معلومة

كيف أتعامل مع العينات اللزجة واللزجة من محللات الخلية؟


للتحقق من تعبير البروتين ، قمت بتكوير كمية صغيرة منه بكتريا قولونية قبل وبعد الاستقراء وإزالتها عن طريق حلها في المخزن المؤقت لتحميل SDS-PAGE وتسخينها إلى 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.

يؤدي هذا إلى حل به بعض الأجزاء اللزجة واللزجة جدًا ، مما يجعل سحب العينة في آبار الهلام أمرًا مزعجًا للغاية. بقدر ما سمعت ، من المحتمل أن يكون هذا هو الحمض النووي الجيني ، وطريقتي المعتادة للتعامل مع هذا هو الطرد المركزي للعينات وماصة جزء صغير فقط من الجزء العلوي. يبدو أن هذا يساعد أحيانًا ، ولكن ليس دائمًا.

كيف يمكنني تجنب تكون تلك الأشياء اللزجة واللزجة أو كيف يمكنني تجنب سحب تلك الأشياء إلى الآبار الخاصة بي؟


نعم ، الحمض النووي الجيني هو الذي يسبب لك المتاعب. على الرغم من أن دورانًا قصيرًا يبلغ 1000 جرام يجب أن يؤدي إلى انخفاض كل شيء ، إلا أن الحبيبات ليست ضيقة أبدًا وستقوم دائمًا بسحب بعض المواد اللزجة باستخدام المادة الطافية الصافية. الحل الأفضل هو تضمين خطوة صوتنة سريعة (5-10 ثوانٍ) قبل دوران 1000 جم. بهذه الطريقة ، يتم تقطيع الحمض النووي ويجب أن يتكوّن بشكل أفضل. لقد نجحت معي في معظم الأوقات. تذكر أيضًا استخدام حجم معقول من المخزن المؤقت لـ SDS عند تحليل الخلايا. القليل من المخزن المؤقت وسيكون دائمًا صعبًا. للمقارنة ، أستخدم حوالي 200ul لكل 1 مل من حبيبات الثقافة وهذا الحجم يعمل بشكل جيد لكل من الخلايا المستحثة قبل وبعد.


بالإضافة إلى اقتراح gkadam ، بالنسبة لجل البروتين الخاص بي ، أقوم بتسخين عيناتي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أود أيضًا أن أنظر في ظروف lysing المختلفة. بدلاً من استخدام المخزن المؤقت لتحميل SDS ، ابحث في خطوات lysing أكثر قوة إما باستخدام مجموعة مثل bug-buster أو باستخدام الخالط. عند تكوير المحلول الخاص بك ، قمت تقليديًا بتدوير 10000 جرام لمدة 10 دقائق.

ربما أعمل فقط مع بروتينات قابلة للذوبان حقًا ...


شاهد الفيديو: الدرس الرابع- العينات غير الاحتمالية غير العشوائية (كانون الثاني 2022).