معلومة

كيف تختار الآلية الجزيئية مكان قطع الكروموسوم لإعادة التركيب؟


أنا أتساءل عن بعض الجوانب الفنية للتقاطع في الانقسام الاختزالي. الهدف من التقاطع هو إنشاء كروموسومات جديدة لا تحتوي على نفس تركيبات الأليل مثل الكروموسومات الأصلية. عادة ، يتم قطع الكروموسومات في نفس المكان على كلا الكروموسومين ، ثم يتم خياطة كل قطعة في ذلك المكان على الأخرى. هذا لتجنب إعادة التركيب غير المتكافئ ، وهو سيناريو يحتوي فيه كروموسوم واحد على عدة حالات من الجين والآخر لا يوجد مثيل على الإطلاق. أتساءل كيف تعرف الآلية الجزيئية مكان القطع.

إذن ، هذا سؤالي: كيف تختار الآلية الجزيئية مكان قطع الكروموسوم لإعادة التركيب؟

يتكون هذا السؤال من جزأين: في أي نوع من المكان يحدث (هل تختار الآلية مكانًا عشوائيًا تمامًا ، بغض النظر عن مكان بدء الجينات ونهايتها ، هل يتم قطعها فقط في بداية الجينات ، أم أنها تفعل شيئًا آخر)؟ بالنظر إلى حدوثه في هذا النوع من الأماكن (مثل بداية الجين) ، كيف يقرر أنه سيقطع هنا (بداية هذا الجين) وليس هناك (بداية ذلك الجين)؟


السؤال واسع للغاية ومعقد ، حيث قد يختلف الوضع في بدائيات النوى وحقيقيات النوى. ومع ذلك ، فإنني أستشهد بورقة جيدة وثيقة الصلة بسؤالك:

تظهر الدراسات التي أجريت على الخميرة أن بدء إعادة التركيب ، الذي يحدث عن طريق تكوين فواصل الحمض النووي المزدوجة ، يحدد توزيع تحويل الجينات وأحداث التقاطع التي تحدث في فترات قريبة. تشير البيانات الحديثة في البشر والفئران أيضًا إلى وجود مواقع بدء محلية للغاية تعزز عمليات الانتقال المتجمعة حول منطقة البدء ويبدو أنها تشترك في ميزات مشتركة مع مواقع في الخميرة. على نطاق أوسع ، تم تحديد المجالات الكروموسومية ذات معدلات إعادة التركيب المختلفة من الخميرة إلى الثدييات. يشير هذا إلى مستوى أعلى من تنظيم إعادة التركيب في الجينوم مع العواقب المحتملة على بنية الجينوم ... تحدث DSBs (فواصل حبلا مزدوجة) في مناطق محلية للغاية وتنتشر على 70-250 نقطة أساس. يكشف تحليل تسلسل الحمض النووي عن عدم وجود تسلسل إجماعي فريد محفوظ ، على الرغم من أن عنصرًا منحطًا بمقدار 50 نقطة أساس يرتبط جزئيًا بمواقع DSB. ومع ذلك ، فإن إحدى السمات الشائعة هي أن DSBs تقع في مناطق يمكن الوصول إليها من الكروماتين بجوار أي من المروجين أو مواقع الربط لعوامل النسخ. بناءً على دراستين ، لا يرتبط نشاط DSB بنشاط النسخ المحلي ، ولكنه يعتمد على ارتباط عامل النسخ (HIS4 في S. cerevisiae و ade6-M26 في S. pombe).

برنارد دي ماسي ، توزيع مواقع إعادة التركيب الانتصافي. اتجاهات في علم الوراثة المجلد 19 رقم 9 سبتمبر 2003

سأختصر ذلك في شكل أشبه بالإجابة. يبدو أن العملية ليست عشوائية ، لأنه من الواضح أن أحداث تكسير الخيط المزدوج ليست موزعة بالتساوي عبر الجينوم. كما تقول الورقة لم يتم العثور على نماذج إجماع محددة حتى الآن ، على الرغم من أنه من الواضح أن هناك شيئًا خاصًا قبل المروجين ومواقع ربط TF ، مما يجعلها أكثر احتمالية لتكون موقع كسر. كيف تختار الماكينة المكان؟ مرة أخرى ، كما تقول الورقة ، يعتمد حدث الانكسار على ربط TF. ولكن هذا هو ل S. cerevisiae. توجد 17 نقطة ساخنة في جينومات الإنسان والفئران ، بعضها متوارث بين الجينات (تحتل مناطق داخلية أو 5 '/ 3' مناطق مجاورة).

فيما يلي توزيع ترددات إعادة التركيب عبر كروموسوم واحد (الشكل مأخوذ من الورقة).

فيما يلي قائمة بمواقع إعادة التركيب عند البشر والفئران


في البشر والفئران على أي حال ، يتلخص الكثير منها في التعرف على تسلسل محدد يحدد النقاط الساخنة لإعادة التركيب من خلال PRDM9. http://www.sciencemag.org/content/327/5967/836

تحرير - أقوم بالتوسيع ردًا على التعليق أدناه ...

يحدث إعادة التركيب الانتصافي بترددات أكبر بكثير في بعض المواقع في الجينوم من غيرها وتسمى هذه النقاط الساخنة لإعادة التركيب. على سبيل المثال ، الشكل هنا ، مأخوذ من http://www.sciencemag.org/content/327/5967/876/F1.large.jpg ">

يُظهر معدل إعادة التركيب في النقطة الساخنة وبعيدًا عنها للشمبانزي والبشر.

يتم التعرف على هذه النقاط الساخنة بواسطة آلية القطع بفضل ارتباط PRDM9 ، وهو بروتين إصبع الزنك ، بتسلسل الحمض النووي الذي يتعرف عليه على وجه التحديد ويتواجد في النقاط الساخنة. يختلف تسلسل الحمض النووي من نوع إلى نوع (كما هو الحال مع تسلسل ووظيفة PRDM9) ولكن في البشر عبارة عن نموذج مميز جيدًا بطول 13 زوجًا أساسيًا ومتسلسل CCNCCNTNNCCNC (حيث N هي أي من القواعد الأربعة في DNA) ، وتمثل نشاط ما يقرب من 40٪ من النقاط الساخنة المعروفة.

يحتوي الرابط الأول الذي نشرته على دليل يشير إلى أن الاختلاف في تكوين PRDM9 هو أحد المحددات التي يتم استخدامها من النقاط الساخنة. يبدو أن PRDM9 يحفز تكوين تعديل معين للهيستون - H3k4me3 (الحمض النووي ملفوف حول هيستونات ، وهناك خمسة هيستون - H1 ، H2A ، H2B ، H3 ، H4 ، ولكل منها ذيل يمكن تعديله كيميائيًا ، وثمانية من هؤلاء (2 من H2A ، 2 من H2B ، 2 من H3 و 2 من H4) تشكل نواة - في هذه الحالة يتم تنظيم بقايا اللايسين الرابعة من ذيل هيستون H3 كما ينظمها PRDM9 ، ويسهل العبور و بدء إعادة التركيب. تحرير الملخص


في الانقسام الاختزالي ، يحدث إعادة التركيب المتماثل. يستخدم بروتينان Spo11 التيروزينات للحث على كسر مزدوج تقطعت به السبل في الحمض النووي. Spo11 ليس لديه موقع انقسام محدد. ومع ذلك ، أدى الانقسام بواسطة Spo11 إلى اكتشاف مركبات Spo11-Oligonucleotide (Spo11 w / المرفقة بعد الانقسام قليل النوكليوتيد) والتي يمكن تعيينها إلى `` النقاط الساخنة '' التي وجدت الدراسة المرتبطة بها عددًا من العوامل المميزة لانقسام Spo11 في الانقسام الاختزالي:

من المواقع الدقيقة لتسلسل 2.2 مليون Spo11-oligonucleotide ، Pan et al. [1] أظهر أن تكوين الحمض النووي المحلي يؤثر أيضًا على مواقع انقسام Spo11. كما هو متوقع من الدراسات السابقة ، لا يحتوي Spo11 على موقع تمييز أو انقسام محدد. ومع ذلك ، تم الكشف عن تحيزات التسلسل: 10 إلى 12 نقطة أساس المحيطة بموقع الانقسام وتوقع أن تكون مرتبطة مباشرة بـ Spo11 غنية نسبيًا بـ AT ، وتتوقع أخاديد حلزونية ضيقة وعميقة نسبيًا تواجه ثنائيات Spo11 المقيدة. يفضل الانقسام المواقع على الفور 3 'من a C ويرفض G في نفس الموضع. أيضًا ، داخل قلب 32 نقطة أساس تحيط بمواقع انقسام Spo11 ، يمكن تمييز تناظر دوراني مزدوج لتكوين ثنائي النوكليوتيد التكميلي ، مما يشير إلى مساهمات منفصلة من "المواقع النصفية" المحيطة بـ Spo11 الربط و / أو الانقسام. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط مواقع الانقسام سلبًا بالنيوكليوزومات الموضعية. وبالمثل ، يتم حجب Spo11 بشكل عام من مواقع الانقسام حيث ترتبط عوامل النسخ ، على الرغم من أن مواقع الربط للعديد من عوامل النسخ المختلفة ترتبط بشكل إيجابي بمواقع النقاط الساخنة.


في حين أن جميع الإجابات المذكورة أعلاه صحيحة وثاقبة لعملية تشكيل DSBs ، فإن إعادة التركيب لها طبقة أخرى من التعقيد.

من المرجح أن يكون التوسط في الفصل الصبغي الصحيح هو النقطة الحقيقية لعمليات الانتقال منذ عمليات الانتقال لا تزال تحدث في الجينوم الفطري، والتي لا تؤدي إلى أنماط فردانية جديدة. يقوم أول أكسيد الكربون بإنشاء هيكل مضاعف متغاير بين خيوط الحمض النووي وتقاطعات هوليداي. تخلق هذه البنية قوى التوتر اللازمة لاجتياز نقطة تفتيش تجميع المغزل قبل أن تتقدم الخلية الانتصافية إلى طور الطور (انظر أوراق عمل Nicklas على كروموسومات الجندب و Hirose et al 2011). في معظم الكائنات الحية ، هناك حاجة إلى ما لا يقل عن ثاني أكسيد الكربون لكل ذراع كروموسوم لتمرير نقطة تفتيش تجميع المغزل والتوسط في الفصل الصحيح. يمكن أن يؤدي عدم وجود COs أو CO في غير محلها إلى عدم الانفصال وزيادة مخاطر اختلال الصيغة الصبغية (Hassold، Hall، Hunt 2007). (* استثناء هو ذكور ذبابة الفاكهة السوداء ، التي لها مسار فصل كروموسوم مستقل عن ثاني أكسيد الكربون).

بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن DSB = / = COs أي أنه لا يتم تحويل جميع DSBs إلى COs. في جميع الكائنات الحية ، يفوق DSB عدد COs الناتجة. يتم حل غالبية DSBs إلى غير عمليات الانتقال (NCOs). هناك دليل جديد (في الفئران على الأقل) على أن هذه الأرقام ليست متناسبة. بمعنى ، إذا تم تقليل إجمالي DSBs في الجينوم ، فلن يتأثر إجمالي عدد ثاني أكسيد الكربون. (كول وآخرون 2012).

أعتقد أن الصياغة الأكثر إثارة لسؤالك ستكون ، كيف يختار الجينوم أي DSBs لحلها إلى COs مقابل NCO?


معمل ديرنبرج

تقوم مجموعتنا بالتحقيق في تنظيم الكروموسومات ودينامياته. نحن نركز على الانقسام الاختزالي ، وهو عملية انقسام الخلايا المتخصصة التي تؤدي إلى ظهور الخلايا التناسلية مثل الحيوانات المنوية والبويضات وحبوب اللقاح والجراثيم. تكمن أخطاء الانقسام الاختزالي وراء العديد من العيوب الخلقية البشرية مثل متلازمة داون ، وتساهم أيضًا في العقم عند الإنسان ، خاصة عند النساء الأكبر سنًا. يتطلب الانقسام الاختزالي الناجح سلسلة فريدة من تفاعلات الكروموسوم: يجب أن يقترن كل كروموسوم بشريكه المتماثل ، ثم تتبادل هذه الكروموسومات المقترنة المعلومات الجينية من خلال إعادة التركيب المتماثل. تؤدي إعادة التركيب المتقاطع إلى تنوع جيني ، كما تخلق روابط مادية بين الكروموسومات تمكنها من الفصل بعيدًا عن بعضها البعض. نحن نحقق في هذه الآليات باستخدام الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans ككائن نموذج أساسي لدينا. يتمتع هذا النظام التجريبي بمزايا تجريبية هائلة ، بما في ذلك علم الوراثة السريع والقوي ، وتحرير الجينوم القوي ، وعلم الخلايا المتميز ، وفرصة مراقبة الانقسام الاختزالي مباشرة من خلال التصوير في الجسم الحي. ندرس أيضًا تطور ومرونة الانقسام الاختزالي من خلال مقارنة هذه الأحداث في C. elegans بالديدان الخيطية الأخرى ، مثل Pristionchus pacificus.

خلال الانقسام الاختزالي ، تخضع الكروموسومات لعملية إعادة تنظيم ديناميكية وحيوية. السمة المميزة للدخول الانتصافي هي إعادة تنظيم كل كروموسوم مكرر في مجموعة خطية من الحلقات المثبتة على محور مركزي ، والذي ينظم العديد من جوانب الانقسام الاختزالي. لقد وصفنا التنظيم الجزيئي ووظيفة محاور الكروموسوم من خلال مناهج بيوكيميائية وتركيبية متنوعة ، بما في ذلك علم البلورات (بالتعاون مع مختبر Kevin Corbett ، UCSD / LICR) والفحص المجهري فائق الدقة (مع Michal Wojcik و Ke Xu ، جامعة كاليفورنيا في بيركلي). تتفاعل كروموسومات الانقسام الاختزالي أيضًا مع المحركات الجزيئية في السيتوبلازم عبر مركب "LINC" ، مما يمكّنها من التحرك بسرعة على طول السطح النووي. من خلال التصوير المباشر لهذه الحركات في الحيوانات الحية ، تعلمنا كيف تعمل على تسريع قدرة الكروموسومات على إيجاد شركائها وتنظيم تفاعلاتها مع الكروموسومات الأخرى. في العديد من الكائنات الحية ، يتم التوسط في هذه الحركة عن طريق التيلوميرات ، وهي تسلسل الحمض النووي المتكرر الخاص في نهايات الكروموسومات ، ولكن في C. elegans ، تم الحصول على هذا الدور من خلال "مراكز الاقتران" ، وهي مناطق واسعة بالقرب من أحد طرفي كل كروموسوم تمتد مئات الكيلوبات. . حددنا المتطلبات الجزيئية لوظيفة مركز الاقتران واستمرنا في التحقيق في أدوارها في الديناميات والتنظيم الانتصافي.

اللغز القديم حول الانقسام الاختزالي هو كيف يخضع كل زوج من الكروموسومات لتقاطع واحد على الأقل ، في حين أن العدد الإجمالي لعمليات الانتقال عادةً ما يكون منخفضًا جدًا. في الواقع ، في C. elegans ، كما هو الحال في العديد من الأنواع الأخرى ، يحدث تقاطع واحد فقط بين كل زوج من المتماثلات. أشارت الأدلة الحديثة إلى أن المركب المشبكي (SC) ، وهو بوليمر خاص يتجمع بين الكروموسومات المزدوجة ، يلعب دورًا مهمًا في التحكم في هذا التقاطع. من خلال التصوير الحي في C. elegans ، اكتشفنا أن SC تتصرف كمقصورة بلورية سائلة فريدة من نوعها. نحن نستكشف كيف تتجمع هذه المادة غير العادية ذاتيًا من خلال فصل الطور ، وكيف تنظم إعادة التركيب الانتصافي. لقد حددنا الإشارات البيوكيميائية ومفتاح التوافق داخل هذه المقصورة التي تنظم تشكيل التقاطع. تُلقي نظرة ثاقبة على آلية الإشارات المجزأة هذه الضوء على كيفية قيام الخلايا بمجموعة متنوعة من القرارات التي تشبه التبديل والمترجمة مكانيًا.

يكمن الانقسام الاختزالي في تطور حقيقيات النوى ، ويتشكل أيضًا من خلال التطور ، مما يُظهر تباينًا رائعًا في تفاصيل تنفيذه. على سبيل المثال ، في العديد من الكائنات الحية ، تعتمد عملية الاقتران المتماثل الانتصافي على آلية إعادة التركيب ، لكن C. elegans من بين الاستثناءات المعروفة لهذه القاعدة. لفهم كيف يمكن للتطور أن يعيد تنظيم التنظيم الانتصافي بشكل أفضل ، نقوم بتطوير نيماتودا أخرى تعرف باسم Pristionchus pacificus ، وهو كائن نموذجي ناشئ من الأقمار الصناعية ، للتحليل الجزيئي للانقسام الاختزالي. من خلال مقارنة كيفية عمل هذه العملية في نوعين مختلفين من الديدان الخيطية (C. elegans و P. pacificus) ، نكشف عن الجوانب الأساسية للتنظيم الانتصافي المشترك عبر حقيقيات النوى ، واستكشاف كيفية ظهور آليات جديدة مثل الاقتران المستقل عن إعادة التركيب في سلالات معينة .

الرؤى الجديدة في علم الأحياء مدفوعة بتقنيات جديدة. على وجه الخصوص ، مكنت التطورات في الفحص المجهري الفلوري ، وتسلسل الحمض النووي ، وتحرير الجينوم ، وقياس الطيف الكتلي مختبرنا من الإجابة على الأسئلة الطويلة الأمد. سوف تستمر التطورات المستقبلية في التأثير على اتجاهات أبحاثنا. بينما تركز مجموعتنا البحثية على المشاريع التي تعتمد على الفرضيات بدلاً من تطوير الأساليب ، فإننا نعمل أيضًا على توسيع مجموعة أدواتنا التجريبية من خلال التعاون والابتكار. على سبيل المثال ، طورنا طرقًا للتصوير طويل المدى في الجسم الحي للكبار من النوع C. elegans ، مما مكننا من فحص ديناميكيات حركة الكروموسوم وتجميع معقد synaptonemal. قمنا أيضًا بتكييف نظام التحلل المحفز للأوكسين (AID) للاستخدام في C. elegans. تتيح هذه الطريقة استنفادًا سريعًا وقويًا للبروتين استجابةً لجزيء صغير غير مكلف وغير سام ، كما تجعل من الممكن إنشاء سلالات أكثر تعقيدًا مما يمكننا استخدام أليلات فقدان الوظيفة التقليدية. نرحب بالباحثين المحتملين المهتمين بتطبيق أحدث الأدوات لدراسة تنظيم الكروموسوم.


ما هي تقنية كريسبر؟

الفيروسات عبارة عن جزيئات معدية من مادة وراثية تؤثر فعليًا على كل نوع من الكائنات الحية ، وبالتالي تطورت آليات الدفاع ضد الفيروسات. في حالة بدائيات النوى ، فإن موضع كريسبر هو منطقة من الحمض النووي الجيني يمكن إضافة تسلسلات الجينوم الفيروسي إليها لتكون بمثابة & quot؛ ذاكرة & quot؛ للعدوى السابقة للدفاع المستقبلي ضد نفس الفيروس. الاسم كريسبر لتقف على التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بشكل منتظم. المناطق القصيرة (20-50 نيوكليوتيدات) للحمض النووي الفيروسي هي & quot؛ quspacers & quot؛ وتستخدم لنسخ CRISPR RNAs (crRNAs). تتفاعل crRNAs مع RNA إضافي (tracrRNA) وبروتين (Cas) مرتبط بـ CRISPR ، والذي يشق الحمض النووي التكميلي الذي يدخل الخلية ، وبالتالي يكسر دورة تكاثر الفيروس.

التجربة: هل تمنح تسلسلات المباعد مقاومة للعاثيات؟

سلالة من النوع البري العقدية الحرارية تعرضت لنوعين من العاثيات (فج 858 و فج 2972) وتم التعرف على البكتيريا الطافرة المقاومة لكل سلالة. تم بعد ذلك تحديد تسلسل المباعد في موضع كريسبر في الطفرات ومقارنتها بتسلسل جينوم العاثيات. كانت المسوخات ذات التسلسلات المباعدة التي تتوافق مع تسلسل في جينوم العاثية مقاومة لتلك العاثية على وجه التحديد (Barrangou et al.2007). حتى القليل من القواعد غير المتطابقة لم تمنح المقاومة.

تعديل أنظمة كريسبر / كاس لتعديل الجينوم

إن اكتشاف أن الحمض النووي الريبي يمكن أن يوجه نوكليازًا داخليًا إلى موضع جينومي محدد لقطع الحمض النووي قدم فرصة لتعديل هذا النظام لتعديل الجينوم. اكتشف العلماء أنه بإمكانهم الجمع بين اثنين من الحمض النووي الريبي (tracrRNA و crRNAs) في دليل صغير واحد من الحمض النووي الريبي (sgRNA). يمكن توفير إنزيم Cas على شكل DNA عبر البلازميد أو RNA الذي يشفر البروتين ، والذي يتم إنتاجه بواسطة آلية التعبير الجيني الخلوي ، أو مباشرة كبروتين منقى. يتطلب بروتين Cas9 تسلسل إجماعي للتفاعل مع الحمض النووي (5 'NGG 3') ، ولكن هذا الحافز شائع نسبيًا ، مما يسمح باستهداف معظم المواقع.

ولكن كيف يمكن أن يفيد الكائن الحي إنشاء فواصل مزدوجة الشريطة في الجينوم؟ تكمن الإجابة في إصلاح الحمض النووي الخلوي. عادةً ما يتم إصلاح الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل عن طريق الانضمام غير المتماثل (NHEJ) أو إعادة التركيب المتماثل. تقوم NHEJ في كثير من الأحيان بإجراء عمليات إدخال أو حذف صغيرة ، والتي يمكن أن تعطل على سبيل المثال تسلسل تشفير البروتين لتعطيله. يمكن أن يحدث الإصلاح بوساطة إعادة التركيب المتماثل إما عن طريق استخدام الكروموسوم المتماثل كقالب للإصلاح أو عن طريق توفير الحمض النووي الخارجي مع التعديل المطلوب ، وانتقال ونقل الخلية بشكل فعال إلى إجراء الإصلاح بناءً على الحمض النووي المتبرع المقدم. الأهم من ذلك ، في هذا الوقت ، أن كفاءة تحرير الجينات CRISPR ليست 100٪ لذا يجب تحديد الخلايا التي تم تحريرها بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك ، يواصل العلماء دراسة حدوث التعديلات غير المستهدفة (غير المقصودة) عند استخدام الأنظمة المستندة إلى كريسبر.

اطلب الخطوات في تعديل الجينات بتقنية كريسبر.

  1. إصلاح الحمض النووي الخلوي
  2. نوكلياز Cas يربط الحمض النووي الجيني في الموقع الذي يحدده الدليل الصغير التكميلي RNA
  3. تحديد الخلايا المحررة
  4. انقسام الحمض النووي الجيني
  5. يتم إدخال نوكلياز Cas و RNA دليل صغير في الخلايا
  6. حدد تسلسل دليل RNA

للحصول على المساعدة ، استخدم هذا الرابط لمراجعة الخطوات https://media.hhmi.org/biointeractive/click/CRISPR/ (انقر فوق N-Learn بواسطة HHMI Biointeractive).


3 ثلاث آليات لقص ولصق الحمض النووي

سمح إنشاء نظام خالٍ من الخلايا لأنواع مختلفة من إعادة التركيب المتخصصة بتوضيح الخطوات البيوكيميائية لتفاعلات تبادل خيوط الحمض النووي. حددت هذه الدراسات في المختبر ثلاث آليات مختلفة لقطع وإعادة ربط جزيئات الحمض النووي ، والتي تتوافق مع الفئات الرئيسية الثلاث للبروتينات الموضحة أعلاه: DDE transposases ، و resolvase / invertase ، وعائلات λ Int من إعادة التركيب الخاصة بالموقع. السمة المشتركة للآليات الثلاث هي أنها تستمر من خلال تفاعلات الاسترة التبادلية دون الحاجة إلى عوامل مساعدة عالية الطاقة مثل ATP (الشكل 3) [3 ، 31 ، 49]. يتم الحفاظ على طاقة روابط الفوسفوديستر المكسورة من أجل تكوين روابط جديدة. تستخدم ترانسبوزسات DDE آلية ترانسسترة من خطوة واحدة ، في حين أن العائلتين المتميزتين من إعادة التركيب الخاصة بالموقع تستخدم آليات إعادة الأسترة المتباينة المكونة من خطوتين والتي تتضمن بقايا الأحماض الأمينية المختلفة في تكوين إنزيم الحمض النووي التساهمي (الشكل 3). لقد وصل فهم هذه الآليات الآن إلى المستوى الذري للدقة من خلال الحصول على بيانات التركيب البلوري لكل من العائلات الثلاث للبروتينات.

كيمياء التحويل وتفاعلات إعادة التركيب الخاصة بالموقع. يحدث تكسير جديلة الحمض النووي وإعادة التركيب عن طريق تفاعلات استرة حيث يكون فوسفات رابطة الفوسفوديستر المقصية عرضة لهجوم محبي النواة من قبل مجموعة الهيدروكسيل (الأسهم).الانقسام الداخلي للنووية عند نهايات الترانسبوزون (A) وتفاعل نقل الخيط الذي ينضم إلى نهايات الحمض النووي المستهدف (B) هو عبارة عن ترانزسترات من خطوة واحدة يكون فيها النوكليوفيل عبارة عن جزيء ماء ونهاية العنصر 3′-OH ، على التوالى. يحدث تبادل السلك المحفز بواسطة إعادة التركيب الخاصة بالموقع (C و D) عن طريق خطوتين من التحلل التبادلي (الانقسام والالتحاق) يتضمن وسيط بروتين تساهمي-دنا. تختلف طبيعة المخلفات التحفيزية وخط دخول النوكليوفيل بين عائلتين recombinase. بالنسبة للانقسام المحفز بواسطة عائلة invertase / resolvase (C) ، فإن nucleophile hydroxyl مشتق من سيرين والمجموعة الخارجة هي 3′-OH من deoxyribose. بالنسبة لعائلة λ Integrase (D) ، تكون البقايا الحفزية عبارة عن tyrosine والمجموعة المتبقية هي 5′-OH. لكلا العائلتين recombinase ، فإن خطوة الانضمام هي عكس خطوة الانقسام. يتم رسم العمود الفقري للفوسفات في خطوط سميكة ورقيقة لتمييز الحمض النووي المتبرع والمستهدف (اللوحة B) أو خيوط DNA الشريكة لإعادة التركيب (الألواح C و D).

كيمياء التحويل وتفاعلات إعادة التركيب الخاصة بالموقع. يحدث تكسير جديلة الحمض النووي وإعادة التركيب عن طريق تفاعلات استرة حيث يكون فوسفات رابطة الفوسفوديستر المقصية عرضة لهجوم محبي النواة من قبل مجموعة الهيدروكسيل (الأسهم). الانقسام الداخلي للنووية عند نهايات الترانسبوزون (A) وتفاعل نقل الخيط الذي ينضم إلى نهايات الحمض النووي المستهدف (B) هو عبارة عن ترانزسترات من خطوة واحدة يكون فيها النوكليوفيل عبارة عن جزيء ماء ونهاية العنصر 3′-OH ، على التوالى. يحدث تبادل السلك المحفز بواسطة إعادة التركيب الخاصة بالموقع (C و D) عن طريق خطوتين من التحلل التبادلي (الانقسام والالتحاق) يتضمن وسيط بروتين تساهمي-دنا. تختلف طبيعة المخلفات التحفيزية وخط دخول النوكليوفيل بين عائلتين recombinase. بالنسبة للانقسام المحفز بواسطة عائلة invertase / resolvase (C) ، فإن nucleophile hydroxyl مشتق من سيرين والمجموعة الخارجة هي 3′-OH من deoxyribose. بالنسبة لعائلة λ Integrase (D) ، تكون البقايا الحفزية عبارة عن tyrosine والمجموعة المتبقية هي 5′-OH. لكلا العائلتين recombinase ، فإن خطوة الانضمام هي عكس خطوة الانقسام. يتم رسم العمود الفقري للفوسفات في خطوط سميكة ورقيقة لتمييز الحمض النووي المتبرع والمستهدف (اللوحة B) أو خيوط DNA الشريكة لإعادة التركيب (الألواح C و D).

3.1 ينقل DDE: تفاعل ترانزستور عالمي من خطوة واحدة

تم فحص الكيمياء الحيوية للتفاعلات المحفزة بواسطة recombinases DDE بالتفصيل لعدة أنظمة مختلفة بما في ذلك ثلاثة عناصر بكتيرية قابلة للنقل: العاثية Mu ، IS10 و تينيسي7 (للاطلاع على المراجعات الحديثة ، انظر [6 ، 11 ، 15 ، 50]. في جميع الحالات ، ينفذ transposase مجموعة من التفاعلات الحرجة التي تربط أطراف 3 ′ للعنصر بالحمض النووي المستهدف ، في حين أن اتصال 5 ينتهي و يتطلب إكمال التحويل معالجة الأحداث التي يتم إجراؤها بواسطة وظائف إصلاح العائل والنسخ المتماثل (الشكل 4). هناك اختلاف مهم بين الأنظمة البكتيرية الثلاثة في عدد وطبيعة القطع التي تفصل الينقولات عن DNA المتبرع المحيط ، مما يؤدي إلى نهاية تبديل مختلفة -المنتجات. بالنسبة إلى الينقولات الثلاثة ، يبدأ التحويل بزوج من انشقاقات حبلا مفردة محددة تعرض نهايات 3′-OH للعنصر (الشكل 4 انظر أيضًا الشكل 3 أ).10 و تينيسي7 التي تستخدم آلية قص ولصق غير متكررة ، يتم أيضًا شق الخيط الآخر للكشف عن نهايات الينقولات 5 ′ واستئصال العنصر من موضعه الجيني الأولي. يكون10 ينتج عن الاستئصال نهايات الينقولات المتدفقة [51] ، بينما ينكسر الخيط المزدوج في نهايات Tn7 تتعثر بثلاثة نيوكليوتيدات ، مع حدوث انشقاقات خماسية الأطراف في العمود الفقري المتبرع المجاور [52]. في تناقض حاد ، لا يحدث الانقسام الثاني في هذه المرحلة من انتقال Mu للعاثيات الذي يظل متصلاً عند نهاياته 5 ′ بتسلسل الحمض النووي المرافقة. في الخطوة الثانية ، تنتهي 3′-OH من الينقولات المستأصلة (IS10 و تينيسي7) أو النكات الموجودة في الجزيء المانح (Mu) تشارك في تفاعل نقل خيط منسق ينضم إلى طرفي العنصر للفوسفات المتدرج في خيطي الحمض النووي المستهدفين (الشكل 4 انظر أيضًا الشكل 3 ب).

الخطوات البيوكيميائية الكامنة وراء التحويل غير التكراري أو التكراري لثلاثة عناصر بكتيرية. تمثل المستطيلات المظللة خيوط الحمض النووي لنهايات العناصر القابلة للتحويل. لهو10 و تينيسي7، ردود الفعل التي تحدث في نهاية واحدة معروضة. المستطيلات بالأبيض والأسود هي تسلسل المانحين المجاورين والحمض النووي المستهدف ، على التوالي. تظهر رؤوس الأسهم السوداء والبيضاء انشقاق 3′-end و 5′-end ، على التوالي. تشير الأسهم المنحنية إلى هجوم محبة النواة ينقل نهايات 3′-OH على فوسفات متداخلة للحمض النووي المستهدف (النقاط السوداء). تمثل الخطوط الملقحة عدد قليل من النيوكليوتيدات المستهدفة التي يتم تكرارها أثناء عملية التحويل. بالنسبة للعناصر الثلاثة ، يتم تحفيز الخطوات الكيميائية الحيوية بواسطة الترانسبوزيز في مجمع حيث تكون نهايات الينقولات في المشابك. لهو10، يتم التقاط الهدف بعد الانتهاء من الفواصل المزدوجة في نهايات الينقولات ، بينما بالنسبة لـ Mu و Tn7، فإن وجود الهدف داخل المجمع مطلوب لتفعيل تفاعلات الانقسام. يمثل التظليل المتقاطع أحداث النسخ التي تكتمل عملية التبديل بعد التفكك المعقد.

الخطوات البيوكيميائية الكامنة وراء التحويل غير التكراري أو التكراري لثلاثة عناصر بكتيرية. تمثل المستطيلات المظللة خيوط الحمض النووي لنهايات العناصر القابلة للتحويل. لهو10 و تينيسي7، ردود الفعل التي تحدث في نهاية واحدة معروضة. المستطيلات بالأبيض والأسود هي تسلسل المانحين المجاورين والحمض النووي المستهدف ، على التوالي. تظهر رؤوس الأسهم السوداء والبيضاء انشقاق 3′-end و 5′-end ، على التوالي. تشير الأسهم المنحنية إلى هجوم محبة النواة ينقل نهايات 3′-OH على فوسفات متداخلة للحمض النووي المستهدف (النقاط السوداء). تمثل الخطوط المحببة عدد قليل من النيوكليوتيدات المستهدفة التي يتم تكرارها أثناء عملية التحويل. بالنسبة للعناصر الثلاثة ، يتم تحفيز الخطوات الكيميائية الحيوية بواسطة ترانسبوزيز في مجمع حيث تكون نهايات الينقولات في المشابك. لهو10، يتم التقاط الهدف بعد الانتهاء من الفواصل المزدوجة في نهايات الينقولات ، بينما بالنسبة لـ Mu و Tn7، فإن وجود الهدف داخل المجمع مطلوب لتفعيل تفاعلات الانقسام. يمثل التظليل المتقاطع أحداث النسخ التي تكتمل عملية التبديل بعد التفكك المعقد.

في حالة IS10 و تينيسي7، ينتج عن معالجة المضيف للحبل الوسيط الناتج عن نقل الخيوط ملء الفجوات القصيرة أحادية الخيط الموجودة عند كل تقاطع DNA مستهدف transposon. هذا الإصلاح الذي في حالة تين7 يُفترض أيضًا أنه يزيل النوكليوتيدات الثلاثة المتدلية عند الأطراف 5 ، ويولد الازدواجية المستهدفة القصيرة التي تحيط بالعنصر في موضعه الجديد (الشكل 4). بعد الانقسام النهائي للعمود الفقري للمانح بواسطة آلية غير محددة ، يمكن معالجة منتج نقل حبلا من البكتيريا Mu بطريقة مماثلة أثناء التكامل غير التكراري للعاثية. بدلاً من ذلك ، في حالة عدم وجود تفكك العمود الفقري للمانحين ، يؤدي التكرار الكامل للعنصر إلى تكامل مشترك ، وهو المنتج النهائي للتبديل التكراري (الشكل 4).

تم الإبلاغ عن اختلافات في مسار التحويل لكل من الينقولات بدائية النواة وحقيقية النواة. على وجه الخصوص ، transposase من IS911، عضو في IS3 تم العثور على عائلة ، لتنفيذ تفاعل دائري مميز أحادي الخيط يتم فيه نقل أحد طرفي الينقولات إلى موقع مستهدف على بعد ثلاثة نيوكليوتيدات بعيدًا عن الطرف الآخر [53 ، 54]. في الجسم الحي ، تتم معالجة جزيء "الشكل الثامن" الناتج ، مما يؤدي إلى ظهور شكل دائري مستأصل من الينقولات التي يُعتقد أنها وسيطة تبديل يمكن إدخالها بكفاءة في موضع جديد. على الرغم من تميزه ميكانيكيًا ، فإن هذا التعميم "الخاص بالموقع" لـ IS911 تذكرنا برد فعل الختان الذي تم إجراؤه بواسطة recombinases الخاصة بالموقع. ومن المثير للاهتمام ، أن تشكيل دوائر transposon المستأصل قد لوحظ لأعضاء آخرين من IS3 الأسرة [54 ، 55] ، وكذلك لداعش1 [56] وبالنسبة إلى الينقولات حقيقية النواة المتنوعة ، مما يشير إلى أنها قد تمثل طريقة رئيسية للتبديل [54].

كما هو مذكور أعلاه ، فإن الانقسام الأولي الذي يولد نهايات 3′-OH وتفاعل نقل الخيط المحفز بواسطة ترانسبوزسات DDE البكتيرية مكافئ كيميائيًا للتفاعلات المحفزة بواسطة بروتينات الإنزيم الفيروسي الارتجاعي (IN) لدمج الفيروس القهقري cDNA في الجينوم لخلية مصابة [6 ، 7 ، 57]. تمضي الانقسامات بوساطة IN في نهايات HIV (كدنا) وخطوة نقل حبلا اللاحقة مع انعكاس chirality في فوسفات الحمض النووي المستهدف. تم الحصول على نفس النتيجة لتفاعل نقل حبلا محفزًا بالعاثية MuA transposase [58 ، 59]. يشير هذا التحليل إلى أن التفاعلات المحفزة بواسطة إعادة تركيب DDE تحدث بواسطة آلية استرة من خطوة واحدة حيث يتم مهاجمة رابطة الفوسفوديستر المقصية مباشرةً ، إما بواسطة جزيء ماء (انشقاق طرفي) ، أو بنهاية العنصر 3′-OH للعنصر. (نقل حبلا) دون تكوين وسيط تساهمية بروتينية DNA (الشكل 3). تتطلب كلتا خطوتي الاسترة التبادلية كاتيونات ثنائية التكافؤ (Mg 2+ أو Mn 2+) وتم افتراض أن دور بقايا DDE هو تكوين جيب ربط أيون معدني في الموقع النشط [49]. هذا الاقتراح مدعوم بقوة من خلال الاكتشاف الأخير الذي يشير إلى أن المجال التحفيزي لـ IN و MuA والإنزيمات الأخرى المشاركة في عمليات نقل الفوسفوريل المعتمدة على أيونات المعادن تظهر هياكل متشابهة جدًا.

يوضح التركيب البلوري للنواة الحفازة التي تحتوي على مادة DDE لـ MuA أن هذه المنطقة من البروتين تحتوي على مجالين فرعيين [60]. تشكل البقايا الطرفية الـ 70 C برميلًا ، على وجه واحد منها منطقة كبيرة ذات إمكانات إيجابية يمكن أن تلعب دورًا في نشاط ربط الحمض النووي غير المحدد المرتبط بالنواة الحفازة بأكملها. تم اقتراح أن هذا النشاط قد يكون مهمًا للتفاعلات إما مع تسلسلات الحمض النووي المحيطة بنقاط الانقسام عند نهايات Mu أو مع DNA الهدف ، من أجل وضع الركيزة في موقع الإنزيم النشط [60]. بشكل ملحوظ ، على الرغم من المستوى المنخفض جدًا لتماثل التسلسل ، فإن بنية المجال الفرعي N-terminal الذي يحتوي على ثالوث DDE يُظهر أوجه تشابه مذهلة ، ليس فقط مع المجال التحفيزي لبروتينات IN لفيروس HIV و ASV retroviruses ، ولكن أيضًا مع هيكل الإنزيمات البعيدة وظيفيًا مثل بكتريا قولونية و ribonucleases H (RNase H) و بكتريا قولونية Holliday حل إنزيم RuvC (تمت مراجعته في المرجعين [61-63]). في البنية التي تشترك فيها هذه البروتينات المختلفة (ورقة مركزية مكونة من خمسة خيوط محاطة بحلزونات α على كلا الجانبين) ، تكون ثلاثة أو أربعة بقايا حمضية مهمة تحفيزيًا ، أي عزر DDE في حالة بروتينات MuA و IN ، هي متجمعة لتشكيل جيب محتمل لربط أيوني معدني كما هو ملاحظ بالفعل في بنية موقع HIV RNase H النشط [64]. يدعم هذا التشابه الهيكلي بين البروتينات غير المرتبطة بقوة الرأي القائل بأن إعادة اتحاد DDE تنتمي إلى مجموعة أكبر من الإنزيمات ، بما في ذلك البوليميرات والريبوزيمات ، التي تحفز تفاعلات الأسترة باستخدام آلية تحفيزية مشتركة "كربوكسيلات ثنائي الأيونات ثنائية المعدن" [61 ، 63] . في هذه الآلية ، المقترحة مبدئيًا لنشاط نوكلياز خارجي 3′-5 لبوليميراز الحمض النووي I ، يشارك أيونان معدنيان مخلبان في تنشيط هيدروكسيل النيوكليوفيل ورابطة فوسفودايستر scissile عن طريق تثبيت الفوسفات في شكل منسق خماسي. ].

ومع ذلك ، فإن recombinases DDE ليست نوكليازات بسيطة أو انتقالات عديد النيوكليوتيديل. تتميز هذه الإنزيمات بحقيقة أنها تحفز على التوالي اثنين (أو ثلاثة) تفاعلات استرة في طرفي الينقولات. يتطلب النقل الناجح تنسيق هاتين المجموعتين من التفاعلات مؤقتًا ومكانيًا من أجل منع أحداث إعادة التركيب غير المكتملة التي من المحتمل أن تكون ضارة بالمضيف والعنصر القابل للنقل نفسه. قدمت الأعمال الحديثة من مختبرات مختلفة نظرة ثاقبة جديدة مثيرة للاهتمام حول كيفية تأثير هذا التحكم في حالة Mu (تمت المراجعة في المرجعين. [66 ، 67]). تتمثل الخطوة الرئيسية في نقل Mu في تجميع المركب المشبكي الذي يتم فيه تنشيط المونومرات الخاملة المحفزة لـ MuA عن طريق تكوين قلب رباعي النواة مرتبط بإحكام بنهايتين الينقولات. وبالتالي ، فإن تجميع الرباعي يعني انتقالًا هيكليًا يتم من خلاله إشراك الإنزيم ومواقع انقسام الحمض النووي في التحفيز ([6 ، 15] انظر أدناه). أظهرت التجارب التكميلية التي يتم إجراؤها عن طريق خلط المسوخات الحفازة المتميزة لـ MuA أن مواقع tetramer النشطة يتم بناؤها عن طريق تشابك مجالات منفصلة لوحدات فرعية متميزة من transposase. في كل موقع نشط ، يوفر أحد المونومر النواة الحفزية لـ DDE (المجال II) ، بينما يتبرع مونومر مختلف بمنطقة تحفيزية أخرى تقع في الجزء الطرفي C من البروتين [68]. على الرغم من أن الوظيفة الدقيقة لهذا المجال التحفيزي الثاني (المجال IIIA) غير معروفة ، يبدو أنها تلعب دورًا في تنشيط و / أو تحديد موقع الحمض النووي [69]. بالنسبة لتفاعلات نقل حبلا ، يتم توفير مجال الموقع النشط IIIA بواسطة مونومرات MuA التي تشغل الجزء الداخلي من نهايات Mu بينما يتم توفير المجال II المحتوي على DEE بواسطة وحدات فرعية transposase مرتبطة بالمواقع الخارجية [70 ، 71]. من خلال تبادل المجال ، يبدو أن هذا الترتيب المكاني معكوس لتفاعلات انشقاق النهايات [71]. علاوة على ذلك ، في كل من خطوات التفاعل ، يعمل مجال DDE II في العابرة، أي أن الوحدة الفرعية المرتبطة بأحد الطرفين تحفز الانقسام والانضمام إلى الطرف المقابل [70 ، 72]. يُنظر إلى هذه البنية المعقدة للمركب الأنزيمي MuA على أنها آلية تضمن ارتباط المشابك الحفاز الركيزة بإحكام. تتفق مشاركة الانتقال الهيكلي عند الربط الرباعي وربط الركيزة أيضًا مع حقيقة أن بقايا DDE للنواة التحفيزية MuA تبدو في تكوين غير نشط [60]. أخذ هذه البيانات في الاعتبار ، يانغ وآخرون. اقترح مسارًا يتم فيه قطع نهايات Mu أولاً داخل موقعي الانقسام النشطين ثم التأرجح في جيوب تحفيزية أخرى ليتم نقلها على الحمض النووي الهدف [71].

بالنسبة إلى Mu ، ينفذ بروتين transposase واحد خطوات التفاعل الثلاثة الكامنة وراء IS10 يلزم تبديل وتجميع المركب المشبكي المشكل مسبقًا لضمان تنسيق أحداث المعالجة التي تحدث عند كلا الطرفين [50 ، 73 ، 74]. يكون10 يتم أيضًا ترتيب مسار التحويل بدرجة عالية. دائمًا ما يسبق انقسام الخيط المنقول (3 end) انقسام الخصلة غير المنقولة (نهاية 5) ، ويلزم استئصال الترانسبوزون بالكامل قبل التقاط المركب لجزيء الحمض النووي المستهدف لتفاعلات نقل الجدائل [75 ، 76]. في تناقض حاد مع Mu ، فإن مونومر ترانسبوزيز واحد يحفز الخطوات الكيميائية الثلاث لـ IS10 ينتهي التبديل في كل من اثنين من الينقولات [77]. وهكذا ، يبدو أن اثنين من المونومرات من الترانسبوزيز تقوم بتنفيذ تفاعل التحويل بالكامل دون مشاركة المجالات. الآلية التي تسمح بالاستخدام المتكرر لجيب تحفيزي واحد يحتوي على مادة DDE غير معروفة. تقترح النماذج الحالية أن عمليات إعادة الترتيب الهيكلية المتتالية يجب أن تحدث بين كل خطوة من خطوات التفاعل لإعادة ضبط الموقع النشط على تكوينات الركيزة الجديدة [50 ، 77].

يتم توفير مثال ثالث ومميز لهندسة الترانسبوزيز بواسطة Tn7 [11]. على عكس Mu و IS10، تينيسي7 يتم تحفيز تفاعلات التحويل بواسطة إنزيمين يحتويان على مادة DDE مع أنشطة منفصلة بوضوح. يتوسط TnsA الانقسام عند نهايات 5 من الينقولات بينما TnsB ، وهو المسؤول أيضًا عن التعرف على Tn وربطه7 ينتهي ، يعزز الانقسام 3 نهاية وينفذ رد فعل نقل حبلا [22]. على الرغم من أنه يمكن حظر الوظائف الخاصة بكل من TnsA و TnsB بشكل انتقائي عن طريق طفرة في بقايا DDE ، فإن وجود كلا البروتينين مطلوب لتشكيل مجمع نشط. تينيسي7 وبالتالي فإن ترانسبوزيز هو إنزيم غير متجانس يحتوي على وحدتين فرعيتين مختلفتين من التحفيز [22]. لم يتم فحص إمكانية تجميع المواقع النشطة لنواة ترانسبوزيز TnsA + B من خلال مساهمة بروتومرات TnsA أو TnsB المميزة حتى الآن. كما هو الحال مع IS10، لا يوجد دليل حاليًا على رابطة الدول المستقلة أو عبر النشاط بواسطة TnsA و / أو TnsB. ومع ذلك ، فإن الفصل الكيميائي الحيوي لتفاعلات المعالجة ذات النهايات 5 و 3 له تأثير ملحوظ. يؤدي تعطيل TnsA إلى تحويل مسار التحويل العادي للقص واللصق لـ Tn7 في آلية النسخ المتماثل التي تشبه Mu ، فإن الانكسار ثلاثي الأطراف والانضمام إلى التفاعلات المحفزة بواسطة TnsB داخل قلب transposase مكافئ وظيفيًا لتلك التي يؤديها MuA tetramer في Mu Transposition [78].

توضح هذه الأمثلة الثلاثة المختلفة "لتقسيم العمل" داخل مجمع النقل المرونة الرائعة التي يمكن من خلالها تكييف آلية كيميائية مشتركة بطرق مختلفة لإنجاز تفاعلات إعادة تركيب معقدة وعالية التحكم.

3.2 إعادة التركيب الخاصة بالموقع: عمليات الاستبدال ذات الخطوتين بآليات متميزة

على عكس الترانسبوزسات ، فإن عمليات إعادة التركيب الخاصة بالموقع ، على الأقل من حيث المبدأ ، تنفذ جميع عمليات كسر الحمض النووي لإعادة التركيب والانضمام إلى التفاعلات دون تضمين وظائف إصلاح العائل أو النسخ المتماثل [3-5 ، 31]. ترتبط هذه التفاعلات كيميائيًا حيويًا بتلك التي يتم تحفيزها بواسطة إنزيمات توبويزوميراز التي تنظم المستوى داخل الخلايا للالتفاف الفائق للحمض النووي [79]. في الواقع ، غالبًا ما تُظهر إعادة التركيب الخاصة بالموقع نشاطًا من النوع الأول topoisomerase والتي يمكن من خلالها استرخاء ركائز الحمض النووي فائقة الالتفاف. ومع ذلك ، في تفاعل إعادة التركيب بين موقعين ، لا يتم كسر خيوط الحمض النووي وإعادة الانضمام إليها فحسب ، بل يتم أيضًا تبادلها. لذلك ، كما نوقش أعلاه بالنسبة لإعادة تركيب DDE ، تتطلب إعادة التركيب الخاصة بالموقع تجميع مجمع متشابك يحتوي على وحدات فرعية متعددة إعادة التركيب وشركاء إعادة اتحاد الحمض النووي ذي الصلة.

بالنسبة لمعظم أنظمة العائلتين الرئيسيتين (على سبيل المثال ، resolvase / invertase و Int العائلات) ، يتم إعادة التركيب داخل جزء قصير من الحمض النووي (∼30 bp) يسمى موقع `` النواة '' أو `` التقاطع '' الذي يوجد فيه اثنان ترتبط الوحدات الفرعية recombinase ، عادةً عن طريق التعرف على متواليات محددة ذات تناظر ثنائي [3 ، 80 ، 81]. في المجمع المشبكي ، يتم تقريب الموقعين الأساسيين. من المسلم به عمومًا أن الوحدات الفرعية الأربعة المؤلفة من إعادة التركيب المربوطة على وحدتي الطباعة على الوجهين تشارك في تفاعل إعادة التركيب (الشكلان 5 و 6). تشتمل بعض الأنظمة ، جميعها تنتمي إلى عائلة λ Int ، على نوعين من بروتينات recombinase المتميزة. في ال بكتريا قولونية نظام الانعكاس Fim ، اثنان من إعادة التركيب ، FimB و FimE ، يعملان بشكل مستقل على نفس مواقع إعادة التركيب للتحكم في وضع "التشغيل" أو "الإيقاف" لهذا المفتاح الجيني المعين [82].على النقيض من ذلك ، تتعاون عمليات إعادة التركيب XerC و XerD في جميع عمليات إعادة ترتيب الحمض النووي بوساطة Xer ويرتبط البروتينان بخصائص مميزة لفصل مناطق مواقع إعادة التركيب المختلفة لهذا النظام [83 ، 84].

تكسر الحمض النووي المتضافر وإعادة الانضمام إلى التفاعلات المحفزة بواسطة إنزيمات عائلة ريزولفاز / إنفرتيز. يظهر نموذج دوران الوحدة الفرعية. تمثل الأشكال البيضاوية الوحدات الفرعية المؤتلفة مع سيرين الحفاز المحفوظ "S". الخطوط السميكة والرفيعة هي الخيوط العلوية والسفلية لمواقع إعادة التركيب ، على التوالي. الأعمدة الرأسية القصيرة هي 2 نقطة أساس لمنطقة التداخل بين نقطتي الانقسام. تمثل الأسهم السوداء الهجمات المحبة للنووية للفوسفات (النقاط السوداء) بواسطة مجموعات الهيدروكسيل (رؤوس الأسهم). يتم شق خيوط الحمض النووي الأربعة (أ) ، ويتم تبادلها بواسطة دوران 180 درجة للوحدات الفرعية المرتبطة بنصف الموقع (ب) وتدين في التكوين المؤتلف (ج).

تكسر الحمض النووي المتضافر وإعادة الانضمام إلى التفاعلات المحفزة بواسطة إنزيمات عائلة ريزولفاز / إنفرتيز. يظهر نموذج دوران الوحدة الفرعية. تمثل الأشكال البيضاوية الوحدات الفرعية المؤتلفة مع سيرين الحفاز المحفوظ "S". الخطوط السميكة والرفيعة هي الخيوط العلوية والسفلية لمواقع إعادة التركيب ، على التوالي. الأعمدة الرأسية القصيرة هي 2 نقطة أساس لمنطقة التداخل بين نقطتي الانقسام. تمثل الأسهم السوداء الهجمات المحبة للنووية للفوسفات (النقاط السوداء) بواسطة مجموعات الهيدروكسيل (رؤوس الأسهم). يتم شق خيوط الحمض النووي الأربعة (أ) ، ويتم تبادلها بواسطة دوران 180 درجة للوحدات الفرعية المرتبطة بنصف الموقع (ب) وتدين في التكوين المؤتلف (ج).

التبادل المتسلسل للخيوط بواسطة recombinases الخاصة بموقع عائلة λ Int. يتم تقديم نموذج مبادلة / مشابهة حبلا DNA. يشير الحرف "Y" إلى التيروزين الحفاز المحفوظ. الرموز الأخرى كما في الشكل 5. يتم شق الخيوط العلوية (الخطوط السميكة) أولاً (أ) ، ويتم تبديلها بين الشريكين (ب) ، ثم تدين (ج). يتم وضع نقطة الفرع من وسيط Holliday الذي تم إنشاؤه في منتصف منطقة التداخل (6-bp) ويتم عبور الخيوط العلوية. تتطلب تشابك تقاطع Holliday إلى تكوين مؤتلف يتم فيه عبور الخيوط السفلية إعادة تنظيم حلزونات الحمض النووي والوحدات الفرعية لإعادة التركيب الأربعة المرتبطة بنصف المواقع داخل المجمع (د). يتم حل الشكل الإسوي لتقاطع Holliday الناتج عن طريق تكرار الخطوات من أ إلى ج من أجل تبادل الخيوط السفلية (هـ).

التبادل المتسلسل للخيوط بواسطة recombinases الخاصة بموقع عائلة λ Int. يتم تقديم نموذج مبادلة / مشابهات الحمض النووي. يشير الحرف "Y" إلى التيروزين الحفاز المحفوظ. الرموز الأخرى كما في الشكل 5. يتم شق الخيوط العلوية (الخطوط السميكة) أولاً (أ) ، ويتم تبديلها بين الشريكين (ب) ، ثم تدين (ج). يتم وضع نقطة الفرع من وسيط Holliday الذي تم إنشاؤه في منتصف منطقة التداخل (6-bp) ويتم عبور الخيوط العلوية. تتطلب تشابك تقاطع Holliday إلى تكوين مؤتلف يتم فيه عبور الخيوط السفلية إعادة تنظيم حلزونات الحمض النووي والوحدات الفرعية لإعادة التركيب الأربعة المرتبطة بنصف المواقع داخل المجمع (د). يتم حل الشكل الإسوي لتقاطع Holliday الناتج عن طريق تكرار الخطوات من أ إلى ج من أجل تبادل الخيوط السفلية (هـ).

يحتوي موضع إعادة التركيب لجميع الأنظمة ، حتى تلك التي تعمل مع recombinase واحد ، على درجة معينة من عدم التناسق بحيث يمكن تمييز الخيوط "العلوية" و "السفلية". في أبسط الحالات ، يتم ترميز عدم التناسق هذا بالكامل داخل الموقع الأساسي بينما في الأنظمة الأخرى ، قد تساهم العناصر الخارجية في قطبية موقع إعادة التركيب من خلال فرض هندسة محددة على المعقد المشبكي ([80 ، 81] انظر أيضًا أدناه). تختلف الآلية التحفيزية المستخدمة من قبل عائلتين من إعادة التركيب الخاصة بالموقع ، وكذلك التنظيم الهيكلي للإنزيمات.

3.2.1 عائلة resolvase / invertase: تكسير منسق وإعادة ضم أربعة خيوط DNA

إن أفضل أنواع إعادة التركيب المميزة لهذه العائلة هي جين Invertases من عاثيات Mu و Hin من السالمونيلا ص. و resolvases من Tn3 و γδ الينقولات [3 ، 32 ، 36 ، 80 ، 81 ، 85]. على الرغم من أن كيمياء تبادل الخيوط التي تستخدمها إعادة التركيب هذه تبدو محفوظة بشكل كبير ، إلا أن هناك تباينًا مهمًا موجودًا في تجميع مشابك إعادة التركيب الذي يحدد انتقائية التفاعل ، أي الانعكاس أو الدقة (انظر أدناه).

في تفاعل إعادة التركيب المحفز بواسطة resolvases أو invertases ، تحدث فواصل حبلا مزدوجة متداخلة بمقدار 2 نقطة أساس في منتصف الموقعين الأساسيين المقترنين ، مما يؤدي إلى نهايات 5 ′ و 3-OH المتدلية (الشكل 5 انظر أيضًا الشكل 3C) ). ترتبط وحدة فرعية واحدة معاد التركيب بكل من النهايات الخمسة من خلال بقايا السيرين المحفوظة للعائلة [86 ، 87]. من المفترض أن يوفر هذا السيرين مجموعة هيدروكسيل النوكليوفيل الأولية في تفاعل الانقسام [45]. يمكن النظر إلى خطوة الربط التي تلي تبادل الخيوط على أنها عكس الانقسام: يتم مهاجمة رابطة فوسفوسريل البروتين والحمض النووي في خصلة واحدة من طرف 3′-OH للشريك لإطلاق الإنزيم وإعادة ختم العمود الفقري للحمض النووي في المؤتلف. التكوين (الشكل 5 انظر أيضًا الشكل 3C).

على الرغم من أن انشقاقات خيوط الدنا الأربعة أو خطوات الارتباط يمكن فصلها تجريبيًا عن طريق استخدام متغيرات موقع إعادة التركيب أو إعادة التركيب المتحول ، فإن كلا النوعين من التفاعل عادة ما يكونان منسقين بدرجة عالية [88 ، 89]. يبدو أن المركب المشقوق الذي يتم فيه تثبيت أربعة مواقع نصفية مرتبطة بالإنزيم معًا عن طريق تفاعلات الوحدة الفرعية المؤتلفة هو وسيط ملزم [88]. وبالتالي ، يحدث إعادة التركيب بواسطة عائلة resolvase / invertase بواسطة آلية يتم فيها كسر أربعة خيوط DNA وإعادة الانضمام إليها بطريقة منسقة.

الركائز القياسية للإنفرتيز و resolvases عبارة عن جزيئات فائقة الالتفاف (انظر أدناه) وقد وجد أن التغيير الطوبولوجي الناجم عن إعادة التركيب يعادل دوران 180 درجة في اليد اليمنى لزوج واحد من نصف المواقع المشقوقة بالنسبة إلى الآخر قبل إعادة الانضمام الخطوة (الشكل 5) [90-92]. في هذه الآلية ، يجب أن تكون مناطق "التداخل" التي تبلغ 2 بي بي التي تفصل بين مواضع انشقاق الشريط العلوي والسفلي متطابقة في الموقعين الأساسيين لإعادة توصيل دنا مزدوجات الحمض النووي المؤتلف بشكل ثابت [93 ، 94]. لقد ثبت مؤخرًا أنه في التفاعلات التي تنطوي على مناطق متداخلة غير متماثلة ، يتم تبادل الخيوط بوساطة Tn3 يتقدم resolvase من خلال الدوران الظاهري 360 درجة (2 × 180 درجة) للمواقع النصفية دون إعادة الانضمام إلى الخيوط المزدوجة الخاطئة في تكوين المؤتلف (دوران 180 درجة) [89].

تم تحديد التركيب البلوري لثنائي الإنزيم γδ resolvase المركب إلى موقع إعادة التركيب الأساسي مؤخرًا [95]. يحتوي مونومر resolvase المرتبط بالحمض النووي على مجالين كرويين مستلقين على وجوه متقابلة من الحلزون DNA ومنطقة ذراع ممتدة تربط المجالين. يشارك مجال ربط الحمض النووي للطرف C الصغير في التعرف على الجزء الخارجي من تسلسل توافق الموقع الأساسي من خلال إجراء اتصالات محددة في كل من الأخاديد الرئيسية والثانوية. هيكلها ، الذي يحتوي على نموذج ربط DNA حلزوني حلزوني ، مشابه لتلك الموجودة سابقًا في مجال ربط الحمض النووي لـ Hin invertase [96]. تساهم منطقة الذراع التي تنضم إلى المجالين الكرويين أيضًا في ربط الحمض النووي من خلال التفاعلات في الأخدود الصغير. يحتوي المجال التحفيزي الكبير N-terminal على سيرين الموقع النشط والمخلفات التحفيزية الأخرى ، بالإضافة إلى مجموعة من البقايا التي تشكل قلبًا كارهًا للماء في الواجهة البينية. يبدو أن هذا المجال مهم أيضًا للتفاعلات عالية المستوى بين ثنائيات resolvase في مجمع إعادة التركيب [97-99]. ينحني الحمض النووي في البلورة المشتركة بمقدار 60 درجة بعيدًا عن المجال التحفيزي للإنزيم.

يبدو أن مركب γδ resolvase-DNA في تكوين غير نشط ، فالسيرينات التحفيزية للوحدتين الفرعيتين resolvase بعيدة جدًا عن فوسفات scissile لشق الحمض النووي [95]. ومع ذلك ، فإن السيرين النشط لأي من المونومر هو الأقرب إلى موضع انقسام الحمض النووي القريب من نصف الموقع المرتبط بالوحدة الفرعية recombinase. يرتبط هذا بحقيقة أن السيرين النشط والعديد من المخلفات التحفيزية الأخرى لـ γδ resolvase act في رابطة الدول المستقلة على أقرب رابطة فسفودايستر مقصية [88]. يشير الهيكل البلوري أيضًا إلى أنه ، كما هو الحال في MuA ، يمكن مشاركة البقايا التحفيزية بين المونومرين لتشكيل الموقع النشط. على الرغم من عدم وجود دليل تجريبي حاليًا لدعم إمكانية وجود موقع تحفيزي مركب ، يبدو أن الطفرات في وحدة فرعية واحدة من resolvase تنشط الوحدة الفرعية المجاورة في العابرة، على الأرجح عن طريق تغيير التفاعلات بين الوحدات الفرعية في واجهة dimer ([88] M.R. Boocock و NDF Grindley ، غير منشورين). وبالمثل ، فإن الطفرات في مجال dimerisation المكافئ لـ DNA Invertases Gin و Hin و Cin ، تجعل إعادة التركيب أكثر تفاعلًا واستقلالية عن العناصر الهيكلية التي تتحكم في تكوين المركب المشبكي لإعادة التركيب ([92 ، 100-103] انظر أيضًا أدناه). تشير هذه الملاحظات إلى أن تنشيط إعادة التركيب السيرين للموقع النشط يبدو أنه يتطلب تغييرات توافقية أثناء تجميع هيكل إعادة التركيب الأنزيمي المختص كما نوقش أعلاه لـ DDE transposases. في الواقع ، يمكن أن يكون مستوى معين من المرونة الهيكلية كما يتضح من المركب المشترك γδ resolvase-DNA متوافقًا مع تشوهات محدودة [95].

تبدو التغييرات التوافقية التي تحدث أثناء تبادل الخيوط أقل وضوحًا. منذ resolvase يشق الحمض النووي في رابطة الدول المستقلة ويبدو أنه لا ينفصل عن موقع الربط الخاص به أثناء إعادة التركيب [104] ، فقد تم اقتراح نموذجين لحساب الدوران الظاهر لنصف الموقع 180 درجة في التفاعل. في نموذج "دوران الوحدة الفرعية" ، يقترن تبادل الخيوط بإعادة ترتيب دورانية للوحدات الفرعية المؤتلفة المرتبطة بالحمض النووي داخل رباعي الحركة [91]. تتمثل إحدى الصعوبات الرئيسية في هذه الآلية في أن الواجهة البينية لإعادة التركيب الثنائي التي تحمل الأطراف المشقوقة في المجمع يجب أن تتعطل بشكل عابر أثناء عملية التفكك / إعادة الارتباط (الشكل 5). يفترض نموذج "وحدة فرعية ثابتة" بديل أن رباعي إنزيم recombinase لا ينفصل وأن إعادة التركيب تحدث عن طريق إعادة ترتيب موضعية وطوبولوجية لجزيئات الحمض النووي داخل المركب [95 ، 99]. يصعب التوفيق بين هذا النموذج الثاني والملاحظة الأخيرة التي تشير إلى أن Tn3 يؤدي resolvase إلى جولات متعددة من التدوير دون إعادة الانضمام إلى وسيط الدوران الفردي 180 درجة. يُقال أنه في آلية الوحدة الفرعية الثابتة ، فإن مثل هذا التكرار للتفاعل من شأنه أن يربط الحمض النووي داخل المركب الحفاز إلى مستوى غير مقبول [89 ، 105].

3.2.2 عائلة λ Int: أزواج متسلسلة من تبادل خيوط الحمض النووي

على عكس recombinases لعائلة resolvase / invertase ، recombinase الخاص بالموقع المرتبط بـ λ Int مثل recombinase Cre لـ phage P1 ، بكتريا قولونية XerC و XerD وبروتين Flp من الخميرة 2μ بلازميد ، يتبادلان زوجي خيوط DNA بشكل منفصل ومتسلسل (الشكل 6) [3 ، 4 ، 31 ، 106].

لبدء التبادل الأول للخيوط ، تهاجم بقايا التيروزين للعنصر الحفاز المحفوظ RHRY فوسفات مقصيًا محددًا في خيط واحد (يُعرّف هنا بعد الخيط العلوي) لكل مواقع أساسية لإعادة التركيب ، وبالتالي تشكل 3 ′ فسفوتيروسيل مرتبط بتكوين ريكومبيناز-دنا معقدة وتولد نهاية 5′-OH مجانية (الشكل 6). وهكذا تنعكس قطبية تفاعل الانقسام هذا عند مقارنتها بتلك الخاصة بالانشقاقات التي تتوسطها resolvase / Invertase (قارن أيضًا الشكل 3C والشكل 3D). في الخطوة الثانية ، يتم مهاجمة رابطة فوسفوتيروزيل recombinase-DNA بنهاية 5′-OH من الطرف المزدوج الشريك لتوليد بنية متفرعة رباعية الاتجاهات ، أو وسيط "تقاطع Holliday" ، حيث تم إعادة توحيد خيطي DNA فقط. لحل هذا التفاعل الوسيط وإكمال تفاعل إعادة التركيب ، يتم تبادل السلاسل الأخرى (السفلية) عن طريق تكرار عملية الانقسام / الارتباط 6-8 bp في اتجاه المصب في موضع الانقسام الأول للخيط (الشكل 6).

كما هو الحال في إعادة التركيب بوساطة resolvase / invertase ، فإن التماثل المتسلسل في منطقة التداخل 6-8 bp التي تفصل بين مواضع انقسام الخيوط العلوية والسفلية في موقعين أساسيين لإعادة التركيب الشريكين ضروريان أيضًا لمعظم (وليس كل) الأنظمة المنتمية لعائلة λ Int. على الرغم من أن التنادد يبدو أنه يلعب دورًا بعد تشابك الموقعين الأساسيين ، إلا أن الآلية الدقيقة التي يؤثر بها التفاعل لا تزال غير واضحة. يفترض النموذج الكلاسيكي أن هوية التسلسل بين مواقع إعادة التركيب مطلوبة لعملية عكسية تسمى `` ترحيل الفرع '' والتي تنقل نقطة فرع تقاطع هوليداي من موقع تكوينها في أحد طرفي منطقة التداخل إلى موقع الدقة في الاتجاه المعاكس. نهاية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الصهر التدريجي وإعادة ربط الخيوط التكميلية للوالدين والشريكين من الحمض النووي المزدوج ، [5 ، 107]. يتم الآن تحدي هذا الرأي من خلال آلية بديلة "مبادلة / مشابهة" (الشكل 6) [108]. يقترح النموذج أنه بعد الانقسام ، يتم صهر اثنين أو ثلاثة نيوكليوتيدات من متواليات التداخل الأبوي ثم يتم تبديلها بين النوكليوتيدات الشريكة. في هذه الآلية ، مطلوب تجانس التسلسل في تفاعل إعادة التجديد الذي يوجه نهاية 5′-OH من الشريط الغازي للربط. تقتصر حركة تقاطع Holliday على 1–3 نقطة أساس مركزية للمنطقة المتداخلة. ستكون هذه الحركة ببساطة أحداثًا غير مكدسة حيث يتم إعادة تنظيم حلزونات DNA لتقاطع Holliday من تكوين `` أبوي '' (خيوط علوية متقاطعة) إلى تكوين `` مؤتلف '' (خيوط سفلية متقاطعة) حيث يتم وضع مواقع انقسام الخيوط السفلية بشكل مناسب تبادل الخيوط (الشكل 6) [108-110]. يدعم هذا الرأي العمل الأخير الذي يُظهر أن أيزومر تقاطع هوليداي يخضع بشكل تفضيلي لتبادل الخيوط العلوية ، في حين أن حل الشكل الأيزو الآخر يحدث غالبًا عن طريق تبادل السلاسل السفلية [111 ، 112]. أيضًا ، في مجمع تقاطع recombinase-Holliday ، يكون مركز منطقة التداخل غير مكدس جزئيًا [113].

على الرغم من أنه يمكن تصور الاختلافات في كلا النموذجين ، فإن آلية مبادلة الخيوط تبدو أكثر ملاءمة لأنظمة إعادة التركيب الأخرى من عائلة λ Int ، مثل الينقولات المقترنة والإنتغريونات ، والتي تعتبر أقل صرامة في متطلباتها للتماثل التسلسلي بين مواقع إعادة التركيب الشريك [23 ، 43]. قد تكون هذه الأنظمة أقل حساسية لسوء اقتران الحمض النووي عن طريق تحفيز تبادل كل من الجدائل دون تلدين الخيوط المؤتلفة. بدلاً من ذلك ، قد يكون شكل iso لتقاطع Holliday الذي تم إنشاؤه بواسطة تبادل خيط واحد منتجًا مستقرًا لإعادة التركيب لا تتم معالجته مرة أخرى بواسطة recombinases ولكن يمكن حله جيدًا بواسطة بعض وظائف المضيف الأخرى (كما تمت مناقشته في المرجع. [113]).

مسألة أخرى من الاختلاف داخل الأسرة Int تتعلق بالدور التحفيزي لوحدات إعادة التركيب المختلفة داخل المجمع المشبكي. تشير ثروة من البيانات إلى أن الخميرة recombinase Flp تستخدم a عبر آلية الانقسام حيث يقوم ثالوث RHR الحفاز لمونومر واحد بتنشيط الفوسفوديستر المقصي المجاور لموقع الارتباط الخاص به ، في حين أن nucleophile التيروزين يساهم فيه مونومر Flp مختلف مرتبط بنصف موقع مختلف. بالنسبة إلى MuA ، تم اقتراح مشاركة الموقع النشط التي تمت ملاحظتها من أجل Flp كآلية لاقتران التحفيز وإعادة التركيب في موقع الاقتران [31 ، 114]. ومع ذلك ، تم إضعاف هذا الرأي من خلال التجارب التي أظهرت أن المونومرين المتعاونين مرتبطان في نفس الموقع الأساسي وأن هذا الانقسام قد يسبق التشابك العصبي بالفعل [115 ، 116]. تم اقتراح نموذج بديل يعتمد على تجميع غير متماثل (من الرأس إلى الذيل) لمونومرات Flp ، مما يشير مرة أخرى إلى أن الجسور الجزيئية النشطة المعتمدة على الموقع قد تكون مطلوبة [117]. في المقابل ، تشير جميع البيانات الحالية إلى أن إعادة التركيب XerC و XerD تعمل على أقرب موقع انقسام من خلال توفير جميع المخلفات التحفيزية في رابطة الدول المستقلة [118]. بالنسبة لـ λ Int ، التجارب التي تدعم كليهما رابطة الدول المستقلة و عبر تم الإبلاغ عن الآليات [119 ، 120]. أثارت هذه النتائج المتضاربة على ما يبدو عددًا من الأسئلة التي تمت مناقشتها في الأدبيات الحديثة [48 ، 121-123].

على الرغم من أن تفاصيل التفاعلات الجزيئية بين الوحدات الفرعية لإعادة التركيب غير معروفة ، فقد تم توفير بعض الأفكار الجديدة من خلال الاستحواذ الأخير على البيانات الهيكلية للأجزاء الحفزية C- الطرفية لـ λ Int و the المستدمية العاثية 1 Integrase (HP1 Int) و 298 aa XerD recombinase [124–126]. يُظهر المجال الحفاز C-terminal الخاص بهذه إعادة التركيب الثلاثة طية مماثلة حيث يتم تعريض البقايا المحفوظة RHR في أخدود أساسي من المحتمل أن يتصل بالحمض النووي لتفعيل رابطة الفوسفوديستر المقطعية. ومع ذلك ، فإن بنية المنطقة التي تحتوي على التيروزين النشط (الجزء الطرفي C المتطرف من المجال) يختلف اختلافًا كبيرًا في الهياكل الثلاثة. يبدو أن هذه المنطقة أيضًا متورطة في تفاعلات إعادة التركيب بين الوحدات الفرعية. في λ Int ، يتم وضع التيروزين على حلقة مرنة مضطربة في تكوين يمكن ، من خلال السماح بالتغييرات المطابقة ، أن يكون متسقًا مع أي من رابطة الدول المستقلة أو عبر انشقاق [124]. في المقابل ، تدعم هياكل كل من HP1 Int و XerD أ رابطة الدول المستقلة آلية ، يتم إرساء التيروزين في موضع ثابت داخل الجيب الحفاز. في المجال التحفيزي HP1 Int ، الذي تبلور على شكل ثنائى ، يكون التيروزين في وضع جاهز للهجوم المحب للنيوكليوفيلي للفوسفات المقطعي [125] ، بينما في النموذج المقترح لمركب XerD-DNA ، بعض التغييرات المحلية للبنية سيكون مطلوبًا لإحضار البقايا في تكوين نشط [126]. بالنسبة إلى γδ resolvase ، يُعتقد أن هذا التنشيط التوافقي ناتج عن تفاعلات البروتين بين XerD والشريك recombinase XerC (نتائجنا غير المنشورة). قد تكون هناك حاجة إلى تغيير توافقي رئيسي آخر لنقل المجال الكروي N-terminal الخاص بـ XerD (غائب عن الهياكل λ و HP1 Int) التي تمنع الوصول إلى الموقع النشط. حقيقة أن الببتيد الذي يربط بين نطاقي XerD مضطرب في البلورة يدل مرة أخرى على المرونة الهيكلية [126].


أمثلة للعلامات الجزيئية | علم الوراثة النباتية

الواسمات الجزيئية هي سلاسل دنا يمكن تحديد نمط وراثتها. الأمثلة الكلاسيكية للواسمات الجزيئية هي: 1. تعدد الأشكال لطول جزء التقييد (RFLP) 2. الحمض النووي متعدد الأشكال المضخم عشوائياً (RAPD) 3. الأجزاء المضخمة تعدد الأشكال (AFLP) 4. المنطقة المضخمة المميزة المتسلسلة (SCAR).

مثال # 1. تعدد الأشكال لطول جزء التقييد (RFLP):

يعتمد هذا النهج الجديد غير القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل على تهجين المسبار إلى أجزاء من الحمض النووي الجيني بعد الهضم باستخدام إنزيمات التقييد. تم توضيح الطبيعة متعددة الأشكال للحمض النووي لأول مرة بواسطة تقنية RFLP. يرجع التنوع الجيني بين الأنواع النباتية أساسًا إلى الاختلاف في تسلسل الحمض النووي ، مع التأكد من الطبيعة متعددة الأشكال للمادة الوراثية التي يتم فيها تخزين المعلومات الجينية في تسلسل الحمض النووي.

يتم هضم الحمض النووي الجيني من العينة التي يتم اختبارها باستخدام نوكليازات مقيدة.يقطع هذا الإنزيم الحمض النووي في مواقع محددة مع تسلسل يعرف باسم تسلسل التعرف على إنزيم التقييد. يتم فصل شظايا الحمض النووي الناتجة عن عملية الهضم والكسر عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام الاغاروز وتعريضها لتقنية النشاف الجنوبي.

إنه يلطخ الحمض النووي من الجل إلى غشاء نايلون للسماح بالتهجين بالمسبار. يتم استخدام المسبار المسمى مسبقًا للتهجين باستخدام الحمض النووي المنقط. عادة ما يكون مسبار DNA البدلة والخجول من الأنواع قيد الدراسة. المجسات المسمى هي في الأساس مستنسخات جينية هي (كدنا). في بعض الأحيان ، تكون جينات RNA الريبوزومية (جينات نسخ متعددة) مفيدة في التحليل.

تتوفر في هذه العملية المجسات ذات العلامات الإشعاعية وغير المشعة. تم وضع العلامات على المجسات تقليديا باستخدام النظائر المشعة. تلك المسمى غير المشعة هي البيوتين ديجوكسيجين كمادة مضان. تكشف طبيعة نمط التهجين عن تعدد الأشكال في عينة الحمض النووي وتظهر اختلاف التسلسل بين الأفراد.

على الرغم من أن تكرار الحمض النووي يتم بشكل دقيق ، فإن العديد من العوامل داخل الخلية مسؤولة عن التغيير في حد ذاته والخجل. تحدث تغييرات زوج القاعدة الفردي في الحمض النووي يمكن أن تكون مسؤولة عن تغيير التسلسل أو يمكن أن تُعزى بعض الانحرافات الصبغية مثل الانتقال ، والانعكاس ، والحذف بشكل أساسي إلى قدر كبير من التباين.

نتيجة لذلك ، تؤدي التغييرات المنخفضة أو العالية في تسلسل الحمض النووي إلى فقدان موقع التعرف أو اكتسابه. إنزيمات التقييد ، لنفترض أن التسلسل المقطوع يفشل في القيام بذلك بسبب التغيير في تسلسل التعرف الذي يؤدي بدوره إلى شظايا تقييد ذات أطوال مختلفة. وبالتالي ، تعتبر شظايا الحمض النووي التي تم الحصول عليها باستخدام إنزيم تقييد معين بمثابة RFLP واحد.

يؤدي توزيع النوكليوتيدات المتغيرة من خلال تسلسل الجينوم إلى أجزاء مقيدة بأطوال مختلفة بين الأنماط الجينية ويمكن اكتشافها على لطخة جنوبية متبوعة بالتهجين باستخدام مجسات مناسبة. للفحص و shyple ، قطع إنزيم التقييد تسلسل الحمض النووي بتسلسل محدد.

يؤدي فقدان واحد أو أكثر من النيوكليوتيدات في تسلسل التعرف على التقييد إلى نقص إعادة التركيب وفشل إنزيم EcoRI في تفتيت خيوط الحمض النووي في الموقع الذي تم تغييره. ونتيجة لذلك ، أنتجت EcoRI شظايا أكبر من الحمض النووي. في هذه الطريقة ، يمكن اكتشاف وجود RFLP في كروموسومات اثنين من الكروموسومات المتجانسة بناءً على وجود موقع تقييد في جزيء الحمض النووي لكروموسوم واحد ينتج شظايا أقصر ونقص موقع القطع (التقييد) في كروموسوم متماثل آخر ينتج شظايا أطول. وبالتالي ، فمن الممكن تمييز وخلط اثنين من الكروموسومات في مثل هؤلاء الأفراد بناءً على هذا RFLP.

بالإضافة إلى التغيير الكروموسومي ، قد يوفر التسلسل المتكرر من 9 إلى 65 زوجًا قاعديًا والذي يحدث عددًا متغيرًا من المرات (10-300 مرة) أيضًا مستوى قيمًا من تعدد الأشكال في الكائن الأعلى ، والذي يمكن اكتشافه بسهولة عن طريق التهجين. تمت الإشارة إلى هذه الحالة الخاصة لتحليل RFLP على أنها تحليل VNTR (عدد متغير من التكرارات الترادفية).

تعتبر متواليات VNTR هذه علامات قيمة ، تُعرف أيضًا باسم الأقمار الصناعية الصغيرة وتعمل كأداة قيمة في التمييز بين النمط الوراثي للنباتات مثل الأرز (Oryza sativa) والفاصوليا (Phaseolus vulgaris). يمكن دراسة محددات الأقمار الصناعية الصغيرة هذه باستخدام مجسات تم إنشاؤها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

يتطلب RFLP كميات كبيرة من الحمض النووي عالي الجودة لاكتشاف مواقع نسخة واحدة ويكتشف فقط جزءًا صغيرًا من تقلب التسلسل الحالي. يوفر اكتشاف تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) نهجًا إضافيًا للتحليل ، والذي يمكنه التغلب على الكمية المطلوبة من الحمض النووي. يمكن لـ PCR تضخيم منطقة معينة من الحمض النووي التي تم الحصول عليها. يمكن مقارنة التسلسل المضخم بواسطة RFLP مباشرة على هلام الاغاروز الملون دون الدخول في التهجين الجنوبي.

الشكل 24.1 أ. نظرة عامة على تقنية RFLP.

مثال # 2. DNA متعدد الأشكال مضخم عشوائياً (RAPD):

هذه علامات سائدة تم اكتشافها في عام 1990. وهي إحدى التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لوصف طبيعة الحمض النووي من النبات والكائنات الحية الأخرى. أحد الأسس الرئيسية لهذه التقنية هو استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل مع بادئات قليلة النوكليوتيد القصيرة ذات التسلسل العشوائي. بناءً على هذا النهج ، يمكن إنشاء علامات الحمض النووي متعدد الأشكال المضخم عشوائياً (RAPD).

هذه التقنية هي أيضًا الأساس لتفاعل البوليميراز المُعد بشكل تعسفي (AP-PCR) وبصمة الإصبع لتضخيم الحمض النووي (DAF). المبدأ الكامن وراء RAPD هو التضخيم باستخدام البادئات القصيرة (9-10 mer) بحيث تكون العديد من المواقع في العينات الجينومية نموذجًا محتملاً للبادئات. يؤدي التباين في تركيز البادئات أو القالب والظروف المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى تضخيم المنتجات المختلفة لإنشاء ملفات تعريف RAPD.

يساهم اختيار البادئات القياسية والنيوكليوتيدات ونوع تعدد أشكال الحمض النووي وتركيزات المغنيسيوم في التكاثر. عندما يتعرض الحمض النووي الجيني من نوعين من النباتات لـ RAPD ، غالبًا ما ينتج أنماط تضخيم مختلفة. يمثل جزء معين تم إنشاؤه للأنواع ولكن ليس للأنواع الأخرى تعدد أشكال الحمض النووي استنادًا إلى ملفات تعريف RAPD. هذا الاختلاف هو الأساس ويمكن استخدامه كعلامة جينية أو علامة RAPD.

تتمثل مزايا RAPD على RFLP في أنها تتطلب استخراجًا خامًا من الحمض النووي. ومع ذلك ، في RFLP ، يتطلب الحمض النووي النقي نسبيًا. حتى كمية صغيرة من الحمض النووي بمستوى نانوجرام (5-20 نانوغرام) كافية لـ RAPD. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام النظائر الراديوية ليس ضروريًا ويمكن مسح الجينوم بالكامل باستخدام بادئات عشوائية.

إن التشغيل الآلي الخاص بها سهل تمامًا نسبيًا ويظهر متوسطًا في الموثوقية. تعتبر RAPD فعالة في تحليل الأنواع الأقل شهرة لأنه يمكن تطبيقها دون معرفة مسبقة بالتسلسل الجيني. يمكن إجراء RAPD بشكل مشابه لتفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الحمض النووي الجيني من الأنواع ذات الأهمية والبادئات العشوائية.

البادئات العشوائية متوفرة تجارياً ويمكن تحضيرها بتركيبات مختلفة من النيوكليوتيدات. يتم تصنيع هذه البادئات بناءً على اختيار التسلسل العشوائي للحمض النووي. كل تمهيدي عشوائي عند استخدامه سوف يصلب إلى مناطق مختلفة من الحمض النووي ويمكن تحليل مواقع مختلفة محتملة.

تتطلب طريقة RAPD استخدام هلام الاغاروز لتحليل منتجات PCR ، على سبيل المثال ، يمكن تمييز تسلسل الحمض النووي بين نوعين نباتيين والفرد من خلال موقع الربط التمهيدي. فشل ربط أساس معين واحد بصنف واحد في الارتباط بآخر بسبب عدم وجود موقع ربط ، مما يؤدي إلى عدم وجود نطاق معين بين منتج تضخيم PCR.

يمكن تنقيح طريقة RAPD للكشف عن المزيد من تعدد الأشكال إذا تم دمجها مع الهضم المقيد ، على سبيل المثال ، بعض محاصيل الحبوب المهمة اقتصاديًا مثل القمح تظهر القليل جدًا من الاختلاف الجيني. يتم هضم الحمض النووي المستخرج من عينة القمح أولاً باستخدام إنزيم التقييد قبل تعريضه لـ RAPD ، والذي يكشف عن تعدد أشكال DNA المكرر.

مثال # 3. تعدد الأشكال بطول الأجزاء المتضخمة (AFLP):

تعدد الأشكال لطول الشظايا المضخمة (AFLP) هي تقنية قائمة على PCR تضمنت هضم تقييد للحمض النووي الجيني متبوعًا بربط المحولات بشظايا الحمض النووي المتولدة ، وبالتالي يتبع تضخيم PCR الانتقائي لهذه الأجزاء.

يتم هضم الحمض النووي من النبات المراد تحليله باستخدام نوكليازات مقيدة ومهايئات قصيرة مزدوجة الجديلة (أوليغنوكليوتيدات قصيرة) يتم ربطها بنهايات شظايا الحمض النووي. الغرض من إضافة المحولات هو أن تسلسل المحولات ومواقع التقييد المجاورة تعمل كمواقع ربط أولية لمزيد من التضخيم.

يتم بعد ذلك تضخيم مواقع نوكلياز التقييد هذه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مواد أولية مكملة للمحولات المضافة ومواقع التقييد. يمكن توفير درجة الخصوصية الإضافية (الشكل 24.1 ب) بواسطة عدد قليل من النيوكليوتيدات المحددة المرفقة بـ 3 & # 8242 وببادئ PCR. يعد اختيار الإنزيمات وطول التمهيدي أمرًا بالغ الأهمية لتحقيق أقصى قدر من النتائج في التطبيق الصعب.

الشكل 24.1 نظرة عامة على تقنية AFLP.

يتم فصل الأجزاء المتضخمة على هلام الاغاروز ، وتعريض لطخة جنوبية ويمكن تصورها عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي أو معدات التسلسل الفلوري. مستوى تعدد الأشكال الذي اكتشفه AFLP أقل من التقنيات الأخرى مثل السواتل المكروية.

ومع ذلك ، فإن تقنية AFLP ممكنة في تحليل عدد كبير من المواقع متعددة الأشكال في وقت واحد باستخدام تركيبة أولية على هلام واحد توفر معلومات قيمة عن طرق رسم الخرائط الأخرى. يتم تصنيع مجموعات البحث لوضع العلامات على بادئات AFLP بموجب ترخيص من الجينات الرئيسية وتكنولوجيا الحياة في الولايات المتحدة الأمريكية.

مثال # 4. تسلسل المنطقة المضخمة المميزة (SCAR) وتسلسل المواقع ذات العلامات (STS):

المناطق المضخمة ذات التسلسل المميز (SCAR) هي طريقة تعتمد على PCR تم تطويرها بواسطة علامات التسلسل التي تم تضخيمها في تجارب الاشعال التعسفي يمكن تحويلها إلى SCARs. يتم استنساخ منتجات RAPD المضخمة ، وتسلسلها ، ويتم التأكد من تسلسل التمهيدي من نهاية النطاق المحدد على أنه علامات RAPD.

في طريقة SCAR ، يلزم تصميم بادئات أطول لتوفير درجة أكبر من الخصوصية. يتم استخدام تسلسل المنتج المضخم لتصميم بادئات أطول (الشكل 24.3). وبالتالي ، يمكن للأشعال الأطول ذات الخصوصية المتزايدة تضخيم نطاق واحد قابل للتكرار. تقييم أفضل لـ F2 يمكن تحقيق الفرد عن طريق تحويل RAPD السائد إلى SCAR السائد.

القدرة القابلة للتكرار لـ SCAR مع التمهيدي الأطول لها ميزة على التمهيدي القصير المستخدم لتحليل RAPD. وبالمثل ، يمكن تحويل RFLP إلى SCAR عن طريق تسلسل طرفين على الحمض النووي الجيني وصُممت البادئات بناءً على تسلسل النهاية. يمكن تضخيم المناطق متعددة الأشكال بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) حيث تم استخدام البادئات مباشرة على الحمض النووي الجيني. يستمر غياب تعدد الأشكال المتضخم لطول الجزء مع تقييد الهضم لشظايا PCR للكشف عن RFLP داخل الأجزاء المضخمة.

STS عبارة عن امتدادات قصيرة من تسلسل DNA الفريد الذي يمكن تضخيمه PCR من مكتبة الجينوم أو الحمض النووي الجيني باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيد محددة. يمكن تصميم بادئات STS عن طريق تسلسل مسار علامات RFLP الجينية ، والتي تُستخدم أيضًا لتطوير البادئات.


طرق الاستنساخ

هناك عدة طرق مختلفة للاستنساخ وستحتاج إلى إيجاد النهج الصحيح لبحثك. فيما يلي بعض الأمثلة على طرق الاستنساخ الشائعة لتوليد بناء الحمض النووي المؤتلف:

الاستنساخ القائم على إنزيم التقييد

إنزيمات التقييد هي إنزيمات تقطع الحمض النووي بالقرب من تسلسل نوكليوتيد قصير محدد يسمى موقع التقييد. تعتمد طريقة الاستنساخ القائمة على إنزيم التقييد على نشاط إنزيمات التقييد إلى "قطع" كل من الناقل وإدخال الحمض النووي ، وتعتمد الطريقة أيضًا على ليجاز الحمض النووي لـ "لصق" جزء الحمض النووي في المتجه. هذه الطريقة مفيدة عندما يكون لديك إدخال واحد من الحمض النووي لدمجها في البلازميد.

باستخدام PCR ، يمكنك إضافة مواقع إنزيم تقييد على إدراج الحمض النووي الخاص بك لاستيعاب هذه الطريقة. يجب ألا يحتوي إدخال الحمض النووي الخاص بك على موقع تقييد داخلي مشابه لموقع التقييد على البلازميد الخاص بك. يمكن أن يقطع إنزيم التقييد الخاص بك إدخال الحمض النووي الخاص بك في موقع التقييد الداخلي هذا وينتج قطعًا أصغر غير مرغوب فيها من شظايا الحمض النووي.

يمكنك اختيار استخدام إنزيم تقييد واحد أو إنزيمين لقطع جزء الحمض النووي الخاص بك وناقله. عند استخدام إنزيمين ، يجب أن يكون كلا الإنزيمين متوافقين أو يعملان بشكل جيد في نفس المخزن المؤقت لإنزيم التقييد.

الاستنساخ القائم على إنزيم التقييد. 1. يتم إضافة التسلسلات القصيرة التي تحتوي على مواقع تقييد إلى نهايات 5 'من البادئات لتضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). 2. يتم هضم كل من الناقل وجزء الحمض النووي بواسطة إنزيمات تقييدية لإنشاء نهايات متماسكة. 3. يتم ربط المتجه وجزء الحمض النووي. 4. يدخل الحمض النووي المؤتلف الخلية المضيفة أثناء التحول.

استنساخ PCR

يعتمد استنساخ تفاعل البوليميراز المتسلسل على عملية تسمى الربط ، وهي طريقة لإدخال جزء من الحمض النووي في ناقل باستخدام ليجاز الحمض النووي. سبب أهمية الربط لهذه الخطوة هو أنه مسؤول عن إدخال منتج PCR في بلازميد "T-Tailed".

تحتوي إدخالات PCR المضخمة على بقايا أدينين في الطرف الثالث لشظايا الحمض النووي (نهايات "الذيل A"). يحتوي ناقل البلازميد "T-Tailed" على 3 "deoxythymidine (T) في كل طرف من أذرع البلازميد الخطي. لذلك ، يمكن ربط منتجات PCR هذه في نواقل "T-Tailed" باستخدام DNA ligase ، ويتبع هذه الخطوة التحول.

يمكنك اختيار هذه الطريقة عندما تكون إنزيمات التقييد لديك غير متوافقة أو تجد موقع إنزيم تقييد داخلي في إدراج الحمض النووي الخاص بك.

أحد عيوب هذه الطريقة هو أنك ستحتاج إلى متجه "T-Tailed" محدد لإجراء استنساخ PCR. ولكن قد لا تحتوي ناقلات "T-Tailed" على عناصر داعمة لأبحاث البروتين الخاصة بك ، مثل منطقة المروج أو علامة البروتين.

استنساخ PCR. 1. يتم دمج منتج PCR مع نهايات A-Tailed مع ناقل T-Tailed. 2. أثناء الربط ، يتم إدخال منتج PCR في الناقل.

الاستنساخ المستقل للربط (LIC)

يتم تنفيذ الاستنساخ المستقل للربط (LIC) عن طريق توليد متواليات قصيرة في نهاية إدراج الحمض النووي التي تتطابق مع التسلسلات القصيرة لناقل البلازميد. تمضغ الإنزيمات ذات نشاط نوكلياز خارجي من 3 إلى 5 نهايات 3 وتولد نهايات متماسكة بين جزء الحمض النووي والمتجه الخطي. ثم يتم دمج المادتين لخطوة التلدين. أثناء التحول ، يقوم الكائن الحي المضيف بإصلاح النكات الموجودة على الحمض النووي المؤتلف.

ميزة هذه الطريقة هي أنها لن تنشئ أي مواقع تقييد جديدة أو تسلسلات غير مرغوب فيها في بناء الحمض النووي النهائي.

استنساخ LIC. 1. يتم إضافة التسلسلات القصيرة التي تتطابق مع التسلسلات الموجودة على البلازميد إلى نهايات 5 'من البادئات لتضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). 2. خطي البلازميد باستخدام إنزيم التقييد. 3. يتم التعامل مع كل من إدخال الحمض النووي والناقل باستخدام 3 'إلى 5' نوكلياز خارجي لإنشاء تراكمات متماسكة. 4. كل من الحمض النووي والناقل ملدن. 5. بعد التحول ، تقوم الخلية المضيفة بإصلاح النكات الموجودة على الحمض النووي المؤتلف.

الاستنساخ السلس (SC)

تعتمد تقنية الاستنساخ السلس (على غرار LIC) على مطابقة التسلسلات القصيرة في نهايات جزء الحمض النووي مع التسلسلات القصيرة على ناقل بلازميد. تتطلب طريقة SC إنزيمًا به نشاط نوكلياز خارجي من 5 إلى 3 بوصات لإنشاء 3 بروزات متدلية ، وبوليميراز DNA لملء الفجوات ، و ligase DNA لسد النكات.

ميزة LIC و SC على الاستنساخ القائم على إنزيم التقييد هي أنه يسمح بإدخال أكثر من جزء من DNA في ناقل. بالإضافة إلى ذلك ، عندما تجد موقع إنزيم تقييد داخلي على جزء الحمض النووي الخاص بك ، يمكنك استخدام LIC أو SC كطريقة اختيارية للاستنساخ.

الاستنساخ السلس. 1. يتم إضافة متواليات قصيرة إلى نهايات 5 'من البادئات لتضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). 2. يتم هضم الناقل بواسطة إنزيم تقييد. 3. يتم التعامل مع كل من جزء الحمض النووي والناقل باستخدام إنزيم به نشاط نوكلياز خارجي يتراوح من 5 إلى 3 بوصات لإنشاء تراكمات متماسكة. 4. أثناء الربط ، يتم إدخال جزء الحمض النووي في الناقل.

الاستنساخ التأشبي

تتطلب هذه الطريقة إنزيمات إعادة تركيب الحمض النووي الخاصة بالموقع ، والتي تتبادل وتعيد تجميع قطع الحمض النووي مع مواقع إعادة التركيب الخاصة.

تتمثل الخطوة الأولى في هذه الطريقة في إدخال جزء من الحمض النووي في ناقل دخول يولد استنساخًا للدخول. هناك طريقة أخرى لإنشاء استنساخ إدخال وهي تبديل متجه مانح وإعادة تجميعه في استنساخ إدخال.

بعد إنشاء استنساخ إدخال ، تكون الخطوة التالية هي تبديل نسخة الإدخال وإعادة تجميعها في نسخة الوجهة. فائدة هذا النهج هو أنه يمكن استخدامه لوضع أكثر من خمسة عناصر في ناقل واحد. يستخدم بشكل شائع لتحديد تفاعلات ربط البروتين أو لتحسين تعبير البروتين وتنقيته وقابليته للذوبان. لتنفيذ هذه الطريقة ، ستحتاج إلى بلازميد معين له مواقع إعادة التركيب.

الاستنساخ التأشبي. 1. يتم إدخال جزء من الحمض النووي في ناقل دخول لإنشاء استنساخ دخول. 2. يتم الجمع بين استنساخ الدخول وناقل الوجهة بواسطة إنزيم recombinase لإنشاء استنساخ وجهة.

في هذه المقالة ، شرحنا بإيجاز عن خمس طرق للاستنساخ الجزيئي يشيع استخدامها من قبل الباحثين. تم استخدام الاستنساخ الجزيئي للعديد من الأغراض المختلفة في مجموعة متنوعة من مجالات البحث. في الزراعة ، يمكن للاستنساخ أن يقصر الوقت اللازم لإدخال وتطوير سمة مفيدة جديدة في المحاصيل ، مثل سمة تتحمل الجفاف أو سمة مقاومة للآفات. من ناحية أخرى ، يمكن استخدام الاستنساخ الجزيئي لإنتاج بروتينات علاجية ، مثل بروتين إذابة الجلطة والإنترفيرون ، أو لتخليق بروتينات مفيدة أخرى ، مثل الأنسولين وهرمونات النمو والأجسام المضادة وحيدة النسيلة. بشكل عام ، يستمر تطبيق الاستنساخ الجزيئي في التحسن وخلق المزيد من التطورات الملحوظة في مجالات الزراعة وصناعة الأدوية والبحوث الطبية الحيوية.


اتخاذ خيارات آمنة: تتجنب آليات إصلاح الحمض النووي التركيبات الصبغية المعرضة للإصابة بالأمراض

مساران لإصلاح تلف الحمض النووي. يقوم Rad51 بإصلاح تلف الحمض النووي بأمانة من خلال تبادل خيوط الحمض النووي مع الحمض النووي السليم (على اليسار). يتسبب Rad52 في إعادة ترتيب الكروموسومات الإجمالية (GCRs) من خلال التلدين أحادي الخيط (SSA) (يمين). الائتمان: جامعة أوساكا

إعادة التركيب المتماثل هي عملية أساسية لإصلاح الحمض النووي للحفاظ على السلامة الجينية للكائن الحي. الآن ، حدد باحثون من اليابان الآليات التي تختار بين المسارات البديلة لإصلاح الحمض النووي للحد من مجموعات الكروموسومات الشاذة والضارة التي قد تكون عرضة للإصابة بالسرطان والأمراض الوراثية.

في دراسة حديثة ، أظهر باحثون من جامعة أوساكا أن التلدين أحادي الخيط (SSA) المعتمد على Rad52 هو آلية الاقتران المتماثل الذي يؤدي إلى إعادة ترتيب الكروموسومات الإجمالية (GCRs) في السنترومير. كما أنها تحدد الطفرات التي تسمح لهذا المسار بالهيمنة على مسار Rad51 الخالي من الأخطاء.

الخلايا تحت ضغط مستمر من السمية الجينية من العوامل الخارجية والداخلية. عدم استقرار الجينوم يكمن وراء العديد من الأمراض بما في ذلك السرطان. وبالتالي ، فإن إصلاح الحمض النووي يحدث بالضرورة آلاف المرات يوميًا في كل خلية بشرية لتصحيح الطفرات الضارة وإعاقة التكاثر والنسخ وانكسار الكروموسومات. ومن المفارقات أن إعادة التركيب هذه قد تتسبب أحيانًا في اختلال وظائف GCRs.

مركز الكروموسوم هو تسلسل الحمض النووي المتخصص الذي يربط زوجًا من الكروماتيدات الشقيقة. العديد من الكائنات الحية ، بما في ذلك البشر والخميرة الانشطارية (شيزوساكارومايس بومب) ، لها تسلسلات متكررة في السنتروميرات. هذا يجعلها عرضة لتكوين isochromosome - صور مرآة معطلة - بسبب نوع معين من إعادة التركيب بين التكرارات المعكوسة. في التجارب التي أجريت على الخميرة الانشطارية ، أظهر الباحثون أن آليات تكرار الحمض النووي تقلل من حدوث GCRs عن طريق تثبيط نشاط SSA في السنتروميرات.

ان في المختبر تفاعل التلدين أحادي الخيط (SSA). مقارنةً بـ Rad52 من النوع البري ، أنتج Rad52-R45K المتحولة كميات محدودة من منتج SSA (النطاقات العلوية). * ، 32 ف ملصق. الائتمان: جامعة أوساكا

يوضح أتسوشي تي أوناكا ، المؤلف الرئيسي: "في السنتروميرات ، يسود إعادة التركيب المعتمد على Rad51 ويبدو أن مسارات إعادة التركيب الأخرى معطلة". "نظرًا لأن Rad51 يروج لإعادة التركيب المحافظ غير المتقاطع ، فإن اختيار مسارات إعادة التركيب مهم لقمع GCRs. يحدث إعادة التركيب هذا في الغالب بين التكرارات المقلوبة ، وبالتالي قمع تكوين isochromosomes.ومع ذلك ، فإن الطريقة التي يسود بها إعادة التركيب المعتمد على Rad51 في السنتروميرات غير معروفة ".

يشرح جي سو ، المؤلف الرئيسي المشارك ، المزيد. "لقد أظهرنا أن SSA المعتمد على Rad52 هو آلية الاقتران المتماثل الذي يؤدي إلى GCRs المركزية. rad52-R45K يضعف نشاط SSA لبروتين Rad52 ويقلل من تكوين isochromosome في راد 51 خلايا متحولة. لفهم كيفية قمع SSA المعتمد على Rad52 في السنترومير بشكل أفضل ، أجرينا شاشة جينية ووجدنا أن الطفرات المحددة في بروتينات شوكة النسخ ومجمع حماية الشوكة تزيد من SSA المعتمد على Rad52 في السنتروميرات وتشكيل isochromosome. "

يوضح المؤلف الكبير Takuro Nakagawa: "يشير بحثنا إلى آلية تكرار الحمض النووي في اختيار مسار إعادة التركيب في السنتروميرات ، مما يمنع SSA المعتمد على Rad52 والذي ينتج عنه GCRs". "هذه المعرفة تحدد Rad52 كهدف واعد في علاج السرطان."

نُشر المقال ، "آلية نسخ الحمض النووي تمنع التلدين أحادي الخيط المعتمد على Rad52 والذي يؤدي إلى إعادة ترتيب الكروموسومات الإجمالية في السنتروميرات" ، في بيولوجيا الاتصالات.


محتويات

1: الجينوم وتدفق المعلومات البيولوجية
2: الجزيئات البيولوجية
3: الأساس الكيميائي للحياة
4: هيكل ووظيفة الكروموسوم
5: دورة الخلية
6: تكرار الحمض النووي
7: الفصل الكروموسوم
8: النسخ
9: تنظيم النسخ
10: معالجة الحمض النووي الريبي
11: الترجمة
12: تنظيم الترجمة
13: RNAs التنظيمية
14: تعديل البروتين واستهدافه
15: الاستجابات الخلوية لتلف الحمض النووي
16: إصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة وإعادة التركيب المتماثل
17: الحمض النووي المحمول
18: علم الجينوم والتنوع الجيني
19: أدوات وتقنيات في علم الأحياء الجزيئي


إعادة الدمج واستهداف الجينات

واحدة من أكثر الأدوات المستخدمة على نطاق واسع في علم الأحياء الحديث هي الاستنساخ الجزيئي باستخدام إنزيمات تقييدية ، والتي تخلق أطرافًا متوافقة بين شظايا الحمض النووي التي تسمح لها بالانضمام معًا. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لها قيود معينة تحد من قابليتها للتطبيق على توليد بناء الحمض النووي الكبير أو المعقد. هناك تقنية أحدث تعالج بعض أوجه القصور هذه وهي إعادة التركيب ، والتي تعدل الحمض النووي باستخدام إعادة التركيب المتماثل (HR) ، والتبادل بين جزيئات الحمض النووي المختلفة بناءً على امتدادات من تسلسلات متشابهة أو متطابقة. جنبًا إلى جنب مع استهداف الجينات ، والذي يستفيد من الموارد البشرية الذاتية لتغيير جينوم الكائن الحي في مكان محدد ، حسنت تقنيات الاستنساخ القائمة على الموارد البشرية بشكل كبير سرعة وفعالية الهندسة الوراثية عالية الإنتاجية.

في هذا الفيديو ، نقدم مبادئ الموارد البشرية ، بالإضافة إلى المكونات الأساسية المطلوبة لإجراء تجربة إعادة التركيب ، بما في ذلك الكائنات الحية المختصة بإعادة التركيب والمكتبات الجينية مثل الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BAC). ثم نسير عبر بروتوكول يستخدم إعادة التركيب لتوليد ناقل استهداف جيني يمكن في النهاية نقله إلى خلايا جذعية جنينية لتوليد حيوان معدّل وراثيًا. أخيرًا ، سيتم تقديم العديد من التطبيقات التي تسلط الضوء على فائدة وتنوع تقنيات إعادة التركيب.

إجراء

أدى الاستنساخ عن طريق إعادة التركيب المتماثل ، أو إعادة التركيب ، إلى تحسين قدرة الباحثين بشكل كبير & # 8217 على إجراء هندسة وراثية عالية الإنتاجية. يتطلب الاستنساخ الجزيئي الكلاسيكي هضم النواقل والإدخالات بنفس إنزيمات التقييد لتوليد نهايات متوافقة لـ & # 8220 recombination ، & # 8221 ولكن بشكل خاص عند محاولة عزل منطقة من تسلسل أطول ، مثل امتداد الحمض النووي الجيني ، لا يوجد قم دائمًا بتقييد الإنزيمات التي ستقطع بشكل فريد حول منطقة الاهتمام ، وليس داخل المنطقة أو في أي مكان آخر في التسلسل. من خلال تجنب الحاجة إلى مواقع التقييد هذه ، توفر إعادة التركيب طريقة أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة لإنشاء بنيات الهندسة الوراثية.

في هذا الفيديو ، سوف نقدم مبادئ إعادة التركيب الجيني ، ونقدم بروتوكولًا عامًا لإعادة تجميع ناقل استهداف الجينات ، ومناقشة العديد من تطبيقات هذه التقنيات.

أولاً ، دع & # 8217s نناقش ماهية إعادة التركيب وكيف يمكن تطبيقها.

يستلزم إعادة التركيب الجيني تبادل المعلومات بين جزيئات الحمض النووي. في & # 8220 إعادة التركيب المتماثل ، & # 8221 يتم تبادل امتدادات كبيرة نسبيًا من تسلسل الحمض النووي المتماثل أو المتطابق. تستخدم الخلايا هذه العملية لإصلاح فواصل الخيوط المزدوجة ، كما أن التكاثر الجنسي لحقيقيات النوى يقوم أيضًا بتنفيذ ذلك بين الكروموسومات المتجانسة أثناء الانقسام الاختزالي لزيادة التنوع الجيني.

تم تسخير إعادة التركيب المتماثل لعدد من الأغراض التجريبية ، بما في ذلك تعديل مواضع داخلية محددة في الخلايا & # 8212 called & # 8220gene target. & # 8221 يتم تطبيقه أيضًا على هندسة التركيبات الجينية ، وهي عملية تسمى & # 8220recombineering ، & # 8221 وهو مفيد بشكل خاص لإجراء تعديلات على مساحات كبيرة من الحمض النووي لاستهداف جينوم الكائن الحي & # 8217s. للقيام بذلك ، يمكن للباحثين الاستفادة من & # 8220 المكتبات الجينية ، & # 8221 أو مجموعات من النواقل التي تحتوي كل منها على أجزاء طويلة من الحمض النووي الجيني. تم إنشاء أنواع مختلفة من المكتبات ذات السعات المختلفة ، والتي عادة ما يتم نشرها في الحيوانات المستنسخة البكتيرية ، ويمكن طلبها من المستودعات التجارية أو غير الربحية. أحد أكثر أنواع المكتبات الجينومية شيوعًا يسمى الكروموسوم الاصطناعي البكتيري أو BAC ، والذي يمكن أن يحمل حجم إدخال بين 150-350 كيلو قاعدة.

من أجل إعادة توحيد التركيب ، يحتاج العلماء إلى كائن حي يحدث فيه إعادة التركيب المتماثل. الخميرة خميرة الخميرة بشكل طبيعي & # 8220 - مؤهل للتركيب & # 8221 ويمكنه بسهولة إجراء إعادة تركيب متماثل بين ناقل وإدخال. نظام آخر شائع الاستخدام يستخدم بروتينات & # 8220Red & # 8221 من عاثيات لامدا ، والتي أعيد تكوينها في البكتيريا بكتريا قولونية. يمكن إعادة تجميع النواقل إما في سلالات بكتيرية تم إنشاؤها مسبقًا معبرة عن اللون الأحمر ، أو يمكن تحويل مكونات النظام الأحمر المشفر البلازميد بشكل مشترك مع ركائز إعادة الاتحاد إلى البكتيريا.

الآن ، دع & # 8217s نتجول في بروتوكول لإنشاء ناقل استهداف الجينات عن طريق إعادة التركيب.

الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء ماوس معدل وراثيا بتغييرات مستهدفة لجين معين. باختصار ، يتم إجراء التعديلات المرغوبة على الجين المعني في BAC ، حيث يتم استرجاع التسلسل المعدل & # 8220 & # 8221 إلى ناقل استهداف ، ويتم نقل هذا المتجه إلى خلايا جذعية جنينية لاستهداف الجينات. يمكن بعد ذلك استخدام الخلايا الجذعية لإنتاج حيوان معدل وراثيًا. للحصول على إرشادات حول هذا الإجراء النهائي ، يرجى الرجوع إلى فيديو JoVE Science Education & # 8220 الهندسة الوراثية للكائنات النموذجية. & # 8221

للبدء ، يتم تحديد وترتيب استنساخ BAC الذي يحتوي على التسلسل الجيني ذي الأهمية. بعد ذلك ، تم تصميم أذرع التماثل ، أو أليغنوكليوتيدات تحتوي على 30-50 منطقة متجانسة قاعدية. تُستخدم قليلات النوكليوتيدات هذه كبادئات أولية في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد الحمض النووي & # 8220 علب & # 8221 المستخدمة لتعديل الجين المعني. تحتوي هذه الكاسيتات عادةً ، على سبيل المثال ، على جينات مقاومة المضادات الحيوية التي يمكن أن تعمل كعلامات اختيار ، والتي يمكن تضخيمها بسهولة من العديد من البلازميدات المتاحة للجمهور. يتم بعد ذلك تحويل استنساخ البكتيريا BAC ، على سبيل المثال عن طريق التثقيب الكهربائي ، مع ترميز البلازميد لمكونات النظام الأحمر ، متبوعًا بأشرطة متجانسة تحتوي على ذراع. ثم يتم تحضين البكتيريا عند درجة حرارة مناسبة للحث على إعادة التركيب.

لاستعادة التسلسل المعدل من BAC ، يتم تكبير متجه & # 8220retrieval & # 8221 خطيًا وتضخيمه باستخدام بادئات تحتوي على أذرع متجانسة تغطي عدة كيلو قواعد حول موقع التعديل. يتم تحويل هذا العمود الفقري المتجه إلى استنساخ بكتيري BAC ، ويتم تحفيز إعادة التركيب مرة أخرى. سيتم إصلاح المتجه & # 8220gap-repair & # 8221 من خلال & # 8220 استعادة & # 8221 التسلسل المناسب من BAC. ينتج عن هذا ناقل لاستهداف الجينات يحتوي على التسلسل المعدل للاهتمام ، بالإضافة إلى المناطق المتجانسة مع الحمض النووي الجيني المحيط بالتسلسل المعدل. يمكن بعد ذلك تنقية هذا المتجه ، خطيًا ، وإدخاله في الخلايا الجذعية الجنينية حيث تستهدف آلية إعادة التركيب المتماثل الذاتية التسلسل المعدل إلى الموضع المقابل ، وبالتالي تغيير جينوم المضيف.

دعونا الآن نلقي نظرة على بعض تطبيقات تقنيات الهندسة القائمة على إعادة التركيب.

أولاً ، يمكن للباحثين استخدام إعادة التركيب لهندسة الجينوم البكتيري بسرعة وسهولة ، على سبيل المثال ، لدراسة مجمعات البروتين. هنا ، تم تصميم شريط يشفر علامة تقارب متسلسلة من الببتيد بالإضافة إلى علامة اختيار مقاومة كاناميسين ليتم إعادة دمجه في النهاية 3 & # 162 للجين المعني. ثم تم إدخال هذا المتجه في Red & # 8220recombination-مختص & # 8221 بكتريا قولونية، وتم عزل المؤتلفات الناجحة باستخدام وسائط انتقائية. تم تنقية مجمعات البروتين ذات العلامات كيميائيًا باستخدام البروتينات التي ترتبط بقوة بالعلامات ، وتم تحليلها بواسطة مقياس الطيف الكتلي لتحديد شركاء التفاعل للبروتين محل الاهتمام.

يمكن أيضًا استخدام إعادة التركيب والاستهداف الجيني لتعديل جينوم الكائنات الطفيلية ، مثل الطفيلي الملتزم داخل الخلايا التوكسوبلازماالذي يسبب مرض التوكسوبلازما. في هذه الدراسة ، تم إعادة تجميع ناقل الاستهداف في الخميرة ، حيث تم وضع التسلسلات الجينومية التي تحيط بالجين المعني حول علامة التحديد. تم بعد ذلك تحويل الناقل خطيًا وكهربائيًا في الطفيليات. تم استخدام الحد من الطلاء المخفف في الوسائط الانتقائية لعزل المؤتلفات الناجحة ، حيث استبدلت آلية إعادة التركيب المتماثل للطفيلي & # 8217s التسلسل الجيني بالتسلسل الهندسي ، وبالتالي حذف الجين المعني. أكد تفاعل البوليميراز المتسلسل في المنطقة المستهدفة أحداث إعادة التركيب الإيجابية.

أخيرًا ، تم وضع إجراء يُعرف باسم الاستنساخ الفرعي بالإضافة إلى الإدراج ، أو SPI ، حيث يتم إصلاح الفجوة وإدخال الكاسيت في وقت واحد ، مما يجعل عملية إعادة التركيب أبسط وأكثر مرونة. من الأهمية بمكان لنجاح هذه العملية التصميم المناسب لأذرع التماثل المتعددة ، والتي تصل إلى 180 نقطة أساس ، وهي أطول من إعادة التركيب التقليدية وذلك لزيادة كفاءة إعادة التركيب. بعد دمج أذرع التماثل في بلازميد الاستنساخ الفرعي وأشرطة الإدخال بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تم تحويلها معًا إلى استنساخ BAC معبر عن الأحمر ، وتم إحداث إعادة التركيب. ثم تم تحديد البنى المعاد تجميعها بنجاح عن طريق تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تحليل ملخص التقييد.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE & # 8217s حول إعادة التركيب. في هذا الفيديو ، ناقشنا مبادئ إعادة التركيب وكيف يمكن استخدامها في الهندسة الوراثية ، وبروتوكول لمشروع إعادة التركيب ، وأخيراً العديد من تطبيقات هذه التقنيات. كما هو الحال دائما، وذلك بفضل لمشاهدة!


محتويات

تحتوي جميع نواقل الاستنساخ الشائعة الاستخدام في البيولوجيا الجزيئية على ميزات أساسية ضرورية لوظيفتها ، مثل موقع استنساخ مناسب وعلامة قابلة للتحديد. قد يكون لدى الآخرين ميزات إضافية خاصة باستخدامهم. من أجل السهولة والراحة ، غالبًا ما يتم إجراء الاستنساخ باستخدام بكتريا قولونية. وبالتالي ، غالبًا ما تحتوي نواقل الاستنساخ المستخدمة على عناصر ضرورية لتكاثرها وصيانتها في بكتريا قولونية، مثل الأصل الوظيفي للنسخ المتماثل (ori). تم العثور على أصل ColE1 للنسخ المتماثل في العديد من البلازميدات. تتضمن بعض النواقل أيضًا عناصر تسمح بالحفاظ عليها في كائن حي آخر بالإضافة إلى بكتريا قولونية، وتسمى هذه النواقل ناقلات المكوك.

تحرير موقع الاستنساخ

تحتوي جميع نواقل الاستنساخ على ميزات تسمح بإدخال الجين بسهولة في المتجه أو إزالته منه. قد يكون هذا موقع استنساخ متعدد (MCS) أو متعدد الروابط ، والذي يحتوي على العديد من مواقع التقييد الفريدة. يتم أولاً شق مواقع التقييد في MCS بواسطة إنزيمات التقييد ، ثم يتم أيضًا ربط الجين المستهدف الذي تم تضخيمه بواسطة PCR والذي يتم هضمه بنفس الإنزيمات في النواقل باستخدام DNA ligase. يمكن إدخال تسلسل الحمض النووي المستهدف في المتجه في اتجاه معين إذا رغبت في ذلك. يمكن استخدام مواقع التقييد أيضًا للاستنساخ الفرعي إلى ناقل آخر إذا لزم الأمر. [2]

قد تستخدم نواقل الاستنساخ الأخرى توبويزوميراز بدلاً من ligase ويمكن أن يتم الاستنساخ بسرعة أكبر دون الحاجة إلى هضم مقيد للناقل أو الإدخال. في طريقة استنساخ TOPO هذه ، يتم تنشيط ناقل خطي عن طريق ربط topoisomerase I بنهاياته ، وقد يقبل هذا المتجه "المنشط TOPO" منتج PCR عن طريق ربط طرفي 5 'لمنتج PCR ، وإطلاق إيزوميراز العلوي وتشكيل ناقلات دائرية في هذه العملية. [3] هناك طريقة أخرى للاستنساخ بدون استخدام هضم الحمض النووي والليغاز وهي إعادة تركيب الحمض النووي ، على سبيل المثال كما هو مستخدم في نظام استنساخ البوابة. [4] [5] الجين ، بمجرد استنساخه في ناقل الاستنساخ (يسمى استنساخ الدخول في هذه الطريقة) ، يمكن إدخاله بسهولة في مجموعة متنوعة من نواقل التعبير عن طريق إعادة التركيب. [6]

تحديد علامة تحرير

يتم وضع علامة قابلة للتحديد بواسطة المتجه للسماح باختيار الخلايا المحولة إيجابياً. غالبًا ما تستخدم مقاومة المضادات الحيوية كواسم ، ومثال على ذلك جين بيتا لاكتاماز ، الذي يمنح مقاومة لمجموعة البنسلين من المضادات الحيوية بيتا لاكتام مثل الأمبيسلين. تحتوي بعض النواقل على اثنين من العلامات القابلة للتحديد ، على سبيل المثال ، يحتوي البلازميد pACYC177 على كل من الجين المقاوم للأمبيسيلين والكاناميسين. [7] متجه المكوك الذي تم تصميمه ليتم الحفاظ عليه في كائنين مختلفين قد يتطلب أيضًا واسمتين قابلتين للتحديد ، على الرغم من أن بعض الواسمات القابلة للتحديد مثل مقاومة الزيوسين والهيغروميسين ب فعالة في أنواع مختلفة من الخلايا. يمكن أيضًا استخدام علامات الانتقاء المساعدة التي تسمح لكائن مساعد التغذية بالنمو في الحد الأدنى من وسط النمو. LEU2 و URA3 التي يتم استخدامها مع سلالات الخميرة المغذية المقابلة لها. [8]

نوع آخر من الواسمات القابلة للتحديد يسمح بالاختيار الإيجابي للبلازميد مع الجين المستنسخ. قد يتضمن ذلك استخدام جينة قاتلة للخلايا المضيفة ، مثل البارناز ، [9] Ccda ، [10] والسموم parD / parE. [11] [12] يعمل هذا عادةً عن طريق تعطيل أو إزالة الجين القاتل أثناء عملية الاستنساخ ، والنسخ غير الناجحة حيث يظل الجين القاتل سليمًا من شأنه قتل الخلايا المضيفة ، لذلك يتم اختيار الحيوانات المستنسخة الناجحة فقط.

مراسل تحرير الجينات

تُستخدم جينات المراسل في بعض نواقل الاستنساخ لتسهيل فحص الحيوانات المستنسخة الناجحة باستخدام ميزات هذه الجينات التي تسمح بتحديد الاستنساخ الناجح بسهولة. قد تكون هذه الميزات الموجودة في نواقل الاستنساخ هي لاكزجزء α لتكملة α في الاختيار الأزرق والأبيض ، و / أو الجين المحدد أو الجينات المراسل في الإطار مع MCS والمحاطة به لتسهيل إنتاج بروتينات الاندماج. من أمثلة شركاء الاندماج التي يمكن استخدامها للفحص البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ولوسيفيراز.

عناصر للتعبير تحرير

لا يحتاج ناقل الاستنساخ إلى احتواء عناصر مناسبة للتعبير عن الجين المستهدف المستنسخ ، مثل المحفز وموقع الربط الريبوسومي (RBS) ، ومع ذلك ، فإن العديد منها يعمل ، وقد يعمل بعد ذلك كمتجه للتعبير. يمكن إدخال الحمض النووي المستهدف في موقع يخضع لسيطرة محفز معين ضروري للتعبير عن الجين المستهدف في المضيف المختار. في حالة وجود المحفز ، يفضل التحكم بإحكام في التعبير عن الجين وتحريضه بحيث يتم إنتاج البروتينات فقط عند الحاجة. بعض المروجين الأكثر شيوعًا هي T7 و لاك المروجين. يعد وجود المحفز ضروريًا عند استخدام تقنيات الفرز مثل الاختيار الأزرق والأبيض.

تُستخدم أحيانًا نواقل الاستنساخ بدون محفز و RBS لتسلسل الحمض النووي المستنسخ ، على سبيل المثال عند استنساخ الجينات التي تكون منتجاتها سامة بكتريا قولونية الخلايا. المروج و RBS لتسلسل الحمض النووي المستنسخ غير ضروريين أيضًا عند إنشاء مكتبة الجينوم أو cDNA للمستنسخات لأول مرة لأن الجينات المستنسخة عادةً ما يتم استنساخها في ناقل تعبير أكثر ملاءمة إذا كان تعبيرها مطلوبًا.

تم تصميم بعض النواقل للنسخ فقط بدون التعبير عن البروتين غير المتجانسة ، على سبيل المثال في المختبر إنتاج مرنا. تسمى هذه النواقل نواقل النسخ. قد تفتقر إلى التسلسلات اللازمة لعملية ربط البولي أدينيل والإنهاء ، وبالتالي قد لا يتم استخدامها لإنتاج البروتين.

يتوفر عدد كبير من نواقل الاستنساخ ، وقد يعتمد اختيار المتجه على عدد من العوامل ، مثل حجم الإدخال ورقم النسخ وطريقة الاستنساخ. قد لا يتم الاحتفاظ بإدخال كبير بشكل ثابت في ناقل عام للاستنساخ ، خاصة بالنسبة لأولئك الذين لديهم عدد نسخ مرتفع ، وبالتالي قد يتطلب استنساخ أجزاء كبيرة متجه استنساخ أكثر تخصصًا. [13]

تحرير البلازميد

تقوم البلازميدات بشكل مستقل بتكرار DNA دائري خارج الكروموسومات. هم نواقل الاستنساخ القياسية والأكثر استخدامًا. يمكن استخدام معظم البلازميدات العامة لاستنساخ إدخال DNA يصل حجمه إلى 15 كيلو بايت. يعد البلازميد pBR322 أحد أقدم نواقل الاستنساخ الشائعة الاستخدام. تشمل نواقل الاستنساخ الأخرى سلسلة pUC من البلازميدات ، ويتوفر عدد كبير من نواقل البلازميد المختلفة للاستنساخ. العديد من البلازميدات لها عدد نسخ مرتفع ، على سبيل المثال pUC19 الذي يحتوي على عدد نسخ من 500-700 نسخة لكل خلية ، [14] وعدد النسخ المرتفع مفيد لأنه ينتج عائدًا أكبر من البلازميد المؤتلف من أجل التلاعب اللاحق. ومع ذلك ، يمكن استخدام بلازميدات ذات عدد نسخ منخفض بشكل مفضل في ظروف معينة ، على سبيل المثال ، عندما يكون البروتين من الجين المستنسخ سامًا للخلايا. [15]

تحتوي بعض البلازميدات على أصل عاثيات M13 للتكاثر ويمكن استخدامها لتوليد DNA أحادي الجديلة. هذه تسمى phagemid ، والأمثلة هي سلسلة pBluescript من نواقل الاستنساخ.

تحرير الجراثيم

العاثيات المستخدمة في الاستنساخ هي λ فج و M13. يوجد حد أعلى لكمية الحمض النووي التي يمكن تعبئتها في فجوة (بحد أقصى 53 كيلو بايت) ، لذلك للسماح بإدخال الحمض النووي الغريب في الحمض النووي للعاثية ، قد تحتاج نواقل استنساخ العاثيات إلى حذف بعض الجينات غير الأساسية ، على سبيل المثال ، جينات اللايسوجين منذ استخدام الملتهمة λ كناقل استنساخ لا يتضمن سوى الدورة اللايتية. [16] هناك نوعان من نواقل الملتهمة - ناقل الإدخال وناقل الاستبدال. تحتوي نواقل الإدخال على موقع انقسام فريد حيث يمكن إدخال دنا أجنبي بحجم 5-11 كيلو بايت. في نواقل الاستبدال ، تحيط مواقع الانقسام بمنطقة تحتوي على جينات غير ضرورية للدورة اللايتية ، ويمكن حذف هذه المنطقة واستبدالها بإدخال DNA في عملية الاستنساخ ، ويمكن إدخال DNA أكبر حجمًا من 8-24 كيلو بايت. [17]

يوجد أيضًا حد أقل للحجم للحمض النووي يمكن تعبئته في فجوة ، ولا يمكن تغليف الحمض النووي المتجه الصغير جدًا في العاثية بشكل صحيح. يمكن استخدام هذه الخاصية للاختيار - قد يكون المتجه بدون إدراج صغيرًا جدًا ، وبالتالي يمكن تحديد المتجهات التي تحتوي على إدراج فقط للنشر. [18]

تحرير Cosmid

الكوسميدات عبارة عن بلازميدات تتضمن جزءًا من العاثية λ DNA التي لها موقع نهائي متماسك (كوس) الذي يحتوي على العناصر المطلوبة لتعبئة الحمض النووي في جزيئات. يتم استخدامه عادة لاستنساخ أجزاء كبيرة من الحمض النووي بين 28 و 45 كيلو بايت. [13]

تحرير الكروموسوم الاصطناعي البكتيري

يمكن استنساخ حجم الإدخال الذي يصل إلى 350 كيلو بايت في كروموسوم اصطناعي بكتيري (BAC). يتم الحفاظ على BACs في بكتريا قولونية برقم نسخة واحد فقط لكل خلية. [17] تعتمد BACs على البلازميد F ، وهو كروموسوم اصطناعي آخر يسمى PAC مبني على فجوة P1.

تحرير الكروموسوم الاصطناعي الخميرة

يستخدم كروموسوم الخميرة الاصطناعي كناقلات لاستنساخ شظايا الحمض النووي التي يزيد حجمها عن 1 ميغا قاعدة (1 ميغا بايت = 1000 كيلو بايت) في الحجم. إنها مفيدة في استنساخ أجزاء أكبر من الحمض النووي كما هو مطلوب في رسم خرائط الجينوم كما هو الحال في مشروع الجينوم البشري. يحتوي على تسلسل تيلومير ، تسلسل متماثل بشكل مستقل (ميزات مطلوبة لتكرار الكروموسومات الخطية في خلايا الخميرة). تحتوي هذه النواقل أيضًا على مواقع تقييد مناسبة لاستنساخ الحمض النووي الأجنبي وكذلك الجينات لاستخدامها كواسمات انتقائية.

تحرير الكروموسوم الاصطناعي البشري

قد يكون الكروموسوم الاصطناعي البشري مفيدًا كنواقل لنقل الجينات لتوصيل الجينات إلى الخلايا البشرية ، وأداة لدراسات التعبير وتحديد وظيفة الكروموسوم البشري. يمكن أن يحمل جزء كبير جدًا من الحمض النووي (لا يوجد حد أعلى للحجم للأغراض العملية) ، وبالتالي لا يعاني من مشكلة قدرة الاستنساخ المحدودة للناقلات الأخرى ، كما أنه يتجنب حدوث الطفرات المغزلية المحتملة الناتجة عن الاندماج في الكروموسومات المضيفة بواسطة الفيروس. المتجه. [19] [20]

ناقلات الفيروسات الحيوانية والنباتية تم التلاعب بالفيروسات التي تصيب الخلايا النباتية والحيوانية لإدخال جينات غريبة في الخلايا النباتية والحيوانية. إن القدرة الطبيعية للفيروسات على الامتصاص في الخلايا وإدخال الحمض النووي الخاص بها والتكاثر جعلتها مركبات مثالية لنقل الحمض النووي الغريب إلى الخلايا حقيقية النواة في المزرعة. تم استخدام ناقل يعتمد على فيروس Simian 40 (SV40) في أول تجربة استنساخ شملت خلايا الثدييات. تم استخدام عدد من النواقل التي تعتمد على نوع آخر من الفيروسات مثل الفيروسات الغدية وفيروس الورم الحليمي لاستنساخ الجينات في الثدييات. في الوقت الحاضر ، نواقل الفيروسات القهقرية شائعة لاستنساخ الجينات في خلايا الثدييات. في حالة النباتات مثل فيروس موزاييك القرنبيط وفيروس موزاييك التبغ وفيروسات الجوزاء قد استخدمت بنجاح محدود.

عادةً ما تشتمل العديد من نواقل الأغراض العامة مثل pUC19 على نظام للكشف عن وجود جزء من الحمض النووي المستنسخ ، بناءً على فقدان النمط الظاهري الذي يتم تسجيله بسهولة. الأكثر استخدامًا هو الترميز الجيني لـ بكتريا قولونية β-galactosidase ، الذي يمكن اكتشاف نشاطه بسهولة من خلال قدرة الإنزيم الذي يشفره على التحلل المائي للركيزة القابلة للذوبان وعديمة اللون X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-d-galactoside) إلى مادة غير قابلة للذوبان ، المنتج الأزرق (5،5'-dibromo-4،4'-dichloro indigo). استنساخ جزء من الحمض النووي داخل النواقل لاك يمنع تسلسل β-galactosidase إنتاج إنزيم نشط. إذا تم تضمين X-gal في لوحات أجار الانتقائية ، فإن المستعمرات المحولة تكون زرقاء بشكل عام في حالة ناقل بدون DNA مدرج وأبيض في حالة ناقل يحتوي على جزء من الحمض النووي المستنسخ.


شاهد الفيديو: شرح تركيب المادة الوراثية الكروموسومات الجينات DNA النيوكليوتيد الصف الثامن (كانون الثاني 2022).