معلومة

كيف ترشح سلاسل ضوء الأجسام المضادة إلى أنواع كابا ولامدا على موقع PDB؟


يمكن أن تكون السلاسل الخفيفة للأجسام المضادة إما من أنواع كابا أو لامدا. أنا أبحث عن تسلسلات متشابهة على موقع RCSB PDB. هل هناك طريقة لتصفية هذين النوعين؟


التعليمات هي كما يلي.

  1. انتقل إلى RCSB PDB Webite.
  2. تحت شريط البحث ، انقر فوقتصفح عن طريق التعليقات التوضيحية.
  3. انقر فوق علامة التبويب الزرقاء المسمىسكوب.
  4. انقر فوق السهم الأبيض الموجود بجانب المجلد الذي يحمل العنوان كل Beta Protiens.
  5. انقر فوق السهم الأبيض الموجود بجانب المجلد المسمى شطيرة بيتا تشبه الغلوبولين المناعي (...).
  6. انقر فوق السهم الأبيض الموجود بجانب المجلد المسمى الغلوبولين المناعي (الأسرة الفائقة).

هذا هو المكان الذي تنقسم فيه ، بناءً على بحثك المحدد.

بالنسبة للسلسلة الخفيفة ، المجال الثابت:

  1. انقر فوق السهم الأبيض الموجود بجانب المجلد الذي يحمل العنوان مجموعة المجالات C1 (مثل المجال الثابت للجسم المضاد).
  2. بالنسبة إلى Kappa Type ، انقر فوق المجلد (وليس السهم) بعنوان الجلوبيولين المناعي ذو السلسلة الخفيفة من مجال كابا الثابت ، CL-kappa.
  3. بالنسبة إلى نوع Lambda ، انقر فوق المجلد (وليس السهم) الذي يحمل العنوان الجلوبيولين المناعي ذو السلسلة الخفيفة من مجال لامدا الثابت ، CL-lambda.

بالنسبة للسلسلة الخفيفة ، المجال المتغير:

  1. انقر فوق السهم الأبيض الموجود بجانب المجلد الذي يحمل العنوان مجموعة V (تشبه المجال المتغير للجسم المضاد).
  2. بالنسبة إلى Kappa Type ، انقر فوق المجلد (وليس السهم) بعنوان سلسلة كابا المتغيرة ذات السلسلة الخفيفة من الجلوبيولين المناعي ، VL-kappa (...).
  3. بالنسبة إلى نوع Lambda ، انقر فوق المجلد (وليس السهم) الذي يحمل العنوان الغلوبولين المناعي ذو السلسلة الخفيفة من مجال لامدا المتغير ، VL-lambda (...).

يجب أن ينقلك هذا إلى قائمة البروتينات التي تبحث عنها.


الكشف عن عصابات IgG kappa و IgG lambda قليلة النسيلة في السائل النخاعي والمصل باستخدام الأجسام المضادة Hevylite ™. مقارنة مع نمط قليل النسيلة خفيف السلسلة الحرة

تشير عصابات IgG قليلة النسيلة في السائل الدماغي الشوكي التي لا توجد في المصل إلى تخليق IgG داخل القراب وهي علامة حساسة للأمراض الالتهابية للجهاز العصبي المركزي ، وخاصة التصلب المتعدد. قد يكون من المهم تحديد ما إذا كانت هذه النطاقات هي في الغالب IgGκ أو IgGλ.

أساليب

لقد استخدمنا الأجسام المضادة Hevylite ™ وقمنا بتطوير تقنية للكشف عن نطاقات قليلة النسيلة IgGκ و IgGλ عن طريق التركيز المتساوي الكهربي متبوعًا بالتكتل المناعي. تم استخدام نفس التقنية للكشف عن و free قليل النسيلة. من بين العديد من التقنيات التي تم اختبارها ، يبدو أن التلقيح المناعي للألفة هو الأكثر حساسية حيث يمكنه اكتشاف أقل من 1 نانوغرام من بروتين IgGκ أو IgGλ. قمنا بمقارنة ملفات تعريف IgG قليلة النسيلة بملفات IgGκ قليلة النسيلة و IgGλ. كان هناك اتفاق جيد بشأن وجود أو عدم وجود تخليق داخل القراب. لاحظنا النسب بين نطاقات IgGκ قليلة النسيلة و IgGλ ، ولم تتطابق دائمًا مع النسب بين النطاقات الحرة κ والحرة λ. تمكنا أيضًا من اكتشاف نطاقات IgGκ و IgGλ قليلة النسيلة المقيدة بمستضد معين في CSF في داء الأورام العصبية. يبقى أن يتم تحديده لاحقًا من خلال دراسة مستقبلية موجهة سريريًا ، سواء كان يمكن ملاحظة ما إذا كان IgGκ / IgGλ السائد أو / free يمكن ملاحظته بشكل متكرر في أمراض معينة مع تخليق IgG قليل النسيلة.

مناقشة

الكشف الحساس للغاية عن عصابات IgGκ و IgGλ قليلة النسيلة في السائل النخاعي مع الأجسام المضادة لـ Hevylite من الممكن أيضًا الكشف عن IgGκ أو IgGλ الخاص بمستضد معين. في حالات معينة ، على سبيل المثال عندما تنشأ صعوبات في التمييز بين نمط قليل النسيلة ووحيد النسيلة ، قد يكون للاختبار قيمة سريرية كبيرة.


2.2. التعرف على بروتينات المصل وحيدة النسيلة

بالتوازي مع الملاحظات السريرية والعلمية لدور بروتين بنس جونز ، كانت تقنيات الرحلان الكهربي لفصل البروتين تتطور ودخلت في النهاية إلى المختبرات السريرية. Perlzweig et al. [56] كان أول من أبلغ عن فرط بروتينات الدم في MM في عام 1928. بعد فترة وجيزة في عام 1930 ، أبلغ Tiselius عن تجانس بعض الجلوبيولين في الدم باستخدام تقنية ابتكرها ، يطلق عليها الانتقال الكهربائي للحدود


تشخبص

يتضمن الاختبار التشخيصي للداء النشواني AL اختبارات الدم واختبارات البول والخزعات. يمكن أن تشير اختبارات الدم و / أو البول إلى علامات البروتين النشواني ، ولكن اختبارات نخاع العظام فقط أو عينات خزعة صغيرة أخرى من الأنسجة أو الأعضاء يمكن أن تؤكد بشكل إيجابي تشخيص الداء النشواني. يتم إجراء بعض الاختبارات مرة واحدة فقط لتحديد تشخيص الداء النشواني AL ، بينما سيتم تكرار اختبارات أخرى لمراقبة تطور المرض والاستجابة للعلاج.

تحاليل الدم والبول

يجب إجراء اختبارات الدم والبول للمساعدة في التحقق من التشخيص. يمكنهم أيضًا المساعدة في اكتشاف الأعضاء المتورطة ومدى تعرضها للخطر. قد تشمل هذه الاختبارات:

  • جمع عينة من البول على مدار 24 ساعة لفحص مستوى البروتين في عينة البول. قد يكون البروتين الزائد في البول مؤشرا على إصابة الكلى.
  • مستوى ALP (إنزيم يسمى "الفوسفاتيز القلوي") في فحوصات الدم المنتظمة.
  • تعتبر اختبارات الدم للبحث عن الإجهاد والضغط على القلب مفيدة في العديد من أمراض القلب ، بما في ذلك الداء النشواني AL. تشمل المؤشرات الحيوية القلبية المستخدمة تروبونين تي أو تروبونين 1 ، و NT-proBNP (الذي يرمز إلى N-terminal المؤيد للدماغ) أو BNP (ببتيد ناتريوتريك للدماغ). تستخدم المعامل المختلفة أحدهما مقابل الآخر.
  • تشمل اختبارات بروتينات الأجسام المضادة غير الطبيعية (الغلوبولين المناعي) في الدم اختبار Freelite ، الذي يُظهر مستوى سلاسل ضوء كابا ولامدا في اختبار دم منفصل. غالبًا ما يشار إلى اختبار Freelite Assay باسم FLC ، وهو اختصار لسلاسل الضوء المجانية.
  • يمكن إجراء اختبار آخر للجلوبيولين المناعي غير الطبيعي بالدم و / أو البول. يطلق عليه & # 8220immunofixation الكهربائي. & # 8221

يمكن أن تساعد اختبارات الدم والبول هذه في التشخيص وتستخدم كثيرًا أثناء مراقبة الاستجابة للعلاج.

مخطط صدى القلب والتصوير

مخطط صدى القلب (يسمى أيضًا "صدى") هو تصوير بالموجات فوق الصوتية للقلب. يمكن للطبيب أن يبحث عن رواسب الأميلويد في القلب ، بينما يطلع على حجمها وشكلها وموقع ومدى أي تأثير للأميلويد.

في الآونة الأخيرة ، أظهرت اختبارات التصوير الأخرى للقلب أنها مفيدة أيضًا. أحد الاختبارات هو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، وفي هذه الحالة ، يُشار إليه أيضًا باسم CMR (للرنين المغناطيسي للقلب). يستخدم مسح بيروفوسفات ، وهو اختبار للطب النووي ، لتقييم ما إذا كان هناك نوع غير عادي من الشذوذ في وظائف عضلة القلب (& # 8220cardiomyopathy & # 8221). تشير البيانات الحالية إلى أن هذا الفحص قد يكون مفيدًا في التمييز بين أنواع مختلفة من أمراض القلب النشواني.

خزعة الأنسجة

تتضمن خزعة الأنسجة إزالة عينة صغيرة من الأنسجة للعثور على دليل على وجود رواسب أميلويد. يجب إرسال أي نوع من الأنسجة أو خزعة الأعضاء إلى المختبر للفحص المجهري ، حيث يتم تلطيخ الأنسجة بصبغة تسمى "بقعة الكونغو الحمراء". بعد وضعه تحت المجهر ، يتم اكتشاف بروتين الأميلويد إذا تحول إلى لون أخضر تفاحي ، مما يؤدي إلى تشخيص الداء النشواني. تشمل المناطق المحتملة لإجراء الخزعات الأقل توغلاً ما يلي:

  • خزعة وسادة من الدهون (من تحت الجلد في البطن)
  • خزعة الغدة اللعابية الشفوية (الشفة الداخلية) و
  • الجلد أو نخاع العظام.

مع توليفة من اختبارات الدم والبول وخزعات الأنسجة ، يمكن تأكيد التشخيص الإيجابي في نسبة عالية من المرضى.

نضح وخزعة نخاع العظم

هناك نوعان من اختبارات نخاع العظام التي يمكن إجراؤها. تتضمن هذه إزالة بعض السائل النخاع العظمي (نضح النخاع العظمي) و / أو إزالة لب 1-2 سم من نسيج النخاع العظمي في قطعة واحدة (خزعة نخاع العظم). يمكن أن تساعد هذه العينات في تحديد النسبة المئوية لخلايا البلازما المنتجة للأميلويد ، وعند اختبارها في المختبر يمكن أن تساعد في تحديد ما إذا كانت خلايا البلازما غير الطبيعية تنتج سلاسل كابا أو لامدا الخفيفة.

خزعة الأعضاء

إذا كان لا يزال هناك شك في الإصابة بالداء النشواني ولكن تبين أن خزعات النخاع العظمي أو الوسادة الدهنية أو الشفة أو مواقع الجلد سلبية ، فيجب إجراء الخزعة الجراحية للعضو الذي يشير إلى الأعراض وإرسالها إلى المختبر. يمكن أخذ عينات الخزعة من:

إذا أظهرت أي نتيجة خزعة تشخيصًا إيجابيًا للداء النشواني ، فمن الضروري أيضًا تحديد النوع الدقيق لبروتين الأميلويد المتضمن. في هذه الحالة ، يجب تأكيد نوع الداء النشواني AL ، والذي يظهر اضطراب نخاع العظم مع تورط السلسلة الخفيفة ، والمعروف أيضًا باسم & # 8220 خلل التنسج الخلوي البلازمي. & # 8221


المواد والأساليب

إنتاج الأرنب IgG

تم تصنيع الجينات المشفرة للجلوبيولين المناعي للأرانب كيميائيًا (Genewiz ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) متبوعًا بالاستنساخ الفرعي في pcDNA3.4 باستخدام مجموعة استنساخ الاندماج (Takara Bio ، Shiga ، اليابان). لإزالة السيستين في سلاسل كابا ، تم إجراء الطفرات باستخدام PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio). تم إنتاج IgGs باستخدام نظام التعبير Expi293 (Thermo Fisher Scientific ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) عن طريق ترنسفكأيشن من متجهين يشفران السلاسل الثقيلة والخفيفة ، على التوالي. تم عزل IgGs بواسطة البروتين A اللوني باستخدام rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) متبوعًا بالتنقية النهائية بواسطة كروماتوجرافيا استبعاد الحجم (SEC) باستخدام HiLoad 16/600 Superdex 200 pg أو HiLoad 26/600 Superdex 200 عمود pg (GE Healthcare). تم تحديد تركيز الأجسام المضادة وببتيد المستضد عن طريق الامتصاص عند 280 نانومتر.

قياس الثبات الحراري

تم تحديد الاستقرار الحراري للأجسام المضادة بواسطة DSC بتركيزات 12-30 ميكرومتر في محلول ملحي بالفوسفات (PBS). تم إجراء جمع البيانات في أداة VP-Capillary DSC (Malvern Instruments ، المملكة المتحدة) بمعدل مسح قدره 1.0 أو 0.33 درجة مئوية دقيقة -1 بين 20 و 100 درجة مئوية. تم إجراء عمليات Rescans في بروتوكول قياسي مقدم من الشركة المصنعة.

قياس نشاط الربط

تم فحص المعلمات الديناميكية الحرارية للتفاعل بين الجسم المضاد والمستضد بواسطة قياس حراري معايرة حراري (ITC) في أداة iTC200 (Malvern). تم تصنيع الببتيد المستضد (Arg-Pro-His-Phe-Pro-Gln-Phe-pSer-Tyr-Ser-Ala-Ser: pSer يمثل الفوسفوسرين) كيميائيًا (Scrum Inc ، طوكيو ، اليابان). لمحلول الجسم المضاد (A4 ، G11: 2 ميكرومتر ، A3: 3 ميكرومتر) في الخلية ، تمت معايرة 1.5 ميكرولتر من محلول ببتيد المستضد (A4 ، G11: 40 ميكرومتر ، A3: 60 ميكرومتر) لكل حقنة لمدة 25 مرة على فاصل 160 ثانية بمعدل تقليب 1000 دورة في الدقيقة. أجريت القياسات في برنامج تلفزيوني عند 25 درجة مئوية. تم إجراء القياسات ثلاث مرات في نفس الإجراء.

تحليل البيانات

تم تحليل بيانات DSC و ITC بواسطة Origin 8.0 (Originlab Corp. ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). بالنسبة لقياسات DSC ، تم إجراء التحليل في نموذج غير حالتين مع عمليتي تمسخ. بالنسبة لقياسات مركز التجارة الدولية ، تم إجراء التحليل كنموذج ربط 1: 1.


مناقشة

يمكن للأجسام المضادة الموجهة إلى NTD و RBD أن تحيد بفاعلية عالية (أقل من 0.01 & # x000a0 & # x003bcg / mL IC50). بينما يُظهر RBD العديد من المواقع غير المتداخلة للضعف تجاه الأجسام المضادة (Barnes et al.، 2020a Brouwer et al.، 2020 Lv et al.، 2020 Pinto et al.، 2020 Yuan et al.، 2020a) ، يبدو أن NTD تحتوي فقط موقع واحد من نقاط الضعف للتحييد. كما نوقش أعلاه ، قد يكون أحد أسباب ذلك هو ارتفاع كثافة الجليكان على NTD ، مع 8 ن- جليكانات مرتبطة في & # x0223c300 بقايا ، كثافة جليكان واحد لكل & # x0223c40 بقايا ، وعدد قليل من الأسطح الخالية من الجليكان التي يمكن التعرف عليها بسهولة من قبل الجهاز المناعي. قد يكون السبب الثاني هو زاوية النهج المقيدة التي لاحظناها لجميع الأجسام المضادة المعادلة الموجهة NTD المعروفة ، بما في ذلك السبعة المبلغ عنها هنا ، والتي تقترب جميعها من & # x0201cabove. & # x0201d نلاحظ في هذا السياق أن تحليل المنافسة يشير إلى NTD أخرى - أجسام مضادة موجهة قادرة على التعرف على السنبلة وتشكيل مجموعة منافسة منفصلة لتكون غير معادلة (Liu et & # x000a0al.، 2020a) & # x02014 والسطح الكبير الآخر على NTD المكشوف على الوجوه المسننة باتجاه الغشاء الفيروسي. هذا السطح في الغالب خالي من الجليكان ، وستكون الأجسام المضادة المرتبطة به مطلوبة للاقتراب من & # x0201cbelow. & # x0201d وهكذا ، على عكس RBD ، حيث يبدو أن الأجسام المضادة المعادلة لها زوايا اقتراب متنوعة ، فإن وجود موقع NTD واحد فقط من قد تتعلق الثغرة بمتطلبات الاقتراب من أعلى.

بالإضافة إلى تلبية المتطلبات الناشئة عن زاوية النهج المقيدة ، من المرجح أن ينشأ الانتشار النسبي العالي للأجسام المضادة الموجهة فوق المواقع NTD من زيادة المناعة بسبب انخفاض كثافة الجليكان النسبية للموقع الفائق والطبيعة المرنة لدبوس الشعر N3 و مناطق التعرف الأولي في حلقة N5 ، بالإضافة إلى قدرتها على تحمل المطابقات المتميزة التي تسمح بالتعرف عليها من خلال الأجسام المضادة المتنوعة. في حالة فئة الجسم المضاد VH1-24 متعددة المانحين ، والتي تنشأ من جين VH الأكثر استخدامًا (الشكل & # x000a0S1A) ، تم مؤخرًا تحديد عضوين إضافيين من فئة المعادلة الموجهة من NTD: FC05 و CM25 (Voss et & # x000a0al ، 2020 Wang et & # x000a0al. ، 2021). وجدنا أن VH1-24 هو أكثر جين VH البشري سالبًا (الشكل & # x000a0S5B). تكمل هذه الإمكانات الكهروستاتيكية السلبية الطبيعة الكهربية الشديدة لموقع NTD الفائق الذي نلاحظه هنا (الشكل & # x000a06 D). وبالتالي ، يمكن أن تسهم عوامل متعددة ، بما في ذلك الارتباط بالجليكوزيل اللاصق والمرونة ، والقيود المفروضة على زاوية الاقتراب ، وتكامل شحنة المظلة ، في انتشار الأجسام المضادة التي تستهدف موقع NTD الفائق.

على الرغم من أن نهج الارتفاع من أعلى الذي لوحظ بالنسبة لجميع الأجسام المضادة المُعادلة الموجهة من NTD يتوافق مع آلية التعادل القائمة على العائق الفاصل لتفاعل السنبلة مع مستقبلات ACE2 في غشاء الخلية ، لا يوجد حاليًا أي دليل على التنافس بين الأجسام المضادة الموجهة من NTD و ACE2 (Liu et & # x000a0al.، 2020a). قد يكون النموذج البديل المعقول هو التعرف على الجسم المضاد لموقع NTD الفائق لإعاقة وظيفة السنبلة في التوسط في اندماج أغشية الفيروس والخلايا المضيفة. في الواقع ، أظهر تحليل مقاومة البروتياز لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية ارتفاعًا معقدًا مع الجسم المضاد المعادل الموجه لـ MERS NTD 7d10 أن الارتباط 7d10 منع زيادة حساسية البروتياز المرتبطة بانتقال ما قبل الانصهار إلى ما بعد الاندماج (Zhou et & # x000a0al. ، 2019). يمكن أن تشرح آلية التثبيت التوافقي أيضًا كيف يمكن لجسم مضاد يربط وحدة فرعية واحدة فقط لكل قاطع سبايك أن يحقق تحييدًا فعالًا. ستكون هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم آليات تحييد الأجسام المضادة التي تتعرف على موقع NTD الفائق.

فيما يتعلق بتأثيرات اللقاح ، تحدد نتائجنا بوضوح موقع NTD من الضعف الذي يحتمل أن يؤدي إلى تحييد الأجسام المضادة. هناك العديد من الطرق التي يمكن بها دمج هذه المعلومات في تصميم اللقاح ، بما في ذلك تضمين NTD جنبًا إلى جنب مع RBD في تركيبات اللقاح ، والعرض متعدد التكافؤ لموقع NTD الفائق على الجسيمات النانوية المناعية ، والتركيز على الحاتمة من خلال إنشاء سقالات تعرض N3 & # x003b2-hairpin ومناطق أخرى تتعرف عليها الأجسام المضادة المُعادلة الموجهة من NTD.

فيما يتعلق بالإمكانيات العلاجية للأجسام المضادة الموجهة من NTD ، فهذه تستهدف موقعًا بعيدًا عن تلك التي تستهدف مواقع RBD وبالتالي يجب أن توفر تحييدًا تكميليًا للأجسام المضادة الموجهة RBD وتتطلب مسارات هروب مميزة. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن جميع ، أو الغالبية العظمى ، من الأجسام المضادة التي تعمل على تحييد NTD تستهدف موقعًا واحدًا ، تشير إلى أنه قد تكون هناك فائدة قليلة لاستخدام توليفات من الأجسام المضادة المعادلة الموجهة من NTD.

أخيرًا ، فإن سلالات SARS-CoV-2 الطافرة الجديدة ، خاصة تلك التي ظهرت في المملكة المتحدة وجنوب إفريقيا (السلالات B.1.1.7 و B.1.351 ، على التوالي) ، مثيرة للقلق بسبب زيادة قابلية الانتقال ، وهذه السلالات تفلت من معظم NTD الموجهة تحييد الأجسام المضادة. تتضمن B.1.1.7 طفرات حذف NTD D69-70 و D144 ، وتتضمن السلالة B.1.351 طفرات NTD D242-244 و R246I. تمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها ، فإن المواقف المتحولة بما في ذلك 144 و 242-244 و 246 كلها داخل موقع NTD الفائق. في حين أن الحذف في 69-70 خارج الموقع الفائق ، فإنه يشكل جزءًا من حلقة N2 القاسية من NTD يمكن أن يؤثر حذفها بشكل كبير على تشكيل موقع NTD الفائق. بشكل ملحوظ ، تمت مشاركة ثلاث وحدات متبقية فقط بين ثمانية حواتم للجسم المضاد الموجه لـ NTD والتي تم تحليلها هنا: Y144 و R246 و L249 (الجدول S5). ومن المثير للاهتمام ، أن اثنين من هذه البقايا الثلاثة هما البقايا الدقيقة التي تحورت في المتغيرات الناشئة المثيرة للقلق (& # x00394144 و R246I) ، ومن المحتمل أن يتأثر L249 بـ & # x00394242-244. وبالتالي ، فإن الجانب الآخر من موقع فائق واحد هو أن تباين الموقع الفائق قد يؤدي إلى مقاومة ضد معظم الأجسام المضادة التي تستهدف الموقع & # x02014 ويتم اختيارها من بين المتغيرات الناشئة.


نتائج

تحليل جينات المنطقة المتغيرة ذات السلسلة الخفيفة في Zebra Finch

باستخدام متواليات IGL البشرية (كابا ولامدا) والدجاج (لامدا) والضفدع (سيغما) كاستعلامات ، حددنا 21 IGL جينات المنطقة المتغيرة الموجودة في مجموعة في الكروموسوم 15 من جينوم الزيبرا فينش. يتم إعطاء الموقع الجينومي لجينات المنطقة المتغيرة هذه في عصفور الحمار الوحشي في الجدول التكميلي S1 (المواد التكميلية عبر الإنترنت). أشارت مقارنة التسلسل مع التسلسلات الوظيفية للإنسان والدجاج والضفدع إلى أنه من بين 21 IGL جينات المنطقة المتغيرة ، تسلسل واحد فقط وظيفي لأنه يحتوي على تسلسل تشفير كامل بدون طفرات تغيير الإطارات و / أو أكواد الإيقاف الداخلية ، ومتبقي Cys محفوظين في مناطق FR1 و FR3 و RSS مناسب (الشكل 1). التركيب الجيني للوظيفة المفردة IGL يظهر جين المنطقة المتغيرة في عصفور الحمار الوحشي في الشكل التكميلي S1 (المواد التكميلية عبر الإنترنت). المتبقي IGVL الجينات إما تفتقر إلى القائد المناسب و / أو RSS أو تم اقتطاعها في نهاياتها 5 أو 3 (الشكل التكميلي S2 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) ، مثل الدجاج IGVL الجينات الكاذبة (Reynaud et al. 1987).احتوت أربعة تسلسلات فقط على أكواد الإيقاف الداخلية (الشكل التكميلي S2 والبيانات التكميلية ، المواد التكميلية عبر الإنترنت).

محاذاة متواليات IGL المتغيرة. تم أخذ التسلسلات المرجعية المختارة عشوائيًا لنماذج كابا المعروفة (ثلاثة متواليات IGVK من الإنسان) ، ولامدا (ثلاثة متواليات IGVL من الإنسان وواحد IGVL من الدجاج) ، وسيغما (IGVS من الضفدع) من Das et al. (2008). يتم تمييز العلامات الجزيئية cladistic التي تميز الأنماط النظيرية الثلاثة (κ و λ و σ). يتم إعطاء أطوال متواليات مباعدة RSS. يعتمد ترقيم مواضع الأحماض الأمينية في المقطع V على متواليات IGVK و IGVL البشرية ، وتتم الإشارة إلى الفجوات المتعلقة بتسلسلات IGVS للضفدع بالحرفين "a" و "b" (Das et al. 2008).

محاذاة متواليات IGL المتغيرة. تم أخذ التسلسلات المرجعية المختارة عشوائيًا لنماذج كابا المعروفة (ثلاثة متواليات IGVK من الإنسان) ، ولامدا (ثلاثة متواليات IGVL من الإنسان وواحد IGVL من الدجاج) ، وسيغما (IGVS من الضفدع) من Das et al. (2008). يتم تمييز العلامات الجزيئية cladistic التي تميز الأنماط النظيرية الثلاثة (κ و λ و σ). يتم إعطاء أطوال متواليات مباعدة RSS. يعتمد ترقيم مواضع الأحماض الأمينية في المقطع V على متواليات IGVK و IGVL البشرية ، وتتم الإشارة إلى الفجوات المتعلقة بتسلسلات IGVS للضفدع بالحرفين "a" و "b" (Das et al. 2008).

تحليل IGL الانضمام إلى جينات المنطقة الثابتة في Zebra Finch

من بحث التشابه باستخدام الاستعلامات ، خمسة متواليات ثابتة IGL وظيفية (واحد IGCK واثنين من IGCL من الإنسان ، و IGCL واحد من الدجاج ، و IGCS واحد من الضفدع) ، حددنا وظيفة واحدة فقط IGL ثابت-ترميز الجين في جينوم الزيبرا فينش. يقع هذا الجين 4.5 كيلو بايت في اتجاه مجرى جين منطقة متغيرة وظيفية واحدة. تؤكد تسلسل ESTs و (كدنا) وجود وظيفة واحدة IGL ثابت - جين ترميز في عصفور الحمار الوحشي لأن تسلسل ESTs و cDNA المحدد يتوافق - مع هوية 100 ٪ تقريبًا ولا توجد فجوات - مع موضع جينومي واحد في جينوم عصفور الحمار الوحشي الذي يتوافق مع موضع الفرد IGCL الجين الوظيفي (الجدول التكميلي S2 والبيانات التكميلية ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). للتعرف على IGL عند الانضمام إلى جين المنطقة في جينوم عصفور الحمار الوحشي ، قمنا بمسح ضوئي لـ RSS المحفوظة في منطقة 4.5 كيلو بايت بين جينات المنطقة المتغيرة الوظيفية والثابتة لأن جين المنطقة المنضمة قصير جدًا (عادةً 12 حمضًا أمينيًا في الطول) لا يمكن تحديده بواسطة عمليات البحث عن الانفجار . بمجرد تحديد RSS المحتمل في هذه المنطقة 4.5 كيلو بايت ، قمنا بترجمة متواليات النيوكليوتيدات في الطرف 3 من RSS إلى أحماض أمينية وقارننا التسلسل المترجم مع تسلسل المنطقة IGL للإنسان والدجاج والضفدع ، والتي تم تحديدها في دراستنا السابقة (داس وآخرون ، 2008). باستخدام هذه الطريقة ، حددنا وظيفة واحدة IGL الانضمام إلى جين المنطقة في زيبرا فينش.

تحديد نوع متساوي من Zebra Finch IGL

لتوصيف النمط المتماثل لتسلسل IGL حمار وحشي ، استخدمنا العلامات الجزيئية cladistic ، والتي وصفناها سابقًا (Das et al. 2008). مثل متواليات IGVL لرباعي الأرجل الأخرى ، فإن تسلسل المنطقة المتغيرة الوظيفية الوحيد لعنصر الحمار الوحشي يفتقر إلى Ser أو Thr في الموضع 7 ولا يمتلك بقايا عطرية ضخمة (Phe أو Tyr) في الموضع 53 (الشكل 1). تحتوي متواليات IGVL رباعية الأرجل بشكل عام على نموذج DEAD محفوظ إلى حد ما (Asp – Glu – Ala-Asp) في منطقة FR3 (Das et al. 2008). ومع ذلك ، مثل تسلسل IGVL للدجاج (على سبيل المثال ، DEAV في الموضع 64-67) ، يتم استبدال بقايا Asp بـ Val في الموضع 67 (الشكل 1).

تمشيا مع تسلسل المنطقة المتغيرة ، تصنفها العلامات الجزيئية في متواليات المنطقة الثابتة والثابتة في زيبرا فينش أيضًا على أنها متواليات سلسلة خفيفة لامدا (الشكلان 2 و 3). بالإضافة إلى ذلك ، مثل جينات سلسلة lambda الخفيفة للثدييات ، يتم مقاطعة تسلسل RSS الذي يحيط بجين المنطقة المتغيرة الوظيفية الفردية وجين المنطقة المنضمة بواسطة فاصل 23-bp و 12-bp ، على التوالي ، في عصفور الحمار الوحشي IGL المكان. ومن ثم ، فإن العلامات الجزيئية في متواليات المنطقة المتغيرة والرابطية والثابتة في عصفور الحمار الوحشي تشير إلى أنه مثل الدجاج (Sanders and Travis 1975) والبط (Magor et al. 1994) ، فإن جينوم عصفور الحمار الوحشي يشفر فقط نمط لامدا من Ig.

محاذاة تسلسلات المنطقة المنضمة IGL. تم أخذ التسلسلات المرجعية المختارة عشوائيًا لنماذج كابا المعروفة (ثلاثة متواليات IGJK من الإنسان) ، ولامدا (ثلاثة متواليات IGJL من الإنسان وواحد IGJL من الدجاج) ، وسيغما (اثنان من IGJS من الضفدع) من Das et al. (2008). تم تمييز العلامات الجزيئية cladistic التي تميز الأنماط النظيرية الثلاثة (و λ و σ) (Das et al. 2008). يتم عرض أطوال متواليات مباعدة RSS.

محاذاة تسلسلات المنطقة المنضمة IGL. تم أخذ التسلسلات المرجعية المختارة عشوائيًا لنماذج كابا المعروفة (ثلاثة متواليات IGJK من الإنسان) ، ولامدا (ثلاثة متواليات IGJL من الإنسان وواحد IGJL من الدجاج) ، وسيغما (اثنان من IGJS من الضفدع) من Das et al. (2008). تم تمييز العلامات الجزيئية cladistic التي تميز الأنماط النظيرية الثلاثة (و λ و σ) (Das et al. 2008). يتم عرض أطوال متواليات مباعدة RSS.

محاذاة متواليات IGL الثابتة. تم أخذ التسلسلات المرجعية لنماذج كابا معروفة (تسلسل IGCK واحد من الإنسان) ، و lambda (اثنان IGCL من الإنسان وواحد IGCL من الدجاج) ، و sigma (IGCS واحد من الضفدع) من Das et al. (2008). يعتمد ترقيم مواضع الأحماض الأمينية في المقطع C على Das et al. (2008). تتميز الفجوة المتعلقة بتسلسل IGCS للضفدع والفجوات المتعلقة بتسلسل IGCL الحمار الوحشي بالأبجديات. يتم تمييز العلامات الجزيئية cladistic التي تميز الأنماط النظيرية الثلاثة (κ و λ و σ).

محاذاة متواليات IGL الثابتة. تم أخذ التسلسلات المرجعية لنماذج كابا معروفة (تسلسل IGCK واحد من الإنسان) ، و lambda (اثنان IGCL من الإنسان وواحد IGCL من الدجاج) ، و sigma (IGCS واحد من الضفدع) من Das et al. (2008). يعتمد ترقيم مواضع الأحماض الأمينية في المقطع C على Das et al. (2008). تتميز الفجوة المتعلقة بتسلسل IGCS للضفدع والفجوات المتعلقة بتسلسل IGCL الحمار الوحشي بالأبجديات. يتم تمييز العلامات الجزيئية cladistic التي تميز الأنماط النظيرية الثلاثة (κ و λ و σ).

اللافت للنظر ، يمكن تمييز تسلسل المنطقة الثابتة IGL لحمار الوحشي عن تسلسل المنطقة الثابتة IGL رباعي الأرجل لأنه يحتوي على إدخال فريد من امتداد ستة أحماض أمينية (QQQSST) (الشكل 3). تم تأكيد هذا الإدراج من خلال حقيقة أن جميع متواليات ESTs / cDNAs ، عند ترجمتها ، تشمل الأحماض الأمينية الستة الإضافية (انظر الجدول التكميلي S2 والبيانات التكميلية ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). لمزيد من تحليل هذا الإدراج ، أنشأنا نموذجًا ثلاثي الأبعاد لبروتين IGCL الحمار الوحشي وقمنا بتعيين الإدخال على النموذج ثلاثي الأبعاد (الشكل 4). يتنبأ تحليلنا بأن إدخال QQQSST يمتد إلى حلقة موجودة في المنطقة الواقعة بين IGVL و IGCL بحوالي 9 Å (الشكل 4 التكميلي S4 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). على الرغم من أنه من المتوقع أن تقلل هذه الحلقة الممتدة من المسافة بين سلاسل Ig الخفيفة والثقيلة بحوالي 6 Å (الشكل التكميلي S4 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت) ، لا يبدو أنها تؤثر على الاتصال بين سلاسل Ig المختلفة. هذا الافتراض يستحق أن يتم اختباره تجريبيا.

يتم تعيين إدخال الأحماض الأمينية لتسلسل بروتين IGCL حمار وحشي فينش على نموذج ثلاثي الأبعاد. تم إنشاء النموذج النظري ثلاثي الأبعاد لـ IGCL الزيبرا فينش (كما هو موضح باللون السماوي الفاتح) باستخدام البنية التي تم حلها تجريبيًا لسلسلة IGL lambda البشرية كقالب (كما هو موضح في رمز الانضمام PDB الأخضر: 1A8J). تمت محاذاة الهياكل المتوقعة والقالب هيكليًا لتمييز منطقة الإدراج (الموضحة باللون الأحمر). تُظهر اللوحة العلوية تمثيلاً كرتونيًا ، بينما يُظهر الجزء السفلي تمثيلًا سطحيًا للمبنيين.

يتم تعيين إدخال الأحماض الأمينية لتسلسل بروتين IGCL حمار وحشي فينش على نموذج ثلاثي الأبعاد. تم إنشاء النموذج النظري ثلاثي الأبعاد لـ IGCL الزيبرا فينش (كما هو موضح باللون السماوي الفاتح) باستخدام البنية التي تم حلها تجريبيًا لسلسلة IGL lambda البشرية كقالب (كما هو موضح في رمز الانضمام PDB الأخضر: 1A8J). تمت محاذاة الهياكل المتوقعة والقالب هيكليًا لتمييز منطقة الإدراج (الموضحة باللون الأحمر). تُظهر اللوحة العلوية تمثيلاً كرتونيًا ، بينما يُظهر الجزء السفلي تمثيلًا سطحيًا للمبنيين.

التنظيم الجينومي لـ IGL Locus في Zebra Finch

في موضع ترميز كابا وسيغما لمعظم رباعيات الأرجل ، توجد جينات متعددة للمنطقة المنضمة في مجموعة ، متبوعة بجين واحد ثابت ، بينما في موضع ترميز لامدا ، تحدث الجينات المنضمة والثابتة على شكل IGJL - IGCL كتل ، والتي عادة ما يكون لها نسخ متعددة. فقط الدجاج واحد IGJL - IGCL بلوك (داس وآخرون 2008). ال IGL يحتوي موضع في زيبرا فينش على وظيفة واحدة IGVL الجين الزائف المتعددIGVL واحد فقط IGJLIGCL بلوك (شكل 5) ، مثل موضع الدجاج (Reynaud et al. 1985 ، 1987).

مخططات تخطيطية للمنظمات الجينومية لمواقع سلسلة لامدا الخفيفة في الإنسان والحصان والدجاج والحمار الوحشي (ليس على نطاق واسع). تشير القضبان الموجودة أعلى وأسفل الخطوط إلى الجينات الموجودة على خيوط متقابلة بناءً على تسلسل الجينوم المحدد. تُظهِر العصي الطويلة جينات وظيفية ، بينما تُظهِر العصي القصيرة جينات خادعة. المعلومات الموضعية لجينات سلسلة لامدا البشرية والحصانية والدجاج مأخوذة من Das et al. (2008).

مخططات تخطيطية للمنظمات الجينومية لمواقع سلسلة لامدا الخفيفة في الإنسان والحصان والدجاج والحمار الوحشي (ليس على نطاق واسع). تشير القضبان الموجودة أعلى وأسفل الخطوط إلى الجينات الموجودة على خيوط متقابلة بناءً على تسلسل الجينوم المحدد. تُظهِر العصي الطويلة جينات وظيفية ، بينما تُظهِر العصي القصيرة جينات خادعة. المعلومات الموضعية لجينات سلسلة لامدا البشرية والحصانية والدجاج مأخوذة من Das et al. (2008).

توضح المقارنة بين موضع IGL بين الدجاج وعصفور الحمار الوحشي أنه في هذه الأنواع عدد وموضع IGL الجينات متشابهة جدًا (الشكل 5) ، على الرغم من حقيقة أن هذه الأنواع قد تباعدت أكثر من 100 مللي أمبير (براون وآخرون ، 2008). يتمثل الاختلاف الرئيسي بين الموقعين في وجود عدد قليل من الجينات الزائفة ذات الاتجاه العكسي في الدجاج. على عكس الحفظ العام لموقع IGL الذي لوحظ بين نوعي الطيور ، تم مقارنة IGL أظهر الموقع بين أنواع الثدييات المختلفة (أي الإنسان - الحصان) التي تباعدت حوالي 100 مليون سنة العديد من الاختلافات في كل من المناطق الثابتة والمتغيرة (الشكل 5). في المنطقة الثابتة ، يحتوي كل من الإنسان والحصان على سبعة IGJLIGCL لكن توزيع الجينات الوظيفية والجينات الكاذبة يختلف بين النوعين (الشكل 5). في المنطقة المتغيرة ، يختلف أيضًا عدد وتوزيع الجينات الوظيفية والجينات الخادعة بين الإنسان (32 جينًا وظيفيًا و 42 جينًا خادعًا للمنطقة المتغيرة) والحصان (25 منطقة وظيفية متغيرة و 20 جينًا خادعًا) موقع لامدا.


مناقشة

لقد شرعنا في تحديد الخصائص الفيزيائية الحيوية لجميع الأنماط والأنواع الفرعية من ستة أنواع خفيفة وتسعة ثقيلة السلسلة فيما يتعلق بالإنتاج المؤتلف وحركية ربط المستضد. لم تؤد محاولاتنا للتعبير البكتيري عن هذه الأنماط النظيرية إلى إنتاج بروتين يمكن اكتشافه ، حتى عند تطبيقه على IgG1 الكامل كما ورد سابقًا 21. بالنظر إلى الطبيعة البشرية للأجسام المضادة التي تتطلب تعديلًا بعد الترجمة (عامل أردنا استبعاده) ، فإن فشل التعبير البكتيري كان غير منطقي. قد تُعزى أسباب فشل التعبير البكتيري إلى اختلاف البلازميد البكتيري المستخدم ، بالإضافة إلى التسلسلات المتغيرة المختلفة.

على حد علمنا ، تعد دراستنا واحدة من أولى المقارنات الشاملة لجميع الأنماط والأنواع الفرعية للسلسلة الثقيلة والخفيفة البشرية المعروفة باستخدام اثنين من الأجسام المضادة النموذجية ضد نفس المستضد في وقت واحد. وتجدر الإشارة إلى أن ترقيم عائلات Cλ لا يعمل بالترتيب لأن بعض عائلات C (مثل Cλ4 و amp Cλ5) تم اكتشافها لاحقًا على أنها جينات خادعة أو جينات نظرية 17. في الواقع ، لاستقصاء تأثيرات CL فقط ، احتفظنا بـ VL الأصلي ، مشكلين المتغيرات الهجينة Vκ-Cλ.

على الأنماط النظيرية للسلسلة الثقيلة ، من المتوقع أن يعرض IgM قلة قلة مميزة في الغالب لأشكال pemtameric / hexameric مع بعض الوسطاء 10 حتى بدون تعداء مشترك للبلازميدات J-chain (الشكل 1). يتفوق قلة القلة لـ IgM من الناحية المناعية في تنشيط النظام التكميلي مقارنة بالأشكال الأحادية 11 ، مما يجعل متغيرات IgM مرشحة مناسبة لاستهداف الخلايا السرطانية النقيلية في الدورة الدموية والتي يمكن تخفيفها عن طريق تجميد المستضدات عن طريق التراص. على الرغم من أنه تم الإبلاغ سابقًا عن IgG4 لعرض تبادل الأسلحة Fab في الجسم الحي 16،26 ، لن يكون لمثل هذا التبادل تأثير في طرق التعبير أحادية النسيلة لدينا ، مما يحافظ على صحة توصيفاتنا الفيزيائية الحيوية.

تُظهر المقارنة بين معدلات الارتباط والتفكك لمتغيرات CH مع نظيراتها التجارية (الشكلان 2 و 3) الجدوى العامة لتبديل النمط النظوي CH لكل من Trastuzumab و Pertuzumab ، وربما لجميع الأجسام المضادة العلاجية. بالنظر إلى أن الوظائف المناعية لـ IgD المفرز تظل غامضة وأن ملامح إنتاج البروتين الضعيفة لمتغيرات Trastuzumab و Pertuzumab IgD ، قد تكون هناك حاجة لإعادة النظر في استخدام IgD المفرز كمتغير علاجي. حقيقة أن مستقبل IgD الفأري لا يرتبط بـ IgD 27 البشري بينما يمكن لمستقبل IgD البشري أن يربط كل من IgD البشري و IgA1 بتعديل O-glycans المماثل في منطقة المفصلة 28 ، مما يجعل من الصعب دراسة IgD باستخدام نماذج حيوانية. لإزالة العامل المربك للجليكوزيل ، أنتجنا جميع متغيرات CH الخاصة بنا في خطوط خلايا HEK البشرية على خلايا CHO أو COS الحيوانية.

ومن المثير للاهتمام أن تأثيرات Pertuzumab IgM عكست الاتجاه العام للربط الأضعف على Trastuzumab. في حين أن هذا حدث فقط لنموذج Pertuzumab ، وبالتالي نحن حذرون لتعميم هذا على جميع الأجسام المضادة ، فإن مثل هذه الملاحظات تدافع عن استخدام IgM كمتغير محتمل لـ CH عند العمل مع أجسام مضادة ملزمة أضعف. على الرغم من أن IgG كان الخيار السائد للأجسام المضادة العلاجية ، إلا أن IgM قد يكون أكثر ملاءمة من IgG عندما يمكنه زيادة قوة الارتباط الكلية وتأثير التراص الفائق عندما يتعلق الأمر بالمستضدات المنتشرة. ومع ذلك ، فإن استخدام IgM كدواء علاجي تضمن انتكاسة تاريخية 29 ، وعدم وجود نموذج حيواني مناسب يمثل عقبات رئيسية. في حين أن هناك مستقبلات متعددة لـ IgM مثل Fcα / μR و FcμR ، وأن Fcα / μR البشري يربط كل من IgM و IgA البشري والفأري ، يتم التعبير عنه على أنواع خلايا مختلفة مقارنة بالفئران. في الإنسان ، تعبر فقط الخلايا البائية الموجودة قبل الجراثيم (خلايا IgD + / CD38 +) عن المستقبلات ، بينما يتم التعبير عن نظيراتها من الفئران فقط في عدد الخلايا البائية المنتشرة والمقيمة 30. لم يتم بعد تحديد التفاعل المتقاطع لـ Fcα / μR مع IgM البشري و IgA ، مما يجعل هذا المستقبل غير مناسب لتحقيقات النموذج الحيواني. ومع ذلك ، فقد أظهر أحد المستقبلات المكتشفة مؤخرًا - FcμR (TOSO / FAIM3) 31،32 - الموجود في كل من البشر والفئران ، تفاعل IgM عبر الأنواع. ومع ذلك ، هناك أيضًا اختلافات في توطين المستقبلات. يتم التعبير عنه في كل من الطحال البشري والفأري والغدة الصعترية ، ولكن أيضًا على كريات الدم البيضاء في الدم المحيطي للإنسان ، ونخاع العظام والعقد الليمفاوية للفئران 31،32. التحقيقات ، خاصة لتجارب التوطين.

أظهرت متغيرات CH الأخرى ، IgA1 ، و IgA2 ، و IgE ثوابت توازن تفكك مماثلة ، وقراءات معدل الارتباط والتفكك للنوع الفرعي IgG1 عند تحميلها مسبقًا على مستشعرات البروتين L ، مما يجعلها مرشحة محتملة جيدة لسرطانات الغشاء المخاطي وعلم الحساسية (IgE). هناك تلميحات لتأثيرات الشغف عندما قارنا النتائج بمستضد محمّل مسبقًا (Her2) ، أظهرت متغيرات النمط المتماثل لـ Trastuzumab المزيد من تأثيرات الطموح حيث كان لمتغيرات IgM و IgD تقلبات أكبر في ثابت الارتباط ، ولكن ليس لمتغيرات النمط النظوي Pertuzumab. وبالمثل ، فإن التباين في معدلات التفكك بين متغيرات CH ، الذي كان أكثر وضوحًا في كلا نموذجي الجسم المضاد ، كان له اختلافات حيث أظهرت Trastuzumab و IgE و IgA2 و IgD اختلافًا في سجل واحد عند الارتباط بـ Her2 المحمّل مسبقًا ، بينما كانت الاختلافات في Pertuzumab في Kd كانت أكثر وضوحًا لـ IgM و IgA1 و IgA2.

بخلاف تضييقه إلى التأثيرات المرتبطة بالنمط المتماثل CDR ، لم نتمكن من تحديد سبب هذه الاختلافات في الشغف. ومع ذلك ، فإن التحميل المسبق لمتغيرات الجسم المضاد على البروتين L أظهر أن مناطق V لهذه المتغيرات النظيرية كانت وظيفية من أجل التعرف عليها بواسطة البروتين L وكذلك ربط Her2.

نظرًا لأن العديد من سرطانات Her2 + تحدث في مناطق الأقنية ، ولم تستبعد نتائجنا ملاءمة المتغيرات النظيرية IgE و IgA ، فإن توفر متغيرات Trastuzumab / Pertuzumab IgE و IgA قد يكون مثاليًا لمثل هذه المواقع. يمكن استخدام هذه المتغيرات جنبًا إلى جنب مع جرعة مخفضة من متغيرات IgM / IgG المستندة إلى الدم للتحقق من انتشار السرطان المنتشر ، وفي هذه العملية ، تقليل الآثار الجانبية القلبية المرتبطة بجرعات عالية من Trastuzumab IgG1 وحده. ومع ذلك ، فإن عدم وجود مستقبلات Ig للفأر الذي يستجيب لـ IgA 12 و IgE 15 البشري ربما يكون السبب الرئيسي وراء عدم شيوع الأجسام المضادة العلاجية لمثل هذه الأنماط المتماثلة حتى الآن ، وقد لا تتم الموافقة عليها للتجارب السريرية في المستقبل القريب.

على الرغم من أن نتائج متغيرات IgG متشابهة ، إلا أن الأنواع الفرعية المختلفة IgG البشرية (IgG2 و IgG4) أظهرت خصائص حماية مختلفة في الفئران ضد المكورات الجديدة Crytococcus neoformans 22 (خميرة مغلفة). نظرًا لأن جميع الأنواع الفرعية البشرية IgG يمكنها عبور المشيمة 33 ، فمن غير المرجح أن تكون العلاجات من هذا النمط النظيري مناسبة للاستخدام أثناء الحمل ، وبالتالي الدعوة إلى استخدام أنماط نظيرية أخرى لتقليل احتمالات التأثير على الجنين وبالتالي منع العلاجات المستهدفة أثناء الحمل.

كدليل على المفهوم في توطين مختلف ، أظهرت تجاربنا الأولية (غير معروضة) على الفئران العارية أن IgG بقي لفترة أطول في الدورة الدموية الجهازية مقارنة بالنماذج النظيرية الأخرى ، والتي تم تطهيرها في الكلى والكبد خلال الأيام القليلة الأولى. ومع ذلك ، فإن هذه النتيجة غير حاسمة لأن تجارب التوطين في الفئران محدودة للغاية نظرًا لأن مستقبلات Ig للفئران للأنماط النظيرية الأخرى لا تتفاعل مع متغيرات Ig البشرية.

ومع ذلك ، أظهرت مقارنة متغيرات CH المختلفة اتجاهًا لقياسات ربط أفضل بشكل عام عند استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية لالتقاط IgG Fc البشرية (الشكل 5) مقارنة بالمستشعرات الحيوية للبروتين L (الشكل 3). نظرًا لأن عملنا السابق على سلاسل Trastuzumab الخفيفة 19 أظهر أن أطر VL يمكن أن تؤثر على ارتباط البروتين L ، فقد سعينا إلى استبعاد التداخلات التي يسببها البروتين L إلى موقع ارتباط Her2 باستخدام AHC بدلاً من البروتين L عند التركيز على تحليل السلسلة الخفيفة (الشكل. 3).

لا يزال سبب وجود نظام Ig البشري 5 عائلات من Cλ ولكن واحدًا فقط هو سبب الغموض. على الرغم من أن الدراسات أظهرت أن سلاسل الضوء العائمة الحرة مرتبطة باستجابات الالتهاب والمناعة الذاتية 34 ، إلا أن دور السلسلة الخفيفة كان بعيد المنال إلى حد ما مع عدم وجود مستقبلات Igκ و Igλ محددة معروفة. تم العثور على سلاسل الضوء التي تؤثر على في الجسم الحي نصف عمر الأجسام المضادة (حيث كان لـ huIgG2λ عمر نصف أقصر من huIgG2κ في الفئران) ، وكذلك يلعب دورًا في تفكك المستضد 19. لهذا السبب ، قد تكون تأثيرات CL على عمر النصف للجسم المضاد وربط مولد الضد لا تعتمد فقط على CL-CH ، ولكن يجب أن تشمل المناطق الأخرى كسلاسل ثقيلة وخفيفة كاملة. يوضح هذا الحاجة إلى تحليل تفصيلي لكيفية تجتمع المناطق المتغيرة والثابتة للأجسام المضادة لكلا السلسلتين للتأثير على ارتباط مولد الضد وإنتاجه وكذلك فترات نصف العمر.

تتفق نتائج CL التي توصلنا إليها مع Montaño وآخرون. 35 (حيث لم ينتج عن CL تأثيرات كبيرة) ، لكنه اختلف عن Ponomarenko وآخرون. (وجد فريقه متغيرات CL لعرض ارتباطات مختلفة لحلقات الببتيد الحلقية والخطية). نظرًا لأن مستضدنا هو الجزء خارج الخلية المؤتلف من Her2 و Ponomarenko وآخرون. الاختلافات الملحوظة بناءً على تشكيل مولد الضد ، من الممكن أن تكون تأثيرات تباين CL تعتمد على التفاعل بين الجسم المضاد ومولد الضد 18 ولا يمكن تعميمها على جميع الأجسام المضادة. من المحتمل أن تكون صلابة وبنية الجسم المضاد متأثرة بالتعديل في السلسلة الخفيفة كما ألمح توجيري. وآخرون. 20 ، قد تكمن وراء آلية الاختلافات. ومع ذلك ، من الواضح أنه بالنسبة لربط Her2 خارج الخلية المؤتلف ، لم تظهر كل من متغيرات Trastuzumab و Pertuzumab CL تأثيرات مهمة في فحوصاتنا.

حاليًا ، لا تزال هناك عقبات كبيرة أمام متغيرات CH و CL للأجسام المضادة العلاجية التي سيتم تبنيها في الاستخدام السريري الفعلي نظرًا لأن التجارب قبل السريرية على الحيوانات في هذا المجال محدودة للغاية. بدون طرق مناسبة لتقييم كل من الفوائد المحتملة وعلم الأمراض المناعي للأنماط المتماثلة للأجسام المضادة / الأنواع الفرعية كعلاجات (مثل الحساسية المفرطة IgE ، واعتلال الكلية IgA ، وعامل IgM الروماتويدي ، ومتلازمة فرط IgD) ، فقد تمر عقود قبل تبني مبادلة النمط النظيري CH كجيل جديد من العلاجات بالأجسام المضادة.


  1. 1. Diamandis EP، Christopoulos TK (1991). نظام biotin- (strept) avidin: مبادئ وتطبيقات في التكنولوجيا الحيوية. كلين تشيم 37: 625-636. pmid: 2032315
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  2. 2. هوليجر بي ، هدسون بي جيه (2005). شظايا الأجسام المضادة المهندسة وظهور المجالات الفردية. Nat Biotechnol 23: 1126-1136. pmid: 16151406
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  3. 3. Hoogenboom HR (1997). تصميم وتحسين استراتيجيات اختيار المكتبة لتوليد أجسام مضادة عالية التقارب. اتجاهات التكنولوجيا الحيوية 15: 62-70. pmid: 9081300
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  4. 4. آدامز جي بي ، وينر إل إم (2005). العلاج بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة للسرطان. Nat Biotechnol 23: 1147-1157. pmid: 16151408
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  5. 5. وو آم ، سينتر بي دي (2005). تسليح الأجسام المضادة: احتمالات وتحديات للمقارنات المناعية. Nat Biotechnol 23: 1137-1146. pmid: 16151407
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  6. 6. Adams GP ، Schier R ، McCall AM ، Simmons HH ، Horak EM ، Alpaugh RK ، Marks JD ، Weiner LM (2001). يقيد التقارب العالي توطين واختراق الورم لجزيئات الجسم المضاد fv أحادية السلسلة. الدقة السرطان 61: 4750-4755. pmid: 11406547
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  7. 7. Yang L، Mao H، Wang YA، Cao Z، Peng X، Wang X، Duan H، Ni C، Yuan Q، Adams G (2009). سلسلة واحدة من الأجسام المضادة لمستقبلات عامل نمو البشرة مترافقة مع الجسيمات النانوية لاستهداف وتصوير الورم في الجسم الحي. صغير 5: 235 - 243. pmid: 19089838
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  8. 8. سميث جي بي (1985). فجوة الاندماج الخيطي: نواقل تعبيرية جديدة تعرض مستضدات مستنسخة على سطح الفيريون. علم 228: 1315-1317. pmid: 4001944
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  9. 9. McCafferty J ، Griffiths AD ، Winter G ، Chiswell DJ (1990). الأجسام المضادة للعاثية: الملتهمة الخيطية التي تعرض نطاقات متغيرة من الجسم المضاد. طبيعة سجية 348: 552-554. pmid: 2247164
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  10. 10. كلاكسون تي ، هووجنبوم إتش آر ، غريفيث أد ، وينتر جي (1991). صنع شظايا الأجسام المضادة باستخدام مكتبات عرض الملتهمة. طبيعة سجية 352: 624-628. pmid: 1907718
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  11. 11. Winter G ، Griffiths AD ، Hawkins RE ، Hoogenboom HR (1994). صنع الأجسام المضادة عن طريق تقنية عرض الملتهمة. Annu Rev Immunol 12: 433-455. pmid: 8011287
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  12. 12. Hoogenboom HR، Chames P (2000). مواقع الربط الطبيعية والمصممة بواسطة تقنية عرض الملتهمة. إمونول اليوم 21: 371 - 378. pmid: 10916139
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  13. 13. Bratkovič T (2010). التقدم في عرض الملتهمة: تطور التقنية وتطبيقاتها. علوم الحياة مول الخلية 67: 749-767. pmid: 20196239
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  14. 14. هوكينز ري ، راسل إس جيه ، وينتر جي (1992). اختيار الأجسام المضادة للعاثية عن طريق تقارب الارتباط: محاكاة نضوج الألفة. J مول بيول 226: 889-896. pmid: 1507232
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  15. 15. Daugherty PS ، Chen G ، Olsen MJ ، Iverson BL ، Georgiou G (1998). نضج تقارب الجسم المضاد باستخدام عرض السطح البكتيري. هندسة البروتين 11: 825 - 832. pmid: 9796833
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  16. 16. Luginbühl B، Kanyo Z، Jones RM، Fletterick RJ، Prusiner SB، Cohen FE، Williamson RA، Burton DR، Plückthun A (2006). تطور موجه لجزء scFv بروتين مضاد للبريون إلى تقارب قدره 1 pM وتفسيره الهيكلي. J مول بيول 363: 75-97. pmid: 16962610
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  17. 17. Lonberg N (2008) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة البشرية من الفئران المعدلة وراثيا. الأجسام المضادة العلاجية: Springer. ص 69-97.
  18. 18. Milstein C (1999). ثورة الورم الهجين: فرع من البحوث الأساسية. بيوسيس 21: 966-973. pmid: 10517870
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  19. 19. Lonberg N ، Huszar D (1995). الأجسام المضادة البشرية من الفئران المعدلة وراثيا. المراجعات الدولية لعلم المناعة 13: 65-93. pmid: 7494109
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  20. 20. Sergeeva A، He H، Ruisaard K، St John L، Alatrash G، Clise-Dwyer K، Li D، Patenia R، Hong R، Sukhumalchandra P، You M، Gagea M، Ma Q، Molldrem J (2016). نشاط 8F4 ، جسم مضاد يشبه مستقبلات الخلايا التائية PR1 / HLA-A2 ، ضد AML البشري الأولي في الجسم الحي. سرطان الدم 30: 1475-1484. pmid: 27055866
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  21. 21. كاواشيما واي ، كوريما ك ، بان ب ، جريفيث إيه جيه ، هولت جيه آر (2015). الجينات الشبيهة بقنوات الغشاء (TMC) مطلوبة من أجل التحسس الميكانيكي السمعي والدهليزي. المجلة الأوروبية لعلم وظائف الأعضاء 467: 85-94. pmid: 25074487
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  22. 22. Tiller KE، Tessier PM (2015). التطورات في تصميم الأجسام المضادة. Annu Rev Biomed Eng 17: 191-216. pmid: 26274600
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  23. 23. Corti D، Lanzavecchia A (2013). تحييد الأجسام المضادة للفيروسات على نطاق واسع. Annu Rev Immunol 31: 705-742. pmid: 23330954
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  24. 24. يوان Q-A ، Simmons HH ، Robinson MK ، Russeva M ، Marasco WA ، Adams GP (2006). تطوير أجسام مضادة مصممة خصيصًا لمستقبل النوع الثاني من مادة موليريان المثبطة: مرشح واعد للعلاج الموجه لسرطان المبيض. هناك سرطان مول 5: 2096-2105. pmid: 16928831
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  25. 25. Ohaegbulam KC، Assal A، Lazar-Molnar E، Yao Y، Zang X (2015). العلاج المناعي للسرطان البشري بأجسام مضادة لمسار PD-1 و PD-L1. اتجاهات مول ميد 21: 24-33. pmid: 25440090
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  26. 26. كورودا D ، Shirai H ، Jacobson MP ، Nakamura H (2012). تصميم الأجسام المضادة بمساعدة الكمبيوتر. بروتين Eng Des Sel 25: 507-521. pmid: 22661385
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  27. 27. Marshall SA، Lazar GA، Chirino AJ، Desjarlais JR (2003). تصميم وهندسة عقلانية للبروتينات العلاجية. اكتشاف المخدرات اليوم 8: 212 - 221. pmid: 12634013
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  28. 28. Caravella JA، Wang D، Glaser SM، Lugovskoy A (2010). تصميم الأجسام المضادة الموجه بالبنية. التصميم الحالي للأدوية بمساعدة الكمبيوتر 6: 128-138. pmid: 26845329
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  29. 29. Lippow SM، Wittrup KD، Tidor B (2007). التصميم الحسابي لتحسين تقارب الأجسام المضادة بعد نضوج الجسم الحي. Nat Biotechnol 25: 1171-1176. pmid: 17891135
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  30. 30. Barderas R، Desmet J، Timmerman P، Meloen R، Casal JI (2008). نضج تقارب الأجسام المضادة بمساعدة النمذجة السيليكو. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم 105: 9029–9034.
    • مشاهدة المقال
    • منحة جوجل
  31. 31. Karanicolas J ، Kuhlman B (2009). التصميم الحسابي للألفة والخصوصية في واجهات البروتين والبروتين. بيول هيكل العملة للعملات 19: 458-463. pmid: 19646858
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  32. 32. Chennamsetty N، Voynov V، Kayser V، Helk B، Trout BL (2009). تصميم بروتينات علاجية ذات ثبات معزز. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم 106: 11937–11942.
    • مشاهدة المقال
    • منحة جوجل
  33. 33. Miklos AE، Kluwe C، Der BS، Pai S، Sircar A، Hughes RA، Berrondo M، Xu J، Codrea V، Buckley PE (2012). تصميم قائم على الهيكل للأجسام المضادة فائقة الشحن والمقاومة للحرارة العالية. تشيم بيول 19: 449-455. pmid: 22520751
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  34. 34. Der BS، Kluwe C، Miklos AE، Jacak R، Lyskov S، Gray JJ، Georgiou G، Ellington AD، Kuhlman B (2013). بروتوكولات حسابية بديلة لشحن أسطح البروتين من أجل التفتح القابل للانعكاس والاحتفاظ بالاستقرار. بلوس واحد 8: e64363. pmid: 23741319
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  35. 35. Pulito VL، Roberts VA، Adair JR، Rothermel AL، Collins AM، Varga SS، Martocello C، Bodmer M، Jolliffe LK، Zivin RA (1996). أنسنة والنمذجة الجزيئية للجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد لـ CD4 ، OKT4A. مجلة علم المناعة 156: 2840-2850. pmid: 8609403
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  36. 36. Lazar GA، Desjarlais JR، Jacinto J، Karki S، Hammond PW (2007). نهج المناعة الجزيئية لإضفاء الطابع البشري على الأجسام المضادة والتحسين الوظيفي. مول إمونول 44: 1986-1998. pmid: 17079018
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  37. 37. Qiao C، Lv M، Li X، Geng J، Li Y، Zhang J، Lin Z، Feng J، Shen B (2013). نضوج تقارب الجسم المضاد MIL5 أحادي النسيلة antiHER2 باستخدام مكتبة ملتهمة اصطناعية خاصة بالحلمة بواسطة التصميم الحسابي. J Biomol Struct Dyn 31: 511-521. pmid: 23003339
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  38. 38. Jacobs TM ، Yumerefendi H ، Kuhlman B ، Leaver-Fay A (2014). SwiftLib: تحسين سريع لمكتبة الكودونات المنحلة من خلال البرمجة الديناميكية. الدقة الأحماض النووية 43: هـ 34. pmid: 25539925
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  39. 39. Ponsel D، Neugebauer J، Ladetzki-Baehs K، Tissot K (2011). تقارب عالٍ وقابلية للتطوير وحجم وظيفي: الكأس المقدسة لتوليد مكتبة الأجسام المضادة التوافقية. جزيئات 16: 3675 - 3700. pmid: 21540796
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  40. 40. Chaparro ‐ Riggers JF، Polizzi KM، Bommarius AS (2007). تصميم مكتبة أفضل: هندسة بروتينية تعتمد على البيانات. مجلة التكنولوجيا الحيوية 2: 180 - 191. pmid: 17183506
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  41. 41. Pantazes R، Maranas C (2010). OptCDR: طريقة حسابية عامة لتصميم مناطق تحديد تكامل الجسم المضاد للربط الحاتمي المستهدف. بروتين Eng Des Sel 23: 849-858. pmid: 20847101
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  42. 42. Li T، Pantazes RJ، Maranas CD (2014). OptMAVEn - إطار جديد لتصميم de novo لنماذج المنطقة المتغيرة للجسم المضاد التي تستهدف حلقات مستضد معينة. بلوس واحد 9: e105954. pmid: 25153121
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  43. 43. Dunbrack RL Jr.، Cohen FE (1997). تحليل إحصائي بايزي لتفضيلات الروتامر ذو السلسلة الجانبية للبروتين. علوم البروتين 6: 1661–1681. pmid: 9260279
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  44. 44. Pantazes RJ، Maranas CD (2013). MAPs: قاعدة بيانات لأجزاء الجسم المضاد المعيارية للتنبؤ بالبنى الثالثة وتصميم الأجسام المضادة الناضجة ذات الألفة. المعلوماتية الحيوية BMC 14: 168.ميد: 23718826
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  45. 45. Gray JJ، Moughon S، Wang C، Schueler-Furman O، Kuhlman B، Rohl CA، Baker D (2003). الالتحام بالبروتين والبروتين مع التحسين المتزامن للإزاحة الصلبة للجسم وتوافقات السلسلة الجانبية. J مول بيول 331: 281 - 299. pmid: 12875852
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  46. 46. ​​Poosarla VG، Li T، Goh BC، Schulten K، Wood TK، Maranas CD (2017). تصميم دي نوفو الحسابي للأجسام المضادة المرتبطة بالببتيد ذي التقارب العالي. Biotechnol Bioeng 6: 1331–1342.
    • مشاهدة المقال
    • منحة جوجل
  47. 47. Lapidoth GD، Baran D، Pszolla GM، Norn C، Alon A، Tyka MD، Fleishman SJ (2015). AbDesign: خوارزمية لتصميم العمود الفقري الاندماجي تسترشد بالمطابقات والتسلسلات الطبيعية. البروتينات 83: 1385-1406. pmid: 25670500
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  48. 48. Le Grand SM، Merz KM (1993). التقريب السريع لمساحة السطح الجزيئي باستخدام المنطق المنطقي وجداول البحث. J كمبوت تشيم 14: 349–352.
    • مشاهدة المقال
    • منحة جوجل
  49. 49. Chothia C، Lesk AM (1987). الهياكل الأساسية للمناطق شديدة التغير من الغلوبولين المناعي. J مول بيول 196: 901-917. pmid: 3681981
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  50. 50. اللاذقاني ب ، ليسك آم ، شوثيا سي (1997). المطابقات القياسية للهياكل الكنسية من الغلوبولين المناعي. J مول بيول 273: 927-948. pmid: 9367782
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  51. 51. Martin AC، Thornton JM (1996). العائلات البنيوية في حلقات البروتينات المتماثلة: التصنيف التلقائي والنمذجة والتطبيق على الأجسام المضادة. J مول بيول 263: 800-815. pmid: 8947577
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  52. 52. Morea V، Tramontano A، Rustici M، Chothia C، Lesk AM (1998). توافق المنطقة الثالثة شديدة التغير في مجال VH من الغلوبولين المناعي. J مول بيول 275: 269 - 294. pmid: 9466909
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  53. 53. North B، Lehmann A، Dunbrack RL Jr. (2011). مجموعة جديدة من مطابقة حلقة CDR للجسم المضاد. J مول بيول 406: 228-256. pmid: 21035459
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  54. 54. Adolf-Bryfogle J، Xu Q، North B، Lehmann A، Dunbrack RL Jr. (2015). PyIgClassify: قاعدة بيانات لتصنيفات هيكل CDR للأجسام المضادة. الدقة الأحماض النووية 43: D432–438. pmid: 25392411
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  55. 55. Lefranc MP، Giudicelli V، Ginestoux C، Jabado-Michaloud J، Folch G، Bellahcene F، Wu Y، Gemrot E، Brochet X، Lane J، Regnier L، Ehrenmann F، Lefranc G، Duroux P (2009). IMGT ، نظام معلومات ImMunoGeneTics الدولي. الدقة الأحماض النووية 37: D1006-1012. pmid: 18978023
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  56. 56. Das R، Baker D (2008). النمذجة الجزيئية مع رشيد. Annu Rev Biochem 77: 363-382. pmid: 18410248
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  57. 57. Mandell DJ، Coutsias EA، Kortemme T (2009). دقة Sub-angstrom في إعادة بناء حلقة البروتين بأخذ عينات مطابقة مستوحاة من الروبوتات. طرق نات 6: 551-552. pmid: 19644455
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  58. 58. Das R (2013). تنبؤ الدقة الذرية لهياكل حلقة البروتين من خلال ansatz مستوحى من RNA. بلوس واحد 8: e74830. pmid: 24204571
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  59. 59. Wang C، Bradley P، Baker D (2007). الالتحام بالبروتين والبروتين مع مرونة العمود الفقري. J مول بيول 373: 503-519. pmid: 17825317
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  60. 60. Tyka MD ، Keedy DA ، Andre I ، Dimaio F ، Song Y ، Richardson DC ، Richardson JS ، Baker D (2011). تم الكشف عن الحالات البديلة للبروتينات من خلال رسم خرائط تفصيلية لطبيعة الطاقة. J مول بيول 405: 607-618. pmid: 21073878
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  61. 61. Conway P، Tyka MD، DiMaio F، Konerding DE، Baker D (2014). استرخاء هندسة السندات الأساسية يحسن نمذجة الطاقة البروتينية للمناظر الطبيعية. علوم البروتين 23: 47-55. pmid: 24265211
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  62. 62. Nivon LG، Moretti R، Baker D (2013). طريقة تحسين باريتو الأمثل لسقالات تصميم البروتين. بلوس واحد 8: e59004. pmid: 23565140
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  63. 63. Smith CA، Kortemme T (2008). تلخص محاكاة العمود الفقري الشبيهة بالنسيج الخلفي التباين التوافقي للبروتين الطبيعي وتحسن تنبؤات السلسلة الجانبية الطافرة. J مول بيول 380: 742-756. pmid: 18547585
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  64. 64. Kuhlman B، Dantas G، Ireton GC، Varani G، Stoddard BL، Baker D (2003). تصميم طية بروتين كروية جديدة بدقة على المستوى الذري. علم 302: 1364-1368. pmid: 14631033
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  65. 65. Röthlisberger D، Khersonsky O، Wollacott AM، Jiang L، DeChancie J، Betker J، Gallaher JL، Althoff EA، Zanghellini A، Dym O (2008). محفزات كيمب للتخلص من خلال تصميم إنزيم حسابي. طبيعة سجية 453: 190–195. pmid: 18354394
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  66. 66. Jiang L، Althoff EA، Clemente FR، Doyle L، Röthlisberger D، Zanghellini A، Gallaher JL، Betker JL، Tanaka F، Barbas CF (2008). تصميم دي نوفو الحسابي لأنزيمات ريترو-ألدول. علم 319: 1387 - 1391. pmid: 18323453
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  67. 67. ريشتر إف ، ليفر فاي أ ، خير سد ، بيليك إس ، بيكر د (2011). تصميم إنزيم De novo باستخدام Rosetta3. بلوس واحد 6: e19230. pmid: 21603656
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  68. 68. Guntas G، Purbeck C، Kuhlman B (2010). هندسة واجهة بروتينية بروتينية باستخدام مكتبة مصممة حسابيًا. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 19296-19301. pmid: 20974935
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  69. 69. فليشمان إس جيه ، كورن جي إي ، ستراوتش إم ، وايتهيد تا ، كارانيكولاس جي ، بيكر د (2011). تصميم دي نوفو المتمركز في النقاط الساخنة لمواد رابطة البروتين. J مول بيول 413: 1047-1062. pmid: 21945116
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  70. 70. فليشمان إس جيه ، وايتهيد تا ، إيكيرت دي سي ، دريفوس سي ، كورن جي إي ، ستراش إم ، ويلسون آي إيه ، بيكر د (2011). التصميم الحسابي للبروتينات التي تستهدف المنطقة الجذعية المحفوظة من هيماجلوتينين الإنفلونزا. علم 332: 816-821. pmid: 21566186
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  71. 71. Canutescu AA، Dunbrack RL Jr. (2003). النسب الدوري المنسق: خوارزمية الروبوتات لإغلاق حلقة البروتين. علوم البروتين 12: 963-972. pmid: 12717019
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  72. 72. Raha K، Wollacott AM، Italia MJ، Desjarlais JR (2000). توقع تسلسل الأحماض الأمينية من الهيكل. علوم البروتين 9: 1106-1119. pmid: 10892804
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  73. 73. Leaver-Fay A، O'Meara MJ، Tyka M، Jacak R، Song Y، Kellogg EH، Thompson J، Davis IW، Pache RA، Lyskov S، Gray JJ، Kortemme T، Richardson JS، Havranek JJ، Snoeyink J ، بيكر د ، كولمان ب (2013). المعايير العلمية لتوجيه تحسين وظيفة الطاقة الجزيئية. طرق الانزيم 523: 109-143. pmid: 23422428
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  74. 74. Davies HTO، Crombie IK، Tavakoli M (1998). متى يمكن أن تكون نسب الأرجحية مضللة؟ بمج 316: 989-991. pmid: 9550961
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  75. 75. Ihaka R، Gentleman R (1996). R: لغة لتحليل البيانات والرسومات. إحصائيات رسومية شركات J 5: 299–314.
    • مشاهدة المقال
    • منحة جوجل
  76. 76. R Core Team (2015) R: A Language and Environment for Statistical Computing. فيينا ، النمسا: مؤسسة R للحوسبة الإحصائية.
  77. 77. Sircar A، Kim ET، Gray JJ (2009). RosettaA Antibody: خادم نمذجة تماثل المنطقة المتغيرة للجسم المضاد. الدقة الأحماض النووية 37: W474–479. pmid: 19458157
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  78. 78. Weitzner BD، Kuroda D، Marze N، ​​Xu J، Gray JJ (2014). أداء التنبؤ الأعمى لـ RosettaAntibody 3.0: التطعيم ، والاسترخاء ، ونمذجة الحلقة الحركية ، وتحسين CDR الكامل. البروتينات 82: 1611-1623. pmid: 24519881
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  79. 79. Weitzner BD، Jeliazkov JR، Lyskov S، Marze N، ​​Kuroda D، Frick R، Adolf-Bryfogle J، Biswas N، Dunbrack Jr RL، Gray JJ (2017). نمذجة وتحام هياكل الأجسام المضادة مع Rosetta. بروتوكولات الطبيعة 12: 401-416. pmid: 28125104
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  80. 80. نعيم A، Vila J، Scheraga HA (1991). دراسة مقارنة لمحاكاة ‐ التلدين ومونتي كارلو مع نهج التصغير إلى أدنى هياكل الطاقة من polypeptides: [Met] ‐enkephalin. J كومب كيم 12: 594–605.
    • مشاهدة المقال
    • منحة جوجل
  81. 81. Lewis SM، Kuhlman BA (2011). تصميم راسخ لواجهات البروتين البروتين. بلوس واحد 6: e20872. pmid: 21698112
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  82. 82. Liao HX، Lynch R، Zhou T، Gao F، Alam SM، Boyd SD، Fire AZ، Roskin KM، Schramm CA، Zhang Z، Zhu J، Shapiro L، Program NCS، Mullikin JC، Gnanakaran S، Hraber P، Wiehe K، Kelsoe G، Yang G، Xia SM، Montefiori DC، Parks R، Lloyd KE، Scearce RM، Soderberg KA، Cohen M، Kamanga G، Louder MK، Tran LM، Chen Y، Cai F، Chen S، Moquin S و Du X و Joyce MG و Srivatsan S و Zhang B و Zheng A و Shaw GM و Hahn BH و Kepler TB و Korber BT و Kwong PD و Mascola JR و Haynes BF (2013). التطور المشترك لجسم مضاد لفيروس HIV-1 معادل على نطاق واسع والفيروس المؤسس. طبيعة سجية 496: 469-476. pmid: 23552890
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  83. 83. بادافاتان إس ، شيرمر تي ، شميدت إم ، أكديس سي ، فالنتا آر ، ميترمان الأول ، سولداتوفا إل ، سلاتر جي ، مولر يو ، ماركوفيتش هوسلي زد (2007). تحديد حاتمة الخلية B للهيالورونيداز ، أحد مسببات الحساسية الرئيسية لسم النحل ، من تركيبتها البلورية المعقدة مع فاب معين. J مول بيول 368: 742-752. pmid: 17374540
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  84. 84. Lehmann A، Wixted JH، Shapovalov MV، Roder H، Dunbrack RL Jr.، Robinson MK (2015). هندسة الاستقرار للأجسام المضادة لـ EGFR scFv من خلال التصميم العقلاني لمبادلة lambda-to-kappa لإطار VL باستخدام نهج موجه بالهيكل. mAbs 7: 1058-1071. pmid: 26337947
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  85. 85. Adolf-Bryfogle J، Dunbrack Jr RL (2013). مجموعة أدوات PyRosetta: واجهة مستخدم رسومية لمجموعة برامج Rosetta. بلوس واحد 8: e66856. pmid: 23874400
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  86. 86. Kleffner R، Flatten J، Leaver-Fay A، Baker D، Siegel JB، Khatib F، Cooper S (2017). Foldit Standalone: ​​واجهة معالجة بنية بروتين مشتقة من لعبة فيديو باستخدام Rosetta. المعلوماتية الحيوية: btx283.
    • مشاهدة المقال
    • منحة جوجل
  87. 87. James LC، Roversi P، Tawfik DS (2003). تعدد أنواع الأجسام المضادة بوساطة التنوع التوافقي. علم 299: 1362 - 1367. pmid: 12610298
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  88. 88. Jha RK، Leaver-Fay A، Yin S، Wu Y، Butterfoss GL، Szyperski T، Dokholyan NV، Kuhlman B (2010). التصميم الحسابي لبروتين ربط PAK1. J مول بيول 400: 257-270. pmid: 20460129
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  89. 89. Sammond DW، Bosch DE، Butterfoss GL، Purbeck C، Machius M، Siderovski DP، Kuhlman B (2011). التصميم الحسابي لتسلسل وهيكل الببتيد المرتبط بالبروتين. شركة J Am Chem Soc 133: 4190-4192. pmid: 21388199
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  90. 90. Stranges PB، Kuhlman B (2013). تسلط المقارنة بين تصميمات واجهة البروتين الناجحة والفاشلة الضوء على تحديات تصميم روابط الهيدروجين المدفونة. علوم البروتين 22: 74-82. pmid: 23139141
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  91. 91. Clark LA ، Boriack ‐ Sjodin PA ، Eldredge J ، Fitch C ، Friedman B ، Hanf KJ ، Jarpe M ، Liparoto SF ، Li Y ، Lugovskoy A ، Miller S ، Rushe M ، Sherman W ، Simon K ، Van Vlijmen H ( 2006). تعزيز الألفة لجسم مضاد علاجي نضج في الجسم الحي باستخدام تصميم حسابي قائم على الهيكل. علوم البروتين 15: 949-960. pmid: 16597831
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  92. 92. Wei Q، Dunbrack Jr RL (2013). دور التدريب المتوازن ومجموعات بيانات الاختبار للمصنفات الثنائية في المعلوماتية الحيوية. بلوس واحد 8: e67863. pmid: 23874456
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  93. 93. ألفورد آر ، ليفر فاي أ ، جيليازكوف جي ، أوميرا إم ، ديمايو إف ، بارك إتش ، شابوفالوف إم ، رينفرو بي ، موليجان الخامس ، كابيل كيه ، لابونت جي دبليو ، باسيلا إم إس ، بونو آر ، برادلي بي ، دونبراك جونيور. RL، Das R، Baker D، Kuhlman B، Kortemme T، Gray JJ (2017). وظيفة طاقة Rosetta All-Atom للنمذجة الجزيئية والتصميم. مجلة النظرية والحساب الكيميائي 13: 3031-3048. pmid: 28430426
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  94. 94. Shapovalov MV، Dunbrack RL Jr. (2011). مكتبة rotamer مُنسَّقة تعتمد على العمود الفقري للبروتينات المشتقة من تقديرات كثافة النواة التكيفية وانحداراتها. بنية 19: 844-858. pmid: 21645855
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  95. 95. Weitzner BD، Dunbrack RL Jr.، Gray JJ (2015). أصل التنوع البنيوي CDR H3. بنية 23: 302 - 311. pmid: 25579815
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  96. 96. Weitzner BD، Gray JJ (2017). تنبؤ دقيق للهيكل لحلقات CDR H3 التي تم تمكينها بواسطة قيد C-Terminal القائم على الهيكل الجديد. ياء إمونول 198: 505-515. pmid: 27872211
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  97. 97. فليشمان إس جيه ، ليفر فاي أ ، كورن جي إي ، ستراوتش إم ، خير إس دي ، كوجا إن ، أشوورث جي ، ميرفي بي ، ريشتر إف ، ليمون جي ، ميلر جي ، بيكر د (2011). RosettaScripts: واجهة لغة برمجة لمجموعة نمذجة جزيئات Rosetta. بلوس واحد 6: e20161. pmid: 21731610
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  98. 98. Renfrew PD، Choi EJ، Bonneau R، Kuhlman B (2012). دمج الأحماض الأمينية غير الكنسية في Rosetta واستخدامها في تصميم واجهة البروتين-الببتيد الحسابي. بلوس واحد 7: e32637. pmid: 22431978
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  99. 99. Berkholz DS، Shapovalov MV، Dunbrack RL Jr.، Karplus PA (2009). اعتماد التشكل على هندسة العمود الفقري في البروتينات. بنية 17: 1316-1325. pmid: 19836332
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  100. 100. Henikoff S، Henikoff JG (1992). مصفوفات استبدال الأحماض الأمينية من كتل البروتين. بروك ناتل أكاد علوم الولايات المتحدة الأمريكية 89: 10915-10919. pmid: 1438297
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  101. 101. Davis IW، Arendall WB 3rd، Richardson DC، Richardson JS (2006). حركة الفرك الخلفي: كيف يتجاهل العمود الفقري للبروتين عندما ترقص السلسلة الجانبية. بنية 14: 265 - 274. pmid: 16472746
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  102. 102. Jacobs TM ، Williams B ، Williams T ، Xu X ، Eletsky A ، Federizon JF ، Szyperski T ، Kuhlman B (2016). تصميم بروتينات متميزة هيكليًا باستخدام استراتيجيات مستوحاة من التطور. علم 352: 687-690. pmid: 27151863
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  103. 103. تشودري إس ، ليسكوف إس ، جراي جي جي (2011). PyRosetta: واجهة قائمة على البرنامج النصي لتنفيذ خوارزميات النمذجة الجزيئية باستخدام Rosetta. المعلوماتية الحيوية 26: 689–691.
    • مشاهدة المقال
    • منحة جوجل
  104. 104. Kilambi KP، Pacella MS، Xu J، Labonte JW، Porter JR، Muthu P، Drew K، Kuroda D، Schueler-Furman O، Bonneau R، Gray JJ (2013). تمديد حوض روزيتا بالماء والسكر ودرجة الحموضة للتنبؤ بالتراكيب المعقدة والصلات لجولات كابري 20-27. البروتينات 81: 2201 - 2209. pmid: 24123494
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  105. 105. Marze NA ، Jeliazkov JR ، Roy Burman SS ، Boyken SE ، DiMaio F ، Gray JJ (2016). نمذجة البروتينات المستطيلة والواجهات المائية مع RosettaDock في جولات CAPRI 28-35. البروتينات 85: 479-486. pmid: 27667482
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  106. 106. Schueler ‐ Furman O، Wang C، Baker D (2005). التقدم في الالتحام بالبروتين والبروتين: تنبؤات الدقة الذرية في تجربة CAPRI باستخدام RosettaDock مع تحسين معالجة مرونة السلسلة الجانبية. البروتينات: بنية, وظيفة, والمعلوماتية الحيوية 60: 187–194.
    • مشاهدة المقال
    • منحة جوجل
  107. 107. Honegger A، Plückthun A (2001). نظام ترقيم آخر للنطاقات المتغيرة للجلوبيولين المناعي: أداة تحليل ونمذجة تلقائية. J مول بيول 309: 657-670. pmid: 11397087
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  108. 108. Gertsman BB (2013) أبقى علم الأوبئة بسيطًا: مقدمة في علم الأوبئة التقليدي والحديث (الإصدار الثالث). أكسفورد: جون وايلي وأولاده.
  109. 109. بادافاتان إس ، شيرمر تي ، شميدت إم ، أكديس سي ، فالنتا آر ، ميترمان الأول ، سولداتوفا إل ، سلاتر جي ، مولر يو ، ماركوفيتش هوسلي زد (2007). تحديد حاتمة الخلية B للهيالورونيداز ، أحد مسببات الحساسية الرئيسية لسم النحل ، من تركيبتها البلورية المعقدة مع فاب معين. J مول بيول 368: 742-752. pmid: 17374540
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل
  110. 110. Lawrence MC، Colman PM (1993). تكامل الشكل في واجهات البروتين / البروتين. J مول بيول 234: 946-950. pmid: 8263940
    • مشاهدة المقال
    • PubMed / NCBI
    • منحة جوجل

المناطق الخاضعة

لمزيد من المعلومات حول مجالات موضوعات PLOS ، انقر هنا.

نريد ملاحظاتك. هل تعتبر مجالات الموضوعات هذه منطقية لهذه المقالة؟ انقر فوق الهدف الموجود بجوار منطقة الموضوع غير الصحيحة وأخبرنا بذلك. شكرا لمساعدتك!

هي منطقة الموضوع "المستضدات" تنطبق على هذه المقالة؟ نعم / لا

هي منطقة الموضوع "الأجسام المضادة" تنطبق على هذه المقالة؟ نعم / لا

هي منطقة الموضوع "المقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم" تنطبق على هذه المقالة؟ نعم / لا

هي منطقة الموضوع "طريقة مونت كارلو" تنطبق على هذه المقالة؟ نعم / لا

هي منطقة الموضوع "عوامل الخطر الطبية" تنطبق على هذه المقالة؟ نعم / لا

هي منطقة الموضوع "قواعد بيانات" تنطبق على هذه المقالة؟ نعم / لا

هي منطقة الموضوع "برامج الكمبيوتر" تنطبق على هذه المقالة؟ نعم / لا

هي منطقة الموضوع "المحاكاة البيوكيميائية" تنطبق على هذه المقالة؟ نعم / لا


طرق STAR & # x02605

جدول الموارد الرئيسية

كاشف أو موردمصدرالمعرف
الأجسام المضادة
الماعز المضاد للإنسان IgG (H + L) الأجسام المضادة الثانوية ، HRPثيرمو فيشر العلميةالقط # 31410 RRID: AB_228269
الجسم المضاد IgG Fab (HRP) للفأرجين سكريبتكاتربلر # A01855-200
ماوس مضاد للإنسان CD20-PECy7BD PharMingenكات # 560735 RRID: AB_399985
APC Mouse CD19 مضاد للإنسانBD PharMingenكات # 555415
مكافحة CD27-PEBD BiosciencesCat # 555441 RRID: AB_395834
مكافحة hCD32BD PharMingenكات # 557333
مضاد HBs H004Wang et & # x000a0al.، 2020bغير متاح
CR3022ter Meulen et & # x000a0al.، 2006غير متاح
الجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد لـ NGu et & # x000a0al ، 2020غير متاح
السلالات البكتيرية والفيروسية
ه & # x000a0 كولي Trans5 & # x003b1 الخلايا المختصة كيميائياًTransGen Biotechكات # CD201-01
فيروس SARS-CoV-2 أصيل ، nCoV-SH01 (GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "MT121215.1" ، "term_id": "1819735426" ، "term_text ":" MT121215.1 ">> MT121215.1)Wu et & # x000a0al.، 2020bغير متاح
المواد الكيميائية والببتيدات والبروتينات المؤتلفة
ستربتافيدين HRPBD Biosciencesالقط # 554066
ستربتافيدين APCBD Biosciencesالقط # 554067 RRID: AB_10050396
ستربتافيدين بيالعلوم الإلكترونيةالقط # 12-4317-87
كتلة الإنسان BD FcBD PharMingenالقط # 564220
بروتين SARS-CoV-2 & # x000a0S (RBD)جين سكريبتكات # Z03479
بروتين SARS-CoV-2 S1جين سكريبتكات # Z03501
بروتين مؤتلف 2019-nCoV S2 (C-Fc)نوفوبروتينالقط # DRA48
بروتين سبايك SARS-CoV-2 (ECD ، علامة العلم الخاصة به & # x00026)جين سكريبتكات # Z03481
حشرة- سيه- NPجين سكريبتكات # Z03480
المؤتلف 2019 nCoV Spike S (الأحماض الأمينية 14-1212)Kactus BiosystemsCat # COV-VM5SS
المؤتلف 2019 nCoV Spike RBDKactus Biosystemsالقط # COV-VM4BD
مثبط RNAsin Plus RNaseبروميغاكات # N2615
4 & # x000a0 & # x000d7 dNTPS (100 & # x000a0mM)علوم الحياة Solarbioكات # PC2300
ماء خالٍ من DNase / RNaseعلوم الحياة Solarbioكات # R1600
PBS (10 & # x000a0 & # x000d7) ، الرقم الهيدروجيني 7.2-7.4علوم الحياة Solarbioكات # P1022
1 & # x000a0M Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 9.0علوم الحياة Solarbioكات # T1160
IGEPAL CA-630سيجماالقط # I8896
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجماالقط # 2650
مصل الزلال البقريWeiAo Biotech ، شنغهايالقط # WH3044
مصل بقري الجنينالجوزاءكات # 900-108
سكروز فائق النقاءماكلين البيوكيميائيةكات # S824459
ملح الصوديوم الأحمر كريسولماكلين البيوكيميائيةكات # C806031
ABTS Chromogen / محلول الركيزة لـ ELISAثيرمو فيشر العلميةالقط # 00-2024
UltraPure 0.5M EDTA، pH 8.0إنفيتروجينالقط # 15575-038
خليط الملح المتوازن Hank & # x02019s (D-Hanks)علوم الحياة Solarbioالقط # H1045-500
EZ TransLife iLAB Bio Technology ، شنغهايكاتربلر # AC04L082
كاشف TRIzol LSثيرمو فيشر العلميةكات # 10296010
المقايسات التجارية الحرجة
أعمدة مغناطيسية LSMiltenyi Biotechكات # 130-042-401
CD19 MicroBeads ، الإنسانMiltenyi Biotechكات # 130-097-055
بيوتين EZ-Link Sulfo-NHS-LC ، لا يوجد تنسيق للوزنثيرمو فيشر العلميةكات # 39257
بيرا بيوتين بروتين ليجاس كيتالطمعالقط # BIRA500
أعمدة تحلية Zeba Spin ، 7K MWCOثيرمو فيشر العلميةكات # 89889
النسخ العكسي العلوي الثالثثيرمو فيشر العلميةكات # 18080044
HotStarTaq DNA بوليميريزQIAGENكات # 203209
بروتين G Sepharose 4 سريع التدفقGE Healthcareالقط # 17061805
بيرس & # x02122 شطف عازلة IgGثيرمو فيشر العلميةكات # 21004
هيستوباك -10771سيجماكات # 10771
العمرنيو إنجلاند بيولابسكات # R3552L
BsiwI-HFنيو إنجلاند بيولابسكات # R3553L
XhoIنيو إنجلاند بيولابسكات # R0146L
SalI-HFنيو إنجلاند بيولابسكات # R3138S
بوليميريز T4 DNAنيو إنجلاند بيولابسكات # M0203L
خطوة واحدة مجموعة PrimeScript RT-PCRتاكاراكاتربلر # RR064B
نظام الفحص Luciferaseبروميغاالقط # E1501
النماذج التجريبية: خطوط الخلايا
خط خلية HEK293F(Wu et & # x000a0al.، 2020b غير متاح
خط خلية HEK293T(Xia et & # x000a0al.، 2020a غير متاح
نظام التعبير Expi293ثيرمو فيشر العلميةالقط # A14635
خط الخلية Huh-7(Xia et & # x000a0al.، 2020a غير متاح
خط خلية Vero-E6(Xia et & # x000a0al.، 2020a غير متاح
خط خلية راجي(Jaume et & # x000a0al.، 2011 غير متاح
قليل النوكليوتيدات
برايمر عشوائيةثيرمو فيشر العلميةكات # 48190011
الحمض النووي معاد التركيب
متجه التعبير IG & # x003b31von Boehmer et & # x000a0al. ، 2016غير متاح
متجه تعبير IG & # x003bavon Boehmer et & # x000a0al. ، 2016غير متاح
متجه التعبير IG & # x003bbvon Boehmer et & # x000a0al. ، 2016غير متاح
pNL4-3.luc.REXia et & # x000a0al.، 2020aغير متاح
pcDNA3.1-SARS-CoV-1-SXia et & # x000a0al.، 2020aغير متاح
pcDNA3.1-SARS-COV-2-SXia et & # x000a0al.، 2020aغير متاح
متجه تعبير IG & # x003b31-GRLRRobbiani et & # x000a0al.، 2019غير متاح
البرمجيات والخوارزميات
نشور زجاجيGraphPadhttps://www.graphpad.com
إيجبلاستYe et & # x000a0al.، 2013https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/
IMGT / V-QUESTBrochet et & # x000a0al.، 2008http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest
آحرون
نظام ترشيح بالفراغ معقم 50 & # x000a0ml يمكن التخلص منهميليبور سيجماكات # SCGP00525
مرشحات الطرد المركزي Amicon Ultra-4 Ultracel-30KMerck Millipore Ltd.القط # UFC803096
وحدات تصفية Ultrafree-MC بالطرد المركزي ، 0.22uM GV DURAPOREMerck Millipore Ltd.القط # UFC30GV0S
ماصة لايت متعددة الماصة L12-20XLS +راينالقط # 17013808
الأنابيب المبردة العامة للتخزين طويل الأمدنالجينالقط # 5000-1020
SimpliAmp جهاز التدوير الحراريثيرمو فيشر العلميةCat # <"type": "entrez-protein"، "attrs": <"text": "A24812"، "term_id": "80001"، "term_text": "pir || A24812" >> A24812
500 & # x000a0mL مرشح فراغ أعلى الزجاجة ، 0.20 & # x000a0 & # x003bcm المسامثيرمو فيشر العلميةكات # 566-0020
أنابيب ACCUSPIN معقمة ، سعة 50 ملسيجماالقط # A2055-10EA

توافر الموارد

يؤدي الاتصال

يجب توجيه مزيد من المعلومات والطلبات للحصول على الموارد والكواشف إلى مسؤول الاتصال الرئيسي ، Qiao Wang ([email protected]) وسيتم تلبيتها.

توافر المواد

جميع الكواشف الفريدة التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة متاحة من جهة الاتصال الرئيسية مع اتفاقية نقل المواد المكتملة. قد تتطلب مشاركة الأجسام المضادة مع الباحثين الأكاديميين دفعة لتغطية تكلفة التوليد واتفاقية نقل المواد المكتملة.

توافر البيانات والرمز

تتضمن المقالة المنشورة جميع مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها أو تحليلها أثناء هذه الدراسة. تم إيداع البيانات الأصلية بيانات Mendeley: https://data.mendeley.com/datasets/bjpky4bzsd/1.

النموذج التجريبي وتفاصيل الموضوع

بالكائن البشري

تم إجراء تجنيد المتطوعين وسحب الدم في مستشفى تشوشان بموجب بروتوكول وافقت عليه لجنة أخلاقيات البحث في مستشفى تشوشان (2020-003). أجريت التجارب المتعلقة بجميع العينات البشرية في كلية العلوم الطبية الأساسية بجامعة فودان بموجب بروتوكول معتمد من لجنة الأخلاقيات المؤسسية (2020-C007). المشاركون في الدراسة ، 16 متبرعًا نقاهًا ، تم تأكيد إصابتهم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، و 8 متبرعين ساذجين غير مصابين. تراوحت أعمار جميع المتبرعين من 7-67 بمتوسط ​​37 ، وكانت نسبة الإناث إلى الذكور 14:10 (الشكل & # x000a0S1B).

خطوط الخلية

تم الحفاظ على خلايا الكلى الجنينية البشرية 293T (HEK293T) وخلايا الورم الكبدي البشري Huh-7 وخلايا Vero-E6 الكلوية الخضراء الأفريقية (Xia et & # x000a0al. ، 2020a) في Dulbecco & # x02019s Modified Eagle Medium (DMEM) مع حرارة 10٪ - مصل بقري جنيني معطل (FBS) ، 100 & # x000a0U / ml بنسلين ، و 100 & # x000a0mg / ml ستربتومايسين. تم الحفاظ على خلايا راجي (Burkitt & # x02019s lymphoblast B lymphoblast) (Jaume et & # x000a0al. ، 2011) ، في RPMI 1640 مكملًا بنسبة 10 ٪ FBS و 100 & # x000a0U / ml بنسلين و 100 & # x000a0mg / ml ستربتومايسين. تمت زراعة جميع خطوط الخلايا عند 37 & # x000b0C في 5 ٪ CO2. تمت زراعة خلايا تعليق الكلية الجنينية البشرية 293F (HEK293F) باستخدام وسط HEK293 الخالي من المصل OPM-293-CD05 (OPM Biosciences) عند 37 & # x000b0C في 5٪ CO2 مع الاهتزاز عند 100 & # x000a0rpm.

الفيروسات

فيروس SARS-CoV-2 الأصلي ، nCoV-SH01 (GenBank: <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "MT121215.1" ، "term_id": "1819735426" ، term_text ":" MT121215.1 ">> MT121215.1) المستخدمة في هذه الدراسة تم عزلها من المرضى المصابين في مختبر مستوى السلامة الحيوية 3 (BSL-3) في كلية شنغهاي الطبية ، جامعة فودان (Wu et & # x000a0al.، 2020b ). تم نشر فيروس SARS-CoV-2 في خلايا Vero-E6. تم اقتطاع مخزون الفيروس المركز وتخزينه في النيتروجين السائل. تم إذابة جزء واحد من فيروس SARS-CoV-2 الأصلي الذي تم تمريره عبر خط الخلية ، والذي تم إطلاقه في الأصل من مصل المريض وتم تخزينه في & # x0221280 & # x000b0C ، من أجل في & # x000a0vitro تجارب عدوى الخلايا.

بكتيريا

ه & # x000a0coli تمت زراعة Trans5 & # x003b1 (TransGen Biotech) عند 37 & # x000b0C مع الاهتزاز عند 230 & # x000a0rpm.

تفاصيل الطريقة

جمع العينات البشرية

تم جمع عينات من الدم المحيطي من مرضى SARS-CoV-2 في مستشفى Zhoushan في مقاطعة Zhejiang. تم تعطيل حرارة عينات المصل لمدة 60 & # x000a0 دقيقة عند 56 & # x000b0C ، مفصولة بالطرد المركزي للدم الكامل المتخثر ، ومقسمة للتخزين عند & # x0221280 & # x000b0C. بعد سحب الدم 400 & # x000a0mL من المتبرع رقم 16 ، تم عزل الخلايا أحادية النواة في الدم البشري المحيطي (PBMCs) باستخدام أنبوب فصل الخلايا مع حاجز فريت. تم تعليق PBMCs المعزول في 90 ٪ من FBS المعطل بالحرارة مع 10 ٪ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وحفظه بالتبريد في النيتروجين السائل.

الأجسام المضادة

تم تحضير جميع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة البشرية المستنسخة ، ونسختها من GRLR ، والجسم المضاد أحادي النسيلة CR3022 الذي تم الإبلاغ عنه سابقًا (ter Meulen et & # x000a0al. ، 2006) بواسطة ترنسفكأيشن عابر لخلايا HEK293F للثدييات كما ورد سابقًا (Wu et & # x000a0al.، 2020b).

إليسا

ارتباط ELISA لعينات المصل أو أجزاء الجسم المضاد IgG المنقى من عينات المصل أو الأجسام المضادة IgG المؤتلفة ضد بروتينات SARS-CoV-2 ، بما في ذلك S-ECD- و RBD- و S1- و S2- و N- البروتينات (انظر التفاصيل في المفتاح جدول الموارد) كما ورد سابقًا (Wang et & # x000a0al.، 2020b). باختصار ، تم طلاء لوحات ELISA أولاً بـ 10 & # x000a0 & # x003bcg / ml من المستضد في محلول ملحي بالفوسفات (PBS) طوال الليل عند 4 & # x000b0C ، ثم تم حظرها باستخدام 2 ٪ من ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني. تم تخفيف المصل أو الجسم المضاد الأول بشكل متسلسل 1: 3 في PBS (التركيز الأقصى ، 1:10 للمصل ، 10 & # x000a0 & # x003bcg / ml للأحادية النسيلة) لثمانية تخفيفات في المجموع ، وإضافتها للحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة . كان التصور باستخدام جهاز IgG المترافق مع الماعز البشري (Thermo Fisher Scientific) أو الفأر المترافق HRP المضاد للإنسان IgG Fab (GenScript). تم حساب المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) لكل جسم مضاد عن طريق التحليل باستخدام برنامج PRISM لتقييم قدرة ربط مولد الضد. تم إجراء فحوصات ELISA باستخدام طفرات RBD كما هو موضح أعلاه باستثناء طلاء RBD-Fc بتركيز 2 & # x000a0 & # x003bcg / ml ، واستخدام RBD من النوع البري كمرجع للتطبيع.

مسابقة إليسا

تم إجراء ELISAs للمنافسة كما هو موضح سابقًا (Wang et & # x000a0al. ، 2020b). باختصار ، تم طلاء الألواح بـ 2 & # x000a0 & # x003bcg / ml SARS-CoV-2 RBD أو 2 & # x000a0 & # x003bcg / ml SARS-CoV-2 S-ECD واحتضانها بـ 15 & # x000a0 & # x003bcg / ml 1 st blocking antibody / البروتينات (60 & # x000a0 & # x003bcg / ml للجسم المضاد CR3022) لمدة ساعتين. تمت إضافة الأجسام المضادة / البروتينات ثنائية النواة 2 (0.25 & # x000a0 & # x003bcg / ml) (15 & # x000a0 & # x003bcg / ml للجسم المضاد CR3022) مباشرة لمدة 30 & # x000a0 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم إجراء الكشف باستخدام الستربتافيدين- HRP (BD Biosciences). تم استخدام محلول PBS المؤقت الذي تم استبداله بالجسم المضاد الأول كمرجع للتطبيع ، في حين أن الجسم المضاد لـ HBs H004 (Wang et & # x000a0al. ، 2020b) ، والذي لم يتمكن من منع ارتباط الأجسام المضادة الثانية ، كان بمثابة سلبي. مراقبة.

تحضير فيروس النمط الكاذب SARS-CoV-2 و SARS-CoV-1

تم إنتاج فيروسات النمط الكاذب كما تم الإبلاغ عنه سابقًا (Xia et & # x000a0al. ، 2020a). باختصار ، البلازميدات pNL4-3.luc.RE (مراسل luciferase الذي يعبر عن العمود الفقري HIV-1) و pcDNA3.1-SARS-CoV-1-S / pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S (ترميز لـ S - تم نقل بروتين SARS-CoV-1 أو SARS-CoV-2 إلى خلايا HEK293T باستخدام كاشف تعداء VigoFect (التكنولوجيا الحيوية القوية ، بكين). تم حصاد المادة الطافية التي تحتوي على جزيئات النمط الكاذب التي تم إطلاقها في 72 ساعة بعد تعداء العدوى. بعد الطرد المركزي ، تم جمع المادة الطافية وتقسيمها وتجميدها عند & # x0221280 & # x000b0C. تم إجراء إنتاج طفرات الفيروس الكاذب SARS-CoV-2 كما هو موضح أعلاه باستثناء استخدام بلازميدات pcDNA3.1-SARS-CoV-2 مع الطفرات المقابلة (V341I و F342L و V367F و R408I و A435S و G476S و V483A) في البروتين S (Ou et & # x000a0al. ، 2020). تم بناء هذه البلازميدات باستخدام بلازميد pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S كقالب بواسطة مجموعة طفرات موجهة للموقع (Yeasen Biotech ، شنغهاي).

في & # x000a0vitro مقايسة التعادل بواسطة النمط الكاذب لفيروسات SARS-CoV-1 و & # x022122

في & # x000a0vitro تم إجراء عدوى الفيروس الكاذب SARS-CoV-1 و SARS-CoV-2 كما هو موصوف سابقًا (Xia et & # x000a0al. ، 2020a). باختصار ، تم زرع خلايا 1 & # x000a0 & # x000d7 10 4 / well Huh-7 في 96 طبقًا جيدًا في DMEM مع 10 ٪ FBS. تمت زراعة الخلايا المصنفة لمدة ثماني ساعات إضافية قبل الإصابة. لتقدير سعة التعادل ، المصل البشري (أقصى تركيز ، 1:20) ، الأجسام المضادة متعددة النسيلة المنقى من مصل الإنسان (أقصى تركيز ، 50 & # x000a0 & # x003bcg / ml) ، أو الأجسام المضادة أحادية النسيلة (أقصى تركيز ، 10 أو 1 أو 0.625 & # x000a0 & # x003bcg / ml) تم تخفيفه بشكل متسلسل 1: 2 في وسط DMEM لتسعة تخفيفات في المجموع. بعد ذلك ، تم تحضين الأجسام المضادة المخففة أو عينات المصل باستخدام فيروس SARS-CoV-1 أو & # x022122 فيروسات كاذبة لمدة 30 & # x000a0 دقيقة عند 37 & # x000b0C قبل إضافتها إلى خلايا Huh-7 للعدوى. بالنسبة لتجارب منع المعادلة ، تم تحضين مستضدات مختلفة (بروتينات RBD أو S1 أو S2 أو S-ECD) بتركيزات مختلفة ، على التوالي ، مع 5 & # x000a0 & # x003bcg / ml من IgG المنقى من المتبرع # 16 لمدة ساعة واحدة عند 37 & # x000b0C من قبل حضانة الفيروس الكاذب SARS-CoV-2. بعد الحضانة لمدة نصف ساعة ، تمت إضافة الخليط أخيرًا إلى خلايا Huh-7 للعدوى. بعد الحضانة لمدة 12 ساعة ، تم استبدال المادة الطافية بوسط DMEM جديد مكمل بـ 2٪ FBS. تمت إزالة طاف الخلية بعد الثقافة لمدة 48 ساعة أخرى ، وتم تحليل الخلايا لقياس نشاط لوسيفيراز باستخدام مجموعة مقايسة Firefly Luciferase (Promega) ومقياس اللمعان وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة & # x02019s.

تم قياس قيم luciferase المطلقة وتم حساب القيم النسبية عن طريق التطبيع مع التحكم في الفيروس فقط بشكل جيد في نفس المسار. على سبيل المثال ، كانت قيمة luciferase المطلقة في بئر التحكم في الفيروسات الكاذبة فقط (تعتبر كمرجع) هي 5 & # x000a0 & # x000d7 10 4 ، بينما قد تؤدي إضافة عينة مصل معادلة إلى تقليل هذا إلى 1 & # x000a0 & # x000d7 10 4. لذلك ، تم حساب قيم لوسيفيراز الطبيعية بنسبة 100٪ في عنصر التحكم الفيروسي الكاذب فقط و 20٪ لهذا المصل المعادل. نظرًا لأن العديد من الجوانب ، مثل تركيز الفيروس الكاذب ، وتركيز الخلايا المستنبتة ، وحالة الخلايا ، وقراءة التألق المناعي ، وما إلى ذلك ، تختلف اختلافًا كبيرًا بين اللوحات المختلفة والاختبارات المختلفة ، فإن التطبيع ضروري لدمج البيانات للمقارنة. بالنسبة لمقايسات تحييد المصل (الشكلان 1 F و 1G) ، تم الإبلاغ عن المعاملة بالمثل لتخفيف المصل الذي أدى إلى تثبيط بنسبة 50٪ مقارنة بالفيروس الكاذب وحده باعتباره عيار التعادل بنسبة 50٪ (NT).50).

في & # x000a0vitro مقايسة المعادلة بواسطة فيروس SARS-CoV-2 الأصلي

في & # x000a0vitro تم إجراء اختبار تحييد SARS-CoV-2 الأصلي باستخدام Vero-E6 كما ورد سابقًا (Chi et & # x000a0al. ، 2020). باختصار ، تم زرع خلايا 1 & # x000a0 & # x000d7 10 4 / well Vero-E6 في 96 طبقًا جيدًا. بعد الثقافة لمدة 24 ساعة ، تم خلط الأجسام المضادة المخففة تسلسليًا بنسبة 1: 4 (التركيز الأقصى ، 5 & # x000a0 & # x003bcg / ml) مع 0.1 MOI (تعدد العدوى) فيروس SARS-CoV-2 الأصلي واحتضانها عند 37 & # x000b0C لمدة 30 & # x000a0 دقيقة. تمت إضافة هذا الخليط لاحقًا إلى خلايا Vero-E6 المستنبتة. تم جمع المواد الطافية بعد مزيد من الثقافة لمدة يومين من أجل النسخ العكسي الكمي PCR وتم تحليل الخلايا عن طريق التألق المناعي.

من أجل التألق المناعي ، تم إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد بنسبة 4 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 20 & # x000a0 دقيقة ، وغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ونفاذية مع 0.1 ٪ Triton X-100 في PBS في درجة حرارة الغرفة. بعد حجب 3 ٪ من مساحة سطح الجسم ، تم تحضين الخلايا بجسم مضاد متعدد الأضداد مضاد لـ N (Gu et & # x000a0al. ، 2020) بتخفيف 1: 1000 طوال الليل عند 4 & # x000b0C وتصور باستخدام حمار مضاد للفأر IgG Alexa Fluor 488 ( ثيرمو فيشر العلمية). كانت النوى ملطخة بـ DAPI. تم تصوير الخلايا باستخدام مجهر مضان مقلوب Eclipse Ti-S (نيكون).

من أجل النسخ العكسي الكمي PCR ، تم استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من المادة الطافية التي تم جمعها باستخدام Trizol LS (Thermo Fisher Scientific) واستخدامها كقوالب لتحليل PCR الكمي بواسطة One-Step PrimeScrip RT-PCR Kit (Takara) باتباع تعليمات الشركة المصنعة & # x02019s. تم سرد الاشعال والمسبار المستخدمة في الجدول S2. تم إدخال أمبليكون PCR بواسطة SARS-CoV-2-N-F و SARS-CoV-2-N-R في بلازميد pUC57 لتوليد المنحنى القياسي. تم تنفيذ برنامج النسخ العكسي الكمي PCR باستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي Mastercycler ep realplex (Eppendorf) على النحو التالي: 95 & # x000b0C 5 & # x000a0minutes 40 دورة من 95 & # x000b0C 10 s، 50 & # x000b0C 30 s، 72 & # x000b0C 30 ثانية.

في & # x000a0vitro الفحص لاكتشاف الدخول الفيروسي المعتمد على الجسم المضاد

في & # x000a0vitro تم إجراء فحوصات فيروس SARS-CoV-2 الكاذبة ADE باستخدام خلايا Raji كما تم الإبلاغ عنه سابقًا (Jaume et & # x000a0al. ، 2011). باختصار ، تم زرع 3 & # x000a0 & # x000d7 10 4 خلايا راجي في كل بئر من 96 طبقًا جيدًا مغلفة بـ 0.01 ٪ بولي- L- ليسين في PBS وتم تربيتها لمدة 24 ساعة. تم تخفيف الأجسام المضادة بشكل متسلسل بنسبة 1: 2 (أقصى تركيز ، 100 & # x000a0 & # x003bcg / ml) في RPMI 1640 لتسع تخفيفات إجمالاً ، وتم حضنها بالفيروس الكاذب SARS-CoV-2 لمدة 30 & # x000a0 دقيقة. تم وضع الخليط على خلايا الراجي وزرعها لمدة 60 ساعة. تم إجراء قياس نشاط luciferase كما هو موضح أعلاه باستخدام Firefly Luciferase Assay Kit (Promega). تم تطبيع قيم نشاط luciferase المطلقة من جميع الآبار إلى قيمة نشاط luciferase التي تم الحصول عليها باستخدام 2 & # x000a0 & # x003bcg / ml من الجسم المضاد XG043 ويتم التعبير عنها كتغير في الطية في نشاط luciferase. تم إجراء نسختين مكررتين من XG043 (2 & # x000a0 & # x003bcg / ml) على كل لوحة وتم اعتبار متوسط ​​قيمة نشاط luciferase لهاتين التكرارات بمثابة مرجع (نشاط luciferase النسبي بنسبة 100 ٪ ، والخطوط المنقطة في الأشكال 6 أ ، 6 د ، و 6E الشكل & # x000a0S6B). نظرًا لأن العديد من العوامل (تركيز الفيروس ، وتركيز الخلية ، وقراءة التألق المناعي ، وما إلى ذلك) تختلف بين لوحات مختلفة أو جولات مختلفة من التجارب ، فإن التطبيع ضروري لمقارنة قيم نشاط لوسيفيراز من لوحات مختلفة. سبب اختيار XG043 كمرجع هو ببساطة أن XG043 كان أول ما تم تحديده للحث على ADE في دراساتنا.

لتجربة منع الدخول الفيروسي المعتمد على الجسم المضاد ، تم تحضين تركيزات مختلفة من مضاد hCD32 (BD PharMingen) بخلايا راجي لمدة 30 & # x000a0 دقيقة عند 37 & # x000b0 درجة مئوية. بعد ذلك ، تمت إضافة خليط من 2 & # x000a0 & # x003bcg / ml جسم مضاد XG005 و SARS-CoV-2 pseudovirus إلى خلايا Raji المعالجة. تم تحضين الصفائح عند 37 & # x000b0C لمدة 60 ساعة قبل قياس أنشطة luciferase كما هو موضح أعلاه.

ل في & # x000a0vitro فحوصات ADE المعتمدة على خلايا الراجي باستخدام فيروس SARS-CoV-2 الأصلي ، تم تحضين خلايا الراجي المزروعة بمزيج من فيروس SARS-CoV-2 الأصلي والأجسام المضادة أحادية النسيلة (التركيز النهائي 4 & # x000a0 & # x003bcg / ml) و XG038 و XG016 و XG005 ، على التوالي. بعد 6 أو 24 أو 48 ساعة من الحضانة ، تم جمع خلايا الراجي لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحليل النسخ العكسي الكمي PCR. تم حساب أرقام نسخ SARS-CoV-2 N-protein RNA باستخدام منحنى قياسي يتكون من سبع عينات من الحمض النووي من بروتين N مع تخفيفات متسلسلة 10 أضعاف.

إنتاج البروتين

تم تصنيع الكودون المحسن من النوع البري (كدنا) لمجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2 (RBD) (الأحماض الأمينية 330 & # x02013530) جنبًا إلى جنب مع علامة Avi (GLNDIFEAQKIEWHE) (GENEWIZ) ، وتم استنساخه في ناقل pACgp67 باستخدام C- المحطة 8 & # x000a0 & # x000d7 علامته للتنقية. تم التعبير عن SARS-CoV-2 RBD باستخدام نظام Bac-to-Bac baculovirus. تم بعد ذلك نقل DNA bacmid المستخرج إلى خلايا Sf9 باستخدام كاشف Cellfectin II (Invitrogen). تم حصاد الفيروسات ذات العيار المنخفض ثم تضخيمها لتوليد مخزون من الفيروسات عالي العيار. تم حصاد المادة الطافية المحتوية على RBD المفرز بدون ارتباط بالجليكوزيل بعد 72 ساعة من الإصابة وتم التقاط بروتين RBD بواسطة راتنج Ni-NTA (GE Healthcare) وتنقيته. كشف تحليل SDS-PAGE نقاء أكثر من 95٪ من البروتين المؤتلف المنقى.

من أجل الطفرات الموجهة بالموقع والتعبير عن طفرات RBD ، تم تصنيع جزء SARS-CoV-2 RBD (بقايا 319-541) وطفراته (GenScript) ، ودمجها مع جزء IgG1 Fc البشري ، واستنساخها في ناقل تعبير الثدييات pSecTag. تم نقل البلازميد إلى خلايا HEK Expi293 واحتضانها عند 37 & # x000b0C لمدة أربعة أيام. تم حصاد المادة الطافية لمزيد من التنقية بواسطة راتنج البروتين G وفقًا للشركة المصنعة وبروتوكول # x02019s.

فرز خلية واحدة لخلايا الذاكرة B المرتبطة بـ RBD- أو S-ECD

تم التعبير عن بروتين S-ECD (GenScript) وتنقيته من خلايا Sf9 المصابة بفيروس باكولوفيروس كيميائيًا باستخدام مجموعة EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo Fisher Scientific) كشركة مصنعة وتعليمات # x02019s. تم عزل RBD المعبر عنه في خلايا Sf9 المصابة بفيروس baculovirus وخلايا S-ECD الموسومة بعلامات Avi المعبر عنها في خلايا HEK293T للثدييات (Kactus Biosystems) باستخدام مجموعة BirA Biotin-Protein Ligase (Avidity). تمت إزالة الفائض من البيوتين غير المرتبط باستخدام عمود Zeba Spin Desalting (Thermo Fisher Scientific). لكل عينة ، تم تحضير بروتين الطعم- PE وبروتين الطعم- APC عن طريق احتضان 3 & # x000a0 & # x003bcg من RBD أو 25 & # x000a0 & # x003bcg من بروتينات S-ECD المخصب بيوتينيل مع streptavidin-PE (eBioscience)-streptavidin BD Biosciences) ، على التوالي.

تم إجراء تنقية الخلايا B ، ووضع العلامات ثنائية الصبغة الفلورية للخلايا B المرتبطة ببروتين الطعم وتجارب فرز الخلية المفردة كما هو موضح سابقًا (Escolano et & # x000a0al. ، 2019 Robbiani et & # x000a0al. ، 2017 Wang et & # x000a0al. ، 2020b ). باختصار ، تم إذابة PBMCs وغسلها باستخدام وسط RPMI مع CD19 MicroBeads (Miltenyi Biotec) من أجل الاختيار الإيجابي للخلايا الليمفاوية B.حضانة متسلسلة عند 4 & # x000b0C مع كتلة Fc بشرية (BD Biosciences) ، بروتين طعم- PE / APC (10 & # x000a0 & # x003bcg / ml لـ RBD ، 60 & # x000a0 & # x003bcg / ml لـ S-ECD) ، ومكافحة CD20- تم إجراء PECy7 (BD Biosciences) ، متبوعًا بفرز خلية واحدة من CD20-PECy7 + بروتين الطعم- PE + بروتين الطعم- APC + خلايا الذاكرة B في 96 طبقًا جيدًا باستخدام FACSAria II (BD Biosciences). تم تخزين الخلايا B المفردة الخلية في & # x0221280 & # x000b0C.

استنساخ الأجسام المضادة والتسلسل والإنتاج

تم إجراء استنساخ الأجسام المضادة من الخلايا المفردة المصنفة وإنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة كما ورد سابقًا (Robbiani et & # x000a0al.، 2017 Wang et & # x000a0al.، 2020b). تم سرد تسلسل الاشعال للجولة 1 st / 2 الثانية من PCR المتداخلة في الجدول S2. تم تحميل منتجات PCR المضخمة من كل خلية مفردة على هلام الاغاروز بنسبة 2 ٪ من أجل الرحلان الكهربائي وتنقيتها لتسلسل Sanger. تم تحليل جميع نتائج التسلسل للسلاسل الخفيفة الثقيلة و kappa / lambda بواسطة IMGT / V-QUEST (Brochet et & # x000a0al. ، 2008) و IgBlast (Ye et & # x000a0al. ، 2013) ، وقطاع الجين V (D) J وتم تحديد متواليات CDR3 لكل جسم مضاد. تعرضت الأجسام المضادة المختارة لبناء ناقلات وتعبير عن الجسم المضاد كما هو موصوف سابقًا (von Boehmer et & # x000a0al. ، 2016).

التحليل العنقودي

تم استخدام أنشطة luciferase النسبية المقاسة في تحييد أو مقايسات ADE أو كليهما لتحليل المجموعات الهرمية غير الخاضعة للإشراف مع لغة البرمجة الإحصائية ر، باستخدام البيانات المحولة بالسجل ، ومعاملات الارتباط الإقليدية لمقياس المسافة ، وتجميع Ward.D2. تم إنشاء خريطة حرارية وشجرة مخطط عنقودي باستخدام حزم R Pretty Heatmaps (خريطة الموقع و hclust).

الكمي والتحليل الإحصائي

النتائج التفصيلية للتحليل الإحصائي موضحة في النتيجة والشكل & # x000a0 Legends. تم استخدام اختبار Shapiro-Wilk واختبار Fisher & # x02019s F للتحقق من الحالة الطبيعية وتجانس الفروق ، على التوالي ، قبل إجراء المقارنة. تم إجراء اختبار Student & # x02019s t لـ RBD ELISA (الشكل & # x000a01 A) ، بينما تم استخدام اختبار مجموع تصنيف Wilcoxon لـ ELISAs الأخرى (الأشكال 1 B & # x020131E) ومقارنات ADE AUC (الشكل & # x000a07 E) بسبب عدم التوزيع الطبيعي. من أجل تحديد ما إذا كان هناك فرق ذو دلالة إحصائية بين ADE AUC و IC50 قيم الأجسام المضادة Cluster-X و -Y و -Z ، تم إجراء الاختبار اللامعلمي (مقارنة دن & # x02019s Kruskal-Wallis) (الشكلان 7 ب و 7 ج). تم إجراء اختبار Fisher & # x02019s الدقيق لتقييم الأهمية الإحصائية بناءً على التوزيع الدقيق لترددات الأجسام المضادة RBD Group-IV في ثلاث مجموعات من الأجسام المضادة (الشكل & # x000a07 D). تم تقييم الارتباط بواسطة طريقة ارتباط رتبة Spearman & # x02019s (الأشكال S6E & # x02013S6G). المنطقة الواقعة تحت منحنيات ELISA (ELISA AUC) (الأشكال 1 A & # x020131E و & # x200B and3A & # x020133D) ، 3 A & # x020133D) ، عيار تحييد نصف الحد الأقصى (NT50) بالنسبة لفحوصات تحييد المصل (الأشكال 1 F & # x020131H) ، فإن التركيز المثبط بنسبة 50٪ (IC50) القيم المحسوبة لقدرات تحييد الجسم المضاد (الأشكال 4 أ ، 4 ف ، & # x200 ب و 5 ج) ، 5 ج) ، المنطقة الواقعة تحت منحنى ADE (ADE AUC) (الشكل & # x000a06 C) ، وتعزيز قيم الطاقة (الشكل & # x000a0S6D ) في برنامج PRISM كما ورد سابقًا (Bardina et & # x000a0al.، 2017 Robbiani et & # x000a0al.، 2019 Wang et & # x000a0al.، 2020b).


شاهد الفيديو: Covid 19 hoe lang nog? (كانون الثاني 2022).