معلومة

لماذا يحتوي ناقل التعبير pET على جين LacI بالإضافة إلى الجينوم؟


يستخدم البلازميد pET للتعبير عن البروتين مع المروج T7 في سلالات التعبير ، مثل بكتريا قولونية BL21 (DE3)

يحتوي على جين lacI الذي يرمز إلى بروتين مثبط lac ، وهو بروتين مهم تحت سيطرة مروج T7 لبوليميراز T7 RNA ومشغل lac يمكنه منع النسخ ، خلف المحرك مباشرةً. يعد lac operon عنصر تحكم آخر في نسخ البروتين محل الاهتمام.

علاوة على ذلك ، يوجد T7 بوليميراز في الجينوم وكذلك تحت سيطرة أوبرون lac.

عند إضافة IPTG ، يتم تعطيل مثبط lac -> T7 بوليميراز وبالتالي سيتم التعبير عن البروتين المطلوب.

إن جين Lac I موجود بالفعل في جينوم سلالة التعبير المستخدمة ، فلماذا يتم استنساخه أيضًا في نواقل pET؟


وفقا لهذا المقال ، واحد لاسي ينتج عن نسخة الجين حوالي 10 نسخ من بروتين lacI لكل خلية ، ويمكننا أن نستنتج ، بالتالي ، أن هذه هي الكمية المطلوبة للاحتفاظ بنسخة واحدة لاك أوبرون مكبوت. يذكر المقال أيضًا لاسيس طفرة في المروج لاسي مما يؤدي إلى زيادة مستوى بروتين lacI بمقدار عشرة أضعاف.

اذا كان لاك يوجد بناء التعبير في أكثر من 100 نسخة لكل خلية ، والنتيجة ستكون قمعًا للتسرب ، ويمكن أن يؤدي ذلك إلى اختيار الطفرات في الجين المعني إذا كان له تأثيرات ضارة على البكتيريا المضيفة. أسهل طريقة للتغلب على هذه المشكلة هي وضع ملف لاسي (أو لاسيس) الجين على التعبير البلازميد بحيث تتناسب مستويات المثبط مع عدد نسخ لاك عامل التشغيل ، كما هو الحال في ناقلات الحيوانات الأليفة.


نظرة عامة على علامات التقارب لتنقية البروتين

كانت علامات التقارب الأولى المستخدمة عبارة عن بروتينات كبيرة تستخدم بشكل حصري تقريبًا لتعبير البروتين وتنقيته في بكتريا قولونية. واحدة من هذه العلامات ، بروتين المكورات العنقودية A ، يبلغ طولها 280 حمض أميني ، وبسبب حجمها الكبير نسبيًا واستقرارها التحلل للبروتين ، يمكن أن تزيد من قابلية الذوبان و / أو التعبير عن البروتينات غير المتجانسة (Sambrook et al. ، 1989). يمكن تنقية اندماج البروتين A بواسطة كروماتوغرافيا التقارب على IgG Sepharose (K.د = 10 نانومتر) ويتم التصفية التتابعية باستخدام عازلة منخفضة الأس الهيدروجيني (الوحدة 9.5) أو البروتياز ، فإن الحجم الكبير للعلامة و / أو انخفاض درجة الحموضة يمكن أن يؤدي إلى تمسخ وفقدان نشاط بروتين الاندماج ، وبالتالي تغيير نشاطه الوظيفي. يمكن لاسترداد البروتياز أن يشق البروتين الموسوم نفسه ، مما يؤدي إلى نفس النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ارتباط بروتينات الاندماج بـ IgG يعقد التحليل المناعي ، وبالتالي فإن اندماج البروتين A غير مناسب للاستخدام ككواشف مناعية.

أدت التطورات الحديثة في تقنية الاسترداد إلى تحسين القدرة على عزل البروتين A والمركبات البروتينية المرتبطة به في شكله النشط من IgG Sepharose. يستخدم Bio-Ox ، وهو شكل بيوتينيلاتيد من ببتيد FcIII ، تقاربه العالي تجاه IgG (Kد = 11 نانومتر) (Strambio-de-Castillia et al. ، 2005). يتنافس Bio-Ox مع البروتين A للارتباط بـ IgG ، مما يؤدي إلى التصفية الفعالة للبروتين المؤتلف. تزيد إضافة البيوتين من قابلية ذوبان FcIII دون التأثير على ألفة الارتباط للببتيد نفسه (Strambio-de-Castillia et al. ، 2005) ، وبالتالي فهي طريقة شطف مثالية لتنقية اندماج البروتين A في أشكالها الأصلية. الأنظمة التجارية متوفرة من GE Healthcare Life Sciences (الجدول 9.9.1).

الجدول 9.9.1

خصائص علامات تقارب البروتين

بطاقة شعارالطول (se-
كوينس)
موقعمصفوفة / شطفالأنظمة التجارية
(المورد)
الاستخدام (الاستخدامات) النموذجيتعليقاتأشير-
ences
بروتين ربط الألبومين (ABP)137N- مصطلح أو C- مصطلحالألبومين / انخفاض درجة الحموضة أو التمسخ (مثل الحرارة واليوريا)غير متوفرتنقية وزيادة التعبير وزيادة الذوبانقد يزيد من استقرار التحلل البروتيني لبروتينات الاندماج لزيادة التعبير قد يحسن قابلية الذوبان الاندماجية العالية للارتباط بالألبومين في مصفوفة الأنظمة حقيقية النواة لها قابلية محدودة لإعادة الاستخدام أو ظروف شطف الأس الهيدروجيني المنخفضة قد تؤثر على خصائص الاندماجنيلسون وآخرون (1997 أ)
الفوسفاتيز القلوي (AP)444الأمينات الأولية (سلسلة جانبية ليسين إبسيلون أمينات و N- طرفي & # x003b1- أمين)مللي أمبير / درجة حموضة منخفضةEasyLink Alkaline phosphatase Conjugation Kit (AbCam) Lightning-Link & # x02122 Alkaline Phosphatase Kit (Innova) gWIZ يفرز ناقل تعبير AP (Genlantis)كشف وتنقيةالكشف اللوني مفيد في النشاف الغربي ، النشاف الغربي البعيد ، النشاف الجنوبي ، الساندويتش ELISA ، والتوطين تحت الخلوي في أنظمة التعبير البكتيرية والثديية. المصفوفة محدودة قابلية إعادة استخدام AP وقد يؤثر الحجم الكبير على خصائص الاندماج.لازاروني وآخرون (1985)
حلقة AU16 (DTYRYI)N- مصطلح أو C- مصطلحمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةEpitope Tag Peptide ، مجموعة AU1 (كوفانس)كشف وتنقيةلا يعطي تنقية الجسم المضاد غلات عالية وقد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني المنخفض بشكل لا رجعة فيه على خصائص البروتين.غولدشتاين وآخرون. (1992)
حلقة AU56 (TDFYLK)N- مصطلح أو C- مصطلحمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةEpitope Tag Peptide ، مجموعة AU5 (كوفانس)كشف وتنقيةلا يعطي تنقية الجسم المضاد غلات عالية وقد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني المنخفض بشكل لا رجعة فيه على خصائص البروتين.كريسبو وآخرون. (1997)
حاتمة الجراثيم T7 (علامة T7)11 (MASMTGGQQMG)N- مصطلح أو داخليمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةمجموعة تنقية التقارب T7-tag (EMD Millipore)تنقية وزيادة التعبيرقد يزيد أحد عشر نوعًا من الأحماض الأمينية من جين Phage T7 10 من التعبير عن بروتينات الاندماج.ماكريدس (1996)
حاتمة الجراثيم V5 (علامة V5)14 (GKPIPNPLLGLDST)C- مصطلحغير متوفرأنظمة توجيهية محددة لـ PET TOPO و pBAD و Gateway (تقنيات الحياة) V5 علامة الببتيد و mAb (AbCam)كشفالجسم المضاد ذو التعرّف الخطي القصير المحدد في المحللات البكتيرية ، على الرغم من أن بعض التفاعل التبادلي في ليسات الثدييات غالبًا ما يستخدم مع علامة His-tag لتنقية البروتينماكلين وآخرون. (2001)
بروتين ناقل البيوتين الكربوكسي (BCCP)100N- مصطلح أو C- مصطلحأفيدين أو ستربتافيدين / بيوتين أو تمسخ (مثل الحرارة واليوريا)نظام PinPoint (Promega) Panorama & # x000ae Antibody Arrays (Sigma-Aldrich)الكشف والتنقية والتثبيتالعلامة هي biotinylated في الجسم الحي يمكن إفراز تنقية بروتين الانصهار بخطوة واحدة من أجل تنقية ملائمة يمكن استخدام علامة البيوتين لتثبيط الاندماج إلى الأسطح المطلية بالستربتافادين ، على سبيل المثال رنين البلازمون السطحي (SPR) رقائق خلفية عالية مرتبطة بأفيدين في أنظمة حقيقية النواة قد يكون الشطف بالبيوتين غير فعال يتطلب تغيير طبيعة الشطف إعادة تشكيل بروتين الاندماج Promega SoftLink avidin ، وهو جزء من نظام PinPoint ، يسمح بالشطف في ظل ظروف معتدلةنيلسون وآخرون (1997 ب)
علامة فيروس اللسان الأزرق (علامة ب)6 (QYPALT)N- مصطلح أو C- مصطلحمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةغير متوفركشف وتنقيةمنطقة VP7 لتنقية الجسم المضاد لفيروس اللسان الأزرق لا تعطي عوائد عالية وقد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني المنخفض بشكل لا رجعة فيه على مصفوفة خصائص البروتين ذات قابلية محدودة لإعادة الاستخداموانغ وآخرون. (1996)
الببتيد المرتبط بالكالموديولين (CBP)26N- مصطلح أو C- مصطلحCalmodulin / EGTA أو EGTA وملح عالينظام تعبير وتنقية البروتين المتقارب (Agilent Technologies)التنقية والتعبيرحافز التعرف القصير نسبيًا ليس داخليًا بكتريا قولونية تسمح البروتينات التي تربط التسلسل المستهدف لـ kalodulin PKA بـ 32 مصفوفة عالية الإنتاجية P-label متوافقة مع عوامل الاختزال والمنظفات ، ولكن قابلية إعادة الاستخدام المحدودة غير مفيدة للتنقية من علامة الخلايا حقيقية النواة عند الطرف N قد تقلل من كفاءة الترجمةتيربي (2003)
الكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز (CAT)218N- المدىكلورامفينيكول / كلورامفينيكولمتجهات gWiz & # x02122 متجهات عالية التعبير (Genlantis)الكشف والتنقية وزيادة الذوبانالمقايسة الأنزيمية المتاحة لتقدير كمية البروتين لا تعطي تنقية الكلورامفينيكول عوائد عالية ، وقد تؤثر العلامة الكبيرة على خصائص بروتين الاندماجPodbielski et al. (1992)
مجال ربط السليلوز (CBP)27 & # x02013189N- مصطلح ، C- مصطلح ، أو داخلي (يعتمد على المجال)السليلوز / تمسخ (الأسرة I CBDs) أو الإيثيلين جلايكول (الأسرة II أو III CBDs)مجموعة ناقلات pCAL-n و pCAL-n-EK و pCAL-n-FLAG و pCAL-c (Agilent Technologies)التنقية والإفراز والشللالارتباط الذي لا رجوع فيه لبعض CBDs إلى السليلوز مفيد في تثبيت الارتباط القابل للانعكاس لعائلات CBD I و II و III المفيدة لتنقية تنقية العائلة الأولى من اندماج CBD يستلزم تجسيد البروتين المنقى للعائلة II CBD يجب أن يتم تبادلها مؤقتًاتيربي (2003)
مجال ربط الكيتين (CBD)51N- مصطلح أو C- مصطلحالكيتين (عند دمجه مع إينتين) / عامل اختزال يحتوي على ثيول (على سبيل المثال ، DTT أو & # x003b2-ME)نظام إمباكت (نيو إنجلاند بيولابس)طهارةتستخدم عادةً جنبًا إلى جنب مع التنقية ذاتي التضفير لعلامة intein ذات الخطوة الواحدة لما يقرب من 100٪ من البروتين النقي مع عوائد منخفضة من المليغرام ، يجب إجراء مصفوفة متوافقة مع تنقية عالية الملح والمنظفات غير الأيونية في غياب عوامل الاختزال المحتوية على الثيول حتى يمكن شطف خطوة الانصهار البروتين لها تأثير على كفاءة الانقسامتيربي (2003)
مجال ربط الكولين (CBD)145N- مصطلحالكولين / الكولين أو الببتيد CBDتنقية البروتين على مرحلتين من LYTAG (تحلل دقيق)التنقية والشلليمكن لـ N-term CBD أن يجمد بروتين الانصهار على رقاقة ذهبية مغلفة بالكولين من أجل SPR أو دراسات مجهرية قد تؤثر علامة كبيرة أو وضع علامة C على بروتينات الاندماججونز وآخرون. (1995)
اختزال ثنائي هيدروفولات (درهم)227N- مصطلح أو C- مصطلحميثوتريكسات / حمض الفوليكمجموعة ناقلات pQE (Qiagen)زيادة التعبيرقد يزيد من الاستقرار التحلل للبروتينات الاندماجية لزيادة التعبير عن القليل من المناعة في الفئران والجرذان ، وبالتالي ، فهو مفيد لتوليد الأجسام المضادة لدمج تنقية الميثوتريكسات لا يعطي عوائد عالية مقترنة عادةً بعلامة تقارب قصيرة (على سبيل المثال ، علامة ، علامة Strep ) للتنقيةموراندي وآخرون. (1984)
حاتمة E210 (SSTSSDFRDR)N- مصطلح ، C- مصطلح أو داخليمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةمجموعة علامات وكشف E2 (Abcam)كشف وتنقيةمشتق من بروتين الورم الحليمي البقري من النوع 1 ، الأجسام المضادة الأولية E2 المتاحة للكشف اللوني والكيميائي للأجسام المضادة لا تعطي عوائد عالية ، قد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني المنخفض بشكل لا رجعة فيه على مصفوفة خصائص البروتين محدودة قابلية إعادة الاستخدامكالدالو وآخرون. (2000)
حاتمة FLAG8 (DYKDDDK)N- مصطلح أو C- مصطلحmAb / منخفض pH ، EDTA ، أو ببتيد FLAGنظام FLAG (Sigma-Aldrich)كشف وتنقيةعزر التعرف الخطي القصير على بروتين نقي معتدل في خطوة واحدة ينشق enterokinase بعد C-term Lys لإزالة العلامة تمامًا ، اعتمادًا على هوية أول حمض أميني لجسم مضاد للانصهار M1 يمكن فقط ربط العلامة عند تنقية الجسم المضاد N-term لا يعطي عوائد عالية منخفضة قد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني بشكل لا رجعة فيه على مصفوفة خصائص البروتين ذات قابلية محدودة لإعادة الاستخدامتيربي (2003)
بروتين ربط الجالاكتوز (GBP)509N- مصطلح أو C- مصطلحالجالاكتوز / الجالاكتوزغير متوفرتنقية وزيادة الذوبانقد يكون بروتين الانصهار مستهدفًا في محيط البلازما لتنقية ملائمة للمستخلصات المحيطة بالبلازما الخام قد تزيد من قابلية ذوبان بروتينات الاندماج وقد تؤثر العلامة الكبيرة على خصائص بروتين الانصهارجونز وآخرون. (1995)
بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)220N- مصطلح أو C- مصطلحغير متوفرناقلات مراسل مستقرة phCMV الانصهار (Genlantis) CT-GFP
مجموعة استنساخ Fusion TOPO (تقنيات الحياة) gWIZ GFP متجه تعبير الثدييات (Genlantis)
كشفيمكن أن يسمح التألق الجوهري بالكشف الأصلي دون تعبير محدد عن الأجسام المضادة للأجسام المضادة لـ GFP في أنظمة التعبير بدائية النواة وحقيقية النواة ، وكذلك الكائنات الحية الكاملة (مثل الديدان والنباتات والفئران) المفيدة لمراقبة التعبير الجيني ، وطي البروتين ، والاستهداف ، وكذلك تفاعلات البروتين والبروتين ، عن طريق FRET ، قد تؤثر بعض عمليات اندماج GFP غير الموجهة بشكل خاص إلى نواة علامة كبيرة جدًا أو ثنائيات GFP على خصائص الانصهارجيرديس وكايثر (1996)
Glu-Glu (علامة EE)6 (EYMPME أو EFMPME)N- مصطلح ، أو C- مصطلح ، أو داخليmAb / منخفض pH أو حضانة 30 & # x000b0CEpitope Tag Peptide ، مجموعة GLU-GLU (كوفانس)كشف وتنقيةيتعرف الجسم المضاد المتوفر القصير والمتوفر على عناصر EYMPME فقط ، حيث أن تنقية الجسم المضاد الحافز لـ EYMPME لا تعطي عوائد عالية ، أو انخفاض درجة الحموضة أو 30 & # x000b0C قد يؤثر بشكل لا رجعة فيه على مصفوفة خصائص البروتين محدودة قابلية إعادة الاستخدامروبينفيلد وآخرون (1991)
الجلوتاثيون S-ترانسفيراز (GST)211N- مصطلح أو C- مصطلحالجلوتاثيون / الجلوتاثيون المختزلنظام pGEX (GE Healthcare) GST & # x02022Bind & # x02122 System (EMD Millipore)الكشف ، التنقية ، زيادة التعبير ، زيادة الذوبان ، والشللعلامة تنقية شائعة جدًا تنقية بخطوة واحدة لمجموعات محددة من الأجسام المضادة للكشف عن البروتين النقي نسبيًا لبروتينات اندماج GST الشائعة (على سبيل المثال ، SPR ، المقايسات الأنزيمية) مصفوفة قابلة لإعادة الاستخدام نسبيًا (من أربعة إلى عشرين مرة) GST عبارة عن تنقية مستضدية عالية في ظل الظروف الأصلية فقط بعض عمليات اندماج GST قد يؤثر تقلل GST غير القابل للذوبان و / أو شطف الجلوتاثيون على خصائص بروتين الاندماجسميث (2000)
هيماجلوتينين الأنفلونزا البشرية (HA)31N- مصطلح ، C- مصطلح أو داخليmAb / انخفاض درجة الحموضة أو الببتيد HAمجموعة ناقلات علامة HA (Clontech) & # x003bcMACS و multiMACS HA Isolation Kit (Miltenyi Biotec)كشف وتنقيةالأجسام المضادة لـ HA المحددة المفيدة في أنظمة التعبير عن الثدييات ، لا يعطي تنقية الجسم المضاد غلات عالية ، وقد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني المنخفض بشكل لا رجعة فيه على خصائص البروتين.تاي وآخرون. (1988)
HaloTag & # x000ae312N- مصطلح أو C- مصطلحHaloLink & # x02122 الراتنج / HaloTag & # x000ae العازلة و TEV Proteaseنظام تنقية البروتين HaloTag & # x000ae (Promega)تنقية وزيادة الذوبان والتعبيريجب شراء يجند مختلف لكل تجربة مختلفة ظروف الغسيل الصارمة قد تؤثر على خصائص الاندماج ويعمل بسرعة وفي الخلايا الحيةلوس وآخرون. (2008)
علامة تقارب الهيستيدين (HAT)19 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK)N- مصطلح أو C- مصطلحمعدن ثنائي التكافؤ (Ni 2+ أو Co 2+ أو Cu 2+ أو Zn 2+) / إيميدازول أو درجة حموضة منخفضةنظام التعبير عن البروتين وتنقيته HAT (Clontech)طهارةتسلسل البروتين الطبيعي الذي تم العثور عليه لاستخلاص المعادن ثنائية التكافؤ نموذج التعرف القصير يحتوي على ستة هيستيدين تتخللها أحماض أمينية أخرى.يمكن تجديد البروتين شبه النقي في مصفوفة خطوة واحدة وإعادة استخدامه بشكل لا نهائي تقريبًا لا يربط راتينج تقارب المعادن بإحكام مثل العلامة أو شروط الشطف قد يؤثر على خصائص الانصهارتيربي (2003)
بيروكسيداز الفجل (HRP)400الأمينات الأولية (سلسلة جانبية ليسين إبسيلون أمينات و N- طرفي & # x003b1- أمين)غير متوفرEZ-Link Plus Activated Peroxidase and Kit (بيرس)كشفالكشف عن اللمعان الكيميائي مفيد في النشاف الغربي ، وشطيرة ELISA ، والكيمياء المناعية غير الموصى بها كعلامة لتنقية البروتين.Imagawa et al. (1982)
حاتمة HSV11 (QPELAPED)C- مصطلحمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةHSV & # x02022Tag & # x000ae Kit (EMD Millipore)طهارةوضع علامة C-term فقط تنقية الجسم المضاد لا يعطي عوائد عالية وقد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني المنخفض بشكل لا رجعة فيه على خصائص البروتين المصفوفة ذات قابلية محدودة لإعادة الاستخدامفريتز وأندرسون (2000)
إيزوميراز الكيتوستيرويد (KSI)125N- مصطلحغير متوفرpET-31b (+) ناقل (EMD ميليبور)زيادة التعبيريُستهدف البروتين غير القابل للذوبان ليشمل الأجسام التي عادةً ما يقترن بعلامة تقارب قصيرة (علامة له ، علامة Strep) لتنقية البروتينات السامة ، ولكن إعادة التشكيل ضروريةكوليوبولوس والش (1994)
حاتمة KT311 (KPPTPPPEPET)N- مصطلح أو C- مصطلحمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةغير متوفركشف وتنقيةلا يعطي تنقية الجسم المضاد ذي التعرف الخطي القصير عوائد عالية وقد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني المنخفض بشكل لا رجعة فيه على خصائص البروتين.كواترا وآخرون (1995)
لاكز1024N- مصطلح أو C- مصطلحAPTG / عازلة بورات عالية درجة الحموضةLacZ & # x00026 Beta-Gal Vectors and Assay Kit (Clontech) gWIZ & # x003b2-galactosidase mammalian vector vector (Genlantis)الكشف والتنقية وزيادة التعبيريُعرف أيضًا باسم & # x003b2-galactosidase أو & # x003b2-gal المقايسة الأنزيمية المتاحة لتقدير كمية البروتين قد تزيد من الاستقرار التحلل للبروتينات الانصهار لزيادة التعبير الانصهار قد تكون علامة كبيرة للغاية غير قابلة للذوبان تشكل رباعي الأبعاد في المحلول ، مما قد يؤثر على خصائص بروتين الاندماجتاي وآخرون. (1988)
لوسيفراس551N- المدىغير متوفرناقل تعبير الثدييات gWIZ luciferase (Genlantis) نظام الفحص Luciferase (Promega)كشفيمكن أن يعمل Luminescent كمراسل فور الترجمة مفيدًا للدراسات التي تتضمن التهجين في الموقع ، ومعالجة الحمض النووي الريبي ، وترنسفكأيشن RNA أو النسخ / الترجمة المختبرية ، وطي البروتين ، والتصوير مع 35 S لا يمكن إزالة أكثر من خمسة أكواد من قد يؤثر المصطلح N أو C للحفاظ على النشاط الأنزيمي على خصائص الانصهاركارب وأكر بلوم (1999)
بروتين ربط المالتوز (MBP)396N- مصطلح أو C- مصطلحأميلوز / مالتوز متصالبVector Fusion-Aid MBP Kit (Vector Laboratories) نظام pMAL (نيو إنجلاند بيولابس)الكشف والتنقية وزيادة التعبير وزيادة الذوبانيمكن أن يؤدي التنقية بخطوة واحدة لمصفوفة البروتين النقي نسبيًا (& # x0003e70٪) المتوافقة مع المنظفات غير المؤينة والملح العالي ، ولكن ليس عوامل الاختزال إلى زيادة التعبير عن البروتينات حقيقية النواة في العلامة الخاصة بالأجسام المضادة لـ MBP للبكتيريا عند مصطلح N يمكن أن تقلل من كفاءة الترجمة جدًا قد يؤثر حجم العلامة الكبير على خصائص بروتين الاندماجنيلسون وآخرون (1997 ب) ، تيربي (2003)
حاتمة Myc11 (CEQKLISEEDL)N- مصطلح ، C- مصطلح أو داخليمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةpDual Expression System (Agilent Technologies) pET Express & # x00026 Purify Kits (Clontech)كشف وتنقيةحافز التعرف الخطي القصير على الجسم المضاد المضاد للفطريات الفطرية إلى حد ما لا يعطي تنقية الجسم المضاد المختلط عوائد عالية وقد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني المنخفض بشكل لا رجعة فيه على خصائص البروتين المصفوفة ذات قابلية محدودة لإعادة الاستخدامكولودزيج ويونغ (1991)
نوسا495N- مصطلح أو C- مصطلحغير متوفرنظام الانصهار pET NusA (EMD Millipore)زيادة التعبير والذوبانيزيد عامل إنهاء مضاد النسخ من الذوبان ويجب استخدام التعبير عن بروتينات الاندماج بالاقتران مع علامة تقارب أخرى لتنقية البروتين قد تؤثر العلامة الكبيرة على خصائص بروتين الانصهارتيربي (2003)
PDZ80 & # x0201390N- مصطلح ، C- مصطلح ، أو داخليعامل اختزال / تسلسل ترابط PDZ C- طرفي معطل (InaD PDZ1)غير متوفرالكشف والتنقية والتثبيتيمكن أن يكون نموذج التعرف الخطي القصير ، تفاعل PDZ-ligand محددًا جدًا وقد يؤدي تقليل الشطف إلى تعطيل خصائص بروتين الاندماجكيمبل وسونديك (2002)
PDZ يجند5 & ​​# x020137 (يختلف)C- مصطلحمجال PDZ المعطل / عامل الاختزال (NorpA C-terminus)غير متوفرالكشف والتنقية والتثبيتيمكن أن يكون نموذج التعرف الخطي القصير ، تفاعل PDZ-ligand محددًا جدًا وقد يؤدي تقليل التقارب الشديد إلى تعطيل خصائص علامة بروتين الانصهار يجب أن يكون عند الطرف C للربط بمجال PDZكيمبل وسونديك (2002)
بوليارجينين (Arg-tag)5 & ​​# x020136 (عادة 5 نسبة مراجعة)C- مصطلحراتنج التبادل الكاتيوني / تدرج ملح بدرجة حموضة عاليةغير متوفرالتنقية والشلليمكن تجميد الأهداف على الميكا للدراسات المجهرية القصيرة ، وقد يؤثر البروتين النقي جدًا في العلامة المشحونة بخطوة واحدة على البنية الثلاثية للبروتين و / أو خصائص البروتين ، والنجاح المحدود لانقسام العلامة بواسطة carboxypeptidase Bتيربي (2003)
بوليسبارتاتي (علامة الجانب)5 & ​​# x0201316 (DDDDD)C- مصطلحراتنج تبادل الأنيون / تدرج ملح بدرجة حموضة منخفضةغير متوفرطهارةقد تؤثر العلامة القطبية ذات التعرّف الخطي القصير على البنية الثلاثية للبروتين و / أو خصائص البروتينستيفنز (2000)
بوليسيستين (علامة Cys)4 (CCCC)N- المدىعامل الاختزال المحتوي على ثيوبروبيل سيفارو (E.G. ، DTT ، & # x003b2-ME)غير متوفرطهارةيجب إجراء عزر التعرف الخطي القصير على بروتين نقي إلى حد ما في خطوة واحدة تنقية في غياب عوامل الاختزال المحتوية على الثيول حتى خطوة الشطف التي تقلل الشطف قد تؤدي إلى تعطيل خصائص بروتين الاندماجستيفنز (2000)
بوليهيستيدين (علامته)2 & # x0201310 (عادة 6 HHHHHH)N- مصطلح أو C- مصطلحمعدن ثنائي التكافؤ (أي Ni 2+ أو Co 2+ أو Cu 2+ أو Zn 2+) / إيميدازول أو درجة حموضة منخفضةنظام QIAexpress (Qiagen) أنظمة توجيهية محددة لـ PET TOPO و pBAD و Gateway (تقنيات الحياة)الكشف والتنقية والتثبيتأكثر علامات التنقية شيوعًا ، تنقية التعرف الخطي بخطوة واحدة ، تنقية بروتين نقي بنسبة 20٪ & # x0201380٪ ، اعتمادًا على مستويات التعبير عن بروتين الانصهار التي تؤدي إلى تغيير طبيعة المصفوفة المحتملة ، يمكن إعادة استخدامها إلى أجل غير مسمى لتثبيط الاندماج إلى Ni-NTA SPR رقاقة ، ولكن التفكك الكبير يعقد علامة تحليل البيانات أو قد يؤثر الشطف على خصائص البروتين التي تكشف عن الأجسام المضادة شديدة الاختلاطبورنهورست وفالك (2000)
بوليفينيل ألانين (Phe-tag)11 (FFFFFFFFFFF)N- المدىفينيل سيفروز / إيثيلين جلايكولغير متوفرطهارةقد يعطل عنصر التعرف الخطي القصير البروتين النقي بشكل معتدل في علامة غير قطبية بخطوة واحدة أو شطف الإيثيلين جلايكول خصائص بروتين الاندماجستيفنز (2000)
Profinity eXact75N- المدىمثبط البروتياز / الفلوريد العازلة والبروتياز السوبتيليزين الناضجProfinity eXact & # x02122 Fusion-Tag System (Bio-Rad)التعبير والتنقيةيمكن تجديد العمود للتنقية والانقسام السريع لمرة واحدة (30 دقيقة) إلى أجل غير مسمى.Abdulaev et al. (2005) ، بياو وآخرون. (2004) ، Ruan et al. (2004)
بروتين سي12N- مصطلح أو C- مصطلحالمخزن المؤقت mAb / Ca 2+نظام وضع العلامات على بروتين سي (روش)كشف وتنقيةعزر التعرف الخطي القصير على الجسم المضاد المضاد للكمبيوتر يرتبط في Ca 2+ - شطف بطريقة معتمدة بواسطة Ca 2+ في ظروف العازلة الفسيولوجية لا يعطي تنقية الجسم المضاد عوائد عاليةفريتز وأندرسون (2000)
علامة S19 (NANNPDWDF)N- مصطلح أو C- مصطلحمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةغير متوفركشف وتنقيةتم اختبار المنطقة القصيرة من فيروس التهاب الكبد B S1 ، الحافز الخطي للتعرف على الجسم المضاد AP1 المحدد في أنظمة التعبير البكتيرية والثديية. إعادة الاستخدامبيرلوت (1999)
علامة S15 (KETAAAKFERQHMDS)N- مصطلح ، C- مصطلح أو داخليجزء S من RNase A / درجة حموضة منخفضةS & # x02022Tag & # x02122 مجموعة تنقية (EMD ميليبور)كشف وتنقيةعزر التعرف الخطي القصير ، يمكن إجراء مقايسة RNase S للمقايسة الكمية لمستويات التعبير.فريتز وأندرسون (2000)
الببتيد الرابط للستربتافادين (SBP)38C- مصطلحالستربتافادين / البيوتيننواقل التعبير عن النظام البكتيري SBP (Sigma-Aldrich)التنقية والشللعزر التعرف القصير نسبيًا على تجميد البروتين إلى وسائط مختلفة (على سبيل المثال ، حبات مغلفة بالستربتافادين ، ورقائق SPR) علامة على المدى C فقطتيربي (2003)
بروتين العنقوديات أ (بروتين أ)280N- المدىمفتش / درجة حموضة منخفضة أو مفتشناقلات pEZZ 18 و pRIT2T (GE Healthcare)تنقية وزيادة الذوبانقد يزيد الاستقرار التحليلي للبروتين من قابلية ذوبان بروتينات الانصهار.نيلسون وآخرون (1997 ب)
بروتين المكورات العنقودية G (بروتين G)280N- مصطلح أو C- مصطلحأميلوز / انخفاض درجة الحموضة أو الأميلوزبروتين AG Agarose ومجموعات (Thermo Scientific)تنقية وزيادة الذوبانقد يزيد الاستقرار التحليلي للبروتين من قابلية ذوبان بروتينات الانصهار ، التنقية المفرزة لا تعطي غلات عالية حجم علامة كبير و / أو انخفاض درجة الحموضة قد يؤثر بشكل لا رجعة فيه على خصائص البروتين مصفوفة ذات قابلية محدودة لإعادة الاستخدامنيلسون وآخرون (1997 ب)
العقديات8 & # x020139 (WSHPQFEK) أو (AWAHPQPGG)N- مصطلح أو C- مصطلحStrep-Tactin (الستربتافادين المعدل) / البيوتين أو الديشيوبيوتينبكتيريا- العلامة & # x000ae & # x02013 بكتيريا-Tactin & # x000ae system (IBA GmbH) Strep-tag & # x000ae Expression Vectors (Neuromics)الكشف والتنقية والتثبيتمصفوفة عزر التعرف الخطي القصيرة القابلة للتجديد مفيدة للتنقية في ظل الظروف اللاهوائية ، وعرض سطح الخلية حقيقية النواة ، وعدم الحركة للأسطح المطلية بالستربتافادين (على سبيل المثال ، رقائق SPR) قد تكون ظروف الربط المحددة غير مناسبة لبعض عمليات الاندماجسكيرا وشميدت (2000)
ستربتافادين159N- مصطلح أو C- مصطلحالبيوتين / البيوتين أو التمسخ (مثل الحرارة واليوريا)غير متوفرالكشف والتنقية وزيادة التعبير والشللقد يزيد من استقرار التحلل البروتيني لبروتينات الاندماج لزيادة التعبير عن تقارب عالٍ للغاية للبيوتين المفيد لتثبيط الاندماج على الأسطح مثل رقائق SPR كبيرة الحجم أو تكوين رباعي النواة قد لا يتم إطلاقه عند إضافة بروتين اندماج البروتين ، مما يستلزم تغيير طبيعة الشطف متبوعًا بإعادة تشكيل طفرات streptavadin الأحدث التي لها ارتباطات أقل بالبيوتين المفيد للتنقيةسانو وآخرون. (1998)
معدل صغير يشبه اليوبيكويتين (سومو)100N- المدىNi-NTA أو NI-IMAC أو الكروماتوغرافيا / السومو بروتيازChampion & # x02122 pET SUMO Expression System (تقنيات الحياة) SUMOstar Kits (LifeSensors) Expresso & # x000ae SUMO Cloning and Expression Systems (Lucigen)زيادة الذوبان والتعبيريسمح بدراسات تفاعل البروتين الخلوي المتاحة لأنظمة التعبير البكتيرية والخميرة والحشرات والثدييات ، تحتوي علامات الديسومويليز وعلامات سومو على علامات His6 لجعل إزالتها فعالة ويمكن استخدامها في وضع العلامات على البروتين في المختبر إلى جانب في الجسم الحي
تنقية التقارب الترادفي (TAP)عاملN- مصطلح أو C- مصطلحتعتمد على متغيرات TAPInterPlay Mammalian TAP System (Agilent Technologies) نظام FLAG & # x000ae HA (Sigma-Aldrich)طهارةينتج عن التنقية المكونة من خطوتين بروتين عالي النقاء مع انخفاض ظروف الشطف الخفيفة غير المحددة في الخلفية لا تؤثر على خصائص الانصهار.لي (2011)
حاتمة T7260N- المدىمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةغير متوفرتنقية وزيادة التعبيرقد يزيد من التعبير عن بروتينات الاندماج يستهدف البروتين غير القابل للذوبان ليشمل أجسامًا تؤدي إلى تغيير طبيعة تنقية البروتينات السامة يستلزم إعادة تشكيلهاستيفنز (2000)
ثيوردوكسين (تركس)109N- مصطلح أو C- مصطلحأكسيد فينيلارسينين / عامل اختزال يحتوي على ثيول (على سبيل المثال ، DTT ، & # x003b2-ME)نظام ThioFusion (تقنيات الحياة)زيادة الذوبانقد يزيد استقرار الحرارة من قابلية ذوبان بروتينات الاندماج.تيربي (2003)
TRPE25 & # x02013336N- مصطلح أو C- مصطلحمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةغير متوفرتنقية وزيادة التعبيرقد يتم استهداف التركيبات الأكبر التي تم التعبير عنها لتشمل الأجسام (مما يسمح بالتعبير عالي المستوى عن الجينات السامة) لا تعطي تنقية الجسم المضاد غلات عالية وقد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني المنخفض بشكل لا رجعة فيه على خصائص البروتين.ستيفنز (2000)
يوبيكويتين76N- المدىغير متوفرغير متوفرزيادة الذوبانقد يزيد من قابلية ذوبان البروتينات المعبر عنها في بكتريا قولونية غير مفيد للتعبير في الخلايا حقيقية النواةستيفنز (2000)
عالمي6 (HTTPHH)N- مصطلح ، C- مصطلح أو داخليمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةغير متوفركشف وتنقيةيتم ترجمة تسلسل HTTPHH بغض النظر عن إطار القراءة لسهولة استنساخ نسخ متعددة من العلامات ، مما يزيد من خصوصية الجسم المضاد الثابت يمكن لـ mAb ربط نسخ علامات متعددة في دراسات SPR.نيلسون وآخرون. (1999)
VSV-G11 (YTDIEMNRLGK)C- مصطلحمللي أمبير / درجة حموضة منخفضةناقل pVPack-VSV-G (ميليبور EMD)كشف وتنقيةبقايا C-term من البروتين النقي نسبيًا VSV-G في خطوة واحدة ، لا تعطي تنقية الجسم المضاد غلات عالية وقد يؤثر شطف الأس الهيدروجيني المنخفض بشكل لا رجعة فيه على مصفوفة خصائص البروتين ذات قابلية محدودة لإعادة الاستخدام

لاكز ، المعروف أيضًا باسم & # x003b2-galactosidase أو & # x003b2-gal ، هو بروتين حمض أميني ثابت 1024 & # x02013 يمكن استخدامه كعلامة تقارب لزيادة التعبير عن بروتينات الانصهار في بكتريا قولونية (Sambrook وآخرون ، 1989). يمكن تنقية بروتينات الاندماج LacZ عن طريق كروماتوغرافيا تقارب الركيزة عند عدم الحركة ص-امينو-فينيل - & # x003b2-D-thio-galactosidase (APTG) ويتم التصفية التتابعية باستخدام عازلة عالية درجة الحموضة. ثم يتحقق الاكتشاف باستخدام المقايسة الأنزيمية اللونية. يعتبر LacZ محايدًا نسبيًا من الناحية المناعية ولذا فهو شريك اندماج مفيد لتوليد الأجسام المضادة لبروتين مهم. نظرًا لحجمها الكبير للغاية وميلها لتشكيل متجانسات متجانسة في المحلول ، يمكن لعلامة تقارب LacZ أن تغير النشاط الوظيفي لبروتين الاندماج المنقى. بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما تكون بروتينات الاندماج LacZ غير قابلة للذوبان. عدم الذوبان هذا له مزايا وعيوب: استهداف البروتين للأجسام المتضمنة يمكن أن يسمح بالتعبير عن منتجات الجينات السامة بكتريا قولونية، ولكن نظرًا لأنه يجب طي LacZ بشكل صحيح لربط APTG ، يجب إعادة طوى بروتينات الاندماج LacZ قبل التنقية و / أو الكشف (الوحدة 6.5).


الملخص

تمايز الكيسات غير المتجانسة في البكتيريا الزرقاء أنابينا ص. تتطلب سلالة PCC 7120 NtcA ، منظم النيتروجين العالمي في البكتيريا الزرقاء ، و HetR ، المنظم الرئيسي لتمايز الكيسات غير المتجانسة. التعبير عن هتر يتم تنظيمه عن طريق الحرمان من النيتروجين ، ويعتمد تنظيمه على NtcA. ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن كيفية تنظيم NtcA للتعبير عن هتر. في التجارب المقدمة هنا ، تم التأكيد على أن NrrA (All4312) ، وهو منظم استجابة يستجيب للنيتروجين ، كان مطلوبًا لتنظيم هتر. استخدام مواقع بدء النسخ المستجيبة للنيتروجين (TIS) لـ هتر الجين يعتمد على NrRA. NrrA مرتبطة على وجه التحديد بالمنطقة المنبع من TISs الموجودة في المواضع & # x02212728 و & # x02212696 في المختبر. الإفراط في التعبير عن nrrA أدى إلى تعزيز هتر التعبير وتشكيل الكيسات غير المتجانسة. تم اقتراح سلسلة تنظيمية جزيئية حيث تقوم NtcA بتنظيم التعبير عن nrrA عند الحد من النيتروجين المركب في الوسط ، ثم ينظم NrrA التعبير عن هتر، مما يؤدي إلى تمايز الكيسات غير المتجانسة.

الكيسات غير المتجانسة هي خلايا متباينة نهائيًا من البكتيريا الزرقاء القادرة على تثبيت النيتروجين في الغلاف الجوي. عند الحد من النيتروجين المركب في الوسط ، تقوم خلايا نباتية معينة بتغيير شكلها إلى أكياس غير متجانسة مع تباعد منتظم من 10 إلى 15 خلية (10 ، 12 ، 29). في البكتيريا الزرقاء الخيطية أنابينا ص. سلالة PCC 7120 ، يقدر أن حوالي 10 ٪ من الجينات الموجودة على الكروموسوم قد تم تنظيمها أثناء تطور الكيسات غير المتجانسة (6 ، 7). تختلف الكيسات غير المتجانسة بشكل ملحوظ عن الخلايا النباتية في الجوانب الفسيولوجية والمورفولوجية (30). يوفر تطوير الكيسات غير المتجانسة نموذجًا ممتازًا لدراسة تمايز الخلايا وتشكيل الأنماط متعددة الخلايا.

ال هتر الجين هو جين رئيسي ينظم تمايز الكيسات غير المتجانسة. بينما الطفرة في هتر الجين يمنع الخطوات المبكرة في التمايز ، نسخ إضافية من هتر يؤدي إلى تكوين أكياس غير متجانسة متعددة متجاورة (النمط الظاهري Mch) في ظل ظروف استنفاد النيتروجين (4). التعبير عن هتر من بيت المروج ، الذي ينظمه النحاس ، يحث على تمايز الكيسات غير المتجانسة بغض النظر عن حالة النيتروجين الخلوي (5). مستوى هتر تزداد النصوص بعد فترة وجيزة من الحرمان من النيتروجين ، ويتم ترجمة تعبيرها إلى الأكياس غير المتجانسة (2). تنظيم هتر يعتمد على ntcA (9).

ال ntcA الجين ، المطلوب لتطوير الكيسات غير المتجانسة (9 ، 28) ، يشفر منظمًا نسبيًا يتحكم عالميًا في استقلاب النيتروجين في البكتيريا الزرقاء (19 ، 27). يرتبط بروتين NtcA ، الذي ينتمي إلى عائلة بروتين مستقبل AMP الدوري للمنظمات البكتيرية ، بمناطق المروج التي تحتوي على توقيع التسلسل GTAN8TAC (12) ، وتسلسل متناوب من ثماني قواعد ، TGTAN8يظهر TACA على أنه تسلسل ربط NtcA الأمثل عن طريق الاختيار في المختبر (15). يتم تعزيز نشاط ربط الحمض النووي لـ NtcA بواسطة 2-oxoglutarate (2-OG) (17 ، 26) ، والنسخ المعتمد على NtcA من glnA مروج المكورات المتزامنة ص. تزداد سلالة PCC 7942 في وجود 2-OG في المختبر (25). يُقترح أن يكون 2-OG جزيء إشارة ينقل المعلومات المتعلقة بحالة النيتروجين الخلوي (24) ويؤدي إلى تمايز الكيسات غير المتجانسة (17). إن المروجين المعتمدين على NtcA لـ هتر لا تحتوي على تسلسل التعرف على NtcA ، ولا يرتبط NtcA بأجزاء الحمض النووي المقابلة لـ هتر مناطق المروج (23). وبالتالي ، فإن الأساس الجزيئي للتنظيم المعتمد على NtcA لـ هتر ما زال مجهولا.

في الآونة الأخيرة وجدنا أن nrrA الجين (all4312) ، الذي يشفر منظم الاستجابة لعائلة OmpR ، شارك في تنظيم تطور الكيسات غير المتجانسة (6). ال nrrA يتم تنظيم الجين عن طريق الحرمان من النيتروجين ، ولكن تحريض nrrA لا يحدث في ntcA سلالة متحولة (6 ، 22). تسلسل المروج لـ nrrA يتوافق الجين مع تسلسل المحفز المنشط بواسطة NtcA ، ويرتبط NtcA بمنطقة المروج لـ nrrA (22). تم حذف nrrA يؤخر تطور الكيسات غير المتجانسة ويتضاءل هتر الحث تحت الحرمان من النيتروجين (6).

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في تنظيم هتر التعبير عن طريق NrrA. أظهر بروتين NrrA ارتباطًا خاصًا بالتسلسل بمنطقة المروج لـ هتر. في أنابينا ص. سلالة PCC 7120 وجود نسخ إضافية من nrrA الجين على البلازميد ، كمية هتر زيادة النسخ وتعزز تكوين الكيسات غير المتجانسة. تشير هذه النتائج إلى أن NrrA ينظم بشكل مباشر هتر التعبير. شلال جزيئي بين تنشيط NtcA وتنظيم هتر في المرحلة المبكرة من تمايز الكيسات غير المتجانسة مرتبط بـ NrRA ، أي أن NtcA ينظم التعبير عن nrrA، ثم ينظم NrrA التعبير عن هتر خلال تمايز الكيسة غير المتجانسة.


ستكون نقطة تحول في حياتي

Lambda phage هو فيروس بكتيري يصيب الإشريكية القولونية ، واعتمادًا على الأحداث المبكرة (والجينات) ، يمكن أن يتكاثر داخل الخلايا مما يؤدي إلى تحلل الخلية ، أو يمكن أن يندمج الحمض النووي الفيروسي في الجينوم البكتيري في عملية تسمى lysogeny. إذا تم تنشيط النسخ الجيني لامبدا ، فإن العدوى التحليلية تحدث مما يؤدي إلى إطلاق العاثية وإصابة خلايا الإشريكية القولونية القريبة. بدلاً من ذلك ، إذا تم قمع النسخ الجيني لامبدا ، فإن العدوى تكون غير طبيعية مما يؤدي إلى تكامل الحمض النووي لامدا في جينوم الإشريكية القولونية.

تم تصميم الطرق الوراثية الجزيئية التطبيقية المستخدمة في المختبر للاستفادة من تحلل الخلايا.

يمكن استخدام مقايسة تكوين اللويحة لعزل سلالات نقية من لاقمات لامدا باستخدام تعدد منخفض للعدوى (وزارة الداخلية). لويحات البكتيريا هي مناطق مادية على صفيحة بتري حيث تتحلل البكتيريا كلها بسبب جولات متعددة من العدوى بواسطة فجوة نسيلية واحدة. تحتوي كل لوحة على حوالي مليون جزيء فيروسي مشتق من حدث عدوى واحد - وبالتالي فإن الجزيئات الفيروسية في لوحة واحدة مرتبطة نسليًا (تسلسل الحمض النووي نفسه).

في بعض الأحيان يكون من المرغوب فيه تنقية كميات كبيرة من الملتهمة لغرض عزل الحمض النووي المؤتلف من عزل نسيلي. تتمثل إحدى طرق القيام بذلك في إصابة مزرعة سائلة للإشريكية القولونية بمخزون الملتهمة ثم حصاد المحللة بعد 4-8 ساعات. تتم إزالة الحطام البكتيري (الخلايا المتحللة) عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة ثم يضاف البولي إيثيلين جلايكول (PEG) إلى المادة الطافية ثم يتم تكوير الملتهمة بواسطة تنبيذ فائق السرعة.

ماذا يعني "عيار مخزون العاثيات" وكيف يتم ذلك؟



لماذا تنمو البكتيريا المضيفة في وسط يحتوي على سكر المالتوز قبل الإصابة؟

لماذا يهم مقدار مخزون العاثيات الذي تضيفه إلى الثقافة السائلة البكتيرية ، ألا يختلط الأمر برمته ويؤدي إلى الإصابة بنسبة 100٪ في النهاية؟

ما هو التفسير البيوكيميائي لإضافة PEG لتعليق الملتهمة؟



بمجرد حصولك على مخزون عالي التركيز من الملتهمة المنقاة ، كيف يمكنك فصل الحمض النووي المأشوب عن بروتينات رأس الملتهمة والذيل؟

كان لا بد من التغلب على عقبتين تقنيتين مهمتين قبل استخدام نواقل لامدا ككاشف استنساخ للمكتبات الجينية ومكتبات (كدنا).

1. تم تطوير مستخلصات عبوات لامدا في المختبر وإتاحتها تجاريًا (انظر مقتطفات عبوات ستراتجين جيغاباك).

نموذج مقترح لنضج عاثيات لامدا (Murialdo، H. Bacteriophage Lambda DNA Maturation and Packaging، Ann. Rev. Biochem. 60: 125-153، 1991)

2. تم تطوير استراتيجيات وراثية لزيادة إنتاجية الملتهمة المؤتلفة في مكتبات الحمض النووي لتعويض انخفاض نسبة الدنا إلى ناقل الحمض النووي المستخدم في تفاعلات الربط الأولية.

يتم عرض اثنين من هذه الاستراتيجيات الجينية أدناه. تم تطوير الأول لمكتبات cDNA والثاني لمكتبات DNA الجينومية. لاحظ أن الطول الإجمالي لدنا لامدا الذي يمكن تعبئته بكفاءة هو محدد حاسم في هذه العملية التي يحركها البروتين بحد أقصى 52 كيلو بايت (ناقل + إدخال).


الاستنساخ الإدراجي في جين cI لناقل استنساخ lambda-gt10 (كدنا) (إدراج الحمض النووي لـ

1-5 kb) في سلالات متحولة hfl (تردد عالي من lysogeny) من E. coli. في سلالات hflA من الإشريكية القولونية ، يرتفع التعبير عن جين lambda cII ، مما يؤدي إلى الحث النسخي لجين lambda cI المكبّر الذي يعزز الاستسقاء. يؤدي تعطيل تسلسل ترميز lambda cI عن طريق إدخال الحمض النووي في موقع EcoRI الفريد لمتجه استنساخ lambda gt10 cDNA إلى عرقلة المسار اللايسوجيني المؤدي إلى تحلل الخلية وتشكيل اللويحات.


استبدال DNA lambda الذي يحتوي على الجينات الحمراء والجيمية في ناقل استنساخ الحمض النووي الجيني lambda EMBL3 بإدخالات الحمض النووي المتوافقة مع BamHI لـ

10-20 كيلو بايت ، يسمح بالنمو التحليلي للعاثية المؤتلفة في سلالات الإشريكية القولونية التي تحتوي على ليسوجين البكتيريا P2.


هل تتطلب عبوات Lambda DNA أي إنزيمات أو تحلل ATP؟



لماذا من المهم استخدام نسب منخفضة من إدخال DNA إلى ناقل DNA في بناء مكتبات lambda DNA ، أليس من الأسهل زيادة النسبة لتقليل عدد "النواقل الفارغة" في مخزون المكتبة؟

M13 بيولوجيا البكتيريا


يحتوي البلعوم الخيطي M13 على جينوم خيطي واحد موجود مؤقتًا داخل خلايا الإشريكية القولونية المصابة كبلازميد مزدوج الشريط. يتم إخراج فجوة M13 من خلية مصابة ويمكن تنقية الحمض النووي الخيطي الفردي لاستخدامه في تسلسل الحمض النووي أو الطفرات في المختبر. في البداية ، تطلبت نواقل العاثيات M13 معرفة عملية ببيولوجيا العاثيات وكانت تُستخدم في المقام الأول لإنشاء جزيئات DNA مفردة حبلا لتسلسل الحمض النووي. لحسن الحظ ، تم تطوير نواقل الاستنساخ المشتقة من M13 والتي تسمى "phagemids" والتي تستفيد من تكرار M13 لإنتاج جزيئات حبلا مفردة ، ولكن يمكن نشرها كبلازميدات تقليدية مزدوجة حبلا تعتمد على ColE1.

Bluescript KS + هو مثال على ناقل استنساخ phagemid. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام نواقل phagemid لإعداد DNA خيط واحد لبروتوكولات الطفرات في المختبر باستخدام بادئات oligonucleotide (الفصل 3).

ينتج عن إصابة خلايا الإشريكية القولونية F + المحتوية على DNA phagemid مع الملتهمة المساعدة M13 التي تعاني من نقص النسخ المتماثل في تغليف الحمض النووي المفرد للحبلة phagemid. يحدد اتجاه أصل النسخ المتماثل M13 (+ أو -) ، بالنسبة إلى الحمض النووي المُدرج ، في ناقل phagemid ، أي خيط من الحمض النووي المُدرج (مشفر أو غير مشفر) سيتم احتوائه في الملتهمة المعبأة.

نظرًا لأن بروتينات بيلوس الجنس البكتيري يتم ترميزها على البلازميد F ، ويلزم وضع الملف الشخصي لمرفق الملتهمة M13 ، فقد تم تطوير سلالات الإشريكية القولونية التي تتضمن جينًا مقاومًا للمضادات الحيوية ترانسبوزون على البلازميد F (tet r أو kan r ). يؤدي تكرار الدائرة المتدحرجة وتعبئة العاثيات بواسطة بروتينات الفيروس المساعدة إلى إنتاج فجوة M13 المؤتلفة.


لماذا تلزم العاثية المساعدة لإنتاج دنا أحادي الخيط من فاجيميد M13؟


ما الذي يخبرك به الاعتماد على التوجيه في M13 ori عن تكرار العاثيات الخيطية وكيف يختلف هذا عن تكرار العاثية في لامدا؟

يعد التعبير عالي المستوى عن البروتينات المؤتلفة في البكتيريا عملية شائعة في التكنولوجيا الحيوية. ومن الأمثلة على ذلك إنتاج البكتيريا للأنسولين البشري. مثال آخر هو إنتاج بروتين الكالريتيكولين النباتي في البكتيريا كوسيلة لتوليد الأجسام المضادة للكالريتيكولين في الأرانب.

من المحتمل أن يكون تعبير البروتين البكتيري الأكثر استخدامًا هو نظام ناقل pET الذي طوره بيل ستوديير وزملاؤه في مختبرات بروكهافن الوطنية عام 1984. يتم الآن بيع نظام المتجهات تجاريًا بواسطة شركة Novagen.

أحد أكثر نواقل الحيوانات الأليفة المبتكرة هو pETBlue الذي يستخدم جين lacZ (منطقة ألفا) على شريط الترميز المعاكس بحيث يمكن إجراء الفحص الأزرق والأبيض لكن البروتين المؤتلف لا يحتوي على أي تسلسلات اندماج lacZ.

الممارسة المعملية 2. تعبير منظم عن منتج جيني مستنسخ في الإشريكية القولونية

أهداف البحث
يهتم عالم أحياء النبات بدراسة بروتين الكالريتيكولين المرتبط بالكالسيوم في نبات Arabidopsis thaliana لتحديد وظيفته المحتملة في الأنسجة الزهرية. كخطوة أولى ، يريد إنتاج أجسام مضادة تتعرف على وجه التحديد على الكالريتيكولين في نبات الأرابيدوبسيس من أجل تحديد أنواع الخلايا الزهرية التي تعبر عن هذه البروتينات باستخدام الكيمياء المناعية. خطته هي التعبير عن تسلسل ترميز أرابيدوبسيس كالريتيكولين في الإشريكية القولونية للسماح بعزل مستضد الكالريتيكولين لإنتاج الأجسام المضادة متعددة النسيلة في الأرانب. لقد بحث في قاعدة بيانات Arabidopsis المعبر عنها بالتسلسل (EST) عبر الإنترنت باستخدام تسلسل الكالريتيكولين البشري المعروف وحدد العديد من الحيوانات المستنسخة (كدنا) المرشحة التي كانت متاحة من مركز الموارد البيولوجية أرابيدوبسيس في جامعة ولاية أوهايو.

المعلومات والكواشف المتوفرة
1. تم الحصول على 1.4 كيلو بايت من نبات أرابيدوبسيس (كدنا) من مركز الموارد وتم تحديد تسلسل الحمض النووي الكامل الخاص به. وجد أنه يشفر 425 بروتين من الأحماض الأمينية مع تشابه مرتفع من الأحماض الأمينية مع الكالريتيكولين البشري.

2. تم الحصول على ناقل التعبير البكتيري pET (His) 6 ، pLysS plasmid encoding T7 lysozyme ، وسلالة BL21 (DE3) E. coli lDE3 lysogen التي تحتوي على جين T7 RNA polymerase تحت سيطرة lac ، من مصدر تجاري.

3. الإمدادات البيوكيميائية متاحة لتنقية البروتينات التي تحتوي على تسلسل متعدد الهيستيدين من مستخلصات الخلايا البكتيرية باستخدام كروماتوجرافيا المعدن.

4. تتوافر الموارد لإنتاج الأجسام المضادة متعددة النسيلة في الأرانب باستخدام مستضد منقى. يتمتع عالم أحياء النبات بخبرة في الكيمياء المناعية والكيمياء الحيوية للنبات.


الاستراتيجية الأساسية
المكونان الأساسيان لنظام التعبير القائم على بوليميراز RNA للبكتيريا T7 هما بلازميد pET الذي يحتوي على تسلسل ترميز لإدخال DNA في اتجاه مجرى مروج T7 (Tpr) ، وسلالة E. coli التي تحتوي على نسخة جينومية من T7 RNA polymerase (T7 pol) تحت سيطرة مروج lac UV5.

يظهر أيضًا في هذا المثال بلازميد ترميز الليزوزيم T7 يحتوي على جين مقاومة الكلورامفينيكول (القط) ، والذي يوفر وسيلة لتثبيط كمية صغيرة من بوليميريز T7 RNA التي يتم التعبير عنها في غياب IPTG. يتم الحصول على تعبير عالي المستوى عن بروتين الكالريتيكولين الموسوم بالهيستيدين عن طريق منع وظيفة مثبط lacI مع إضافة IPTG إلى الوسائط.

يعتمد نظام التعبير المحرض على IPTG على اكتشاف أن بوليميريز T7 RNA للعاثية شديد التحديد والفعالية في نسخ الجينات التي تحتوي على محفز T7. من خلال تحويل ناقل الكالريتيكولين المأشوب إلى سلالة الإشريكية القولونية التي تحتوي على جين بوليميريز T7 RNA الخاضع للتحكم ، سيكون من الممكن تحفيز تعبير الكالريتيكولين عن طريق معالجة الخلايا باستخدام IPTG (انظر أدناه). نظرًا لأن مستوى التعبير المنخفض عن جين بوليميراز T7 RNA يحدث في هذا النظام في غياب IPTG ، وقد تمنع المستويات الملموسة من بروتين كالريتيكولين النبات النمو البكتيري ، سيتم أيضًا إدخال بلازميد متوافق يحتوي على جين الليزوزيم T7 في الخلايا المضيفة. T7 الليزوزيم هو بروتين ثنائي الوظيفة لا يشق روابط الببتيدوغليكان في جدار الخلية البكتيرية فحسب ، بل يثبط أيضًا وظيفة بوليميراز T7 RNA. لذلك ، فإن المستوى المنخفض للتعبير عن الليزوزيم T7 قادر على تثبيط نشاط جزيئات بوليميريز T7 RNA الموجودة في الخلايا حتى قبل العلاج IPTG.

التعبير المنظم للجينات في الإشريكية القولونية باستخدام نظام ناقل PET.
المكونان الأساسيان لنظام التعبير القائم على بوليميراز RNA للبكتيريا T7 هما بلازميد pET الذي يحتوي على تسلسل ترميز لإدخال DNA في اتجاه مجرى مروج T7 (Tpr) ، وسلالة E. coli التي تحتوي على نسخة جينومية من T7 RNA polymerase (T7 pol) تحت سيطرة مروج lac UV5. يظهر أيضًا في هذا المثال بلازميد ترميز الليزوزيم T7 يحتوي على جين مقاومة الكلورامفينيكول (القط) ، والذي يوفر وسيلة لتثبيط كمية صغيرة من بوليميريز T7 RNA التي يتم التعبير عنها في غياب IPTG. يتم الحصول على تعبير عالي المستوى عن بروتين الكالريتيكولين الموسوم بالهيستيدين عن طريق منع وظيفة مثبط lacI مع إضافة IPTG إلى الوسائط.

مخطط التدفق لإنتاج الأجسام المضادة كالريتيكولين باستخدام البروتين النقي من المستخلصات البكتيرية.
يمكن استخدام علامة polyhistidine الموجودة في بروتين الكالريتيكولين المؤتلف لتنقية البروتين القابل للذوبان من مستخلصات الخلية باستخدام عمود تقارب Ni2 +. يُستخرج بروتين الكالريتيكولين المرتبط من العمود باستخدام إيميدازول الذي يتفوق على الهيستيدينات لربط Ni2 +. تتم مراقبة تنقية البروتين عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام (SDS-PAGE). في هذا المثال ، يتم إنتاج الأجسام المضادة متعددة النسيلة الخاصة بالكالريتيكولين في أرنب ويتم تحصينها مناعياً بعمود ألفة كالريتيكولين يتم تصنيعه باستخدام بروتين مستضد الكالريتيكولين من مستخلصات الإشريكية القولونية. يمكن أن تكون الأجسام المضادة الخاصة بالكالريتيكولين المناعي مفيدة ككواشف في البقع الغربية ودراسات كيميائية مناعية وتجارب ترسيب مناعي.

تعليقات
يعتبر إنتاج المستضد في الإشريكية القولونية أقل التطبيقات تطلبًا لأنظمة التعبير البكتيرية حيث يمكن استخدام ظروف تغيير الطبيعة للمساعدة في إذابة البروتين. أصبح إنتاج الأجسام المضادة متعددة النسيلة باستخدام البروتينات المؤتلفة إجراءً قياسيًا. يستخدم العديد من الباحثين الخدمات التجارية المتخصصة في إنتاج الأجسام المضادة. يتم إرسال عينات البروتين إلى الخدمة عن طريق البريد السريع ، وبعد 7-10 أسابيع ، يتم إرسال المصل مرة أخرى للتحليل. نظرًا لأن المستضد يتم إنتاجه في الإشريكية القولونية وبالتالي يتوفر بكميات كبيرة ، يمكن تنقية الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد من المصل باستخدام كروماتوجرافيا التقارب. اعتمادًا على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة ، قد يكون هناك ما يبرر أيضًا إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة بمولد الضد.


مأمول
وجد عالم الأحياء النباتية أن الأجسام المضادة للكالريتيكولين كشفت عن مستويات عالية من البروتين في نمو البذور ، وهي نتيجة تتفق مع دورها كبروتين مساعد في الأنسجة ذات معدلات مرتفعة من تخليق البروتين. أثناء تطوير البذور ، يتم تصنيع كميات كبيرة من بروتينات التخزين والتي تتحلل لاحقًا لتغذية إنبات البذور. سيكون من المثير للاهتمام تحديد ما إذا كان الكالريتيكولين مطلوبًا لتنمية البذور. يمكن القيام بذلك على سبيل المثال ، عن طريق تعطيل وظيفة الكالريتيكولين باستخدام الجينات المضادة للحساسية الخاصة بالخلية أو تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) وعن طريق توصيف الكالريتيكولين في طفرات نبات الأرابيدوبسيس التي تحتوي على عيوب في نمو البذور. يمكن أيضًا دراسة وظيفة Calreticulin في البذور عن طريق عزل بروتينات البذور التي تتفاعل مع بروتين calreticulin (His) 6 المعبر عن البكتيريا بعد امتصاصه إلى عمود تقارب Ni2 +.


ما ميزتان لاستخدام مروج T7 و T7 RNA polymerase في نظام pET للتحكم في التعبير عن الجينات المستنسخة المؤتلفة. كيف يكون هذا أفضل من مجرد استخدام محفز لاك في المنبع من جين الكالريتيكولين)؟



ما هو الغرض من تشغيل المصل المضاد متعدد الأضلاع للأرنب فوق عمود تقارب الكالريتيكولين؟ كيف يتم استخلاص الأجسام المضادة من العمود دون إطلاق مستضد الكالريتيكولين في نفس الوقت؟




صف كيف يمكن استخدام بروتين هاس-كالريتيكولين المعبر عنه جرثوميًا لعزل بروتينات ربط الكالريتيكولين من مستخلصات البذور؟ كيف يمكنك تحديد البروتينات المرتبطة بما يتجاوز وزنها الجزيئي على مادة هلامية؟


السؤال الثاني: أي بلازميد يجب اختياره؟

إن بلازميدات التعبير الأكثر شيوعًا المستخدمة اليوم هي نتيجة مجموعات متعددة من النسخ المتماثلة ، والمروجين ، وعلامات الاختيار ، ومواقع الاستنساخ المتعددة ، واستراتيجيات إزالة بروتين الانصهار / بروتين الانصهار (الشكل 1). لهذا السبب ، فإن كتالوج نواقل التعبير المتاحة ضخم ومن السهل أن تضيع عند اختيار واحد مناسب. لاتخاذ قرار مستنير ، يجب تقييم هذه الميزات بعناية وفقًا للاحتياجات الفردية.

الشكل 1. تشريح متجه التعبير. يوضح الشكل السمات الرئيسية الموجودة في نواقل التعبير الشائعة. كل منهم موصوف في النص. تم وضع علامات التقارب وتسلسلات الترميز لإزالتها بشكل تعسفي عند الطرف N من أجل البساطة. MCS ، موقع استنساخ متعدد. مربع منقوش مخطط: تسلسل ترميز للبروتين المطلوب.

ريبليكون

تحتوي العناصر الجينية التي تخضع للتكاثر كوحدات مستقلة ، مثل البلازميدات ، على نسخة متماثلة. يتكون من أصل واحد للنسخ المتماثل مع ما يرتبط به رابطة الدول المستقلة- فاعلية عناصر التحكم. من المعلمات المهمة التي يجب مراعاتها عند اختيار ناقل مناسب هو رقم النسخ. يكمن التحكم في رقم النسخة في النسخ المتماثل (ديل سولار وإسبينوزا ، 2000). من المنطقي الاعتقاد بأن جرعة البلازميد العالية تساوي إنتاجية بروتينية مؤتلفة أكثر حيث توجد العديد من وحدات التعبير في الخلية. ومع ذلك ، فإن ارتفاع عدد البلازميد قد يفرض عبئًا استقلابيًا يقلل من معدل نمو البكتيريا وقد ينتج عنه عدم استقرار البلازميد ، وبالتالي ينخفض ​​عدد الكائنات الحية السليمة لتخليق البروتين (بنتلي وآخرون ، 1990 بيرنباوم وبيلي ، 1991). لهذا السبب ، فإن استخدام البلازميدات ذات عدد النسخ العالي للتعبير عن البروتين لا يعني بأي حال زيادة في غلات الإنتاج.

المتجهات شائعة الاستخدام ، مثل سلسلة pET ، تمتلك أصل pMB1 (مشتق ColE1 ، 15 & # x0201360 نسخة لكل خلية بوليفار وآخرون ، 1977) بينما توجد نسخة متحولة من أصل pMB1 في سلسلة PUC (500 & # x02013700 نسخ لكل خلية مينتون ، 1984). يمكن العثور على أصل ColE1 من النوع البري (15 & # x0201320 نسخة لكل خلية Lin-Chao and Bremer ، 1986 Lee et al. ، 2006) في ناقلات pQE (Qiagen). ينتمون جميعًا إلى نفس مجموعة عدم التوافق مما يعني أنه لا يمكن نشرهم معًا في نفس الخلية حيث يتنافسون مع بعضهم البعض على آلية النسخ (ديل سولار وآخرون ، 1998 معسكرات ، 2010). للتعبير المزدوج عن البروتينات المؤتلفة باستخدام اثنين من البلازميدات ، تتوفر أنظمة مع p15A ori (سلسلة pACYC و pBAD من البلازميدات ، 10 & # x0201312 نسخة لكل خلية Chang and Cohen ، 1978 Guzman et al. ، 1995). على الرغم من ندرته ، يمكن تحقيق التعبير الثلاثي عن طريق استخدام بلازميد pSC101. يخضع هذا البلازميد للتحكم الصارم في النسخ المتماثل ، وبالتالي فهو موجود في عدد نسخ منخفض (& # x0003C5 نسخ لكل خلية نوردستروم ، 2006). يمكن أن يكون استخدام البلازميدات التي تحمل هذا الريليكون ميزة في الحالات التي يؤدي فيها وجود جرعة عالية من الجين المستنسخ أو منتجها إلى تأثير ضار على الخلية (Stoker et al.، 1982 Wang and Kushner، 1991). بدلاً من ذلك ، فإن استخدام نواقل Duet (Novagen) يبسط التعبير المزدوج عن طريق السماح باستنساخ جينين في نفس البلازميد. تمتلك بلازميدات Duet موقعين متعددين للاستنساخ ، يسبق كل منهما محفز T7 ، أ لاك المشغل وموقع ربط الريبوسوم. من خلال الجمع بين نواقل Duet متوافقة مختلفة ، يمكن إنتاج ما يصل إلى ثمانية بروتينات مؤتلفة من أربعة بلازميدات تعبيرية.

المروجين

العنصر الأساسي في أبحاث المروج بدائية النواة هو بلا شك لاك المروج ، العنصر الرئيسي في لاك أوبرون (M & # x000FCller-Hill ، 1996). سمحت المعرفة المتراكمة في عمل النظام باستخدامه الموسع في نواقل التعبير. يتسبب اللاكتوز في تحريض النظام ويمكن استخدام هذا السكر لإنتاج البروتين. ومع ذلك ، فإن الحث يكون صعبًا في وجود مصادر الكربون سريعة التمثيل الغذائي (مثل الجلوكوز الموجود في الوسائط الغنية). في حالة وجود اللاكتوز والجلوكوز ، يتم التعبير من لاك لا يتم تحفيز المروج بالكامل حتى يتم استخدام كل الجلوكوز. في هذه المرحلة (انخفاض الجلوكوز) ، يتم إنتاج أدينوزين أحادي الفوسفات (cAMP) ، وهو أمر ضروري للتنشيط الكامل لـ لاك أوبرون (وانر وآخرون ، 1978 Postma and Lengeler ، 1985). يُعرف هذا التحكم الإيجابي في التعبير باسم قمع الهدم. وفقًا لذلك ، تكون مستويات cAMP منخفضة في الخلايا التي تنمو فيها لاك السكريات المثبطة للأوبرا ، وهذا يرتبط بمعدلات أقل من التعبير عن لاك أوبرون (إبشتاين وآخرون ، 1975). أيضا ، الجلوكوز يلغي امتصاص اللاكتوز لأن نفاذية اللاكتوز غير نشطة في وجود الجلوكوز (Winkler and Wilson ، 1967). لتحقيق التعبير في وجود الجلوكوز ، تم إدخال طفرة تقلل (ولكن لا تقضي على) الحساسية لتنظيم الهدم ، لاكمروج UV5 (Silverstone et al. ، 1970 Lanzer and Bujard ، 1988). ومع ذلك ، عند وجوده في البلازميدات متعددة النسخ ، يعاني كلا المروجين من عيب وجود مستويات عالية غير مقبولة من التعبير في بعض الأحيان في غياب المحرض (المعروف أيضًا باسم & # x0201Cleakiness & # x0201D) بسبب معايرة المستويات المنخفضة من لاك بروتين مثبط المحفز LacI من نسخة كروموسومية واحدة من جينها (حوالي 10 جزيئات لكل خلية M & # x000FCller-Hill et al. ، 1968). يمكن تحقيق التحكم في التعبير الأساسي عن طريق إدخال محفز متحور لـ لاسي يسمى الجين لاسي س ، هذا يؤدي إلى مستويات أعلى من التعبير (حوالي 10 أضعاف) من LacI (كالوس ، 1978). ال لاك المروج ومشتقاته لاكUV5 ضعيف نوعًا ما وبالتالي ليس مفيدًا جدًا لإنتاج البروتين المؤتلف (Deuschle et al. ، 1986 Makoff and Oxer ، 1991). الهجينة الاصطناعية التي تجمع بين قوة المروجين الآخرين ومزايا لاك المروج متاحة. على سبيل المثال ، ملف تاك المروج يتكون من -35 منطقة من trp (التربتوفان) المروج والمنطقة -10 من لاك المروجين. هذا المروج أقوى بحوالي 10 مرات من لاكUV5 (de Boer et al. ، 1983). أمثلة بارزة للبلازميدات التجارية التي تستخدم لاك أو تاك المروجين لدفع تعبير البروتين هي سلسلة pUC (لاكمروج UV5 ، Thermo Scientific) وسلسلة نواقل pMAL (تاك المروج ، NEB).

نظام المروج T7 الموجود في ناقلات pET (pMB1 ori ، رقم النسخ المتوسط ​​، Novagen) شائع للغاية لتعبير البروتين المؤتلف. هذا ليس مفاجئًا لأن البروتين المستهدف يمكن أن يمثل 50٪ من إجمالي بروتين الخلية في الحالات الناجحة (Baneyx، 1999 Graumann and Premstaller، 2006). في هذا النظام ، يتم استنساخ الجين المعني خلف مروج تم التعرف عليه بواسطة Phage T7 RNA polymerase (T7 RNAP). يجب توفير هذا البوليميراز عالي الفعالية في بلازميد آخر أو ، الأكثر شيوعًا ، يتم وضعه في الجينوم البكتيري في ترميز (& # x003BBDE3) لـ T7 RNAP تحت التحكم النسخي لـ لاكمروج UV5 (Studier and Moffatt ، 1986). وبالتالي ، يمكن تحفيز النظام عن طريق اللاكتوز أو الأيزوبروبيل التناظري غير القابل للتحلل بالماء & # x003B2-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG). يمكن التحكم في التعبير القاعدية لاكI Q ولكن أيضًا عن طريق التعبير المشترك T7 lysozyme (Moffatt and Studier ، 1987). يرتبط الليزوزيم T7 بـ T7 RNAP ويمنع بدء النسخ من مروج T7 (Stano and Patel ، 2004). وبهذه الطريقة ، إذا تم إنتاج كميات صغيرة من T7 RNAP بسبب التعبير المتسرب عن الجين الخاص به ، فإن الليزوزيم T7 سوف يتحكم بشكل فعال في التعبير غير المقصود للجينات غير المتجانسة الموضوعة تحت محفز T7. يتم توفير الليزوزيم T7 بواسطة بلازميد متوافق (pLysS أو pLysE). بعد الحث ، تتجاوز كمية T7 RNAP المنتجة مستوى البوليميراز الذي يمكن أن يثبطه الليزوزيم T7. وبالتالي يمكن لـ & # x0201Cfree & # x0201D T7 RNAP المشاركة في نسخ الجين المؤتلف. هناك مستوى آخر من التحكم يكمن في إدخال ملف لاكو المشغل المصب لمروج T7 ، مما يجعل T7 مختلطًا /لاك المروج (دوبندورف وستوديير ، 1991). جميع الآليات الثلاث (القمع الشديد لـ لاك- الجين T7 RNAP القابل للتحفيز بواسطة لاكتثبيط I Q ، T7 RNAP بواسطة الليزوزيم T7 ووجود a لاكعامل O بعد مروج T7) يجعل النظام مثاليًا لتجنب التعبير الأساسي.

مشكلة التعبير المتسرب هي انعكاس للتحكم السلبي في لاك المروجين. يجب أن يتمتع المروجون الذين يعتمدون على التحكم الإيجابي بمستويات أقل من التعبير في الخلفية (Siegele and Hu ، 1997). هذا هو الحال في araPسيء المروج الموجود في نواقل pBAD (Guzman et al. ، 1995). يلعب بروتين AraC دورًا مزدوجًا كمنشط / مثبط. في حالة عدم وجود محفز الأرابينوز ، يقوم AraC بقمع الترجمة عن طريق الارتباط بموقعين في الحمض النووي البكتيري. يشكل مركب البروتين & # x02013DNA حلقة ، مما يمنع بشكل فعال بوليميريز الحمض النووي الريبي من الارتباط بالمحفز. عند إضافة المحرض ، يتحول AraC إلى & # x0201Cactivation mode & # x0201D ويعزز النسخ من آرا المروج (شليف ، 2000 ، 2010). بهذه الطريقة ، هناك حاجة ماسة إلى الأرابينوز للتحريض.

هناك طريقة أخرى مستخدمة على نطاق واسع وهي وضع الجين تحت سيطرة محفز الملتهمة المنظم. يوجه المروج الأيسر القوي (pL) من Phage lambda التعبير عن الجينات التحليلية المبكرة (Dodd et al. ، 2005). يتم قمع المحفز بإحكام بواسطة البروتين المكبب & # x003BBcI ، والذي يجلس على تسلسل المشغل أثناء النمو اللايسوجيني. عندما يتم تشغيل استجابة SOS للمضيف بسبب تلف الحمض النووي ، يتم تحفيز التعبير عن البروتين RecA ، والذي بدوره يحفز الانقسام الذاتي لـ & # x003BBcI ، مما يسمح بنسخ الجينات التي يتحكم فيها pL (Johnson et al. ، 1981 Galkin et al. ، 2009). تُستخدم هذه الآلية في نواقل التعبير التي تحتوي على محفز pL. يمكن استنباط استجابة SOS (والتعبير البروتيني المؤتلف) عن طريق إضافة حمض الناليديكسيك ، وهو مثبط DNA جيراز (Lewin et al. ، 1989 Shatzman et al. ، 2001). هناك طريقة أخرى لتنشيط المروج وهي التحكم في إنتاج & # x003BBcI عن طريق وضع الجين الخاص به تحت تأثير مروج آخر. تم بالفعل وصف نظام التحكم ذي المرحلتين هذا للنواقل القائمة على المروج T7 / T7 RNAP. في سلسلة النواقل pLEX (تقنيات الحياة) ، تم دمج الجين المكابح & # x003BBcI في الكروموسوم البكتيري تحت سيطرة trp المروجين. في حالة عدم وجود التربتوفان ، يكون هذا المروج دائمًا & # x0201Con & # x0201D ويتم إنتاج & # x003BBcI باستمرار. عند إضافة التربتوفان ، يتم تكوين مركب مثبط التربتوفان- TrpR الذي يرتبط بإحكام بـ trp عامل التشغيل ، وبالتالي منع توليف القامع & # x003BBcI. بعد ذلك ، يتم التعبير عن الجين المطلوب تحت مروج pL (Mieschendahl et al. ، 1986).

بدأ النسخ من جميع المروجين الذي تمت مناقشته حتى الآن من خلال إشارات كيميائية. الأنظمة التي تستجيب للإشارات المادية (على سبيل المثال ، درجة الحرارة أو الأس الهيدروجيني) متاحة أيضًا (Goldstein and Doi ، 1995). مروج pL هو أحد الأمثلة. يعتبر بروتين مثبط متحولة & # x003BBcI (& # x003BBcI 857) حساسًا لدرجة الحرارة وغير مستقر عند درجات حرارة أعلى من 37 & # x000B0C. بكتريا قولونية نمت سلالات المضيف التي تحتوي على بروتين & # x003BBcI 857 (إما مدمج في الكروموسوم أو في ناقل) لأول مرة عند 28 & # x0201330 & # x000B0C إلى الكثافة المرغوبة ، ثم يتم تحفيز التعبير البروتيني عن طريق التحول في درجة الحرارة إلى 40 & # x0201342 & # x000B0C (Menart et al.، 2003 Valdez-Cruz et al.، 2010). تكمن الميزة الصناعية لهذا النظام جزئيًا في حقيقة أنه أثناء التخمير ، عادةً ما يتم إنتاج الحرارة وزيادة درجة الحرارة في المزارع عالية الكثافة أمر سهل. من ناحية أخرى ، الجينات الخاضعة لسيطرة المحفز الذي يحفزه البرد cspA ناتجة عن انخفاض درجة الحرارة إلى 15 & # x000B0C (Vasina et al. ، 1998). درجة الحرارة هذه مثالية للتعبير عن البروتينات الصعبة كما سيتم شرحه في قسم آخر. تحتوي سلسلة pCold من البلازميدات على عمود فقري pUC118 (مشتق من PUC18 Vieira and Messing ، 1987) مع cspA المروج (كينج وآخرون ، 2004 هاياشي وكوجيما ، 2008). في الورقة الأصلية ، تم تحقيق تعبير ناجح لأكثر من 30 بروتينًا مؤتلفًا من مصادر مختلفة ، ووصلت إلى مستويات تصل إلى 20 & # x0201340٪ من إجمالي البروتينات المعبر عنها (Qing et al. ، 2004). ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه في حالات مختلفة تم الحصول على البروتينات المستهدفة في شكل غير قابل للذوبان.

محدد التحديد

لردع نمو الخلايا الخالية من البلازميد ، تتم إضافة علامة مقاومة إلى العمود الفقري البلازميد. في ال بكتريا قولونية النظام ، وعادة ما تستخدم جينات مقاومة المضادات الحيوية لهذا الغرض. يتم منح مقاومة الأمبيسلين من قبل جيش تحرير بلوخ الجين الذي يكون منتجه إنزيمًا محيطيًا يعمل على تعطيل & # x003B2-lactam الحلقة & # x003B2-lactam. ومع ذلك ، نظرًا لأن & # x003B2-lactamase يتم إفرازه باستمرار ، فإن تحلل المضاد الحيوي يترتب عليه وفي غضون ساعتين ، ينضب الأمبيسلين تقريبًا (Korpimaki et al. ، 2003). في ظل هذه الحالة ، يُسمح للخلايا التي لا تحمل البلازميد بزيادة عددها أثناء الزراعة. على الرغم من عدم التحقق من صحتها تجريبياً ، إلا أن العوامل الانتقائية التي تعتمد فيها المقاومة على التحلل ، مثل الكلورامفينيكول (شو ، 1983) والكاناميسين (أوميزاوا ، 1979) ، يمكن أن يكون لها هذه المشكلة أيضًا. لهذا السبب ، ثبت أن التتراسيكلين مستقر للغاية أثناء الزراعة (Korpimaki et al. ، 2003) ، لأن المقاومة تعتمد على التدفق النشط للمضاد الحيوي من الخلايا المقاومة (روبرتس ، 1996).

تعتبر تكلفة المضادات الحيوية وانتشار مقاومة المضادات الحيوية من الاهتمامات الرئيسية في المشاريع التي تتعامل مع الثقافات واسعة النطاق. لقد تم بذل الكثير من الجهد في تطوير أنظمة بلازميد خالية من المضادات الحيوية. تعتمد هذه الأنظمة على مفهوم إدمان البلازميد ، وهي ظاهرة تحدث عندما لا تتمكن الخلايا الخالية من البلازميد من النمو أو العيش (Zielenkiewicz and Ceglowski ، 2001 Peubez et al. ، 2010). على سبيل المثال ، يمكن حذف الجين الأساسي من الجينوم البكتيري ثم وضعه على البلازميد. وهكذا ، بعد انقسام الخلية ، تموت البكتيريا الخالية من البلازميد. توجد أنواع فرعية مختلفة من أنظمة إدمان البلازميد وفقًا لمبدأ وظيفتها: (1) الأنظمة القائمة على السموم / مضادات السموم ، (2) الأنظمة القائمة على التمثيل الغذائي ، و (3) أنظمة معايرة مثبط المشغل (Kroll et al. ، 2010). بينما أثبتت هذه التكنولوجيا الواعدة نجاحها في المخمرات واسعة النطاق (Voss and Steinbuchel ، 2006 Peubez et al. ، 2010) ، لا تزال أنظمة التعبير القائمة على إدمان البلازميد غير موزعة على نطاق واسع.

علامات التقارب

عند ابتكار مشروع يحتاج إلى بروتين مؤتلف نشط منقى قابل للذوبان (كما هو الحال في كثير من الأحيان) ، فإنه لا يقدر بثمن أن يكون لديك وسائل لـ (1) اكتشافه على طول مخطط التعبير والتنقية ، (2) تحقيق أقصى قابلية للذوبان ، و (3) ) تنقيته بسهولة من بكتريا قولونية الوسط الخلوي. التعبير عن امتداد الأحماض الأمينية (علامة الببتيد) أو عديد ببتيد كبير (شريك اندماج) جنبا إلى جنب مع البروتين المطلوب لتكوين بروتين خيمري قد يسمح بالوصول إلى هذه الأهداف الثلاثة بشكل مباشر (Nilsson et al. ، 1997).

كونها صغيرة ، من غير المرجح أن تتداخل علامات الببتيد عند دمجها مع البروتين. ومع ذلك ، في بعض الحالات قد تثير آثارًا سلبية على البنية الثالثة أو النشاط البيولوجي للبروتين الكيمري المنصهر (Bucher et al. ، 2002 Klose et al. ، 2004 Chant et al. ، 2005 Khan et al. ، 2012). تتوفر نواقل تسمح بوضع العلامة على الطرف N أو الطرف C (يكون الخيار الأخير مفيدًا عندما يتم وضع إشارة الببتيد في نهاية الطرف N لإفراز البروتين المؤتلف ، انظر أدناه). إذا كان الهيكل ثلاثي الأبعاد للبروتين المرغوب متاحًا ، فمن الحكمة التحقق من النهاية المدفونة داخل الطية ووضع العلامة في النهاية التي يمكن الوصول إليها بواسطة المذيب. الأمثلة الشائعة لعلامات الببتيد الصغيرة هي علامات poly-Arg- و FLAG- و poly-His- و c-Myc- و S- و Strep II (Terpe ، 2003). نظرًا لأن الأجسام المضادة التجارية متوفرة لجميعهم ، يمكن اكتشاف البروتين المؤتلف الموسوم بواسطة لطخة غربية على طول تجارب التعبير ، وهو أمر مفيد للغاية عندما لا تكون مستويات البروتينات المرغوبة عالية بما يكفي لاكتشافها بواسطة SDS-PAGE. أيضًا ، تسمح العلامات بتنقية التقارب بخطوة واحدة ، حيث تتوفر الراتنجات التي تربط العلامات بإحكام وبشكل خاص. على سبيل المثال ، يمكن استعادة البروتينات التي تحمل علاماته عن طريق كروماتوجرافيا تقارب أيونات المعدن الثابت باستخدام Ni 2 + أو Co 2 + راتنجات حمض النيتريلوترياسيتيك - agarose (Porath and Olin ، 1983 Bornhorst and Falke ، 2000) ، في حين أن المواد الهلامية المتقاربة المضادة لـ FLAG (Sigma-Aldrich) تستخدم لالتقاط بروتينات الانصهار FLAG (Hopp et al. ، 1988).

من ناحية أخرى ، فإن إضافة شريك اندماج غير ببتيد له ميزة إضافية تتمثل في العمل كمعززات للذوبان (Hammarstrom et al. ، 2002). أكثر علامات الاندماج شيوعًا هي بروتين ربط المالتوز (MBP Kapust and Waugh ، 1999) ، وبروتين مادة الاستخدام N A (NusA Davis et al. ، 1999) ، و thioredoxin (Trx LaVallie et al. ، 1993) ، الجلوتاثيون س-ترانسفيراز (جي إس تي سميث وجونسون ، 1988) ، يوبيكويتين (بيكر ، 1996) وسومو (بوت وآخرون ، 2005). تظل الأسباب التي تجعل شركاء الاندماج هؤلاء بمثابة معززات للذوبان غير واضحة وقد تم اقتراح العديد من الفرضيات (تمت مراجعتها في Raran-Kurussi and Waugh ، 2012). في حالة MBP ، تم إثبات أنه يمتلك نشاط مرافق جوهري (Kapust and Waugh ، 1999 Raran-Kurussi and Waugh ، 2012). في دراسات المقارنة ، أظهرت GST أضعف قدرات تعزيز الذوبان (Hammarstrom et al. ، 2006 Bird ، 2011). تعرض NusA و MBP و Trx أفضل خصائص تحسين القابلية للذوبان ولكن حجمها الكبير قد يؤدي إلى تقييم خاطئ لقابلية ذوبان البروتين (Costa et al. ، 2013). في الواقع ، عند إزالة هذه العلامات ، لا يمكن التنبؤ بالذوبان النهائي للمنتج المطلوب (Esposito and Chatterjee ، 2006). لهذه الأسباب ، من المستحسن استخدام العلامات الأصغر ذات التأثيرات القوية المعززة للذوبان. في الآونة الأخيرة ، بروتين رابط الكالسيوم 8-كيلو دالتون Fh8 من الطفيلي المتورقة الكبدية أظهرت أنها جيدة مثل العلامات الكبيرة أو أفضل منها من حيث تحسين القابلية للذوبان. علاوة على ذلك ، حافظت البروتينات المؤتلفة على قابليتها للذوبان بعد إزالة العلامات (Costa et al. ، 2013). يمكن استخدام MBP و GST لتنقية البروتين المصهور عن طريق كروماتوجرافيا التقارب ، حيث يرتبط MBP بالأميلوز & # x02013agarose و GST بالجلوتاثيون & # x02013agarose. MBP موجود في سلسلة pMAL من النواقل من NEB و GST في سلسلة pGEX (GE). يجب إضافة علامة الببتيد إلى البروتين المحتوي على شريك الاندماج إذا كانت هناك حاجة إلى خطوة كروماتوغرافيا تقارب في مخطط التنقية. ترتبط MBP و GST بركائزها بشكل غير تساهمي. على العكس من ذلك ، يعتمد HaloTag7 (Promega) على الالتقاط التساهمي للعلامة على الراتنج ، مما يجعل النظام سريعًا ومحددًا للغاية (Ohana et al. ، 2009).

مجموعة مختلفة من علامات الاندماج هي علامات تستجيب للمحفزات ، والتي تترسب بشكل عكسي من المحلول عند تعرضها للمحفز المناسب. تسمح إضافة علامات لفة & # x003B2 إلى بروتين مؤتلف بترسيبها الانتقائي في وجود الكالسيوم. قدمت المنتجات النهائية درجة نقاء عالية ولم يستغرق بروتوكول الترسيب سوى دقيقتين (Shur et al. ، 2013). علامات تنقية أخرى مستجيبة للمحفزات قائمة على البروتين هي عديد ببتيدات تشبه الإيلاستين (ELPs) ، والتي تتكون من تكرار ترادفي لتسلسل VPGXG ، حيث X هي Val أو Ala أو Gly بنسبة 5: 2: 3 (Meyer و Chilkoti ، 1999). تخضع هذه العلامات لانتقال طور عكسي عند درجة حرارة انتقال معينة (تير). عندما تير يتم الوصول إلى اندماج البروتين ELP & # x02013 بشكل انتقائي وعكس ، مما يسمح بإثراء سريع للبروتين المؤتلف عن طريق الطرد المركزي (Banki et al. ، 2005). يمكن أيضًا تشغيل الترسيب عن طريق ضبط القوة الأيونية للمحلول (Ge et al. ، 2005). تمثل هذه التقنيات بديلاً لطرق التنقية التقليدية القائمة على الكروماتوغرافيا ويمكن أن توفر تكاليف الإنتاج ، خاصة في الأماكن واسعة النطاق (Fong and Wood ، 2010). الخصائص الرئيسية للعلامات المذكورة في هذا القسم موضحة في الجدول 1.

الجدول 1. الخصائص الرئيسية لعلامات اندماج البروتين.

إزالة العلامة

إذا كانت هناك حاجة لدراسات هيكلية أو كيميائية حيوية على البروتين المؤتلف ، فيجب استبعاد شريك الاندماج من البروتين المؤتلف. يجب إزالة علامات الببتيد أيضًا لأنها يمكن أن تتداخل مع نشاط البروتين وبنيته (Wu and Filutowicz، 1999 Perron-Savard et al.، 2005) ، ولكن يمكن تركها في مكانها حتى بالنسبة للدراسات البلورية (Bucher et al.، 2002 Carson) وآخرون ، 2007). يمكن التخلص من العلامات إما عن طريق الانقسام الأنزيمي أو الانقسام الكيميائي.

في حالة إزالة العلامة عن طريق هضم الإنزيم ، تمتلك نواقل التعبير تسلسلات ترمز لمواقع انقسام البروتياز في اتجاه مجرى الترميز الجيني للعلامة. تم استخدام Enterokinase والثرومبين والعامل Xa والبروتياز لفيروس حفر التبغ (TEV) بنجاح لإزالة علامات الببتيد وشركاء الاندماج (Jenny et al. ، 2003 Blommel and Fox ، 2007). يعتمد الاختيار من بين أنواع البروتياز المختلفة على النوعية والتكلفة وعدد الأحماض الأمينية المتبقية في البروتين بعد الانقسام وسهولة الإزالة بعد الهضم (Waugh ، 2011). كان إنزيم Enterokinase والثرومبين شائعين في الماضي ولكن استخدام TEV الموسوم به أصبح خيارًا يوميًا نظرًا لخصوصياته العالية (باركس وآخرون ، 1994) ، فمن السهل إنتاجه بكميات كبيرة (تروبيا وآخرون ، 2009 ) ويترك فقط بقايا سيرين أو جلايسين (أو حتى الطرف الطبيعي N) بعد الهضم (Kapust et al. ، 2002).

كما يوحي الاسم ، في الانقسام الكيميائي ، تتم إزالة العلامة عن طريق معالجة بروتين الاندماج باستخدام كاشف كيميائي. تتمثل مزايا استخدام المواد الكيميائية لهذا الغرض في سهولة إزالتها من خليط التفاعل ورخيصة بالمقارنة مع الإنزيمات المحللة للبروتين ، مما يجعلها خيارًا جذابًا في الإنتاج واسع النطاق للبروتينات المؤتلفة (Rais-Beghdadi et al. ، 1998). ومع ذلك ، فإن ظروف التفاعل قاسية ، لذلك يقتصر استخدامها إلى حد كبير على البروتينات المؤتلفة المنقاة التي تم الحصول عليها من IBs. غالبًا ما تسبب أيضًا تعديلات غير مرغوب فيها في البروتين (Hwang et al. ، 2014). كاشف الانقسام الكيميائي الأكثر شيوعًا هو بروميد السيانوجين (CNBr). يشق CNBr طرف C رابطة الببتيد إلى بقايا الميثيونين ، لذلك يجب أن يكون هذا الحمض الأميني موجودًا بين العلامة والبروتين محل الاهتمام (Rais-Beghdadi et al. ، 1998). أيضًا ، يجب ألا يحتوي البروتين المستهدف على ميثيونين داخلي. يمكن إجراء انشقاق CNBr في ظروف تغيير طبيعة شائعة (6 مولار كلوريد جوانيدينيوم) أو 70٪ حمض الفورميك أو حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (Andreev et al. ، 2010). يمكن العثور على طرق كيميائية أخرى لانقسام البروتين في Hwang et al. (2014).


البيانات الموسعة الشكل 1 التوزيع النشئي للبروتينات في مجموعة بيانات التعبير عن البروتين على نطاق واسع.

ترمز الألوان الموجودة في مخطط cladogram عدد الجينات / البروتينات من كل كائن حي ، كما هو مبين في وسيلة الإيضاح. تتضمن مجموعة البيانات 47 من حقيقيات النوى (45 من البشر و 2 من الفئران) ، و 809 من البكتيريا البدائية ، و 96 من بكتريا قولونية، فيما يأتي الباقي من بكتيريا eubacteria الأخرى. الكائن الحي الذي يساهم بأكبر عدد من البروتينات في مجموعة البيانات هو eubacterium Bacteroides thetaiotaomicron (150 بروتين).

البيانات الموسعة الشكل 2 العلاقات بين معلمات تسلسل mRNA الإضافية والنتائج في مجموعة بيانات تعبير البروتين على نطاق واسع.

أ, أنا, ك، توضح الرسوم البيانية لكل تعبير توزيع تردد G + C الإجمالي (أ) ، التردد في جميع إطارات القراءة للتسلسل الأساسي AGGA لتسلسل ربط Shine-Dalgarno ribosome (أنا) ، ومعدل تكرار الأحماض الأمينية ص (ك انظر طرق التعريف). توزيعات المعلمات في فئات E = 5 و E = 0 (ن = 3،727 لكليهما معا) في أ باللون الأزرق الداكن والأزرق الفاتح ، على التوالي ، وفي أنا و ك باللون الأحمر والأسود ، على التوالي. الرموز المستخدمة في الرسوم البيانية لدرجات التعبير الوسيط (ن = 2621 لكل مجموعة) موضحة في وسيلة الإيضاح لكل لوحة. بح, ي, لا، تُظهر المخططات اللوغاريتم لنسبة عدد البروتينات مع E = 5 مقابل E = 0 درجات كدالة لقيمة المعلمة. ب، بيانات عن الترددات الإجمالية لقواعد النوكليوتيدات الفردية الأربعة بالإضافة إلى تردد G + C المدمج (المسمى GC). جه، البيانات المكافئة بشكل منفصل لأول (ج)، ثانيا (د) والثالث (ه) في الكودونات في الجينات. F، بيانات الجينات التي لا تحتوي على أو تحتوي على حدث واحد على الأقل من كودون ATA-ATA di-codon (ص = 2 × 10 −32).تمثل أشرطة الخطأ في هذه اللوحة حدود ثقة بنسبة 95٪ محسوبة من تمهيد أشرطة الخطأ للجينات دون حدوث أي من هذا الرمز الثنائي أصغر من حجم الرمز. ز, ح، بيانات مؤشر تكيف الكودون 14 (ز) ومؤشر تكيف الحمض الريبي النووي النقال 16 (ح). ي، بيانات عن التردد في جميع إطارات القراءة لتسلسل AGGA. ل, م، بيانات معدل تكرار الأحماض الأمينية ص (ل) ومعدل تكرار الكودون (م). ن, ا، بيانات الانتروبيا الإحصائية للحمض الأميني (ن) وتسلسلات الكودون (ا). البيانات الموجودة في أه, أنا و ك يتم إهمالها في نطاقات متساوية لقيمة المعلمة ، بينما يتم تخزين البيانات بتنسيق ز, ح, ي و لا يتم إهمالها في الشرائح العشرية التي تحتوي على عدد متساو من السكان.

البيانات الموسعة الشكل 3 الارتباطات بين معلمات التسلسل في الجينات المدرجة في مجموعة بيانات تعبير البروتين على نطاق واسع.

أج، Corrgrams التي تمثل معاملات ارتباط Pearson الموقعة بين معلمات تسلسل mRNA المختلفة في الجينات في E = 0 plus E = 5 فئات في مجموعة البيانات (ن = 3727 للاثنين مجتمعين). يتم تحديد الترميز اللوني بشكل تخطيطي على اليسار في أ، حيث يتم استخدام اللون الأزرق للمتغيرات المرتبطة إيجابًا ، والأحمر للمتغيرات المرتبطة سلبًا ، والأبيض للمتغيرات غير المرتبطة. في أ، تمثل E درجة التعبير في الفئات الثنائية (0 ، 5) ، سالكل يمثل القيمة المتوسطة لمقياس تأثير الكودون الجديد (الرموز الملونة في الشكل 3 أ) على الجين بأكمله (بدون علامة LEHHHHH) ، س7–16 و س17–32 تمثل القيم المتوسطة لهذا المقياس للكودونات 7-16 و17-32 على التوالي ،جيأوه يمثل الطاقة المجانية المتوقعة لطي mRNA لـ 5′-UTR من ناقل التعبير pET21 بالإضافة إلى أول 48 نيوكليوتيد في الجين ، & lt∆جيتي& GT96 تمثل القيمة المتوسطة في باقي الجين للطاقة الحرة المتوقعة للطي في 50 ٪ من النوافذ المتداخلة لـ 96 نيوكليوتيد ، أنا يمثل متغير مؤشر يفترض قيمة 0 أو 1 إذا (Δجيأوه & lt − 39 كيلو كالوري مول −1) و (٪ GC2–6 & GT 0.65) ، دAUA يفترض قيمة 0 أو 1 إذا كان هناك تكرار واحد على الأقل لكودون ATA-ATA di-codon ، ص يمثل معدل تكرار الكودون (انظر الطرق) ، ويمثل ٪ GC النسبة المئوية لمحتوى قواعد G plus C في الجين. المتغيرات أح, أح 2 , زح 2 و ش3 ح تمثل الوظائف الأحادية للمحتوى الكسري لقواعد A و G و U في الكودونات 2-6 ، تم حساب معامل الارتباط لشروط تكوين النوكليوتيدات هذه باستخدام مجموعها الموزون بمعاملاتها المحسّنة من النموذج M (الشكل 4 وجدول البيانات الموسعة 1 أ) ) ، كما هو وارد في المعادلة في النص الرئيسي. ب، ترتبط بيانات ترددات الكودونات بشكل إيجابي مع درجة التعبير E. ج، ترتبط بيانات ترددات الكودونات سلبًا بنتيجة التعبير E. دز، الرسوم البيانية ثنائية الأبعاد التي توضح اعتماد النتائج في مجموعة بيانات تعبير البروتين واسعة النطاق على أزواج من معلمات التسلسل. ترميز الألوان الزيادة الكسرية للبروتينات بـ E = 5 مقابل E = 0 درجات (أي (# E5 - # E0) / (# E5 + # E0)) ، كما تمت معايرتها بواسطة شريط المقياس الموجود على اليمين. تتناسب مساحة كل مربع مع عدد البروتينات في تلك الحاوية في مساحة المعلمة ثنائية الأبعاد. المتغيرات سالكل, س7–16 و سذيل تمثل ، على التوالي ، القيم المتوسطة لمقياس تأثير الكودون الجديد الخاص بنا للجين بأكمله ، من أجل الكودونات من 7 إلى 16 ، ولكل الكودونات المتبقية في الجين. Δجيأوه يمثل الطاقة المجانية المتوقعة لطي mRNA لـ 5′-UTR من ناقل التعبير pET21 بالإضافة إلى أول 48 نيوكليوتيد في الجين ، & lt∆جيتي& GT96 تمثل القيمة المتوسطة في باقي الجين للطاقة الحرة المتوقعة للطي في 50٪ نوافذ متداخلة من 96 نيوكليوتيد ، و ص يمثل معدل تكرار الأحماض الأمينية (كما هو محدد في الطرق).

البيانات الموسعة الشكل 4 علاقة مقياس تأثير الكودون الجديد بالمعلمات المفترض أنها تؤثر على كفاءة الترجمة في الأدبيات السابقة.

أ، متوسط ​​تكرار كل كودون بدون توقف في الجينات في E = 0 زائد E = 5 فئات (رمادي غامق) أو في E = 0 إلى E = 5 فئات (رمادي فاتح) ، مع أشرطة خطأ تمثل sd. من التردد بين الجينات في كل مجموعة. ب، تنحدر Codon من الانحدارات اللوجيستية الثنائية ذات المتغير الفردي (الرموز الرمادية الداكنة في الشكل 3 أ) مفصولة وفقًا لهوية النيوكليوتيد في كل من المواضع الثلاثة في الكودون. تأتي هذه المنحدرات من الانحدارات اللوجيستية الخطية ذات المتغير الفردي والتي تم إجراؤها بشكل منفصل لكل من الرموز 61 بدون توقف الفردية. ج، منحدرات Codon من نموذج الانحدار اللوجستي الثنائي المتزامن متعدد المعلمات M (جدول البيانات الممتد 1 أ والرموز الملونة في الشكل 3 أ) مفصولة وفقًا لهوية النيوكليوتيد في كل من المواضع الثلاثة في الكودون. دح، تم رسم منحدرات الكودون من النموذج M مقابل استخدام الكودون المرادف النسبي (RSCU) في بكتريا قولونية BL21 (ه) ، مؤشر تكيف الكودون 14 بوصة بكتريا قولونية K12 (F) ، حساسية الكودون 24 بوصة بكتريا قولونية K12 (د) ، مؤشر تكيف الحمض الريبي النووي النقال 16 بوصة بكتريا قولونية K12 (ز) ، وتركيز الحمض النووي الريبي المشابه تمامًا 23 بوصة بكتريا قولونية K12 (ح). الأشكال والترميز اللوني للرموز بتنسيق بح، والتي هي نفسها كما في الشكل 3 ، ترميز الخصائص الكيميائية الهيكلية والنوعية للأحماض الأمينية.

البيانات الموسعة الشكل 5 التباين في تأثير الكودون كدالة للموضع في تسلسل التشفير.

المخططات التي توضح انخفاض انحراف النموذج الحسابي الناتج عن إضافة مصطلح يمثل القيمة المتوسطة لمنحدر الكودون (الرموز الملونة في الشكل 3 أ) في نافذة بعرض 5 أو 10 أو 16 كودونًا بدءًا من الموضع المشار إليه في الإحداثي (أي ، c إلى (c + 4) باللون الأزرق ، c إلى (c + 9) باللون الأحمر ، أو c خلال (c + 15) باللون الأرجواني ، على التوالي ، حيث يمثل c رقم الرمز الأول في النافذة) . تم حساب الانخفاض في الانحراف بالنسبة إلى نموذج أساسي يحتوي على ترددات الكودون في تسلسل الترميز الكامل ، شروط تكوين نوكليوتيدات الرأس (أح, أح 2 , ش3 ح و زح 2) ، الطاقة الحرة المتوقعة لطي RNA في الرأس بالإضافة إلى 5′-UTR (Δجيأوه) ، متغير المؤشر الثنائي لتأثيرات طي الرأس أنا، يشير المتغير الثنائي إلى حدوث كودون AUAAUA ثنائي دAUA، ومعدل تكرار الكودون ص (ن = 3727). من المفترض أن متوسط ​​الانحدار للكودونات 2-6 لا يحسن النموذج لأن مصطلحات تكوين الرأس بدلاً من محتوى الكودون تهيمن على تأثير هذه المنطقة على مستوى التعبير البروتيني. ربما يفسر هذا التأثير أيضًا القمم في سج - (ج + 9) و سج - (ج + 15) المؤامرات للنوافذ تبدأ في كودون 7. للإشارة ، إضافة س7–16 و س16–32 تساهم شروط النموذج M بـ 29.7 نقطة (ص = 5 × 10 8) و 12 نقطة (ص = 5 × 10 −4) لانحراف النموذج ، على التوالي (جدول البيانات الموسعة 1 والشكل 4 أ). يُظهر الاستغناء عن المصطلحات لقياس تأثيرها (الشكل 4 أ) أن كل كودون يساهم في المتوسط ​​(423.7 / 270) = 1.6 وحدة انحراف ، بينما تساهم الكودونات 7-16 في المتوسط ​​بمزيد من وحدات الانحراف (29.6 / 10) = 3.0 وحدة انحراف. لذلك ، فإن الكودونات الفردية في المواضع 7-16 تكون تقريبًا أكثر تأثيرًا بثلاث مرات من تلك الموجودة في ذيل الجين.

البيانات الموسعة الشكل 6 مزيد من التجارب على الجينات الاصطناعية المصممة لتعزيز التعبير البروتيني.

أد، بيانات لثلاثة بروتينات إضافية تعادل البيانات الواردة في الشكل 5. و في الجسم الحي و في المختبر تتم مقارنة خصائص التعبير من نواقل pET للجينات الأصلية المترجمة غير الفعالة (WT) والجينات المترادفة المعاد تصميمها في الرأس أو الذيل أو كليهما باستخدام أساليب 6AA أو 31C-FO أو 31C-FD. نوع التسلسل في الرأس (ح) يشار إليه بشكل منفصل عن ذلك في الذيل (تي) ، واسم البروتين المستهدف موضح على اليسار في كل صف. أ, بكتريا قولونية منحنيات نمو الخلايا المضيفة BL21 (DE3) في درجة حرارة الغرفة بعد تحريض الجين المستهدف في الوقت صفر في وسط MJ9 المحدد كيميائيًا. ب، Coomassie-blue-stained SDS-PAGE هلام من الخلايا الكاملة بعد الحث بين عشية وضحاها عند 17 درجة مئوية ، مع تطبيع الكمية التي تم تحميلها في كل حارة إلى أ600 نانومتر من الثقافة وقت الحصاد. تشير الأسهم السوداء إلى مواقع هجرة البروتينات المستهدفة. ج، تصوير أوتوريغرافي من المواد الهلامية SDS – PAGE من في المختبر تفاعلات الترجمة باستخدام مكونات ترجمة نقية بالكامل في وجود [35 S] ميثيونين. احتوى كل تفاعل على كمية متساوية من الرنا المرسال المنقى الذي تم نسخه في المختبر باستخدام T7 RNA polymerase. د، اللطخة الشمالية تحليلات mRNA للبروتين المستهدف بعد تحريض التعبير في الجسم الحي. تم تحميل كمية متساوية من إجمالي الحمض النووي الريبي في كل حارة ، وتم تهجين البقع باستخدام مسبار يطابق 5′-UTR. ه, F، مواد هلامية SDS – PAGE ملطخة باللون الأزرق من Coomassie (ه) والبقع الغربية المضادة للرباعيستيدين (F) يوضح أن تحسين الجينات له تأثيرات مكافئة على مستويات التعبير الفسيولوجي للبروتين. أزواج من المترادفات الأصلية (WT) و 31C-FO المُحسَّنة من الكودونح / ت تمت إعادة استنساخ الجينات التي تحتوي على علامات hexahistidine C الطرفية تحت سيطرة محفز الأرابينوز في ناقل pBAD 62 ، وتم تعديل تركيز أرابينوز في وسط النمو بحيث يكون 31C-FOح / ت أسفرت الجينات عن تعبير البروتين في النطاق الفسيولوجي كما تم تقييمه من المواد الهلامية SDS-PAGE المصبوغة باللون الأزرق من Coomassie لمستخلصات الخلية الكاملة. تشير الأسهم السوداء إلى مواقع البروتينات المستهدفة المستحثة. انخفاض كبير في تعبير البروتين من الجينات البرية مقارنةً بالمرادف 31C-FOح / ت توضح الجينات في هذه التجارب أن تأثيرات استخدام الكودون المكافئة يتم ملاحظتها عندما يتم التعبير عن البروتينات بشكل مفرط باستخدام ناقل PET أو يتم التعبير عنها بمستويات بيولوجية تقريبًا باستخدام ناقل pBAD ، على الرغم من التغييرات الموضحة في الطرق عبر الإنترنت في البوليميراز المستخدمة لنسخ الجينات ، الوسيط تستخدم لتنمية الخلايا ، والنطاق الزمني ودرجة حرارة عملية تحريض البروتين

بروتين 25 كيلو دالتون يتفاعل مع الجسم المضاد للتيتراهيستدين في الخلايا التي تحتوي على 31C-FOح / ت من المحتمل أن يكون جين YcaQ عبارة عن بروتين مبتور أمينيًا يتم تصنيعه من رنا مرسال 5-اقتطاع تم نسخه من تسلسل محفز داخلي يتم إدخاله عن طريق الصدفة في هذا الجين الاصطناعي. يتم تضمين عمليات المسح غير المقصوصة للمواد الهلامية الموضحة هنا في الشكل التكميلي 1.

البيانات الموسعة الشكل 7 في الجسم الحي التعبير عن الجينات الاصطناعية ذات التسلسل الأمثل باستخدام طريقة 31C-FO.

أ، Coomassie-blue-stained SDS-PAGE المواد الهلامية من مستخلصات الخلايا الكاملة بعد الحث طوال الليل عند 17 درجة مئوية من الجينات الاصطناعية المصممة باستخدام 31C-FOح طريقة ترميز 17 بروتينًا مختلفًا. تم استنساخ جميع الجينات في الإطار باستخدام علامة سداسي هيستيدين C- الطرفية في نفس مشتق البلازميد pET21 المستخدم لتوليد مجموعة بيانات التعبير عن البروتين على نطاق واسع 38. تم تحميل أحجام متساوية من المزارع المستحثة في جميع الممرات. ب، Coomassie-blue-stained SDS-PAGE المواد الهلامية من مستخلصات الخلية الكاملة (أعلى) والكسور القابلة للذوبان المقابلة (أسفل) بعد الحث طوال الليل عند 17 درجة مئوية من 14 من الجينات الاصطناعية المنصهرة في الإطار عند الطرف C من الجين ل بكتريا قولونية بروتين ربط المالتوز (MBP). تأتي تسلسل البروتين من كائنات المصدر التالية: LCABL_04230 from Lactobacillus casei BL23 VIPARP466_2889 من فيبرايو بارايموليتيكوس AM1_4824 من مرسى Acaryochloris MBIC11017 CLO_0718 من المطثية الوشيقية E1 ESAG_04692 من Escherichia sp. 3_2_53FAA FTCG_00666 و FTCG_01175 من فرانسيسيلا تولارنسيس سوبسب. نوفيسيدا GA99-3549 FTE_1275 و FTE_1608 و FTE_0420 و FTE_1020 من فرانسيسيلا تولارنسيس سوبسب. نوفيسيدا FTE FRANO wbtG و A1DS62_FRANO من فرانسيسيلا نوفيسيدال FTBG_00988 و A7JEH2_FRATL من فرانسيسيلا تولارنسيس سوبسب. تولارينسيس FSC033 FTN_1238 من فرانسيسيلا تولارينسيس سبس. نوفيسيدا U112 O1O_09285 من الزائفة الزنجارية MPAO1 / P1 Sthe_2331 من Sphaerobacter thermophilus DSM20745 / S6022 SEVCU126_0606 من المكورات العنقودية البشروية VCU126 و Y007_20720 من السالمونيلا المعوية subsp. enterica serovar مونتيفيديو 507440-20.

البيانات الموسعة الشكل 8 محصول مرنا من النسخ في المختبر باستخدام بوليميريز T7 RNA المنقى.

أ، المحصول النهائي من الرنا المرسال المنقى من التفاعلات التي أجريت في ظل ظروف مماثلة ، كما هو موضح في الطرق. تم حساب الغلات من الكثافة الضوئية عند 260 نانومتر. به، التحليلات الحركية في المختبر تفاعلات النسخ باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام فورمالديهايد-الاغاروز. تم أخذ العينات في 0 و 5 و 10 و 30 دقيقة. كانت المواد الهلامية ملطخة ببروميد إيثيديوم. يحتوي الممر "القياسي" على 1 ميكروغرام من نفس الرنا المرسال بعد التنقية لتمكين المعايرة للاختلافات في حساسية الجزيئات للتلطيخ. بدأت التفاعلات بإضافة النوع البري أو 31C-FOح/ 31C-FOتي (31C-FOح / ت) ترميز البلازميدات الخطية SRU_1983 (ب) ، APE_0230.1 (ج) ، SCO1897 (د) ، أو Eco-YcaQ (ه).


4 الإجراءات التجريبية

4.1 المواد

تم الحصول على المضادات الحيوية من Sigma-Aldrich. قدمت شركة Takara Biotechnology كواشف البيولوجيا الجزيئية. قدمت شركة Novagen ناقلات الحيوانات الأليفة. تم الحصول على أعمدة Ni-agarose من Sigma-Aldrich. قدمت Bio-Rad كاشف صبغة برادفورد السريع Quick Start. كانت جميع الكواشف الأخرى من أعلى مستويات الجودة المتاحة. قام جين سكريبت (نانجينغ ، جيانغسو ، الصين) بتوليف البادئات قليلة النوكليوتيد.

4.2 السلالات البكتيرية والبلازميدات وظروف النمو

يتم سرد السلالات والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول S1. بكتريا قولونية نمت سلالات في وسط Luria Bertani (10 جم / لتر من التربتون ، 5 جم / لتر مستخلص الخميرة ، 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.0) عند 37 درجة مئوية. X. campestris نمت سلالات عند 28 درجة مئوية في وسط NYG (5 جم / لتر ببتون ، 3 جم / لتر مستخلص الخميرة ، 20 جم / لتر جلسرين ، درجة الحموضة 7.0) أو أجار مرق المغذيات (NA) (5 جم / لتر ببتون ، 3 جم / مستخلص لحم البقر ، 10 جم / لتر سكروز ، 1 جم / لتر مستخلص الخميرة ، درجة الحموضة 7.0). لإعداد وسط الاستزراع ، تم شراء التربتون ، الببتون ، مستخلص اللحم البقري ، ومستخلص الخميرة من Sangon Biotech. عند الحاجة ، تمت إضافة المضادات الحيوية بالتركيز التالي: 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين الصوديوم ، 30 ميكروغرام / مل كبريتات كانامايسين ، و 30 ميكروغرام / مل جنتامايسين من أجل بكتريا قولونية أو 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين X. campestris.

4.3 التعبير عن البروتين وتنقيته

تم إجراء تعبير البروتين وتنقيته كما هو موضح سابقًا (Li وآخرون.، 2017). لاستنساخ Xcc rpoN1 و Xcc rpoN2 الجينات والحمض النووي الجيني المستخرج من X. campestris تم استخدامه لتضخيم PCR مع Pfu بوليميريز الحمض النووي باستخدام الاشعال المدرجة في الجدول S2. تم إدخال منتجات PCR في pET-28b (+) لإنتاج البلازميدات pET-rpoN1 و PET-rpoN2. Xcc rpoN1 و Xcc rpoN2 تم التحقق من الجينات عبر تسلسل النوكليوتيدات بواسطة Genscript. Xcc rpoN1 و Xcc rpoN2 مع ناقلات المشفرة صاحب6تم التعبير عن علامة N-termini بتنسيق بكتريا قولونية BL21 (DE3) وتنقيته باستخدام Ni-NTA agarose (Sigma-Aldrich) باستخدام عمود تقارب نيكل أيون. تمت مراقبة نقاوة البروتين بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE).

4.4 حذف Xcc rpoN الجينات والتكامل

لتعطيل Xcc rpoN1 و Xcc rpoN2 الجينات ، pK18mobsacB التي تنقلها البلازميدات الانتحارية للحذف داخل الإطار pK18-ΔrpoN1 و pK18-ΔrpoN2 شيدت. شظايا الحمض النووي 500 نقطة أساس التي تحيط بـ Xcc rpoN1 و Xcc rpoN2 تم تضخيم الجينات مع Pfu استخدام بوليميريز الحمض النووي X. campestris الحمض النووي الجيني كقالب ، وإما rpoN1 باممرحبا و rpoN1 up1 (لأعلى rpoN1), rpoN1 down1 و rpoN1 هينdIII (لأسفل rpoN1), rpoN2 باممرحبا و rpoN2 up1 (لأعلى rpoN2)، أو rpoN2 down1 و rpoN2 هينdIII (لأسفل rpoN2) ، مثل الاشعال (الجدول S2). تمت تنقية الشظايا وربطها بواسطة تداخل PCR. تم هضم الجزء المنصهر مع باممرحبا و هينdIII ، وإدخالها في pK18mobscaB (Schafer وآخرون.، 1994) للحصول على البلازميدات pK18-ΔrpoN1 و pK18-ΔrpoN2. تم نقل التركيبات الناتجة إلى X. campestris بواسطة electroporation و kanamycin لاختيار تكامل البلازميد غير المتماثل في الكروموسوم المتلقي. تم نشر مستعمرة متكاملة أحادية التقاطع على وسط NYG بدون كاناميسين عند 28 درجة مئوية لمدة 36 ساعة ، وبعد التخفيف المناسب تم نشر الثقافة على ألواح NYG المحتوية على 15٪ سكروز. تم فحص المستعمرات الحساسة للكاناميسين بواسطة PCR باستخدام البادئات المدرجة في الجدول S2 ، و Xcc rpoN1 و Xcc rpoN2 سلالات الحذف (ΔrpoN1 و ΔrpoN2) تم الحصول عليها. لتكملة Xcc rpoN1 و Xcc rpoN2 المسوخ ، مناطق ترميز Xcc rpoN1 و Xcc rpoN2 تم تضخيمها بواسطة PCR واستنساخها في بلازميد pBBR1MCS5 متعدد الاستخدامات (Kovach وآخرون.، 1995). تم نقل البلازميد الناتج إلى X. campestris سلالة بالتثقيب الكهربائي. ΔrpoN1 / N1 وΔrpoN2 / N2 تم الحصول على سلالات. ΔrpoN1N2 سلالات مزدوجة متحولة ومكملة ΔrpoN1 / N2، ΔrpoN2 / N1، ΔrpoN1N2 / N1و ΔrpoN1N2 / N2 تم الحصول عليها بنفس الطريقة.

4.5 فحوصات الإمراضية

تم إجراء فحوصات التلقيح والفوعة النباتية كما هو موضح سابقًا (Cai وآخرون.، 2017). باختصار ، نباتات عمرها 6 أسابيع من صنف الملفوف ب. oleracea تم استخدام "Jingfeng No. 1" كنباتات مضيفة. السلالة البرية Xc1 والعقيمة 10 ملي MgCl2 تم استخدام الضوابط الإيجابية والسلبية ، على التوالي. تمت زراعة جميع السلالات البكتيرية طوال الليل في وسط NYG الذي يحتوي على مضادات حيوية مناسبة. تم جمع الخلايا وغسلها بـ 10 ملي MgCl2، وتم تعديل كثافة الخلايا إلى OD600 = 0.1 قبل التلقيح في أوراق النبات باستخدام مقص معقم. تم قياس أطوال الآفات بعد 10 أيام من التلقيح في 20 ورقة لكل سلالة تم اختبارها.

4.6 النسخ العكسي الكمي PCR

تم إجراء RT-qPCR كما هو موضح في الدراسات السابقة (Cui وآخرون.، 2018). تم جمع الخلايا البكتيرية عند الكثافة البصرية للخلية (OD600) بلغ 1.0 في وسط NYG. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام الطريقة القائمة على TRIzol (تقنيات الحياة). تم إجراء مراقبة جودة الحمض النووي الريبي من خلال عدة خطوات: (أ) تمت مراقبة درجة تدهور الحمض النووي الريبي والتلوث المحتمل على 1 ٪ من المواد الهلامية agarose (ب) نقاء الحمض النووي الريبي (A)260280، أ260230) باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoPhotometer (IMPLEN) و (ج) تم قياس سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام Bioanalyzer 2100 (Agilent). يتم سرد الاشعال المستخدمة في هذا الاختبار في الجدول S2. تم الانتهاء من التحديد الكمي للتعبير الجيني وتحليل منحنى الذوبان باستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي QuantStudio 6 Flex (النظم البيولوجية التطبيقية) ، وتم استخدام TransStart Top Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. كعنصر تحكم ، تم تطبيق RT-qPCR بالمثل للتحليل 16S rDNA التعبير الجيني. تم حساب مستويات التعبير النسبي للجينات المستهدفة باستخدام 2 −ΔΔجطريقة ر للقياس الكمي المقارن.

4.7 RNA ‑ Seq

تم إجراء اختبار RNA-Seq كما هو موضح سابقًا (Yang وآخرون.، 2017 تشو وآخرون.، 2017). باختصار ، النوع البري Xc1 ، ΔrpoN1، ΔrpoN2و ΔrpoN1N2 نمت سلالات متحولة في وسط NYG ، وتم جمع خلاياها عند OD600 وصلت إلى 1.0 بناءً على منحنى النمو. تم استخدام الخلايا التي تم جمعها لاستخراج الحمض النووي الريبي بالطريقة المستندة إلى TRIzol (تقنيات الحياة) ، وتم رصد تدهور وتلوث الحمض النووي الريبي على 1 ٪ من المواد الهلامية agarose. تم إجراء التجميع والتسلسل بواسطة شركة Genedenovo Biotechnology Co. ، Ltd (قوانغتشو ، قوانغدونغ ، الصين). لتحليل DEGs بين النوع البري Xc1 ، ΔrpoN1، ΔrpoN2و ΔrpoN1N2 سلالات متحولة ، تم تطبيع مستويات التعبير الجيني بشكل أكبر باستخدام شظايا لكل كيلو قاعدة من طريقة قراءة النص لكل مليون (FPKM) للتخلص من تأثير أطوال الجينات المختلفة وكمية بيانات التسلسل على حساب التعبير الجيني. تم استخدام حزمة edgeR (http://www.r-project.org/) لتحديد DEGs عبر العينات مع تغييرات الطية ≥2 ومعدل الاكتشاف الخاطئ المعدل ص (ف القيمة) & lt.05. ثم خضعت DEGs لتحليل إثراء لوظائف الأنطولوجيا الجينية (GO) ومسارات KEGG ، و ف تم تصحيح القيم باستخدام & lt.05 كحد أدنى.

4.8 فحوصات التحول الهلامي للتنقل الكهربي

تم تنفيذ EMSAs كما هو موصوف (Hirakawa وآخرون.، 2015 شاو وآخرون.، 2018). بالنسبة لفحوصات تحول هلام RpoN ، استخدمنا شظايا الحمض النووي التي تضمنت pXCC fliC (408 نقطة أساس) و pXCC fliQ (497 نقطة أساس) مناطق محفز كمجسات. تم خلط DNA المسبار (50 نانوغرام) مع البروتين في خليط تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على 10 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 7.5) ، 50 ملي مولار بوكل ، 1 ملي ديثيوثريتول ، و 0.4٪ جلسرين. بعد الحضانة لمدة 25 دقيقة عند 28 درجة مئوية ، تم فصل العينات بالكهرباء على هلام أكريلاميد غير قابل للتشبع بنسبة 5 ٪ في محلول مؤقت 0.5 × Tris-borate-EDTA (TBE) عند 4 درجات مئوية. تم نقع الجل في صبغة الحمض النووي SYBR Green I المخففة 10000 مرة (Sangon Biotech) ، وتم تصور الحمض النووي عند 300 نانومتر.

4.9 قياس النشاط الأنزيمي خارج الخلية وحركة السباحة

تم تقييم الأنشطة النسبية للأنزيمات خارج الخلية كما هو موضح سابقًا (Wei وآخرون.، 2007 يو وآخرون.، 2016). اثنان ميكرولتر لكل منهما X. campestris ثقافة السلالة (OD600 1.0) على ألواح أجار NYG المحتوية على 1٪ (وزن / حجم) حليب منزوع الدسم (للبروتياز) ، 0.5٪ (وزن / حجم) كربوكسي ميثيل سلولوز (للسليولاز) ، أو 0.1٪ (وزن / حجم) نشا (للأميلاز) وحضنت عند 28 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة. تم تلوين اللوحات عند الضرورة كما هو موضح سابقًا (Wei وآخرون.، 2007). تم تصوير مناطق الخلوص حول البقع بسبب تدهور الركيزة. تم تلقيح ثلاث أطباق في كل تجربة وتكررت كل تجربة ثلاث مرات. تمت الإشارة إلى النشاط الأنزيمي النسبي بقطر منطقة الخلوص.

تم تحديد حركة السباحة على أجار شبه صلب (0.3٪). تم تلقيح البكتيريا في مراكز لوحات NYG التي تحتوي على 0.3 ٪ من الاغاروز. تم تحضين الصفائح عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل قياس أقطار المستعمرة.

4.10 مقايسة تكوين EPS

تم قياس إنتاج EPS كما هو موضح سابقًا (Yu وآخرون.، 2016). كل X. campestris ثقافة السلالة (2 مل ، OD600 ≈ 1.0) لتلقيح 100 مل من وسط NYG المحتوي على 4٪ جلوكوز في دورق سعة 250 مل وحفظه عند 28 درجة مئوية مع الرج عند 180 دورة في الدقيقة لمدة 4 أيام. تم ترسيب EPS من المادة الطافية للثقافة بإضافة 4 أحجام من الإيثانول. تم غسل البوليستيرين المكوّن من حبيبات مع 70٪ من الإيثانول ، وتجفيف الهواء ، والوزن. تم تلقيح ثلاث قوارير في كل تجربة وتكررت كل تجربة ثلاث مرات.

4.11 مقايسة تشكيل بيوفيلم

تم إجراء اختبار تكوين البيوفيلم كما هو موضح سابقًا مع بعض التعديلات (Wang وآخرون.، 2018). باختصار ، تم زراعة الخلايا البكتيرية في وسط NYG إلى OD النهائي600 من 1.0. بعد ذلك ، تمت إضافة 3 مل من المعلق الخلوي إلى أنابيب البوليسترين المعقمة. تم حفظ هذه الأنابيب في غرفة رطبة عند 28 درجة مئوية لمدة 7 أيام دون رج. ثم تم نقل المزروعات وغسل الأنابيب ثلاث مرات في ماء الصنبور. تم تصور تكوين البيوفيلم على الأنابيب عن طريق التلوين بنسبة 0.1 ٪ من السيرة الذاتية ، تليها الغسيل ثلاث مرات في ماء الصنبور. تمت إذابة الغشاء الحيوي الملون CV في أنابيب البوليسترين في ميثانول - حمض أسيتيك - ماء (4: 1: 5 ، المجلد / المجلد / المجلد) وقياس الكمية عن طريق قياس A575 باستخدام 8453 مقياس طيف ضوئي مرئي للأشعة فوق البنفسجية (Agilent). تم استخدام متوسط ​​ثلاث مكررات للقياس الكمي. تم تكرار فحوصات الأغشية الحيوية ثلاث مرات وأظهرت نتائج مماثلة بثلاث مكررات في كل مرة.

4.12 الكشف عن مكونات إشارة DSF في X. campestris طاف الثقافة

تم وصف بروتوكول استخراج وتنقية مكونات عائلة DSF سابقًا (Zhou وآخرون.، 2015 أ). X. campestris تمت زراعة السلالات في وسط سائل لمدة 36 ساعة وتم جمع 50 مل من المادة الطافية البكتيرية بالطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم تعديل الرقم الهيدروجيني للمادة الطافية إلى 4.0 بإضافة حمض الهيدروكلوريك قبل عمليتي استخلاص بحجم متساوٍ من أسيتات الإيثيل. تم جمع كسور أسيتات الإيثيل ، وإزالة المذيب بالتبخير الدوراني حتى يجف عند 42 درجة مئوية. تمت إذابة المتبقي في 100 ميكرولتر من ميثانول. تعرض المستخلص الخام لترشيح نجمي صغير 0.22 ميكرومتر ، وتم تركيز ناتج الترشيح إلى 100 ميكرولتر. تم حقن المستخلص (10 ميكرولتر) في عمود HPLC ذو طور معكوس C18 (4.6 × 250 مم ، Agilent Technologies ، Inc.) وتم التصفية التتابعية بالماء في ميثانول (23:77 حجم / حجم ، 0.1٪ حمض الفورميك) عند التدفق. بمعدل 1 مل / دقيقة في نظام HPLC E2695 (مياه) مع كاشف UV220.

4.13 تحليل تكوين الأحماض الدهنية

نمت المزارع البكتيرية بطريقة هوائية لمدة 2-4 أيام. تم حصاد الخلايا وغسلها ثلاث مرات بماء معقم. تم تصنيع واستخراج استرات ميثيل الأحماض الدهنية كما هو موصوف سابقًا (Li وآخرون.، 2017). تم تصبن الدهون الخلوية بإضافة 2 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم / ميثانول عند 100 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة مع الرج (800 دورة في الدقيقة). تمت ميثلة الأحماض الدهنية بإضافة 4 مل من محلول حمض الهيدروكلوريك / ميثانول عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وتبريدها إلى أقل من 20 درجة مئوية. تم الحصول على إسترات ميثيل الأحماض الدهنية عن طريق ثلاث عمليات استخلاص باستخدام 1 مل من الإيثر البترولي. تمت إزالة المذيب تحت تيار من النيتروجين ، وتمت إذابة المادة المتبقية في 100 ميكرولتر من الهكسان. تم ترشيح المستخلص الخام بوحدات نجمية صغيرة 0.22 ميكرومتر ، وتم تحليل 2 ميكرولتر من المستخلص بواسطة GC-MS. تم تحليل العينات باستخدام نظام GC-MS (Agilent 5975c) بعمود كروماتوجرافي DB 5MS. تم الاحتفاظ بدرجة حرارة الفرن عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتغييرها عند 10 درجة مئوية / دقيقة إلى 200 درجة مئوية والاحتفاظ بها لمدة 5 دقائق ، ثم تغييرها عند 10 درجة مئوية / دقيقة إلى 250 درجة مئوية والاحتفاظ بها لمدة 5 دقائق. تم استخدام التأين بالصدمات الإلكترونية (EI +، 70 eV) لجميع العينات. تم إجراء قياس الطيف الكتلي عند 1 ثانية / مسح ، م/ض 35-500 ، و 1 كيلو فولت ، وتم تحليل البيانات بواسطة قاعدة بيانات NIST 08.

4.14 التحليلات الإحصائية

خضعت مجموعات البيانات التجريبية لتحليلات التباين باستخدام GraphPad Prism 7.0. تم تحديد أهمية آثار العلاج بواسطة F القيمة (ص = .05). إذا كان كبير F تم الحصول على القيمة ، وتم فصل الوسائل عن طريق الاختلاف الأقل أهمية المحمي فيشر عند ص ≤ .05.


الملخص

تم العثور على بروتين الموصل ، المعروف أيضًا باسم بروتين البوابة ، الموجود في قمة البوابة في عاثية Phi29 للعب دورًا رئيسيًا في محرك تعبئة الحمض النووي للجينوم. هناك منطقة مضطربة ، تتكون من 12 مجموعة من 18 حلقة من البقايا N229-N246 ، يُفترض أنها تعمل بمثابة "مشبك" للاحتفاظ بالحمض النووي داخل الكابسيد المضغوط عندما يتم تغليف الحمض النووي بالكامل. ومع ذلك ، تظل العملية غير محددة حول كيفية حدوث لقط الحمض النووي والإشارة المستخدمة لإشراك حلقات القناة لربط الحمض النووي بالقرب من نهاية عبوة الحمض النووي. في هذه الدراسة ، نستخدم تقنية الغشاء ثنائي الطبقة الدهنية (PLB) لدراسة الموصل مع حلقاته المشقوقة. تتم مقارنة خصائص القناة بخصائص الموصل مع حلقات من النوع البري المقابلة عند إمكانات غشاء مختلفة. على أساس فرضية تأثيرات دونان في نموذج السقاطة البراونية الوامضة ، فإننا نربط النتائج التجريبية لـ PLB بنتائج التجارب البيوكيميائية ذات الصلة على الصفحات الأولية التي تحتوي على الموصلات بدون الحلقات ، مما يمكننا من تقديم صورة واضحة عن كيف يحدث لقط الحمض النووي. تم إنشاء علاقة رياضية بين إمكانات دونان وكثافة تغليف الحمض النووي ، مما يدل على أنهما في جوهرهما نفس الإشارة التي يتم استقبالها ونقلها بواسطة الموصل لإملاء لقط الحمض النووي وإنهاء تغليف الحمض النووي. في نهاية الدراسة ، تم اقتراح تقنية PLB كأداة بحث فيروسية ، وتم تسليط الضوء على استخدامها المحتمل لدراسة وظائف مجالات معينة في بروتين بوابة من عاثيات الذيل.

عنوان بنيامين بوريس الحالي هو قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية ، جامعة ولاية أوهايو ، كولومبوس ، أوهايو 43210.


على هذه الصفحة:

لدى الوكالات الحكومية الأمريكية التالية والممولين من القطاع الخاص شراكات مع NLM للاستفادة من البنية التحتية لشركة PMC. للحصول على معلومات محددة حول كيفية الامتثال لسياسات هؤلاء الممولين ، يرجى الاطلاع على مواقعهم الإلكترونية. (قد تكون نظرة عامة حول كيفية دخول الأوراق إلى PMC ذات أهمية أيضًا.) يجب توجيه أي أسئلة حول سياسة ومتطلبات المؤسسة إلى الممول.

شركاء الوكالة الفيدرالية الأمريكية

شركاء خاصون ودوليون

  • جمعية الزهايمر
  • جمعية القلب الأمريكية - جمعية السكتات الدماغية الأمريكية
  • مؤسسة علوم التوحد
  • التوحد يتحدث
  • معهد ابحاث السرطان
  • مؤسسة ديمون رونيون لأبحاث السرطان
  • مؤسسة دوناهو
  • مؤسسة دوريس ديوك الخيرية
  • مؤسسة محاربة العمى
  • JDRF
  • مؤسسة طول العمر
  • مؤسسة أبحاث سرطان الغدد الليمفاوية
  • مؤسسة مرض باركنسون
  • معهد أبحاث النتائج المرتكز على المريض (PCORI)
  • سوزان جي كومن
  • مؤسسة V لأبحاث السرطان
  • تحالف التصلب الحدبي

امتحان علم الوراثة 3

طفرات التحويل = الاستبدالات الأساسية التي يتم فيها تغيير البيورين إلى بيريميدين أو العكس.

طفرة هراء = عندما تحل طفرة محل كودون حاسي مع كودون STOP (أو هراء).

الطفرة الصامتة = استبدال النيوكليوتيدات الذي يغير تسلسل كودون mRNA ولكن ليس المعنى.

الإصلاح المباشر = يتم إصلاح تلف الحمض النووي عن طريق التغيير المباشر للنيوكليوتيدات التالفة إلى هيكلها الأصلي.

إصلاح استئصال القاعدة = يتم استئصال القاعدة التالفة ثم استبدال النيوكليوتيد بأكمله.

1.4 × 10-4 = الحثل العضلي الدوشيني (ديستروفين) (DHD)

ب. التوافق مع مرض السكري أعلى بكثير في التوائم أحادية الزيجوت مقارنة بالتوائم ثنائية الزيجوت ، لذلك يمكننا
نستنتج أن العوامل الوراثية تلعب دورًا ما في التعرض لمرض السكري. تشير حقيقة أن التوائم أحادية الزيجوت تظهر توافقًا أقل من 100٪ إلى أن العوامل البيئية تلعب دورًا أيضًا.

ج. يظهر كل من التوائم أحادية الزيجوت وثنائي الزيجوت نفس التوافق العالي لشرب القهوة حتى نتمكن من استنتاج ذلك
هناك القليل من التأثير الجيني على شرب القهوة. تشير حقيقة أن التوائم أحادية الزيجوت تظهر توافقًا أقل من 100٪ إلى أن العوامل البيئية تلعب دورًا.

د. يكون التوافق مع التدخين أقل في التوائم ثنائية الزيجوت عنها في التوائم أحادية الزيجوت لذا يبدو أن العوامل الوراثية
تؤثر على الميل للتدخين. حقيقة أن التوائم أحادية الزيجوت تظهر توافقًا أقل من 100 ٪ تشير إلى ذلك
تلعب العوامل البيئية دورًا أيضًا.


شاهد الفيديو: The race to sequence the human genome - Tien Nguyen (كانون الثاني 2022).