معلومة

9: التحقيق في الحمض النووي - علم الأحياء


9: فحص الحمض النووي

يُظهر اكتشاف جديد أن الخلايا البشرية يمكنها كتابة تسلسل الحمض النووي الريبي في الحمض النووي

تحتوي الخلايا على آلات تقوم بتكرار الحمض النووي في مجموعة جديدة تدخل في خلية مشكلة حديثًا. هذه الفئة نفسها من الآلات ، التي تسمى بوليميراز ، تبني أيضًا رسائل RNA ، والتي تشبه الملاحظات المنسوخة من مستودع الحمض النووي المركزي للوصفات ، بحيث يمكن قراءتها بشكل أكثر كفاءة في البروتينات. لكن كان يُعتقد أن البوليميرات تعمل فقط في اتجاه واحد من الحمض النووي إلى الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. هذا يمنع إعادة كتابة رسائل RNA في كتاب الوصفات الرئيسي للحمض النووي الجيني. الآن ، يقدم باحثو جامعة توماس جيفرسون الدليل الأول على أنه يمكن إعادة كتابة مقاطع الحمض النووي الريبي في الحمض النووي ، مما قد يتحدى العقيدة المركزية في علم الأحياء ويمكن أن يكون له آثار واسعة تؤثر على العديد من مجالات علم الأحياء.

يقول ريتشارد بوميرانتز ، دكتوراه ، أستاذ مشارك في الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية في جامعة توماس جيفرسون. "حقيقة أن البوليميراز البشري يمكنه القيام بذلك بكفاءة عالية ، يثير العديد من الأسئلة." على سبيل المثال ، تشير هذه النتيجة إلى أنه يمكن استخدام رسائل RNA كقوالب لإصلاح أو إعادة كتابة الحمض النووي الجيني.

نُشر العمل في 11 حزيران / يونيو في المجلة تقدم العلم.

بالتعاون مع المؤلف الأول جوروشانكار تشاندرامولي Gurushankar Chandramouly وغيره من المتعاونين ، بدأ فريق الدكتور بوميرانتز بفحص بوليميراز غير عادي للغاية ، يسمى بوليميراز ثيتا. من بين 14 بوليميراز DNA في خلايا الثدييات ، يقوم ثلاثة فقط بالجزء الأكبر من عمل تكرار الجينوم بأكمله للتحضير لانقسام الخلايا. أما الـ 11 المتبقية فهم يشاركون في الغالب في الكشف وإجراء الإصلاحات عندما يكون هناك انقطاع أو خطأ في خيوط الحمض النووي. تقوم بوليميراز ثيتا بإصلاح الحمض النووي ، لكنها عرضة للخطأ وتسبب العديد من الأخطاء أو الطفرات. لذلك لاحظ الباحثون أن بعض الصفات "السيئة" لبوليميراز ثيتا كانت تلك التي تشترك فيها مع آلة خلوية أخرى ، وإن كانت أكثر شيوعًا في الفيروسات - النسخ العكسي. مثل Pol theta ، يعمل المنتسخ العكسي لفيروس نقص المناعة البشرية كبوليميراز DNA ، ولكن يمكنه أيضًا ربط RNA وقراءة الحمض النووي الريبي مرة أخرى في حبلا DNA.

في سلسلة من التجارب الأنيقة ، اختبر الباحثون بوليميراز ثيتا ضد النسخ العكسي من فيروس نقص المناعة البشرية ، وهو واحد من أفضل الدراسات من نوعه. أظهروا أن بوليميراز ثيتا كان قادرًا على تحويل رسائل الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي ، وهو ما فعلته بالإضافة إلى النسخ العكسي لفيروس نقص المناعة البشرية ، وأنه في الواقع قام بعمل أفضل من نسخ الحمض النووي إلى الحمض النووي. كان Polymerase theta أكثر كفاءة وأدخل أخطاءً أقل عند استخدام قالب RNA لكتابة رسائل DNA جديدة ، مقارنةً بتكرار الحمض النووي في DNA ، مما يشير إلى أن هذه الوظيفة يمكن أن تكون هدفها الأساسي في الخلية.

تعاونت المجموعة مع مختبر الدكتور Xiaojiang S. Chen في جامعة جنوب كاليفورنيا واستخدمت علم البلورات بالأشعة السينية لتحديد البنية ووجدت أن هذا الجزيء كان قادرًا على تغيير شكله من أجل استيعاب جزيء RNA الأكثر ضخامة - وهو إنجاز فريد بين البوليميراز.

يقول الدكتور بوميرانتز: "يشير بحثنا إلى أن الوظيفة الرئيسية لبوليميراز ثيتا هي العمل كنسخة عكسية". "في الخلايا السليمة ، قد يكون الغرض من هذا الجزيء هو إصلاح الحمض النووي بوساطة RNA. في الخلايا غير الصحية ، مثل الخلايا السرطانية ، يتم التعبير عن بوليميريز ثيتا بشكل كبير ويعزز نمو الخلايا السرطانية ومقاومة الأدوية. سيكون من المثير أن نفهم كيف يساهم نشاط بوليميراز ثيتا على الحمض النووي الريبي في إصلاح الحمض النووي وتكاثر الخلايا السرطانية ".


مقدمة

أدى مجال الحويصلات خارج الخلية سريع الظهور (EVs) إلى تحولات نموذجية في العديد من المجالات المختلفة في علم الأحياء والطب الحيوي. لقد ثبت أن إطلاق المركبات الكهربائية ، الذي كان يعتقد في الأصل أنه يعمل فقط على إزالة المواد الضارة من الخلايا ، له العديد من النتائج الوظيفية ومجموعة واسعة من الآثار المترتبة على الطب الحيوي. لفهم بنية ووظيفة المركبات الكهربائية ، تطورت المناهج الكيميائية الحيوية الأولية المستهدفة بسرعة إلى تحليلات واسعة النطاق خالية من التحيز باستخدام بيولوجيا الأنظمة والمعلوماتية الحيوية. في عام 2009 ، تم إطلاق أول قاعدة بيانات منسقة يدويًا لبروتينات EV و RNA والدهون ، ExoCarta 1 (http://www.exocarta.org/). تبعتها قاعدتا بيانات إضافيتان بما في ذلك Vesiclepedia 2،3 (http://www.microvesicles.org/) و EVpedia 4،5 (http://student4.postech.ac.kr/evpedia2_xe/xe/). هذه هي مستودعات مجموعات بيانات الحمض النووي الريبي والبروتين والدهون والمستقلبات. نظرًا لأن معلمات ما قبل التحليل قد تلعب أدوارًا مهمة في جودة الاستعدادات للمركبات الكهربائية ، يجب تفسير إدخالات قاعدة البيانات بحذر ، ويجب إيلاء اهتمام خاص لظروف ما قبل التحليل. في الآونة الأخيرة ، تم توسيع علم الوجود الجيني ليشمل سياق اتصالات المركبات الكهربائية ، نظرًا لزيادة الاعتراف بأهمية مجال EV 6. علاوة على ذلك ، أصبحت أدوات المعلومات الحيوية التي يمكن استخدامها لتحليل مجموعات بيانات EV متوفرة 7،8. قد تتضمن التوجيهات المستقبلية ما يلي: (1) تحليلات بيولوجيا الأنظمة بعد تحليلات مسبقة أكثر معيارية للمركبات الكهربائية ، (2) تحليلات متعددة الوسائط لعينات المركبات الكهربائية (مجموعات من مجموعات ذرات مختلفة تستخدم للتحليل) ، و (3) تحديد مرض معين الأنماط / الشبكات الجزيئية للمركبات الكهربائية المكونة من أنواع جزيئات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تمتد مناهج بيولوجيا الأنظمة لتشمل مجالات جديدة مثل بيولوجيا الأنظمة القائمة على الصور.

ستساعد التطورات في تحليل الأنظمة البيولوجية المعقدة مثل المركبات الكهربائية في الكشف عن الأهمية البيولوجية لهذه الهياكل المكتشفة حديثًا واستغلال إمكاناتها التشخيصية و / أو العلاجية.


نتائج ومناقشة

نظرة عامة على RnBeads والميزات الجديدة

تتضمن RnBeads وحدات لاستيراد البيانات ، ومراقبة الجودة ، والتصفية والتطبيع ("المعالجة المسبقة") ، وتصدير البيانات المعالجة ("المسارات والجداول") ، والاستدلال المتغير (على سبيل المثال ، التنبؤ بالعمر اللاجيني وعدم تجانس نوع الخلية من بيانات مثيلة الحمض النووي) ، الاستكشافية التحليل (على سبيل المثال ، تقليل الأبعاد ، والتوزيع العالمي لمستويات مثيلة الحمض النووي ، والتكتل الهرمي) ، وتحليل مثيلة الحمض النووي التفاضلي (الشكل 1). تقوم كل وحدة تحليل نمطية بإنشاء تقرير HTML يجمع أوصاف الطريقة وجداول النتائج ومخططات درجات النشر. توفر هذه التقارير للمستخدم ملخصًا شاملاً وسهل المشاركة لمجموعة البيانات.

نظرة عامة على سير عمل تحليل RnBeads والميزات الجديدة المضافة في RnBeads 2.0. رسم مفاهيمي لسير عمل RnBeads لتحليل مثيلة الحمض النووي ، مع سرد الميزات الرئيسية (يمين) لكل من وحدات تحليل RnBeads (في الوسط) ، مع الميزات المضافة حديثًا المشار إليها بنص أحمر غامق. علامة تبويب ، ملفات مجدولة (على سبيل المثال ، مفصولة بفواصل) idat ، ملفات شدة إشارة Infinium جغرافية ، تنزيل من مستودع بيانات GEO

من بين الميزات المختلفة التي قدمناها في RnBeads منذ النشر الأصلي في عام 2014 ، نسلط الضوء بشكل خاص على المجالات الأربعة التالية:

أنواع البيانات الجديدة والتحليل عبر الأنظمة الأساسية: تدعم RnBeads الآن المصفوفات الدقيقة EPIC وتتيح تكاملًا سلسًا للبيانات عبر فحوصات مثيلة الحمض النووي المختلفة (على سبيل المثال ، مصفوفات EPIC و 450 كيلو و 27 كيلو بالإضافة إلى WGBS و RRBS) ، مما يسهل التحليلات الوصفية لمثيلات الحمض النووي التي تجمع بين العديد من مصادر البيانات في مجموعة واحدة من النتائج.

طرق التحليل والاستدلال الموسعة: أضفنا وظائف جديدة للتعامل مع البيانات غير المكتملة والقيم المفقودة ، لاكتشاف الأدلة الجينية لتلوث العينة أو جودة البيانات المنخفضة ، لقياس عدم تجانس مثيلة الحمض النووي ، والاستدلال القائم على مثيلة الحمض النووي للمعلومات المظهرية. قمنا بدمج خوارزمية LUMP [22] ، والتي تقدر محتوى الخلايا المناعية للأورام وعينات الأنسجة غير المتجانسة الأخرى ، والتنبؤ بالعمر اللاجيني [23] لكل من بيانات تسلسل Infinium microarray و bisulfite. هذه التنبؤات مفيدة ليس فقط لاستنتاج التعليقات التوضيحية المفقودة للمانحين ، ولكن أيضًا لاكتشاف الانحرافات التي تشير إلى الشيخوخة المتسارعة [24] أو دليل على اختلاط العينات. تشمل الميزات الجديدة الإضافية تحديد المناطق الجينومية التي تتميز بتباين مثيلة الحمض النووي التفاضلي [25 ، 26] وتحليل إثراء المنطقة الجينومية باستخدام أداة LOLA [27].

واجهة جديدة سهلة الاستخدام: نحن نقدم واجهة مستخدم رسومية لـ RnBeads تسهل تكوين وتنفيذ تحليلات مثيلة الحمض النووي. جنبًا إلى جنب مع تقارير HTML التفاعلية والواضحة بذاتها من RnBeads ، تجعل هذه الواجهة الجديدة تحليلات RnBeads أكثر سهولة للمستخدمين ذوي المعرفة المحدودة بال R / Bioconductor.

تحسين الكفاءة الحسابية: باستخدام التوازي والتوزيع التلقائي لتحليلات RnBeads عبر مجموعة الحوسبة عالية الأداء (HPC) ، تمكنا من معالجة مجموعات البيانات التي تضم المئات من ملفات تعريف RRBS / WGBS والآلاف من ملفات التعريف المستندة إلى ميكروأري في عملية تحليل واحدة.

لتوضيح الفائدة العملية لميزات RnBeads الجديدة هذه ، نقدم أربع حالات استخدام: (1) مثيلة الحمض النووي في عينات الدم المحيطي البشري ، (2) مثيلة الحمض النووي الخاصة بنوع الخلية في تكوين الدم البشري ، (3) عدم تجانس مثيلة الحمض النووي في عينات السرطان و (4) تحليل مثيلة الحمض النووي عبر النظام الأساسي. تتوفر إصدارات مفصلة قابلة لإعادة التشغيل من هذه التحليلات ، بما في ذلك التكوينات والنتائج ، للتصور والتنزيل من موقع ويب RnBeads (https://rnbeads.org/methylomes.html). توفر هذه التحليلات المكونة مسبقًا والتقارير المحسوبة مسبقًا أيضًا نقطة انطلاق جيدة للتعرف على استخدام RnBeads ، وبالتالي استكمال البرامج التعليمية المتوفرة على موقع RnBeads على الويب (https://rnbeads.org/tutorial.html) ، وللتكوين تحليلات مخصصة تدمج مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها حديثًا مع البيانات المرجعية المتاحة للجمهور.

حالة الاستخدام 1: تحليل مثيلة الحمض النووي في مجموعة كبيرة من عينات الدم المحيطي

لتوضيح استخدام RnBeads لتحليل بيانات ميكروأري مثيلة الحمض النووي في مجموعة كبيرة ، حصلنا على ملامح Infinium 450k لعينات الدم المحيطي من 732 فردًا سليمًا [28]. قمنا أيضًا بتضمين ملفات تعريف مرجعية لأنواع خلايا الدم المصنفة [29] ، من أجل حساب الفروق بين الأفراد في تواتر أنواع الخلايا المختلفة [30]. أولاً ، استخدمنا RnBeads لاستنتاج عمر المتبرع والجنس لكل عينة ، وبالتالي ملء حفنة من التعليقات التوضيحية المفقودة بالقيم المنسوبة ، مع التحقق أيضًا من اختلاط العينات المحتمل بين تلك العينات التي تم توثيق عمر المتبرع والجنس كجزء من شرح (الشكل 2 أ ، ب). ثانيًا ، أجرينا تقديرًا مرجعيًا لتكوين الخلايا المناعية [30] كما تم تنفيذه في RnBeads ، ووجدنا أن محتوى الخلايا المناعية المستنتج [22] (بالإضافة إلى التعليقات التوضيحية الأخرى) مرتبط بالفعل بمكونات رئيسية مهمة لمثيل الحمض النووي مجموعة البيانات (الشكل 2 ج ، د). تؤكد نتائجنا على الحاجة إلى تصحيح هذه المتغيرات المشتركة عند تحديد CpGs والمناطق الجينومية المرتبطة بالتعليقات التوضيحية ذات الاهتمام الأساسي. ثالثًا ، قمنا بمقارنة العمر الزمني مع جزء خلايا CD4 + T المستنتج من بيانات مثيلة الحمض النووي باستخدام أنواع خلايا الدم المصنفة كمرجع [30] (الشكل 2 هـ) ولاحظنا ارتباطًا سلبيًا ، بما يتوافق مع التحول المرتبط بالعمر نحو تكون الدم النخاعي (بدلاً من اللمفاوي) [31]. باختصار ، توضح حالة الاستخدام هذه التنبؤ بالعمر والجنس وتكوين الخلية بناءً على بيانات مثيلة الحمض النووي ، وتوفر إطارًا لدراسات الارتباط على مستوى الإبيجينوم المستندة إلى ميكروأري.

تحليل مجموعة بيانات مثيلة كبيرة من الحمض النووي لعينات الدم التي تم تحديدها باستخدام Infinium 450k. أ مخطط مبعثر يوضح العلاقة بين العمر اللاجيني المتوقع من مثيلة الحمض النووي والعمر الزمني المُبلغ عنه لـ 729 متبرعًا سليمًا (تم استبعاد ثلاثة أفراد بسبب عدم الإبلاغ عن عمر كرونولوجي). ب وضع العينات في فضاء ثنائي الأبعاد للتنبؤ بالجنس. ج الارتباط الإحصائي بين المكونات الرئيسية (الأعمدة) وعينة التعليقات التوضيحية (الصفوف). ارتباطات كبيرة مع ص يتم تمييز القيم الأقل من 0.01 بدوائر مملوءة ، بينما يتم تمثيل القيم غير المهمة كدوائر فارغة. د تحليل المكون الرئيسي لـ 792 ملفًا لمثيلات الحمض النووي المستندة إلى الدم ، والتي تضم 732 عينة دم محيطية و 60 مجموعة خلايا دم مصنفة ، باستخدام نفس المكونات الرئيسية الموجودة في اللوحة ج. تم تقدير محتوى الخلايا المناعية باستخدام خوارزمية LUMP. ه مخطط مبعثر يوضح الارتباط السلبي بين العمر الزمني والجزء المقدر لخلايا CD4 + T.

حالة الاستخدام 2: تشريح مشهد مثيلة الحمض النووي لتكوين الدم البشري

أدت الجهود التي يبذلها الاتحاد الدولي للإبيجينوم البشري [14] والمشاريع المساهمة فيه إلى مجموعات كبيرة من بيانات WGBS المتاحة للجمهور لأنواع مختلفة من الخلايا. لإثبات قدرة RnBeads على معالجة مثل هذه المجموعات المرجعية الكبيرة ، قمنا بتحليل مجموعة بيانات ميثيلوم الحمض النووي التي تضم 195 ملف تعريف WGBS و 26238599 موقعًا فريدًا من مواقع CpG (بعد خطوة المعالجة المسبقة) لمختلف أنواع الخلايا المكونة للدم (الشكل 3 أ) ، والتي تم إنشاؤها في الأصل بواسطة مشروع BLUEPRINT [32]. بالتركيز على مجموعات المناطق الجينومية المحددة مسبقًا بما في ذلك البنية التنظيمية للمجموعة [33] ، لاحظنا التوزيع المتوقع لميثيل الحمض النووي ، مع مستويات عالية من مثيلة الحمض النووي في مناطق التبليط على مستوى الجينوم ، ومستويات أقل قليلاً في المعززات ومواقع ربط عامل النسخ ، ومستويات أقل بكثير (وتوزيع ثنائي) من مثيلة الحمض النووي في محفزات الجينات ومواقع بدء النسخ (الشكل 3 ب). تتجمع ملامح مثيلة الحمض النووي وفقًا للسلالة الخلوية (الخلايا اللمفاوية مقابل الخلايا النخاعية) ، ومرحلة نضج الخلية (الساذجة مقابل خلايا المستجيب / خلايا الذاكرة) ، ونوع الخلية (الشكل 3 ج). بمقارنة نوعين من الخلايا النخاعية (الخلايا الأحادية والعدلات) ، حددت RnBeads انخفاض مستويات مثيلة الحمض النووي في الخلايا الوحيدة في مجموعة فرعية من المناطق التنظيمية المفترضة (الشكل ثلاثي الأبعاد). تحليل LOLA لإثراء مجموعات المناطق الجينومية [27] (ميزة جديدة قدمناها في RnBeads 2.0 لتسهيل التفسير البيولوجي) حدد الإثراء المميز للمناطق التنظيمية الخاصة بنوع الخلية (بما في ذلك الكروماتين المفتوح الخاص بالوحيدات وتعديلات الهيستون المرتبطة به) ول مواقع الربط لعوامل النسخ المكونة للدم الهامة مثل CEBPB و SPI-1 / PU.1. باختصار ، توضح حالة الاستخدام هذه قابلية توسيع RnBeads لمجموعات بيانات مثيلة الحمض النووي الكبيرة (والتي تتضمن توزيع وظائف التحليل عبر مجموعة HPC للحساب المتوازي الفعال) ، والتحليل القائم على المنطقة لمثيلة الحمض النووي ، والتفسير البيولوجي عن طريق تحليل إثراء مجموعة المنطقة .

تحليل على مستوى الجينوم لمثيلات الحمض النووي في الخلايا المكونة للدم التي تم تحديدها باستخدام WGBS. أ نظرة عامة على أنواع الخلايا وأرقام العينات في مجموعة بيانات BLUEPRINT WGBS (إصدار أغسطس 2016) ، والتي تم تحليلها باستخدام RnBeads. ب توزيع مستويات مثيلة الحمض النووي لأنواع مختلفة من مجموعات المناطق الجينومية. ج تقليل أبعاد t-SNE استنادًا إلى المسافات الإقليدية لمتوسط ​​مثيلة الحمض النووي في المناطق التنظيمية المفترضة. يتم ترميز أنواع الخلايا بالألوان كما هو الحال في اللوحة أ. د مخططات مبعثرة الكثافة تظهر مستويات مثيلة الحمض النووي التفاضلية بين الخلايا الوحيدة (ن = 20) والعدلات (ن = 10). يشار إلى كثافة النقطة من خلال التظليل الأزرق. يتم عرض 0.1٪ من المناطق في أكثر المناطق كثافة سكانية في قطعة الأرض كنقاط فردية. يشار إلى أعلى 500 منطقة ناقصة الميثيل في حيدات مقارنة مع العدلات باللون الأرجواني. ه نسب احتمالات اللوغاريتمات لتحليل تخصيب LOLA لـ 500 منطقة مظللة في اللوحة د. يتم عرض أفضل 20 فئة من أكثر الفئات إثراءً لقواعد بيانات LOLA الأساسية والموسعة. تمثل الأشرطة الملونة بشكل مختلف أنواعًا مختلفة من بيانات المنطقة الجينومية (على سبيل المثال ، قمم علامات هيستون أو مواقع ربط عامل النسخ). Mf ، macrophage GM ، الخلية اللمفاوية Mo ، monocyte REMC ، اتحاد رسم الخرائط Epigenomics خارطة الطريق

حالة الاستخدام 3: تحديد عدم تجانس مثيلة الحمض النووي في مجموعة سرطان الطفولة

ظهر عدم التجانس اللاجيني مؤخرًا كخاصية رئيسية لعينات الورم [34]. لإثبات فائدة RnBeads لأبحاث السرطان ، قمنا بإعادة تحليل 188 من سمات RRBS المنشورة مؤخرًا لأورام ساركوما Ewing وخطوط الخلايا والخلايا الجذعية الوسيطة [7]. ساركوما إوينغ هو سرطان العظام لدى الأطفال يتميز بانخفاض عدم التجانس الجيني ولكن التغييرات المدهشة في الإبيجينوم [7 ، 35]. أدت معالجة البيانات ومراقبة الجودة إلى 2،217،186 موقعًا فريدًا من مواقع CpG تمت تغطيتها بخمس قراءات تسلسلية على الأقل في أكثر من 50٪ من العينات. بناءً على CpGs هذه ، قمنا بتجميع قيم مثيلة الحمض النووي في كل عينة عبر مناطق الجينوم المشروحة ، بما في ذلك العناصر التنظيمية المفترضة المحددة في البنية التنظيمية للمجموعة [33]. أظهر تحليل المكون الرئيسي الفصل المتوقع بين الأورام وخطوط الخلايا والخلايا الجذعية الوسيطة ، مع عدم تجانس أعلى من عينة إلى عينة بين الأورام وخطوط الخلايا مقارنة بالخلايا الجذعية الوسيطة (الشكل 4 أ). قارنا الأورام الأولية بخطوط الخلايا باستخدام وحدة مثيلة الحمض النووي التفاضلية لـ RnBeads ، ووجدنا أن معظم المناطق الميثيلية التفاضلية كانت مفرطة الميثيل في خطوط الخلايا (الشكل 4 ب). لاحظنا أيضًا زيادة التباين في خطوط الخلايا (الشكل 4 ج). كشف تحليل LOLA عن إثراء مختلف بشكل ملحوظ بين المناطق الميثيلية التفاضلية (DMRs) والمناطق المتغيرة تفاضليًا (DVRs) ، مما يشير إلى أن المقياسين يوفران معلومات تكميلية حول مشهد مثيلة الحمض النووي (الشكل 4 د-و). تم إثراء المناطق المفرطة الميثيل في خطوط خلايا ساركوما Ewing لمواقع DNase شديدة الحساسية في عينات الأنسجة الصحية المختلفة (الشكل 4 د) ، بما يتوافق مع فرط الميثيل على نطاق واسع وإسكات المناطق التنظيمية غير الأساسية في خطوط الخلايا. في المقابل ، تم إثراء المناطق شديدة التغير من أجل ارتباط عامل النسخ وتعديلات الهيستون في خطوط الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية الجنينية (الشكل 4f) ، مما يدل على زيادة اللدونة التنظيمية لخطوط خلايا ساركوما إوينغ مقارنة بالأورام الأولية. باختصار ، تصف حالة الاستخدام هذه تحليل مجموعة البيانات المستندة إلى RRBS (والتي تستفيد من التحليل المستند إلى المنطقة بسبب التقلبات في تغطية CpG المفردة) ، وتوضح فائدة RRBS و RnBeads للتحقيق في عدم تجانس مثيلة الحمض النووي في عينات الورم .

تشريح عدم تجانس مثيلة الحمض النووي في عينات ساركوما يوينغ التي تم تحديدها باستخدام RRBS. أ تحليل المكون الرئيسي لمجموعة بيانات RRBS لأورام ساركوما إوينغ وخطوط الخلايا والخلايا الجذعية الوسيطة ، بناءً على قيم مثيلة الحمض النووي المجمعة عبر مناطق البناء التنظيمي للمجموعة. ب مخطط تشتت الكثافة يقارن مستويات مثيلة الحمض النووي المجمعة بين أورام ساركوما يوينغ (ن = 140) وخطوط خلايا ساركوما إوينغ (ن = 16). تم تمييز المناطق الميثيلية التفاضلية ذات الترتيب الأعلى باللون البنفسجي حتى حد التصنيف المحدد تلقائيًا. ج مخطط تشتت الكثافة يقارن تباين مثيلة الحمض النووي بين أورام ساركوما يوينغ وخطوط الخلايا. يتم تمييز المناطق المتغيرة تفاضليًا باللون البني. د الإثراء (نسب الأرجحية اللوغاريتمية) استنادًا إلى تحليل LOLA للمناطق الميثيلية التفاضلية الموضحة في اللوحة ب وفي اللوحة ه. تمثل الأشرطة الملونة بشكل مختلف أنواعًا مختلفة من بيانات المنطقة الجينومية. ه مخطط تشتت الكثافة يقارن نسب اللوغاريتمات بين مستويات مثيلة الحمض النووي والتباين في أورام ساركوما يوينغ وخطوط الخلايا. F الإثراء (نسب الأرجحية اللوغاريتمية) استنادًا إلى تحليل LOLA للمناطق المتغيرة تفاضليًا الموضحة في اللوحة ج وفي اللوحة ه. ESC ، الخلايا الجذعية الجنينية CGIs ، جزر CpG

حالة الاستخدام 4: تحليل بيانات مثيلة الحمض النووي عبر منصات الفحص المختلفة

تم استخدام عدة أجيال من المصفوفات الدقيقة لـ Infinium DNA methylation على مر السنين ، وقد يكون من الضروري دمج مجموعات بيانات متعددة في تحليل تكاملي. توفر RnBeads الآن طرقًا مخصصة للتحليل عبر الأنظمة الأساسية ، مما يجعل من الممكن دمج كائنات بيانات RnBeads عبر الإصدارات المختلفة من Infinium microarray (27k ، 450k ، EPIC) ومع بيانات تسلسل ثنائي سلفيت (RRBS ، WGBS). لإثبات هذه الميزة ، قمنا بتحليل مجموعة بيانات معيارية تتألف من ثلاث منصات اختبار مختلفة: المصفوفات الدقيقة Infinium 450k ، والمصفوفات الدقيقة Infinium EPIC ، و WGBS [36]. تم تحميل جميع مجموعات البيانات الثلاث ومعالجتها مسبقًا بشكل منفصل باستخدام RnBeads ، مما أدى إلى كائنات بيانات مع 443،053 (450 كيلو) و 801،716 (EPIC) و 25،918،426 (WGBS) مواقع CpG الفريدة ، على التوالي. بتطبيق طريقة RnBeads لدمج مجموعات البيانات مع خيار تضمين CpGs التي تغطيها الأنظمة الأساسية الثلاثة فقط ، تم دمج هذه الكائنات في مجموعة بيانات مجمعة تضم 408621 CpGs مشتركة. تمت معالجة مجموعة البيانات المجمعة هذه باستخدام وحدات تحليل RnBeads. لاحظنا الاختلافات في التوزيع العالمي لمستويات مثيلة الحمض النووي بين المقايسات (الشكل 5 أ). ومع ذلك ، أظهر تحليل المكون الرئيسي أن الاختلافات البيولوجية بين العينات تهيمن على الاختلافات التقنية بين المنصات (الشكل 5 ب). بالتركيز بشكل خاص على المقارنة بين خط خلايا سرطان البروستاتا (LNCaP) وخلايا البروستاتا الظهارية (PrECs) ، لاحظنا أعلى ارتباط بين التكرارات لنفس الاختبار في نفس نوع الخلية (Pearson’s ص = 0.9979 ، الشكل 5 ج). ومع ذلك ، فإن الارتباط بين المقايسات المختلفة في نفس نوع الخلية (Pearson’s ص = 0.9655 ، الشكل 5 د) لا يزال مرتفعًا وأقوى بكثير من الارتباط بين أنواع الخلايا المختلفة لنفس الاختبار (بيرسون ص = 0.6471 ، الشكل 5 هـ). باختصار ، تسلط حالة الاستخدام هذه الضوء على الجدوى والمنفعة العملية للتحليل عبر النظام الأساسي لمثيلة الحمض النووي باستخدام RnBeads.

تكامل البيانات عبر الأنظمة الأساسية باستخدام RnBeads. أ توزيع مستويات مثيلة الحمض النووي لنفس العينات التي تم تحديدها عبر منصات الفحص المختلفة. ب تحليل المكون الرئيسي لمجموعة بيانات مقارنة الفحص. تصور الأشكال والألوان النقطية منصات الفحص وأنواع الخلايا ، على التوالي. ج – هـ مخططات مبعثرة الكثافة تقارن مكررات الخلايا الظهارية للبروستاتا التي تم تحديدها باستخدام اختبار EPIC (لوحة ج) لمحة عن خلايا البروستاتا الظهارية باستخدام مقايسة EPIC و WGBS (لوحة د) وخلايا البروستاتا الظهارية بالإضافة إلى خط خلايا سرطان البروستاتا الموصوف بمقايسة EPIC (اللوحة ه). يشار إلى كثافة النقطة من خلال التظليل الأزرق. يتم عرض 0.1 ٪ من CpGs في المناطق الأكثر كثافة سكانية في قطعة الأرض كنقاط فردية. تستند جميع المؤامرات على CpGs التي تمت تغطيتها بواسطة جميع منصات الفحص الثلاثة. تظهر معاملات ارتباط بيرسون أسفل كل رسم بياني. NAF ، الخلايا الليفية غير الخبيثة المرتبطة بالأنسجة CAF ، الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان PrEC ، الخلايا الظهارية للبروستاتا LNCaP ، خط خلايا سرطان البروستاتا

مقارنة بأدوات البرمجيات الأخرى لتحليل مثيلة الحمض النووي

لتقييم الكفاءة الحسابية لـ RnBeads ، قمنا بمقارنة أدائها بأداء حزم البرامج الأخرى لتحليل مثيلة الحمض النووي [37،38،39،40] ، بشكل منفصل لبيانات المصفوفة الدقيقة لمثيل الحمض النووي ، وبيانات RRBS ، وبيانات WGBS (انظر "الطرق" "للحصول على تفاصيل وملف إضافي 2: الجدول S2 لتكوينات الأداة). نظرًا لأن الأدوات المختلفة توفر مجموعات ميزات مختلفة إلى حد كبير ، فقد درسنا ثلاثة سيناريوهات: (1) استيراد البيانات فقط ، (2) الوحدات الأساسية ، و (3) التحليل الشامل مع تنشيط معظم الميزات (ملف إضافي 3: الشكل S1). كانت RnBeads هي الأداة الوحيدة التي دعمت التحليل القائم على التسلسل القائم على ميكروأري وثنائي كبريتيت. بالنسبة للتحليل القائم على المصفوفة الدقيقة ، كانت حزم معالجة البيانات منخفضة المستوى minfi و methylumi و wateRmelon أسرع من ChAMP و RnBeads (التي تحتاج إلى إعداد مجموعة البيانات لتحليلاتها الأكثر شمولاً في المصب). مقارنةً بـ ChAMP ، كانت RnBeads أكثر كفاءة في الذاكرة وأسرع في الإعداد الشامل. بالنسبة للتحليل المستند إلى تسلسل بيسلفيت ، أظهرت RnBeads أداءً أفضل من methylKit على مجموعة بيانات WGBS في إعداد الوحدة الأساسية ، ولكن وقت تشغيل أطول إلى حد ما واستخدام أعلى للذاكرة في مجموعة بيانات RRBS. يمكن أن تُعزى هذه الاختلافات إلى إعادة التهيئة إلى هياكل بيانات فعالة للذاكرة يقوم بها RnBeads أثناء استيراد البيانات. باختصار ، كان أداء وقت تشغيل RnBeads مشابهًا لأداء الأدوات الأخرى ذات الوظائف المحدودة ، مما يشير إلى أن اختيار الأداة الأكثر ملاءمة لتحليل مثيلة الحمض النووي يعتمد بشكل أساسي على الميزات المطلوبة وأوضاع التحليل. للمساعدة في اختيار مستنير ، قمنا بالتالي بمسح مجموعة واسعة من الأدوات لتحليل مثيلة الحمض النووي وقمنا بتجميع جدول ميزات مفصل بناءً على وثائق الأداة (ملف إضافي 1: الجدول S1). ظهرت RnBeads من هذه المقارنة كبرنامج ينفذ سير العمل الأكثر شمولاً لتحليل بيانات مثيلة الحمض النووي ، مع توفير واجهة سهلة الاستخدام وخيارات واسعة للإبلاغ وإمكانية التكاثر.


ديناميات ميثيلوم الحمض النووي الزماني المكاني لجنين الفأر النامي

يعتبر مثيلة الحمض النووي للسيتوزين أمرًا ضروريًا لتطور الثدييات ولكن فهم توزيعه الزماني المكاني في الجنين النامي يظل محدودًا. هنا ، كجزء من مشروع موسوعة الفأر لعناصر الحمض النووي (ENCODE) ، قمنا بتحديد ملامح 168 ميثيلوم من 12 أنسجة أو أعضاء فأر في 9 مراحل نمو من التطور الجنيني إلى مرحلة البلوغ. حددنا 1،808،810 منطقة جينومية أظهرت اختلافات في مثيلة CG من خلال مقارنة الميثيلومات للأنسجة أو الأعضاء المختلفة من المراحل التنموية المختلفة. تفقد عناصر الحمض النووي هذه في الغالب مثيلة CG أثناء نمو الجنين ، بينما ينعكس الاتجاه بعد الولادة. خلال المراحل المتأخرة من نمو الجنين ، تراكمت مثيلة غير CG داخل أجسام جينات عامل النسخ التنموي الرئيسية ، بالتزامن مع قمع النسخ. لقد مكننا تكامل مثيلة الحمض النووي على مستوى الجينوم ، وتعديل هيستون وبيانات إمكانية الوصول إلى الكروماتين ، من التنبؤ بـ 461،141 معززًا مفترضًا خاصًا بالأنسجة التنموية ، تم إثراء تقويم العظام البشري من أجل المتغيرات الجينية المرتبطة بالأمراض. توفر خرائط الإيبيجينوم الزمانية المكانية هذه مورداً لدراسات تنظيم الجينات أثناء تقدم الأنسجة أو العضو ، ونقطة انطلاق للتحقيق في العناصر التنظيمية التي تشارك في اضطرابات النمو البشرية.

بيان تضارب المصالح

ب. هو أحد مؤسسي Arima Genomics، Inc. ومساهميها في شركة Arima Genomics، Inc. ويصرح المؤلفون الآخرون بعدم وجود مصالح متنافسة.

الأرقام

الشكل 1. شرح تنظيمي لمتغير المثيلة ...

التين. 1. شرح توضيحي للعناصر التنظيمية المتغيرة المثيلة في تطوير أنسجة الفأر.

الشكل 2. تخضع CG-DMRs الخاصة بالأنسجة لنزع الميثيل المستمر ...

الشكل 2. تخضع CG-DMRs الخاصة بالأنسجة لنزع الميثيل المستمر أثناء التطور الجنيني وإعادة الميثيل بعد الولادة.

الشكل 3. تراكم mCH يتنبأ بانخفاض الجين ...

الشكل 3. تراكم mCH يتنبأ بانخفاض التعبير الجيني.

الشكل 4. شرح توضيحي محسّن لتطوير الماوس ...

الشكل 4. شرح توضيحي محسن لتطوير أنسجة الفأر.

الشكل 5. الارتباط بين mCG والتعبير الجيني ...

الشكل 5. الارتباط بين mCG والتعبير الجيني والتعدد السكاني المرتبط بالأمراض.

بيانات موسعة الشكل 1. ميثلة الهيبوميثيل العالمية في ...

بيانات موسعة الشكل 1. ميثلة نقص الميثيل العالمية في كبد الجنين.

بيانات موسعة الشكل 2. تصنيف CG-DMRs.

بيانات موسعة الشكل 2. تصنيف CG-DMRs.

البيانات الموسعة الشكل 3. توصيف معبي ...

الشكل 3. توصيف توصيفات FeDMRs و unxDMRs الأولية البعيدة.

الشكل 4. حجم تأثير CG-DMR ...

الشكل 4. تحليل حجم تأثير CG-DMR.

بيانات موسعة الشكل 5. الارتباط بين المثيلة ...

بيانات موسعة الشكل 5. ربط بين ديناميات مثيلة وتعديلات هيستون في الأنسجة الخاصة CG-DMRs.

الشكل 6. بيانات موسعة. 6. مثلة جزيئية CG على نطاق واسع ...

الشكل 6. البيانات الموسعة. 6. يتداخل مثبط الميثيل المنخفض CG على نطاق واسع بشدة مع المُحسِنات الفائقة.


CH450 و CH451: الكيمياء الحيوية - تحديد الحياة على المستوى الجزيئي

حمض الجينوم deoxyribonucleic هو DNA الكروموسومي ، على عكس الحمض النووي خارج الكروموسومات مثل ذلك الموجود في الميتوكوندريا للثدييات أو الهياكل البلازميدية في البكتيريا (الشكل 5.1). ستتم مناقشة البلازميدات بمزيد من التفصيل في القسم 5.3 أثناء مناقشة استنساخ الجينات والتعبير عنها. ثم يتم اختصارها أيضًا باسم جدنا. تمتلك معظم الكائنات الحية نفس الحمض النووي الجيني في كل خلية ، ومع ذلك ، فإن جينات معينة فقط تنشط في كل خلية للسماح بوظيفة الخلية والتمايز داخل الجسم.

إن جينوم الكائن الحي (المشفر بواسطة الحمض النووي الجيني) هو المعلومات (البيولوجية) للوراثة التي تنتقل من جيل من الكائنات الحية إلى الجيل التالي. يتم نسخ هذا الجينوم لإنتاج أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي ، والتي تعتبر ضرورية لوظيفة الكائن الحي. يتم نسخ السلائف mRNA (pre-mRNA) بواسطة RNA polymerase II في النواة. ثم تتم معالجة pre-mRNA عن طريق التضفير لإزالة الإنترونات ، تاركًا exons في الرسول الناضج RNA (mRNA). تتضمن المعالجة الإضافية إضافة غطاء 5 & # 8242 وذيل بولي (A) إلى pre-mRNA. يمكن بعد ذلك نقل الرنا المرسال الناضج إلى العصارة الخلوية وترجمته بواسطة الريبوسوم إلى بروتين. تشمل الأنواع الأخرى من الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبوزي (الرنا الريباسي) ونقل الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي). يتم نسخ هذه الأنواع بواسطة RNA polymerase II و RNA polymerase III ، على التوالي ، وهي ضرورية لتخليق البروتين. ومع ذلك ، فإن الرنا الريباسي 5s هو الرنا الريباسي الوحيد الذي يتم نسخه بواسطة RNA Polymerase III.

في علم الوراثة ، الحمض النووي التكميلي (كدنا) هو DNA مركب من الحمض النووي الريبي أحادي الخيط (على سبيل المثال ، قالب RNA الرسول (mRNA) أو microRNA) في تفاعل محفز بواسطة النسخ العكسي للإنزيم (الشكل 5.1). إن إنزيم النسخ العكسي هو إنزيم موجود في الفيروسات القهقرية مثل فيروس نقص المناعة البشرية الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي كمادة وراثية أساسية. عند دخول الخلية المضيفة ، يتم نسخ الحمض النووي الريبي بشكل عكسي لإنتاج نسخة من الحمض النووي الريبي (cDNA) التي يمكن أن تندمج بعد ذلك في الحمض النووي الجيني للمضيف. في التكنولوجيا الحيوية ، غالبًا ما يتم استخدام النسخ العكسي لإنشاء cDNA من mRNA المعبر عنه في خلايا أو أنسجة معينة. بهذه الطريقة ، يمكن استنساخ جينات حقيقيات النوى بدون أي إنترونات موجودة في الهيكل. هذا مفيد بشكل خاص إذا كان الهدف هو التعبير عن البروتين في مضيف بدائي النواة (بكتيري). تذكر أن الحمض النووي البكتيري لا يحتوي على أي تسلسلات intron داخل الحمض النووي الصبغي. وبالتالي ، إذا كنت تستخدم نظامًا بدائية النواة للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة ، فيجب عليك استخدام cDNA ، لأن النظام بدائيات النواة لن يكون قادرًا على إزالة تسلسلات intron بعد النسخ الجيني.

المصطلح كدنا يستخدم أيضًا ، عادةً في سياق المعلوماتية الحيوية ، للإشارة إلى نسخة mRNA & # 8217s تسلسل ، معبرًا عنه كقواعد DNA (GCAT) بدلاً من قواعد RNA (GCAU).

الشكل 5.1. الحمض النووي الجيني (جدنا) مقابل الحمض النووي التكميلي (كدنا). يوضح الرسم البياني الأيسر معالجة الحمض النووي الجيني داخل الخلية لإنتاج بروتين (اللوحة الزرقاء العلوية يوضح العناصر الهيكلية المشتركة للجينات حقيقية النواة. تنتج عملية النسخ الجيني جزيء مرسال RNA (mRNA) يجب تعديله بعد الترجمة ، لوحة رمادية ، لإزالة تسلسلات intron غير المشفرة وإضافة المقاطع 5 & # 8242-CAP و Poly-A-Tail. يتم نقل mRNA الناضج من النواة إلى السيتوبلازم حيث يتم ترجمته بواسطة الريبوسوم إلى تسلسل البروتين ، لوحة حمراء.) يوضح الرسم البياني الأيمن أنه يمكن استخدام عزل mRNA من خلية لتوليف cDNA باستخدام إنزيم النسخ العكسي. يحتوي cDNA الناتج فقط على عناصر من mRNA الناضج ، بما في ذلك exons و poly-a tail.

تقنيات عزل الحمض النووي

عزل الحمض النووي هي عملية تنقية الحمض النووي من العينة باستخدام مجموعة من الطرق الفيزيائية والكيميائية. تم إجراء أول عزل للحمض النووي في عام 1869 بواسطة فريدريش ميشر. وهو حاليًا إجراء روتيني في البيولوجيا الجزيئية أو تحليلات الطب الشرعي. بالنسبة للطريقة الكيميائية ، هناك العديد من المجموعات المختلفة المستخدمة في الاستخراج ، واختيار المجموعة الصحيحة سيوفر الوقت في إجراءات الاستخراج والتحسين. يعتبر اكتشاف حساسية PCR لإظهار التباين بين المجموعات التجارية.

هناك ثلاث تقنيات قياسية لتنقية الحمض النووي موصوفة أدناه:

  • يجب جمع الخلايا المراد دراستها.
  • كسر أغشية الخلايا لفضح الحمض النووي مع السيتوبلازم داخل (تحلل الخلية).
    • يتم تكسير الدهون من غشاء الخلية والنواة بالمنظفات والمواد الخافضة للتوتر السطحي.
    • تكسير البروتينات بإضافة البروتياز (اختياري).
    • كسر الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة RNase (اختياري).
    1. ترسيب الإيثانولعادة عن طريق الإيثانول المثلج أو الأيزوبروبانول. نظرًا لأن الحمض النووي غير قابل للذوبان في هذه الكحوليات ، فسوف يتجمع معًا ، مما يعطي حبيبات مضغوطة عند الطرد المركزي. يتم تحسين ترسيب الحمض النووي عن طريق زيادة القوة الأيونية ، عادة عن طريق إضافة أسيتات الصوديوم.
    2. استخراج الفينول والكلوروفورم حيث يفسد الفينول البروتينات في العينة. بعد الطرد المركزي للعينة ، تبقى البروتينات الممسوحة في الطور العضوي بينما يتم خلط الطور المائي الذي يحتوي على حمض نووي مع الكلوروفورم الذي يزيل بقايا الفينول من المحلول.
    3. تنقية العمود الصغير هذا يعتمد على حقيقة أن الأحماض النووية قد ترتبط (الامتزاز) بالمرحلة الصلبة (السيليكا أو غيرها) اعتمادًا على الرقم الهيدروجيني وتركيز الملح في المخزن المؤقت (الشكل 5.2).

    يمكن إزالة البروتينات الخلوية والهيستون المرتبطة بالحمض النووي إما عن طريق إضافة البروتياز أو عن طريق ترسيب البروتينات مع أسيتات الصوديوم أو الأمونيوم ، أو استخلاصها بمزيج الفينول وكلوروفورم قبل ترسيب الحمض النووي.

    بعد العزل ، يتم إذابة الحمض النووي في محلول قلوي قليل ، عادة في محلول Tris-EDTA ، أو في ماء نقي للغاية. غالبًا ما يتم إجراء التعديلات التي يتم إجراؤها على هذه التقنيات القياسية إذا كان من الصعب تحطيم الأنسجة المستخدمة ، أو إذا استمرت الملوثات في محلول التحلل التي تمنع المزيد من التفاعلات ، أو إذا كانت العينة ضئيلة للغاية ، كما هو الحال في كثير من الأحيان في تحقيقات الطب الشرعي. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم تصميم مجموعات تجارية مختلفة لعزل الحمض النووي الجيني الأكبر أو DNA البلازميد الأصغر.

    الشكل 5.2 عمود تدور السيليكا المستخدم لتنقية الحمض النووي. تنقية الأحماض النووية القائمة على عمود الدوران هي طريقة استخراج المرحلة الصلبة لتنقية الأحماض النووية بسرعة. تعتمد هذه الطريقة على حقيقة أن الحمض النووي سيرتبط بالطور الصلب للسيليكا في ظل ظروف معينة ثم يتم إطلاقه عند تغيير تلك الظروف. للربط ، يضاف محلول عازل إلى محلول الحمض النووي مع الإيثانول أو الأيزوبروبانول. هذا يشكل الحل الملزم. يتم نقل محلول الربط إلى عمود دوران ويوضع العمود في جهاز طرد مركزي. يفرض جهاز الطرد المركزي محلول الربط من خلال غشاء هلام السيليكا الموجود داخل عمود الدوران. إذا كان تركيز الأس الهيدروجيني والملح في محلول الربط مثاليًا ، فإن الحمض النووي سيرتبط بغشاء هلام السيليكا أثناء مرور المحلول من خلاله. لغسل المكونات الخلوية غير المحددة من العمود ، تتم إزالة التدفق من خلال وإضافة مخزن مؤقت للغسيل إلى العمود. يتم وضع العمود في جهاز طرد مركزي مرة أخرى ، مما يجبر عازلة الغسيل عبر الغشاء. هذا يزيل أي شوائب متبقية من الغشاء ، تاركًا الحمض النووي فقط مرتبط بجل السيليكا. للتخلص ، تتم إزالة المخزن المؤقت للغسيل وإضافة محلول شطف منخفض الملح (أو ببساطة الماء) إلى العمود. يتم وضع العمود في جهاز طرد مركزي مرة أخرى ، مما يجبر المخزن المؤقت للشطف عبر الغشاء. يقوم محلول الشطف بإزاحة الحمض النووي من العمود مما يسمح بجمعه في التدفق خلاله. على عكس الحمض النووي الريبي الذي يتحلل بسرعة كبيرة ، فإن الحمض النووي مستقر تمامًا ويمكن تخزينه لفترات طويلة في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

    تقنيات تسلسل الحمض النووي

    تسلسل الحمض النووي هي عملية تحديد تسلسل الحمض النووي - ترتيب النيوكليوتيدات في الحمض النووي. يتضمن أي طريقة أو تقنية تُستخدم لتحديد ترتيب القواعد الأربعة: الأدينين ، والجوانين ، والسيتوزين ، والثايمين. أدى ظهور طرق تسلسل الحمض النووي السريع إلى تسريع البحث والاكتشاف البيولوجي والطبي بشكل كبير.

    أصبحت معرفة تسلسل الحمض النووي لا غنى عنها للبحث البيولوجي الأساسي ، وفي العديد من المجالات التطبيقية مثل التشخيص الطبي والتكنولوجيا الحيوية وعلم الأحياء الشرعي وعلم الفيروسات والنظاميات البيولوجية. يمكن لمقارنة تسلسل الحمض النووي الصحي والمتحور تشخيص الأمراض المختلفة بما في ذلك السرطانات المختلفة ، وتمييز ذخيرة الأجسام المضادة ، ويمكن استخدامها لتوجيه علاج المريض. إن وجود طريقة سريعة لتسلسل الحمض النووي يسمح بتقديم رعاية طبية أسرع وأكثر تخصيصًا ، وللتعرف على المزيد من الكائنات الحية وفهرستها.

    كانت السرعة السريعة للتسلسل التي تم تحقيقها باستخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الحديثة مفيدة في تسلسل تسلسل الحمض النووي الكامل ، أو الجينوم ، لأنواع وأنواع عديدة من الحياة ، بما في ذلك الجينوم البشري وتسلسلات الحمض النووي الكاملة الأخرى للعديد من الحيوانات والنباتات والميكروبات. محيط.

    تم الحصول على تسلسلات الحمض النووي الأولى في أوائل السبعينيات من قبل باحثين أكاديميين باستخدام أساليب شاقة تعتمد على كروماتوغرافيا ثنائية الأبعاد. بعد تطوير طرق التسلسل المستندة إلى الفلورة باستخدام مُسلسِل الحمض النووي ، أصبح تسلسل الحمض النووي أسهل وأسرع من حيث الحجم.

    يتكون التركيب القانوني للحمض النووي من أربع قواعد: الثايمين (T) والأدينين (A) والسيتوزين (C) والجوانين (G). تسلسل الحمض النووي هو تحديد الترتيب المادي لهذه القواعد في جزيء الحمض النووي. ومع ذلك ، غالبًا ما يتم تعديل قواعد الحمض النووي بواسطة عمليات الوراثة اللاجينية للتحكم في التعبير الجيني. وهكذا ، فإن العديد من القواعد المعدلة الأخرى التي قد تكون موجودة في جزيء DNA غير القواعد الأربعة القياسية. على سبيل المثال ، في بعض الفيروسات (على وجه التحديد ، العاثية) ، يمكن استبدال السيتوزين بهيدروكسي ميثيل أو هيدروكسي ميثيل جلوكوز سيتوزين. في الحمض النووي حقيقيات النوى ، يمكن العثور على قواعد متغيرة مع مجموعات الميثيل أو الفوسفوسلفات (الشكل 5.3). اعتمادًا على تقنية التسلسل ، قد يتم أو لا يتم اكتشاف تعديل معين ، على سبيل المثال ، 5mC (5 -methylcytosine) الشائع في البشر.

    الشكل 5.3 تعديلات الحمض النووي مع الوظائف التنظيمية اللاجينية وترابطها. يتم ميثلة السيتوزين (C) إلى 5-ميثيل سيتوزين (5mC) بواسطة DNA methyltransferases (DNMT) ثم يتأكسد إلى 5hmC و 5fC و 5caC بواسطة Tet dioxygenases. يتم إنتاج 5-Hydroxyuracil (5hmU) عن طريق أكسدة الثايمين (T) المحفزة بـ Tet.من المحتمل أن يتم تحفيز N6-methyladenine (6mA) بواسطة DNA N6 adenine methyltransferases (DAMT-1 in C. ايليجانس) ، على الرغم من أن النشاط الكيميائي الحيوي لهذه الإنزيمات لا يزال يتعين وصفه. تم إثبات أن إنزيمات ALKB التي تشبه Tet NMAD (N6-methyl adenine demethylase 1) و DMAD (DNA 6mA demethylase) متورطة في إزالة الميثيل 6mA في C. ايليجانس و في ذبابة الفاكهة، على التوالي ، ربما باستخدام آلية ديوكسجيناز محفوظة.

    طرق تسلسل الحمض النووي المبكر

    تضمنت الطريقة الأولى لتحديد تسلسل الحمض النووي استراتيجية تمديد التمهيدي الخاصة بالموقع والتي وضعها راي وو في جامعة كورنيل في عام 1970. تم استخدام تحفيز بوليميراز الحمض النووي ووسم النوكليوتيدات المحدد ، وكلاهما يظهر بشكل بارز في مخططات التسلسل الحالية ، لتسلسل النهايات المتماسكة من DNA phage lambda. بين عامي 1970 و 1973 ، أوضح Wu و R Padmanabhan وزملاؤه أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد أي تسلسل DNA باستخدام بادئات اصطناعية خاصة بالموقع. تبنى فريدريك سانجر بعد ذلك استراتيجية التمديد التمهيدي هذه لتطوير طرق أسرع لتسلسل الحمض النووي في مركز MRC ، كامبريدج ، المملكة المتحدة ونشر طريقة لتسلسل & # 8220DNA مع مثبطات إنهاء السلسلة & # 8221 في عام 1977. والتر جيلبرت وألان ماكسام في هارفارد طور أيضًا طرق التسلسل ، بما في ذلك واحدة لتسلسل & # 8220DNA بالتحلل الكيميائي & # 8221. في عام 1973 ، أبلغ جيلبرت وماكسام عن تسلسل 24 زوجًا أساسيًا باستخدام طريقة تُعرف باسم تحليل بقعة التجوال. تم تعزيز التقدم في التسلسل من خلال التطوير المتزامن لتقنية الحمض النووي المؤتلف ، مما سمح بعزل عينات الحمض النووي من مصادر أخرى غير الفيروسات.

    تسلسل ماكسام جيلبرت يتطلب وضع العلامات المشعة في نهاية الحمض النووي رقم 5 & # 8242 وتنقية جزء الحمض النووي ليتم تسلسلها. تولد المعالجة الكيميائية بعد ذلك فواصل عند نسبة صغيرة من قاعدة أو اثنتين من قواعد النوكليوتيدات الأربعة في كل تفاعل من التفاعلات الأربعة (G ، A + G ، C ، C + T). يتم التحكم في تركيز المواد الكيميائية المعدلة لإدخال تعديل واحد في المتوسط ​​لكل جزيء DNA. وبالتالي يتم إنشاء سلسلة من الأجزاء ذات العلامات ، من النهاية ذات العلامات الإشعاعية إلى الموقع الأول & # 8220cut & # 8221 في كل جزيء. يتم فصل الشظايا في التفاعلات الأربعة جنبًا إلى جنب في تغيير طبيعة المواد الهلامية من مادة الأكريلاميد لفصل الحجم. لتصور الأجزاء ، يتم تعريض الهلام لفيلم الأشعة السينية للتصوير الشعاعي الذاتي ، مما ينتج عنه سلسلة من النطاقات المظلمة ، كل منها يتوافق مع جزء DNA المسمى إشعاعيًا ، والذي يمكن استنتاج التسلسل منه.

    تسببت الجوانب التقنية لتسلسل Maxam-Gilbert في الخروج عن صالحها بمجرد أن تكون طريقة تسلسل Sanger ثابتة ، كما هو موضح أدناه.

    طريقة تسلسل سانجر

    سرعان ما أصبحت طريقة إنهاء السلسلة التي طورها فريدريك سانجر وزملاؤه في عام 1977 هي الطريقة المفضلة ، نظرًا لسهولتها النسبية وموثوقيتها. عند اختراعها ، استخدمت طريقة إنهاء السلسلة مواد كيميائية سامة أقل وكميات أقل من النشاط الإشعاعي مقارنة بطريقة Maxam-Gilbert. نظرًا لسهولتها النسبية ، سرعان ما أصبحت طريقة Sanger آلية وكانت الطريقة المستخدمة في الجيل الأول من متواليات الحمض النووي.

    تتطلب طريقة إنهاء السلسلة الكلاسيكية قالب DNA أحادي الجديلة ، وبادئة DNA ، وبوليميراز DNA ، و deoxynucleotidetriphosphates (dNTPs) ، و di-deoxynucleotidetriphosphates (ddNTPs) المعدل ، وهذا الأخير ينهي استطالة الحمض النووي. تفتقر هذه النيوكليوتيدات المنتهية بالسلسلة إلى مجموعة 3 & # 8242-OH المطلوبة لتكوين رابطة فوسفوديستر بين نيوكليوتيدات ، مما يتسبب في توقف بوليميريز الحمض النووي عن تمديد الحمض النووي عندما يتم دمج ddNTP المعدل. قد يتم تمييز ddNTPs بشكل إشعاعي أو فلوري للكشف عن أجهزة التسلسل الآلي.

    تنقسم عينة الحمض النووي إلى أربعة تفاعلات تسلسلية منفصلة ، تحتوي على كل أربعة من الديوكسينوكليوتيدات القياسية (dATP ، dGTP ، dCTP و dTTP) وبوليميراز الحمض النووي. يضاف إلى كل تفاعل واحد فقط من أربعة ديوكسينوكليوتيدات (ddATP ، ddGTP ، ddCTP ، أو ddTTP) ، في حين أن النيوكليوتيدات المضافة الأخرى هي النيوكليوتيدات العادية (الشكل 5.4).

    الشكل 5.4. ddNTPs الفلورية لتسلسل سانجر. يتم استخدام Dideoxynucleotides للتسلسل حيث لا يمكن تمديدها أكثر بمجرد دمجها في الحمض النووي المجاور.

    يجب أن يكون تركيز ديوكسينوكليوتيد أقل بحوالي 100 ضعف من تركيز ديوكسينوكليوتيد المقابل (على سبيل المثال 0.005 ملي مولار دي دي تي تي بي: 0.5 ملي مولار دي تي تي بي) للسماح بإنتاج شظايا كافية مع استمرار نسخ التسلسل الكامل. في المجموع ، هناك حاجة إلى أربعة تفاعلات منفصلة في هذه العملية لاختبار جميع ddNTPs الأربعة (الشكل 5.5).

    الشكل 5.5. طريقة سانجر (إنهاء السلسلة) لتسلسل الحمض النووي. (1) يتم تلدين مادة أولية إلى تسلسل ، (2) تتم إضافة الكواشف إلى التمهيدي والقالب ، بما في ذلك: بوليميريز الحمض النووي ، dNTPs ، وكمية صغيرة من جميع النوكليوتيدات الأربعة (ddNTPs) المسمى بالفلوروفور. أثناء استطالة التمهيدي ، يؤدي الإدخال العشوائي لـ ddNTP بدلاً من dNTP إلى إنهاء تخليق السلسلة لأن بوليميريز الحمض النووي لا يمكن أن يتفاعل مع الهيدروكسيل المفقود. ينتج عن هذا كل الأطوال الممكنة للسلاسل. (3) يتم فصل المنتجات على هلام شعري مفرد ، حيث تتم قراءة العصابات الناتجة بواسطة نظام تصوير. (4) ينتج عن ذلك مئات الآلاف من النيوكليوتيدات يوميًا ، وهي بيانات تتطلب التخزين والتحليل الحسابي اللاحق.

    بعد جولات من تمديد قالب الحمض النووي من التمهيدي المرتبط ، يتم تغيير طبيعة أجزاء الحمض النووي الناتجة وفصلها حسب الحجم باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. تم تنفيذ هذه التقنية بشكل متكرر باستخدام هلام البولي أكريلاميد واليوريا المغير طبيعة مع كل من التفاعلات الأربعة التي تعمل في واحد من أربعة ممرات فردية (الممرات A ، T ، G ، C). يمكن بعد ذلك تصور نطاقات الحمض النووي عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي أو ضوء الأشعة فوق البنفسجية ويمكن قراءة تسلسل الحمض النووي مباشرة من فيلم الأشعة السينية أو صورة الهلام (الشكل 5.6).

    الشكل 5.6. جل الترطيب التقليدي سانجر. التسلسل المرئي بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي. يحتوي كل حارة على تفاعلات واحدة تحتوي على جميع النيوكليوتيدات الأربعة العادية وكمية صغيرة من أحد ديوكسينيوكليوتيدات (ddNTPs). مع مرور الوقت ، سيتم دمج ddNTPs في كل موضع يحتوي على هذا النوكليوتيد المحدد. يمكن بعد ذلك قراءة الهلام من الأسفل إلى الأعلى ، حيث أن أصغر الأجزاء (تنتهي تلك الأجزاء من الأقرب إلى التمهيدي عند الطرف 5 & # 8242) ستمتد إلى أبعد مسافة في الهلام. تسلسل هذه القطعة هو:

    أصبح من الممكن أتمتة طريقة تسلسل Sanger عندما تم التحول من النيوكليوتيدات الموسومة إشعاعيًا إلى النيوكليوتيدات ذات العلامات الفلورية. داخل أجهزة التسلسل الآلية ، يتم إجراء الفصل الكهربائي للهلام الشعري بدلاً من فصل العينات باستخدام الفصل الكهربائي للهلام. الناتج من الرحلان الكهربائي الشعري هو ذروة تتبع الاستشراب الفلوري (الشكل 5.7). يمكن لأدوات تسلسل الحمض النووي الآلية (متسلسلات الحمض النووي) تسلسل ما يصل إلى 384 عينة من الحمض النووي في دفعة واحدة. قد تحدث عمليات التشغيل المجمعة حتى 24 مرة في اليوم مما يعزز بشكل كبير السرعة التي يمكن بها تسلسل العينات وتحليلها. تتضمن التحديات الشائعة لتسلسل الحمض النووي باستخدام طريقة Sanger جودة رديئة في أول 15-40 قاعدة من التسلسل بسبب ارتباط التمهيدي وتدهور جودة آثار التسلسل بعد 400-500 قاعدة.

    الشكل 5.7 مقارنة جنبًا إلى جنب بين الرحلان الكهربائي للهلام والرحلان الكهربائي الشعري. رسم تخطيطي لليسار يُظهر التصوير الشعاعي التلقائي التقليدي لعينات تسلسل سانجر. ال رسم تخطيطي لليمين يُظهر نفس التفاعلات باستخدام ddNTPs الموسومة الفلورية مفصولة بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري. يظهر إخراج الكروماتوجرام في أقصى اليمين.

    تسلسل سانجر هو الطريقة التي سادت من 1980s حتى

    2005. خلال تلك الفترة ، تم إحراز تقدم كبير في التقنية ، مثل وضع العلامات الفلورية ، والرحلان الكهربائي الشعري ، والأتمتة العامة. سمحت هذه التطورات بتسلسل أكثر كفاءة ، مما أدى إلى انخفاض التكاليف. طريقة سانجر ، في شكل الإنتاج الضخم ، هي التكنولوجيا التي أنتجت أول جينوم بشري في عام 2001 ، إيذانا ببدء عصر علم الجينوم.

    تسلسل موائع جزيئية سانجر

    تسلسل موائع جزيئية سانجر هو أ تطبيق lab-on-a-chip لتسلسل الحمض النووي ، حيث يتم دمج خطوات تسلسل سانجر (الدراجات الحرارية ، وتنقية العينة ، والرحلان الكهربائي الشعري) على شريحة على نطاق رقاقة باستخدام أحجام عينة نانوليتر (الشكل 5.8). تولد هذه التقنية قراءات طويلة ودقيقة للتسلسل ، مع تجنب العديد من أوجه القصور الكبيرة في طريقة Sanger التقليدية (على سبيل المثال ، الاستهلاك العالي للكواشف باهظة الثمن ، والاعتماد على المعدات باهظة الثمن ، والتلاعب المكثف للأفراد ، وما إلى ذلك) من خلال دمج وأتمتة خطوات التسلسل Sanger .

    الشكل 5.8 تقنيات Lab-On-A-Chip. مثال لمختبر ميكروفلويديك على جهاز رقاقة يجلس على طبق من البوليسترين. تعمل إبر الفولاذ المقاوم للصدأ التي يتم إدخالها في الجهاز كنقاط وصول للسوائل إلى القنوات الصغيرة داخل الجهاز ، والتي تكون بحجم شعرة الإنسان تقريبًا.

    تسلسل الجيل القادم

    تسلسل الجيل التالي (NGS) ، المعروف أيضًا باسم التسلسل عالي الإنتاجية ، هو المصطلح الشامل المستخدم لوصف عدد من تقنيات التسلسل الحديثة المختلفة. تسمح هذه التقنيات بتسلسل الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) بسرعة أكبر وبتكلفة أقل بكثير من تسلسل سانجر المستخدم سابقًا ، وبالتالي أحدثت ثورة في دراسة علم الجينوم والبيولوجيا الجزيئية. تشمل هذه التقنيات:

    تسلسل Illumina & # 8211 في NGS ، يتم ترتيب أعداد كبيرة من القراءات القصيرة بضربة واحدة باستخدام تقنية lab-on-a-chip الموصوفة أعلاه. للقيام بذلك ، يجب تقسيم عينة الإدخال إلى أقسام قصيرة. في تسلسل Illumina ، يتم استخدام قراءات 100-150 نقطة أساس. يتم ربط الأجزاء الأطول إلى حد ما بالمحولات العامة وتصلبها إلى شريحة باستخدام المحولات. يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم كل قراءة ، مما يؤدي إلى إنشاء مكان به نسخ عديدة من نفس القراءة. ثم يتم فصلها إلى حمض نووي منفرد تقطعت به السبل ليتم تسلسلها (الشكل 5.9).

    الشكل 5.9 إجراء تسلسل Illumina. (أ) يتم غمر الشريحة مع شظايا PCR المضخمة للحمض النووي بالنيوكليوتيدات وبوليميراز الحمض النووي. يتم تمييز هذه النيوكليوتيدات بشكل فلوري مع كل لون يتوافق مع قاعدة معينة. تحتوي التفاعلات أيضًا على فاصل موجود ، بحيث تتم إضافة قاعدة واحدة فقط في كل مرة. (ب) تؤخذ صورة للشريحة. في كل موقع رد فعل ، ستكون هناك إشارة فلورية تشير إلى أنه تمت إضافة قاعدة معينة. (ج) يتم تسجيل البيانات ثم يتم إعداد الشريحة للدورة التالية. أثناء التحضير ، تتم إزالة أدوات الإنهاء ، مما يسمح بإضافة القاعدة التالية ، ويتم قطع إشارة الفلورسنت ، مما يمنع إشارة الفلورسنت من تلويث الصورة التالية. تتكرر العملية ، بإضافة نيوكليوتيد واحد في كل مرة (G ، A ، T ، أو C) والتصوير بينهما. ستكون جميع قراءات التسلسل بنفس طول إضافة القواعد الفردية في كل دورة.

    روش 454 التسلسليشبه عملية Illumina ولكن يمكنه تسلسل القراءات الأطول بكثير. مثل Illumina ، يقوم بذلك عن طريق تسلسل عدة قراءات مرة واحدة عن طريق قراءة الإشارات الضوئية عند إضافة القواعد.

    كما هو الحال في Illumina ، يتم تجزئة الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي إلى قراءات أقصر ، تصل في هذه الحالة إلى 1 كيلوبايت (1،000 نقطة أساس). تتم إضافة محولات عامة إلى النهايات ويتم تلدينها في الخرز ، جزء واحد من الحمض النووي لكل حبة. يتم بعد ذلك تضخيم الأجزاء بواسطة PCR باستخدام بادئات مخصصة للمهايئ. ثم يتم وضع كل خرزة في بئر شريحة واحدة. لذلك سيحتوي كل بئر على حبة واحدة مغطاة بالعديد من نسخ PCR من تسلسل واحد. تحتوي الآبار أيضًا على بوليميراز الحمض النووي ومخازن للتسلسل (الشكل 5.10).

    5.10 إجراء تسلسل Roche 454. (أ) بمجرد توصيل منتج PCR بالخرز ، تغمر الشريحة بأحد أنواع NTP الأربعة. عندما يكون هذا النيوكليوتيد هو التالي في التسلسل ، فإنه يضاف إلى تسلسل القراءة. إذا تكررت هذه القاعدة الفردية ، فسيتم إضافة المزيد. لذلك إذا غمرنا قواعد Guanine ، والتالي في التسلسل هو G ، فسيتم إضافة G واحد ، ولكن إذا كان الجزء التالي من التسلسل هو GGGG ، فسيتم إضافة أربعة Gs. (ب) تؤدي إضافة كل نوكليوتيد إلى إطلاق إشارة ضوئية. يتم الكشف عن مواقع الإشارات هذه واستخدامها لتحديد الحبيبات التي تمت إضافة النيوكليوتيدات إليها. (ج) يتم غسل مزيج NTP. تمت الآن إضافة مزيج NTP التالي وتكرار العملية ، مع التنقل عبر NTPs الأربعة. ستكون جميع قراءات التسلسل من 454 تسلسلًا بأطوال مختلفة ، لأنه سيتم إضافة أعداد مختلفة من القواعد مع كل دورة.

    أحدث التقنيات مثل تقنية ايون تورنتو ال نظام MinION الكشف عن بيانات التسلسل باستخدام الإشارات الكهربائية على شريحة أشباه الموصلات ، بدلاً من القراءة البصرية للنيوكليوتيدات ذات العلامات الصبغية. هذا ممكن لأن إضافة dNTP إلى بوليمر الحمض النووي يتسبب في إطلاق H + أيون (الشكل 5.11). كما هو الحال في الأنواع الأخرى من NGS ، فإن مدخلات DNA أو RNA مجزأة هذه المرة

    200 نقطة أساس. تضاف المحولات ويوضع جزيء واحد على حبة. يتم تضخيم الجزيئات على الحبة بواسطة مستحلب PCR. يتم وضع كل حبة في بئر واحد للشريحة.

    الشكل 5.11 تقنية تسلسل أيونات السيل. (أ) على غرار التسلسل 454 ، تغمر الشريحة بنوع واحد من dNTP ، جنبًا إلى جنب مع المخازن المؤقتة والبوليميراز. يتم مراقبة الأس الهيدروجيني في كل من الآبار بعد إضافة dNTP المحدد. سينخفض ​​الأس الهيدروجيني عندما يتم دمج dNTP في البوليمر مما يتسبب في إطلاق بروتون (H +). تسمح لنا التغييرات في الرقم الهيدروجيني بتحديد ما إذا كانت تلك القاعدة وعددها قد أضيفت إلى تسلسل القراءة. (ب) يتم غسل dNTPs وتكرار العملية بالدورة عبر أنواع dNTP المختلفة. (ج) يتم استخدام تغيير الرقم الهيدروجيني ، إن وجد ، لتحديد عدد القواعد (إن وجدت) التي تمت إضافتها مع كل دورة.

    مثل هذه التقنيات الأيونية التي لا تتطلب الكشف البصري ، قد مكنت من إنتاج أجهزة تسلسل الحمض النووي المحمولة الصغيرة التي يمكن توصيلها بمحرك USB على كمبيوتر محمول واستخدامها في الميدان في ظل ظروف التجميع في الوقت الفعلي (الشكل 5.12).

    الشكل 5.12 جهاز التسلسل في الوقت الحقيقي المحمول MinION. يمكن لجهاز MinION إنتاج ما يصل إلى 30 جيجا بايت من بيانات تسلسل الحمض النووي لكل عينة

    المزايا الأربع الرئيسية لـ NGS على تسلسل Sanger الكلاسيكي هي:

    حجم العينة

    NGS أرخص بكثير وأسرع وتحتاج إلى حمض نووي أقل بكثير وهي أكثر دقة وموثوقية من تسلسل سانجر. دعونا ننظر إلى هذا عن كثب. لتسلسل سانجر ، هناك حاجة إلى كمية كبيرة من قالب الحمض النووي لكل قراءة. هناك حاجة إلى عدة خيوط من الحمض النووي للقالب لكل قاعدة يتم تسلسلها (على سبيل المثال ، بالنسبة لتسلسل 100 نقطة بت ، تحتاج & # 8217d إلى عدة مئات من النسخ ، لتسلسل 1000 بت في الثانية ، تحتاج & # 8217d إلى عدة آلاف من النسخ) ، حيث أن الشريط الذي ينتهي عند كل قاعدة هو اللازمة لبناء تسلسل كامل. في NGS ، يمكن الحصول على تسلسل من حبلا واحد. في كلا النوعين من التسلسل ، يتم أخذ نسخ متعددة متداخلة من أجل البناء المستمر والتحقق من صحة التسلسل.

    NGS أسرع من تسلسل سانجر بطريقتين. أولاً ، يمكن دمج التفاعل الكيميائي مع كشف الإشارة في بعض إصدارات NGS ، بينما في تسلسل Sanger ، هاتان عمليتان منفصلتان. ثانيًا ، والأهم من ذلك ، قراءة واحدة فقط (الحد الأقصى

    1kb) في وقت واحد في تسلسل Sanger ، في حين أن NGS متوازية بشكل كبير ، مما يسمح بقراءة 300 جيجا بايت من الحمض النووي على تشغيل واحد على شريحة واحدة.

    يعني تقليل الوقت والقوى العاملة والكواشف في NGS أن التكاليف أقل بكثير. تكلف أول تسلسل للجينوم البشري في المنطقة 2.7 مليار دولار في عام 2003. وباستخدام طرق Sanger الحديثة للتسلسل ، بمساعدة بيانات من التسلسل المعروف ، لا يزال الجينوم البشري الكامل يكلف 300000 دولار في عام 2006. تسلسل الجينوم البشري باستخدام NGS اليوم يكلف حوالي 1000 دولار.

    تعد التكرارات جوهرية في NGS ، حيث يتم تضخيم كل قراءة قبل التسلسل ، ولأنها تعتمد على العديد من القراءات القصيرة المتداخلة ، لذلك يتم تسلسل كل قسم من DNA أو RNA عدة مرات. أيضًا ، نظرًا لأنه أسرع وأرخص بكثير ، فمن الممكن إجراء عمليات تكرار أكثر من إجراء تسلسل Sanger. يعني المزيد من التكرارات تغطية أكبر ، مما يؤدي إلى تسلسل أكثر دقة وموثوقية ، حتى لو كانت القراءات الفردية أقل دقة لـ NGS.

    يمكن استخدام تسلسل Sanger لإعطاء قراءات تسلسلية أطول بكثير. ومع ذلك ، فإن الطبيعة الموازية لـ NGS تعني أنه يمكن تكوين القراءات الأطول من العديد من القراءات القصيرة المتجاورة.

    تقنيات تخليق الحمض النووي

    تخليق الحمض النووي هو الخلق الطبيعي أو الاصطناعي لجزيئات الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA). يمكن أن يشير مصطلح تخليق الحمض النووي تكرار الحمض النووي (والتي سيتم تناولها بمزيد من التفصيل في الفصل العشرون) ، تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)أو التوليف الجيني (إنشاء تسلسل جيني اصطناعي فيزيائيًا).

    تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

    يشير تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) إلى تقنية مستخدمة على نطاق واسع في العلوم الأساسية والطبية الحيوية. PCR هي تقنية معملية تستخدم لتضخيم أجزاء معينة من الحمض النووي لمجموعة واسعة من التطبيقات المختبرية و / أو السريرية. بناءً على عمل بانيت و Khorana الناجح في تضخيم الحمض النووي في المختبر، قام كاري موليس وزملاؤه بتطوير PCR في أوائل الثمانينيات ، بعد أن حصلوا على جائزة نوبل بعد عقد واحد فقط. من خلال السماح بتضخيم أكثر من مليار ضعف لمناطق مستهدفة محددة ، أصبح مفيدًا في العديد من التطبيقات بما في ذلك استنساخ الجينات وتشخيص الأمراض المعدية وفحص الأطفال قبل الولادة بحثًا عن تشوهات وراثية ضارة.

    الأساسيات

    المكونات الرئيسية لـ PCR هي القالب ، والبادئات ، وقواعد النوكليوتيدات الحرة ، وإنزيم بوليميريز الحمض النووي. ال قالب الحمض النووييحتوي على المنطقة المحددة التي ترغب في تضخيمها ، مثل الحمض النووي المستخرج من قطعة من الشعر على سبيل المثال. الاشعال، أو oligonucleotides ، عبارة عن خيوط قصيرة من الحمض النووي أحادي السلسلة مكمل للنهاية 3 & # 8242 لكل منطقة مستهدفة. كل من التمهيدي الأمامي والخلفي مطلوبان ، واحد لكل خيط مكمل من الحمض النووي. بوليميريز الحمض النووي هو الإنزيم الذي ينفذ تكاثر الحمض النووي. تعتبر نظائرها الحرارية لبوليميراز الحمض النووي I ، مثل Taq polymerase ، الذي تم العثور عليه في الأصل في بكتيريا تنمو في الينابيع الساخنة ، خيارًا شائعًا نظرًا لمقاومتها لدورات التسخين والتبريد اللازمة لـ PCR.

    يستفيد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من الاقتران الأساسي التكميلي والطبيعة المزدوجة الشريطة ودرجة حرارة انصهار جزيئات الحمض النووي. تتضمن هذه العملية التدوير من خلال 3 جولات متتالية من التفاعلات المعتمدة على درجة الحرارة: ذوبان الحمض النووي (تمسخ) ، التلدين وتكرار الحمض النووي (الاستطالة) الذي يحركه الإنزيم. تمسخيبدأ بتسخين التفاعل إلى حوالي 95 درجة مئوية ، مما يؤدي إلى تعطيل الروابط الهيدروجينية التي تربط شريطين قالب الحمض النووي معًا. بعد ذلك ، يتم تقليل التفاعل إلى حوالي 50 إلى 65 درجة مئوية ، اعتمادًا على المتغيرات الفيزيائية والكيميائية للبادئات ، مما يتيح التلدينمن أزواج القواعد التكميلية. البادئات ، التي تضاف إلى المحلول الزائد ، ترتبط ببداية 3 & # 8242 نهاية كل خيط قالب وتمنع إعادة تهجين خيط القالب بنفسه. أخيرًا ، استنساخ الحمض النووي الذي يحركه الإنزيم ، أو استطالة، يبدأ من خلال ضبط درجة حرارة التفاعل على المقدار الذي يحسن نشاط بوليميريز الحمض النووي ، والذي يتراوح بين 75 إلى 80 درجة مئوية. تجميع النيوكليوتيدات الحرة في محلول في الاتجاه 3 & # 8242 إلى 5 & # 8242 لإنتاج مجموعتين كاملتين من الخيوط التكميلية. أصبح الحمض النووي المركب حديثًا متطابقًا الآن مع حبلا القالب وسيتم استخدامه على هذا النحو في دورات PCR التقدمية (فيديو 5.1).

    فيديو 5.1: تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). (1) خطوات عملية PCR التقليدية. (2) كشف الفلوروفور غير المحدد في qPCR ، و (3) كشف مسبار التهجين المحدد في qPCR.

    بالنظر إلى أن خيوط الحمض النووي المركبة مسبقًا تعمل كقوالب ، فإن تضخيم الحمض النووي باستخدام PCR يزداد بمعدل أسي ، حيث تتضاعف نسخ الحمض النووي في نهاية كل خطوة تكرار. في النهاية ، يصل التكاثر الأسي للحمض النووي المستهدف إلى حوالي 30 إلى 40 دورة ويرجع ذلك أساسًا إلى قيود الكاشف ، ولكن يمكن أن يكون أيضًا بسبب مثبطات تفاعل البوليميراز الموجود في العينة ، والتلدين الذاتي للمنتج المتراكم ، وتراكم جزيئات البيروفوسفات.

    عند ظهورها ، اقتصرت تقنية PCR على التحليل النوعي أو شبه الكمي بسبب القيود المفروضة على القدرة على تقدير الأحماض النووية. في ذلك الوقت ، للتحقق مما إذا كان الجين المستهدف قد تم تضخيمه بنجاح ، تم فصل منتج الحمض النووي بالحجم عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. يمكن أن يعطي إيثيديوم بروميد ، وهو جزيء يتألق عندما يرتبط بـ dsDNA ، تقديرًا تقريبيًا لكمية الحمض النووي عن طريق مقارنة سطوع النطاقات المنفصلة تقريبًا ، ولكنه لم يكن حساسًا بدرجة كافية لإجراء تحليل كمي صارم.

    أدت التحسينات في تطوير الفلوروفور والأجهزة إلى معالجات حرارية لم تعد تتطلب قياس الحمض النووي للمنتج النهائي فقط. هذه العملية ، والمعروفة باسم الوقت الحقيقي PCR ،أو PCR الكمي (qPCR) ، سمح باكتشاف dsDNA أثناء التضخيم. تم تجهيز المعالجات الحرارية qPCR بالقدرة على إثارة الفلوروفورات بأطوال موجية محددة ، واكتشاف انبعاثها باستخدام كاشف ضوئي ، وتسجيل القيم. عززت المجموعة الحساسة للقيم العددية أثناء التضخيم بقوة التحليل الكمي.

    هناك نوعان رئيسيان من الفلوروفورات المستخدمة في qPCR: تلك التي ترتبط على وجه التحديد بتسلسل هدف معين وتلك التي لا ترتبط. كانت حساسية الفلوروفور جانبًا مهمًا من جوانب تطوير qPCR. واحدة من العلامات غير المحددة الأكثر فاعلية والمستخدمة على نطاق واسع ، SYBR Green ، بعد الارتباط بالأخدود الصغير لـ dsDNA ، تُظهر زيادة في التألق بمقدار 1000 ضعف مقارنة بكونها مجانية في المحلول (فيديو 5.1). ومع ذلك ، في حالة الرغبة في المزيد من التحديد ، يمكن إضافة أوليغنوكليوتيد خاص بالتسلسل ، أو مسبار التهجين ، والذي يرتبط بالجين المستهدف في نقطة ما أمام التمهيدي (بعد نهاية 3 & # 8242). تحتوي مجسات التهجين هذه على جزيء مراسل في الطرف 5 & # 8242 وجزيء تقطير في الطرف 3 & # 8242. يمنع جزيء التبريد بشكل فعال المراسل من التألق بينما يكون المسبار سليمًا. ومع ذلك ، عند ملامسة بوليميراز الحمض النووي I ، يتم شق مسبار التهجين ، مما يسمح بتألق الصبغة (فيديو 5.1).

    عكس النسخ PCR

    منذ ظهورها ، تم توسيع تقنية PCR بشكل إبداعي و النسخ العكسي PCR (RT-PCR) هو أحد أهم التطورات. كثيرًا ما يتم الخلط بين تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي وبين النسخ العكسي لـ PCR ، لكنهما تقنيات منفصلة. في RT-PCR ، يتم اشتقاق الحمض النووي المتضخم من mRNA باستخدام إنزيمات النسخ العكسي ، لإنتاج نسخة cDNA من الجين. باستخدام متواليات البادئات للجينات ذات الأهمية ، يمكن استخدام طرق PCR التقليدية مع (كدنا) لدراسة التعبير عن الجينات نوعيًا. حاليًا ، يتم استخدام PCR النسخ العكسي بشكل شائع مع PCR في الوقت الفعلي ، والذي يسمح للمرء بقياس التغيير النسبي في التعبير الجيني عبر عينات مختلفة كميًا.

    مواضيع الاهتمام

    إحدى عيوب تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل هي أنها حساسة للغاية. يمكن أن تؤدي الكميات الضئيلة من تلوث الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي في العينة إلى نتائج مضللة للغاية. عيب آخر هو أن البادئات المصممة لـ PCR تتطلب بيانات متسلسلة ، وبالتالي لا يمكن استخدامها إلا لتحديد وجود أو عدم وجود مسببات الأمراض أو الجينات المعروفة. القيد الآخر هو أنه في بعض الأحيان يمكن للبادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل أن تصلب بشكل غير محدد للتسلسلات التي تشبه الجين المستهدف ولكنها ليست متطابقة.

    هناك مشكلة أخرى محتملة لاستخدام PCR وهي إمكانية تكوين ثنائي التمهيدي (PD). PD هو منتج ثانوي محتمل ويتكون من جزيئات أولية تم تهجينها مع بعضها البعض بسبب سلاسل القواعد التكميلية في البادئات. يضخم بوليميراز الحمض النووي PD ، مما يؤدي إلى التنافس على كواشف PCR التي يمكن استخدامها لتضخيم التسلسلات المستهدفة.

    الأهمية السريرية

    يعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل أداة لا غنى عنها مع تطبيقات مختلفة في الطب. في كثير من الأحيان ، يتم استخدامه لاختبار وجود أليلات معينة ، كما هو الحال في حالة فحص الوالدين المحتملين للحوامل الجينية ، ولكن يمكن أيضًا استخدامه لتشخيص وجود المرض بشكل مباشر وللتشخيص في حدوث طفرات في الجنين النامي. على سبيل المثال ، كانت المرة الأولى التي تم فيها استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بهذه الطريقة لتشخيص فقر الدم المنجلي من خلال الكشف عن طفرة جينية واحدة.

    بالإضافة إلى ذلك ، أحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ثورة كبيرة في القدرة التشخيصية للأمراض المعدية ، حيث يمكن استخدامه لتحديد هوية الميكروبات التي لم يكن من الممكن استزراعها تقليديًا ، أو التي تطلبت أسابيع للنمو. تشمل العوامل الممرضة التي يتم اكتشافها بشكل روتيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، المتفطرة السلية ، وفيروس نقص المناعة البشرية ، وفيروس الهربس البسيط ، والزهري ، والعديد من مسببات الأمراض الأخرى. علاوة على ذلك ، لا يتم استخدام qPCR فقط لاختبار الوجود النوعي للميكروبات ولكن أيضًا لتحديد الأحمال البكتيرية والفطرية والفيروسية.

    تحسنت حساسية أدوات التشخيص للطفرات في الجينات المسرطنة والجينات المثبطة للورم بما لا يقل عن 10000 ضعف بسبب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يسمح بالتشخيص المبكر للسرطانات مثل اللوكيميا. أتاح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أيضًا علاجات أكثر دقة وفردية لمرضى السرطان. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في تصنيف الأنسجة الذي يعد أمرًا حيويًا لزرع الأعضاء ، وقد تم اقتراحه أيضًا كبديل للاختبارات القائمة على الأجسام المضادة لفصيلة الدم. يحتوي تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضًا على تطبيقات سريرية في مجال الاختبارات السابقة للولادة لمختلف الأمراض الوراثية و / أو الأمراض السريرية. يتم الحصول على العينات إما عن طريق بزل السائل الأمنيوسي أو أخذ عينة من خلايا المشيمة.

    في الطب الشرعي ، يتم تضخيم قطع قصيرة من الحمض النووي التكراري متعدد الأشكال للغاية ، والتكرار الترادفي القصير المصاغ (STRs) ، واستخدامها لمقارنة التباين المحدد داخل الجينات للتمييز بين الأفراد. يتم استخدام مواد أولية محددة لمواقع تقارير المعاملات المشبوهة هذه وتضخيمها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. تحتوي المواقع المختلفة على تقارير المعاملات المشبوهة في الجينوم البشري ، ويتم تعزيز القوة الإحصائية لهذه التقنية عن طريق فحص مواقع متعددة.

    التوليف الجيني

    التوليف الجيني الاصطناعي، يُعرف أحيانًا باسم طباعة الحمض النووي هي طريقة في البيولوجيا التركيبية تُستخدم لإنشاء جينات اصطناعية في المختبر. استنادًا إلى تخليق الحمض النووي للطور الصلب ، يختلف عن الاستنساخ الجزيئي وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في أنه لا يجب أن يبدأ بتسلسلات الحمض النووي الموجودة مسبقًا. لذلك ، من الممكن صنع جزيء DNA مزدوج الشريطة اصطناعي بالكامل بدون حدود واضحة على تسلسل أو حجم النوكليوتيدات.

    تم استخدام هذه الطريقة لتوليد كروموسومات بكتيرية أو خميرة وظيفية تحتوي على ما يقرب من مليون زوج قاعدي. يمكن أن يؤدي إنشاء أزواج جديدة من القاعدة النووية بالإضافة إلى الزوجين الأساسيين في الطبيعة إلى توسيع الشفرة الجينية بشكل كبير.

    تم عرض توليف أول جين كامل ، وهو عبارة عن خميرة tRNA ، بواسطة Har Gobind Khorana وزملاؤه في عام 1972. تم إجراء توليف أول جينات ترميز الببتيد والبروتين في مختبرات هربرت بوير وألكسندر ماركهام ، على التوالي.

    خدمات تصنيع الجينات التجارية متاحة الآن. غالبًا ما تعتمد المناهج على مزيج من تقنيات الكيمياء العضوية والبيولوجيا الجزيئية ويمكن تصنيع الجينات بأكملها & # 8220de novo & # 8221 ، دون الحاجة إلى قالب DNA. يعد التوليف الجيني أداة مهمة في العديد من مجالات تقنية الحمض النووي المؤتلف بما في ذلك التعبير الجيني غير المتجانسة وتطوير اللقاح والعلاج الجيني والهندسة الجزيئية. يمكن أن يكون تخليق تسلسل الحمض النووي أكثر اقتصادا من إجراءات الاستنساخ والطفرات التقليدية. وهي أيضًا أداة هندسية قوية ومرنة لإنشاء وتصميم تسلسلات جديدة للحمض النووي ووظائف البروتين.

    تحسين الجينات

    في حين أن القدرة على عمل امتدادات طويلة بشكل متزايد من الحمض النووي بكفاءة وبأسعار منخفضة هي المحرك التكنولوجي لهذا المجال ، يتركز الاهتمام بشكل متزايد على تحسين تصميم الجينات لأغراض محددة. في وقت مبكر من عصر تسلسل الجينوم ، تم استخدام التخليق الجيني كمصدر (مكلف) لـ cDNAs التي تم التنبؤ بها بواسطة معلومات cDNA الجينية أو الجزئية ولكن كان من الصعب استنساخها. مع توفر مصادر عالية الجودة للتسلسل الذي تم التحقق منه (كدنا) المستنسخة ، أصبحت هذه الممارسة أقل إلحاحًا.

    قد يكون إنتاج كميات كبيرة من البروتين من تسلسل الجينات (أو على الأقل مناطق ترميز البروتين للجينات ، إطار القراءة المفتوح) الموجودة في الطبيعة أمرًا صعبًا في بعض الأحيان وهي مشكلة ذات تأثير كافٍ حيث تم تخصيص المؤتمرات العلمية للموضوع. عادة ما يتم تنظيم العديد من البروتينات الأكثر إثارة للاهتمام التي يبحث عنها علماء الأحياء الجزيئية بحيث يتم التعبير عنها بكميات منخفضة جدًا في الخلايا البرية. تقدم إعادة تصميم هذه الجينات وسيلة لتحسين التعبير الجيني في كثير من الحالات. إعادة كتابة إطار القراءة المفتوحة ممكنة بسبب انحطاط الشيفرة الجينية. وبالتالي من الممكن تغيير ما يصل إلى حوالي ثلث النيوكليوتيدات في إطار قراءة مفتوح مع استمرار إنتاج نفس البروتين. العدد المتاح للتصميمات البديلة الممكنة لبروتين معين فلكي. للحصول على تسلسل بروتيني نموذجي يتكون من 300 حمض أميني ، هناك أكثر من 10 150 مجموعة كودون ترميز بروتينًا متطابقًا. إن تحسين Codon ، أو استبدال الكودونات التي نادرًا ما تستخدم بكودونات أكثر شيوعًا ، يكون لها أحيانًا تأثيرات دراماتيكية. يمكن أيضًا تضمين مزيد من التحسينات مثل إزالة الهياكل الثانوية للحمض النووي الريبي. على الأقل في حالة بكتريا قولونية، يتم تعظيم تعبير البروتين عن طريق استخدام الكودونات المقابلة لـ tRNA التي تحتفظ بشحن الأحماض الأمينية أثناء الجوع. برامج الكمبيوتر المكتوبة لأداء هذه ، وغيرها من التحسينات المتزامنة تستخدم للتعامل مع التعقيد الهائل للمهمة. يمكن للجين المُحسَّن جيدًا تحسين تعبير البروتين من 2 إلى 10 أضعاف ، وفي بعض الحالات تم الإبلاغ عن أكثر من 100 ضعف. بسبب الأعداد الكبيرة من التغييرات النوكليوتيدية التي تم إجراؤها على تسلسل الحمض النووي الأصلي ، فإن الطريقة العملية الوحيدة لإنشاء الجينات المصممة حديثًا هي استخدام التوليف الجيني.

    تخليق قليل النوكليوتيد

    يتم تصنيع قليل النوكليوتيدات كيميائيًا باستخدام لبنات بناء تسمى نيوكليوزيد فوسفوراميديت. يمكن أن تكون هذه نيوكليوسيدات طبيعية أو معدلة لها مجموعات حماية تمنع تفاعل الأمينات ومجموعات الهيدروكسيل ومجموعات الفوسفات بشكل غير صحيح. تتم إضافة فوسفوراميديت واحد في كل مرة ، ويتم إزالة مجموعة الهيدروكسيل 5 & # 8242 وإضافة قاعدة جديدة وما إلى ذلك. تنمو السلسلة في الاتجاه 3 & # 8242 إلى 5 & # 8242 ، وهو اتجاه عكسي بالنسبة إلى التخليق الحيوي للحمض النووي في الجسم الحي. في النهاية ، تتم إزالة جميع المجموعات الحامية.

    الشكل 5.13 دورة تخليق فوسفوراميديت من أربع خطوات. إن طريقة الفوسفوراميديت ، التي ابتكرها مارفن كاروثرز في أوائل الثمانينيات ، وعُزِّزت من خلال تطبيق تكنولوجيا المرحلة الصلبة والأتمتة ، أصبحت الآن طريقة راسخة في الاختيار. يستمر تخليق أليغنوكليوتيد الفوسفوراميديت في الاتجاه من 3 إلى 5 (عكس اتجاه 5 إلى 3 للتخليق الحيوي للحمض النووي في تكرار الحمض النووي). يضاف نوكليوتيد واحد لكل دورة تخليق. تتكون دورة تخليق الحمض النووي للفوسفوراميديت من سلسلة من الخطوات الموضحة في الشكل

    ومع ذلك ، لكونها عملية كيميائية ، تحدث العديد من التفاعلات غير الصحيحة مما يؤدي إلى بعض المنتجات المعيبة. كلما طالت مدة تصنيع تسلسل قليل النوكليوتيدات ، زاد عدد العيوب الموجودة ، وبالتالي فإن هذه العملية عملية فقط لإنتاج متواليات قصيرة من النيوكليوتيدات. يبلغ الحد العملي الحالي حوالي 200 نقطة أساس (أزواج قاعدية) للأوليغنوكليوتيد بجودة كافية لاستخدامها مباشرة في التطبيقات البيولوجية. يمكن استخدام HPLC لعزل المنتجات بالتسلسل الصحيح. وفي الوقت نفسه ، يمكن تصنيع عدد كبير من الأوليجوس بالتوازي على رقائق الجينات. للحصول على الأداء الأمثل في إجراءات التوليف الجيني اللاحقة ، يجب تحضيرها بشكل فردي وفي نطاقات أكبر.

    تخليق الحمض النووي والبيولوجيا التركيبية

    أدى الانخفاض الكبير في تكلفة تخليق الجينات في السنوات الأخيرة بسبب المنافسة المتزايدة للشركات التي تقدم هذه الخدمة إلى القدرة على إنتاج بلازميدات بكتيرية كاملة لم تكن موجودة في الطبيعة. يستخدم مجال البيولوجيا التركيبية التكنولوجيا لإنتاج دوائر بيولوجية اصطناعية ، وهي عبارة عن امتدادات من الحمض النووي يتم التلاعب بها لتغيير التعبير الجيني داخل الخلايا وتسبب في إنتاج الخلية للمنتج المطلوب.

    ستمكن القدرة على إنتاج الحمض النووي الصناعي من تطوير المنتجات البيئية والطبية والتجارية ذات الصلة. على سبيل المثال ، في عام 2015 ، قامت شركة Novartis بالتعاون مع شركة Synthetic Genomics Vaccines inc. وأعلنت الهيئة الأمريكية للبحث والتطوير في مجال الطب الحيوي المتقدم ، أنهما قد ابتكرتا بشكل فعال لقاح إنفلونزا DNA الاصطناعي. لقاحات الدنا الاصطناعية الجديدة تبشر بتوفير بديل للقاحات التقليدية الحالية المنتجة من البيض والتي يمكن أن تعاني من انخفاض الفعالية.

    لقاحات الحمض النووي قادرة على تجنب العديد من المشكلات المرتبطة بإنتاج لقاح قائم على البيض عن طريق إنتاج بروتينات فيروسية داخل الخلايا المضيفة. لإنشاء لقاح DNA ، يتم استنساخ الجين المشفر للمستضد في بلازميد تعبير غير متماثل ، والذي يتم تسليمه إلى المضيف عن طريق طرق التطعيم التقليدية. تعبر الخلايا المضيفة التي تتناول البلازميد عن مستضد اللقاح الذي يمكن تقديمه للخلايا المناعية عبر مسارات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC). يعد تنشيط الخلايا المساعدة CD4 + T بعد عرض MHC من الدرجة الثانية لبروتين لقاح الحمض النووي المفرز أمرًا بالغ الأهمية لإنتاج الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد (الشكل 5.14).

    الشكل 5.14 إنشاء لقاح DNA. يتم تصنيع الجين المستضدي واستنساخه في ناقل بلازميد. (تم وصف الخطوات المتعلقة بعملية الاستنساخ بمزيد من التفصيل في القسم 5.3). يتم تسليم لقاح الحمض النووي إلى المضيف ، حيث سيتم التعبير عنه لإنتاج مستضد وتقديمه إلى جهاز المناعة المضيف.

    بعد عقدين من البحث ، تكتسب تقنية لقاح الحمض النووي مرحلة النضج - تم ترخيص العديد من لقاحات الحمض النووي البيطرية حاليًا لفيروس غرب النيل وسرطان الجلد ، وبشكل ملحوظ ، تمت الموافقة مؤخرًا على أول لقاح تجاري للحمض النووي ضد H5N1 في الدجاج من قبل وزارة الزراعة الأمريكية. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم التجارب الكبيرة الجارية على الحيوانات لقاحات الحمض النووي ضد أمراض أخرى مثل فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد وفيروس زيكا رؤى قيمة يمكن تطبيقها على تصميم لقاح إنفلونزا الحمض النووي. نشأت مناهج واعدة من الدراسات العديدة التي تقيم تركيبات مختلفة من لقاح الدنا وأنظمة توصيله ، ولكن لم تظهر بعد استراتيجية تحمي باستمرار من الإنفلونزا في النماذج الحيوانية الكبيرة. يظل التسليم الناجح للبلازميد واستخدام المواد المساعدة المناسبة من التحديات الرئيسية التي يجب معالجتها قبل أن تصبح لقاحات DNA الإنفلونزا فعالة للاستخدام البشري.

    5.2 المعلوماتية الحيوية

    لقد لوحظت ثورة غير مسبوقة في العلوم مع التطورات التكنولوجية الحديثة ، والتي قدمت كمية كبيرة من البيانات "omic". كان جيل الهلال وتوفر هذه المعلومات المتوفرة في قواعد البيانات العامة ، ولا يزال ، يمثل تحديًا للمهنيين من مختلف المجالات. ومع ذلك ، ما هو التحدي؟ في علم الأحياء ، يتمثل التحدي الرئيسي في فهم الكم الهائل من البيانات الهيكلية والتسلسلات التي تم إنشاؤها على مستويات متعددة من الأنظمة البيولوجية. ومع ذلك ، في المعلوماتية الحيوية ، من الضروري تطوير أدوات (إحصائية وحسابية) قادرة على المساعدة في فهم الآليات الكامنة وراء الأسئلة البيولوجية في الدراسة. علاوة على ذلك ، إذا أخذنا في الاعتبار تعقيد العلم ، فهذه وجهة نظر اختزالية للغاية. يظهر عصر "علم الأحياء الجديد" مصحوبًا بولادة / تطور علوم أخرى ، مثل المعلوماتية الحيوية وعلم الأحياء الحسابي ، والتي لها واجهة متكاملة للبيولوجيا الجزيئية. على الرغم من اعتبارها مؤخرًا ، فقد تطورت المعلوماتية الحيوية والجينوميات بشكل مترابط وعززت تأثيرًا تاريخيًا على المعرفة المتاحة.

    المعلوماتية الحيوية ، علم هجين يربط البيانات البيولوجية بتقنيات تخزين المعلومات وتوزيعها وتحليلها لدعم مجالات متعددة من البحث العلمي بما في ذلك الطب الحيوي. وهي تشمل بشكل أساسي البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة وعلوم الكمبيوتر والرياضيات والإحصاء. يتم معالجة المشكلات البيولوجية كثيفة البيانات وواسعة النطاق من وجهة نظر حسابية. يتم تغذية المعلوماتية الحيوية من خلال تجارب توليد البيانات عالية الإنتاجية ، بما في ذلك تحديد التسلسل الجيني وقياسات أنماط التعبير الجيني. تقوم مشاريع قواعد البيانات برعاية البيانات والتعليق عليها ثم توزيعها عبر شبكة الويب العالمية. يؤدي التنقيب عن هذه البيانات إلى اكتشافات علمية وتحديد تطبيقات إكلينيكية جديدة.

    عادة ما يتضمن حل المعلوماتية الحيوية الخطوات التالية:

    • جمع الإحصائيات من البيانات البيولوجية
    • بناء نموذج حسابي
    • حل مشكلة النمذجة الحسابية
    • اختبار وتقييم الخوارزمية الحسابية

    كما تتناول الجوانب التالية:

    • أنواع المعلومات وقواعد البيانات البيولوجية
    • تحليل التسلسل والنمذجة الجزيئية
    • التحليل الجينومي
    • بيولوجيا النظم

    في مجال الطب على وجه الخصوص ، تم اكتشاف عدد من التطبيقات الهامة للمعلوماتية الحيوية. على سبيل المثال ، يتم استخدامه لتحديد الارتباطات بين تسلسل الجينات والأمراض ، للتنبؤ بتركيبات البروتين من تسلسل الأحماض الأمينية ، للمساعدة في تصميم أدوية جديدة ، ولتخصيص العلاجات للمرضى الفرديين بناءً على تسلسل الحمض النووي الخاص بهم (علم الصيدلة الجيني). في المعلوماتية الحيوية ، يمكننا الآن إجراء تحليلات عالمية لجميع البيانات المتاحة بهدف الكشف عن المبادئ المشتركة التي تنطبق عبر العديد من الأنظمة وتسليط الضوء على الميزات الجديدة.

    فيما يلي بعض تطبيقات المعلوماتية الحيوية في التكنولوجيا الحيوية:

    علم الجينوم

    لإدارة كمية متزايدة من المعلومات الجينومية ، فإن أدوات المعلومات الحيوية مطلوبة للحفاظ على تسلسل الحمض النووي من كائن حي مختلف وتحليله.تحديد تجانس التسلسل ، وإيجاد الجينات ، وتحديد منطقة الترميز ، والتحليلات الهيكلية والوظيفية للتسلسلات الجينية ، إلخ ، كل هذا ممكن عن طريق استخدام أدوات المعلومات الحيوية المختلفة وحزم البرامج.

    فيما يلي قائمة ببعض أدوات المعلوماتية الحيوية المستخدمة في علم الجينوم (الجدول 5.1).

    الجدول 5.1 أدوات / قواعد بيانات المعلوماتية الحيوية المستخدمة في علم الجينوم

    أدوات المعلوماتية الحيوية غرض
    كاري قاعدة بيانات الشبكات التنظيمية النسخية
    CisML أداة الكشف عن الحافز
    ICSF تحديد السمات الهيكلية المحفوظة في مواقع ربط TF
    الأبوسوم أداة للبحث عن الحافز
    المروج أداة استخراج المروج من الكائنات حقيقية النواة
    REPFIND تحديد التكرارات العنقودية في جزء الحمض النووي
    الكتلة ، المغفل أداة للتنبؤ بالعناصر العنقودية في تسلسل الحمض النووي
    سيستر يجد المناطق التنظيمية في شظايا الحمض النووي
    زهرة البرسيم ابحث عن الأشكال التي تم تمثيلها بشكل كبير في تسلسل الحمض النووي
    جلام أداة للتنبؤ بالزخارف الوظيفية
    MotifViz تحديد الزخارف الممثلة بشكل زائد
    NECorr أداة لتحليل بيانات التعبير الجيني
    روفر يتنبأ بزخارف تم تمثيلها بشكل مفرط في شظايا الحمض النووي
    SeqVISTA أداة عارض التسلسل
    DNADynamo أداة للعثور على عوامل النسخ مع مواقع ربط أكثر من تمثيل في مناطق المنبع للجينات البشرية المعبر عنها بشكل مشترك

    علم الجينوم المقارن

    تلعب المعلوماتية الحيوية دورًا مهمًا في علم الجينوم المقارن من خلال تحديد العلاقة الهيكلية والوظيفية الجينومية بين الأنواع البيولوجية المختلفة.

    فيما يلي قائمة ببعض أدوات المعلوماتية الحيوية المستخدمة في علم الجينوم المقارن (الجدول 5.2).

    الجدول 5.2 أدوات / قواعد بيانات المعلوماتية الحيوية المستخدمة في علم الجينوم المقارن

    أدوات المعلوماتية الحيوية غرض
    انفجار أداة محاذاة تسلسل الحمض النووي أو البروتين
    هامر أداة البحث عن تسلسل البروتين المتماثل
    أوميغا كلوستال أداة محاذاة تسلسل متعددة
    متسلسل أداة إنشاء ملفات تعريف التسلسل
    بروتبارام يتنبأ بالخصائص الفيزيائية والكيميائية للبروتينات
    نوفو يتنبأ بطفرة نقطة واحدة في تسلسل الحمض النووي
    الباحث عن ORF ابحث عن إطار قراءة مفتوح في الجينات المفترضة
    البصمة الافتراضية تحليل جينوم بدائية النواة بالكامل
    WebGeSTer يتنبأ بمواقع إنهاء الجينات أثناء النسخ
    جينسكان ابحث عن مواقع exon-intron في تسلسل الحمض النووي
    أدوات سوفت بيري أداة شرح الجينوم جنبًا إلى جنب مع هيكل ووظيفة التنبؤ بالجزيئات البيولوجية
    ميجا دراسة العلاقة التطورية
    مولفي أداة تحليل النشوء والتطور القائمة على الاحتمالية القصوى
    PHYLIP أداة لدراسات النشوء والتطور
    JStree أداة لعرض وتحرير الأشجار النشوء والتطور
    جالفيو إنها أداة تحرير المحاذاة
    بنك بيانات الحمض النووي في اليابان موارد لتسلسل النوكليوتيدات
    رفام تحتوي قاعدة البيانات على مجموعة من عائلات الحمض النووي الريبي
    يوني بروت قاعدة بيانات تسلسل البروتين
    بنك بيانات البروتين توفر قاعدة البيانات بيانات عن هياكل الأحماض النووية والبروتينات وما إلى ذلك
    سويس بروت قاعدة بيانات تحتوي على تسلسل البروتين المشروح يدويًا
    InterPro توفير معلومات عن عائلات البروتين ، والمجالات المحفوظة والمواقع النشطة
    قاعدة بيانات تعريف البروتيوميات يحتوي على بيانات عن التوصيف الوظيفي وتعديل ما بعد الترجمة للبروتينات والببتيدات
    فرقة قاعدة بيانات تحتوي على جينومات مشروحة لحقيقيات النوى بما في ذلك الإنسان والفأر والفقاريات الأخرى
    مدرب قاعدة بيانات للأعشاب الطبية

    البروتيوميات:

    أدت التقنيات الجزيئية المتقدمة إلى تراكم البيانات البروتينية الضخمة لأنماط نشاط البروتين ، والتفاعلات ، والتنميط ، والتكوين ، والمعلومات الهيكلية ، وتحليل الصور ، وبصمة كتلة الببتيد ، وبصمات تجزئة الببتيد ، إلخ. يمكن إدارة هذه البيانات الهائلة باستخدام أدوات مختلفة من المعلوماتية الحيوية .

    فيما يلي قائمة ببعض أدوات المعلوماتية الحيوية المستخدمة في البروتينات (الجدول 5.3).

    الجدول 5.3 أدوات / قواعد بيانات المعلوماتية الحيوية المستخدمة في علم البروتينات.

    أدوات المعلوماتية الحيوية غرض
    K2 / FAST أداة محاذاة بنية البروتين
    SMM أداة لتحديد ارتباط الببتيدات بمركب التوافق النسيجي الرئيسي
    ZDOCK أداة لرسو البروتين والبروتين
    معيار الإرساء أداة لتقييم أداء خوارزميات الإرساء
    خادم ZDOCK خادم آلي لتشغيل ZDOCK
    ميلاني التحليل البروتيني لتحليل صور 2D-Gel

    إكتشاف عقار

    المعلوماتية الحيوية السريرية هي مجال جديد ناشئ من المعلوماتية الحيوية يستخدم أدوات معلوماتية حيوية مختلفة مثل تصميم الأدوية بمساعدة الكمبيوتر لتصميم أدوية جديدة ولقاحات ونمذجة عقاقير الحمض النووي و في السيليكو اختبار الأدوية لإنتاج أدوية جديدة وفعالة في إطار زمني أقصر مع مخاطر أقل.

    أبحاث وتحليل السرطان

    لعبت أدوات المعلومات الحيوية مثل NCI و NCIP (جزء من NCI) و CBIIT دورًا مهمًا في علم الجينوم والبروتيوميات والتصوير والأيض لزيادة معرفتنا بالأساس الجزيئي للسرطان.

    دراسات علم الوراثة

    باستخدام العديد من أدوات المعلوماتية الحيوية ، يمكن بسهولة تحقيق تحليل النشوء والتطور للبيانات الجزيئية في فترة زمنية قصيرة من خلال إنشاء أشجار النشوء والتطور لدراسة علاقتها التطورية بناءً على محاذاة التسلسل.

    علم الطب الشرعي

    يتكون عدد من قواعد البيانات من ملفات تعريف الحمض النووي للمنحرفين المعروفين. يوفر التقدم في تقنية ميكروأري والشبكات البيزية وخوارزميات البرمجة طريقة فعالة لتنظيم الأدلة وتفسيرها.

    الدفاع البيولوجي

    على الرغم من أن المعلوماتية الحيوية لها تأثير محدود على الطب الشرعي لأن هناك حاجة إلى المزيد من الخوارزميات المتقدمة والتطبيقات الحسابية بحيث يمكن لقواعد البيانات المنشأة أن تظهر قابلية التشغيل البيني مع بعضها البعض.

    علم المورثات الغذائية

    يؤدي التقدم في الجينوميات الهيكلية / الوظيفية والتقنيات الجزيئية مثل تسلسل الجينوم والمصفوفات الدقيقة للحمض النووي إلى توليد معرفة قيمة تشرح التغذية فيما يتعلق بعلم الوراثة للفرد الذي يؤثر بشكل مباشر على عملية التمثيل الغذائي. بسبب تدفق أدوات المعلوماتية الحيوية ، زادت الأبحاث المتعلقة بالتغذية بشكل كبير.

    التعبير الجيني

    تنظيم التعبير الجيني هو جوهر علم الجينوم الوظيفي الذي يسمح للباحثين بتطبيق البيانات الجينية على التقنيات الجزيئية التي يمكن أن تحدد كمية الجينات التي يتم نسخها بنشاط في أي خلية في أي وقت (مثل صفائف التعبير الجيني).

    فيما يلي قائمة ببعض أدوات المعلوماتية الحيوية المستخدمة في دراسة التعبير الجيني الجدول 5.4.

    الجدول 5.4 أدوات / قواعد بيانات المعلوماتية الحيوية المستخدمة في التعبير الجيني

    أدوات المعلوماتية الحيوية غرض
    جينيكوردس أداة استرجاع الجينات المحفوظة
    موصل حيوي يوفر أدوات لتحليل البيانات الجينومية عالية الإنتاجية
    GXD قاعدة بيانات التعبير الجيني لفأر المختبر
    مكتشف التكرارات المعكوسة البحث عن التكرارات المقلوبة في الحمض النووي الجيني
    BU ORChID تخزن قاعدة البيانات بيانات انشقاق جذور الهيدروكسيل لتسلسل الحمض النووي
    ODB يتنبأ بمجموعات الجينات الوظيفية
    دعم طية RNA يتنبأ ببنية الحمض النووي الريبي بناءً على الطفرات في الأليلات
    CellNetVis أداة تصور للمجمعات والشبكات البيولوجية
    مكتشف التكرار الترادفي يجد الترادفات الترادفية في الحمض النووي الجيني
    VisANT أدوات لتصور وتحليل العديد من التفاعلات البيولوجية
    برومو تحديد مواقع ربط عامل النسخ
    كونترا V.3 الكشف عن موقع ارتباط عامل النسخ

    الجدول مُعاد خلطه من Kahn، N. (2018)

    جودة الطعام

    أدخلت التحسينات الجديدة في خوارزميات الحوسبة وقواعد بيانات المحاكاة الهيكلية المتاحة للهياكل المعترف بها النمذجة الجزيئية في كيمياء الأغذية التقليدية. ستجعل مثل هذه المحاكاة من الممكن تحسين جودة الغذاء من خلال تطوير إضافات غذائية جديدة من خلال فهم أسس تماسك الذوق والتضاد والتكامل.

    توقع بنية البروتين ووظيفته

    أصبح تنبؤ طوبولوجيا البروتين الآن سهلاً للغاية بفضل المعلوماتية الحيوية التي تساعد في التنبؤ بالبنية ثلاثية الأبعاد للبروتين لاكتساب نظرة ثاقبة على وظيفته أيضًا.

    فيما يلي قائمة ببعض أدوات المعلوماتية الحيوية المستخدمة في بنية البروتين والتنبؤ بالوظيفة الجدول 5.

    الجدول 5.5 أدوات / قواعد بيانات المعلوماتية الحيوية المستخدمة في بنية البروتين والتنبؤ الوظيفي

    أدوات المعلوماتية الحيوية غرض
    CATH أداة لتنظيم البروتينات المصنفة
    فيري 2 أداة لتنبؤ بنية البروتين
    HMMSTR للتنبؤ بترابط بنية التسلسل في البروتينات
    العارض يتنبأ ببنية ثلاثية الأبعاد للبروتين
    JPRED / APSSP2 يتنبأ بالتراكيب الثانوية للبروتينات
    رابتوركس يتنبأ ببنية البروتين
    كوارك يتنبأ ببنية البروتين

    الجدول مُعاد خلطه من Kahn، N. (2018)

    طب شخصي

    سيتمكن الأطباء من تحليل الملف الجيني للمريض ووصف أفضل علاج دوائي متاح والجرعة من البداية من خلال استخدام أداة المعلوماتية الحيوية.

    تطبيقات الجينوم الميكروبي

    تمت دراسة الميكروبات على مستوى أساسي للغاية بمساعدة أدوات المعلوماتية الحيوية المطلوبة لتحليل مجموعة الجينات الفريدة التي تمكنها من البقاء في ظل ظروف غير مواتية.

    5.3 الاستنساخ والتعبير المأشوب

    لإنجاز التطبيقات الموضحة أعلاه ، يجب أن يكون علماء الكيمياء الحيوية قادرين على استخراج الأحماض النووية ومعالجتها وتحليلها. لفهم التقنيات الأساسية المستخدمة للعمل مع الأحماض النووية ، تذكر أن الأحماض النووية عبارة عن جزيئات كبيرة مكونة من النيوكليوتيدات (سكر ، فوسفات ، وقاعدة نيتروجينية). تحتوي كل مجموعات الفوسفات في هذه الجزيئات على شحنة سالبة صافية. مجموعة كاملة من جزيئات الحمض النووي في نواة الكائنات حقيقية النواة تسمى الجينوم. يحتوي الحمض النووي على خيطين متكاملين مرتبطين بروابط هيدروجينية بين القواعد المزدوجة.

    على عكس الحمض النووي في الخلايا حقيقية النواة ، تترك جزيئات الحمض النووي الريبي النواة. يتم تحليل Messenger RNA (mRNA) بشكل متكرر لأنه يمثل جينات ترميز البروتين التي يتم التعبير عنها في الخلية.

    تم وصف تقنيات عزل الحمض النووي في القسم 5.1 وهي الخطوة الأولى لدراسة الأحماض النووية أو معالجتها. يمكن أيضًا استخراج الحمض النووي الريبي ودراسته لفهم أنماط التعبير الجيني في الخلايا. الحمض النووي الريبي غير مستقر بشكل طبيعي لأن الإنزيمات التي تكسر الحمض النووي الريبي توجد عادة في الطبيعة. حتى أن بعضها تفرزها بشرتنا ويصعب للغاية تعطيلها. أثناء استخراج الحمض النووي الريبي ، تُستخدم مثبطات RNase والمعالجة الخاصة للأواني الزجاجية لتقليل خطر إتلاف العينة أثناء العزل

    هلام الكهربائي

    نظرًا لأن الأحماض النووية عبارة عن أيونات سالبة الشحنة عند درجة حموضة محايدة أو قلوية في بيئة مائية ، فيمكن نقلها بواسطة مجال كهربائي. الرحلان الكهربائي للهلام هو تقنية تستخدم لفصل الجزيئات المشحونة على أساس الحجم والشحنة. يمكن فصل الأحماض النووية ككروموسومات كاملة أو أجزاء. يتم تحميل الأحماض النووية في فتحة في أحد طرفي مصفوفة الهلام ، ويتم تطبيق تيار كهربائي ، ويتم سحب الجزيئات سالبة الشحنة باتجاه الطرف المقابل للجيل (النهاية مع القطب الموجب). تتحرك الجزيئات الأصغر عبر المسام في الهلام أسرع من الجزيئات الأكبر ، وهذا الاختلاف في معدل الهجرة يفصل الأجزاء على أساس الحجم. الأحماض النووية في مصفوفة هلامية غير مرئية حتى يتم تلطيخها بمركب يسمح برؤيتها ، مثل الصبغة. تظهر شظايا مميزة من الأحماض النووية كعصابات على مسافات محددة من الجزء العلوي من الهلام (نهاية القطب السالب) التي تعتمد على حجمها (الشكل 5.15). يظهر خليط من شظايا متعددة بأحجام مختلفة على شكل مسحة طويلة ، في حين أن الحمض النووي الجينومي غير المقطوع عادة ما يكون أكبر من أن يمر عبر الهلام ويشكل نطاقًا كبيرًا واحدًا في الجزء العلوي من الجل.

    الشكل 5.15 الرحلان الكهربائي لجيل الحمض النووي. تظهر أجزاء من الحمض النووي من ست عينات تعمل على مادة هلامية ، ملطخة بصبغة فلورية ويتم عرضها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. (الائتمان: تعديل العمل بواسطة جيمس جاكوب ، كلية المجتمع تومبكينز كورتلاند)

    تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

    تمت مناقشة تفاصيل PCR في القسم 5.1. تستخدم هذه التقنية في استنساخ الحمض النووي إلى زيادة عدد النسخ بسرعة مناطق معينة من الحمض النووي.

    استنساخ

    بشكل عام ، يعني الاستنساخ إنشاء نسخة متماثلة مثالية. عادةً ما تُستخدم الكلمة لوصف إنشاء نسخة متطابقة وراثيًا. في علم الأحياء ، يُشار إلى إعادة تكوين كائن كامل باسم "الاستنساخ التناسلي". قبل وقت طويل من محاولات استنساخ كائن حي بأكمله ، تعلم الباحثون كيفية نسخ امتدادات قصيرة من الحمض النووي - وهي العملية التي يشار إليها باسم الاستنساخ الجزيئي.

    يسمح الاستنساخ الجزيئي بإنشاء نسخ متعددة من الجينات ، والتعبير عن الجينات ، ودراسة جينات معينة. للحصول على جزء من الحمض النووي في خلية بكتيرية بالشكل الذي سيتم نسخه أو التعبير عنه ، يتم إدخال الجزء أولاً في ناقل الاستنساخ.

    أ ناقلات الاستنساخ عبارة عن قطعة صغيرة من الحمض النووي يمكن الحفاظ عليها بثبات في كائن حي ، ويمكن إدخال جزء دنا أجنبي فيها لأغراض الاستنساخ. قد يكون ناقل الاستنساخ عبارة عن دنا مأخوذ من فيروس ، أو خلية كائن حي أعلى ، أو قد يكون بلازميد بكتيريا. وبالتالي ، يحتوي المتجه على ميزات تسمح بإدخال أو إزالة جزء من الحمض النووي بشكل مناسب إلى الناقل أو منه ، على سبيل المثال عن طريق معالجة المتجه والحمض النووي الغريب بإنزيم تقييد يقطع الحمض النووي. تحتوي أجزاء الحمض النووي المتولدة على نهايات غير حادة أو نتوءات معروفة باسم النهايات اللاصقة ، ويمكن بعد ذلك ضم الحمض النووي المتجه والحمض النووي الغريب ذي النهايات المتوافقة معًا عن طريق الربط الجزيئي. بعد استنساخ جزء من الحمض النووي في ناقل استنساخ ، قد يتم استنساخه بشكل ثانوي في ناقل آخر مصمم لاستخدام أكثر تحديدًا.

    هناك العديد من أنواع نواقل الاستنساخ ، ولكن أكثرها شيوعًا هي البلازميدات المعدلة وراثيًا. يتم إجراء الاستنساخ لأول مرة باستخدام الإشريكية القولونية، وناقلات الاستنساخ بتنسيق بكتريا قولونية تشمل البلازميدات ، العاثيات (مثل العاثية λ) ، الكوسميدات ، والكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs). ومع ذلك ، لا يمكن الحفاظ على بعض الحمض النووي بشكل ثابت في بكتريا قولونية، على سبيل المثال شظايا كبيرة جدًا من الحمض النووي. لهذه الدراسات ، يمكن استخدام كائنات أخرى مثل الخميرة. تشمل نواقل الاستنساخ في الخميرة صبغيات الخميرة الاصطناعية (YACs).

    الشكل 5.16 مثال لمتجه الاستنساخ المشترك.

    تحتوي جميع نواقل الاستنساخ الشائعة الاستخدام في البيولوجيا الجزيئية على ميزات أساسية ضرورية لوظيفتها ، مثل موقع استنساخ مناسب به إنزيمات تقييدية وعلامة اختيار. قد يكون لدى الآخرين ميزات إضافية خاصة باستخدامهم. لأسباب تتعلق بالسهولة والراحة ، غالبًا ما يتم إجراء الاستنساخ باستخدام بكتريا قولونية. وبالتالي ، غالبًا ما تحتوي نواقل الاستنساخ المستخدمة على عناصر ضرورية لتكاثرها وصيانتها في بكتريا قولونية، مثل وظيفية أصل النسخ المتماثل (ORI). تم العثور على أصل ColE1 للنسخ المتماثل في العديد من البلازميدات. تتضمن بعض النواقل أيضًا عناصر تسمح بالحفاظ عليها في كائن حي آخر بالإضافة إلى بكتريا قولونية، وتسمى هذه النواقل ناقلات المكوك.

    موقع الاستنساخ

    تحتوي جميع نواقل الاستنساخ على ميزات تسمح بإدخال الجين بسهولة في المتجه أو إزالته منه. قد يكون هذا ملف موقع استنساخ متعدد (MCS) أو متعدد الوصلات، والتي تحتوي على العديد من مواقع التقييد الفريدة. يتم أولاً شق مواقع التقييد في MCS بواسطة إنزيمات التقييد ، ثم يتم أيضًا ربط الجين المستهدف الذي تم تضخيمه بواسطة PCR والذي يتم هضمه بنفس الإنزيمات في النواقل باستخدام DNA ligase. يمكن إدخال تسلسل الحمض النووي المستهدف في المتجه في اتجاه معين إذا رغبت في ذلك. يمكن استخدام مواقع التقييد أيضًا للاستنساخ الفرعي إلى ناقل آخر إذا لزم الأمر.

    قد تستخدم نواقل الاستنساخ الأخرى توبويزوميراز بدلاً من ligase ويمكن أن يتم الاستنساخ بسرعة أكبر دون الحاجة إلى هضم مقيد للناقل أو الإدخال. في طريقة استنساخ TOPO هذه ، يتم تنشيط ناقل خطي عن طريق إرفاق topoisomerase I بنهاياته ، وقد يقبل هذا المتجه & # 8220TOPO-activated & # 8221 بعد ذلك منتج PCR عن طريق ربط طرفي منتج PCR 5 & # 8242 ، مما يؤدي إلى إطلاق الإيزوميراز العلوي وتشكيل ناقل دائري في هذه العملية. طريقة أخرى للاستنساخ دون استخدام هضم الحمض النووي والليغاز هي عن طريق إعادة تركيب الحمض النووي ، على سبيل المثال كما هو مستخدم في نظام استنساخ البوابة. يمكن إدخال الجين ، بمجرد استنساخه في ناقل الاستنساخ (يسمى استنساخ الدخول في هذه الطريقة) ، بشكل ملائم في مجموعة متنوعة من نواقل التعبير عن طريق إعادة التركيب.

    إنزيمات التقييد

    أنزيمات التقييد (وتسمى أيضًا نوكليازات التقييد) تتعرف على تسلسلات DNA محددة وتقطعها بطريقة يمكن التنبؤ بها تنتجها البكتيريا بشكل طبيعي كآلية دفاع ضد الحمض النووي الغريب.

    كما يوحي الاسم ، فإن نوكليازات التقييد (أو إنزيمات التقييد) هي "محدد"في قدرتها على قطع أو هضم الحمض النووي. القيد الذي يفيد علماء الكيمياء الحيوية عادة ما يكون أ متناوب تسلسل الحمض النووي. المتواليات المتناظرة هي نفس التسلسل للأمام وللخلف. بعض الأمثلة على المتناظرات: RACE CAR ، CIVIC ، A MAN A PLAN A CANAL PANAMA. فيما يتعلق بالحمض النووي ، هناك خيطانان يعملان بشكل مضاد للتوازي مع بعضهما البعض. لذلك ، فإن المكمل العكسي لأحد الخيطين مطابق للآخر.

    كما هو الحال مع كلمة متناظرة ، هذا يعني أن تسلسل الحمض النووي المتناظر يقرأ نفس الشيء للأمام والخلف. في معظم الحالات ، يقرأ التسلسل نفس الشيء للأمام على خصلة واحدة وللخلف على الشريط التكميلي. غالبًا ما تقطع العناصر المتفاعلة الحمض النووي إلى نمط متعرج. عندما يتم إجراء قطع متداخلة في تسلسل ، تكون الأجزاء المتدلية مكملة (الشكل 5.17).

    الشكل 5.17 تسلسل التعرف على إنزيم التقييد. في هذا (أ) موقع التعرف على إنزيم تقييد ستة نيوكليوتيدات ، لاحظ أن تسلسل ستة نيوكليوتيدات يقرأ نفس الشيء في اتجاه 5 إلى 3 على حبلا واحد كما هو الحال في اتجاه 5 إلى 3 على الشريط التكميلي. هذا هو المعروف باسم المتناظرة. (ب) يقوم إنزيم التقييد بعمل فواصل في خيوط الدنا ، و (ج) ينتج عن القطع في الحمض النووي "نهايات لزجة". قطعة أخرى من الحمض النووي مقطوعة على كلا الطرفين بواسطة نفس إنزيم التقييد يمكن أن تلتصق بهذه الأطراف اللاصقة ويتم إدخالها في الفجوة التي يصنعها هذا القطع.

    يميل علماء الأحياء الجزيئية أيضًا إلى استخدام هذه المقصات الجزيئية الخاصة التي تتعرف على متناظرات من 6 أو 8. باستخدام 6 قواطع أو 8 قاطعات ، تحدث التسلسلات عبر امتدادات كبيرة نادرًا ، ولكن غالبًا ما تكون ذات فائدة.

    ايكو ارى يولد نهايات لزجة متماسكة SmaI يولد نهايات حادة

    الشكل 5.18 إنزيمات التقييد. تتعرف إنزيمات التقييد على التسلسلات المتناظرة في الحمض النووي وتتحلل روابط فوسفو دايستر التساهمية للحمض النووي لتترك إما نهايات "لزجة / متماسكة" أو نهايات "غير حادة". هذا التمييز في القطع مهم لأن ايكو ارى يمكن استخدام الطرف اللاصق لمطابقة قطعة من الحمض النووي المقطوعة بنفس الإنزيم من أجل لصقها أو ربطها معًا مرة أخرى. بينما تقطع نوكليازات الحمض النووي ، إنزيمات دمج الجزيئات انضم إليهم مرة أخرى معًا. هضم الحمض النووي مع ايكو ارى يمكن ربطها مرة أخرى مع قطعة أخرى من الحمض النووي المهضوم بها ايكو ارى، ولكن ليس للقطعة المهضومة بها SmaI. قاطع غير حاد آخر هو EcoRV مع تسلسل التعرف على GAT | ATC.

    علامة اختيار

    يتم وضع علامة قابلة للتحديد بواسطة المتجه للسماح باختيار الخلايا المحولة إيجابياً. غالبًا ما تستخدم مقاومة المضادات الحيوية كواسم ، ومثال على ذلك جين بيتا لاكتاماز ، الذي يمنح مقاومة لمجموعة البنسلين من المضادات الحيوية بيتا لاكتام مثل الأمبيسلين.تحتوي بعض النواقل على اثنين من العلامات القابلة للتحديد ، على سبيل المثال ، يحتوي البلازميد pACYC177 على كل من الجين المقاوم للأمبيسيلين والكاناميسين. قد تتطلب أيضًا نواقل المكوك التي تم تصميمها للمحافظة عليها في كائنين مختلفين اثنين من العلامات القابلة للتحديد ، على الرغم من أن بعض الواسمات القابلة للتحديد مثل مقاومة الزيوسين والهيغروميسين ب تكون فعالة في أنواع الخلايا المختلفة. يمكن أيضًا استخدام علامات الانتقاء المساعدة التي تسمح لكائن مساعد التغذية بالنمو في الحد الأدنى من وسط النمو. LEU2 و URA3 التي يتم استخدامها مع سلالات الخميرة المغذية المقابلة لها.

    نوع آخر من الواسمات القابلة للتحديد يسمح بالاختيار الإيجابي للبلازميد مع الجين المستنسخ. قد يتضمن ذلك استخدام جينة قاتلة للخلايا المضيفة ، مثل البارناز ، Ccda ، وسموم parD / parE. يعمل هذا عادةً عن طريق تعطيل أو إزالة الجين القاتل أثناء عملية الاستنساخ ، والنسخ غير الناجحة حيث يظل الجين القاتل سليمًا من شأنه أن يقتل الخلايا المضيفة ، لذلك يتم اختيار الحيوانات المستنسخة الناجحة فقط.

    جينات المراسل

    تُستخدم جينات المراسل في بعض نواقل الاستنساخ لتسهيل فحص الحيوانات المستنسخة الناجحة باستخدام ميزات هذه الجينات التي تسمح بتحديد الاستنساخ الناجح بسهولة. قد تكون هذه الميزات الموجودة في نواقل الاستنساخ هي لاكزجزء α لتكملة α في الاختيار الأزرق والأبيض ، و / أو الجين المحدد أو الجينات المراسل في الإطار مع MCS والمحاطة به لتسهيل إنتاج بروتينات الاندماج. من أمثلة شركاء الاندماج التي يمكن استخدامها للفحص البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ولوسيفيراز.

    الشكل 5.19 جينات المراسل. في هذا الرسم البياني ، يتم استخدام بروتين التألق الأخضر كجينات مراسلة لدراسة التسلسلات التنظيمية الأولية.

    عناصر للتعبير

    إذا كان التعبير عن الجين المستهدف مطلوبًا ، فإن ناقل الاستنساخ يحتاج أيضًا إلى احتواء عناصر مناسبة للتعبير عن الجين المستهدف المستنسخ ، بما في ذلك المحفز وموقع الربط الريبوسومي (RBS). يمكن إدخال الحمض النووي المستهدف في موقع يخضع لسيطرة محفز معين ضروري للتعبير عن الجين المستهدف في المضيف المختار. في حالة وجود المحفز ، يفضل التحكم بإحكام في التعبير عن الجين وتحريضه بحيث يتم إنتاج البروتينات فقط عند الحاجة. بعض المروجين الأكثر شيوعًا هي T7 و لاك المروجين. يعد وجود المحفز ضروريًا عند استخدام تقنيات الفرز مثل الاختيار الأزرق والأبيض.

    تُستخدم أحيانًا نواقل الاستنساخ بدون محفز و RBS لتسلسل الحمض النووي المستنسخ ، على سبيل المثال عند استنساخ الجينات التي تكون منتجاتها سامة بكتريا قولونية الخلايا. المروج و RBS لتسلسل الحمض النووي المستنسخ غير ضروريين أيضًا عند إنشاء مكتبة الجينوم أو cDNA للمستنسخات لأول مرة لأن الجينات المستنسخة عادةً ما يتم استنساخها في ناقل تعبير أكثر ملاءمة إذا كان تعبيرها مطلوبًا.

    أنواع نواقل الاستنساخ

    يتوفر عدد كبير من نواقل الاستنساخ ، وقد يعتمد اختيار المتجه الصحيح على عدد من العوامل ، مثل حجم الإدخال ورقم النسخ وطريقة الاستنساخ. قد لا يتم الاحتفاظ بإدخالات الحمض النووي الكبيرة بشكل ثابت في ناقلات الاستنساخ العامة ، خاصة بالنسبة لأولئك الذين لديهم عدد نسخ مرتفع ، وبالتالي قد يتطلب استنساخ أجزاء كبيرة ناقلات استنساخ أكثر تخصصًا.

    تقوم البلازميدات بشكل مستقل بتكرار DNA دائري خارج الكروموسومات. هم نواقل الاستنساخ القياسية والأكثر استخدامًا. يمكن استخدام معظم البلازميدات العامة لاستنساخ إدخال DNA يصل حجمه إلى 15 كيلو بايت. العديد من البلازميدات لديها عدد نسخ مرتفع ، على سبيل المثال pUC19 الذي يحتوي على عدد نسخ من 500-700 نسخة لكل خلية ، وعدد النسخ المرتفع مفيد لأنه ينتج عائدًا أكبر من البلازميد المؤتلف من أجل التلاعب اللاحق. ومع ذلك ، يمكن استخدام بلازميدات ذات عدد نسخ منخفض بشكل مفضل في ظروف معينة ، على سبيل المثال ، عندما يكون البروتين من الجين المستنسخ سامًا للخلايا.

    الجراثيم

    العاثيات الأكثر شيوعًا في الاستنساخ هي ملتهمة لامدا (λ) وعاثية M13. يوجد حد أعلى لكمية الحمض النووي التي يمكن تعبئتها في فجوة (بحد أقصى 53 كيلو بايت). يبلغ متوسط ​​جينوم العاثيات لامدا 48.5 كيلو بايت تقريبًا (الشكل 5.20). لذلك ، للسماح بإدخال الحمض النووي الغريب في دنا العاثيات ، قد تحتاج نواقل استنساخ العاثيات إلى حذف بعض جيناتها غير الأساسية لإفساح المجال للحمض النووي الغريب.

    يوجد أيضًا حد أقل للحجم للحمض النووي يمكن تعبئته في فجوة ، ولا يمكن تغليف الحمض النووي المتجه الصغير جدًا في العاثية بشكل صحيح. يمكن استخدام هذه الخاصية في التحديد & # 8211 المتجه بدون إدخال قد يكون صغيرًا جدًا ، لذلك يمكن تحديد المتجهات التي تحتوي على إدراج فقط للنشر.

    الشكل 5.20 Lambda Phage. (أ) تمثيل تخطيطي للجينوم الدائري للعاثية لامدا (ب) رسم تخطيطي لجسيم لامدا فج المعدية و (ج) صورة مجهرية إلكترونية للجراثيم ذات الصلة ، اهتزاز VvAWI. يشير الشريط إلى طول 50 نانومتر.

    الكوسميدات عبارة عن بلازميدات تتضمن جزءًا من العاثية λ DNA التي لها مواقع نهائية متماسكة (كوس) الذي يحتوي على العناصر المطلوبة لتعبئة الحمض النووي في جزيئات. يتم استخدامه عادة لاستنساخ أجزاء كبيرة من الحمض النووي بين 28 و 45 كيلو بايت.

    الكروموسوم الاصطناعي البكتيري

    يمكن استنساخ حجم الإدخال الذي يصل إلى 350 كيلو بايت في كروموسوم اصطناعي بكتيري (BAC). يتم الحفاظ على BACs في بكتريا قولونية برقم نسخة واحد فقط لكل خلية. غالبًا ما تم استخدام BACs لتسلسل جينوم الكائنات الحية في مشاريع الجينوم ، بما في ذلك مشروع الجينوم البشري. يتم تضخيم قطعة قصيرة من DNA الكائن الحي & # 8217s كإدخال في BACs ، ثم تسلسلها. أخيرًا ، يتم إعادة ترتيب الأجزاء المتسلسلة في السيليكو، مما أدى إلى التسلسل الجيني للكائن الحي. تم استبدال BACs إلى حد كبير بهذه السعة بأساليب تسلسل أسرع وأقل شاقة مثل تسلسل الجينوم الكامل للبندقية والآن تسلسل الجيل التالي مؤخرًا.

    كروموسوم الخميرة الاصطناعي

    يتم استخدام كروموسوم الخميرة الاصطناعي كناقلات لاستنساخ شظايا الحمض النووي لأكثر من 1 ميغا قاعدة (1 ميغا بايت = 1000 كيلو بايت = 1000000 قاعدة) في الحجم. إنها مفيدة في استنساخ أجزاء أكبر من الحمض النووي كما هو مطلوب في رسم خرائط الجينوم كما هو الحال في مشروع الجينوم البشري. يحتوي على تسلسل تيلومير ، تسلسل متماثل بشكل مستقل (ميزات مطلوبة لتكرار الكروموسومات الخطية في خلايا الخميرة). تحتوي هذه النواقل أيضًا على مواقع تقييد مناسبة لاستنساخ الحمض النووي الأجنبي وكذلك الجينات لاستخدامها كواسمات انتقائية.

    كروموسوم الإنسان الاصطناعي

    قد تكون الكروموسومات الاصطناعية البشرية مفيدة كنواقل لنقل الجينات لتوصيل الجينات إلى الخلايا البشرية ، وأداة لدراسات التعبير وتحديد وظيفة الكروموسوم البشري. يمكن أن يحمل جزء كبير جدًا من الحمض النووي (لا يوجد حد أعلى للحجم للأغراض العملية) ، وبالتالي لا يعاني من مشكلة قدرة الاستنساخ المحدودة للناقلات الأخرى ، كما أنه يتجنب حدوث الطفرات المغزلية المحتملة الناتجة عن الاندماج في الكروموسومات المضيفة بواسطة الفيروس. المتجه.

    كما تم التلاعب بالنواقل الفيروسية الحيوانية والنباتية التي تصيب الخلايا النباتية والحيوانية لإدخال جينات غريبة في الخلايا النباتية والحيوانية. إن القدرة الطبيعية للفيروسات على الامتصاص في الخلايا وإدخال الحمض النووي الخاص بها والتكاثر جعلتها مركبات مثالية لنقل الحمض النووي الغريب إلى الخلايا حقيقية النواة في المزرعة. تم استخدام ناقل يعتمد على فيروس Simian 40 (SV40) في أول تجربة استنساخ شملت خلايا الثدييات. تم استخدام عدد من النواقل التي تعتمد على نوع آخر من الفيروسات مثل الفيروسات الغدية وفيروس الورم الحليمي لاستنساخ الجينات في الثدييات. في الوقت الحاضر ، نواقل الفيروسات القهقرية شائعة لاستنساخ الجينات في خلايا الثدييات. في حالة تحول النبات ، تم استخدام الفيروسات بما في ذلك فيروس موزاييك القرنبيط وفيروس موزاييك التبغ وفيروسات الجوزاء بنجاح محدود.

    ملخص لاستنساخ الحمض النووي

    يقدم الشكل 5.21 ملخصًا لأساليب الاستنساخ الأساسية الأكثر استخدامًا في مختبرات الكيمياء الحيوية. يتم عزل الحمض النووي الأجنبي أو تضخيمه باستخدام PCR للحصول على مادة كافية لإجراء الاستنساخ. يتم تنقية الحمض النووي وتقطيعه باستخدام إنزيمات تقييدية ، ثم يتم مزجه مع ناقل تم قطعه بنفس إنزيمات التقييد. يمكن بعد ذلك خياطة الحمض النووي مرة أخرى مع DNA ligase. يمكن بعد ذلك تحويل الحمض النووي إلى نظام مضيف ، غالبًا البكتيريا ، لتنمية كميات كبيرة من البلازميد الذي يحتوي على الحمض النووي المستنسخ.

    يمكن استخدام نقش جزء التقييد وتسلسل الحمض النووي للتحقق من صحة المادة المستنسخة.

    الشكل 5.21 رسم بياني يوضح الخطوات الرئيسية في الاستنساخ.

    للحصول على فيديو تعليمي عن استنساخ الحمض النووي ، قم بزيارة: HHMI & # 8211 BioInteractive

    تسمى البلازميدات التي تحتوي على دنا أجنبي داخلها بجزيئات الحمض النووي المؤتلف لأنها تحتوي على توليفات جديدة من المواد الجينية. تسمى البروتينات التي يتم إنتاجها من جزيئات الحمض النووي المؤتلف بالبروتينات المؤتلفة. ليست كل البلازميدات المؤتلفة قادرة على التعبير عن الجينات. يمكن أيضًا تصميم البلازميدات للتعبير عن البروتينات فقط عندما يتم تحفيزها بواسطة عوامل بيئية معينة ، بحيث يمكن للعلماء التحكم في التعبير عن البروتينات المؤتلفة.

    الاستنساخ التناسلي

    الاستنساخ التناسلي هو طريقة تستخدم في استنساخ أو ملف نسخة متطابقة من كائن متعدد الخلايا كامل. تخضع معظم الكائنات متعددة الخلايا للتكاثر بالوسائل الجنسية ، والتي تتضمن مساهمة الحمض النووي من فردين (الوالدين) ، مما يجعل من المستحيل إنتاج نسخة متطابقة أو استنساخ لأي من الوالدين. جعلت التطورات الحديثة في التكنولوجيا الحيوية من الممكن استنساخ الثدييات التناسلية في المختبر.

    يتضمن التكاثر الجنسي الطبيعي اتحاد الحيوانات المنوية والبويضة أثناء الإخصاب. كل من هذه الأمشاج أحادي العدد بمعنى أنها تحتوي على مجموعة واحدة من الكروموسومات في نواتها. ثم تكون الخلية الناتجة ، أو الزيجوت ثنائي الصيغة الصبغية ويحتوي على مجموعتين من الكروموسومات. تنقسم هذه الخلية بشكل انقسامي لإنتاج كائن متعدد الخلايا. ومع ذلك ، فإن اتحاد أي خليتين فقط لا يمكن أن ينتج زيجوتًا قابلاً للحياة ، فهناك مكونات في السيتوبلازم لخلية البويضة ضرورية للتطور المبكر للجنين خلال الانقسامات الخلوية القليلة الأولى. بدون هذه الأحكام ، لن يكون هناك تطور لاحق. لذلك ، لإنتاج فرد جديد ، يلزم وجود مكمل جيني ثنائي الصبغة وسيتوبلازم بيض. تتمثل طريقة إنتاج فرد مستنسخ صناعيًا في أخذ خلية بويضة فرد واحد وإزالة النواة أحادية العدد. ثم يتم وضع نواة ثنائية الصبغيات من خلية جسم الفرد الثاني ، المتبرع ، في خلية البويضة. ثم يتم تحفيز البويضة على الانقسام حتى يستمر التطور. يبدو هذا بسيطًا ، ولكنه في الواقع يتطلب عدة محاولات قبل إكمال كل خطوة بنجاح.

    كان أول حيوان زراعي مستنسخ هو دوللي ، وهي شاة ولدت في عام 1996. وكان معدل نجاح الاستنساخ لأغراض التكاثر في ذلك الوقت منخفضًا للغاية. عاشت دوللي لمدة ست سنوات وتوفيت بسبب ورم في الرئة (الشكل 5.22). كانت هناك تكهنات بأنه نظرًا لأن الحمض النووي للخلية الذي أدى إلى ظهور دوللي جاء من فرد أكبر سنًا ، فقد يكون عمر الحمض النووي قد أثر على متوسط ​​عمرها المتوقع. منذ دوللي ، تم استنساخ العديد من أنواع الحيوانات (مثل الخيول والثيران والماعز) بنجاح.

    كانت هناك محاولات لإنتاج أجنة بشرية مستنسخة كمصادر للخلايا الجذعية الجنينية. في هذا الإجراء ، يتم إدخال الحمض النووي من إنسان بالغ في خلية بويضة بشرية ، والتي يتم تحفيزها بعد ذلك على الانقسام. تشبه هذه التقنية التقنية التي تم استخدامها لإنتاج دوللي ، ولكن لا يتم زرع الجنين أبدًا في أم بديلة. تسمى الخلايا المنتجة بالخلايا الجذعية الجنينية لأنها تتمتع بالقدرة على التطور إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، مثل العضلات أو الخلايا العصبية. يمكن استخدام الخلايا الجذعية للبحث وتقديم تطبيقات علاجية في نهاية المطاف ، مثل استبدال الأنسجة التالفة. وتتمثل فائدة الاستنساخ في هذه الحالة في أن الخلايا المستخدمة لتجديد أنسجة جديدة ستكون مطابقة تمامًا للمتبرع بالحمض النووي الأصلي. على سبيل المثال ، لا يحتاج مريض اللوكيميا إلى شقيق لديه نسيج مطابق لعملية زرع نخاع العظم.

    الشكل 5.22 كانت النعجة دوللي أول حيوان زراعي يتم استنساخه. لإنشاء دوللي ، تمت إزالة النواة من خلية بويضة مانحة. تم وضع البويضة المنزوعة النوى بجانب الخلية الأخرى ، ثم صُدموا للانصهار. لقد صُدموا مرة أخرى لبدء الانقسام. تم السماح للخلايا بالانقسام لعدة أيام حتى الوصول إلى مرحلة جنينية مبكرة ، قبل أن يتم زرعها في أم بديلة.

    لماذا كانت دوللي فنلندي دورست وليست من الأغنام الاسكتلندية ذات الوجه الأسود؟

    لأنه على الرغم من أن الخلية الأصلية جاءت من خروف اسكتلندي ذو وجه أسود وكانت الأم البديلة ذات وجه أسود اسكتلندي ، فإن الحمض النووي جاء من فين دورست.

    الهندسة الوراثية

    يُعرف استخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف لتعديل الحمض النووي للكائن الحي لتحقيق السمات المرغوبة بالهندسة الوراثية. تعد إضافة الحمض النووي الأجنبي في شكل نواقل الحمض النووي المؤتلف التي يتم إنشاؤها بواسطة الاستنساخ الجزيئي أكثر الطرق شيوعًا في الهندسة الوراثية. يسمى الكائن الحي الذي يتلقى الحمض النووي المؤتلف أ كائن معدل وراثيا (GMO). إذا كان الحمض النووي الغريب الذي تم إدخاله يأتي من نوع مختلف ، يتم استدعاء الكائن الحي المضيف المعدلة وراثيا. تم تعديل البكتيريا والنباتات والحيوانات وراثيًا منذ أوائل السبعينيات للأغراض الأكاديمية والطبية والزراعية والصناعية.

    شاهد هذا الفيديو القصير الذي يشرح كيف ابتكر العلماء حيوانًا معدّلًا وراثيًا.

    على الرغم من أن الطرق الكلاسيكية لدراسة وظيفة الجينات بدأت بنمط ظاهري معين وحددت الأساس الجيني لهذا النمط الظاهري ، فإن التقنيات الحديثة تسمح للباحثين بالبدء على مستوى تسلسل الحمض النووي والسؤال: "ماذا يفعل هذا الجين أو عنصر الحمض النووي؟" هذه التقنية تسمى علم الوراثة العكسي، أدى إلى عكس المنهجية الجينية الكلاسيكية. أحد الأمثلة على هذه الطريقة يماثل إتلاف جزء من الجسم لتحديد وظيفته. الحشرة التي تفقد جناحها لا تستطيع الطيران ، مما يعني أن وظيفة الجناح هي الطيران. تقارن الطريقة الجينية الكلاسيكية الحشرات التي لا تستطيع الطيران مع الحشرات القادرة على الطيران ، وتلاحظ أن الحشرات غير الطائرة فقدت أجنحة. وبالمثل في نهج علم الوراثة العكسي ، فإن تحور الجينات أو حذفها يوفر للباحثين أدلة حول وظيفة الجينات. بالتناوب ، يمكن استخدام الوراثة العكسية لجعل الجين يفرط في التعبير عن نفسه لتحديد التأثيرات المظهرية التي قد تحدث.

    تقنية كريسبر

    كريسبر تمثل متكررة متكررة متناظرة قصيرة متباعدة بانتظامويمثل عائلة من سلاسل الحمض النووي الموجودة داخل جينومات الكائنات بدائية النواة مثل البكتيريا والعتائق. يتم اشتقاق هذه التسلسلات من شظايا الحمض النووي للعاثيات التي سبق أن أصابت بدائيات النوى وتستخدم لاكتشاف وتدمير الحمض النووي من العاثيات المماثلة أثناء العدوى اللاحقة. ومن ثم تلعب هذه التسلسلات دورًا رئيسيًا في نظام الدفاع المضاد للفيروسات بدائيات النوى.

    5.23 هيكل بلوري لمجمع المراقبة CRISPR RNA الموجه ، Cascade ، المرتبط بهدف ssDNA. وحدات بروتين متتالية لنظام CRISPR وحدات فرعية CasA و CasB و CasC و CasD و CasE (سماوي) مرتبطة بـ CRISPR RNA (أخضر) والحمض النووي الفيروسي (أحمر) استنادًا إلى PDB 4QYZ وتم تقديمها باستخدام PyMOL.

    Cas9 (أو & # 8220CRISPR المرتبط بالبروتين 9 & # 8221) هو إنزيم يستخدم تسلسلات CRISPR كدليل للتعرف على سلاسل معينة من الحمض النووي المكملة لتسلسل كريسبر وربطها. تشكل إنزيمات Cas9 جنبًا إلى جنب مع تسلسل CRISPR أساس تقنية تُعرف باسم CRISPR-Cas9 والتي يمكن استخدامها لتحرير الجينات داخل الكائنات الحية. عملية التحرير هذه لها مجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك البحوث البيولوجية الأساسية ، وتطوير منتجات التكنولوجيا الحيوية ، وعلاج الأمراض.

    الشكل 5.24 رسم تخطيطي لآلية دفاع كريسبر بدائية النواة المضادة للفيروسات.

    نظام CRISPR-Cas هو نظام مناعي بدائية النواة يمنح مقاومة للعناصر الجينية الأجنبية مثل تلك الموجودة داخل البلازميدات والعاثيات التي توفر شكلاً من أشكال المناعة المكتسبة. يساعد RNA الذي يحتوي على تسلسل المباعد بروتينات Cas (المرتبطة بـ CRISPR) على التعرف على الحمض النووي المسبّب للأمراض وقطعه. تقوم بروتينات Cas الأخرى الموجهة من RNA بقطع الحمض النووي الريبي الأجنبي. تم العثور على كريسبر في حوالي 50٪ من الجينومات البكتيرية المتسلسلة وما يقرب من 90٪ من العتائق المتسلسلة.

    5.4 المصفوفات الدقيقة للحمض النووي

    أ ميكروأري الحمض النووي(المعروف أيضًا باسم رقاقة DNA أو biochip) عبارة عن مجموعة من بقع الحمض النووي المجهرية المتصلة بسطح صلب. يستخدم العلماء المصفوفات الدقيقة للحمض النووي لقياس مستويات التعبير لأعداد كبيرة من الجينات في وقت واحد أو لتحديد التركيب الجيني لمناطق متعددة من الجينوم. تحتوي كل بقعة DNA على بيكومولات (10 -12 مول) من تسلسل DNA محدد ، والمعروف باسم المجسات (أو المراسلين أو oligos). يمكن أن تكون هذه جزءًا قصيرًا من جين أو عنصر DNA آخر يتم استخدامه لتهجين عينة cDNA أو cRNA (تسمى أيضًا RNA المضاد للحس) (تسمى أيضًا استهداف) في ظل ظروف شديدة الصرامة. عادة ما يتم الكشف عن تهجين هدف المسبار وتحديد كميته عن طريق الكشف عن الأهداف التي تحمل علامات الفلوروفور أو الفضة أو الإشعاع الكيميائي لتحديد الوفرة النسبية لتسلسل الحمض النووي في الهدف. كانت مصفوفات الحمض النووي الأصلية عبارة عن مصفوفات ماكرو بحجم 9 سم × 12 سم وتم نشر أول تحليل قائم على الصور المحوسبة في عام 1981. وقد اخترعها باتريك أو.براون.

    الشكل 5.25 رسم تخطيطي لمصفوفات الحمض النووي الدقيقة. داخل الكائنات الحية ، يتم نسخ الجينات وتقسيمها لإنتاج نسخ mRNA ناضجة (حمراء). يتم استخراج mRNA من الكائن الحي ويتم استخدام النسخ العكسي لنسخ mRNA إلى ds-cDNA المستقر (الأزرق). في المصفوفات الدقيقة ، يتم تجزئة ds-cDNA وتسميتها الفلورية (برتقالية). ترتبط الأجزاء المسمى بمصفوفة مرتبة من قليل النوكليوتيدات التكميلية ، ويشير قياس شدة الفلورسنت عبر الصفيف إلى وفرة مجموعة متواليات محددة مسبقًا. عادة ما يتم اختيار هذه التسلسلات على وجه التحديد للإبلاغ عن الجينات ذات الأهمية داخل جينوم الكائن الحي & # 8217s.

    المبدأ الأساسي وراء المصفوفات الدقيقة هو التهجين بين خيطي DNA ، وهي خاصية تسلسل الحمض النووي التكميلي للاقتران على وجه التحديد مع بعضها البعض عن طريق تكوين روابط هيدروجينية بين أزواج قاعدة النوكليوتيدات التكميلية. يعني العدد الكبير من أزواج القواعد التكميلية في تسلسل النوكليوتيدات وجود رابطة غير تساهمية أكثر إحكامًا بين الخيطين. بعد غسل متواليات الترابط غير المحددة ، ستبقى الخيوط المزدوجة القوية مهجنة فقط. تولد التسلسلات المستهدفة ذات العلامات الفلورية التي ترتبط بتسلسل مسبار إشارة تعتمد على ظروف التهجين (مثل درجة الحرارة) ، والغسيل بعد التهجين. تعتمد القوة الإجمالية للإشارة ، من نقطة (ميزة) ، على مقدار ارتباط العينة المستهدفة بالمجسات الموجودة في تلك البقعة. تستخدم المصفوفات الدقيقة القياس الكمي النسبي الذي تتم فيه مقارنة شدة الميزة بكثافة نفس الميزة تحت ظروف مختلفة ، ويتم التعرف على هوية السمة من خلال موقعها.

    الشكل 5.26 تهجين الحمض النووي المستهدف باستخدام دنا المسبار أثناء تحليل المصفوفة الدقيقة

    توجد أنواع عديدة من المصفوفات وأوسع تمييز هو ما إذا كانت مرتبة مكانيًا على سطح أو على خرز مشفر:

    • المصفوفة التقليدية ذات الطور الصلب عبارة عن مجموعة من المجسات الدقيقة المنتظمة & # 8220 بقعة & # 8221 ، تسمى الميزات ، ولكل منها آلاف المجسات المتطابقة والمحددة المتصلة بسطح صلب ، مثل الزجاج أو البلاستيك أو رقاقة السيليكون الحيوية (المعروفة باسم a شريحة الجينوم, رقاقة DNA أو مجموعة الجينات). يمكن وضع الآلاف من هذه الميزات في مواقع معروفة على مصفوفة ميكروأري واحدة للحمض النووي.
    • مجموعة الخرزة البديلة عبارة عن مجموعة من خرزات البوليسترين المجهرية ، ولكل منها مسبار محدد ونسبة صبغتين أو أكثر ، والتي لا تتداخل مع الأصباغ الفلورية المستخدمة في التسلسل المستهدف.

    يمكن استخدام المصفوفات الدقيقة للحمض النووي للكشف عن الحمض النووي (كما هو الحال في التهجين الجيني المقارن) ، أو اكتشاف الحمض النووي الريبي (الأكثر شيوعًا مثل cDNA بعد النسخ العكسي) الذي قد يترجم أو لا يترجم إلى بروتينات. تسمى عملية قياس التعبير الجيني عبر (كدنا) تحليل التعبير أو التنميط التعبير.

    تلفيق

    يمكن تصنيع المصفوفات الدقيقة بطرق مختلفة ، اعتمادًا على عدد المجسات قيد الفحص والتكاليف ومتطلبات التخصيص ونوع السؤال العلمي الذي يتم طرحه. قد تحتوي المصفوفات من البائعين التجاريين على ما لا يقل عن 10 مجسات أو ما يصل إلى 5 ملايين أو أكثر من مجسات الميكرومتر.

    مرقط مقابل. فى الموقع المصفوفات المركبة

    يمكن تصنيع المصفوفات الدقيقة باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات ، بما في ذلك الطباعة باستخدام دبابيس دقيقة على الشرائح الزجاجية ، والطباعة الحجرية الضوئية باستخدام أقنعة مسبقة الصنع ، والطباعة الحجرية الضوئية باستخدام أجهزة المرآة الدقيقة الديناميكية ، والطباعة بنفث الحبر ، أو الكيمياء الكهربية على مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة.

    في المصفوفات الدقيقة المرقطة، المجسات عبارة عن أليغنوكليوتيدات أو كدنا أو أجزاء صغيرة من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تتوافق مع الرنا المرسال. يتم تصنيع المجسات قبل ترسيبها على سطح المصفوفة ثم يتم & # 8220 رصدها & # 8221 على الزجاج. يستخدم النهج الشائع مجموعة من المسامير الدقيقة أو الإبر التي يتم التحكم فيها بواسطة ذراع آلية يتم غمسها في الآبار التي تحتوي على مجسات الحمض النووي ثم إيداع كل مسبار في مواقع محددة على سطح الصفيف. تمثل المجسات & # 8220grid & # 8221 الناتجة ملفات تعريف الحمض النووي للمسبارات المعدة وهي جاهزة لتلقي cDNA أو cRNA التكميلي & # 8220targets & # 8221 المشتقة من العينات التجريبية أو السريرية. يستخدم علماء الأبحاث هذه التقنية في جميع أنحاء العالم لإنتاج & # 8220in-house & # 8221 مصفوفات دقيقة مطبوعة من مختبراتهم الخاصة. يمكن تخصيص هذه المصفوفات بسهولة لكل تجربة ، لأنه يمكن للباحثين اختيار المجسات ومواقع الطباعة على المصفوفات ، وتوليف المجسات في مختبرهم (أو المنشأة المتعاونة) ، وتحديد المصفوفات. يمكنهم بعد ذلك إنشاء عينات خاصة بهم من أجل التهجين ، وتهجين العينات إلى المصفوفة ، ثم مسح المصفوفات في النهاية بمعداتهم الخاصة. يوفر هذا مصفوفة ميكروأري منخفضة التكلفة نسبيًا يمكن تخصيصها لكل دراسة ، وتجنب تكاليف شراء المصفوفات التجارية الأكثر تكلفة في كثير من الأحيان والتي قد تمثل أعدادًا كبيرة من الجينات التي لا تهم المحقق. توجد منشورات تشير إلى أن المصفوفات الدقيقة المرقطة في المنزل قد لا توفر نفس المستوى من الحساسية مقارنة بمصفوفات قليلة النوكليوتيد التجارية ، ربما بسبب أحجام الدُفعات الصغيرة وكفاءة الطباعة المنخفضة عند مقارنتها بالمصنوعات الصناعية لمصفوفات oligo.

    في المصفوفات الدقيقة قليلة النوكليوتيد، المجسات عبارة عن تسلسلات قصيرة مصممة لمطابقة أجزاء من تسلسل إطارات القراءة المفتوحة المعروفة أو المتوقعة. على الرغم من أن مجسات قليل النوكليوتيد تُستخدم غالبًا في المصفوفات الدقيقة & # 8220 المرقطة & # 8221 ، فإن المصطلح & # 8220 مصفوفة النوكليوتيد # 8221 غالبًا ما يشير إلى تقنية محددة للتصنيع. يتم إنتاج مصفوفات قليل النوكليوتيد عن طريق طباعة متواليات قصيرة قليلة النوكليوتيد مصممة لتمثيل جين واحد أو عائلة من متغيرات لصق الجينات عن طريق توليف هذا التسلسل مباشرة على سطح الصفيف بدلاً من ترسيب متواليات سليمة. قد تكون التسلسلات أطول (مجسات 60 مير مثل تصميم Agilent) أو أقصر (مجسات 25-Mer التي تنتجها Affymetrix) اعتمادًا على الغرض المطلوب ، تكون المجسات الأطول أكثر تحديدًا للجينات المستهدفة الفردية ، وقد يتم رصد تحقيقات أقصر بكثافة أعلى عبر المصفوفة وأرخص في التصنيع. تتضمن إحدى التقنيات المستخدمة لإنتاج مصفوفات قليلة النوكليوتيد التوليف الليثوغرافي الضوئي (Affymetrix) على ركيزة السيليكا حيث يتم استخدام عوامل الإخفاء الحساسة للضوء والحساسية للضوء & # 8220 بناء & # 8221 تسلسل نيوكليوتيد واحد في كل مرة عبر المجموعة بأكملها. كل مسبار قابل للتطبيق يتم إخفاؤه بشكل انتقائي & # 8220unmasked & # 8221 قبل الاستحمام بالصفيف في محلول من نيوكليوتيد واحد ، ثم يحدث تفاعل اخفاء ويتم الكشف عن المجموعة التالية من المجسات استعدادًا لتعرض نيوكليوتيد مختلف. بعد العديد من التكرارات ، يتم إنشاء تسلسل كل مسبار بشكل كامل. في الآونة الأخيرة ، جمعت شركة Maskless Array Synthesis من NimbleGen Systems بين المرونة مع عدد كبير من المجسات.

    الشكل 5.27 رسم تخطيطي لتجربة نموذجية ميكروأري ثنائية اللون. داخل مصفوفة ميكروأري ثنائية اللون ، يتم عادةً تهجين الحمض النووي للمسبار باستخدام (كدنا) المحضرة من عينتين مختلفتين ، كل منها مُصنَّف بمسبار فلورسنت مختلف. سينتج عن التحليل مضان أخضر لعينة واحدة ينظم التعبير الجيني ، في حين أن العينة الأخرى الموسومة بعلامة مضان حمراء ستشير إلى أن الحالة الأخرى تثير التعبير الجيني في ذلك الموقع. يشير اللون الأصفر إلى التعبير الجيني في كلتا العينتين.

    صورة معدلة من Larssono والصورة B من Guillaume Paumier

    المصفوفات الدقيقة ذات اللونين أو المصفوفات الدقيقة ثنائية القناة يتم تهجينها عادةً باستخدام (كدنا) محضرة من عينتين لمقارنتها (على سبيل المثال الأنسجة المريضة مقابل الأنسجة السليمة) والتي يتم تصنيفها باستخدام نوعين مختلفين من الفلوروفور. تشمل الأصباغ الفلورية المستخدمة عادةً في وضع العلامات (كدنا) Cy3 ، التي يبلغ طول موجة انبعاثها الفلوري 570 نانومتر (المقابل للجزء الأخضر من طيف الضوء) ، و Cy5 بطول موجة انبعاث مضان يبلغ 670 نانومتر (المقابلة للجزء الأحمر من الضوء) نطاق). يتم خلط عينات (كدنا) التي تحمل علامة Cy وتهجينهما إلى مصفوفة ميكروأري واحدة يتم مسحها ضوئيًا بعد ذلك في ماسح ضوئي ميكروأري لتصور مضان الفلوريين بعد الإثارة بشعاع ليزر بطول موجي محدد. يمكن بعد ذلك استخدام الشدة النسبية لكل حامل فلور في التحليل القائم على النسبة لتحديد الجينات المنظمة والأقل تنظيمًا.

    غالبًا ما تحمل المصفوفات الدقيقة قليلة النوكليوتيد مجسات تحكم مصممة للتهجين باستخدام RNA spike-ins. يتم استخدام درجة التهجين بين سبايك إنز ومجسات التحكم لتطبيع قياسات التهجين للمجسات المستهدفة. على الرغم من أنه يمكن تحديد المستويات المطلقة للتعبير الجيني في المصفوفة ثنائية اللون في حالات نادرة ، فإن الاختلافات النسبية في التعبير بين البقع المختلفة داخل العينة وبين العينات هي الطريقة المفضلة لتحليل البيانات لنظام اللونين. تتضمن الأمثلة على موفري مثل هذه المصفوفات الدقيقة Agilent مع منصة الوضع المزدوج الخاصة بهم ، و Eppendorf مع منصة DualChip الخاصة بهم لوضع العلامات اللونية على Silverquant ، و TeleChem International مع Arrayit.

    في المصفوفات الدقيقة أحادية القناة أو المصفوفات الدقيقة أحادية اللون، توفر المصفوفات بيانات كثافة لكل مجس أو مجموعة مجسات تشير إلى مستوى نسبي من التهجين مع الهدف المحدد. ومع ذلك ، فهي لا تشير حقًا إلى مستويات وفرة الجين ، بل تشير إلى الوفرة النسبية عند مقارنتها بالعينات أو الظروف الأخرى عند معالجتها في نفس التجربة. يواجه كل جزيء من الحمض النووي الريبي بروتوكولًا وتحيزًا خاصًا بالدُفعة أثناء مراحل التضخيم ووضع العلامات والتهجين في التجربة ، مما يجعل المقارنات بين الجينات لنفس المصفوفة الدقيقة غير مفيدة. تتطلب المقارنة بين شرطين لنفس الجين تهجينين منفصلين للصبغة الواحدة. العديد من أنظمة القناة الفردية الشائعة هي Affymetrix & # 8220Gene Chip & # 8221 و Illumina & # 8220Bead Chip & # 8221 و Agilent أحادية القناة صفيفات والمصفوفات الدقيقة التطبيقية & # 8220CodeLink & # 8221 و Eppendorf & # 8220DualChip & amp ؛ Silverquant . تكمن إحدى نقاط القوة في نظام الصبغة المفردة في حقيقة أن العينة الشاذة لا يمكن أن تؤثر على البيانات الأولية المشتقة من عينات أخرى ، لأن كل شريحة مصفوفة تتعرض لعينة واحدة فقط (على عكس نظام ثنائي اللون يكون فيه مستوى منخفض واحد) - قد تؤثر عينة الجودة بشكل كبير على دقة البيانات الإجمالية حتى لو كانت العينة الأخرى عالية الجودة). فائدة أخرى هي أن البيانات يمكن مقارنتها بسهولة أكبر بالمصفوفات من تجارب مختلفة طالما تم احتساب تأثيرات الدُفعات.

    5.5 التهجين الموقعي

    فى الموقع تهجين (ISH) هو نوع من التهجين الذي يستخدم الحمض النووي التكميلي أو الحمض النووي الريبي أو خيط الأحماض النووية المعدلة (أي المسبار) لتحديد تسلسل DNA أو RNA معين في جزء أو جزء من الأنسجة (فى الموقع) أو إذا كان النسيج صغيرًا بدرجة كافية (على سبيل المثال ، بذور النباتات ، ذبابة الفاكهة الأجنة) ، في النسيج بأكمله (جبل ISH بالكامل) ، في الخلايا ، وفي الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs). هذا يختلف عن الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، التي عادة ما توضع البروتينات في أقسام الأنسجة.

    يستخدم التهجين في الموقع للكشف عن موقع تسلسل الحمض النووي المحدد على الكروموسومات أو الأنسجة ، وهي خطوة حاسمة لفهم تنظيم وتنظيم ووظيفة الجينات. التقنيات الرئيسية المستخدمة حاليا تشمل فى الموقع التهجين إلى mRNA باستخدام مجسات قليلة النوكليوتيد والحمض النووي الريبي (المسمى بالراديو والمسمى hapten) ، التحليل باستخدام المجاهر الضوئية والإلكترونية ، جبل كامل فى الموقع التهجين ، والكشف المزدوج عن RNAs و RNA بالإضافة إلى البروتين ، والفلوريسنت فى الموقع التهجين للكشف عن تسلسل الكروموسومات. يمكن استخدام DNA ISH لتحديد بنية الكروموسومات. يمكن ، على سبيل المثال ، استخدام الفلورسنت DNA ISH (FISH) في التشخيص الطبي لتقييم سلامة الكروموسومات. RNA ISH (RNA فى الموقع تهجين) لقياس وتوطين الحمض النووي الريبي (mRNAs ، lncRNAs ، و miRNAs) داخل أقسام الأنسجة والخلايا والتركيبات الكاملة والخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs). فى الموقع تم اختراع التهجين بواسطة ماري لو باردو وجوزيف ج.

    الشكل 5.28 تهجين من النوع البري في الموقع ذبابة الفاكهة الأجنة في مراحل نمو مختلفة للحمض النووي الريبي من جين يسمى أحدب.

    بالنسبة للكيمياء النسيجية للتهجين ، يتم عادةً معالجة خلايا العينة والأنسجة لإصلاح النصوص المستهدفة في مكانها وزيادة وصول المسبار. كما هو مذكور أعلاه ، يكون المسبار إما DNA تكميليًا موسومًا أو ، الآن الأكثر شيوعًا ، RNA تكميلي (riboprobe). يتم تهجين المسبار مع التسلسل المستهدف عند درجة حرارة مرتفعة ، ثم يتم غسل المسبار الزائد بعيدًا (بعد التحلل المائي السابق باستخدام RNase في حالة مسبار RNA الزائد غير المهجن). يمكن معالجة معلمات المحلول مثل درجة الحرارة و / أو الملح و / أو تركيز المنظف لإزالة أي تفاعلات غير متطابقة (على سبيل المثال ، تظل مطابقة التسلسل الدقيق فقط مقيدة). بعد ذلك ، يتم تحديد موقع المسبار الذي تم تسميته بقواعد موصوفة بالراديو أو الفلوريسنت أو المستضد (على سبيل المثال ، الديجوكسيجينين) وكميته في الأنسجة باستخدام التصوير الإشعاعي الذاتي أو الفحص المجهري الفلوري أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، على التوالي. يمكن لـ ISH أيضًا استخدام اثنين أو أكثر من المجسات ، الموصوفة بالنشاط الإشعاعي أو غيرها من الملصقات غير المشعة ، للكشف في وقت واحد عن نصين أو أكثر.

    يمكن استخدام تقنية بديلة ، مقايسة الحمض النووي المتفرعة ، مع الحمض النووي الريبي (mRNA ، و lncRNA ، و miRNA) فى الموقع مقايسات التهجين بحساسية جزيء واحد دون استخدام النشاط الإشعاعي. يمكن استخدام هذا النهج (على سبيل المثال ، فحوصات ViewRNA) لتصور ما يصل إلى أربعة أهداف في اختبار واحد ، ويستخدم تصميم مسبار حاصل على براءة اختراع وتضخيم إشارة bDNA لتوليد إشارات حساسة ومحددة. يتم إصلاح العينات (الخلايا والأنسجة و CTCs) ، ثم يتم معالجتها للسماح بإمكانية الوصول إلى هدف RNA (إلغاء إخفاء RNA). تهجين مجسات محددة الهدف لكل RNA مستهدف. يعتمد تضخيم الإشارة اللاحق على تهجين محدد للمجسات المجاورة (قليل النوكليوتيدات الفردية [oligos] التي ترتبط جنبًا إلى جنب مع أهداف الحمض النووي الريبي). سيحتوي المسبار الخاص بالهدف النموذجي على 40 قليل النوكليوتيدات ، مما ينتج عنه 20 زوجًا قليل النوكلي يرتبط جنبًا إلى جنب على الهدف للكشف عن mRNA و lncRNA ، و 2 oligos أو زوج واحد للكشف عن ميرنا. يتم تحقيق تضخيم الإشارة عبر سلسلة من خطوات التهجين المتسلسلة. يتم تهجين جزيء المضخم المسبق لكل زوج قليل على الحمض النووي الريبي المحدد الهدف ، ثم يتم تهجين جزيئات مضخم متعددة لكل مضخم مسبق. بعد ذلك ، يتم تهجين oligonucleotides مسبار متعدد الملصقات (مترافق مع الفوسفاتاز القلوي أو مباشرة إلى الفلوروفور) لكل جزيء مضخم. يحتوي هيكل تضخيم الإشارة المجمّع بالكامل "شجرة" على 400 موقع ربط لتحقيقات التسمية. عندما ترتبط جميع المجسات الخاصة بالهدف بنسخة mRNA المستهدفة ، يحدث تضخيم إشارة بمقدار 8000 ضعف لذلك النص الواحد. تتيح أنظمة تضخيم الإشارة المنفصلة ولكن المتوافقة إجراء فحوصات تعدد الإرسال. يمكن تصور الإشارة باستخدام مجهر مضان أو برايتفيلد.

    5.6 المراجع

    Ghannam، M.G.، and Varacallo، M. (2018) Biochemistry، Polymerase Chain Reaction (PCR) StatPearls Publishing. متاح على: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK535453/

    كان ، إن تي. (2018) الدور الناشئ للمعلومات الحيوية في التكنولوجيا الحيوية. J. Biotech. وبيوميد. العلوم 1 (3) ISSN: 2576-6694. متاح على: https://openaccesspub.org/jbbs/article/803

    Lee LYY و Izzard L و Hurt AC (2018) مراجعة لقاحات الحمض النووي ضد الإنفلونزا. أمام. إمونول. 9: 1568. دوى: 10.3389 / fimmu.2018.01568 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6046547/pdf/fimmu-09-01568.pdf

    Molnar، C. and Gair، J. (2019) 10.1 الاستنساخ والهندسة الوراثية. فصل في مفاهيم علم الأحياء & # 8211 الطبعة الكندية الأولى. متاح على: https://opentextbc.ca/biology/

    Nidhi M. المعلوماتية الحيوية: مقدمة. افتح Acc Biostat Bioinform. 1 (4). OABB.000522. 2018. DOI: 10.31031 / OABB.2018.01.0005 22 https://pdfs.semanticscholar.org/f220/86467e2532106c8c616f03fc0a61aff9b3ea.pdf

    Seto ، D. (2010) الجينوميات الفيروسية والمعلوماتية الحيوية. الفيروسات 2: 2587-2593. دوى: 10.3390 / v2122587


    شاهد الفيديو: قياس تركيز ونقاوة الحمض النووي + الترحيل الكهربائي على هلام الاكاروز (كانون الثاني 2022).