ما يتم إيقاف الخلايا غير المرحة (Johnston et al. ، 1991 Brockerhoff and Davis ، 1992 Brockerhoff et al. ، 1994 Lillie and Brown ، 1994 Govindan ، et آل ، 1995). Smy1p هو بروتين شبيه بالكينيسين تم تحديده على أنه مثبط للجرعة لطفرة في MYO2. (ليلي وبراون ، 1994).

وجدنا أن الأكتين مطلوب لتوطين Sec4p و Sec8p و Smy1p إلى موقع البراعم المفترض. في المقابل ، كان كل من Myo2p و calodulin قادرين على التوطين في هذه المنطقة في غياب الأكتين ، وإن كان بدرجة أقل من الخلايا الضابطة. يتم عرض أمثلة على البيانات الحركية والتصويرية لـ Sec4p و calodulin (الشكلان 9 و 10). في الخلايا الخارجة من G0، أصبح Sec4p شديد الاستقطاب في موقع البرعم المفترض ، ويبقى عند طرف البراعم في الخلايا الصغيرة ثم يصبح أكثر انتشارًا بقليل مع نمو البراعم. لم يكن مرئيًا بشكل واضح في معظم الخلايا ذات البراعم المتوسطة إلى الكبيرة ، ولكن لوحظ في عنق برعم الأم قبل التحلل الخلوي (الشكل 9 ، أ و ب). ومع ذلك ، عندما تمت إضافة LAT-A إلى وسط النمو أثناء الخروج من المرحلة الثابتة ، لم يظهر Sec4p توطين مستقطب (الشكل 9 ، أ و ج).

في حالة عدم وجود LAT-A ، يتم ترجمة الكودوديولين و Myo2p إلى موقع البرعم المفترض ، وطرف الخلايا الصغيرة ومنطقة الحاجز. كان التلوين في الخلايا المتوسطة إلى الكبيرة أكثر خفوتًا (الشكل 10 ، أ و ب يتم عرض بيانات kalodulin فقط لأن تلطيخ Myo2p كان متطابقًا بشكل أساسي). في وجود LAT-A ، كان هناك مستوى عالٍ من تلطيخ السيتوبلازم مع عدم إظهار معظم الخلايا أي استقطاب للتلطيخ. ومع ذلك ، في 30٪ من الخلايا ، ظهر الهدودولين في رقعة منفصلة تقع في نهاية الخلية الإهليلجية ، وهو الوضع المناسب لموقع البرعم (الشكل 10). ج). عندما تمت متابعة الخلايا لمدة تزيد عن 4 ساعات ، زاد عدد الخلايا التي تحتوي على نمط التلوين هذا زيادة طفيفة ولكنها لم ترتفع فوق 35٪ من الخلايا التي تمت ملاحظتها.

البروتينات المطلوبة للحركة الخلوية

يتم توطين العديد من البروتينات في موقع البرعم الافتراضي ولكنها أكثر أهمية للعمليات التي تحدث بعد تكوين البراعم. إن حواجز الخميرة ، المطلوبة للحركة الخلوية والمقترح أن تكون وحدات فرعية من الخيوط التي لوحظت في عنق برعم الأم بواسطة المجهر الإلكتروني ، هي مثل هذه البروتينات (Hartwell، 1971 Haarer and Pringle، 1987 Ford and Pringle، 1991 Kim et al.، 1991) .

درسنا توطين اثنين من بروتينات septin ، Cdc10p و Cdc11p. نظرًا لأن النتائج كانت لا يمكن تمييزها بالنسبة لهذين البروتينين ، فقد قدمنا ​​فقط بيانات Cdc11p. في كل من غياب ووجود LAT-A ، أصبح Cdc11p مستقطبًا وكانت حركيات التوطين متشابهة (الشكل 11). كان نمط التلوين عبارة عن هيكل حلقة ساطعة في موقع البرعم المفترض. في حالة عدم وجود LAT-A ، شوهدت الخلايا ذات البراعم الأكبر تحتوي على حلقة مزدوجة من التلوين في عنق البرعم (الشكل 11 ،ب). في الخلايا المنقسمة ، يبدو أن حلقة واحدة تبقى مع الأم والأخرى مع الخلية البنت. في وجود LAT-A ، شوهدت حلقات مفردة فقط ، مما يشير إلى أن تكرار الحلقة يعتمد على تكوين البراعم (الشكل 11). ج).

البروتينات الأخرى في موقع Pre-Bud

تم توطين العديد من البروتينات الأخرى في موقع البرعم المفترض ، لكن أنشطتها الخلوية ليست مفهومة حاليًا بشكل جيد بما يكفي للسماح بتصنيفها وظيفيًا.

يتم توطين Gin4p و Bni4p في بنية حلقة في موقع البرعم المفترض الذي يستمر في عنق برعم الأم طوال نمو البراعم (Longtine ، M. ، D. DeMarini ، J. Pringle ، التواصل الشخصي). في وجود LAT-A ، حقق كل من Gin4p و Bni4p توطينًا مستقطبًا (الشكل 13).

يتم ترجمة Spa2p إلى موقع البرعم المفترض وإلى طرف توقعات التزاوج (Snyder ، 1989 Snyder et al. ، 1991). تم حذف الخلايا لـ واس 2 لا تظهر أي عيوب في القدرة على التبرعم ولكنها تظهر عيبًا في اختيار موقع البراعم (Snyder ، 1989). في غياب LAT-A ، أصبح Spa2p مستقطبًا مع حركية مماثلة للأكتين (الشكل 12 ، أ و ب). في وجود LAT-A ، كان Spa2p لا يزال قادرًا على الاستقطاب. ومع ذلك ، فقد تأخرت حركية الاستقطاب (الشكل 12 ، أ و ج). في ثلاث تجارب منفصلة ، كان التوطين المستقطب لـ Spa2p دائمًا 1-2 ساعة أبطأ منه في غياب LAT-A.

دور الأكتين في الحفاظ على قطبية الخلية

لتحديد ما إذا كان الأكتين يلعب دورًا في الحفاظ على محور قطبية الخلية ، أطلقنا كلًا من الخلايا أحادية الصيغة الصبغية والمزدوجة الصبغية من الطور الثابت إلى المرحلة التي تحتوي فيها أكثر من 50٪ من الخلايا على براعم صغيرة. ثم عالجنا هذه الخلايا باستخدام LAT-A لمدة 5 دقائق لتعطيل الهيكل الخلوي للأكتين تمامًا ، وغسلنا الخلايا ، وسمحنا لها باستئناف النمو. بعد ساعتين ، قمنا بتحليل مورفولوجيا الخلايا (الشكل 14). لكل من الخلايا أحادية الصيغة الصبغية والثنائية الصبغية ، تسبب اضطراب الهيكل الخلوي للأكتين في أن تصبح نسبة كبيرة من الخلايا ثنائية الصبغيات. ومن المثير للاهتمام ، أنه في جميع الحالات تقريبًا ، تم وضع هذا البرعم الثاني بشكل صحيح فيما يتعلق بالموضع المتوقع لاختيار موقع البراعم. أي أن البراعم أحادية الصيغة الصبغية كانت متاخمة لبعضها البعض ، وكانت البراعم ثنائية الصبغيات إما في كلا القطبين أو في نفس قطب الخلية (لمناقشة أنماط التبرعم ، انظر دروبين ونيلسون ، 1996).

في مجموعة مماثلة من التجارب ، أحادي الصيغة الصبغية MATأ تعرضت الخلايا لعامل ألفا حتى شكل أكثر من 90٪ من السكان إسقاطًا للتزاوج. تم بعد ذلك تعريض السكان لـ LAT-A لمدة 5 دقائق لتعطيل الهيكل الخلوي للأكتين تمامًا ، وغسلهم ، وإطلاقهم في وسائط جديدة. كان α-Factor موجودًا في جميع المراحل. في مجموعة التحكم التي تمت إضافة DMSO إليها في المرحلة المتوسطة ، لوحظ اثنان من shmoos في 19 ٪ من الخلايا. على النقيض من ذلك ، احتوت 53 ٪ من الخلايا المعرضة لـ LAT-A على اثنين من shmoos.


الملخص

أصبحت زيادة مقاومة البكتيريا سالبة الجرام للمضادات الحيوية مشكلة عالمية ، وهناك حاجة إلى فئات جديدة من المضادات الحيوية بآليات عمل جديدة. وحدة البروتياز المحللة للكازين P (ClpP) عبارة عن بروتياز سيرين محفوظ بين البكتيريا التي تعتبر هدفًا دوائيًا مثيرًا للاهتمام. تشارك وظيفة ClpP في دوران البروتين والتوازن ، والاستجابة للإجهاد ، والفوعة من بين العمليات الأخرى.كان تركيز هذه الدراسة على تحديد مثبطات جديدة الإشريكية القولونية ClpP وفهم طريقة عملها. تم اختبار مكتبة مركزة من مثبطات الأنزيم البروتيني السيرين المبنية على رؤوس حربية من نوع diaryl phosphonate لتثبيط ClpP ، وتم إجراء استكشاف كيميائي حول المركبات المصابة. إجمالاً ، هناك 14 مثبطًا قويًا جديدًا من بكتريا قولونية تم تحديد ClpP. مجمعات سكنية 85 و 92 ظهرت كمركبات مثيرة للاهتمام من هذه الدراسة بسبب قوتها ، وعلى التوالي ، لخصائصها المضادة للبكتيريا المعتدلة ولكن المتسقة بالإضافة إلى المظهر الجانبي المناسب للسمية الخلوية.


2.1. كاثيبسين

كاثيبسين السيستين هو في المقام الأول بروتياز داخل الخلايا ، ليسوزومي بروتياز مسؤول عن دوران البروتين ولكن ثبت أنه منتظم في السرطان ، غالبًا في الآفات المبكرة [19]. عادة ما يتضمن انشقاق الركيزة المحفز بالكاثيبسين ثيول نيوكليوفيليك السيستين ، الهيستيدين ، والأسبارتات في الموقع النشط ويفضل الانقسام بسبب الظروف الحمضية [16]. ومع ذلك ، يجب تحديد ركائز معينة من كاثيبسين السيستين المتورطة في الحالات المرضية [19]. كاثيبسين السيستين المفرط التعبير متورط في الورم الدبقي [20-21] ، سرطان الجلد [22] ، سرطان المريء [23] ، المعدة [24] ، القولون [25] ، البروستات [26-27] ، الثدي [28] والرئة [ 29] واستخدمت كواصمات بيولوجية مرضية [30]. تم العثور على كاثيبسين السيستين النشط بشكل شائع في الظروف الحمضية لليزوزومات مع بعض الاستثناءات. عادةً ما يُفرز كاثيبسين K إلى الفراغ خارج الخلية بين ناقضات العظم والعظام لإعادة تشكيل العظام [31-32]. على الرغم من أن البروتياز داخل الخلايا لم يتم دراسته كثيرًا في دوره في السرطان مقارنة بالبروتياز المهين ECM الأكثر شيوعًا مثل MMP و uPA ، يمكن أن يؤدي إلغاء التنظيم في مواقعهم إلى بدء المزيد من السلاسل المحللة للبروتين خارج الخلية [33-34]. على سبيل المثال ، تحلل الكاتيبسين B و L المائي من النوع الرابع الكولاجين ، الفبرونكتين [35] ، بروتينات التصاق الخلايا [36] واللامينين [35] لتمكين تكاثر الخلايا السرطانية وتحفيز المؤيدة لـ MMPs. يمكن أن تؤدي كاثيبسين السيستين أيضًا إلى تدهور الكولاجين عن طريق تحلل البروتين داخل الخلايا. يمكن تناول الكولاجين عن طريق البلاعم والخلايا السرطانية عبر uPA و uPAR ثم يتحلل في الجسيمات الحالة بواسطة كاثيبسين السيستين [19]. أكثر الكاتيبسين بحثًا ، الكاتيبسين B و L ، يظهر أنه يتم التعبير عنه بشكل مفرط عن طريق تضخيم الجينات ، متغيرات النسخ المعبر عنها بواسطة الخلايا السرطانية ، عوامل النسخ والتنظيم اللاحق للنسخ [37]. تم التعرف على كاثيبسين ب في الغشاء الكهفي ، خارج الليزوزوم ، لخلايا سرطان القولون البشرية وافترض أنه يتوسط في مزيد من الأحداث التحلل للبروتين على سطح الخلية والتطعيم ECM [38]. أظهر العمل الأخير أن نفاذية الغشاء الليزوزومي متورط في السرطان ، ويرجع ذلك في الغالب إلى إفراز العديد من كاثيبسين السيستين من موقعها الفطري [39]. بمجرد خروج الكاتيبسين من الخلية إلى البيئة خارج الخلية للأورام ، يمكن تنشيطها من خلال الظروف الحمضية الموجودة في البيئة الدقيقة للورم [40]. ومع ذلك ، فإن آليات التنشيط المختلفة ممكنة أيضًا. يظهر أن كاثيبسين K يتم تنشيطه بواسطة الجليكوزامينوجليكان بينما يتم إفراز الكاتيبسين B و L و S في شكل نشط [41]. ومن المثير للاهتمام أن كاثيبسين السيستين ، مثل الكاتيبسين B و H و L و S و K [42] ، ينتقل إلى العصارة الخلوية داخل الخلايا بدون ارتباط غشاء لبدء موت الخلايا المبرمج [43-44]. أظهرت بعض الكاتيبسين أدوارًا وقائية [2] ، مثل كاثيبسين إل [45]. لذلك ، قد يكون تنشيط الأدوية الأولية بواسطة الكاتيبسين طريقة جيدة لإيصال الأدوية المضادة للسرطان على العلاجات المثبطة للبروتياز ، والتي لها صلة بوظيفة الخلية الطبيعية. إن الإفراط في التعبير عن كاثيبسين السيستين موثق جيدًا في العديد من الأشكال العدوانية للسرطان [46] ، مما يعطي تقارن ركيزة دواء كاثيبسين فرصة لتنشيطه في البيئات السرطانية وإيصال العلاجات الكيميائية مباشرة إلى موقع الحاجة.

يعتبر كاثيبسين E والكاثيبسين الليزوزومي D من البروتياز الأسبارتي المتماثل الذي يلعب دورًا مهمًا بنفس القدر في دوران البروتين في الخلية مثل كاثيبسين السيستين. يتكون بروتياز الأسبارتيك من 14 عائلة ولكن جميعها توجد عادة في ظروف شديدة الحموضة ، كما هو الحال في الجسيمات الحالة أو في الجهاز الهضمي. تم العثور على كاثيبسين D في الجسيم الحال ، وهو متورط في البروستاتا [47] والثدي [48] وسرطان القولون والمستقيم [49]. يوازي تعبير وإفراز كاثيبسين D العديد من بروتينات السيستين الليزوزومية المذكورة أعلاه. من ناحية أخرى ، لا يوجد كاثيبسين إي في الجسيمات الحالة ولكن في الفضاء داخل الخلايا مثل الهياكل الداخلية ، والشبكة الإندوبلازمية وجهاز جولجي ، وكذلك في غشاء البلازما والمرتبط بشكل أساسي بالخلايا المناعية [50]. ارتبط الإفراط في التعبير عن كاثيبسين إي بعدة أشكال من السرطان مثل سرطان المعدة البشري [51] ، وعنق الرحم [52] ، وأورام البنكرياس [53-54] السرطانية الغدية وسرطان الرئة [55]. حتى الآن ، تركز معظم PAPs المتقدمة على cathepsin B بسبب تعبيرها في الجسيمات الحالة داخل الخلايا.


مناقشة

جهاز المناعة الفطري هو خط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض الغريبة وتشارك مختلف المكونات الخلوية والجزيئية في هذه العملية (Liu et al. ، 2016 Huang et al. ، 2019). تعد التعديلات اللاحقة للترجمة أيضًا منظمات مهمة للمناعة وهذا يشمل الانتشار (Liu et al. ، 2016). Ubiquitin عبارة عن بولي ببتيد يحتوي على 76 من الأحماض الأمينية يمكن أن يتفاعل تساهميًا مع البروتينات المستهدفة ويمكن أن يخضع اليوبيكويتين نفسه للتواجد في بعض المخلفات (Ciechanover et al. ، 2000 Pickart ، 2001 Jiang and Chen ، 2011). ينتج عن هذا تكوين سلاسل بوليوبيكويتين مرتبطة بالليسين أو سلاسل بوليوبيكويتين خطية (هيتون وآخرون ، 2015). من المعروف أن ارتباط الليسين 48 (K48) متعدد النواة يعزز التحلل البروتيني للبروتينات المستهدفة (Ciechanover et al. ، 2000). على العكس من ذلك ، فقد تورط lysine 63 (K63) في عمليات خلوية مثل الاستجابة لتلف الحمض النووي والالتهاب والالتقام الخلوي (Panier and Durocher، 2009 Erpapazoglou et al.، 2014 Zhou Z. et al.، 2020). من المهم أيضًا ملاحظة أنه يتم استكشاف أنواع أخرى من روابط سلسلة بوليوبيكويتين وأن تعديلات يوبيكويتين يمكن أن تؤدي إلى نتائج خلوية مختلفة (Komander and Rape ، 2012 Ohtake et al. ، 2018).

علاوة على ذلك ، فإن إنزيمات deubiquitinases البشرية (DUBs) هي إنزيمات تزيل تعديلات اليوبيكويتين وتساهم في الاستتباب (Li et al. ، 2016). تعتمد الفيروسات على الخلايا المضيفة للبقاء على قيد الحياة ، ومن أجل إكمال دورة حياتها ، فقد طوروا استراتيجيات للتهرب من الاستجابة المناعية المضادة للفيروسات (Nelemans and Kikkert ، 2019). ومن المثير للاهتمام ، أنه تم العثور على العديد من البروتينات الفيروسية التي تمتلك نشاطًا مضادًا للفيروسات ويمكن استخدامها لمقاومة أو تعديل مسار الإشارات المناعية المضادة للفيروسات (Kumari and Kumar ، 2018).

كان نشاط إزالة التكاثر لـ SARS-CoV-2 PL pro هو المحور الرئيسي لهذه الدراسة وتم استخدام التركيب البلوري لـ PL pro في مركب مع ubiquitin propargylamide (Klemm et al. ، 2020). بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم أربعة هياكل بلورية أخرى لـ SARS-CoV-2 التي كانت متوفرة على RCSB PDB. تم استخدام الهياكل البلورية لمجمعات ألدهيد SARS-CoV PL pro -ubiquitin و MERS-CoV PL pro -ubiquitin للمقارنة (Bailey-Elkin et al. ، 2014 Ratia et al. ، 2014). يسمح الالتحام الجزيئي بالتنبؤ بخصائص ارتباط المركبات بالموقع المستهدف المعروف للمثبطات القائمة على النفثالين وفحصها.

كان GRL-0617 هو عنصر التحكم وقد وجد سابقًا أنه يثبط بشكل فعال SARS-CoV و SARS-CoV-2 PL pro بطريقة غير تساهمية (Ratia et al. ، 2008 Freitas et al. ، 2020 Shin et al. ، 2020). يشغل مثبط GRL-0617 جيوب S3 و S4 من SARS-CoV و SARS-CoV-2 PL pro (Ratia et al. ، 2008 Gao et al. ، تحت الطبع). استنادًا إلى نتائج الالتحام الجزيئي من الدراسة الحالية ، كان GRL-0617 محاطًا في الغالب ببقايا كارهة للماء في الهياكل البلورية SARS-CoV و SARS-CoV-2 (الشكل 1 والأشكال التكميلية 3 & # x020136) (Ratia et al. ، 2008 ). تم توقع أن يشكل هذا المركب روابط ذرية مع بقايا البروتين وشمل ذلك D164 في بنية 6wuu SARS-CoV-2 ، وكذلك Q269 في بنية 7jrn SARS-CoV-2. في التركيب البلوري الذي حدده Gao وآخرون ، تم العثور على GRL-0617 ، والذي كان عبارة عن ليجند متبلور بشكل مشترك ، لتشكيل روابط هيدروجينية مع هذه البقايا الحرجة (Gao et al. ، في الصحافة). عند قول ذلك ، تم العثور على D164 و Q269 لإحاطة GRL-0617 في الهياكل 6xaa و 6w9c و 6wx4 من SARS-CoV-2 PL pro.

تفاعل GRL-0617 أيضًا مع Y268 في SARS-CoV-2 PL pro وكانت جهات الاتصال بين الذرات موجودة مع هذه البقايا في بعض الهياكل. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم العثور على المانع القائم على النفثالين 3k ليشكل باستمرار اتصالات بين الذرات مع Y264 في جميع الهياكل البلورية لـ SARS-CoV-2 (الشكل 2 والأشكال التكميلية 3 & # x020136) (Bosken et al. ، 2020). تم تشكيل روابط بين الجزيئات أيضًا بين 3k و D164 في ثلاثة من البروتياز الشبيه بـ SARS-CoV-2 ، وكذلك Y268 في هيكل 6wx4 (Bosken et al. ، 2020). Bosken et al. حددت هذه البقايا على أنها تلعب دورًا مهمًا في وضع الربط لـ 3k (Bosken et al. ، 2020).

قد تكون الاختلافات التي لوحظت في الروابط بين الجزيئات ناتجة عن مطابقة مجال الأصابع وحلقة BL2 في الهياكل البلورية PL pro (الشكل 1) (B & # x000E1ez-Santos et al. ، 2015). في هياكل SARS-CoV-2 و SARS-CoV PL pro ، تتوافق حلقة BL2 مع المخلفات 267-272 (Lee et al. ، 2015 Gao et al. ، في الصحافة). في هيكل MERS-CoV PL pro المستخدم في هذه الدراسة ، تتكون حلقة BL2 من بقايا 1،752 & # x020131،758 (Bailey-Elkin et al.، 2014 Lee et al.، 2015). تمت مناقشة الأهمية الهيكلية لحلقة BL2 (حلقة الحظر) في عدد من الأوراق وتم تسليط الضوء على مرونتها (B & # x000E1ez-Santos et al. ، 2015 Bosken et al. ، 2020 Klemm et al. ، 2020). لوحظت تغييرات مطابقة في حلقة BL2 وتم الإبلاغ عن المطابقات & # x0201Copen & # x0201D أو & # x0201Cclosed & # x0201D في الأدبيات (B & # x000E1ez-Santos et al. ، 2015). فيما يتعلق بـ MERS-CoV ، هناك اختلافات هيكلية كبيرة في حلقة BL2 وقد اقترح أن هذا يؤثر على خصوصية التعرف على المثبط (Lee et al. ، 2015).

GRL-0617 غير فعال ضد MERS-CoV وفي الدراسة التي أجراها شين وآخرون ، نوقش أن هذا قد يكون بسبب وجود بقايا ثريونين بدلاً من التيروزين في موضع محفوظ (Lee et al. ، 2015 Shin et آل ، 2020). في متواليات SARS-CoV-2 و SARS-CoV PL pro ، المخلفات المقابلة هي Y268 و Y269 ، على التوالي (Shin et al. ، 2020). مطلوب Y268 للتأثير المثبط لـ GRL-0617 و Shin et al. أظهر أن تحور هذه البقايا يقلل بشدة من فعاليتها (Shin et al. ، 2020). بينما كان من المتوقع أن يرتبط GRL-0617 و 3k بـ MERS-CoV PL pro (4rf0) في هذه الدراسة ، فقد يلزم المزيد من الالتحام إلى هياكل بلورية إضافية للمقارنة (الأشكال 1 ، 2). كانت المثبطات القائمة على النفثالين محاطة بالبقايا D165 و Y269 و Q270 في SARS-CoV PL pro. راتيا وآخرون. و B & # x000E1ez-Santos et al. ، وصفوا أيضًا أهمية هذه البقايا في آليات عمل هذه الروابط (Ratia et al. ، 2008 B & # x000E1ez-Santos et al. ، 2014).

وعلى وجه الخصوص ، من المتوقع أن ترتبط المركبات الغذائية (-) - epigallocatechin gallate و hypericin و rutin و cyanidin-3-O-glucoside بشكل أقوى بموقع مثبط النفثالين في SARS-CoV-2 و SARS-CoV و MERS. -بروتياز يشبه غراء فيروس كورونا من المثبطات المعروفة (الشكل 2 والأشكال التكميلية 3 & # x020136). لقد شكلوا أيضًا تفاعلات متعددة مع بقايا البروتين الرئيسية مقارنة بـ GRL-0617 و 3 k. وبالمثل ، أظهرت نتائج الالتحام العمياء على سلاسل PL pro الرئيسية أن هذه الروابط الطبيعية لها أوضاع متعددة داخل هذه المنطقة (الشكل 3 والأشكال التكميلية 1 ، 2). (-) - Epigallocatechin gallate و rutin و cyanidin-3-O-glucoside هي مركبات الفلافونويد ، وهي فئة نشطة بيولوجيًا من المركبات الفينولية (Bonvino et al. ، 2018). في مراجعة الأدبيات الحديثة التي أجراها Verma وآخرون ، وجد أن مركبات الفلافونويد هي أكبر فئة من المركبات ذات النشاط المحتمل ضد فيروسات كورونا (Verma et al. ، 2020).

في 2005 ، Li et al. نشر دراسة حول الأنشطة المضادة للفيروسات للمركبات الطبيعية ضد السارس (Li et al. ، 2005). تم تحديد الليكورين كمركب قوي مضاد للفيروسات ومن المحتمل أن يكون مرشحًا لتطوير أدوية جديدة (Li et al. ، 2005). تم فحص المركبات الطبيعية لقدرتها على استهداف بروتينات SARS-CoV-2. يتضمن ذلك مقتطفات من الأعشاب الطبية وقد ركزت العديد من الدراسات على آثارها المثبطة على البروتينات الرئيسية ، مثل البروتين السكري المرتفع والبروتياز الرئيسي (M pro) (Mani et al.، 2020 Pitsillou et al.، 2020 Russo et al.، 2020 سميث وسميث ، 2020). في ورقة حديثة كتبها Alamri et al. تم استخدام نهج حسابي منظم لتحديد المركبات التي قد تعمل كمثبطات لـ PL pro ويمكن تطويرها بشكل أكبر كعوامل مضادة للفيروسات (Alamri et al. ، تحت الطبع). بالنظر إلى الوضع الحالي ، في السيليكو جعلت الطرق من الممكن فحص المكتبات الكبيرة من المركبات المعتمدة الحالية بطريقة سريعة نسبيًا (Ojha et al. ، 2020). يمكن تحسين هياكل الزيارات التي تم تحديدها من هذه الدراسات الحسابية كجزء من عملية اكتشاف الدواء (Ojha et al. ، 2020). بالإضافة إلى المركبات الدوائية الاصطناعية ، يمكن فحص المكونات العشبية بنفس الطريقة وقد تم وصف هذه الطريقة في العديد من الأوراق (Bhowmik et al.، 2020 Chikhale et al.، 2020 Ghosh et al.، 2020 Gupta et al.، 2020 Jena et al.، 2020 Krupanidhi et al.، 2020 Muhseen et al.، 2020 Sinha et al.، 2020 Subbaiyan et al.، 2020). يتضمن عدد من الدراسات التي يمكن العثور عليها على منصة التسجيل الدولية للتجارب السريرية لمنظمة الصحة العالمية & # x00027s أيضًا مركبات نباتية ، وخاصة مركبات الفلافونويد.

راتيا وآخرون. حددوا التركيب البلوري لـ SARS-CoV في مركب مع ubiquitin aldehyde ووصفوا كيف يتفاعل البولي ببتيد هذا مع مناطق النخيل والأصابع في PL pro (Ratia et al. ، 2014). أكدوا أن كمية كبيرة من طاقة الربط لليوبيكويتين يمكن أن تُعزى إلى مخلفاتها الطرفية C (R72-G76) وأن هذا الجزء من يوبيكويتين يشكل عددًا كبيرًا من روابط الهيدروجين بين الجزيئات مع PL pro (راتيا وآخرون ، 2014 ). أشارت نتائج دراستهم أيضًا إلى أن السارس-CoV PL pro كان له تفضيل يوبيكيتين المرتبط بـ K48 و ISG15 ، على سلاسل K63-polyubiquitin و mono-ubiquitin (Ratia et al. ، 2014). وعلى وجه الخصوص ، تم تمييز موقعين للتعرف على سطح PL pro وتم تعريفهما على أنهما SUb1 أو SUb2 (Ratia et al. ، 2014).

في مجمع SARS-CoV-2 PL pro ، يوجد ubiquitin propargylamide في نفس المجالات الفرعية مثل بنية SARS-CoV (مناطق النخيل والأصابع) ، وتمتد المحطة C إلى الموقع النشط (Klemm et al. ، 2020). مثل SARS-CoV ، وجد أيضًا أن SARS-CoV-2 PL pro يحتوي على موقع ربط يوبيكويتين ثانٍ (SUb2) مهم لربط بوليوبيكويتين (K48-diubiquitin) و ISG15 (Klemm et al. ، 2020). MERS-CoV (مجموعة الفضاء P6522) تم حل مجمع PL pro -ubiquitin بواسطة Bailey-Elkin et al. وفي ورقتهم ، يشيرون إلى هذا الهيكل على أنه التشكل المغلق منذ أن تحول مجال الأصابع نحو اليوبيكويتين (Bailey-Elkin et al. ، 2014).

عندما كان يوبيكويتين موجودًا في هياكل SARS-CoV-2 و SARS-CoV و MERS-CoV PL pro ، أظهرت النتائج من Schr & # x000F6dinger ورسو السفن العمياء أن المركبات تم إزاحتها من جيب ربط مثبط النفثالين (الأشكال 3 و 4 و الأشكال التكميلية 1 ، 2). مقارنةً بـ apo PL pro ، لم يكن hypericin قادرًا على إنتاج أوضاع الالتحام الجزيئي لمجمعات PL pro -ubiquitin. وبالمثل ، كشفت نتائج الالتحام بالبروتين مع الروابط المرتبطة بالفعل بهذه المنطقة في PL pro أن يوبيكويتين كان مرتبطًا في تركيبات مختلفة وأن موضع الطرف C قد تم تغييره (الشكل 5). يشير هذا إلى أن المركبات الغذائية قد تكون قادرة على التدخل في نشاط deubiquitinase لـ PL pro ومن حيث في السيليكو الطرق ، يمكن تقييم ذلك بشكل أكبر باستخدام محاكاة الديناميكيات الجزيئية (MD).

تم استخدام مقايسة إنزيمية PL pro المتاحة تجاريًا لقياس نشاط deubiquitinase باستخدام GRL-0617 كعنصر تحكم إيجابي داخلي في هذا الاختبار المحدد ، وقد ثبت أن GRL-0617 يحتوي على IC50 قيمة 1.7 & # x003BCM لتثبيط نشاط PL pro deubiquitinase (BP Bioscience). بشكل عام ، أشارت النتائج التي توصلنا إليها إلى التثبيط بترتيب فاعلية GRL-0617 و hypericin & # x0003E rutin و cyanidin-3-O-glucoside & # x0003E epigallocatechin gallate و epicatechin gallate & # x0003E & # x0003E cefotaxime. GRL-0617 و hypericin & # x0003E rutin & # x0003E cyanidin-3-O-glucoside و epicatechin gallate & # x0003E cefotaxime و epigallocatechin gallate (الشكل 6). يعتبر التثبيط القوي لنشاط PL pro deubiquitinase بواسطة hypericin والذي ، بتركيزات أعلى ، مشابهًا لـ GRL-0617 ، أمرًا مشجعًا بشكل خاص. Hypericin هو مشتق anthraquinone يمكن العثور عليه في النبات المزهر عشبة القديس يوحنا، والتي تُعرف أيضًا باسم نبتة سانت جون & # x00027s (Napoli et al. ، 2018). تم تحديده كمركب رئيسي لبروتين السارس SARS-CoV-2 وكانت خصائصه المضادة للفيروسات موضوعًا للعديد من الأوراق في الماضي (Jacobson et al. ، 2001 Shih et al. ، 2018 Chen et al. ، 2019 ). بالإضافة إلى آثاره المضادة للفيروسات ، يتم أيضًا التحقيق في نبتة سانت جون & # x00027s لخصائصه المضادة للاكتئاب وقد اكتسب هايبرسين الاصطناعي (SGX301) الانتباه لاستخدامه كعامل ضوئي ديناميكي في علاج سرطان الغدد الليمفاوية التائية الجلدي (Rook et al. .، 2010 Montoya et al.، 2015 Apaydin et al.، 2016).

بينما تم اختيار مركبات معينة لاستخدامها في هذه الدراسة ، سيكون من المهم توسيع هذا في المستقبل لدمج عدد أكبر من المواد الكيميائية النباتية الموجودة في المستخلصات النباتية المختلفة. كما يتم استخدام علم الصيدلة الشبكي بشكل متزايد في اكتشاف الأدوية ويمكن أن يساعد هذا النهج المنهجي في تحديد أهداف البروتين المحتملة ومركبات الرصاص ، بالإضافة إلى فهم آليات عملها (Zhang et al.، 2019 Pan H. D. et al.، 2020). ومع ذلك ، فإن الخصائص المضادة للفيروسات ومضادات الأكسدة والمضادة للالتهابات للمركبات المستخدمة في هذه الدراسة قد تم الإبلاغ عنها مسبقًا في الأدبيات وبالتالي كانت مرشحة مناسبة. تم استخدام الالتحام الجزيئي للفحص الافتراضي وعلى الرغم من أن وظائف التسجيل الناتجة عن طاقات الربط المطلقة لرسو السفن & # x00027t ، فقد سمحت بإجراء تنبؤات حول تفاعلات البروتين الرابط. تم إجراء الإرساء باستخدام بروتوكول Glide (XP) الخاص بـ Schr & # x000F6dinger Suite وفي دراسة أجراها Wang et al. ، تم العثور على معدل نجاح بنسبة 90 ٪ في تحديد أوضاع الربط الصحيحة للروابط (Wang et al. ، 2016). في هذه الدراسة ، تم قياس الأنشطة المثبطة للمركبات لاحقًا باستخدام مقايسة النشاط الأنزيمي. في السيليكو يتم استخدام الأدوات حاليًا للمراحل المبكرة من خط أنابيب اكتشاف الأدوية ، ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن خط الأنابيب يتضمن خطوات متعددة وهي عملية تستغرق وقتًا طويلاً (Agostino et al. ، 2019). يجب استكشاف العقاقير المحتملة بشكل أكبر في التجارب قبل السريرية باستخدام مجموعة من التقنيات والتجارب السريرية (Agostino et al. ، 2019).


الملخص

من مكتبة اندماجية كبيرة من الببتيدات ثنائية الحلقات المقيدة كيميائيًا ، قمنا بعزل انتقائي وقوي (كأنا = 53 نانومتر) مثبط لمنشط البلازمينوجين من نوع urokinase البشري (uPA) وبلور المركب.كشف هذا عن بنية ممتدة من الببتيد مع كل من حلقات الببتيد التي تشرك الهدف لتشكيل سطح تفاعل كبير من 701 2 مع روابط هيدروجينية متعددة وتفاعلات شحنة تكميلية ، مما يفسر التقارب العالي وخصوصية المثبط. تشبه الواجهة تلك الموجودة بين بروتينين وتشير إلى أن هذه الببتيدات المقيدة لديها القدرة على العمل كمقلدات بروتين صغيرة.


دور أنظمة Ubiquitin-Proteasome في بيولوجيا وفوعة الطفيليات الأولية

في الخلايا حقيقية النواة ، تؤدي البروتيازومات أدوارًا حاسمة في العديد من المسارات الخلوية عن طريق تحطيم البروتينات لفرض مراقبة الجودة وتنظيم العديد من العمليات الخلوية مثل تقدم دورة الخلية ، ونقل الإشارة ، وموت الخلايا ، والاستجابات المناعية ، والتمثيل الغذائي ، ومراقبة جودة البروتين ، والتنمية. القلب التحفيزي لهذه المجمعات ، البروتيازوم 20S ، محفوظ بشكل كبير في البكتيريا والخميرة والبشر. ومع ذلك ، حتى سنوات قليلة ماضية ، كان دور البروتيازومات في بيولوجيا الطفيليات غير معروف تمامًا. هنا ، نلخص النتائج حول دور البروتيازومات في بيولوجيا الطفيليات الأولية والفوعة. أكدت العديد من التقارير دور البروتيازومات في العمليات البيولوجية للطفيليات مثل تمايز الخلايا ، ودورة الخلية ، والتكاثر ، والتكيس. يعد الانتشار وتمايز الخلايا خطوات أساسية في استعمار المضيف. بالنظر إلى أهمية البروتيازومات في كلتا العمليتين في العديد من الطفيليات المختلفة مثل المثقبيات ، الليشمانية ، التوكسوبلازما ، و Entamoeba، البروتيازومات الطفيلية قد تكون بمثابة عوامل ضراوة. تشير العديد من الأدلة بقوة إلى أن مسار اليوبيكويتين-البروتوزوم هو أيضًا هدف علاجي طفيلي قابل للتطبيق. أظهرت الأبحاث في السنوات الأخيرة أن البروتيازوم هو هدف دوائي صالح لمرض النوم والملاريا. بعد ذلك ، تعتبر البروتيازومات عضية رئيسية في بيولوجيا الطفيليات وفراعتها ويبدو أنها هدف علاجي كيميائي جديد وجذاب.

1 المقدمة

في ورقة نشرت عام 1978 ، Ciehanover et al. [1] أبلغ عن وجود مكون متعدد الببتيد مستقر للحرارة لنظام التحلل البروتيني المعتمد على ATP المعزول من الخلايا الشبكية. ذكرت ورقة ثانية من نفس الباحثين أن الاقتران المعتمد على ATP لبروتينات الخلايا الشبكية إلى عديد الببتيد كان مطلوبًا لتدهور البروتين [2]. بناءً على هذه النتائج ، Hershko et al. [3] اقترح في عام 1980 أن ربط اليوبيكويتين بالبروتينات يستهدفها للتحلل بواسطة البروتياز الذي يعمل بشكل خاص على البروتينات مع العديد من جزيئات اليوبيكويتين المرتبطة [3 ، 4]. اكتشف هوغ وزملاؤه "البروتياز" ، وهو البروتياز 26S ، الذين أبلغوا عن تحديد وتوصيف البروتياز المعتمد على ATP من محللات الخلايا الشبكية للأرانب [5]. التأثير الحقيقي لهذا الاكتشاف سيكون له أبعاد في العقود القادمة. في الواقع ، لم يكن عمل هيرشكو على إنزيمات يوبيكويتين مناسبًا فحسب ، بل ساهم في فتح مجال بحثي جديد كان غامضًا وغير مستكشف في ذلك الوقت. جائزة نوبل في الكيمياء لعام 2004 ، التي مُنحت إلى هيرشكو وسيتشانوفر وروز "لاكتشاف تحلل البروتين بوساطة يوبيكويتين" ، لم تكن فقط اعترافًا بهؤلاء الباحثين ولكن اعترافًا بأهمية مسار اليوبيكويتين البروتيني للحياة من الخلية والصحة والمرض والعدوى والمناعة [6]. ساهم العديد من الباحثين في معرفتنا الحالية لهذا المسار البيولوجي. تم بالفعل نشر العديد من المراجعات ذات الصلة. في هذا السياق ، الهدف الرئيسي من هذه المراجعة هو جذب الانتباه إلى دور جديد للبروتيازومات: بيولوجيا وضراوة الطفيليات الأولية. سيتم تلخيص الجوانب العامة لمسارات ومثبطات اليوبيكويتين-البروتوزوم فقط.

2. نظام Ubiquitin-Proteasome

يتم تنفيذ الجزء الأكبر من دوران البروتينات داخل الخلايا في الخلايا حقيقية النواة من خلال نظامين مستقلين للبروتين ، وهما الليزوزومات والبروتيازومات. تتحلل معظم البروتينات بواسطة نظام اليوبيكويتين البروتيازومي (UPS) [6].

البروتيازومات عبارة عن مجمعات كبيرة تؤدي أدوارًا مهمة في العديد من المسارات الخلوية عن طريق تحطيم البروتينات في العصارة الخلوية ونواة الخلايا حقيقية النواة لفرض مراقبة الجودة وتنظيم العديد من العمليات الخلوية الأساسية. من بين هذه العمليات التقدم خلال دورة الخلية ، ونقل الإشارة ، وموت الخلية ، والاستجابات المناعية ، والتمثيل الغذائي ، ومراقبة جودة البروتين ، والتطور ، حيث تتحلل البروتينات البروتينية المنظمة قصيرة العمر أو البروتينات الشاذة هيكليًا [٦ ، ٧]. القلب التحفيزي لهذه المجمعات ، البروتيازوم 20S ، محفوظ بشكل كبير في البكتيريا والخميرة والبشر [8] ، مع وجود نسخ أبسط أيضًا في بعض العتيقة وبدائيات النوى.

20S proteasome عبارة عن مجموعة على شكل برميل مكونة من 28 وحدة بروتينية فرعية. إنه يشكل جسيم معبأ ، نتيجة التراص المحوري لاثنين من الخارج α حلقات داخلية واثنين β حلقات مكونة من سبع حلقات مرتبطة هيكليا α و β وحدات فرعية تشكل الحلقات α1–7β1–7β1–7α1–7 بنية. تحتوي الوحدات الفرعية الثلاثة لكل حلقة داخلية على بقايا ثريونين نشطة تحفيزيًا عند الطرف N الخاص بها وتُظهر نشاط N-terminal nucleophile hydrolase ، مما يشير إلى أن البروتيازوم عبارة عن بروتياز ثريونين [8]. ال β1, β2 و βيرتبط الشكل 5 بأنشطة شبيهة بالكاسبيز ، تشبه التربسين ، وكيموتريبسين ، على التوالي ، والتي تمنح القدرة على تشقق روابط الببتيد في الجانب C الطرفي لبقايا الأحماض الأمينية الحمضية ، الأساسية ، والطارئة للماء ، على التوالي. تلك الروابط التي تتبع الجلايسين والبرولين تكون أقل سهولة في الانقسام [9]. كما كشفت الدراسات الهيكلية التي أجراها هوبر وزملاؤه [10 ، 11] ، فإن الإزالة الكارثية المحتملة للركائز غير المناسبة يتم منعها عن طريق عزل المواقع النشطة داخل الهيكل المجوف لبروتيازوم 20 ثانية. تصل الركائز إلى الغرفة الحفازة المركزية من خلال المنافذ المحورية في الحلقات النهائية لـ α الوحدات الفرعية [12] ، على الرغم من عدم وجود المنشطات ، يتم إغلاق هذه القنوات ويتم قمع نشاط البروتياز. يعمل البروتيازوم 20S على تحطيم بروتينات العميل بشكل عملي ، مما ينتج عنه ترتيب قليل الببتيدات في الطول من 3 إلى 15 من الأحماض الأمينية. يتم بعد ذلك تحلل نواتج الببتيد الناتجة إلى أحماض أمينية بواسطة أوليغوبيبتيدازز و / أو ببتيدات أمين كربوكسي [9].

يتم تنشيط البروتيازومات بواسطة مجمعات البروتين التي ترتبط بحلقات نهاية α الوحدات الفرعية. المنشط الأكثر شهرة هو PA700 [المنشط البروتيازومي MW 700 ، المعروف أيضًا باسم 19S أو المركب التنظيمي (RC)] ، والذي تم حفظه بشكل كبير من الخميرة إلى البشر ويرتبط ببروتيازوم 20S لتشكيل البروتيازوم 26S. PA700 هو المنشط الوحيد للبروتياز ، المعروف بتحفيز تحلل ركائز البروتين. وبالتالي ، يُعتقد أن PA700 هو الوسيط في معظم التأثيرات البيولوجية للبروتيازوم من خلال تسهيل تدهور الركيزة [13 ، 14]. على عكس PA700 ، فإن مركبين بروتينيين آخرين محفوظين تطوريًا ثبت أنهما يرتبطان على وجه التحديد وينشطان البروتيازومات 20S ضد ركائز الببتيد النموذجية ، PA28 (المعروف أيضًا باسم 11S أو REG) [7 ، 15] و PA200 [7 ، 16] ، لا تتعرف على البروتينات المنتشرة أو تستخدم ATP. المنشط البروتيازومي PA200 يعزز الانقسام البروتيازومي بعد المخلفات الحمضية في المختبر ومع ذلك ، استجابة للإشعاع المؤين ، تشكل PA200 بروتيازومات هجينة مع أغطية 19S و 20S بروتيازومات أساسية تتراكم على الكروماتين ، مما يؤدي إلى زيادة نشاط التحلل البروتيني. تم الإبلاغ عن دور فريد لـ PA200 في الاستقرار الجيني ، والذي من المحتمل أن يتم توسطه من خلال قدرته على تعزيز انقسام ما بعد الجلوتاميل بواسطة البروتيازومات ، [17]. Blm10 / PA200 (خميرة الخميرة/ الإنسان) لا يستخدم ATP ويعتقد عمومًا أنه يحفز التحلل المائي للببتيدات ولكن ليس البروتينات. تم اقتراح Blm10 / PA200 للعمل في مجموعة متنوعة من العمليات بشكل مدهش [18] ، بما في ذلك تجميع البروتوزوم 20S [19] ، وإصلاح الحمض النووي [20] ، والاستقرار الجيني [17] ، وتثبيط البروتوزوم [21] ، وتكوين الحيوانات المنوية [22] ، وتنظيم نقاط تفتيش الميتوكوندريا [23]. ومع ذلك ، فقد تم أيضًا وصف مثبطات داخلية مثل Hsp 90 و P131 و PR 39 و Tat. تمت مراجعة الدور البيولوجي لبروتيازوم 26S ومنشطاته ومثبطاته على نطاق واسع في مكان آخر [5 ، 7 ، 24 ، 25]. ظهرت آليات تنظيمية جديدة. مجمع PAN ATPase الأثري متماثل مع حقيقيات النوى 19S ATPases ويحتوي على شكل C محمي مسعور- التيروزين- X (HbYX) ، أي أنه ضروري لـ PAN لربطه بـ 20S proteasomes وفتح قناته المسورة لدخول الركيزة [ 26]. يمكن إحداث فتح البوابة بواسطة الببتيدات الطرفية C من الوحدات الفرعية 19S ATPase ، Rpt2 ، و Rpt5 ، ولكن ليس بواسطة الببتيدات الطرفية C من PA28 / 26 ، والتي تفتقر إلى نموذج HbYX وتتسبب في فتح البوابة بآليات متميزة. كما تم إثبات أن بقايا الطرف C في 19S ATPases ضرورية لبوابة واستقرار البروتيازوم 26S. وبالتالي ، فإن الطرف C الخاص بأحزمة ATPsomal تعمل مثل "مفتاح في قفل" للحث على فتح البوابة والسماح بدخول الركيزة [26]. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات أن ربط ركائز polyUb بمنظم 19S يثبت فتح بوابة البروتيازوم 20S ويؤدي إلى تغييرات توافقية في البروتيازوم 20S التي تسهل توجيه الركائز ووصولها إلى المواقع النشطة. نتيجة لذلك ، تحفز ركائز polyUb بشكل خافت تحللها ، مما يعزز أنشطة الببتيداز لبروتياز 20S حوالي ضعفين في عملية تتطلب تحلل ATP المائي [27]. بالإضافة إلى ذلك ، تشير مجموعة من الأدلة التي تم نشرها مؤخرًا إلى أن العديد من وظائف البروتياز ، مثل التعرف على الركيزة ، و deubiquitylation ، والتفتت ، والتدهور ، يبدو أنه يتم التحكم فيها بشكل متباين [28 ، 29].

في هذا المسار ، يتم استهداف البروتينات للتحلل عن طريق الربط التساهمي مع يوبيكويتين. Ubiquitination يميز البروتين المستهدف بالبروتينات الشبيهة باليوبيكويتين (UBLs) ، مثل يوبيكويتين ، ومعدلات صغيرة تشبه اليوبيكويتين (سومو) ، و NEDD8. Ubiquitination هو تعديل لاحق للترجمة للبروتينات حيث يكون المعدل عبارة عن بولي ببتيد مترافق مع البروتينات المستهدفة بواسطة رابطة إيزوببتيد بين ركائز البروتوزوم: الطرف C من يوبيكويتين وواحد أو أكثر من سلاسل ليسين الجانبية في البروتينات المستهدفة [30]. يحدث تعديل البروتين بواسطة يوبيكويتين في ثلاث خطوات متتالية بوساطة ثلاثة إنزيمات: الإنزيم المنشط E1 ، والإنزيم المُقترن E2 ، ويوبيكويتين ليغاز E3. هذا التعديل قابل للعكس ، ويمكن إزالة البروتينات المتواجدة في كل مكان من البروتين بواسطة إنزيمات deubiquitizing محددة [30 ، 31]. يمكن لجزيئات Ubiquitin أن تشكل سلاسل بوليوبيكويتين مترافقة مع البروتينات المستهدفة ، والتي عادة ما يتم التعرف عليها وتدهورها بواسطة البروتوزوم [30 ، 32] ومع ذلك ، فإن المعرفة الحالية لـ UPS تشير بقوة إلى أن انتشار البروتين يبدو ضروريًا ولكنه ليس ضروريًا. تشير ورقة بحثية حديثة إلى أن البروتيازومات يمكن أن تحلل نسبة كبيرة من البروتينات الخلوية بشكل مستقل عن الانتشار. بعد ذلك ، تتعرف البروتيازومات 26S بشكل خاص على المواقع المتشابهة وتشقها ، بغض النظر عن الانتشار ، مما يشير إلى أن المناطق المضطربة من المحتمل أن تشكل إشارة هيكلية عالمية لتحلل البروتينات الركيزة البروتوزومية بواسطة البروتيازومات. وبنفس الطريقة ، فإن تثبيط إنزيم يوبيكويتين المنشط E1 لا يمنع تدهور ركائز البروتوزوم الذاتية [33].

اكتملت الصورة بواسطة إنزيمات deubiquitising (DUBs) [30 ، 34]. إنهم يولدون شقوق Ub مجانية من منتجات الترجمة الأولية الخاصة بهم ، ويعيدون تدوير اليوبيكويتين أثناء تحلل اتحادات البروتين متعدد اليوبيكويتين ، و / أو يعكسون تأثيرات التواجد في كل مكان. جميع DUBs التي تم اختبارها لها خصوصية ملحوظة بالنسبة إلى يوبيكويتين. وقد تورطت DUBs في مجموعة متنوعة من العمليات في الحيوانات والخميرة ، مما يشير إلى أن DUBs الفردية محددة الهدف [34]. الاحتمال المثير للاهتمام هو أن بعض DUBs يمكنها أيضًا تنظيم نصف عمر البروتين عن طريق عكس التواجد في كل مكان. يقوم عدد كبير من الجينات بتشفير إنزيمات deubiquitizing ، مما يشير إلى أن العديد منها لها وظائف محددة ومنظمة للغاية. ومن المثير للاهتمام أن العديد من هذه الإنزيمات موضعية في الهياكل تحت الخلوية أو المجمعات الجزيئية. تلعب هذه التعريب أدوارًا مهمة في تحديد الخصوصية الوظيفية ويمكن أن يكون لها تأثيرات كبيرة على أنشطتها التحفيزية [34]. في الواقع ، تشير النتائج الحديثة بقوة إلى أن التواجد في كل مكان ينظمه كل من مسارات محددة من التواجد في كل مكان و deubiquitination. باختصار ، يتم ربط ركائز البروتين أولاً بجزيئات متعددة من يوبيكويتين ثم يتم تحلل ركائز اليوبيكويتين بسرعة بواسطة البروتيازوم 26S ، وهو مركب معتمد على ATP يشتمل على بروتيازوم 20S الأساسي محاطًا بمجمعين تنظيميين منشط بروتياز (19S). تقوم إنزيمات إزالة التكاثر بإعادة تدوير جزيئات يوبيكويتين ويتم تعديل المسار بواسطة منشطات ومثبطات البروتين. ويرد نظرة عامة على نظام يوبيكويتين بروتيازوم في الشكل 1.

باختصار ، مسار اليوبيكويتين-البروتياز ليس مجرد آلة تحلل تركز على تدمير البروتينات القديمة أو التالفة. هذا المسار هو نقطة تحكم رئيسية لتنظيم ، من بين أمور أخرى ، البروتينات قصيرة العمر التي تعمل كعوامل تنظيمية في مجموعة كبيرة من العمليات الخلوية مثل تقدم دورة الخلية [35] ، ونمو الخلايا ، ونسخ الجينات الخاص بالمرحلة [36] ، الاستجابة الالتهابية [37] ، ومعالجة المستضد [32]. تحتوي البروتيازومات حقيقية النواة 20S على العديد من أنشطة الببتيداز ، بالإضافة إلى أنشطة نوكلياز endoribonuclease والبروتين chaperone وأنشطة DNA-hellase [38].

حتى سنوات قليلة ماضية ، كان دور البروتيازومات في بيولوجيا الطفيليات غير معروف تمامًا.

3. دور البروتيازومات في بيولوجيا الطفيلي والفوعة

البروتوزوان الطفيلية هي خلايا أحادية الخلية ولكنها معقدة تخضع لأحداث تمايز متعددة لاستيعاب مختلف العوائل والبيئات المادية التي يواجهونها في دورات حياتهم.

تشارك بعض البروتياز في تمايز المراحل المعدية لعدد صغير من طفيليات الأوليات إلى مراحلها المسببة للأمراض [39-41]. تم إثبات الدور المركزي الذي تلعبه الأنشطة التحليلية لنظام البروتوزوم / يوبيكويتين في تنظيم التوازن الخلوي في عدد كبير من الفطريات وحقيقيات النوى الأعلى ، ومؤخرًا في الطفيليات الأولية [42].

السمة البارزة لدورة حياة الطفيليات المسببة للأمراض هي التغيرات المورفولوجية العميقة التي تتعرض لها أثناء التطور في مضيفات الفقاريات واللافقاريات. هذه التغييرات التنموية ، التي يجب خلالها على الشكل والحجم والهياكل الهيكلية للخلايا أن تتكيف مع المرحلة الجديدة ، تنطوي على تحلل بروتيني واسع النطاق ومراقب بعناية. قادنا السؤال المثير للاهتمام حول ماهية نظام التحلل البروتيني المتورط في تحلل البروتين في الطفيليات إلى التحقيق في دور البروتيازومات في تمايز الطفيليات الأولية.

تتشابه بروتيازوم 20S للطفيليات الأولية في التشكل والحجم مع البروتيازوم 20S المعزول من البكتيريا القديمة والخميرة والثدييات. وبالمثل ، فإن تكوين الوحدات الفرعية للبروتوزوا يشبه إلى حد بعيد تلك الموجودة في البروتيازومات حقيقية النواة ، مع α و β الوحدات الفرعية بدلاً من النوع الفردي α و β الوحدة الفرعية الموصوفة في البروتيازومات البدائية. وجدت الدراسات التي أجريت في مختبرات مختلفة ونماذج مختلفة أن تثبيط وظيفة البروتوزومال يثبط مراحل معينة من التمايز المورفولوجي في المثقبيات, المتصورة ، و Entamoeba وتكرار المتصورة, التوكسوبلازما, الليشمانيا، و المثقبيات ومع ذلك ، لا يتم منع غزو الخلية المضيفة في المثقبيات, المتصورة, الليشمانيا ، أو التوكسوبلازما. لوحظت اختلافات بين البروتيازومات في الثدييات والطفيليات (المثقبيات) ، وكذلك الاختلافات في الهياكل المناعية (المثقبيات و التوكسوبلازما) والأنشطة الأنزيمية (المثقبيات و Entamoeba). تشير هذه الاختلافات إلى أن بروتوزومات طفيلي الأوالي يمكن اعتبارها هدفًا للعلاج الكيميائي ، على الرغم من أن هذه العضية موجودة أيضًا في جميع الخلايا المضيفة حقيقية النواة. في خلايا الثدييات ، يعتبر نظام بروتياز يوبيكويتين ضروريًا لجميع الخلايا حقيقية النواة ، وبالتالي فإن أي تغيير في مكوناتها له عواقب مرضية محتملة [43]. يمكن أن يؤدي العلاج الكيميائي الذي يستهدف البروتيازومات الطفيلية إلى علاجات ناجحة.

فيما يلي النتائج الرئيسية التي تم الإبلاغ عنها في الأدبيات فيما يتعلق بدور البروتوزومات الطفيلي الأولي.

3.1. كريبتوسبوريديوم

تسلسل DNA يتكون من 1281 نيوكليوتيدات (nt) يتكون من إطار قراءة مفتوح واحد (ORF) يشفر بروتيازوم 20S المفترض βتم عزل الوحدة الفرعية من النوع الأول من كريبتوسبوريديوم بارفوم. اقترح تحليل اللطخة الجنوبية أن الحمض النووي المتسلسل موجود في جيم بارفوم الجينوم كنسخة واحدة. يتكون البروتين المتوقع من 210 من الأحماض الأمينية (aa) ، بما في ذلك الأحماض الأمينية المميزة الشائعة لجميع الوحدات الفرعية من البروتوزوم ، وهو أكثر شبهاً بالوحدة الفرعية من النوع بيتا 1 من الخميرة من الأنواع الأخرى من وحدات بيتا الفرعية [44]. لم تفحص أي دراسات دورها البيولوجي.

3.2. الجيارديا

يحتوي الطفيل على جين واحد يشفر المونوبيكويتين ، ومع ذلك ، فقد أظهرت فحوصات الرحلان الكهربائي ثنائية الأبعاد أن الجيارديا يبدو أن بروتين 20S معقد مثل حقيقيات النوى الأخرى [45]. دراسة الجينات السبعة التي تقوم بتشفير ملف α الوحدات الفرعية لل G. الاثني عشر أشار proteasome إلى أن ملف α- تطورت عائلة جينات البروتيزوم بسرعة من جين واحد في العتائق إلى سبعة أو أكثر من الجينات في حقيقيات النوى [46]. ال G. الاثني عشر يبدو أن بروتين 20S مشابه لتلك الموصوفة في الخلايا حقيقية النواة ، والتي تحتوي على مجموعة متباينة من α الوحدات الفرعية [47]. تم إجراء مقاربات البروتيوميات لاكتشاف البروتينات الجديدة المرتبطة بالمرحلة المحددة ، والحويصلات الخاصة بجولجي (ESV) التي حددت العوامل السيتوبلازمية واللمعية لنظام مراقبة جودة الشبكة الإندوبلازمية ، أي عدة هيكلية (α) ومحفز (β) الوحدات الفرعية البروتياز. في المقابل ، تخضع مجمعات البروتيازوم السيتوبلازمية لعملية إعادة توطين منظمة تنمويًا إلى ESVs أثناء التحام. في خلايا الثدييات وفي الخميرة ، تتوضع مجمعات البروتياز في أغشية ER بالإضافة إلى السيتوبلازم والنيوكليوبلازم. أظهر تحليل الفحص المجهري متحد البؤر أن المركب الأساسي giardial 20S وهيكل غطاء 19S كانا مرتبطين بأغشية ESV أثناء التكوّن المبكر حتى 7 ساعات على الأقل بعد الحث. كما لوحظ سابقًا ، لا يتم تنظيم التعبير عن الوحدات الفرعية البروتيازومية في الخلايا المشفرة [47]. أشارت بيانات الفحص المجهري متحد البؤر إلى إعادة تمركز من مواقع أكثر محيطية في السيتوبلازم إلى محيط ESVs ، مما يشير إلى ارتفاع معدل النقل الرجعي لبروتينات العضية المخصصة للتدهور. في ضوء هذه النتائج ، اقترح المؤلفون أن تجنيد البروتياز أثناء التحفيز هو نتيجة لمراقبة الجودة وعمليات نضج البضائع في ER و ESVs المبكرة (مثل طي البروتين ، والتبديل غير المتماثل ، والتشذيب) مما ينتج عنه كميات كبيرة من المواد المخصصة للتحلل [ 48].

3.3. Entamoeba

تم وصف نشاط 20S في البروتيازومات بناءً على نمط SDS-electrophoretic وتحليل طقطقة مناعية للذوبان. المتحولة الحالة للنسج استخراج مجزأة بواسطة الطرد المركزي التدرج الكثافة [49]. دراسة هستوليتيكا أكد البروتين وجود مكونات يوبيكويتين بروتيازوم [50]. من ناحية أخرى ، فإن الجينات المشفرة لملف α تُظهر الوحدات الفرعية البروتيازوم هوية أعلى مع بروتيازوم الثدييات (60.1٪ تماثل مع بروتيازوم الفئران و 60.5٪ مع بروتيازوم بشرية) من البروتيازومات من اسيدوفيلوم ثيرموبلازما و خميرة الخميرة (39.5٪ و 53.8٪ على التوالي).في هستوليتيكا trophozoites ، لم يكن التوطين النووي لمجمع 20S واضحًا حتى من خلال الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة [51]. بدلاً من ذلك ، لوحظ تفاعل الفلورسنت ضد الوحدات الفرعية البروتوزومية EhotS و EhS2 حصريًا في العصارة الخلوية ، حيث أظهر توزيعًا متجانسًا مع عدم وجود استبعاد ظاهري للمقصورات التي تشبه جهاز ER و Golgi ، كما لوحظ في أنواع الخلايا الأخرى [30 ، 51].

في الآونة الأخيرة ، متعددة هستوليتيكا تم استنساخ وتمييز مكونات التواجد الشامل ، بما في ذلك يوبيكويتين وإنزيمات التنشيط (E1) ، والتصريف (E2) ، والربط (E3). يتم تنشيط EhUbiquitin بواسطة وتشكيل رابطة thioester مع EhUba1 (E1) في المختبر بطريقة تعتمد على ATP والمغنيسيوم. وفقًا للمؤلفين ، يُظهر EhUba1 سرعة ابتدائية قصوى أكبر لتبادل بيروفوسفات-ATP من نظيره البشري ، مما يشير إلى أن حركيات مختلفة لتنشيط يوبيكويتين قد توجد في هستوليتيكا [52].

في أميبا الزواحف ، Entamoeba يغزو، يتم تثبيط التحفيز بواسطة لاكتاسيستين ، وهو مثبط محدد وغير قابل للانعكاس للبروتيازومات [53] ومع ذلك ، يبدو أن لاكتاسيستين ليس له تأثير على E. الغزاة استثارة [54].

3.4. الليشمانيا

هذه الطفيليات هي طفيليات طفيليات أولية ذات مرحلة داخل الخلايا تسمى amastigote تتكاثر في الضامة الثديية ومرحلة خارج الخلية تسمى البروماستيجوت الذي يتكاثر في أمعاء حشرة بلع دموية تنتمي إلى الجنس Lutzomyia.

البروتيازومات المنقى من L. مكسيكانا تمت دراستها باستخدام التفريد الكهربي بولي أكريلاميد-جل (SDS-PAGE) ، وكشف عن 10 نطاقات مختلفة بكتل تتراوح بين 22 و 32 كيلو دالتون ، مما يشير إلى تعقيد مماثل لتلك الموجودة في البروتيازومات حقيقية النواة [55]. يتأثر اللاكتاسيستين L. مكسيكانا النسخ المتماثل فقط عند استخدامه بتركيزات أعلى من 5 ميكرومترم ، بينما منعت MG132 نفس العملية بتركيزات أقل. قد تكون هذه التناقضات بسبب انخفاض سعة L. مكسيكانا لدمج هذه المثبطات. وفقًا لكريستنسن وآخرون. [56] ، مستضد جديد يشبه α تم تحديد الوحدة الفرعية للبروتيازوم البشري 20S في الليشمانيا. هذا المستضد (LePa) مناعي في البشر. علاوة على ذلك ، أدى لقاح الحمض النووي المستند إلى مستضد LePa إلى انخفاض أولي في حجم الآفات عندما تم تحدي الفئران مع الليشمانيا الكبرى. المناعة القوية لـ الليشمانيا تم تأكيد بروتيازوم بواسطة Couvreur et al. [57] ، الذي ذكر أن Antigen 24 ، وهو مركب مناعي معزول عن الليشمانيا الطفولية يستخدم كمستضد مرجعي في التشخيص المناعي لداء الليشمانيات الحشوي البشري ، وتم التعرف عليه من خلال مصل الأرانب المحصنة بالمطهر. L. مكسيكانا البروتيازومات. من ناحية أخرى ، فإن ليشمانيا شاغاسي تمت تنقية البروتيازوم جزئيًا وأظهر حساسية تجاه لاكتاسيستين وكلاستو لاكتاسيستين بيتا لاكتون ، مما أدى إلى حجب في المختبر نمو مرحلة البروماستيجوت. على الرغم من أن المعالجة المسبقة للبروماستيغوت باللاكتاسيستين لم تمنع غزو الخلية ، يبدو أن وظيفة البروتوزومال ضرورية لتكرار وبقاء الماستيغوت داخل الخلايا في الخلية المضيفة [58].

متزامن الليشمانيا الثقافات ، دوبيساي وآخرون. [59] ذكرت التنظيم المعتمد على دورة الخلية لمستويات البروتين. يوجد كينيسين يسمى LmjKIN13-1 بكثرة في مرحلة G2 + M ويوجد عند مستويات منخفضة جدًا بعد الانقسام الفتيلي. يتحلل هذا البروتين من خلال مسارات يوبيكويتين-بروتيازوم ، مما يدل على أنه يحتوي على إشارات تحلل زائدة عن الحاجة C-terminal. هذه الملاحظة تشير إلى أن في الليشمانيا، حيث يكون التنظيم اللاحق للجلد نادرًا أو غائبًا ، يبدو أن البروتيازوم يشارك في تنظيم مستويات البروتين [59]. من ناحية أخرى ، في الليشمانيا دونوفاني ، تم الإبلاغ عن تدهور اختزال البتيريدين 1 (PTR1). في الليشمانيا، PTR1 هو إنزيم أساسي في استقلاب البتيرين والفولات. دراسات اللطخة الغربية باستخدام L. donovani أظهرت العدوى المنقولة بواسطة PTR1-GFP أن PTR1 قد تدهور في المرحلة الثابتة للنمو ، عندما تبدأ الطفيليات في تكوين الميتاسكلوجين. وبالمثل ، تم تحديد صندوق تدمير محتمل يتكون من تسعة أحماض أمينية (Q63ADLSNVAK71) وبقايا ليسين K156 (كموقع لاقتران يوبيكويتين) في L. donovani PTR1. تشير هذه النتيجة إلى أن تحلل PTR1 خلال المرحلة الثابتة من النمو يتم بوساطة البروتيازومات ، مما يؤدي إلى انخفاض مستويات H4-biopterin ، مما يعزز تكوين الميتاسكلوجين وبالتالي ينتج عنه مراحل طفيلي شديدة العدوى [60]. ثبت أن اثنين من مثبطات الأنزيم البروتيني لفيروس نقص المناعة البشرية ، وهما إندينافير وساكوينافير ، يعوقان وظائف البروتياز وقد لوحظت تأثيرات على نمو L. الكبرى و الليشمانية الطفولية. بعد 24 ساعة من العلاج ، أظهر كلا الدواءين نشاطًا مضادًا للجرعة يعتمد على الجرعة ، مع قيم جرعة مميتة تبلغ 50٪ (LD50) ، 8.3 ميكرومترم و 7 ميكرومترم على L. الكبرى، ونشاط بسيط في L. infantum. تشير هذه النتائج إلى إمكانية استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني هذه ضد العدوى الانتهازية في المرضى المصابين بالمصل المعالجين [61].

كما تم الإبلاغ عنها في L. donovani أن البروتوزوم يشارك في تقليل تنظيم ميثيونين أدينوسيل ترانسفيراز (MAT) ، وهو إنزيم مهم لعمليات التمثيل الغذائي ، يلعب منتجه ، S-adenosylmethionine (AdoMet) ، دورًا رئيسيًا في الميثيلين العابر ، والكبريتات العابرة ، وتخليق البوليامين. منع وجود مثبطات البروتوزوم مثل MG-132 و MG-115 و epoxomicin و lactacystin في وسط الاستزراع من تدهور MAT في كل من سلالات الليشمانية MAT-overexpressing و "المنقولة الوهمية". كما تم دعم دور مسار يوبيكويتين (Ub) في تقليل تنظيم MAT من خلال تجارب الترسيب المناعي. تفاعل MAT المتراكم المناعي مع الأجسام المضادة لـ Ub ، مما يوفر دليلًا على تقليل التنظيم بوساطة البروتوزوم لوفرة MAT الليشمانية [62].

3.5 المثقبيات

ال المثقبيات البروتيازوم هو أكثر البروتيازومات دراسة مكثفة. بروتيازوم المثقبية البروسية كان أول من تمت تنقيته وتمييزه ، إلا أن دوره في بيولوجيا الطفيل لم يتم وصفه [63]. أظهر العمل اللاحق أن نشاط البروتياز يبدو ضروريًا لتقدم دورة الخلية ، على الرغم من أن المشاركة يبدو أنها تختلف بين أشكال الدم والحلقة. كانت كمية اللاكتاسيستين اللازمة لمنع تكاثر الأشكال الحلزونية 5-10 ميكرومترم ، أعلى بخمس مرات مما هو مطلوب لتثبيط نفس العملية في أشكال الدم. وفقًا للمؤلفين ، يمكن تفسير هذا الاختلاف في الحساسية للمثبطات بالاختلافات في نفاذية الخلية. أظهر تحليل الحمض النووي عن طريق قياس التدفق الخلوي أنه في الأشكال غير الحلقية ، يثبط اللاكتاسيستين تقدم دورة الخلية في مرحلتي G2 و M ، بينما في أشكال الدم ، يجعلها في مراحل G1 / S و G2 و M. وفقا لنفس المؤلفين ، في T. بروسي ، لاكتاسيستين في 1 ميكرومتركان M غير قادر على منع تمايز أشكال الدم إلى مرحلة ما قبل الحلقة [64]. تشير هذه النتائج إلى أن البروتيازومات في المثقبيات تشارك في تنظيم مستويات السيكلين [65]. زاد البروتوزوم 20S المنقى من أشكال الدورة الدموية ومجرى الدم من النشاط الشبيه بالتريبسين ، على عكس البروتيازومات حقيقية النواة التي يكون فيها النشاط الشبيه بالكيموتريبسين أعلى. بالإضافة إلى ذلك ، هناك اختلافات أخرى بين T. بروسي وقد تم العثور على البروتيازومات في الثدييات. (1) يحتوي البروتيازوم 20S من المثقبيات على وزن جزيئي قدره 630 كيلو دالتون ، بينما يبلغ وزن الثدييات 700 كيلو دالتون (2) تحتوي المواد الهلامية ثنائية الأبعاد من البروتيازوم 20S على 26 بقعة بروتين فقط ، أقل مما لوحظ في البروتيازوم 20S المعزولة من الفئران. الكبد [66] (3) على الرغم من مورفولوجيا وحجم تي. بروسي البروتيازوم مماثلة لتلك الموصوفة في البروتيازومات الثديية ، قطر مسام من T. بروسي 20S proteasome أكبر من تلك التي لوحظت في الفئران 20S proteasome (4) الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي أثيرت ضد بروتين 20S البشري المتفاعل مع أشكال مجرى الدم والدم. T. بروسي ومع ذلك ، فقد أدركوا بقوة 20S proteasome الفئران 20S proteasome. من ناحية أخرى ، تم الحصول على الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد بروتين 20S المنقى المعزول من أشكال الدم T. بروسي تفاعل 20S أيضًا مع البروتياز 20S المنقى المعزول من الأشكال المتسارعة للطفيل ولكن ليس مع البروتيازوم 20S من كريات الدم الحمراء في الفئران. ال α5 وحدة فرعية من T. بروسي يحتوي البروتيازوم على تطابق تسلسل بنسبة 50 ٪ فقط مع مثيله في الفئران [67].

تم تحديد منشط بروتيازوم 20S أيضًا في أشكال الدم والدم T. بروسي. في المختبر، يتبلمر PA26 26 كيلو دالتون تلقائيًا مع 20S بروتياز لتوليد البروتيازوم 20S المنشط [68]. نظيرتها البشرية ، PA28α، كانت فعالة مثل PA26 في الارتباط مع النشاط الأنزيمي للبروتيازوم 20S وتحفيزها ، لكنها لم تكن قادرة على تنشيط البروتيازوم 20S من T. بروسي. علاوة على ذلك ، على عكس بروتوزومات الثدييات والخميرة ، فإن T. بروسي البروتيازوم غير قادر على تحلل مركب أورنيثين ديكاربوكسيلاز-أنتيزيم (ODC) في الثدييات ، والذي يحفز الخطوة الأولى في التخليق الحيوي لعديد الأمين. هذا العجز هو فرق كبير بين المثقبيات و proteasomes الثدييات [69]. علاوة على ذلك ، أظهر التوصيف الوظيفي لـ 11 وحدة فرعية غير ATPase (جسيمات تنظيمية ليست ATPase (Rpn)) في المجمع التنظيمي 19S أنه عندما كان Rpn10 ناقصًا ، تم تكوين معقد بدون Rpn ، ولكن توقف نمو الخلية. تشكل قابلية الاستغناء الهيكلية هذه ولكن الضرورة الوظيفية لـ Rpn10 جانبًا فريدًا آخر من T. بروسي بروتيازوم [70]. وبالمثل ، سمحت مناهج البروتينات والمعلومات الحيوية بتحديد ورسم خرائط T. بروسي البروتيازومات [71].

تم اختبار تسعة فينيل استر ثلاثي الببتيدات الانتقائية لتثبيط نشاط البروتوزوم الشبيه بالتريبسين في الثدييات. في المختبر نشاط ضد T. بروسي. أظهر اثنان نشاطًا مبيدًا للمثقبيات في النطاق منخفض الميكرومولار دون إظهار السمية الخلوية ضد الخلايا البشرية ، ومع ذلك ، فإن المركبات لم تمنع النشاط الشبيه بالتريبسين لبروتوزوم المثقبيات ، على الرغم من أن تأثيرها يرتبط بتعطيل نشاط يشبه كيموتريبسين. تشير هذه النتيجة إلى أن حساسيات المثبط تختلف بين بروتيازوم المثقبيات والثدييات. يمكن استغلال هذا الاختلاف من أجل تطوير عقلاني مضاد للمثقبيات [72].

من ناحية أخرى ، فإن دور T. كروزي تم توثيق البروتيازومات في التمايز trypomastigote-to-amastigote بوضوح [73 ، 74]. منع Lactacystin بشكل كبير تحول trypomastigotes إلى amastigotes في وسط ممحوض عند درجة الحموضة 5.0 [73]. تمت تنقية البروتيازوم 20S وتوصيفه وتبين أنه يمتلك أنشطة تشبه التربسين وتشيموتريبسين وتشبه الكاسباس. لا يمنع العلاج باللاكتاسيستين غزو الخلايا ولكنه يقلل بشدة من إفراز الطفيل. وبالمثل ، أظهر وضع العلامات الأيضية لـ leucine C 14 في trypomastigotes أن تحلل البروتين يحدث أثناء ذلك T. كروزي تمايز الخلايا من trypomastigote إلى amastigote. تم حظر مسار التحلل البروتيني هذا بواسطة مثبطات البروتوزوم مثل اللاكتاسيستين والفينيل سلفون ، ولكن ليس بواسطة مثبطات سيرين أو سيستينيل بروتيناز ، مما يشير إلى أن تدهور البروتين الذي يحدث أثناء تمايز الخلايا الطفيلية يعتمد على البروتيازوم [74]. بعد ذلك ، أثناء تمايز الخلايا الطفيلية عند درجة الحموضة الحمضية ، لوحظ مسار بروتيني معتمد على ATP وتم التعرف على البروتيازومات 26S وتم تمييزها لأول مرة في طفيلي أولي [74]. وبالمثل ، أظهر هؤلاء المؤلفون أن بروتينات الهيكل الخلوي ، وخاصة مستضد قضيب paraflagellar ، قد تحطمت بواسطة مسار يعتمد على البروتيازوم. ومع ذلك ، أثيرت الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد T. كروزي وقد لوحظ بروتيازوم 20S بواسطة المجهر الإلكتروني والدراسات متحد البؤر ، ووجود البروتيازومات في النواة ، والسيتوبلازم ، و kinetoplasts. تم تأكيد هذه النتائج من خلال الكشف عن الأنشطة الشبيهة بالبروتوزوم الكيموتريبسين في kinetoplast ، المعزولة بواسطة تدرجات بيركول [75]. في خلايا الثدييات ، تم العثور على UPS في غشاء الميتوكوندريا الخارجي المرتبط بالتدهور (OMMAD) الذي يتحكم في جودة البروتينات المترجمة إلى OMM [76]. بعد ذلك ، عند الغشاء الخارجي ، قد تلعب UPS دورًا في إعادة تدوير البروتينات المضمنة في الغشاء أو المستوردة [77]. الدور الذي تؤديه البروتيازومات T. كروزي لا يزال kinetoplast غير معروف. ومع ذلك ، يمكننا التكهن بأن البروتيازومات قد تشارك ليس فقط في مراقبة جودة البروتينات ولكن أيضًا في تغيرات مورفولوجيا kinetoplast التي تحدث عندما يتمايز trypomastigotes إلى amastigotes أو epimastigotes يتمايز عن trypomastigotes metacyclic.

وفقًا لكاردوسو وآخرون. [78] ، تثبيط مسار يوبيكويتين البروتيازوم في T. كروزي لا يمنع epimastigotes الالتصاق ولكنه يعطل انقسام الخلايا. بنفس الطريقة، في المختبر T. كروزي تم إعاقة تكوين الميتاسكلوجين بشدة (95 ٪) عن طريق العلاج بـ 5 ميكرومترم لاكتاسيستين.

التحلل البروتيني البروتيزومي أثناء في المختبر metacyclogenesis من T. كروزي كما تمت دراستها. كاردوسو وآخرون [79] أظهر أن التحلل البروتيني المعتمد على البروتيازوم يحدث أثناء التكوّن العضلي. لم يلاحظ أي ذروات من التحلل بوساطة اليوبيكويتين ، وكان ملف الاتحادات المتواجدة في كل مكان متشابهًا في جميع مراحل التمايز ، ومع ذلك ، أظهر تحليل البروتينات الكربونية تباينًا كبيرًا في مستويات البروتين المؤكسد في مراحل مختلفة من التمايز ، وكذلك تثبيط البروتياز. زيادة مستويات البروتين المؤكسد. تشير هذه الملاحظات إلى أن مجمعات بروتيازوم مختلفة تتعايش أثناء التكوّن العضلي. قد يكون البروتيازوم 20S حرًا أو مرتبطًا بجزيئات تنظيمية (PA700 ، PA26 ، و PA200) ، في مواقع خلوية محددة ، وسيمكن العمل المنسق لهذه المجمعات من التحلل البروتيني للبروتينات الموسومة باليوبيكويتين والبروتينات المؤكسدة لتتعاشر في زنزانة. بالإضافة إلى ذلك ، تشير هذه النتائج بقوة إلى أن سلسلة منسقة من التكيفات البيوكيميائية تحدث أثناء T. كروزي يمكن أيضًا تنظيم عملية التكوُّن العضلي بواسطة نشاط معقدات بروتوزوم مختلفة. تسلط هذه البيانات الضوء أيضًا على أهمية تحلل البروتوزومي المستقل عن اليوبيكويتين أثناء التكوُّن العضلي [79]. قادنا دور البروتيازومات في تمايز الخلايا إلى اقتراح هذه العضية كعامل ضراوة المثقبيات [80].

اثنين من الجينات ترميز α1 و α6 وحدات فرعية من T. كروزي البروتيازوم تم استنساخه وتمييزه [81]. بالنظر إلى أن معظم الدراسات الهيكلية قد أجريت في المثقبيات [67 ، 69 ، 74 ، 75] ، يظهر تكوين الوحدات الفرعية للإنسان ، الخميرة ، والمثقبيات في الجدول 1.

3.6. المتصورة

حضور المتصورة تم عرض البروتيازوم لأول مرة باستخدام مثبطات. يمنع Lactacystin في المختبر تطوير أشكال exoerythrocytic من المتصورة البرغي ولكنه لا يمنع غزو البوغ للخلية المضيفة. التأثير المثبط للاكتاسيستين خاص بالمرحلة ، وعلى الرغم من عدم بقاء أي جرذ مصاب ، إلا أن اللاكتاسيستين قلل من طفيليات الدم في الحيوانات المصابة. وبالتالي اقترح المؤلفون البروتوزوم كهدف علاجي كيميائي واعد [82]. من ناحية أخرى ، منع اللاكتاسيستين نمو ثلاثة خطوط مختلفة من المتصورة المنجلية بتركيزات مولارية مماثلة وكان أكثر فعالية ضد الطفيليات المقاومة للكلوروكين [83]. ترميز الجينات β الوحدات الفرعية من المتصورة المنجلية تم بالفعل استنساخ 20S proteasome [84].

فسفويتانولامين ميثيل ترانسفيراز (fepm) ، وهو إنزيم ذو أهمية مركزية في مسار سيرين ديكاربوكسيلاز فسفويثانولامين ميثيل ترانسفيراز (SDPM) ، ينظم بشكل سلبي ويتحلل بواسطة البروتيازوم في وجود الكولين. أظهرت تجارب التجلط المناعي ومطاردة النبض والكروماتين المناعي أن تدهور Pfpmt لم يحدث فقط في الخلايا البرية ولكن أيضًا في الطفيليات المعدلة وراثيًا التي تعبر عن Pfpmt بشكل أساسي. مثبط البروتوزوم bortezomib منع تحلل الكولين بوساطة Pfpmt. كانت هذه البيانات أول دليل على أن المستقلب يمكنه التوسط في تنظيم النسخ وتدهور البروتيازوم في المتصورة [85].

قد يكون للسم الجليوتوكسين (GTX) ، وهو مستقلب من أصل فطري في المختبر تأثير مضاد الملاريا. أظهر GTX نشاطًا ضد السلالات المقاومة للحساسية والمقاومة للكلوروكين المتصورة المنجلية. كانت السمية الخلوية لـ GTX أقل بشكل ملحوظ مقابل خطوط خلايا الكبد الطبيعية [86]. وفقًا لنفس الباحثين ، منعت GTX نشاطًا شبيهًا بالكيموتريبسين في المتصورة المنجلية معقد بروتيني في الخلية. بالطريقة نفسها ، أظهر MLN-273 ، مثبط البروتوزوم الذي ينتمي إلى عائلة حمض الببتيدل البورونيك ، أنه يثبط المراحل المبكرة داخل كرات الدم من المتصورة المنجلية ، وكذلك مراحل إفراز كريات الدم الحمراء P. berghei. لم يؤثر المانع على كريات الدم الحمراء أو خلايا الكبد ولكنه تسبب في انخفاض كبير في تحلل بروتين الطفيل. وفقًا لهؤلاء المؤلفين ، فإن استخدام مثبطات البروتوزوم كأدوية مضادة للأورام يوحي بإمكانية العلاج الكيميائي للملاريا على أساس مثبطات البروتوزوم [87]. من هذا المنظور ، مثبطات البروتوزوم مثل بورتيزوميب (Velcade: [(1R) -3-methyl-1 - [[(2S) -1-oxo-3-phenyl-2 - [(pyrazinylcarbonyl) amino] بروبيل] أمينو] بوتيل] حمض البورونيك) ، الذي تمت الموافقة عليه لعلاج مرضى المايلوما ، وبورونات مماثلة تسمى Z-Leu-Leu-Leu-B (OH) 2 (ZL3B) ، تم تقييمها مقابل أربع سلالات من المتصورة المنجلية (3D7 و HB3 و W2 و Dd2) التي لها مستويات مختلفة من الحساسية لأدوية مكافحة الملاريا مثل البيريميثامين والكلوروكين. كان كلا الدواءين فعالين بنفس القدر ضد الطفيليات الحساسة والمقاومة ، مما يعيق نمو الطفيليات داخل كرات الدم. تشير هذه البيانات بقوة إلى أنه يمكن استخدام هذه الأدوية بمفردها أو بالاشتراك مع العلاج الكيميائي للملاريا [88].

دراسة شاملة لمثبطات البروتوزوم النشطة ضد المتصورة المنجلية أظهرت السلالات المختبرية والعزلات الحقلية من الجابون أن مادة الإيبوكسوميسين كانت شديدة الفعالية ضدها المتصورة المنجلية ولم تظهر عليها علامات المقاومة المتصالبة مع الأدوية المماثلة أو أي مثبط للبروتوزوم في منطقة ذات مقاومة عالية للكلوروكين [89].

على الرغم من أن المتصورة تم اقتراح البروتوزوم كهدف محتمل للعقار المضاد للملاريا ، وقد حالت سمية المثبطات دون التحقق من صحة هذا الإنزيم في الجسم الحي. تم إجراء شاشة من مكتبة من 670 نظيرًا لمثبط كارفيلزوميب المعتمد مؤخرًا من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، لتحديد المركبات التي تقتل الطفيليات بشكل انتقائي. أظهر أحدهم ، PR3 ، نشاطًا كبيرًا لقتل الطفيليات في المختبر ولكنه قلل بشكل كبير من السمية في الخلايا المضيفة. وفقًا للمؤلفين ، فإن هذه السمية الخاصة بالطفيليات لم تكن بسبب الاستهداف الانتقائي لـ المتصورة بروتيازوم على المضيف البروتيازوم ولكن بسبب نقص النشاط ضد واحدة من الوحدات الفرعية البشرية البروتوزوم. بعد ذلك ، استخدموا PR3 لتقليل حمل الطفيليات بشكل كبير P. berghei الفئران المصابة دون سمية المضيف ، وبالتالي التحقق من صحة البروتياز كهدف دواء مضاد للملاريا قابل للتطبيق [90].

3.7. التوكسوبلازما

ال التوكسوبلازما تم فحص البروتياز من حيث توطينه داخل الخلايا ونشاطه الأنزيمي. أظهرت دراسات التألق المناعي مع الأجسام المضادة ضد البروتيازوم أنه ، على عكس الخلايا حقيقية النواة (التي يقع فيها البروتوزوم في كل من النواة والعصارة الخلوية) ، في التوكسوبلازما ، البروتيازومات تقتصر على العصارة الخلوية. تم الكشف عن نشاط شبيه بالكيموتريبسين ، مع كم قيم قريبة من تلك التي لوحظت في الخلايا حقيقية النواة [91]. المعالجة المسبقة لل tachyzoites الحرة مع مثبطات البروتوزوم (10 ميكرومترم لاكتاسيستين) أو 5 ميكرومترm gliotoxin [92] لم يمنع دخول الطفيل أو تكوين فجوة الطفيليات ولكنه منع نمو الطفيل داخل الخلايا وتخليق الحمض النووي. ومع ذلك ، شو وآخرون. [93] أظهر أن لاكتاسيستين (2 ميكرومترم) لا يمنع دخول الطفيلي أو إنشاء فجوة الطفيلي ولكنه يمنع نمو الطفيل وتبرعم الخلية البنت ، وكذلك تخليق الحمض النووي. لم تمنع المعالجة المسبقة للخلايا المضيفة باللاكتاسيستين دخول الطفيل أو تطوره. تسلط هذه النتائج الضوء على الدور المحتمل لـ التوكسوبلازما نشاط البروتياز في التطور داخل الخلايا وتنظيم تكاثر الطفيلي. بالطريقة نفسها ، لم يتم تعديل تغلغل الطفيليات في الخلايا المضيفة بتركيز عالٍ من السموم الجليوتوكسين (1 ميكرومترم) ، ولكن انخفض بشكل ملحوظ النسخ المتماثل (حوالي 50٪ تثبيط بمقدار 0.5 ميكرومترم الجليوتوكسين). قلل الجليوتوكسين من النشاط الشبيه بالكيموتريبسين لـ التوكسوبلازما بروتيازوم ذو فاعلية أقل بخمس مرات من خلايا هيلا [92]. تم تلخيص النتائج الرئيسية حول دور البروتيازومات في الطفيليات الأولية في الشكل 2.

4. ملاحظات ختامية

نشاط البروتياز ضروري للعديد من النظم والعمليات البيولوجية. في الطفيليات ، يعتبر البروتياز ضروريًا لتدهور أنسجة المضيف والتهرب المناعي واكتساب التغذية [94]. حتى أقل من عشرين عامًا ، لم يكن الوجود والدور البيولوجي للبروتيازومات معروفًا في الطفيليات.

منذ التقرير الأول للبروتيازومات في البروتوزوا [63] ، والوصف الأول لوظيفتها البيولوجية [73] ، والوصف الأول لوجود البروتيازوم 26S في البروتوزوا [74] ، أكدت العديد من التقارير دور البروتيازومات في الطفيليات. العمليات البيولوجية مثل التمايز ودورة الخلية والتكاثر والتشخيص. يعد الانتشار والتمايز خطوتين أساسيتين في استعمار المضيف. بالنظر إلى أهمية البروتيازومات في كلتا العمليتين في العديد من الطفيليات المختلفة مثل المثقبيات, الليشمانيا, التوكسوبلازما ، و Entamoeba، البروتيازومات الطفيلية قد تكون بمثابة عوامل ضراوة.

على الرغم من العديد من الظواهر البيولوجية الطفيلية التي يشارك فيها البروتوزوم ، فإن المعلومات المتعلقة بكيفية مشاركة البروتوزوم في مثل هذه الظواهر غير معروفة. لم يتم تحديد غالبية بروتينات الطفيل التي تتحلل بواسطة البروتيازومات. لا يزال يتعين توضيح أهداف البروتياز والمسارات البيولوجية التي تنطوي على البروتيازومات في العملية البيولوجية الرئيسية.

كانت مثبطات البروتوزوم أدوات بحثية قيّمة في البيولوجيا الخلوية من خلال توضيح العمليات البيولوجية المهمة المرتبطة بمسار تحلل بروتين يوبيكويتين-بروتيازوم. يعد نظام يوبيكويتين-بروتيازوم هدفًا دوائيًا متميزًا لتطوير الأدوية نظرًا للإمكانات الهائلة للتدخل في العديد من الأمراض بما في ذلك السرطان والأمراض التنكسية العصبية والأمراض المناعية والالتهابات. تم الكشف عن الإمكانات الدوائية لـ UPS بعد النجاح غير المتوقع لمثبطات البروتوزوم في علاج بعض الأورام الدموية الخبيثة.

علاوة على ذلك ، بعد أن وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على بورتيزوميب (فيلكاد) لعلاج المايلوما المتعددة المنكسرة ، ظهر البروتيازوم كهدف علاجي جديد لأمراض متنوعة. طورت برامج اكتشاف الأدوية في الأوساط الأكاديمية وصناعة المستحضرات الصيدلانية مجموعة من مثبطات البروتوزوم 20S الطبيعية والاصطناعية منخفضة النانو مولار وأدخلتها في التجارب السريرية البشرية باعتبارها خيوطًا مهمة مضادة للسرطان ومضادة للالتهابات. يتطور مشهد العلاجات القائمة على مثبطات البروتوزوم بسرعة ، مع وعد يتجاوز علم الأورام الإكلينيكي ، ويمثل مثالًا مثيرًا للطب الترجمي.

تشير العديد من الأدلة بقوة إلى أن مسار اليوبيكويتين-البروتوزوم هو أيضًا هدف علاجي طفيلي قابل للتطبيق. أظهرت الأبحاث في السنوات الأخيرة أن البروتيازوم هو هدف دوائي صالح لمرض النوم [72 ، 95 ، 96]. على الرغم من أن تركيب البروتوزوم المثقبي يشبه نظيره في الثدييات ، إلا أن مجمعات الإنزيم تختلف عن بعضها البعض فيما يتعلق بنشاط الببتيداز ، وخصوصية الركيزة ، وحساسية المثبط. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت التحليلات الأنزيمية أن وظائف المثقبيات والبروتوزوم في الثدييات حساسة بشكل خاص لتثبيط الأنشطة الشبيهة بالتريبسين والكيموتريبسين ، على التوالي [97 ، 98]. وبالتالي ، فإن المركبات التي تستهدف على وجه التحديد النشاط الشبيه بالتريبسين للبروتيازوم المثقبي قد تشكل أساسًا لتطوير الأدوية المضادة للمثقبيات. ومع ذلك ، فإن ظهور وانتشار المتصورة المنجلية تتطلب مقاومة مضادات الملاريا الموجودة البحث عن أهداف دوائية جديدة ومركبات علاج كيميائي. إن تثبيط البروتوزوم هو استراتيجية واعدة لتطوير عقاقير جديدة مضادة للملاريا.

تؤثر الأمراض التي تسببها الطفيليات على مئات الملايين من الناس في جميع أنحاء العالم ، مع آثار صحية واقتصادية مدمرة ، ومع ذلك ، فقد تم إهمال الطفيليات إلى حد كبير من حيث تطوير الأدوية لأنها تؤثر على الفقراء في المناطق الفقيرة من العالم. معظم الأدوية المستخدمة حاليًا لعلاج هذه الأمراض عمرها عقود ولها العديد من القيود ، بما في ذلك مقاومة الأدوية. البروتيازومات هي عضية رئيسية في بيولوجيا الطفيليات والفوعة ويبدو أنها هدف علاجي كيميائي جديد وجذاب.

تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا السيد You Garmendia على الدعم في تصميم وإعداد الأرقام. تم تمويل هذا العمل من قبل FONDECYT no. 1131007 إلى Jorge González.

مراجع

  1. A. Ciehanover ، Y. Hod ، و A. Hershko ، "مكون متعدد الببتيد مستقر للحرارة لنظام التحلل البروتيني المعتمد على ATP من الخلايا الشبكية ،" الكيمياء الحيوية والبيوفيزيائية تبحث في الاتصالات، المجلد. 81 ، لا. 4، pp. 1100–1105، 1978. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  2. A. Ciechanover ، H. Heller ، S. Elias ، A. L. Haas ، و A. Hershko ، "الاقتران المعتمد على ATP لبروتينات الخلايا الشبكية مع عديد الببتيد المطلوب لتحلل البروتين ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 77 ، لا. 3، pp. 1365–1368، 1980. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  3. A. Hershko ، A. Ciechanover ، H. Heller ، A. L. Haas ، and I. A. Rose ، "الدور المقترح لـ ATP في تكسير البروتين: اقتران البروتين مع سلاسل متعددة من polypeptide لتحلل البروتين المعتمد على ATP ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 77 ، لا. 4، pp. 1783–1786، 1980. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  4. أ. هيرشكو ، "دروس من اكتشاف نظام يوبيكويتين ،" الاتجاهات في العلوم البيوكيميائية، المجلد. 21 ، لا. 11، pp. 445–449، 1996. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  5. R. Hough، G. Pratt، and M. Rechsteiner، “Ubiquitin-lysozyme conjugates. تحديد وتوصيف البروتياز المعتمد على ATP من محللات الخلايا الشبكية للأرانب ، " مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 261 ، لا. 5 ، ص 2400-2408 ، 1986. عرض على: الباحث العلمي من Google
  6. A. Ciechanover ، "نظام يوبيكويتين الحال للبروتين: من فكرة غامضة ، من خلال الآليات الأساسية ، إلى الأمراض البشرية واستهداف الأدوية ،" علم الأعصاب، المجلد. 66 ، لا. 2، pp. S7 - S19، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  7. Y. Saeki و K. Tanaka ، "تجميع ووظيفة البروتيازوم ،" في معدلات عائلة يوبيكويتين والبروتيازوم، المجلد. 832 من طرق في علم الأحياء الجزيئي، الصفحات 315-337 ، هيومانا برس ، نيو جيرسي ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2012. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  8. R. E. Valas و P. E. Bourne ، "إعادة التفكير في تطور البروتياز: اثنين من البروتيازوم البكتيرية الجديدة ،" مجلة التطور الجزيئي، المجلد. 66 ، لا. 5 ، ص 494-504 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  9. K. Tanaka ، "البروتيازوم: من الآليات الأساسية إلى الأدوار الناشئة ،" مجلة كيو للطب، المجلد. 62 ، لا. 1، pp.1-12، 2013. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  10. R. Huber ، J. L & # xf6we ، D. Stock ، B. Jap ، P. Zwickl ، and W. Baumeister ، "Crystal Structure of the 20S proteasome from the archaeon T. أسيدوفيلوم بدقة 3.4 "، علم، المجلد. 268 ، ص 533-539 ، 1995. عرض على: الباحث العلمي من Google
  11. M. Groll ، L. Ditzel ، J. L & # xf6we et al. ، "هيكل 20S proteasome من الخميرة بدقة 2.4 & # x2009 & # xc5 ،" طبيعة سجية، المجلد. 386 ، لا. 6624 ، ص 463-471 ، 1997. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  12. M. Groll ، M. Bajorek ، A. K & # xf6hler et al. ، "قناة مسورة في الجسيم الأساسي البروتيازومي ،" علم الأحياء الهيكلية الطبيعة، المجلد. 7 ، لا. 11، pp.1062–1067، 2000. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  13. ريكستاينر وسي بي هيل ، "تعبئة آلة التحلل: الأدوار البيولوجية للخلية لمنشطات ومثبطات البروتوزوم ،" الاتجاهات في بيولوجيا الخلية، المجلد. 15 ، لا. 1، pp.27–33، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  14. د. فوجيس ، ب.زويكل ، و دبليو بوميستر ، "البروتيازوم 26S: آلة جزيئية مصممة لتحليل البروتين المتحكم فيه ،" المراجعة السنوية للكيمياء الحيوية، المجلد. 68، pp.1015–1068، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  15. هيل ، إي.ماسترز ، وإف جي ويتبي ، "منظمات 11S لنشاط بروتيازوم 20S" الموضوعات الحالية في علم الأحياء الدقيقة والمناعة، المجلد. 268، pp.73–89، 2002. View at: Google Scholar
  16. V. Ustrell ، L. Hoffman ، G. Pratt ، و M. Rechsteiner ، "Pa200 ، منشط نووي بروتياز مشارك في إصلاح الحمض النووي ،" مجلة EMBO، المجلد. 21 ، لا. 13، pp. 3516–3525، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  17. J. Blickwedehl ، M. Agarwal ، C. Seong et al. ، "دور المنشط البروتيازومي PA200 ونشاط البروتيازوم بعد الجلوتاميل في الاستقرار الجيني ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 105 ، لا. 42، pp. 16165–16170، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  18. A. F. Savulescu و M.H. Glickman ، "منشط البروتيازوم 200: الحرارة قيد التشغيل ،" البروتينات الجزيئية والخلوية، المجلد. 10 ، لا. 5 ، 2011. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  19. M. Fehlker و P. Wendler و A. Lehmann و C. Enenkel ، "Blm3 هو جزء من البروتيازومات الوليدة ويشارك في مرحلة متأخرة من تجميع البروتيازوم النووي ،" تقارير EMBO، المجلد. 4 ، لا. 10، pp. 959–963، 2003. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  20. C. Concannon و R. S. Lahue ، "إصلاح ختان النوكليوتيدات ووظيفة البروتيازوم 26S معًا لتعزيز التوسعات المتكررة ثلاثي النوكليوتيد ،" إصلاح الحمض النووي، المجلد. 13 ، لا. 1 ، ص 42-49 ، 2014. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  21. A. Lehmann ، K.Jechow ، و C. Enenkel ، "يرتبط Blm10 بالجسيمات الأساسية البروتيازية التي تم تنشيطها مسبقًا بتشكيل البوابة المفتوحة ،" تقارير EMBO، المجلد. 9 ، لا. 12 ، ص 1237-1243 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  22. M.-X. Qian ، Y. Pang ، C.H Liu et al. ، "التحلل البروتوزومي بوساطة XAcetylation للهستونات الأساسية أثناء إصلاح الحمض النووي وتكوين الحيوانات المنوية ،" زنزانة، المجلد. 153 ، لا. 5، pp.1012–1024، 2013. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  23. K. Sadre-Bazzaz ، F.G.Wetby ، H. Robinson ، T. Formosa ، and C.P Hill ، "هيكل مجمع Blm10 يكشف عن الآليات المشتركة للربط البروتيني وفتح البوابة ،" الخلية الجزيئية، المجلد. 37 ، لا. 5 ، ص 728-735 ، 2010. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  24. B. M. Stadtmueller و C.P Hill، “Proteasome Activators،” الخلية الجزيئية، المجلد. 41 ، لا. 1، pp.8–19، 2011. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  25. A. Ciechanover و A. Stanhill ، "تعقيد التعرف على الركائز المنتشرة بواسطة البروتيازوم 26S ،" Biochimica et Biophysica Acta، المجلد. 1843 ، لا. 1 ، ص 86-96 ، 2014. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  26. D. M. Smith، S.-C. تشانغ ، إس بارك ، دي فينلي ، واي.تشينغ ، وأ.ل.غولدبرغ ، "إرساء محطة الكربوكسيل البروتينية في البروتوزومال ATPases في العشرينات من البروتيازوم & # x3b1 الحلقة تفتح البوابة لدخول الركيزة " الخلية الجزيئية، المجلد. 27 ، لا. 5، pp.731–744، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  27. D. Bech-Otschir ، A. Helfrich ، C. Enenkel et al. ، "تعمل ركائز البوليوبيكويتين على تنشيط تحللها بواسطة البروتين 26S ،" الطبيعة الهيكلية & # x26 البيولوجيا الجزيئية، المجلد. 16 ، لا. 2 ، ص 219-225 ، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  28. P. & # x15aled & # x17a و F. F & # xf6rster و W. Baumeister ، "تأثيرات Allosteric في تنظيم أنشطة البروتياز 26S" مجلة البيولوجيا الجزيئية، المجلد. 425 ، لا. 9 ، ص 1415-1423 ، 2013. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  29. A. M. Ruschak و L. E. Kay ، "allostery Proteasome كتحول سكاني بين المطابقات التبادلية ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 109 ، لا. 50، pp. E3454-E3462، 2012. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  30. A.M Weissman ، "الموضوعات والاختلافات في الانتشار الشامل ،" مراجعات الطبيعة بيولوجيا الخلية الجزيئية، المجلد. 2 ، لا. 3، pp. 169–178، 2001. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  31. L.A Passmore و D. Barford ، "الوصول إلى الموقع: الآليات التحفيزية لبروتين البروتين في كل مكان ،" مجلة الكيمياء الحيوية، المجلد. 379 ، لا. 3 ، ص 513-525 ، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  32. مساء. Kloetzel ، "معالجة المستضد بواسطة البروتيازوم ،" مراجعات الطبيعة بيولوجيا الخلية الجزيئية، المجلد. 2 ، لا. 3، pp. 179–187، 2001. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  33. J.M Baugh و E.G Viktorova و E.V Pilipenko ، "يمكن للبروتيازومات أن تحلل نسبة كبيرة من البروتينات الخلوية بشكل مستقل عن الانتشار ،" مجلة البيولوجيا الجزيئية، المجلد. 386 ، لا. 3، pp.814–827، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  34. S. S. Wing ، "إزالة الإنزيمات - أهمية القيادة في الاتجاه المعاكس على طول مسار اليوبيكويتين - البروتيازوم ،" المجلة الدولية للكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلية، المجلد. 35 ، لا. 5، pp.590–605، 2003. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  35. إم. باجانو ، "تنظيم دورة الخلية من خلال مسار يوبيكويتين ،" مجلة FASEB، المجلد. 11 ، لا. 13 ، ص 1067-1075 ، 1997. عرض على: الباحث العلمي من Google
  36. H. L. Pahl و P. A. Baeuerle ، "التحكم في التعبير الجيني عن طريق تحلل البروتين ،" الرأي الحالي في بيولوجيا الخلية، المجلد. 8 ، لا. 3، pp.340–347، 1996. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  37. Piccinini ، M. Mostert ، و M. T. Rinaudo ، "البروتيازوم كأهداف للأدوية ،" أهداف المخدرات الحالية، المجلد. 4 ، لا. 8، pp.657–671، 2003. View at: Google Scholar
  38. أ.م.كونستانتينوفا ، أ.س.تسيموخا ، وأ.جي.متينبيرج ، "دور البروتيازومات في التنظيم الخلوي ،" المجلة الدولية للخلية والبيولوجيا الجزيئية، المجلد. 267 ، ص 59-124 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  39. W. Ward، L. Alvarado، N.D Rawlings، JC Engel، C. Franklin، and J.H McKerrow، “A إنزيم بدائي لخلية بدائية: الأنزيم البروتيني المطلوب لإثارة الجيارديا,” زنزانة، المجلد. 89 ، لا. 3، pp. 437–444، 1997. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  40. J.R Forney، S. Yang، and M.C Healey، “نشاط البروتياز المرتبط بإثارة كريبتوسبوريديوم بارفوم بيض ، " مجلة علم الطفيليات، المجلد. 82 ، لا. 6، pp.889–892، 1996. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  41. A. Makioka و M. Kumagai و S. Kobayashi و T. Takeuchi ، "Entamoeba يغزو: مثبطات إنزيم البروتياز السيستين تمنع الإفراز وتطور النقائل ، " علم الطفيليات التجريبية، المجلد. 109 ، لا. 1، pp.27–32، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  42. أ.باوجام ، أ.- إل. Bulteau ، J. Dupouy-Camet ، C. Creuzet ، and B. Friguet ، "توصيف ودور البروتوزومات الطفيلي الأولي ،" الاتجاهات في علم الطفيليات، المجلد. 19 ، لا. 2 ، ص 55-59 ، 2003. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  43. دالمان ، "دور البروتيازومات في المرض ،" الكيمياء الحيوية BMC، المجلد. 8 ، لا. 1 ، المقالة S3 ، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  44. P. A. Chung و J. الحمض النووي للميتوكوندريا، المجلد. 11 ، لا. 3-4 ، الصفحات 309-314 ، 2000. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  45. إميرليش ، يو سانتاريوس ، تي باكر-جرونوالد ، وإتش شولز ، "العزلة وتكوين الوحدة الفرعية للـ جيارديا لامبليا,” الطفيليات الجزيئية والكيميائية الحيوية، المجلد. 100 ، لا. 1، pp. 131–134، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  46. J.L Bouzatrid، L.K McNeilrid، H. M.روبرتسون وآخرون ، "تحليل النشوء والتطور من & # x3b1 عائلة الجينات البروتوزومية من حقيقيات النوى المتباينة في وقت مبكر ، " مجلة التطور الجزيئي، المجلد. 51 ، لا. 6 ، ص 532-543 ، 2000. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  47. إميرليش ، إتش شولز ، إف دي جيلين ، وتي باكر-جرونوالد ، "توصيف البروتيازوم & # x3b1-سلسلة من جيارديا لامبليا,” بحوث الطفيليات، المجلد. 87 ، لا. 2، pp.112–115، 2001. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  48. S. Stefanic ، D. Palm ، S.G.Sv & # xe4rd ، و A.B Hehl ، "تكشف البروتينات العضوية عن آليات نضج البضائع المرتبطة بحويصلات التحفيز الشبيهة بجولجي في الأوالي المتباعدة المبكرة جيارديا لامبليا,” مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 281 ، لا. 11 ، ص 7595-7604 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  49. Scholze و S. Frey و Z. المتحولة الحالة للنسج,” مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 271 ، لا. 11 ، ص 6212-6216 ، 1996. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  50. تولستروب وإي كراوس وإي تانيش وإي بروتشهاوس ، "التحليل البروتيني لـ المتحولة الحالة للنسج,” علم الطفيليات، المجلد. 134 ، لا. 2، pp.289–298، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  51. R. S & # xe1nchez و A. Alag & # xf3n و R. P. Stock، “المتحولة الحالة للنسج: التوزيع داخل الخلايا للبروتيازوم ، " علم الطفيليات التجريبية، المجلد. 102 ، لا. 3-4، pp. 187–190، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  52. D. E. Bosch و D.P.Siderovski ، "المحددات الهيكلية لاقتران اليوبيكويتين في المتحولة الحالة للنسج,” مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 288 ، لا. 4 ، ص 2290-2302 ، 2013. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  53. J. Gonz & # xe1lez و G. Bai و U. Frevert و E. J. Corey و D. Eichinger ، "تكوين الكيس المعتمد على البروتيازوم وتراكم اليوبيكويتين المرنا المرتبط بمرحلة معينة في Entamoeba Invadens ،" المجلة الأوروبية للكيمياء الحيوية، المجلد. 264 ، لا. 3 ، ص 897-904 ، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  54. A. Makioka ، M. Kumagai ، H. Ohtomo ، S. Kobayashi ، and T. Takeuchi ، "تأثير مثبطات البروتوزوم على نمو وتكيس وإثارة المتحولة الحالة للنسج و Entamoeba يغزو,” بحوث الطفيليات، المجلد. 88 ، لا. 5، pp.454–459، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  55. سي دي روبرتسون ، "إن الليشمانية المكسيكية معقد بروتيني في الخلية،" الطفيليات الجزيئية والكيميائية الحيوية، المجلد. 103 ، لا. 1 ، ص 49-60 ، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  56. C.B V. Christensen، L.J & # xf8rgensen، A. T.R. Jensen et al.، "Molecular Characterization of a الليشمانيا دونوفاني استنساخ (كدنا) مشابه للوحدة الفرعية من النوع a بروتيزوم 20S البشرية ، " Biochimica et Biophysica Acta & # x2014 الأساس الجزيئي للمرض، المجلد. 1500 ، لا. 1، pp. 77–87، 2000. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  57. كوفرور ، أ.بولين ، ج.- س. Dujardin ، و D. Le Ray ، "المزيد من panantigens في الليشمانيا,” الاتجاهات في علم الطفيليات، المجلد. 17 ، لا. 2 ، ص 63-64 ، 2001. عرض على: الباحث العلمي من Google
  58. آي سيلفا جارديم ، إم إف آند # xe1tima هورتا ، وإف جيه رامالهو-بينتو ، "The ليشمانيا شاغاسي بروتيازوم: دور في تعزيز النمو ويحفز البقاء على قيد الحياة داخل الضامة الفأرية ، " اكتا تروبيكا، المجلد. 91 ، لا. 2، pp. 121–130، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  59. P. Dubessay ، C. Blaineau ، P. Bastien et al. ، "تنظيم التعبير المعتمد على دورة الخلية عن طريق المسار البروتيني وتوصيف إشارة الاستهداف النووي لرائد الليشمانيات Kin-13 kinesin ،" علم الأحياء الدقيقة الجزيئي، المجلد. 59 ، لا. 4 ، الصفحات من 1162 إلى 1174 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  60. P. Kumar ، S. Sundar ، and N. Singh ، "تحلل إنزيم pteridine reductase 1 (PTR1) أثناء مرحلة النمو في طفيلي الأوالي الليشمانيا دونوفاني,” علم الطفيليات التجريبية، المجلد. 116 ، لا. 2، pp. 182–189، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  61. سافويا ، تي أليس ، ب.أ.توفو ، "النشاط المضاد لمثبطات إنزيم البروتياز لفيروس نقص المناعة البشرية ،" المجلة الدولية للعوامل المضادة للميكروبات، المجلد. 26 ، لا. 1 ، ص 92-94 ، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  62. Y. P & # xe9rez-Pertejo و R. & # xc1lvarez-Velilla و C.G Estrada و R. Bala & # xf1a-Fouce و R. M. Reguera ، "الليشمانيا دونوفاني: التنظيم النازل بوساطة البروتياز لميثيونين أدينوسيل ترانسفيراز ، " علم الطفيليات، المجلد. 138 ، لا. 9، pp.1082–1092، 2011. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  63. شاو بنج ، دبليو- واي. To، T. T. Nguyen، M.-L. Wong ، و C.C. وانج ، "تنقية وتوصيف البروتيازومات من المثقبية البروسية,” الطفيليات الجزيئية والكيميائية الحيوية، المجلد. 78 ، لا. 1-2 ، ص 33-46 ، 1996. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  64. M. C. Mutomba و C.C. Wang ، “دور التحلل البروتيني أثناء تمايز المثقبية البروسية من مجرى الدم إلى الشكل الدوري ، " الطفيليات الجزيئية والكيميائية الحيوية، المجلد. 93 ، لا. 1، pp. 11–22، 1998. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  65. جيه جيه فان هيليموند وجي سي موترام "The CYC3 جين المثقبية البروسية ترميز cyclin بعمر نصف قصير " الطفيليات الجزيئية والكيميائية الحيوية، المجلد. 111 ، لا. 2، pp.227–282، 2000. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  66. L. Huang و M. Shen و I.Chernushevich و A.L Burlingame و C.C. Wang و C.D. المثقبية البروسية,” الطفيليات الجزيئية والكيميائية الحيوية، المجلد. 102 ، لا. 2، pp.211–223، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  67. Y. Yao و C.R Toth و L. Huang et al. ، "& # x3b15 وحدة فرعية في المثقبية البروسية يمكن للبروتيازوم أن يتجمع ذاتيًا لتشكيل أسطوانة من أربع حلقات هيبتامر مكدسة ، " مجلة الكيمياء الحيوية، المجلد. 344 ، لا. 2، pp.349–358، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  68. Yao ، L. Huang ، A. Krutchinsky et al. ، "التوصيفات الهيكلية والوظيفية للبروتين المنشط للبروتين PA26 من المثقبية البروسية,” مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 274 ، لا. 48، pp. 33921–33930، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  69. Z. Li و C.C. Wang ، "التوصيف الوظيفي للبروتينات الفرعية لـ 11 non-ATPase في المركب التنظيمي البروتيازوم 19 S من المثقبيات ،" مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 277 ، لا. 45، pp. 42686–42693، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  70. Z. Li، C.-B. Zou ، Y. Yao et al. ، "يحفز البروتيازوم 26 S المنفصل بسهولة مسارًا أساسيًا لتدهور البروتين بوساطة اليوبيكويتين في المثقبية البروسية,” مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 277 ، لا. 18، pp. 15486–15498، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  71. L. Huang ، R.Jacob ، S. C.-H. Pegg وآخرون ، "التعيين الوظيفي لـ 20S proteasome من المثقبية البروسية باستخدام مطياف الكتلة ونهج المعلوماتية الحيوية الجديدة " مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 276 ، لا. 30 ، ص 28327-28339 ، 2001. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  72. D. Steverding ، A. Baldisserotto ، X. Wang ، و M. Marastoni ، "نشاط مبيد المثقبيات من مشتقات peptidyl vinyl ester الانتقائي لتثبيط نشاط يشبه التربسين بروتيازوم الثدييات ،" علم الطفيليات التجريبية، المجلد. 128 ، لا. 4 ، ص 444-447 ، 2011. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  73. J. Gonz & # xe1lez، F.J. Ramalho-Pinto، U. Frevert et al. ، "نشاط البروتيازوم مطلوب للتحول الخاص بالمرحلة لطفيلي البروتوزوان ،" مجلة الطب التجريبي، المجلد. 184 ، لا. 5، pp.1909–1918، 1996. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  74. J. de Diego، J.M Katz، P. Marshall et al.، "يلعب مسار اليوبيكويتين-البروتيازوم دورًا أساسيًا في تحلل البروتينات أثناء المثقبية الكروزية إعادة تصميم،" الكيمياء الحيوية، المجلد. 40 ، لا. 4 ، ص 1053-1062 ، 2001. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  75. B. Guti & # xe9rrez ، L. Osorio ، M. المثقبية الكروزية 20S بروتياز ، " الطفيليات الدولية، المجلد. 58 ، لا. 4، pp.367–374، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  76. A. Neutzner ، R.J. Youle ، و M. Karbowski ، "تحلل بروتين غشاء الميتوكوندريا الخارجي بواسطة البروتيازوم ،" ندوة مؤسسة نوفارتيس، المجلد. 287 ، الصفحات من 4 إلى 14 ، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  77. ليفنات ليفانون وإم إتش جليكمان ، "نظام Ubiquitin-proteasome والميتوكوندريا & # x2014reciprocity ،" Biochimica et Biophysica Acta & # x2014 آليات تنظيم الجينات، المجلد. 1809 ، لا. 2، pp. 80–87، 2011. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  78. J. Cardoso ، M.J. Soares ، R.F.S Menna-Barreto et al. ، "تثبيط كتل النشاط البروتيازومي المثقبية الكروزية النمو وتكوين الحلقات ، " بحوث الطفيليات، المجلد. 103 ، لا. 4، pp. 941–951، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  79. J. Cardoso، C. D. P. Lima، T. Leal et al.، “تحليل التحلل البروتيني البروتيزومي أثناء في المختبر metacyclogenesis من المثقبية الكروزية,” بلوس واحد، المجلد. 6 ، لا. 6 ، معرف المقالة e21027 ، 2011. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  80. L. Osorio و I. R & # xedos و B. Guti & # xe9rrez و J. Gonz & # xe1lez ، "عوامل الفوعة من المثقبية الكروزية: من هو من؟" الميكروبات والعدوى، المجلد. 14 ، لا. 15، pp. 1390–1402، 2012. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  81. D.C Bartholomeu ، و J.AN Batista ، و M.H Vainstein ، و B. D. Lima ، و M. المثقبية الكروزية,” علم الوراثة الجزيئية وعلم الجينوم، المجلد. 265 ، لا. 6 ، ص 986-992 ، 2001. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  82. S.M Gantt ، و J.M Myung ، و M.R.S Briones et al. ، "تمنع مثبطات البروتيازوم تطوير المتصورة النيابة,” عوامل مضادات الميكروبات والعلاج الكيميائي، المجلد. 42 ، لا. 10، pp.2731–2738، 1998. View at: Google Scholar
  83. ج. سيرتاد ، أ.أبراهيم ، وإي.جورج ، "الاستنساخ والتوصيف الجزئي للبروتيازوم S4 ATPase من المتصورة المنجلية,” علم الطفيليات التجريبية، المجلد. 93 ، لا. 3، pp. 123–131، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  84. م. لي ، ج. لي ، إم. موغثين ، وس. أ. وارد ، "الاستنساخ الجزيئي لجين يشفر بروتيازوم 20 ثانية & # x3b2 الوحدة الفرعية من المتصورة المنجلية,” المجلة الدولية لعلم الطفيليات، المجلد. 30 ، لا. 6 ، ص 729-733 ، 2000. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  85. دبليو إتش ويتولا وسي بي مأمون ، "يتسبب الكولين في قمع النسخ والتدهور البروتوزومي لميثيل ترانسفيراز فوسفو إيثانول أمين الملاريا ،" خلية حقيقية النواة، المجلد. 6 ، لا. 9 ، ص 1618-1624 ، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  86. T. Hatabu ، M. Hagiwara ، N. Taguchi وآخرون ، "المتصورة المنجلية: يثبط المستقلب الجليوتوكسين الفطري نشاط التحلل للبروتين ويمارس تأثير مبيد للبلازما على المتصورة المنجلية,” علم الطفيليات التجريبية، المجلد. 112 ، لا. 3، pp. 179–183، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  87. C. Lindenthal و N. Weich و Y. S. Chia و V. Heussler و M.Q. Klinkert ، "يعيق مثبط البروتوزوم MLN-273 نمو كريات الدم الحمراء وتطور طفيليات المتصورة" علم الطفيليات، المجلد. 131 ، لا. 1 ، ص 37-44 ، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  88. جيه إم رينولدز ، ك. البساطي ، جيه براندنبورغ ، إيه جي & # xfcnzl ، وسي بي مامون ، "النشاط المضاد للملاريا لمانع السرطان ومثبط البروتيازوم بورتيزوميب ونظيره ZL3B ،" علم الصيدلة السريرية BMC، المجلد. 7 ، المادة 13 ، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  89. Kreidenweiss، P.G Kremsner، and B. Mordm & # xfcller، "دراسة شاملة لمثبطات البروتوزوم ضد المتصورة المنجلية السلالات المختبرية والعزلات الحقلية من الجابون ، " مجلة الملاريا، المجلد. 7 ، المادة 187 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  90. H. Li ، E.L Ponder ، M. Verdoes et al. ، "التحقق من البروتيازوم كهدف علاجي في المتصورة باستخدام مثبط الإيبوكسي كيتون مع سمية خاصة بالطفيلي ، " الكيمياء & # x26 علم الأحياء، المجلد. 19 ، لا. 12 ، ص 1535-1545 ، 2012. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  91. A. Paugam ، C. Creuzet ، J. Dupouy-Camet ، و M. P. Roisin ، "دليل على وجود بروتيازوم في التوكسوبلازما gondii: التوطين داخل الخلايا وأنشطة الببتيداز المحددة ، " طفيلي، المجلد. 8 ، لا. 4، pp.267–273، 2001. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  92. A. Paugam و C. Creuzet و J. Dupouy-Camet و M. التوكسوبلازما,” بحوث الطفيليات، المجلد. 88 ، لا. 8 ، ص 785-787 ، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  93. M. K. Shaw ، C. Y. He ، D. S. Roos ، and L.G Tilney ، “تمنع مثبطات البروتيازوم النمو داخل الخلايا وتضاعف التوكسوبلازما,” علم الطفيليات، المجلد. 121 ، لا. 1 ، ص 35-47 ، 2000. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  94. جي إتش ماكيرو ، سي كافري ، بي كيلي ، بي لوك ، إم ساجيد ، "البروتياز في الأمراض الطفيلية ،" المراجعة السنوية لعلم الأمراض، المجلد. 1 ، ص 497-536 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  95. ستيفردينج ، إكس وانج ، ب. سي بوتس ، وإم أ بالادينو ، "نشاط مبيد المثقبيات & # x3b2-لاكتون-& # x3b3مثبطات بروتوزوم اللاكتام ، " بلانتا ميديكا، المجلد. 78 ، لا. 2، pp.131–134، 2012. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  96. سي. سي وانج ، ز. بوزديش ، سي-إل. Liu et al. ، "التحليل الكيميائي الحيوي لبروتيازوم 20S من المثقبية البروسية,” مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 278 ، لا. 18، pp. 15800–15808، 2003. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  97. آر جلين ، إيه جيه بيمبرتون ، إتش جي رويلي وآخرون ، "تأثير المثقبيات & # x3b1& # x2032 ،& # x3b2& # x2032-epoxyketones يشير إلى أن المثقبيات حساسة بشكل خاص لمثبطات نشاط البروتوزوم الشبيه بالتريبسين ، " المجلة الدولية للعوامل المضادة للميكروبات، المجلد. 24 ، لا. 3، pp.286–289، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  98. ستيفردينغ ، آر دبليو سباكمان ، إتش جيه رويل ، و آر جلين ، "أنشطة مبيدات المثقبيات لمثبطات بروتوزوم ترايلوسين ميثيل فينيل سلفون ،" بحوث الطفيليات، المجلد. 95 ، لا. 1، pp.73–76، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل

حقوق النشر

حقوق النشر & # xA9 2015 Christian Mu & # xf1oz et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط الاستشهاد بالعمل الأصلي بشكل صحيح.


الاستنتاجات

لقد حددنا مواقع أستلة في اللايسينات الخمسة في الطرف C لـ Cx32. يوضح التحليل التحولي لمخلفات الأسيتيل أو المخلفات المحاكية أن هذه اللايسينات تلعب دورًا محتملاً في تنظيم انتشار Cx32 واستقراره ودورانه. يؤدي تثبيط HDAC6 إلى تراكم بروتين Cx32 الأسيتيل ، مما يوفر مزيدًا من الأدلة على تعديل HDAC6 لمستويات أستلة Cx32. أظهر التحليل الإضافي للطفرات C- الطرفية أن بقايا اللايسين الحرجة هذه لا تغير موصلات تقاطع الفجوة بوساطة Cx32 ، وبدلاً من ذلك ، يبدو أن حالة الأسيتيل لهذه الليسين الطرفية C تنظم معدل دوران البروتين Cx32 وتؤثر على وظائف القناة المستقلة ، بما في ذلك الخلوية. الانتشار. تسلط هذه النتائج الضوء على دور اللايسينات في الذيل الطرفي C لـ Cx32 في الضبط الدقيق لاستقرار Cx32 والوظائف المستقلة عن القناة.


شاهد الفيديو: التخلص من مشكلة عدم معرفة المستوى البنائي للبروتين الى الابد باذن الله #بالقرآننحيا (كانون الثاني 2022).