معلومة

توليد ديمر كامل من المونومر مع تناظر C2؟


لقد قمت بتنزيل ملف PDB من dimer ، لكنه يحتوي فقط على المونومر ، ويقول إنه يمكن الحصول على dimer من تناظر C2. للحصول على مثال انظر هنا: http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do؟structureId=2PJY.

كيف يمكنني إنشاء PDB للديمر الكامل؟

أنا مرتاح مع PyMol ، لذا يفضل الإجابة باستخدام PyMol.


يحتوي ملف PDB على الوحدة غير المتماثلة الموجودة في دراسة بلورية معينة. التجمع البيولوجي هو التركيب الرباعي المعروف أو المتوقع وجوده في الأنظمة الحية. بالنسبة للعديد من البروتينات (ولكن ليس 2PJY) ، يمكن تنزيل التجميع البيولوجي مباشرة من RCSB. بالنسبة للبروتينات الأخرى ، قد يحتوي ملف PDB على مصفوفة التحويل المستخدمة لإنشاء التجميع البيولوجي من الوحدة غير المتماثلة. إذا نظرت إلى الملف في محرر نصوص ، ستجد هذه المعلومات تحت الملاحظة 350:

REMARK 350 BIOMOLECULE: 1 ملاحظة 350 مؤلفًا محددًا للوحدة البيولوجية: ملاحظة سداسية 350 برمجيًا محددًا هيكل رباعي: ملاحظة سداسية 350 البرنامج المستخدم: PISA REMARK 350 إجمالي مساحة السطح: 2 ، C ملاحظة 350 BIOMT1 1 1.000000 0.000000 0.000000 0.00000 ملاحظة 350 BIOMT2 1 0.000000 1.000000 0.000000 0.00000 ملاحظة 350 BIOMT3 1 0.000000 0.000000 1.000000 0.00000 ملاحظة 350 BIOMT1 2 1.000000 0.000000 0.000000 0.00000 علامة تجارية 350 BIOMT2 2 0.000000-1.000000 0.000000 BIOMT2 2 0.000000-1.000000 0.000000 BIOMT2 350 1.000000 0.00000

لاحظ أن التجميع البيولوجي الفعلي لـ 2PJY هو شكل سداسي والوحدة غير المتماثلة في ملف PDB عبارة عن أداة قص. يمكنك أن ترى أن المصفوفة الأولى هي متطابقة (أي تحافظ على الوحدة الأصلية غير المتماثلة). تقوم المصفوفة الثانية بتحويل الوحدة غير المتماثلة لإنشاء الشكل السداسي الكامل. تم توقع هذه المصفوفة لكل من المؤلف و PISA. يمكنك بالفعل الانتقال إلى موقع PISA الإلكتروني وجعله يتنبأ بالتجميع البيولوجي لملف PDB معين ، وسوف يبصق إحداثيات السداسي (والتجمعات الأخرى المتوقعة) والتي يمكنك تحميلها بعد ذلك في PyMOL.

قد تحتوي ملفات PDB أيضًا على سجل CRYST1 ، والذي يعطي معلومات حول خلية الوحدة والمجموعة الفضائية للبلورة. عبر أمر symexp ، يمكن لـ PyMOL استخدام هذه المعلومات لإعادة إنشاء الوحدات غير المتماثلة المجاورة. من خلال تحديد مسافة القطع (وهذا يتطلب التجربة والخطأ) ، يمكن إعادة تكوين التجميع البيولوجي. هذا البرنامج النصي ، على سبيل المثال ، سوف يولد السداسي:

إحضار 2PJY symexp 2PJY، 2PJY، 2PJY، 2.5 إخفاء كل شيء تظهر رسوم متحركة


Ca 2+ - مونومر مستقل وتكوين ديمر مفاتيح تبديل بروتين كابري بين بروتين منشط Ras GTPase (GAP) وأنشطة RapGAP

CAPRI هو عضو في عائلة GAP1 للبروتينات المنشطة لـ GTPase (GAPs) لبروتينات G الصغيرة. من المعروف أنه يعمل كمستشعر اتساع لمستويات Ca 2+ داخل الخلايا التي يتم تحفيزها بواسطة إشارات خارج الخلية وله مجال تحفيزي مع أنشطة RasGAP و RapGAP المزدوجة. هنا ، قمنا بالتحقيق في الآلية التي تحول CAPRI بين نشاطي GAP. نظهر أن كابري تشكل المتجانسين في المختبر و في الجسم الحي بطريقة تعتمد على Ca 2+. تم تحديد الموقع المطلوب للثنائي عن طريق الحذف والطفرات النقطية إلى شكل حلزوني يشكل وجهًا كارهًا للماء في الذيل C المتطرف لبروتين CAPRI. أدى حذف هذا الشكل اللولبي إلى إلغاء تكوين ثنائي الملمس ولكنه لم يؤثر على انتقال كابري إلى غشاء البلازما عند تحفيز الخلية بالهيستامين. لقد وجدنا أن كابري ثنائي ومونومري يتعايشان في الخلايا وأن نسبة ديمير إلى كابري أحادي تزداد عند تحفيز الخلية بالهيستامين. كان الكالسيوم الحر 2+ بتركيزات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ضروريًا وكافيًا لتشكيل الثنائيات. الأهم من ذلك ، أن الأشكال أحادية وخافتة من كابري أظهرت أنشطة جاب التفاضلية في الجسم الحي كان للشكل البري من CAPRI نشاط RapGAP أقوى من نشاط RasGAP ، في حين أظهر طفح CAPRI أحاديًا RasGAP أقوى من نشاط RapGAP. توضح هذه النتائج أن CAPRI يقوم بالتبديل بين أدواره المزدوجة في GAP من خلال تكوين المونومرات أو المتجانسات من خلال عملية تنظمها Ca 2+. نقترح أن تباين Ca 2+ المعتمد على CAPRI قد يعمل على تنسيق مسارات إشارات Ras و Rap1.


يتسابق العلماء لمعرفة أسرار متلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة و # x02013coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ، وهو سبب جائحة مرض COVID-19. تتمثل الخطوة الأولى في الدخول الفيروسي في ربط بروتين سبايك الفيروسي الثلاثي بمستقبلات الإنسان المحول للأنجيوتنسين الإنزيم 2 (ACE2). يان وآخرون. اعرض تركيب إنزيم ACE2 البشري في مركب مع بروتين غشائي يرافقه ، B 0 AT1. في سياق هذا المركب ، فإن ACE2 هو ثنائي. يُظهر هيكل آخر كيف يتفاعل مجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2 مع ACE2 ويقترح أنه من الممكن أن يرتبط بروتينان شائكان متشابهان بثنائي ACE2. توفر الهياكل أساسًا لتطوير العلاجات التي تستهدف هذا التفاعل الحاسم.

علم، هذه القضية ص. 1444


نتائج ومناقشة

يكسر Dimerization ارتباطات الضوضاء الطويلة في الدائرة الذاتية

لتقييم التأثيرات الديناميكية لارتباط البروتين بالبروتين في دوائر الجينات ذات التنظيم الذاتي الإيجابي ، نقوم ببناء عدة نماذج بديلة للدوائر الذاتية الإيجابية. يؤكد كل نموذج على مجموعة مختلفة من آليات التغذية الراجعة المحتملة ، ويمكن تجميع طوبولوجيا الشبكة التي تم النظر فيها في فئتين من الدوائر أحادية المونومر (MO) والدوائر المسموح بها (DA) ، وفقًا لتوافر حالة ثنائيات البروتين ( الترميز اللوني في الشكل 1). نقوم أيضًا بتجميع دوائر DA في ثلاثة أشكال ، DA1 إلى DA3 ، اعتمادًا على شكل البروتين هو عامل النسخ الوظيفي (TF) ومكان حدوث التباين. بالنسبة إلى DA1 ، نسمح فقط للديمر بالارتباط بتسلسل مشغل الحمض النووي (عامل النسخ الخافت ، DTF) ، بينما يحدث ثنائي الأبعاد لـ DA2 من خلال الارتباط المتسلسل للمونومرات على الحمض النووي. في DA3 ، تكون حركيات ربط البروتين والحمض النووي هي نفسها الموجودة في دائرة MO ، ومن ثم عامل النسخ الأحادي (MTF) ، مع إضافة حالة ثنائيات البروتين الخلوي. بينما سنقدم نتائج DA1 فقط في هذه الورقة ، لا يوجد فرق كبير بين DA2 و DA3 [ملف إضافي 1].

رسم تخطيطي لدائرة جين التنظيم الذاتي النموذجية. يشار إلى حالة ربط الحمض النووي بواسطة Dxy ، حيث تتوافق x مع منطقة المشغل (فارغة = 0 ، ومونومر = 1 ، ومونومر = 2) ، و y إلى منطقة المروج (فارغة = 0 ، و RNA بوليميريز مرتبط = 1). يمثل C المركب المفتوح من holoenzyme DNA-RNAp مع تسلسل المروج الذي تم مسحه للتو من RNAp ويخضع لاستطالة النسخ. أخيرًا ، تتوافق M و P1 و P2 مع mRNA ومونومر البروتين والثنائي على التوالي. يمكن تجميع طبولوجيا الشبكة في فئتين ، دوائر أحادية المونومر فقط (MO) أو دوائر مسموح بها ثنائية الأبعاد (DA). لقد درسنا DA1 (الخطوط الحمراء) ، والتي تسمح فقط للديمر بالارتباط مع تسلسل مشغل الحمض النووي ، DA2 (الأخضر) مع الربط المتسلسل للمونومرات على الحمض النووي ، و DA3 (الأزرق) ، التي تشترك في حركية ربط البروتين والحمض النووي مع MO مع السماح بتضخم في العصارة الخلوية. لاحظ أنه بالنسبة لطوبولوجيا DA2 ، اخترناها ك31 = ك30 (انظر النص للحصول على التفاصيل) لقد افترضنا أن الخلايا في مرحلة النمو الأسي وعدد ثابت RNAp (R).

لاحظ أن حلقة التغذية المرتدة ليست صريحة في الشكل 1 ولكنها مدرجة ضمنيًا من خلال اعتماد توازن ربط مروج RNAp على حالة الربط لزوج مشغل TF. يتم تحديد علامة (إيجابية أو سلبية) وقوة التحكم في التغذية المرتدة من خلال الحجم النسبي لثوابت التفكك بين RNAp و DNA التي تكون إما حرة أو مرتبطة بـ TF. على سبيل المثال ، يمتلك الهيكل DA1 تحكمًا إيجابيًا في ردود الفعل إذا كان ك30 = ك30/ ف30 & GT ك32 = ك32/ ف32، و ك30 يتوافق مع مستوى النسخ التأسيسي (بدء النسخ في غياب عامل النسخ المرتبط). لكل طوبولوجيا ، ندرس اعتماد خصائص الضوضاء على المعدلات الحركية من خلال تغيير العمر الباهت ، وتقارب الارتباط ، ومعدلات الارتباط / التفكك الفردي (انظر الجدول والشكل 1). بينما نناقش فقط التحكم في ردود الفعل الإيجابية للدائرة الذاتية في هذه الورقة ، فقد حصلنا على النتائج المقابلة للتحكم في ردود الفعل السلبية [ملف إضافي 1].

يوضح الشكل 2 عينة من عشر دورات زمنية تمثيلية لوفرة البروتين. يتم تمييز تأثير التقلبات العشوائية في دائرة MO. ومع ذلك ، في جميع دوائر DA حيث قد يشكل البروتين ثنائيات خلوية خلوية ، نلاحظ انخفاضًا كبيرًا في مستوى الضوضاء في وفرة المونومر. يستمر قمع التقلبات في جميع أنحاء نطاق المعلمات الحركية التي (حتى الآن) معروفة بأنها ذات صلة من الناحية الفسيولوجية (انظر الجدول 1).

عشر دورات زمنية مستقلة لوفرة مونومرات البروتين في دائرة التنظيم الذاتي (الإيجابية). إن توفر حالة ديمر خلوي عصاري (أحمر ، باستخدام طوبولوجيا الدائرة DA1) يقلل بشكل كبير من تقلبات عدد النسخ للمونومر مقارنة بدائرة المونومر فقط (MO) (الأزرق). جميع معلمات MO و DA1 المقابلة لها نفس القيم. في عمليات المحاكاة التي تلت ذلك ، يتم اختيار الظروف الأولية لتكون حل الحالة المستقرة لمعادلة المعدل الحتمية المقابلة بحيث يجب تقليل السلوك العابر.

عند حساب توزيع الحالة المستقرة لوفرة المونومر والثنائي (الشكل 3) ، نلاحظ اتجاهًا واضحًا يتمثل في تقليل عامل المونومر فانو (نسبة التباين إلى المتوسط) مع تحول توازن الربط نحو الثنائى. يتم الحفاظ على هذا الاتجاه لجميع طبولوجيا DA التي تم فحصها (انظر معلومات تكميلية). طالما يُسمح بالثنائيات في العصارة الخلوية ، فإن توازن الارتباط السريع يمتص التقلبات الطويلة الأمد الناتجة عن التوليف السريع أو تحلل المونومر. عندما يؤدي التذبذب العشوائي إلى حدوث تغيير مفاجئ في رقم نسخة المونومر ، فإن dimerization يوفر تجمعًا مؤقتًا يمتص التغيير المفاجئ. خلاف ذلك ، سوف تنتشر رشقات نارية عشوائية في وفرة المونومر إلى النشاط النسخي للمحفز ، مما يؤدي إلى التحكم غير المنتظم في التعبير البروتيني. يجب التأكيد على أن هذا لا علاقة له بعلامة اللائحة ويتوافق مع ملاحظات المرجع. [21] للتنظيم الذاتي السلبي. من المثير للدهشة أن حجم تقليل الضوضاء في دائرة التنظيم الذاتي الموجب هو تقريبًا نفس الحجم الخاص بالتنظيم الذاتي السلبي والذي يُعتبر عادةً بناءًا مستقرًا للغاية [ملف إضافي 1].

توزيع الحالة الثابتة لوفرة البروتين المونومر (الأسود) والثنائي (البرتقالي) في الدوائر الذاتية الموجبة. يتوافق العمود الأيسر (الأيمن) مع نسبة معدلات الاضمحلال الثنائى والمونومر لـ γ2/γ1 = 1/10 (γ2/γ1 = 1/2). يتم جمع أرقام النسخ الجزيئية في فترة زمنية محددة (5 · 10 3 ثوانٍ) بعد الوصول إلى الحالة المستقرة. هنا ك1ف1/ك1 هو ثابت تفكك ثنائى البروتين. كما يتم تحويل توازن الربط نحو حالة dimer (تناقص ك1) ، يتم تقليل مستوى الضوضاء بشكل رتيب (انظر الجدول 2). لاحظ أن عمر البروتين المطول بسبب التكوين المعقد (العمود الأيسر) يؤثر على مستوى الضوضاء.

يمكن العثور على تفسير إرشادي من تحليل جاكوبي لنظام ديناميكي حتمي ، وهو مبرر لاضطرابات صغيرة حول حالة مستقرة. عندما يقوم التذبذب العشوائي بإزاحة رقم نسخة المونومر بعيدًا عن قيمة الحالة المستقرة ، يمكن وصف الانحلال نحو الحالة المستقرة بواسطة النظام Jacobian. يشير التباين في حجم قيم eigenvalues ​​(السلبية) لمصفوفة Jacobian لـ MO مقابل دوائر DA إلى أن الحالة المضطربة يتم تخزينها مؤقتًا عن طريق التسوية السريعة لتوازن المونومر ثنائي الأبعاد. يحدث هذا التخزين المؤقت قبل أن يتراكم التقلب العشوائي ، ربما مع تأثيرات فسيولوجية كارثية ، مما يفسر أنماط الوقت الطويل الخشنة التي لوحظت في نموذج MO على النقيض من دارات DA (الشكل 2).

التبييض الانتقائي للضوضاء البراونية

تولد عملية dimerization نفسها تقلبات عشوائية على نطاق زمني قصير. ومع ذلك ، نظرًا لأن هذا المقياس الزمني منفصل بشكل أساسي عن مقياس تخليق المونومر وانحلاله (أوامر الحجم أسرع) ، فإن التباين يقلل بشكل فعال من التقلبات على مستوى المونومر. من الأفضل دراسة محتوى التردد للتذبذبات من خلال تحليل الكثافة الطيفية للقدرة (PSD) ، والتي تُعرَّف على أنها تحويل فورييه لوظيفة الارتباط التلقائي [27] ، الذي تم تقديمه في الأصل لمعالجة الإشارات. يوضح الشكل 4 أطياف قدرة الضوضاء لـ DA1 ، ويتضح على الفور التمييز بين دائرة MO وطوبولوجيا DA. على وجه الخصوص ، نلاحظ الميزتين التاليتين. (1) اضمحلال قانون القدرة بتردد متزايد و (2) هضبة أفقية لدارات DA. يتم تفسير ميزة قانون القوة من خلال طبيعة "السير العشوائي" لتخليق البروتين وانحلاله: يبلغ أس قانون القوة حوالي 2 ، وهو ما يذكرنا بالحركة البراونية (عملية وينر) في حدود عدد النسخ الجزيئية الكبيرة. مقارنة بالإشارات الأخرى التي يتم ملاحظتها بشكل شائع ، مثل الضوضاء البيضاء (غير المرتبطة) أو 1 /F الضوضاء ، تخليق البروتين / تسوسه له وقت ارتباط أطول. إذا كانت وظيفة الارتباط التلقائي لدورة زمنية تتميز بتضاؤل ​​أسي واحد ، كما هو الحال بالنسبة للضوضاء البراونية ، يتم إعطاء PSD بواسطة ملف تعريف لورينتز ، وبالتالي ، يتم تقريبه جيدًا بواسطة قانون التربيع العكسي في نظام التردد المنخفض . نحن لا نلاحظ قيمة التشبع لدائرة MO ، ومن المحتمل ألا تكون في نافذة التردد ذات الأهمية الفسيولوجية. قد يكون هذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة للدوائر حيث تكون أوقات الارتباط طويلة.

الكثافة الطيفية للقدرة (PSD) لتقلبات وفرة البروتين. يُظهر PSD الخاص بدائرة MO بوضوح سلوك قانون القوة. تطور جميع أنظمة النماذج الأخرى التي تحتوي على حالة ديمر بروتين عصاري خلوي متوفرة (DA1 الموضحة هنا) هضبة في منطقة التردد المتوسط ​​بغض النظر عن تفاصيل النموذج (انظر معلومات تكميلية). مع زيادة تقارب الربط الخافت ، يتم تقليل مستوى الضوضاء بشكل أكبر. لقد قمنا بتضمين نتيجة MO في لوحة dimer (يمين) كمرجع. تتوافق مجموعات البيانات ذات الرموز الصلبة (الفارغة) مع γ2/γ1 = 1/10 (γ2/γ1 = 1/2).

يتم تقليل الضوضاء في نظام التردد المنخفض ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية ، وفي الشكل 4 أشرنا إلى القيم النموذجية لدورة الخلية وعمر الرنا المرسال. على الرغم من أن التقلبات العشوائية تفرض حدًا أساسيًا في معالجة المعلومات الخلوية ، إلا أن مصادر الضوضاء المتعددة قد تؤثر على علم وظائف الأعضاء الخلوي بشكل غير مضاف. بالنسبة للخلية الحية ، تكون التقلبات ذات صلة بشكل خاص عندما يكون وقت ارتباطها مشابهًا لدورة الخلية أو أطول منها. في الوقت نفسه ، يتم تخفيف تقلبات النطاق قصيرة الوقت (المتعلقة بدورة الخلية) بسهولة أو لا تنتشر [28]. بالإضافة إلى ذلك ، تشير المنطقة المسطحة المرصودة في PSD لدوائر DA إلى أنه فيما يتعلق بتقلبات التردد متوسطة المدى ، يمكننا تقريبها بأمان كضوضاء بيضاء. قد تلقي هذه الرؤية الضوء على موثوقية مخططات التقريب للديناميكيات العشوائية الفعالة في النماذج البروتينية فقط.

تلعب زيادة العمر الافتراضي للديمر دورًا مهمًا

ترتبط فضيلة الحالة المضاعفة للخلية الخلوية ارتباطًا مباشرًا بالعمر الطويل للبروتينات عندما تكون في مجمع. باستثناء علامات التحلل لتحلل البروتين النشط ، فإن معدل دوران أبطأ بكثير من أوليغومرات البروتين هو القاعدة. يمكن تفسير ذلك جزئيًا من خلال الملاحظة الشائعة بأن المونومرات لها هياكل مكشوفة إلى حد كبير ، وهي عرضة لأن تكون هدفًا لتحلل البروتين [29]. وقد تمت الإشارة أيضًا إلى أن العمر الطويل للشكل قليل القسيمات هو عامل حاسم في تعزيز نطاقات المعلمات الممكنة لدوائر الجينات [30]. كما يتضح من الشكل 3 (أيضًا الجدول 2) ، فإن التغيير الطي لتقليل الضوضاء ، على الرغم من أنه لا يزال مهمًا ، ليس قوياً بالنسبة للحالة (الافتراضية) لعمر الثنائيات مثل حالة المونومر (γ2/γ1 = 1/2). ومع ذلك ، فإن أطياف القدرة منخفضة التردد لا تزال تعرض قدرة ضوضاء أقل بترتيب من حيث الحجم تقريبًا مما هي عليه في دائرة MO مع نفس معلمات المعدل (الشكل 4). ومن ثم ، فإن قدرة الحد من الضوضاء تبقى جيدة طالما أن عمر الثنائى يظل طويلاً بشكل كافٍ مقارنةً بالانتقال بين المونومر والثنائي.

آثار homo-dimerization في تبديل التبديل الجيني

اللاقمات المستقرة بشكل استثنائي من الملتهمة λ، حيث يكون معدل الفقد التلقائي 10 -7 لكل خلية لكل جيل [31 ، 32] ، قد حفز تركيب مفتاح التبديل الجيني [15]. تم إنشاء مفتاح التبديل من زوج من الجينات ، والتي سنشير إليها على أنها جين أ و ب، فإن ذلك يقمع تعبيرات بعضنا البعض بشكل نسبي. يمكن اعتبار هذا التنظيم السلبي المتبادل حلقة ردود فعل إيجابية فعالة ويوفر الأساس للحالات المستقرة المتعددة. إن وجود قابلية التعددية ، بدوره ، يمكن استغلاله كأداة للذاكرة اللاجينية أو لاتخاذ القرار [33].

كما تشير السمات العامة للتعليقات الإيجابية مع التعاون ، فإن مفتاح التبديل الجيني يستجيب للإشارات الخارجية بطريقة فائقة الحساسية: عندما تقترب قوة الإشارة من قيمة العتبة ، يمكن أن تنقلب حالة التعبير الجيني عن طريق تغيير بسيط في الإشارة. على سبيل المثال ، تركيز البروتين أ (ب) قد ينتقل بسرعة من الأعلى إلى الأدنى والعكس صحيح. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات السابقة لمفتاح تبديل اصطناعي أن تبديل الحالة الناجم عن الضوضاء هو حدث نادر [15 ، 34 ، 35]. في التحليل التالي ، نهدف إلى تحديد أصل هذا الاستقرار الاستثنائي.

في نموذج بسيط ، تبديل المونومر فقط (MO) ، توجد البروتينات التنظيمية فقط في شكل أحادي. على الرغم من عدم تضمين إشارة خارجية بشكل صريح ، فإن التقلبات العشوائية في وفرة المكونات الجزيئية للدائرة ستقلب أحيانًا حالة التبديل لنوعي البروتين. بالاعتماد على نتائج تحليلنا لدارات الجينات ذاتية التنظيم الإيجابية ، نفترض أن التقليل في البروتينات التنظيمية لمفتاح التبديل سيعمل على استقرار أدائها ضد الضوضاء. نحن نسمح لمنتجات البروتين لكل جين بتكوين جهاز homodimer ، إما AA أو BB، وهو مشابه لنظام cI-cro في فج λ [36]. يتم تعريف ثابت التفكك للثنائيات على أنها ك1 = ف1/ك1، أين ك1 هو معدل اثنين من المونومرات التي تشكل معقدًا ، و ف1 معدل تفكك المجمع إلى مكونين له.

نقوم بتقييم تأثير ديناميكيات فك الارتباط السريع للبروتين على أداء مفتاح التبديل باستخدام إما (1) المونومرات أو (2) المتجانسات كشكل وظيفي للقمع. يوضح الشكل 5 ، للقيم المختارة لثابت التفكك ك1، سلسلة زمنية تمثيلية لمونومر البروتين (يسار) وديمير (يمين) وفرة لحالة (أ) مونومري أو (ب) عوامل نسخ قاتمة ، على التوالي. يؤكد التحليل الدقيق لمساحة الطور (في ظل وجود ضوضاء) لمجموعة المعلمات التي اخترناها أن أنظمة تبديل التبديل المدروسة تقع في المنطقة ثنائية الاستقرار [37].

عينة سلسلة زمنية لأرقام نسخ المونومر والثنائي في مفتاح التبديل الجيني. (أ) دائرة MTF ، حيث يكون المونومر هو الشكل الوظيفي للمانع. (ب) دارة DTF ، حيث يكون dimer هو الشكل الوظيفي للمانع. يُظهر العمود الأيسر (الأيمن) عدد جزيئي المونومر أ و ب (ثنائيات AA و BB) ، والحالة الأولية دائمًا مع الأنواع أ (أحمر) بكثرة. لاحظ أن تردد التبديل يعتمد على ألفة ربط ثنائيات البروتين.

عندما يكون المونومر هو الشكل الوظيفي لجزيء المكثف (الشكل 5 (أ)) و ك1 كبير (حد من التقارب المنخفض المنخفض) ، تهيمن المونومرات على تجمعات البروتين. ومن ثم ، فإن الدائرة تتصرف بشكل فعال مثل تبديل MO. كما ك1 ينخفض ​​، نرى أن مستوى التبديل العشوائي مكبوت: بشكل مشابه للدائرة الذاتية ، يقوم تجمع dimer بتثبيت تجمع مونومر البروتين. ومع ذلك ، فإن قمع الضوضاء ليس رتيبًا مع زيادة تقارب الربط الخافت. في الواقع ، من أجل تقاربات الربط الكبيرة جدًا (الصغيرة ك1) ، يزداد عدد أحداث التبديل العشوائي نظرًا لأن المونومر متاح فقط بأرقام نسخ منخفضة. وبالتالي ، في هذا الحد ، يصبح من المرجح أن يؤدي التذبذب الصغير في وفرة المونومر إلى حدوث تغيير جذري في ملف تعريف التعبير الجيني العام. ينعكس أيضًا تأثير تثبيت الضجيج الناتج عن تقليل البقع في PSDs المقابلة [ملف إضافي 1]. على سبيل المثال ، نلاحظ قمعًا ملحوظًا لتقلبات التردد المنخفض في وفرة المونومر مع زيادة ك1.

في الشكل 5 (ب) نعرض عينة متسلسلة زمنية مقابلة لحالة المكثف الخافت ، وجميع الخصائص الأخرى هي نفسها كما في (أ). في حين أن الاتجاهات العامة متشابهة ، إلا أننا نلاحظ الاختلاف التالي. على عكس حالة المثبط الأحادي ، هناك عدد قليل جدًا من أحداث التبديل في حد الربط القوي: نظرًا لأن جزيئات الإشارة (ثنائيات) الجين السائد (جين "on") تميل إلى التواجد بأعداد نسخ كبيرة ، فإن التذبذب الكبير هو اللازمة لقلب حالة مفتاح التبديل. في حالة القمع الأحادي ، يوجد جزيء الإشارة بكثرة منخفضة في هذا الحد. وبالتالي ، فإن أنواع البروتين السائدة في نظام المثبط ثنائي الأبعاد قادرة على الحفاظ على تحكم أفضل بكثير في حالة مفتاح التبديل.

في الشكل 6 ، نعرض التوزيع (ن أ- ن ب) ، الاختلاف في وفرة الجزيء لنوعي البروتين في حالة عامل النسخ الأحادي (يسار) والثنائي (الأيمن). عدم التناسق فيما يتعلق بمحور الصفر ناتج عن اختيارنا للظروف الأولية (أنواع البروتين أ في التركيز العالي والأنواع ب بتركيز منخفض) ، وكذلك الطول المحدود للسلسلة الزمنية. بالنسبة للنسخ الأحادي ، فإن وجود ثنائيات ذات تقارب ربط معتدل يزيد من حدة توزيع وفرة المونومر مع إبراز طابعه ثنائي النسق. هذا يتفق مع الملاحظة النوعية من الشكل 5 على تبديل الاستقرار. بالنسبة للنسخ الخافت ، نلاحظ بوضوح أن تناظر النظام مكسور لقيم صغيرة لـ ك1، مما يشير إلى أن حالة مفتاح التبديل مستقرة للغاية ، وبالتالي من المحتمل أن يتم تحديدها من خلال اختيار الظروف الأولية.

توزيع فروق وفرة المونومر بين أنواع البروتين أ و ب. يرجع عدم التناسق فيما يتعلق بمحور الصفر إلى اختيار الحالة الأولية (الأنواع أ عالية) والمدى الزمني المحدود لعمليات المحاكاة.

لتقدير ملاحظاتنا بشكل منهجي على التفاعل بين تقارب الربط الثنائي والثبات الوظيفي لمفتاح التبديل ، أنشأنا سلسلة زمنية طويلة (≈3 · 10 7 ثوانٍ) لقياس متوسط ​​معدل التبديل التلقائي. في الشكل 7 ، نعرض متوسط ​​تردد التبديل بالنسبة إلى تردد تبديل MO من أجل تقاربات الربط ك1/ نانومتر = <2 ، 20 ، 100 ، 1000> ، ومتوسط ​​معدل تبديل MO هو 7.5 × 10 -6 / ساعة. كما هو متوقع ، نجد تلك القيم الوسيطة لـ ك1 قادرون على تثبيت مفتاح التبديل. يبرز الشكل 7 أيضًا الاستقرار المتزايد لمفتاح التبديل لعامل نسخ خافت مقابل عامل نسخ أحادي ، حيث تكون معدلات التبديل القاتمة دائمًا أقل وتقترب من الصفر لربط ثنائي قوي.

معدلات التحويل العشوائية لمفاتيح التبديل الجينية. الترتيب هو نسبة معدلات التبديل العشوائية لمفاتيح التبديل المختلفة إلى تلك الخاصة بدائرة المونومر فقط (MO) ، 7.5 × 10 -6 / ساعة. MTF ، عامل النسخ الأحادي DTF ، عامل النسخ الثنائى Het-MTF ، عامل النسخ الأحادي مع حالة مغاير غير نشط.

التغاير في التبديل الوراثي

لقد نظرنا أيضًا في حالة التغاير في مفتاح التبديل ، نظرًا لأن الضوضاء - والاستقرار الوظيفي للمفتاح قد يتأثران بشكل مباشر بتكوين ومصدر الثنائيات. لاحظ أن نشاط تنظيم الجينات يمنحه بروتينات المونومر أ و ب وليس مغاير AB. ومع ذلك ، نجد أن وجود مغاير غير متجانسة (غير نشطة) يؤدي إلى تأثيرات مثبِّتة للضوضاء مشابهة جدًا لتأثيرات المثليين (الشكل 7). في الواقع ، يسمح وجود حالة heterodimer لأنواع البروتين السائدة بقمع المونومرات (النشطة) لأنواع الأقليات بشكل فعال. وبالتالي ، تُظهر دائرة المغير المتغاير استقرارًا وظيفيًا محسّنًا بشكل كبير مقارنة بحالة المثبطات المتجانسة ، ولا تشارك الضعف الذي تمت مناقشته لدائرة MO للضوضاء الجوهرية. على الرغم من أن هذا ، على حد علمنا ، هو تصميم تبديل افتراضي بحت ، إلا أنه يوفر استراتيجية عامة للتحكم في الضوضاء في دوائر الجينات الاصطناعية ، جنبًا إلى جنب مع النهج المقترح سابقًا لتداخل المجالات التنظيمية الأولية [38].


في السنوات الأخيرة ، حقق تصميم البروتين القابل للذوبان نجاحات مثل الإنزيمات الاصطناعية وأقفاص البروتين الكبيرة. تمثل بروتينات الغشاء تحديًا كبيرًا في التصميم ، ولكن هنا أيضًا حدثت تطورات ، بما في ذلك تصميم رباعي نقل الزنك. لو وآخرون. الإبلاغ عن تصميم المونومرات الغشائية المستقرة ، والمنسوجات المتجانسة ، والقواطع ، والرباعية مع ما يصل إلى ثماني مناطق ممتدة للأغشية في أوليغومر. اعتمدت البروتينات المصممة حالة قلة القلة المستهدفة ومترجمة إلى الأغشية الخلوية المتوقعة ، وعكست الهياكل البلورية للديمر والرباعي المصمم نماذج التصميم.

لا يزال التصميم الحسابي لبروتينات الغشاء مع أكثر من منطقة ممتدة للغشاء يمثل تحديًا كبيرًا. أبلغنا عن تصميم المونومرات الغشائية ، المتجانسات ، المشذبات ، ورباعي الأبعاد مع 76 إلى 215 وحدة فرعية متبقية تحتوي على منطقتين إلى أربع مناطق ممتدة للأغشية وما يصل إلى 860 من البقايا الكلية التي تتبنى حالة القلة المستهدفة في محلول المنظف. تتمركز البروتينات المصممة في غشاء البلازما في البكتيريا وفي خلايا الثدييات ، وتشير التجارب التي تتكشف عن الملقط المغناطيسي في الغشاء إلى أنها مستقرة جدًا. الهياكل البلورية للديمر والرباعي المصممين - هيكل على شكل صاروخ مع قاعدة سيتوبلازمية عريضة تنتقل إلى ثمانية حلزونات غشائية - قريبة جدًا من نماذج التصميم. تمهد نتائجنا الطريق لتصميم بروتينات غشائية متعددة الامتدادات بوظائف جديدة.

في السنوات الأخيرة ، أصبح من الممكن تصميم de novo ، بدقة عالية ، هياكل بروتين قابلة للذوبان تتراوح من الببتيدات المقيدة القصيرة إلى أقفاص البروتين الضخمة (1). كانت هناك أيضًا تطورات في تصميم البروتين الغشائي ، كما يتضح من رباعي الببتيد الغشائي الأنيق الذي ينقل الزنك المسمى Rocker (2) و oligomer هندسيًا موصلًا للأيونات على أساس مقطع الغشاء الطرفي C (TM) من الإشريكية القولونية ناقلة السكاريد Wza (3). كلاهما عبارة عن غشاء واحد - يمتد على الببتيدات المركبة مع أقل من 36 وحدة بنائية. كان من الممكن أيضًا تصميم وتأكيد طوبولوجيا الغشاء لبروتينات الغشاء متعدد الكتلة باستخدام تسلسل بسيط للكارهة للماء والنماذج القائمة على الشحن (4) ، ولكن إلى أي مدى تتراكم حلزونات الغشاء مع بعضها البعض غير واضح. ظل تصميم البروتينات الغشائية متعددة الكتلة المحددة هيكليًا يمثل تحديًا كبيرًا بسبب الصعوبة في تحديد البنية داخل الغشاء وفي التحديد التجريبي لهياكل البروتين الغشائية عمومًا ، لم يتم بعد حتى الآن ، لا توجد تركيبات بلورية لبروتينات غشاء متعددة الكتلة مصممة من نوع de novo.

ينبع التحدي الرئيسي لتصميم البروتين الغشائي من تشابه بيئة الغشاء مع النوى البروتينية الكارهة للماء. في تصميم البروتينات القابلة للذوبان ، يمكن تحديد الهيكل الثانوي والطوبولوجيا الكلية من خلال نمط المخلفات الكارهة للماء والماء ، مع الأول داخل البروتين والأخير بالخارج ، يواجه المذيب. لا يمكن استخدام مبدأ التصميم الأساسي هذا لبروتينات الغشاء لأن البيئة القطبية للنواة الهيدروكربونية للطبقة الدهنية الثنائية تتطلب أن تكون البقايا المواجهة للخارج في الغشاء غير قطبية أيضًا. ثبت أن الروابط الهيدروجينية المدفونة بين السلاسل الجانبية القطبية تلعب دورًا مهمًا في ارتباط الببتيدات الحلزونية داخل الغشاء ، والتغلب على الانحطاط في التفاعلات غير القطبية (57).

استنتجنا أن طريقة تم تطويرها مؤخرًا لتصميم شبكات الروابط الهيدروجينية المدفونة (8) يمكن أن تسمح بتحديد تفاعلات الحشو لولبيات الغشاء في بروتينات الغشاء متعددة الكتلة. اكتشفنا أولاً تصميم بروتينات الغشاء الحلزوني بأربعة TMs - ثنائيات من 76- إلى 104 دبابيس شعر متخلفة أو تصميم سلسلة واحدة من 156 وحدة بنائية - مع مناطق ممتدة كارهة للماء تتراوح من 21 إلى 35 (الشكلان 1 أ و 2 أ) ، إعادة تعيين الغرض شبكات روابط الهيدروجين المحتوية على Ser- و Gln في ثنائى حلزون رباعي قابل للذوبان مصمم مع تناظر C2 [2L4HC2_23 معرف بنك بيانات البروتين (PDB) 5J0K] (8) لتوفير الخصوصية الهيكلية. تم إنتاج حزم أربع حلزون بأطوال مختلفة مع هندسة العمود الفقري القادرة على استضافة هذه الشبكات باستخدام معادلات توليد حدودي (9) ، تم إدخال المخلفات التي تشتمل على شبكات رابطة الهيدروجين وبقايا التعبئة المجاورة ، وتم تحسين باقي التسلسل باستخدام Rosetta Monte Carlo (10) حسابات التصميم للحصول على متواليات منخفضة الطاقة. تم بناء حلقات ربط بين الحلزونات باستخدام رشيد. لتحديد اتجاه التصاميم (11) في الغشاء عند التعبير عنه في الخلايا ، عند حدود الماء الدهني المصمم على الجانب خارج الخلوي / محيط البلازمية ، قمنا بدمج حلقة من المخلفات العطرية الأمفيباثية ، وفي حدود الماء الدهني على الجانب السيتوبلازمي ، حلقة من البقايا الموجبة الشحنة (الشكلان 1 أ و 2 أ). بين هاتين الحلقتين ، تتعرض بقايا السطح لبيئة الغشاء الكارهة للماء ، وقد اقتصرت هذه المواضع في حسابات تصميم تسلسل Rosetta على الأحماض الأمينية الكارهة للماء (المواد التكميلية). تمشيا مع التصميم ، تتوقع TMHMM أن تصميمات dimer تحتوي على 2 TMs وتصميم أحادي السلسلة (scTMHC2) يحتوي على 4 TMs (الشكل S1). في المتوسط ​​، لكل بقايا

68٪ من مساحة سطح السلسلة الجانبية مدفونة في نماذج التصميم ، والتي يمكن أن توفر استقرارًا جوهريًا لـ Van der Waals (12).

(أ و ب) من اليسار إلى اليمين ، تصميمات وبيانات لـ TMHC2 (دبوس الشعر عبر الغشاء C2) ، TMHC2_E (ممدود) ، TMHC2_L (مدى طويل) ، و TMHC2_S (فترة قصيرة). (أ) تصميم نماذج مع مناطق داخل وخارج الغشاء بأطوال مختلفة. تحدد الخطوط الأفقية مناطق الغشاء الكارهة للماء. توجد المخططات الشريطية على اليسار ، والأسطح الكهروستاتيكية على اليمين ، ومناطق الغشاء المحايدة باللون الرمادي. (ب) صور مجهرية متحد البؤر لخلايا HEK293T المنقولة بواسطة TMHC2 مدمجة في mTagBFP ، و TMHC2_E مدمجة في mTagBFP ، و TMHC2_L مدمجة في mCherry ، و TMHC2_S مدمجة في بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. تُظهر عمليات مسح الخط (الخطوط الصفراء) عبر الأغشية زيادة كبيرة في التألق عبر أغشية البلازما لـ TMHC2 و TMHC2_E و TMHC2_L ، ولكن زيادة أقل جوهرية لـ TMHC2_S. (ج) منحنيات توازن الترسيب التمثيلية للجامعة الأمريكية بالقاهرة عند ثلاث سرعات مختلفة للدوار. كل مجموعة بيانات مناسبة عالميًا كنوع واحد مثالي في محلول يتوافق مع الوزن الجزيئي للثنائي. يشير "MW (D)" و "MW (E)" إلى الوزن الجزيئي لتصميم أوليغومر والذي تم تحديده من التجربة ، على التوالي. (د) أطياف القرص المضغوط و (أقحم) تذوب درجة الحرارة. لم تلاحظ أي انتقالات تتكشف ظاهرة حتى 95 درجة مئوية.

(أ) نموذج تصميم (يسار) وسطح إلكتروستاتيكي (يمين) لـ scTMHC2. يتم تلوين دبابيس الشعر الحلزونية N و C- باللون الأخضر والأزرق على التوالي. تشير الأرقام إلى ترتيب ذاكرات الترجمة الأربعة في التسلسل. الرابط الذي يربط بين دبابيس الشعر ملون باللون الأرجواني. أجريت تجارب الكشف القسري أحادية الجزيء عن طريق تطبيق التوتر الميكانيكي على النهايتين N و C من scTMHC2 واحد (الشكل S5). (ب) أطياف القرص المضغوط لـ scTMHC2 في درجات حرارة مختلفة. لم يلاحظ أي انتقال يتكشف حتى 95 درجة مئوية. (ج) آثار تمديد القوة أحادية الجزيء لـ scTMHC2. تتم الإشارة إلى التحولات المتكشفة وإعادة الطي بالسهام الحمراء والزرقاء. (د) تم الحصول على منظر طبيعي للطاقة من تجارب الجزيء الواحد. ن, أنا، و يو تشير إلى الحالة الأصلية والمتوسطة والمتكشفة ، على التوالي.

تم الحصول على الجينات الاصطناعية التي ترميز التصميمات وتم التعبير عن البروتينات في بكتريا قولونية وخلايا الثدييات. كان تصميم dimer مع أقصر فترة كارهة للماء (15 وحدة بنائية TMHC2_S) يتصرف بشكل سيئ في كليهما. بكتريا قولونية وخلايا الثدييات ، ولكن التصميمات باهتة ذات الامتدادات الأطول - TMHC2 و TMHC2_E و TMHC2_L - المترجمة إلى غشاء الخلية عند التعبير عنها في خلايا 293T من الكلية الجنينية البشرية (HEK) (الشكل 1 ب) وفي بكتريا قولونية. تمت تنقية البروتينات المصممة عن طريق استخراج بكتريا قولونية جزء الغشاء مع المنظف ، متبوعًا بالكروماتوجرافيا بحمض النيكل-نيتريلوترياسيتيك (NTA) وكروماتوجرافيا استبعاد الحجم (SEC) مع ناتج

2 مجم / لتر (الشكل S2 و A و B). تمت إزالة البروتينات المصممة TMHC2 و TMHC2_E و TMHC2_L على شكل قمم مفردة في SEC ، وفي تجارب الطرد المركزي التحليلي الفائق (AUC) في محلول المنظفات ، ترسبت البروتينات على شكل ثنائيات ، وهو ما يتوافق مع نماذج التصميم (الشكل 1C والشكل S3) . بالنسبة إلى سلسلة scTMHC2 أحادية السلسلة ، كانت الأنواع الرئيسية في SEC هي المونومر ، مع ذروة جانبية صغيرة تمت إزالتها بسهولة عن طريق التنقية (الشكل S2B). أظهرت قياسات ازدواج اللون الدائري (CD) أن التصميمات كانت حلزونية ألفا ومستقرة بدرجة حرارة عالية ، وكانت أطياف القرص المضغوط عند 95 درجة مئوية مماثلة لتلك الموجودة عند 25 درجة مئوية (الشكلان 1 د و 2 ب). فحوصات TOXCAT-β − lactamase (TβL) (13) ، أي زوجين بكتريا قولونية يشير البقاء على قيد الحياة إلى قلة القلة والتوجيه الصحيح لعلامات مقاومة المضادات الحيوية المندمجة على النهايتين N و C إلى أن النهايتين N و C لـ TMHC2 موجودة في السيتوبلازم ، كما هو الحال في نماذج التصميم (الشكل S4).

لقد وصفنا من الناحية الكمية استقرار الطي لـ scTMHC2 باستخدام تجارب الكشف القسري أحادية الجزيء (الشكل 2) (14, 15). تم ربط البروتين المصمم المعاد تكوينه في bicelle بشكل تساهمي بحبة مغناطيسية وسطح زجاجي من خلال طرفيه N و C (الشكل 2A والشكل S5). تم تحديد المسافة بين الحبة والسطح كدالة للتوتر الميكانيكي المطبق. في تجارب تتكشف مع زيادة القوة ببطء (

0.5 pN / s) ، لوحظت تحولات تتكشف في

18 pN ، وعند إزالة القوة ، لوحظت انتقالات انعكاسية في

9 pN (80.1٪ من آثار الكشف المسجلة كان لها انتقالات تتكشف بخطوة واحدة ، و 84.6٪ من انتقالات الانكسار كان لها خطوتان) (الشكل 2C والشكلان S6 و S7). تمشيا مع التناظر الداخلي لتصميم السلسلة الواحدة (الشكل 2 أ والشكل S5) ، كان حجم خطوات إعادة الطي متشابهين للغاية (الشكل S8). يتماشى عدم التناسق الذي يتكشف وينعكس مع مشهد الطاقة الحرة المكون من ثلاث حالات: الدولة الأصلية (ن) ، حالة وسيطة تحتوي على دبوس شعر واحد فقط (أنا) وحالة مكشوفة (يو) (الشكل S9). أثناء الانكشاف بقوة عالية ، يتم ملاحظة الحاجز بين الحالة الأصلية والحالة الوسيطة فقط ، بينما عند القوى المنخفضة التي يحدث فيها الانكسار ، يصبح كل من حواجز الطاقة بارزين (شكل S9). تم تحديد معدلات الانتقال بين الحالات المطوية والوسيطة وغير المطوية باستخدام نموذج بيل (16) ، مما ينتج عنه الطاقات الحرة النسبية للحالات وارتفاعات الحاجز المرتبطة بها (الشكل 2D والشكل S10) (14). يبلغ الثبات الديناميكي الحراري الكلي لـ scTMHC2 7.8 (± 0.9) كيلو كالوري / مول على أساس الحلزون عبر الغشاء ، وهو أكثر استقرارًا من بروتينات الغشاء الحلزوني التي تحدث بشكل طبيعي والتي تمت دراستها حتى الآن [الطاقة الحرة القابلة للطي لكل حلزون لـ scTMHC2 هي 2.0 (± 0.2) kcal / (mol helix) مقارنة بـ 0.7 إلى 0.9 kcal / (mol helix) لـ GlpG (14, 17) و 1.6 إلى 1.8 كيلو كالوري / (مول لولب) لجرثومة البكتيرية (18) تقديرات الخطأ بين قوسين تنتشر من الأخطاء المعيارية لقياسات الخواص الحركية].

قمنا بتنفيذ شاشات الكريستال في المنظفات المختلفة لكل تصميم وحصلنا على بلورات التصميم مع المنطقة السيتوبلازمية الأكثر شمولاً ، TMHC2_E ، في ن- نونيل- β- د -جلوكوبيرانوسيد (NG). انحرفت البلورات إلى دقة 2.95-Å ، وقمنا بحل الهيكل عن طريق الاستبدال الجزيئي بنموذج التصميم.كما هو متوقع ، فإن المنطقة القابلة للذوبان الممتدة تتوسط الحشو الشبكي البلوري ، وهناك قنوات مذيبات كبيرة حول TMs المصممة على الأرجح بسبب جزيئات المنظفات المضطربة المحيطة (الشكل 3 أ). تحتوي كل وحدة غير متناظرة على أربعة دبابيس شعر حلزونية: يتم إقران اثنين في ثنائي ، بينما يشكل الاثنان الآخران ثنائيات C2 من خلال التناظر البلوري مع اثنين من المونومرات في وحدات غير متماثلة متجاورة. يتم محاذاة محور C2 في التصميم تمامًا مع الشكل البلوري المزدوج (الشكل 3 ب). مطابقة الثنائيات في الوحدات البيولوجية الثلاث متطابقة تقريبًا ، مع وجود اختلافات صغيرة جدًا بسبب التعبئة البلورية [انحرافات جذر متوسط ​​التربيع Cα (RMSDs) ، 0.60 إلى 0.84 Å] (الشكل S11). كل من الهيكل العام والتعبئة الأساسية من السلسلة الجانبية متطابقان تقريبًا في الهيكل البلوري ونموذج التصميم ، مع Cα RMSD يبلغ 0.7 فوق المخلفات الأساسية (الشكل 3C). اثنتان من بقايا الروابط الهيدروجينية الثلاثة المدفونة داخل الغشاء لهما مطابقة تطابق تمامًا نموذج التصميم (S13 و Q93) ، لكن Q17 يتبنى دوارًا مختلفًا ، حيث يتبرع النيتروجين من السلسلة الجانبية برابطة هيدروجينية لأكسجين الكربونيل الرئيسي (الشكل ثلاثي الأبعاد).

(أ و ب) الكريستال شعرية التعبئة. (أ) تتوسط المنطقة القابلة للذوبان الممتدة جزءًا كبيرًا من العبوة الشبكية البلورية. تم تلوين دبابيس الشعر الحلزونية الأربعة في الوحدة غير المتماثلة باللون الأخضر والرمادي والأصفر والأزرق على التوالي. تشكل TMs ، في اللون الأرجواني ، طبقات في البلورة تفصل المناطق القابلة للذوبان. (ب) يتماشى محور C2 للتصميم مع التخطيط البلوري ذو شقين. يتم إقران اثنين من المونومرات (الرمادي والأصفر) في ثنائى ، في حين أن الاثنين الآخرين (الأخضر والأزرق) يشكلان ثنائيات C2 مع اثنين من المونومرات المتجاورة البلورية. يظهر مخطط مجموعة الفضاء (C121) في الخلفية. (ج) تراكب الهيكل البلوري TMHC2_E ونموذج التصميم (RMSD = 0.7 Å فوق ذرات Cα الأساسية). (د) ترتيبات الحشو ذات السلسلة الجانبية عند الطبقات [(C) ، المربعات الملونة] عند أعماق مختلفة في الغشاء متطابقة تقريبًا مع نموذج التصميم.

استخدمنا نهجًا مشابهًا لتصميم قاطع الغشاء بستة حلزونات ممتدة للغشاء (TMHC3) استنادًا إلى سقالة 5L6HC3_1 (معرف PDB 5IZS) (8). مسترشدين بالنتائج مع تصميمات C2 ، اخترنا مدى كاره للماء من

30 Å (20 وحدة بنائية) (الشكل 4 أ). تم التعبير عن التصميم في بكتريا قولونية وتنقيته حتى التجانس ، تتم التصفية التتابعية على عمود ترشيح الهلام كنوع واحد متجانس (الشكل S2C). أظهرت قياسات القرص المضغوط أن TMHC3 كان مستقرًا للحرارة بدرجة عالية ، مع الحفاظ على هيكل حلزوني ألفا عند 95 درجة مئوية (الشكل 4 ب). أظهرت تجارب الجامعة الأمريكية بالقاهرة أن TMHC3 عبارة عن أداة تشذيب في محلول المنظف ، وهو ما يتوافق مع نموذج التصميم (الشكل 4C والشكل S12A).

(أ) نموذج قاطع الغشاء المصمم TMHC3 بستة حلزونات غشائية. يظهر تمثيل العصا من الجانب المحيطي (يسار) وعرض السطح الجانبي (يمين). (ب) توصيف القرص المضغوط لـ TMHC3. التصميم مستقر حتى 95 درجة مئوية. (ج) منحنيات توازن الترسيب التمثيلية للجامعة الأمريكية بالقاهرة عند ثلاث سرعات دوارة مختلفة لـ TMHC3. تناسب البيانات نوعًا مثاليًا واحدًا في محلول بوزن جزيئي قريب من وزن أداة التشذيب المصممة. (د) نموذج رباعي الغشاء المصمم TMHC4_R بثمانية حلزونات غشائية. يتم تلوين البروتومرات الأربعة باللون الأخضر والأصفر والأرجواني والأزرق على التوالي. (ه) منحنيات توازن الترسيب بالجامعة الأمريكية بالقاهرة عند ثلاث سرعات دوار مختلفة لـ TMHC4_R تتناسب جيدًا مع نوع واحد ، بوزن جزيئي مُقاس يبلغ

94 كيلو دالتون (F) الهيكل البلوري لـ TMHC4_R. هيكل رباعي الأسطوانات الكلي مشابه جدًا لنموذج التصميم ، بجسم حزمة حلزوني وزعانف تكرار حلزونية. تميل الحلزونات الخارجية لدبابيس الشعر عبر الغشاء بعيدًا عن المحور

10°. (جي) المقطع العرضي من خلال الهيكل البلوري TMHC4_R والسطح الكهروستاتيكي. يشكل HRD وعاءًا في قاعدة الهيكل العام بعمق

20. يشار إلى منطقة الغشاء في سطور. (ح) ثلاث مناظر لتراكب العمود الفقري للهيكل البلوري TMHC4_R ونموذج التصميم.

لاستكشاف قدرتنا على تصميم بروتينات غشائية ذات طوبولوجيا أكثر تعقيدًا ، قمنا بتصميم رباعي C4 مع منطقة ذات غشاء حلزوني ثنائي الحلقات تتكون من ثمانية TMs ومجال حشوي ممتد على شكل وعاء يتكون من تكرار الهياكل المنبثقة بعيدًا عن التناظر المحور (الشكل 4 د). التصميم له شكل صاروخ شامل ، بارتفاع

100 Å ، ويمكن تقسيمها إلى ثلاث مناطق: مجال الحزمة الحلزونية (HBD) ، ومجال التكرار الحلزوني (HRD) ، والرابط الحلزوني بين الاثنين. تم اشتقاق HBD المركزي من التصميم القابل للذوبان 5L8HC4_6 (8) ، وتم اشتقاق الوعاء من بروتين homo-oligomer المتكرر الحلزوني المصمم (tpr1C4_2) (19). تم إنشاء الوصلات الحلزونية باستخدام RosettaRemodel (20) تم العثور على تقاطع تسعة بقايا لإنتاج السجل الحلزوني الصحيح (الشكل S13). بعد حسابات تصميم تسلسل Rosetta ، تم تصنيع الجين الذي يشفر تصميم الطاقة الأقل ، TMHC4_R. تم التعبير عن البروتين في بكتريا قولونية وتم تنقيته باستخدام تقارب النيكل وكروماتوجرافيا الترشيح الهلامي كان الناتج النهائي

3 ملجم / لتر ، والبروتين المنقى كروماتوجراف كذروة أحادية الانتشار في SEC (الشكل S2C). أظهرت تجارب القرص المضغوط أن التصميم كان حلزونيًا ألفا وقابل للحرارة حتى 95 درجة مئوية (شكل S12B). أظهرت قياسات AUC أن TMHC4_R عبارة عن رباعي في محلول المنظف ، وهو ما يتوافق مع نموذج التصميم (الشكل 4E والشكل S12C). بعد جهد منظم لفحص المنظفات بحثًا عن التبلور ، حصلنا على بلورات في مزيج من ن-decyl-β- d -maltopyranoside (DM) و NG في المجموعة الفضائية P4 التي انحرفت إلى دقة 3.9 Å. قمنا بحل التركيب البلوري عن طريق الاستبدال الجزيئي باستخدام نموذج التصميم (رالشغل/رمجانا = 0.29 / 0.32 ، مع كثافة إلكترون لا لبس فيها) (الجدول S1 والشكل S14). تكون الحشوة الشبكية البلورية في المقام الأول بين المجالات السيتوبلازمية الممتدة ، وقد تكون هناك تفاعلات طفيفة بوساطة المنظفات بين نطاقات الغشاء والتكرار الحلزوني (HR) أيضًا (الشكل S15).

على الرغم من أن الدقة غير كافية لتقييم تفاصيل عبوة السلسلة الجانبية ، إلا أنها تسمح بإجراء مقارنات على مستوى العمود الفقري. هناك أربعة مونومرات TMHC4_R في وحدة واحدة غير متماثلة ، مع هياكل متطابقة تقريبًا (Cα RMSDs بين 0.2 و 0.6) (الشكل S16A). تتراوح قيم Cα RMSD بين الهيكل ونموذج التصميم من 1.2 إلى 1.8 لحلزونات الغشاء المونومر ، و 0.3 إلى 0.4 للوصلات ، و 1.1 إلى 1.5 لمجالات الموارد البشرية ، و 3.3 إلى 3.6 للهيكل العام (الشكل S16B ). كما في حالة تصميم C2 ، يتطابق محور التناظر C4 للتصميم مع المحاور البلورية للشبكة البلورية (الشكل S16C). تحتوي الهياكل الرباعية الأربعة على محاور C4 البلورية على هياكل عامة متشابهة جدًا مع بعضها البعض ونموذج التصميم (الشكل 4 ، F و G ، والشكل S16A) ، ومجال الغشاء الرباعي ، ومجال الموارد البشرية ، والهيكل الرباعي الكلي لها Cα RMSDs لنموذج التصميم من 1.3 إلى 1.5 ، ومن 3.3 إلى 3.8 ، ومن 3.3 إلى 3.8 ، على التوالي (الشكل 4H والشكل S16D ، على اليسار). قد ينتج الانحراف في مجال الموارد البشرية عن تفاعلات الحشو البلورية بين الأطراف Cα RMSDs على أول 162 وحدة بنائية تتراوح من 2.2 إلى 2.3 (الشكل S16D ، يمين). الانحراف الرئيسي عن نموذج التصميم هو إمالة الحلزونات الخارجية لدبابيس الشعر عبر الغشاء من المحور بواسطة

يوضح الاتفاق بين الهياكل البلورية لـ TMHC2_E و TMHC4_R مع نماذج التصميم أن أوليغومرات متجانسة الغشاء تحتوي على مناطق غشائية متعددة ومجالات واسعة خارج الخلية يمكن تصميمها بدقة. بالنسبة إلى العمل المستقبلي ، فإن النهج العام المتمثل في تصميم وتوصيف شبكة الروابط الهيدروجينية أولاً - التي تحتوي على إصدارات قابلة للذوبان من الهياكل الغشائية المرغوبة ، ثم التحويل إلى بروتينات غشائية متكاملة عن طريق إعادة تصميم المخلفات المعرضة للغشاء ، يمكن أن تكون قوية جدًا. تُظهر تجارب الكشف القسري والتشويه الحراري لجزيء واحد أن البروتينات المصممة مستقرة للغاية. على الرغم من أن التصميمات تفتقر إلى التعبئة الكلاسيكية للبقايا الصغيرة في اللب والتي يُعتقد أنها محرك مهم لطي بروتين الغشاء (2124) ، مثل بروتينات الغشاء الطبيعي ، فإنها تدفن مساحة سطح أكبر من البروتينات القابلة للذوبان النموذجية ، مما يزيد من مساهمات فان دير فالس (12). نطاق ميزات التصميم - أطوال الحلزون المتغيرة عبر الغشاء وخارجه والالتواءات الفائقة الحلزونية ، والمجالات القابلة للذوبان واسعة النطاق ، والحالات قليلة القسيمات المتنوعة - هي خطوات جوهرية نحو تعقيد بروتينات الغشاء الطبيعي مع مناطق متعددة تغطي الغشاء ومجالات غشائية خارجية تلعب دورًا مهمًا الأدوار في التعرف على الترابط / الركيزة وتثبيت الهيكل ، كما هو الحال في ناقلات الكاسيت المرتبطة بالأدينوسين 5′-ثلاثي الفوسفات ، والقنوات الأيونية ، ومستقبلات الريانودين ، و γ-secretase (25, 26). إن القدرة على تصميم بروتينات الغشاء متعدد الكتلة المعقدة بدقة والتي يمكن التعبير عنها في الخلايا تفتح الباب أمام تصميم جيل جديد من هياكل ووظائف البروتين الغشائي متعدد الكتلة.


مناقشة

تحتوي جزيئات الفيروس على شكلين على الأقل: الأشكال المعدية المنتقلة ، وعند دخول الخلية ، حالات الطاقة الحرة المنخفضة التي يتم الوصول إليها لتحرير الجينومات الفيروسية. في الفيروسات المغلفة ، تخضع كل من بروتينات الاندماج الموجودة على السطح الخارجي للفيريونات والطبقات الهيكلية أسفل الغلاف الفيروسي لتحولات هيكلية أثناء دخول الخلية ، وغالبًا ما يتم التوسط من خلال انخفاض درجة الحموضة في الجسيم الداخلي الذي تدخل من خلاله. توجد سابقة واسعة النطاق لطي البروتينات الهيكلية الفيروسية المنقاة إلى هياكل مشابهة لتلك الموجودة في الأشكال منخفضة الأس الهيدروجيني في فيريونات سليمة ، كما هو الحال في الهياكل المعروفة للهيماجلوتينين الإنفلونزا (تمت مراجعتها في [24]).

تحتوي جسيمات IAV المعدية على طبقة واحدة من M1 تحت الغلاف الفيروسي. يؤدي تعطيل هذه الفيروسات المعدية إلى تكوين تجمعات M1 التي تظهر بواسطة EM على شكل أسطوانات مجوفة ذات قذائف متعددة الطبقات [6،7،25-30]. هنا ، نوضح أنه في المحلول ، فإن بروتين WT-M1 المنقى من الفيروسات أو المعبر عنه بشكل متجانس يشكل أوليغومرات ذات قوة أيونية عالية تذكرنا بشدة بهذه الهياكل المنهارة (الشكل 1). تم استخدام القوة الأيونية العالية على نطاق واسع في قلة البروتينات القفيصة الفيروسية مثل تلك الخاصة بفيروس نقص المناعة البشرية وفيروس التهاب الكبد B بسبب تأثيرها في تحييد الشحنات بين وحدات البروتين الفرعية [31،32].

تعرض هذه الأسطوانات متعددة الطبقات من M1 ، سواء تم تجميعها في محلول أو في فيريونات معطلة ، أقطار داخلية وخارجية تبلغ حوالي 200 و 500 ، على التوالي ، وسمك جزيئي لكل منعطف حلزوني يبلغ 110 (الشكل 7 ، الجدول 1) [6] . تم تشكيل هياكل مماثلة بواسطة المؤتلف M1 ، سواء تم التعبير عنه من IAVs كروية أو خيطية. وبالتالي ، فإن تكوين أوليغومرات متعددة الطبقات هي سمة محفوظة لـ M1 المنقى والتي تكون مستقلة عن دورها في مورفولوجيا الفيروسات. هنا ، قمنا بتحليل الهياكل التي شكلتها WT-M1 ، والتي تُظهر تشابهًا مشابهًا لتلك الموجودة في الفيروسات المعطلة ، و M1-V97K ، والتي تشبه إلى حد كبير بنية M1 القلة الموجودة في الفيروسات المعدية.

(أ) أثناء تكوين الفيريون ، يتجمع M1 في طبقة مصفوفة غير مستقرة متصلة بالمغلف الفيروسي. (ب) نفترض أن أوليغومرات M1-V97K تحاكي طبقة المصفوفة التي لوحظت في الفيروسات السليمة. (C ، D) داخل أوليغومر M1-V97K ، تتفاعل بروتينات المصفوفة عبر واجهة dimer المكدسة بينما تكون CTDs و NTDs على اتصال وثيق ، كما هو موضح بالروابط المتقاطعة باللونين الأحمر والأخضر. تواجه بقايا K97 ، التي تظهر على شكل نجوم صفراء ، الجزء الخارجي من الأنبوب. تحول طفرة V97K داخل أوليغومرات M1-V97K والتفاعلات مع الغشاء الفيروسي في فيريونات سليمة تمنع إضافة طبقات M1 جديدة. (هـ) داخل الجسيم الداخلي ، يحول المشغل طبقة المصفوفة إلى مصفوفة متعددة الطبقات. (F) نفترض أن أوليغومرات متعددة الطبقات تم تجميعها من WT-M1 تحاكي أوليغومرات الموجودة في الفيروسات المعطلة. (G) داخل أوليجومرات WT-M1 ، يمكن أن تحدث زيادة في درجة الصوت الحلزونية إلى 111 Å بسبب التغييرات المطابقة لـ CTD ، والتي يُشار إليها بفقدان الروابط المتقاطعة الحمراء. تسمح الواجهات الجديدة في منطقة interstrand ومن خلال تعطيل التفاعلات مع الغلاف الفيروسي بإضافة طبقات جديدة من بروتين المصفوفة. CTD ، المجال الطرفي C M1 ، بروتين المصفوفة 1 NTD ، المجال الطرفي N WT-M1 ، الطول الكامل PR8 M1.

تمت ملاحظة ثلاث مجموعات مختلفة من جهات الاتصال بين الجزيئات بين NTD M1 في الهياكل البلورية السابقة: واجهة تناظر C2 ، وواجهة مكدسة متعدية ، وواجهة جانبية متعدية (S1 الشكل). نوضح هنا أن العديد من الطفرات في هذه الواجهة المكدسة تمنع تشكيل أي هياكل ذات ترتيب أعلى يمكن اكتشافها (الشكل 3) ، بحجة أن هذه الواجهة المحددة مسبقًا مطلوبة من أجل قلة القلة M1 ، على الرغم من أن NTD وحدها لا تتضخم بسهولة (الشكل 1) . من ناحية أخرى ، أدى تعطيل الاتصالات الجانبية أو المتناظرة المحتملة بواسطة طفرة V97K إلى تكوين أوليغومرات رقيقة أحادية الطبقة تذكرنا بطبقات المصفوفة التي لوحظت في الفيروسات المعدية السليمة (الشكل 3). سمح لنا انتظام مجموعات M1-V97K بتحديد هيكلها ثلاثي الأبعاد بدقة 3.4 Å بواسطة cryo-EM (الشكل 5 والشكل 6).

الكل في الكل ، يُنظر إليه على أنه لبنة واحدة في جدار أوليغومر V97K ، يعرض كل مونومر M1 الحافة التي تحتوي على متحولة V97K على السطح الخارجي موجب الشحنة. تتوافق أبعاد مونومرات M1 (35 في 65 S10 الشكل) مع تحليلات EM السابقة للبقعة السلبية لطبقة المصفوفة في فيريونات سليمة [10،30]. يعرض كل منعطف لهذا الجدار الحلزوني خطوة 42 ، بالاتفاق مع تحليلات cryo-EM السابقة لطبقات المصفوفة داخل virions (الجدول 1) [6]. يُظهر هيكل M1-V97K ، بالتفصيل الجزيئي ، الواجهة المكدسة لـ NTD التي تسمح بتعبئة محكم للخيوط الحلزونية (الشكل 6). من المفترض أنه بسبب تعطلها بسبب طفرة V97K ، لم يتم ملاحظة تناظر C2 المحدد من الناحية البلورية والواجهات الجانبية داخل أوليغومر M1-V97K. نحن نفترض أن تعطيل اتصالات الغشاء- NTD أثناء اضطراب الفيريون المصاحب لدخول الخلية يسمح بتكوين تناظر C2 والواجهات الجانبية لإنشاء الهياكل متعددة الطبقات المنهارة.

تم الكشف عن واجهات جديدة بين الوحدات الفرعية M1 التي تتضمن بشكل حاسم CTDs ، مثل الواجهات البينية وواجهات تبادل المجال ، في بنية أوليغومرات V97K. كان الاكتشاف المفاجئ عبارة عن مجموعة من الهيستيدات عند نقاط الاتصال بين 3 وحدات فرعية M1 على السطح الداخلي لطبقة المصفوفة (الشكل 6). يمكن لبعض هذه الهيستيدينات أن تعمل كمواقع ربط معدنية ، كما اقترحت الدراسات السابقة [33]. بدلاً من ذلك ، نظرًا لأن بروتونات بقايا الهيستيدين قابلة للمعايرة بين الرقم الهيدروجيني 5.5 و 7.0 ، فمن الممكن أن يؤدي انخفاض الرقم الهيدروجيني المصاحب لدخول الخلية إلى بروتونات مجموعة الهيستيدين هذه وتعطيل تفاعلات interstrand. دعماً لذلك ، أظهرت أوليغومرات M1-V97K خصائص ترسيب متغيرة عند معالجتها برقم هيدروجيني منخفض ، في حين أن أوليغومرات WT-M1 ، التي تشبه إلى حد كبير تشكيل الفيريونات المعالجة برقم هيدروجيني منخفض ، لم تفعل ذلك (الشكل S11).

تجادل أنماط التشكل والتشابك لأوليجومرات M1-V97K المعروضة هنا بأن هذا الهيكل يعكس طبقة المصفوفة في حالة مستقرة في فيروسات الإنفلونزا السليمة والمعدية. من المحتمل أن يتم حفظ الطيات الحلزونية وواجهات التجميع في مصفوفات الأنفلونزا أ في جميع أنحاء عائلة orthomyxovirus لفيروسات الحمض النووي الريبي السالب ، بالنظر إلى أوجه التشابه بين هذه الميزات بين بنية M1-V97K الموصوفة هنا وتلك الموجودة في فيريونات السلمون المعدي فيروس فقر الدم [34] ، الذي يكون M1 أصغر منه ويتشابه بنسبة 11٪ فقط مع الأنفلونزا M1. في جزيئات فيروس أنيميا السلمون المعدية ، يُرى أن NTDs لـ M1 تلامس الغلاف الفيروسي ، وهو اتجاه تم اقتراحه أيضًا من خلال التصوير المقطعي بالإلكترون المُنشر مؤخرًا لجزيئات الأنفلونزا الخيطية A بدقة 8 [16]. تدعم هذه الملاحظات الفرضية القائلة بأن NTDs من أوليغومرات الأنفلونزا أحادية الطبقة M1 ، التي تمثلها البنية عالية الدقة للأوليغومرات M1-V97K المذكورة هنا ، تواجه الغشاء الفيروسي سالب الشحنة والمجالات السيتوبلازمية للبروتينات السكرية الفيروسية المضمنة في [35) ]. على سبيل المثال ، من المعروف أن الذيل العصاري الخلوي لـ IAV هيماجلوتينين بالميتويليت ، والذي يمكن أن يساهم في تفاعلات M1 من خلال شحنته السالبة [36]. في الجزء الداخلي من طبقة مصفوفة IAV ، من المرجح أن تتصل المناطق السالبة الشحنة من CTDs بالبقع المشحونة إيجابًا على مجمعات البروتين النووي [37]. يتمثل أحد الاختلافات بين أوليغومرات M1-V97K وتلك الموجودة في الجسيمات الفيروسية في أنه داخل الفيريونات ، يكون قطر قذائف M1 أحادية الطبقة (500 Å) أكبر من أوليغومرات M1-V97K المنقى (200 Å الجدول 1). يمكن أن تكون التفاعلات المحددة لطبقة M1 مع دهون الغشاء والبروتينات على جانب واحد والبروتين النووي الريبي من ناحية أخرى مسؤولة عن انخفاض الانحناء الذي لوحظ في الفيروسات ، يمكن أن تسهل مثل هذه التفاعلات التجميع وتعزز استقرار الغلاف أحادي الطبقة.

من ناحية أخرى ، فإن أوجه التشابه في البنية التحتية الدقيقة وأنماط التشابك بين أوليغومرات من WT كامل الطول M1 والفيريونات المعطلة تجادل بأن أوليغومرات WT-M1 تمثل حالة الطاقة المنخفضة المنهارة. من المحتمل أن يكون تحويل المصفوفة أحادية الطبقة في حالات العدوى إلى حالة متعددة الطبقات أثناء دخول الخلية ناتجًا عن مشغل الأس الهيدروجيني أو أيون معدني داخل الجسيم الداخلي [6،38]. نفترض أن بروتونات كتلة الهيستيدين (الشكل 6G والشكل 6H) في الفيروسات المعدية تقدم قوى طاردة تغير اتجاه CTD بالنسبة لـ NTD داخل كل مونومر M1. في الواقع ، لقد ثبت أن الببتيد المشتق من تسلسل رابط CL9 ، الذي يربط NTD و CTD (الشكل 5C) ويحتوي على 2 من 5 بقايا هيستيدين ، يطوي في حلزون ألفا عند درجة حموضة منخفضة [37]. سيؤدي الانفصال اللاحق لطبقة المصفوفة عن الغلاف الفيروسي إلى كشف السطح M1 المحتوي على V97 ، مما يسمح بتجميع المزيد من الوحدات الفرعية M1 ويؤدي إلى أوليغومرات متعددة الطبقات (الشكل 7). بعد هذه الخطوة ، من المحتمل أن أوليغومرات M1 من فيريونات معطلة تنفصل عن الدراسات باستخدام الفحص المجهري الفلوري للخلايا المصابة وقد أظهرت انتشار M1 في السيتوبلازم بعد الاندماج الداخلي [11 ، 12].

باختصار ، لقد قمنا بتنقية المؤتلف ، كامل الطول M1 واكتشفنا 2 أوليغومرات التي تظهر أوجه تشابه بنيوية لطبقات المصفوفة داخل فيروسات سليمة ومعطلة ، على التوالي. كشفت البنية عالية الدقة لإحدى هذه المجموعات ، الأكثر تشابهًا مع طبقات المصفوفة في فيريونات سليمة ، عن بنية مطوية بإحكام مع تفاعلات معقدة بين مونومرات M1 وواجهات التجميع الحرجة التي تتضمن CTD. توضح المقارنات بين أوليغومرات أحادية الطبقة ومتعددة الطبقات آلية محتملة لتسهيل إزاحة طبقات البروتين من الأغشية أثناء دخول الخلية عن طريق المنافسة بواسطة وحدات فرعية إضافية من البروتين. أخيرًا ، توضح هذه الدراسات 3 أهداف مختلفة مضادة للفيروسات: أوليغومر M1 في فيريونات غير معطلة ، وأوليجومر M1 المنهار داخل الجسيمات الداخلية ، والتحويل البيني الهيكلي بينهما.


SYMMDOCK: التنبؤ بالمركبات مع ج ن التناسق باستخدام الإرساء القائم على الهندسة

SymmDock عبارة عن خوارزمية لرسو السفن مبنية على الهندسة للتنبؤ بمركب متماثل دوريًا نظرًا لبنية وحدته غير المتماثلة. مثل PatchDock ، فإنه يستغل مطابقة الميزة المحلية لإنتاج مجموعة التحويلات المرشحة. بينما يكتشف PatchDock التحولات ذات الشكل التكميلي العالي ، يقيد SymmDock بحثه على التحولات الدورية المتماثلة لترتيب معين ن . تستفيد الخوارزمية من الخصائص الخاصة للتحولات المتماثلة دوريًا في كل من منهجيات البحث والتجميع. تفاصيل الخوارزمية وبعض النتائج التجريبية معطاة في المرجع. (23).


نتائج

في البداية ، أنشأنا سقالة جسيمات نانوية مثالية لتجميع اللقاح. صمم مختبر بيكر واجهة قاتمة في الألدولاز ثلاثي الطبقات من البكتيريا المحبة للحرارة Thermotoga maritima، مما يؤدي إلى مسامية 60 مير ثنائي الوجوه. لقد قمنا سابقًا بزيادة المرونة والتفاعل المعياري لهذه الجسيمات لتوليد SpyCatcher-mi3. 15 بالتوازي ، قمنا مؤخرًا بتطوير SpyTag003 / SpyCatcher003 ، مع معدل تفاعل يقترب من حد الانتشار. 16 لذلك ، عبرنا بشكل منحل عن SpyCatcher003-mi3 VLPs في ملف الإشريكية القولونية السيتوبلازم إلى إنتاجية عالية ودراسة خصائصها الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية. تمت تنقية SpyCatcher-mi3 الأصلي باستخدام كروماتوغرافيا تقارب C-tag. نظرًا لأن التنقية القائمة على التقارب تؤدي إلى زيادة التكلفة وإبطاء التحجيم ، فقد أنشأنا تنقية مستقلة عن راتنج التقارب. سمح الجمع بين ترسيب كبريتات الأمونيوم وكروماتوجرافيا استبعاد الحجم (SEC) بالتنقية الفعالة لجزيئات SpyCatcher003-mi3 إلى درجة نقاء عالية (الشكل S1A-C). نظرًا للمشكلة الكبيرة المتمثلة في فشل سلسلة التبريد لاستخدام اللقاح العالمي 18 ، استخدمنا تحليلات الاستقرار الحراري وذوبان الجليد كمقايسات بديلة لتقييم مرونة منصة VLP الجديدة. حافظ SpyCatcher003-mi3 على قابلية الذوبان حتى بعد فترة الحضانة لمدة ساعة واحدة عند 95 درجة مئوية ، مما أظهر مرونة حرارية فائقة لمنصة SpyCatcher-mi3 الأصلية (الشكل 2 أ). وبالمثل ، أظهر SpyCatcher003-mi3 استقرارًا معززًا لتجميد الذوبان مقارنةً بـ SpyCatcher-mi3 (الشكل 2 ب).

عزز SpyCatcher003 استقرار VLP وقلل من التفاعل المصلي الموجود مسبقًا. أ) تم تسخين SpyCatcher-mi3 و SpyCatcher003-mi3 لمدة 60 دقيقة عند درجة الحرارة المحددة ، وتم تبريدهما إلى 4 درجات مئوية ، وتمت إزالة الركام بالطرد المركزي ، وتم تحديد جزء البروتين القابل للذوبان. يعني ± sd. ، ن= 3. ب) تعرض SpyCatcher-mi3 أو SpyCatcher003-mi3 لعدد محدد من دورات التجميد-الذوبان وتمت إزالة الجزء غير القابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي. تم تحليل VLP في المادة الطافية بواسطة SDS-PAGE. يتم تمييز المتوسط ​​بواسطة اختبار الطالب ذي الذيلتين الأفقيتين ، ن= 3. ج) وجود تفاعل مصل سابق ل S. المقيحة المستضدات. عيار الجسم المضاد من المصل من 52 شخصًا ضد عنصر التحكم الإيجابي Spy0469 أو SpyTag: SpyCatcher أو SpyTag003: SpyCatcher003. يظهر كل شخص كنقطة ، مع المتوسط ​​باللون البرتقالي. د) ملخص الاستجابات المناعية في (ج). هـ) المقارنة الزوجية للعيار. الشخص الذي لديه عيار متزايد ضد SpyTag003: يشار إلى SpyCatcher003 باللون البرتقالي (اختبار تصنيف موقع ويلكوكسون للأزواج المتطابقة ، ن= 52). F – G) النموذج الهيكلي (معرف PDB: 2X5P) لمجال CnaB2 ومحاذاة التسلسل مع أزواج SpyTag / SpyCatcher. البدائل من CnaB2 هي أرجواني (SpyCatcher) أو برتقالي (SpyCatcher003). البدائل في SpyTag003 هي السماوي. يشير الخط المنقط إلى منطقة لم يتم حلها في CnaB2.

تم اختبار التوسط بوساطة SpyTag في مجموعة من نماذج اللقاحات قبل السريرية ، خاصةً للملاريا ، 9 ولكن لم يتم استكشاف مدى وجود أجسام مضادة موجودة مسبقًا لدى الأشخاص ضد SpyTag / SpyCatcher. تم تصميم SpyTag / SpyCatcher من مجال CnaB2 لبروتين الالتصاق FbaB من مسببات الأمراض البشرية الشائعة الأبراج العقدية. 10 S. المقيحة تسبب العدوى في 700 مليون شخص في جميع أنحاء العالم كل عام. يتم التعبير عن 19 FbaB بشكل أساسي بواسطة النمط المصلي M3 لـ S. المقيحة. 20 لفهم الآثار المترتبة على التعرض المشترك بشكل أفضل S. المقيحة من أجل التطوير السريري للقاحات المستندة إلى SpyTag / SpyCatcher ، استخدمنا مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لتحليل وجود الأجسام المضادة الموجودة مسبقًا ضد SpyTag: SpyCatcher و SpyTag003: SpyCatcher003 في عينات مصل من 52 بالغًا صحيًا في المملكة المتحدة. تم رد فعل كل الماسك مسبقًا باستخدام العلامة الخاصة بها وتمت إزالة علامات التنقية (الشكل S2A) ، لتقليد الاتحادات الموجودة في VLPs المزينة بمولد الضد. تم اختبار جميع الأشخاص البالغ عددهم 52 شخصًا إيجابيًا للأجسام المضادة ضد المناعي S. المقيحة البروتين السطحي Spy0469 ، 19 يؤكد التعرض الشائع المتوقع للناس S. المقيحة (الشكل 2 ج ، د ، الشكل S2B). الأجسام المضادة لـ SpyTag: تم اكتشاف SpyCatcher في 98٪ من العينات ، لكن 52٪ فقط أعطوا استجابة إيجابية لـ SpyTag003: SpyCatcher003 (انخفاض 5.4 أضعاف في متوسط ​​العيار ، الشكل 2 C ، D ، الشكل S2C ، D). في المقارنة الزوجية فقط 1/52 كان له عيار أعلى مقابل SpyTag003: SpyCatcher003 (الشكل 2 E). لذلك ، فإن 18 بدائل من الأحماض الأمينية من SpyTag: SpyCatcher إلى SpyTag003: SpyCatcher003 16 بشكل عام قللت من الكشف عن طريق الأجسام المضادة البشرية الموجودة (الشكل 2 F ، G). أكدنا هذا الاختلاف باستخدام شطيرة ELISA مع anti-His6 الجسم المضاد (الشكل S2E ، F). لقد حققنا في ما إذا كان عيار مكافحة Spy0469 العالي يتوقع استجابة عالية لمكافحة SpyCatcher. Spy0469 مقابل SpyTag: كان لدى SpyCatcher معامل ارتباط Pearson 0.33 (ص=0.02, ن= 51) ، مما يشير إلى علاقة إيجابية ضعيفة (الشكل S2G). ومع ذلك ، لم نجد علاقة ارتباط ذات دلالة إحصائية بين Spy0469 و SpyTag003: عيار SpyCatcher003 (معامل ارتباط بيرسون = 0.28 ، ص=0.15, ن= 27) (الشكل S2 H). كما هو متوقع ، SpyTag: SpyCatcher و SpyTag003: SpyCatcher003 كان لها علاقة إيجابية ذات دلالة إحصائية (معامل ارتباط بيرسون = 0.67 ، ص=0.0001, ن= 27) (الشكل S2I).

لقد أنشأنا أيضًا SnoopTag / SnoopCatcher كزوج تفاعلي متعامد من أجل النقل التلقائي وتجميع اللقاحات 21 (الشكل S3A). تم تصميم SnoopTag / SnoopCatcher من لاصق RrgA لـ العقدية الرئوية ما يصل إلى 65٪ من الأطفال و 10٪ من البالغين حاملون للأعراض. تم اختبار 22 جميع الأمصال البشرية إيجابية ضد الرئوية الرئوية البروتين السطحي المناعي PsaA 23 (الشكل S3B ، C ، E ، F). كان 25 ٪ فقط إيجابيين ضد SnoopTag / SnoopCatcher (الشكل S3D-F). لم نجد علاقة بين PsaA و SnoopTag: التتر SnoopCatcher (معامل ارتباط بيرسون = 0.15 ، ص=0.63, ن= 13) (الشكل S3G).

للتحقيق في عرض VLP للمستضدات ذات الأحجام المتنوعة والهياكل المتعددة ، قمنا بالتعبير عن لوحة من بروتينات SpyTag و SpyTag003 المدمجة (الشكل 3 أ). كمونومر ، عبرنا عن مجال ربط المستقبلات (RBD) من ارتفاع SARS-CoV-2 (الشكل 3 أ) ، وهو لقاح مرشح لـ Covid-19 ، 24 يحمل SpyTag N- طرفي.

سمحت جسيمات SpyCatcher003-mi3 بعرض فعال للمستضدات بأحجام وتناظرات مختلفة. أ) تراكيب المستضدات متفاوتة التناظر. يظهر كل مستضد في اتجاهين مع نموذج ملء الفراغ ، مع كل سلسلة بلون مختلف. يتم تقديم نموذج SpyCatcher003-mi3 بنفس المقياس. معرّفات PDB: RBD: 6W41 ، OspC: 1G5Z ، NDV HN: 3T1E ، HA: 4UO0 ، NA: 2HTY (مع مجال tetramerization: 1USE) ، الستربتافيدين: 1SWB ، β-galactosidase: 6DRV. تشير الكرات الحمراء إلى مكان انصهار الببتيد التفاعلي. ب) اقتران مستضدات نموذجية عند مولاري مختلف VLP: نسب مستضد. تم تفاعل العينات لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية ، وإزالة الركام غير القابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي ، وتحميل المادة الطافية عند تقليل SDS-PAGE قبل تلطيخ كوماسي. ج) القياس الكمي لـ VLP: تفاعلات المستضد. تم تقسيم شدة كل نطاق من قياس كثافة الجل على شدة نطاق VLP وحده عند 2 ميكرومتر. تمثل الأشرطة متوسط ​​+ sd ، ن= 3. د) حافظت المستضدات ذات التناظر الدوري على قابلية ذوبان VLP جيدة. تم تحديد الجزء القابل للذوبان من المستضدات المقترنة بنسبة 1: 1 مولار بواسطة قياس الكثافة (يعني ± sd ، ن= 3). بعض أشرطة الخطأ صغيرة جدًا بحيث لا يمكن رؤيتها.

كان أول ثنائي لدينا هو بروتين السطح الخارجي C (OspC) ، وهو لقاح مهم مرشح من بوريليا برغدورفيرية، البكتيريا المسببة لمرض لايم. يتم التعبير عن OspC أثناء الانتقال من القراد وعند الدخول إلى مضيف الثدييات. 25 لقد عبرنا عن جزء مبتور طرفيًا من OspC بشكل قابل للذوبان في بكتريا قولونية مع SpyTag003 في نهايتها N. جزء OspC Δ19 C129S ، ثنائي الأبعاد متوازي (تناظر C2 ، الشكل 3 أ) ، شديد المناعة ويحفز مناعة وقائية ضد ب. بورجدورفيري عدوى. 25

يعد فيروس مرض نيوكاسل (NDV) من الفيروسات المخاطانية ويمثل خطرًا خاصًا على تربية الدواجن. يعتبر hemagglutinin-neuraminidase (HN) من NDV أمرًا حاسمًا في دخول الخلايا المضيفة وخروجها ، ومثل العديد من مستضدات الفيروسة المخاطانية ، يوجد على شكل رباعي مترابط بشكل فضفاض مكون من اثنين من ثنائيات ثنائية متوازنة تقريبًا. 26 ، 27 لقد عبرنا عن جزء مبتور طرفيًا من HN (يُطلق عليه NDV HN) ، بهدف إنشاء ثنائى C2 (الشكل 3 أ) يحمل SpyTag003 عند نهايته C. الطرفان C من ثنائى HN في معرف PDB: 3T1E هما & gt7 nm متباعدان. 26

يعد فيروس الإنفلونزا تحديًا مستمرًا لكل من صحة الإنسان والبيطرة. 28 تتسبب أوبئة الأنفلونزا البشرية السنوية في ما بين 3-5 ملايين حالة مرض وخيم ، مع وفاة 290.000-650000. 28 قد تفشل لقاحات الأنفلونزا الحالية في إحداث حماية فعالة ، خاصة لدى الأشخاص فوق 65 عامًا. 29 علاوة على ذلك ، فإن اللقاحات المنتجة في البيض بطيئة في الانتشار ويمكن أن يقلل تكيف بيض المستضد من الفعالية. 30 تعمل اللقاحات الحالية في الغالب على تحفيز الأجسام المضادة لـ Hemagglutinin (HA) ولكن ليس Neuraminidase (NA) ، على الرغم من أن الأجسام المضادة لكليهما تساهم في الحماية. 31 باعتباره أداة تشذيب مع تناظر C3 ، فإن HA مناسب تمامًا للاندماج الجيني للمحور ثلاثي الأبعاد للجسيمات النانوية البروتينية المختلفة. 6 ، 7 ومع ذلك ، NA هو رباعي مع تناظر C4 ، مما يعقد الاندماج الجيني لتجميع البروتين الذاتي VLPs. لذلك ، اكتشفنا ما إذا كان يمكن تزيين كل من هذه التناظرات على منصة VLP الخاصة بنا. نظرًا لأن الإنفلونزا تُظهر تنوعًا كبيرًا ، 28 قمنا باختبار نهجنا على المستضدات من سلالات متميزة. بالنسبة لـ HA ، قمنا باختبار H3 من سلالات الأنفلونزا A / Aichi / 2/1968 (تسمى H3 Aichi) و A / Victoria / 361/2011 (تسمى H3 Vic). بالنسبة إلى NA ، قمنا باختبار N2 من A / Victoria / 361/2011 (يُسمى N2) و N1 من A / England / 195/2009 (يُطلق عليه N1). بصفتنا رباعيات ذات تناظر ثنائي السطوح (D2) ، قمنا بربط بروتينين بحجم متباين Streptomyces avidinii الستربتافيدين (60 كيلو دالتون) وكبير جدا بكتريا قولونية β-galactosidase (483 كيلو دالتون) (الشكل 3 أ).

تم اقتران المستضدات مع SpyCatcher003-mi3 بنسب مولارية مختلفة لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية وأي مجاميع غير قابلة للذوبان تمت إزالتها بالطرد المركزي. تم قياس كمية اتحاد VLP-Antigen التساهمي المتكون عند كل نسبة اقتران باستخدام SDS-PAGE وقياس كثافة الجل. بصرف النظر عن β-galactosidase ، تم عرض جميع المستضدات بكفاءة على SpyCatcher003-mi3 (الشكل 3 B ، C ، الشكل S4A ، B). عندما تم تحضينها في تركيز متساوي المولي من Tag and Catcher ، أنتجت معظم التفاعلات الحد الأدنى من المستضد غير المترافق المتبقي (الشكل 3 ب ، ج). يشير هذا النقص في الوحدات الفرعية المجانية للمستضد إلى أنه عند التركيز المنخفض للمستضد ، يحدث اقتران المستضد في الغالب على الرغم من جميع علامات SpyTag على كل مستضد (الشكل 1 د). مع جميع المستضدات المختبرة ، كان الاقتران شبه الكمي لجميع VLP SpyCatchers قابلاً للتحقيق (الشكل 3 ب) ، مما يشير إلى أن العائق الجامد لم يمنع تفاعل SpyCatcher003 حتى عندما تم عرض مولدات المضادات المتعددة الكبيرة. ومع ذلك ، تشير لوحة المستضدات الخاصة بنا إلى أن حجم المستضد واتجاه وحداته الفرعية يمكن أن يكون لهما تأثير على كفاءة الاقتران. تفاعل OspC بكفاءة من خلال كل من الوحدات الفرعية و SpyCatcher003 المشبعة عند انخفاض VLP: نسب المستضد (الشكل 3 ب ، ج). وبالمثل ، فإن النوعين المتغيرين من الأنفلونزا HA كان لهما حد أدنى من الوحدات الفرعية المجانية المتبقية عند 1: 1 و 1: 1.5 مولار ، مما يشير إلى أن متغيرات HA كانت مترافقة بشكل أساسي من خلال جميع SpyTags الثلاثة (الشكل 3 B ، C ، الشكل S4A ، B ، C) . على النقيض من ذلك ، فإن بناء NDV HN الخاص بنا ، وهو ثنائي الأبعاد مضاد للتوازي ، يتطلب زيادة في مستضد 3 أضعاف لتشبع VLP ، مع وجود المزيد من الوحدات الفرعية غير المقترنة تساهميًا عند مستوى التشبع (على سبيل المثال ، مقترنة بعلامة واحدة فقط من كل ديمر) (الشكل 3 ب ، ج). بالنسبة للمستضدات ذات التناظر الثنائي السطوح ، احتفظ الستربتافيدين بقابلية ذوبان VLP الجيدة ولكن β-galactosidase أدى إلى فقدان شبه كامل لـ VLP القابل للذوبان في جميع النسب (الشكل 3 ب-د). يشير هذا الاختلاف إلى أن حجم المستضد أمر بالغ الأهمية عندما توجد العلامات على وجوه مختلفة من المستضد. أنشأنا أيضًا عرضًا مشتركًا فعالًا لـ HA و NA على VLPs ، حيث سمح تغيير نسبة المستضدات أثناء الاقتران بتعديل بسيط لكثافة العرض (الشكل S4D). يوفر هذا النهج طريقة بسيطة لإنشاء لقاحات مرشحة تحاكي كثافة HA و NA على فيروسات الإنفلونزا الطبيعية.

لا يكشف تحليل القابلية للذوبان بالضرورة عن مستويات منخفضة من VLP crosslinking ، والتغيرات الهيكلية في VLP ، أو وجود مجاميع قابلة للذوبان. لذلك ، درسنا توزيع الحجم والتشتت الأحادي عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS). كان نصف القطر الهيدروديناميكي لـ SpyCatcher003-mi3 غير المترافق 18.6 نانومتر. تراوح نصف القطر الهيدروديناميكي للجسيمات المقترنة بالمستضد من 19.5 نانومتر (Streptavidin) إلى 28.3 نانومتر (H3 Vic) ، بما يتوافق مع حجم المستضد (الشكل 4 أ ، الشكل S5A-G). كان لكل من VLPs غير المزخرفة والمزخرفة بمولد الضد توزيعات ضيقة الحجم ، مما يشير إلى أن VLPs المزينة بمولد الضد كانت أحادية التشتت وأن VLP كان الحد الأدنى. كما هو متوقع ، عرضت الجسيمات المزينة بالمستضد أشكالًا وأحجامًا متميزة اعتمادًا على المستضد المعروض ، عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) بعد تلطيخ سلبي (الشكل 4 ب). مشذب H3 Vic المزين على SpyCatcher003-mi3 موجه للخارج بترتيب شعاعي ، محاكياً اتجاه HA على فيروسات الإنفلونزا الطبيعية. للتحقق من استقرار المستضد بعد زخرفة VLP ، قمنا بدراسة كل مستضد ثنائي باستخدام Thermofluor. أدى تجميع OspC على SpyCatcher003-mi3 إلى زيادة طفيفة قدرها 0.9 درجة مئوية في المستضد تيم (الشكل S6A). زادت زخرفة NDV HN على SpyCatcher003-mi3 المستضد تيم بمقدار 3.2 درجة مئوية (الشكل S6B). لذلك ، تحافظ شاشة Spy-VLP على سلامة مستضد جيدة ويمكنها حتى تثبيت بنية بعض المستضدات متعددة القراءات.

توزيع حجم الجسيمات بعد زخرفة VLP لمستضدات مختلفة التماثل. أ) نصف القطر الهيدروديناميكي لجسيمات SpyCatcher003-mi3 ، مع أو بدون اقتران لمولدات المضادات (يعني ± sd لـ H3 Vic ن= تجربتان مستقلتان لجميع العينات الأخرى ن= 3). ب) TEM من SpyCatcher003-mi3 VLPs المزينة بمستضد سلبي الملون. مقياس بار: 50 نانومتر.

بعد تأكيد الزخرفة السطحية لمستضدات الأنفلونزا ثلاثية أو رباعية على منصة VLP الخاصة بنا ، قمنا بالتحقيق في حجم ونوعية الاستجابات المناعية. لقد تحققنا من اقتران VLP الفعال لـ H3 Vic أو H3 Aichi أو N1 بواسطة SDS-PAGE (الشكل S7A). تم تحصين الفئران عضليًا بجرعات 0.1 ميكروغرام من المستضد باستخدام نظام تعزيز أولي متماثل ، جنبًا إلى جنب مع AddaVax المساعد (الشكل 5 أ). تم إجراء التعزيز بعد أسبوعين من الذروة ، مع أخذ عينات الدم بعد 4 أسابيع من التعزيز. قارنا التحصين بنفس جرعة المستضد من المستضدات غير المقترنة أو مع ضوابط الإنفلونزا الفيروسية. بالنسبة لفيروس H3 Vic ، كان فيروس فيكتوريا من النوع البري / 361/2011 (يسمى Vic / 361) هو عنصر التحكم. بالنسبة إلى H3 Aichi و N1 ، كانت فيروسات الأنفلونزا أحادية الدورة (S-FLU) ذات النمط الكاذب المطابق لـ HA أو NA عناصر تحكم. S-FLU هو لقاح ناقل فيروسي واعد: تصيب فيروسات S-FLU الخلايا المضيفة ولكنها تفتقر إلى الجين للتعبير عن المزيد من HA ، وبالتالي فهي غير قادرة على الإصابة بعدوى فيروسية منتجة. 32 قمنا بتحليل عيار الأجسام المضادة باستخدام اختبار قائم على الخلية. يتم تحضين عينات المصل بخلايا تعبر عن سطح H3 أو N1. ثم يتم الكشف عن الأجسام المضادة المرتبطة بالخلايا باستخدام الجسم المضاد المترافق مع HRP. يتسبب كل من H3 Vic و N1 ، عند اقترانهما بـ SpyCatcher003-mi3 ، في إحداث عيار متوسط ​​من الأجسام المضادة أعلى من المستضد الحر (7 أضعاف لـ H3 Vic ، 490 ضعفًا لـ N1 ، الشكل 5 B-D). أدى عرض VLP لـ H3 Aichi إلى زيادة طفيفة في العيار ولكن هذا الاختلاف لم يكن ذا دلالة إحصائية (الشكل 5 ج). تم عرض H3 Vic على VLP المستحث بمتوسط ​​عيار أعلى بمقدار 14 ضعفًا من فيروس من النوع البري ، بينما تسبب كل من H3 Aichi: VLP و N1: VLP في التتر مماثل لـ S-FLU (الشكل 5 B-D).

عرض مستضدات الأنفلونزا الثلاثية أو الرباعية على SpyCatcher003-mi3 عيار الجسم المضاد المحسن. أ) جدول التحصين. ب) عيار الأجسام المضادة ضد H3 Vic من الفئران التي تم تحضيرها وتعزيزها باستخدام H3 Vic المجاني أو H3 Vic المعروض على SpyCatcher003-mi3 (H3 Vic: VLP) أو فيروس الأنفلونزا Vic / 361. كل نقطة تمثل فأرًا واحدًا والمتوسط ​​موضح باللون البرتقالي. ن= 6. تم فحص الأمصال ضد H3 Vic المرتبط بغشاء البلازما. مصل الفئران المحصنة بـ N1: كان VLP عنصر تحكم سلبي. ج) أما (ب) مع H3 أيشي. د) أما (ب) مع N1. مصل التحصين مع H3 Aichi: كان VLP عنصر تحكم سلبي. هـ) رسم تخطيطي لمقايسة التحييد الدقيق. يتم تحديد فاعلية التحييد من خلال الانخفاض في GFP في الخلايا المحتضنة بالفيروس المخلوط مسبقًا بالمصل. و) رسم تخطيطي لمقايسة تثبيط NA. يتم قياس تثبيط النشاط التحفيزي لـ NA من خلال تقليل ارتباط الليكتين-HRP بالفيتوين المعطل في وجود الأجسام المضادة المعادلة لـ NA. G) VLP-display نشاط محسن للفيروسات من تحصين H3 Vic. مقايسة التحييد المجهري على المصل بعد كل طريق تحصين ، تم اختباره ضد إنفلونزا A / Victoria / 361/2011. مصل التحصين بـ N1: كان VLP عنصر تحكم سلبي. ن= 6 ، باستثناء N1: VLP ن= 5. H) مقايسة التحييد الدقيق كما في (G) ولكن لفيروس H3 Aichi و A / Aichi / 2/1968. I) مقايسة تثبيط NA للفئران المحصنة بـ N1 أو N1 المجاني المعروض على VLP أو مطابقة S-FLU. مصل التحصين مع H3 Aichi: كان VLP عنصر تحكم سلبي. ن= 6 ، باستثناء H3 Aichi: VLP ن= 4. تشير الخطوط المتقطعة إلى حد الاكتشاف (التخفيف 1:40). تم تحليل الأهمية باستخدام السجل10- بيانات محولة و ANOVA أحادي الاتجاه مع تصحيح Bonferroni. n.s. = غير مهم.

كطريقة بديلة لتحليل العيار ، استخدمنا ELISA غير المباشر مع مستضدات مغلفة على لوحة ميكروترية. تطابقت النتائج إلى حد كبير مع الفحص المستند إلى الخلية ، حيث أعطى كل من H3 Vic: VLP و N1: VLP عيارًا أعلى بكثير من المستضدات الحرة (الشكل S7B-D). على عكس الفحص المستند إلى الخلية ، في ELISA غير المباشر ، كانت جميع النواقل الفيروسية المختبرة تحتوي على عيارات أقل بكثير مما تم إحداثه بواسطة مستضدات VLP المعروضة (الشكل S7B-D).

بالإضافة إلى كمية الأجسام المضادة ، من المهم تقييم فعالية الجسم المضاد. درسنا الوظيفة في مقايسة تحييد الفيروس المجهري للأجسام المضادة الخاصة بـ HA (الشكل 5 هـ). أدى عرض 32 SpyCatcher003-mi3 لمتغيرات H3 إلى تحسين متوسط ​​التتر المعادل بمقدار 8.5-12 مرة مقارنةً بالمستضد الحر أو الضوابط القائمة على الفيروسات (الشكل 5 G ، H). لتأكيد خصوصية الأجسام المضادة المعادلة ، قمنا بتقييم المصل ضد النمط الكاذب S-FLU باستخدام H3 Vic أو H3 Aichi ، مع إعطاء نتائج مماثلة (الشكل S7E ، F).

تمت دراسة فاعلية الأجسام المضادة الخاصة بـ NA في تثبيط تحفيز NA باستخدام مقايسة محاضرة مرتبطة بالإنزيم (ELLA) (الشكل 5 و). 33 NA تثبيط هو ارتباط مستقل للحماية من الإنفلونزا في التجارب السريرية. أظهر 31 N1 المترافق مع VLP تثبيطًا قويًا لـ NA ، بينما لم تظهر أي من العينات من التحصين مع N1 المجاني تثبيطًا يمكن اكتشافه (الشكل 5 I). على غرار N1: VLP ، A / England / 195/09 الأجسام المضادة التي يسببها S-FLU مع تثبيط قوي لـ NA (الشكل 5 I).

لمعرفة ما إذا كان عرض VLP للمستضد قد زاد من وظائف الأجسام المضادة المستحثة ، قمنا بحساب IC50/ EC50 النسب. تم تضمين العينات التي تحتوي على إشارة فوق العتبة فقط في كلا الاختبارين. أدى عرض VLP لـ H3 Vic إلى زيادة طفيفة في متوسط ​​IC50/ EC50 النسبة مقارنة بالمستضد الحر ، لكن هذا الاختلاف لم يكن ذا دلالة إحصائية (الشكل S7G). في المقابل ، أدى عرض VLP لـ H3 Aichi إلى زيادة IC بشكل ملحوظ50/ EC50، مما يشير إلى تحسين وظائف الجسم المضاد (الشكل S7 H). لم يكن من الممكن حساب IC50/ EC50 مجانًا N1 ، لأن IC50 كان أقل من عتبة الكشف. N1: أعطى VLP و S-FLU المطابق IC مشابهًا50/ EC50، مما يشير إلى وظائف الجسم المضاد المماثلة (الشكل S7I). مجتمعة ، فإن عرض المستضدات على منصة SpyCatcher003-mi3 لا يؤدي فقط إلى زيادة عدادات الجسم المضاد ولكن يمكنه أيضًا تحسين وظائف الجسم المضاد.


مقدمة

تستخدم العديد من البكتيريا سالبة الجرام أنظمة إفراز من النوع الأول لنقل السموم أو الإنزيمات المائي أو البروتينات السطحية عبر غلاف الخلية (هولندا وآخرون، 2005).نموذج مجمع النقل هذا هو جهاز الهيموليسين (Hly) A ، الذي تم اكتشافه في أوائل الثمانينيات في أمراض الجهاز البولي. الإشريكية القولونية سلالات (ويلش وآخرون، 1981) ، والتي تعتمد مثل جميع أنظمة النوع الأول على وجود إشارة إفراز طرفية C في الركيزة المنقولة. تتكون آلية إفراز HlyA من ثلاثة عناصر لا غنى عنها: ناقل ABC- (A TP- b inding c Assette) HlyB ، بروتين الاندماج الغشائي HlyD ، كلاهما يقيمان في الغشاء الداخلي لـ بكتريا قولونيةوبروتين الغشاء الخارجي TolC (هولندا وآخرون, 2005 ).

ناقلات ABC ، ​​مثل HlyB ، عبارة عن بروتينات غشائية تعتمد على ATP في كل مكان (Higgins ، 1992 Schmitt and Tampé ، 2002) التي تنقل مجموعة مذهلة من ركائز النقل عبر الأغشية ، إلى جانب استهلاك ATP. على الرغم من تنوع ركيزة النقل هذا ، فإن جميع ناقلات ABC تشترك في نفس البنية ، وتتألف من مجالين أو وحدات فرعية عبر الغشاء (TMDs) واثنين من مجالات ربط النوكليوتيدات (NBDs) (Schmitt and Tampé ، 2002 Davidson and Chen ، 2004 Jones and George ، 2004 ). في حين أن أنظمة TMDs الحلزونية α متباينة في الهيكل الأساسي ، يتم الحفاظ على NBDs فيما يتعلق بالتسلسل والهيكل ثلاثي الأبعاد. ومع ذلك ، يمكننا تحديد منطقة متنوعة هيكليًا (SDR) داخل العديد من ABC-NBDs المختلفة (شميت وآخرون، 2003) التي قد تكون متورطة في إرسال الإشارات إلى TMDs. ينعكس الحفاظ على NBDs أيضًا من خلال حقيقة أن جميع الزخارف المحفوظة لناقلات ABC ، ​​ونمط Walker A و B ، وحلقة C أو شكل توقيع ABC ، ​​و Q- و Pro-loop ، و D- و تقع حلقات H داخل بنك دبي الوطني.

على مدار العقد الماضي ، شهدنا تطورات هائلة في أبحاث ناقل ABC بما في ذلك الهياكل البلورية لبطاقات NBD المعزولة (للاطلاع على المراجعات الأخيرة ، انظر Ye وآخرون، 2004 أوزوالد وآخرون، 2006) وناقلات كاملة الطول (Chang and Roth ، 2001 Locher وآخرون، 2002 Chang، 2003 Reyes and Chang، 2005). بناءً على هذه البيانات الهيكلية والكيميائية الحيوية التي تم الحصول عليها من NBDs المعزولة (Chen وآخرون، 2001 ياناس وآخرون، 2003) ، يُعتقد الآن أنها تشكل ثنائي مائي مركب في الحالة المرتبطة بـ ATP. هنا ، يعمل ATP كغراء جزيئي ، يتم وضعه بين نموذج Walker A لمونومر واحد ( رابطة الدول المستقلة مونومر) وعنصر توقيع ABC للمونومر الآخر ( عبر مونومر) (سميث وآخرون، 2002). ومع ذلك ، على الرغم من المعرفة المتزايدة بسرعة بالكيمياء الحيوية والهيكل ثلاثي الأبعاد لناقلات ABC ، ​​ما زلنا بعيدين عن الفهم الجزيئي المفصل للدورة التحفيزية لبنك دبي الوطني. علاوة على ذلك ، لا يزال هناك تحليل شامل للمفاتيح الميكانيكية المشاركة في حركات المجال المرتبطة بربط الركيزة أو التفكك. الأهم من ذلك ، يجد المرء أن هذه الميزات بشكل عام أقل حفظًا من هندسة الموقع النشط. وبالتالي ، لا يمكن إجراء تحليل موثوق به لحركات المجال ، والتغييرات التوافقية وأنماط المتغيرة لتفاعلات البروتين - الترابط أو البروتين - البروتين باستخدام الهياكل المشتقة من نفس البروتين. حتى الآن ، لم يتحقق هذا إلا لمالك من خلال حل هياكل النماذج المرتبطة بـ apo- و ATP- و ADP (Chen وآخرون، 2003 لو وآخرون، 2005). على عكس HlyB-NBD ، فإن MalK تعمل على استيراد ركيزة النقل ، والأهم من ذلك ، أنها تنحرف عن NBD الكنسي من خلال وجود مجال C كبير ، مطلوب لتنظيم mal أوبرون.

لقد حصلنا الآن على الهياكل البلورية لنوعين متحولين من HlyB-NBD و H662A و E631Q ، في معقد مع ATP (dimers) أو ADP (مونومرات) ، والبنية البلورية لبروتين مونومر من النوع البري مع ADP مرتبط. بالاشتراك مع الهياكل البلورية التي تم نشرها مؤخرًا لـ H662A / ATP-Mg 2+ (زايتسيفا وآخرون، 2005 أ) ديمر وهيكل HlyB-NBD في غياب النوكليوتيدات المرتبطة (شميت وآخرون، 2003) ، يمكن الآن وصف دورة تحفيز ABC أساسية بالتفصيل الهيكلي. وقد كشف هذا عن رؤى ميكانيكية مهمة والعديد من الميزات الجديدة بما في ذلك عدم التناسق الهيكلي داخل الثنائى في وجود ATP / Mg 2+. نقترح أن يمثل هذا نفقًا واحدًا مفتوحًا وآخر مغلقًا لخروج الفوسفات. مكننا التحليل الإضافي لهذا التباين من تحديد اثنين من الأحماض الأمينية ذات الأهمية الحاسمة للتعاون المعتمد على ATP. بالاقتران مع آلية لتخزين طاقة ATP داخل NBD ، نصف الآن الآليات الجزيئية التي تعمل لتنسيق dimerization NBD ، والتحلل المائي ATP والتغيرات المطابقة المرتبطة من أجل وقود نقل الركيزة نقل.


نقاش

هيكل ديمر والحركات الداخلية

هيكل [د (5mCCTCACTCC)]2 تم حساب العرض في الشكل 9 باستخدام قيود المسافة والثنائية السطوح المدرجة في الجدول 1. الدقة الجيدة لطيف الرنين المغناطيسي النووي توفر بنية عالية الوضوح تعرض خصائص مشتركة لهياكل i-motif. يتم عرض المعلمات الهيكلية المستمدة من تحليل 10 المطابقات المختارة في الجدول 2. انتهاكات القيود والانحرافات عن الهندسة المثالية للهياكل المحسوبة مدرجة في الجدول 1.

جوهر i-motif

تم بناء الديمر بواسطة دبابيس شعر متناظرة بما في ذلك ستة أزواج C • C + وزوج T • T. تميل قواعد T3 بشكل متماثل في الأخاديد العريضة. تفريغ T3 يترك فاصلًا بين C2 • C2 + و C4 • C4 + مما يسمح بإقحام أزواج T7 • T7 و C6 • C6 + المتجاورتين بالتتابع. فترة التراص بين أزواج C • C + هي 3.1 ± 0.1 Å. وهو أكبر بين الأزواج T7 • T7 و C6 • C6 +: 3.9 ± 0.1 Å. الالتواء الحلزوني بين السيتيدات المقترنة ، 16 درجة في الخطوة 1 - 2 و 25 درجة في الخطوة 8-9 هي نموذجية للقيم التي لوحظت في هياكل عزر i. كما لوحظ سابقًا في الهياكل ذات الصلة من [d (5mCCTCC)]4 (2) و [د (5mCCTCTCC)]4 (3) ، يؤدي توجيه قواعد زوج T • T إلى تقليل الالتواء الحلزوني في الخطوة 5 C-T وفي تطور أكبر في الخطوة T-C3 (الجدول 2). تم تعريف عروض الأخدود على أنها متوسط ​​25 مسافة بين الخيوط التي تربط ذرات C1 ′ و C2 ′ و C3 ′ و C4 و O4 للسكريات المتلامسة عبر الأخاديد الضيقة والعريضة. عرض الأخدود الضيق هو 5.2 ± 0.3 Å عند الدرجات حيث يتم تكديس القواعد بواسطة الوجوه الموجهة في الاتجاه 3. كما هو ملاحظ دائمًا في هياكل i-motif ، فهو أوسع قليلاً ، 6.3 ± 0.5 Å ، عند الخطوات التي يتم فيها تكديس القواعد بواسطة الوجوه الموجهة في اتجاه 5. إنه أوسع بكثير ، 9.2 ± 0.2 Å ، عند الخطوات بين T3 / T7 و T3 / C6. عرض الأخدود الواسع هو 11.4 ± 1 Å في المتوسط.

الحلقة A5

تؤدي عمليات المحاكاة التي تفرض حلقات A5 عبر الأخاديد العريضة إلى تعطيل الزوج C4 • C4 + وفي مسافات بين البروتونات غير متوافقة مع أطياف الرنين المغناطيسي النووي. يتم وضع سكر A5 بواسطة قيود المسافة المستمدة من خمس قمم متقاطعة مع القاعدة وبروتونات السكر في C4 والقاعدة A5 موجهة بواسطة القمم المتقاطعة A (H2) -C4 (H5 و H1 ′) في اتجاه تقريبًا عمودي على المستوى المجاور C4 • C4 (الشكل 5). يتوافق عدم وجود أي وصلات نواة داخلية بالبروتونات A5 (H8) والبروتونات الأمينية مع اتجاه حافة C8-N6 من A5 خارج قلب الحافز i. يستبعد التداخل المتواضع لقواعد A5 والمسافة بين المستويات الأساسية ، ∼5 Å ، تفاعلات التراص. I5 في [د (5mCCTCICTCC)]2 و A5 في [د (5mCCTCICTCC)]2 متصلة بزوج C4 • C4 + بقمم متقاطعة مشابهة. يشير هذا إلى اتجاهات مماثلة لقواعد البيورين في كل هيكل.

تم وصف العديد من هياكل عزر i باهتة وأحادية اللون. في جميع الحالات ، تحتوي الحلقات التي تعبر الأخاديد الضيقة (المخلفات التي تحتها خط في التسلسل أدناه) على اثنين من البقايا ، كما هو الحال في ثنائيات d (5mCCT CT CC) (2) والعنصر i الأحادي لـ d ( CC TT TCCTTTACC TT TCC) (18) ، ثلاث بقايا في حالة [d (CCCC TGT CCCC)]2 (19) ولحفة i أحادية اللون لـ d (CCCTAACCC TAA CCCTAACCC) (20) أو أربعة بقايا كما هو موضح لثنائي d (TCCC GTTT CCA) (21). توضح الدراسة الحالية أن بقايا واحدة يمكن أن تمتد عبر الأخدود الضيق لعزر i بدون تشويه ملحوظ لأزواج C • C + المجاورة. في دبوس الشعر d (GCG A AGC) المستقر للغاية ، تم وصف حلقة صغيرة تحتوي على أدينين واحد ، A4 ، (22 ، 23) ، ولكن في هذا المثال ، يتم تكديس A4 إلى بقايا G3 المجاورة والتي تشكل عنصرًا غير قياسي G4 • A5 زوج.

سكر الفوسفات الأساسي

كما لوحظ سابقًا في هياكل i-motif الأخرى (20) ، فإن الطيف 31 P لـ [d (5mCCTCACTCC)]2 يعرض تشتت طيفي جيد (2.07 جزء في المليون الشكل 3). الطيف 31 P من [d (5mCCTCICTCC)]2 يكاد يكون مستحيلًا للغاية ، باستثناء 31 P على كل جانب من بقايا البيورين (الجدول التكميلي S1). لقد تم اقتراح أن التحولات الكيميائية 31 P للازدواج B-DNA مرتبطة بزوايا ε ثنائية السطوح (24). يمكن ملاحظة أن التحولات الكيميائية 31 P لـ [d (5mCCTCACTCC)]2 وبنية الحافز i للتكرارات التيلوميرية البشرية (20) تظهر علاقة ضعيفة للغاية مع قيم الزاوية المشتقة من ثابت اقتران 3 J 1 H3′- 31 P.

تتميز مطابقة BI و BII للعمود الفقري للفوسفات بالفرق (ε − ζ) (25). تشير قيم (ε − ζ) المقاسة لبقايا T3 و A5 غير المقترنة ، 209 ± 9 ° و 133 ± 59 ° ، على التوالي ، إلى أن ذرة الفوسفور في جانبها الثالث (P4 و P6) تتبنى التشكل غير المألوف BII بينما تتوافق قيم (ε − ζ) المقاسة للمخلفات الأخرى مع تشكل BI ، حيث يتم ملاحظة ذلك بشكل عام في هياكل i-motif. الملاحظة التي تشير إلى أن جميع البقايا ذات القمم المتقاطعة القوية (الضعيفة) H6 / H8- H3 تظهر قمم متقاطعة ضعيفة (قوية) H3′- 31 P (الشكل 4) تشير إلى بعض الارتباط بين تجاعيد السكر وزوايا ثنائية السطوح.

القمم المتقاطعة NOESY المقابلة للتسلسل القصير (H2 ″)ن- (H5 ′)ن+1 مسافات 2.4-3 Å لوحظت في الخطوات 2-3 ، 7-8 و8-9 من [d (5mCCTCACTCC)]2 لم يتم ملاحظتها في دراسات الرنين المغناطيسي النووي السابقة لهياكل عزر i ، ربما بسبب ضعف دقة المناطق المقابلة لأطياف NOESY. يشير فحص هياكل i-motif من دراسات الرنين المغناطيسي النووي أو الأشعة السينية إلى أنه قصير (H2 ″)ن- (H5 ′)ن+1 المسافات ليست سمات منهجية. على سبيل المثال ، قياس المسافات المتسلسلة 12 × 4 بين H2 ′ / H2 ″ و H5 ′ / H5 بروتونات التركيب البلوري لـ [d (CCCC)]4 [(26) PDB رقم الانضمام. 190D] فقط أربع مسافات & lt3 Å ، كلها بين H2 ″ و H5 البروتونات. علاوة على ذلك ، فإن العديد من مسافات H5 ′ / H5 ″ -H2 ′ / H2 قصيرة جدًا أيضًا في عدة خطوات من التركيب البلوري لـ d (CGCGAATTCGCG)2 مزدوج [(27) PDB access no. 1BNA). وبالتالي ، نستنتج أن المسافات القصيرة H2 ″ -H5 ليست من سمات بنية i-motif ولكن نتيجة مزيج من ستة ((2 ، ε ، ζ)ن و (α ، β ، γ)ن+1) زوايا ثنائية الأضلاع.

مقارنة مع الهياكل ذات الصلة

يوضح الشكل 9 أن الشكل الهيكلي لجوهر [d (5mCCTCACTCC)]2 يرتبط ارتباطًا وثيقًا بعنصر i لـ [d (5mCCTCC)]4 (2). تم بناء هذا tetramer عن طريق إقحام اثنين من الدوبلكس المتماثل غير المكافئ. ترتيب التراص هو C5 -5mC1- C4 -C2- (T3) -T3- C2 -C4- 5mC1 -C5. في وحدة الطباعة على الوجهين التي يتم وضع خط تحتها بقاياها ، يتم لف الثيميدينات (T3). في أشكال الطباعة المزدوجة الأخرى T3 ، يكون هناك زوج T3 • T3. تُظهر القمم المتقاطعة التبادلية الملاحظة بين البروتونات المتجانسة لكل مزدوج أن الإغلاق المتزامن لبقايا (T3) وفتح زوج T3 • T3 يتبادلان الهياكل المزدوجة بمعدل قريب من 1 ثانية عند 0 درجة مئوية. يوضح الشكل 9 أن عملية التحويل البيني المكافئة في [d (5mCCTCACTCC)]2 قد يتضمن فتح الزوج T7 • T7 والاقتران المتزامن لبقايا T3 المفتوحة. إن عدم وجود نسبة يمكن اكتشافها من الأنواع ثنائية الأبعاد ذات الثيميدين T7 المفتوح و T3 المقترن هو نتيجة لعدم تكافؤ بقايا T في الثايمي. أ [د (5mCCTCACTCC)]2 يمكن تصميم الهيكل مع قواعد T3 المقترنة و T7 المفتوحة دون اتصال ملحوظ لـ van der Waal ولا تعطي المقارنة بين الهياكل المرصودة والمحاكاة أي مؤشرات حول اختلاف الطاقة الحرة بينهما.

الحركات الداخلية في [d (5mCCTCACTCC)]2

يشتمل قلب الثنائيات على ثلاثة أزواج ذات بروتونات نصفية طويلة العمر: C1 • C1 + و C8 • C8 + و C2 • C2 +. على الرغم من التشابه الهيكلي بين الثنائيات و [d (5mCCTCC)]4 الهياكل (الشكل 9) ، تُظهر المقارنة بين حركية فتح الزوج الأساسي أنه في الثنائيات ، فإن عمر الأزواج C1 • C1 + و C8 • C8 + و C2 • C2 + هو 10 أضعاف نظيراتها في الرباعي .

إن عمر الثنائيات وأوقات التبادل للبروتون الأميني المرتبط بـ H لأزواج C • C + الثلاثة طويلة العمر قابلة للمقارنة (الشكل 6). يشير هذا بقوة إلى أن تبادل البروتون الأميني يتطلب تفككًا باهتًا. لوحظ الفرق الهائل بين أوقات تبادل البروتونات الأمينية المرتبطة بـ H وبين البروتونات الأمينية الخارجية في الدراسات السابقة لهياكل i-motif (6). في [د (5mCCTCACTCC)]2 يبدو أن دوران المجموعة الأمينية حول الرابطة C4-N4 معوق تمامًا بالنسبة للمخلفات C1 و C8 و C2. هذا على الأرجح نتيجة التراص المحكم لهذه المخلفات. توفر مقارنة وقت تبادل البروتونات الأمينية المرتبطة بـ H مع بقايا السيتدين الحرة ، 0.15 ثانية عند 0 درجة مئوية ، ودرجة الحموضة 5.6 ، (28) قيمة حد أعلى تبلغ 10 −5 لثوابت التفكك للأزواج 1.8 و 2.

حركية التوازن بين المونومر والثنائي

السمة البارزة التي تظهر من دراسة الخواص الحركية هي بطء معدلات تكوين الثنائيات والتفكك. تتوافق هذه الملاحظة مع التخلفية المذهلة التي لوحظت في ملامح الذوبان وإعادة التشبع للهياكل i-motif (4). حركية التكوين والتفكك لـ [d (5mCCTCACTCC)]2 يُظهر اختلافات ملفتة للنظر مع تلك الموجودة في الدوبلكس Watson – Crick (29 ، 30). معدل ارتباط قليل النوكليوتيدات التكميلية في Watson-Crick على الوجهين يتراوح بين 5 × 10 5 و 10 7 M −1 s −1. وهي مستقلة عن الرقم الهيدروجيني (∼7) وتعتمد بشكل ضعيف على طول قليل النوكليوتيد ودرجة الحرارة. العمر عند 20 درجة مئوية لدرجات Watson-Crick المزدوجة التي تحتوي على عدد من الأزواج الأساسية يمكن مقارنتها بـ [d (5mCCTCACTCC)]2 في حدود 0.15-1 ثانية.

بين الرقم الهيدروجيني 4.8 و 6.8 ، معدل الارتباط ، كتشغيل، من خيطين d (5mCCTCACTCC) في ثنائي عزر i يختلف بمقدار 10 −pH (الشكل 8 أ). أصل هذا الاعتماد على الرقم الهيدروجيني تافه. يعكس تباين تركيز شريك C + البروتوني. يمكن توقع أنه بالنسبة لقيم الأس الهيدروجيني الأصغر من السيتدين pكN3, كتشغيل يجب أن تنخفض لسبب متماثل: خلخلة الشريك C المحايد. ومع ذلك ، بمجرد أخذ تأثير الأس الهيدروجيني في الاعتبار على تركيز الشركاء المتفاعلين ، نجد أن المعدل المستقل للرقم الهيدروجيني ،

[د (5mCCTCACTCC)]2 يتطلب تكوين بروتون ستة سيتدينات. ومن ثم ، ستحدث عملية ثنائية تعاونية بالكامل بمعدل يعتمد على قوة ستة من تركيز البروتون. يُظهر المعدل المقاس الذي يزداد مع تركيز البروتون بوضوح أن ثنائي الميتر لا يستلزم تكوينًا تعاونيًا لستة أزواج C • C + ويوحي بأن استطالة البنية نصف البروتونية جزئيًا تحدث خطوة بخطوة عبر التكوين المتتالي لأزواج C • C + ذات البروتونات النصفية.

عمر [d (5mCCTCACTCC)]2 يقع في نطاق الساعات حول درجة الحموضة 4.8 وينخفض ​​تقريبًا بمقدار 10 درجة حموضة عندما يرتفع الرقم الهيدروجيني (الشكل 8 أ). ومع ذلك ، فإن مقارنة الأطياف عند الرقم الهيدروجيني 4.8 و 6.8 ، لا تعطي أي مؤشر على تغيير هيكلي يفسر تقليل عمر الثنائيات.

نصف البروتون درجة الحموضة ، الرقم الهيدروجيني1/2، من أزواج هيميبروتونيد يعتمد على السيتدين pKN3 وعلى ثابت تفكك زوج القاعدة: الرقم الهيدروجيني1/2 ≈ صكN3 - سجل (كديس) (32). ومن ثم ، مع تقدير أقل من 10 5 لثوابت تفككهم (راجع أعلاه) ، يجب أن يكون الأزواج 1.8 و 2 ثابتًا حتى الرقم الهيدروجيني 9.3.

يتمتع زوجا C • C + و C6 • C6 + الخارجيان بعمر قصير للغاية واستقرار متواضع على الأرجح. من المحتمل أنه عند درجة الحموضة المرتفعة ، يزيد عدم البروتون المؤقت من عمر الحالة المفتوحة لهذه الأزواج وينتج عنه زعزعة استقرار الزوج الداخلي عن طريق التآكل النهائي. إذا كان اضطراب الأزواج الخارجية يقلل بشدة من عمر الثنائيات ، فإن نسبة صغيرة من الزوج المفتوح ، التي لا يمكن اكتشافها على الطيف الثنائي ، قد تساهم بكفاءة في تقليل عمر عزر i. وفقًا لهذا التفسير ، يمكن تخمين أن ثبات i-motif عند درجة حموضة عالية يعتمد بشدة على استقرار الزوج الخارجي.

في الهياكل أحادية الجزيء i-motif لـ d (CC TT TCCTTTACC TT TCC) (18) و d (CCCTAACCC TAA CCCTAACCC) (20) ، تتم حماية الأزواج الخارجية إلى حد ما بواسطة الحلقات التي تعبر الأخاديد وهناك عمر ما لا يقل عن 10 أضعاف من الأزواج الخارجية من [d (5mCCTCACTCC)]. قد يكون هذا مرتبطًا بالاستقرار الأفضل للهياكل المطوية عند درجة حموضة عالية ومع ملاحظة أن عمر هيكل d المطوي (CCCTAACCC TAA CCCTAACCC) هو نفسه عند الرقم الهيدروجيني 5 و 6 (33). الهياكل المصممة بأوليغنوكليوتيدات غنية بـ C منتهية بمخلفات تكميلية تسمح بتكوين قلب عزر i محمي عند كل طرف بواسطة أزواج مزدوجة متوازية مكدسة على أزواج C • C + الخارجية قد توفر نماذج مثيرة للاهتمام لاختبار تأثير التشويش النهائي على الثبات من هيكل i-motif.

أخيرًا ، يمكن ملاحظة أن الاعتماد على الرقم الهيدروجيني كتشغيل و كإيقاف يؤدي إلى تقليل ثبات الثبات بمعامل 100 عندما يرتفع الرقم الهيدروجيني بوحدة واحدة. يوضح هذا بوضوح أن بيئة الاستقرار ، ولا سيما للأزواج الخارجية ذات البروتونات النصفية ، هي أ شرط لا غنى عنه شرط وجود i-motif في بيئة الخلية ووظيفة بيولوجية لهياكل i-motif.

قيود المسافة والثنائية السطوح والانتهاكات والانحرافات عن الهندسة المثالية لـ [d (5mCCTCACTCC)]2

قيود البقايا الداخلية أ 103
قيود البقايا الداخلية البروتونات القابلة للتبديل ب 45
قيود البقايا الداخلية ، البروتونات غير القابلة للتبديل 40
قيود الاقتران بقاعدة ج 20
القيود البغيضة د 90
عدد الزوايا ثنائية الأضلاع المقيدة e 17
مخالفات قيود الإدخال و عدد RMSD
انتهاكات NOE & GT0.2 Å 4.2 ± 1.3 0.067 ± 0.05
انتهاكات ثنائية السطوح و GT6 ° 3.2 ± 0.7 4.4 ± 1.4
الانحرافات عن الهندسة المثالية
الانحرافات الزاوية & gt6 ° 6.4 ± 0.7 1.7 ± 0.5
الانحرافات على طول السندات و GT0.05 0 0.008 ± 0.001
انحراف غير لائق & gt6 ° 0 0.9 ± 0.05
عدد جهات اتصال van der Waal 0
زوجي RMSD في الحساب الهيكلي (Å) (F) القواعد سكر المجموعة P
0.38 0.41 1.1
قيود البقايا الداخلية أ 103
قيود البقايا الداخلية البروتونات القابلة للتبديل ب 45
قيود البقايا الداخلية ، البروتونات غير القابلة للتبديل 40
قيود الاقتران بقاعدة ج 20
القيود البغيضة د 90
عدد الزوايا ثنائية الأضلاع المقيدة e 17
مخالفات قيود الإدخال و عدد RMSD
انتهاكات NOE & GT0.2 Å 4.2 ± 1.3 0.067 ± 0.05
انتهاكات ثنائية السطوح و GT6 ° 3.2 ± 0.7 4.4 ± 1.4
الانحرافات عن الهندسة المثالية
الانحرافات الزاوية & gt6 ° 6.4 ± 0.7 1.7 ± 0.5
الانحرافات على طول السندات و GT0.05 0 0.008 ± 0.001
انحراف غير لائق & gt6 ° 0 0.9 ± 0.05
عدد جهات اتصال van der Waal 0
زوجي RMSD في الحساب الهيكلي (Å) (F) القواعد سكر المجموعة P
0.38 0.41 1.1

(أ) تم فرض نفس قيود المسافة داخل البقايا بين كل زوج من المخلفات المتعلقة بالتناظر.

(ب) تم فرض نفس قيود المسافة بين المخلفات على اثنين لكل خصلة من أجل إنفاذ تكافؤهما.

c ثلاثة لكل C • C + أزواج واثنان للزوج T7 • T7.

د قيود المسافة المحددة بحد أدنى (راجع قسم المواد والطريقة).

e زاوية التدوير الكاذب لكل بقايا وزاوية لثمانية بقايا.

f محسوبة لـ 10 من المطابقات المختارة.

قيود المسافة والثنائية السطوح والانتهاكات والانحرافات عن الهندسة المثالية لـ [d (5mCCTCACTCC)]2

قيود البقايا الداخلية أ 103
قيود البقايا الداخلية البروتونات القابلة للتبديل ب 45
قيود البقايا الداخلية ، البروتونات غير القابلة للتبديل 40
قيود الاقتران بقاعدة ج 20
القيود البغيضة د 90
عدد الزوايا ثنائية الأضلاع المقيدة e 17
مخالفات قيود الإدخال و عدد RMSD
انتهاكات NOE & GT0.2 Å 4.2 ± 1.3 0.067 ± 0.05
انتهاكات ثنائية السطوح و GT6 ° 3.2 ± 0.7 4.4 ± 1.4
الانحرافات عن الهندسة المثالية
الانحرافات الزاوية & gt6 ° 6.4 ± 0.7 1.7 ± 0.5
الانحرافات على طول السندات و GT0.05 0 0.008 ± 0.001
انحراف غير لائق & gt6 ° 0 0.9 ± 0.05
عدد جهات اتصال van der Waal 0
زوجي RMSD في الحساب الهيكلي (Å) (F) القواعد سكر مجموعة ف
0.38 0.41 1.1
قيود البقايا الداخلية أ 103
قيود البقايا الداخلية البروتونات القابلة للتبديل ب 45
قيود البقايا الداخلية ، البروتونات غير القابلة للتبديل 40
قيود الاقتران بقاعدة ج 20
القيود البغيضة د 90
عدد الزوايا ثنائية الأضلاع المقيدة e 17
مخالفات قيود الإدخال و عدد RMSD
انتهاكات NOE & GT0.2 Å 4.2 ± 1.3 0.067 ± 0.05
انتهاكات ثنائي السطوح و GT6 ° 3.2 ± 0.7 4.4 ± 1.4
الانحرافات عن الهندسة المثالية
الانحرافات الزاوية & gt6 ° 6.4 ± 0.7 1.7 ± 0.5
الانحرافات على طول السندات و GT0.05 0 0.008 ± 0.001
انحراف غير لائق & gt6 ° 0 0.9 ± 0.05
عدد جهات اتصال van der Waal 0
زوجي RMSD في الحساب الهيكلي (Å) (F) القواعد سكر مجموعة ف
0.38 0.41 1.1

(أ) تم فرض نفس قيود المسافة داخل البقايا بين كل زوج من المخلفات المتعلقة بالتناظر.

(ب) تم فرض نفس قيود المسافة بين المخلفات على اثنين لكل خصلة من أجل إنفاذ تكافؤهما.

c ثلاثة لكل C • C + أزواج واثنان للزوج T7 • T7.

د قيود المسافة المحددة بحد أدنى (راجع قسم المواد والطريقة).

e زاوية التدوير الكاذب لكل بقايا وزاوية لثمانية بقايا.

f محسوبة لـ 10 من المطابقات المختارة.

منطقة بروتون قابلة للتبديل من multimers من (أ) د (5 mCCTCACTCC) (ب) د (5mCCTCICTCC)]2 و (ج) د (5mCCCCACCCC). يتم تمييز البروتونات الإيمينية برقم البقايا. منطقة البروتون العطرية H1 ′ التي تم حلها جيدًا في المولد المتعدد لـ d (5mCCTCATCTCC) في 2 H2يظهر الحل في الشكل الداخلي. تي = 5 درجات مئوية ، ودرجة الحموضة 4.3.

منطقة بروتون قابلة للتبديل من multimers من (أ) د (5 mCCTCACTCC) (ب) د (5mCCTCICTCC)]2 و (ج) د (5mCCCCACCCC). يتم تمييز البروتونات الإيمينية برقم البقايا. منطقة بروتون العطرية H1 ′ التي تم حلها جيدًا في المولد المتعدد لـ d (5mCCTCATCTCC) في 2 H2يظهر الحل في الشكل الداخلي. تي = 5 درجات مئوية ، ودرجة الحموضة 4.3.

تحديد القياس المتكافئ متعدد المرات. اللوحة اليسرى: معايرة الرنين المغناطيسي النووي عند التوازن. الأس الهيدروجيني 5.6 ، 0 درجة مئوية (دوائر مغلقة) و 25 درجة مئوية (دوائر مفتوحة). التركيز المتعدد الذي يزداد مع قوة اثنين من تركيز المونومر يكشف عن تكوين ثنائى. اللوحة اليمنى: تحديد قياس العناصر المتكافئة بواسطة كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، درجة الحموضة 4.5 ، في درجة حرارة الغرفة. وقت التحويل البيني بين المونومر والمتعدد أقصر من مرات الشطف. يتم التخلص من ذروة واحدة في موضع يعتمد على تركيز الخصلة. تم حساب ملاءمة موضع الذروة مقابل تركيز حبلا للمحلول المُزَال من أجل توازن ثنائي-مونومر مع ثابت تفكك 5 × 10 −7 م -1.

تحديد القياس المتكافئ متعدد المرات. اللوحة اليسرى: معايرة الرنين المغناطيسي النووي عند التوازن. الأس الهيدروجيني 5.6 ، 0 درجة مئوية (دوائر مغلقة) و 25 درجة مئوية (دوائر مفتوحة). التركيز المتعدد الذي يزداد مع قوة اثنين من تركيز المونومر يكشف عن تكوين ثنائى. اللوحة اليمنى: تحديد قياس العناصر المتكافئة بواسطة كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، درجة الحموضة 4.5 ، في درجة حرارة الغرفة. وقت التحويل البيني بين المونومر والمتعدد أقصر من مرات الشطف. يتم التخلص من ذروة واحدة في موضع يعتمد على تركيز الخصلة. تم حساب ملاءمة موضع الذروة مقابل تركيز حبلا للمحلول المُزَال من أجل توازن ثنائي-مونومر مع ثابت تفكك 5 × 10 −7 م -1.

تعيينات البروتون والتعريفات المتسلسلة عبر الرابطة في [d (5mCCTCATCTCC)]2. يتم تمييز القمم المتقاطعة برقم البقايا (تحتها خط H3 ′ مائل لـ H4). اللوحة العلوية: تحديد بروتونات H3 ′ و H4 ′ و H5 / H5 ″ على طيف HSQC بوفرة طبيعية. اللوحة المركزية: Aromatic-H3 ′ / H4 ′ / H5 ′ / H5 ″ منطقة من الطيف NOESY (وقت الخلط 250 مللي ثانية). اللوحة السفلية: تجربة 1 H - 31 P TOCSY توفر تحديدًا تسلسليًا من خلال (H3 ′)ن+1- (31 ف)ن- (H4′-H5 ′ / H5 ″)ن عبر القمم. تربط الخطوط الحمراء القمم المتقاطعة C4 (H3 ′) - A5 (31 P) و A5 (31P) -A5 (H4 ′ / H5 ′ / H5 ″) بالقمم المتقاطعة المقابلة لأطياف HSQC و NOESY. حالة الحل: تي = 5 درجة مئوية ، درجة الحموضة 4.4 ، 2 ساعة2يا حل ، حبلا تركيز 6 مم.

تعيينات البروتون والتعريفات المتسلسلة عبر الرابطة في [d (5mCCTCATCTCC)]2. يتم تمييز القمم المتقاطعة برقم البقايا (تحتها خط H3 ′ مائل لـ H4). اللوحة العلوية: تحديد بروتونات H3 ′ و H4 ′ و H5 / H5 ″ على طيف HSQC بوفرة طبيعية. اللوحة المركزية: Aromatic-H3 ′ / H4 ′ / H5 ′ / H5 ″ منطقة من الطيف NOESY (وقت الخلط 250 مللي ثانية). اللوحة السفلية: تجربة 1 H - 31 P TOCSY توفر تحديدًا تسلسليًا من خلال (H3 ′)ن+1- (31 ف)ن- (H4′-H5 ′ / H5 ″)ن عبر القمم. تربط الخطوط الحمراء القمم المتقاطعة C4 (H3 ′) - A5 (31 P) و A5 (31P) -A5 (H4 ′ / H5 ′ / H5 ″) بالقمم المتقاطعة المقابلة لأطياف HSQC و NOESY. حالة الحل: تي = 5 درجة مئوية ، درجة الحموضة 4.4 ، 2 ساعة2يا حل ، حبلا تركيز 6 مم.

مناطق مختارة من NOESY (وقت الخلط 50 مللي ثانية) و 1 H - 31 P أطياف مريحة من [d (5mCCTCACTCC)]2. يتم تمييز البروتونات H3 ′ وبعض بروتونات H5 برقم البقايا ، الأسود والأحمر ، على التوالي. اللوحة العلوية: H2 ′ / H2 ″ -H3 القمم المتقاطعة داخل المخلفات والمتسلسلة (H2 ′ / H2 ″)ن- (H5 ′)ن+1 القمم المتقاطعة بين: (α) T7 (H2 ″) - C8 (H5 ′) (β) C8 (H2 ″) - C9 (H5 ′) (χ) C2 (H2 ″) - C3 (H5 ′). باستثناء C8 (H2 ″) - C9 (H5 ″) (البيانات غير معروضة) فإن القمم المتقاطعة H2 ′ / H2 -H5 غير موجودة. اللوحة المركزية: تشير الكثافة القوية للقمم المتقاطعة H3′-H6 / H8 داخل المخلفات إلى التشكل N لـ C6 و T7 و C8 و C9. اللوحة السفلية: يُظهر طيف 1 H- 31 P COZY ضعيفًا منهجيًا H3′- 31 P COZY عبر القمم المتقاطعة للسكر في النطاق التوافقي N. حالة الحل: تي = 5 درجة مئوية ، درجة الحموضة 4.4 ، محلول 2 H O ، تركيز حبلا 6 مم.

مناطق مختارة من NOESY (وقت الخلط 50 مللي ثانية) و 1 H - 31 P أطياف مريحة من [d (5mCCTCACTCC)]2. يتم تمييز البروتونات H3 ′ وبعض البروتونات H5 برقم البقايا ، الأسود والأحمر ، على التوالي. اللوحة العلوية: H2 ′ / H2 ″ -H3 القمم المتقاطعة داخل المخلفات والمتسلسلة (H2 ′ / H2 ″)ن- (H5 ′)ن+1 القمم المتقاطعة بين: (α) T7 (H2 ″) - C8 (H5 ′) (β) C8 (H2 ″) - C9 (H5 ′) (χ) C2 (H2 ″) - C3 (H5 ′). باستثناء C8 (H2 ″) - C9 (H5 ″) (البيانات غير معروضة) فإن القمم المتقاطعة H2 ′ / H2 -H5 غير موجودة. اللوحة المركزية: تشير الكثافة القوية للقمم المتقاطعة H3′-H6 / H8 داخل المخلفات إلى التشكل N لـ C6 و T7 و C8 و C9. اللوحة السفلية: يُظهر طيف 1 H- 31 P COZY ضعيفًا منهجيًا H3′- 31 P COZY عبر القمم المتقاطعة للسكر في النطاق التوافقي N. حالة الحل: تي = 5 درجة مئوية ، درجة الحموضة 4.4 ، محلول 2 H O ، تركيز حبلا 6 مم.

المسافات القصيرة بين المخلفات (& lt4.7 Å) المستخدمة لحساب بنية [d (5mCCTCATCC)]2. يتم تمييز وجوه القواعد الموجهة في الاتجاه الخامس بخط أسود كثيف. البقايا غير السيتدين مظللة باللون الرمادي. يربط خط ثقيل متقطع المخلفات الأساسية المزدوجة.

المسافات القصيرة بين المخلفات (& lt4.7 Å) المستخدمة لحساب بنية [d (5mCCTCATCC)]2. يتم تمييز وجوه القواعد الموجهة في الاتجاه الخامس بخط أسود كثيف. البقايا غير السيتدين مظللة باللون الرمادي. يربط خط ثقيل متقطع المخلفات الأساسية المزدوجة.

عمر الزوج الأساسي ، وأوقات تبادل البروتونات الأمينية ، وعمر الثنائيات مقابل درجة الحرارة عند الرقم الهيدروجيني 5.6. عمر الأزواج C8 • C8 + (دوائر مغلقة) C1 • C1 + (مثلثات مغلقة) C2 • C2 + (مثلثات مفتوحة) و T7 • T7 (دوائر مفتوحة). وقت تبادل البروتون الأميني H-bonded للزوج 5mC1 • 5mC1 + (مربع مفتوح). وقت تبادل البروتونات الأمينية المرتبطة بشكل سيئ H-bonded الأزواج C8 • C8 + و C2 • C2 + قابلة للمقارنة. عمر ديمر (الصلبان).

عمر الزوج الأساسي ، وأوقات تبادل البروتونات الأمينية ، وعمر الثنائيات مقابل درجة الحرارة عند الرقم الهيدروجيني 5.6. عمر الأزواج C8 • C8 + (دوائر مغلقة) C1 • C1 + (مثلثات مغلقة) C2 • C2 + (مثلثات مفتوحة) و T7 • T7 (دوائر مفتوحة). وقت تبادل البروتون الأميني H-bonded للزوج 5mC1 • 5mC1 + (مربع مفتوح). يمكن مقارنة وقت تبادل البروتونات الأمينية المرتبطة بشكل سيئ H-bonded للأزواج C8 • C8 + و C2 • C2 +. عمر ديمر (الصلبان).

حركية الارتباط والتفكك لـ [d (5mCCTCACTCC)]2 وجزء ثنائى عند التوازن كدالة للرقم الهيدروجيني. (أ) حركيات التقليل لـ d (5mCCTCACTCC). كان قليل النوكليوتيد ، 0.125 ملي مولار ، في البداية أحاديًا. تركيز الثنائيات ، المقاس على أطياف الرنين المغناطيسي النووي التي تم جمعها كدالة للوقت ، يميل نحو توازن يعتمد على الرقم الهيدروجيني. يتم حساب النوبات وفقًا للمعادلة 1 مع F و كتشغيل قيم 0.48 و 3.4 M −1 s −1 عند الرقم الهيدروجيني 6.24 (مربع مغلق) 0.75 و 20.7 M −1 s −1 عند الرقم الهيدروجيني 5.82 (مربع مفتوح) 0.88 و 57.8 M −1 s −1 عند الرقم الهيدروجيني 5.45 (دائرة مغلقة) . (ب) حركيات التفكك لـ [d (5mCCTCACTCC)]2. بدأت القياسات مباشرة بعد التخفيف إلى 45 ميكرومتر من محلول خافت مركّز بالكامل. تم الحصول على أعمار الثنائيات ، 1130 و 480 و 158 ثانية عند الأس الهيدروجيني 5.23 و 5.7 و 6.2 ، على التوالي ، من النوبات الأسية. (ج) جزء من ثنائيات عزر i عند التوازن مقابل الأس الهيدروجيني. دوائر مغلقة: تي = 0 درجة مئوية ، تركيز حبلا 0.33 ملي مولار. دوائر مفتوحة: تي = 15 درجة مئوية ، وتركيز حبلا 0.1 مم.

حركية الارتباط والتفكك لـ [d (5mCCTCACTCC)]2 وجزء ثنائى عند التوازن كدالة للرقم الهيدروجيني. (أ) حركيات التقليل لـ d (5mCCTCACTCC). كان قليل النوكليوتيد ، 0.125 ملي مولار ، في البداية أحاديًا. تركيز الثنائيات ، المقاس على أطياف الرنين المغناطيسي النووي التي تم جمعها كدالة للوقت ، يميل نحو توازن يعتمد على الرقم الهيدروجيني. يتم حساب النوبات وفقًا للمعادلة 1 مع F و كتشغيل قيم 0.48 و 3.4 M −1 s −1 عند الرقم الهيدروجيني 6.24 (مربع مغلق) 0.75 و 20.7 M −1 s −1 عند الرقم الهيدروجيني 5.82 (مربع مفتوح) 0.88 و 57.8 M −1 s −1 عند الرقم الهيدروجيني 5.45 (دائرة مغلقة) . (ب) حركيات التفكك لـ [d (5mCCTCACTCC)]2. بدأت القياسات مباشرة بعد التخفيف إلى 45 ميكرومتر من محلول خافت مركّز بالكامل. تم الحصول على أعمار الثنائيات ، 1130 و 480 و 158 ثانية عند الأس الهيدروجيني 5.23 و 5.7 و 6.2 ، على التوالي ، من النوبات الأسية. (ج) جزء من ثنائيات عزر i عند التوازن مقابل الأس الهيدروجيني. دوائر مغلقة: تي = 0 درجة مئوية ، تركيز حبلا 0.33 ملي مولار. دوائر مفتوحة: تي = 15 درجة مئوية ، وتركيز حبلا 0.1 مم.

الخواص الحركية وثوابت التفكك لـ [d (5mCCTCACTCC)]2 كدالة للأس الهيدروجيني. (أ) معدل التكوين ثنائي الجزيء [d (5mCCTCACTCC)]2 مقابل الرقم الهيدروجيني. يتم حساب الملاءمة وفقًا للمعادلة 5 مع

الخواص الحركية وثوابت التفكك لـ [d (5mCCTCACTCC)]2 كدالة للأس الهيدروجيني. (أ) معدل التكوين ثنائي الجزيء [d (5mCCTCACTCC)]2 مقابل الرقم الهيدروجيني. يتم حساب الملاءمة وفقًا للمعادلة 5 مع

هيكل ثنائي الحافز i لـ d (5mCCTCATCTCC). (أ) التمثيل التخطيطي. يتكون الهيكل المكون من بروتينات نصفية من دبابيس شعر متصلة ببعضها البعض مترابطة بواسطة ستة C • C + زوج وبواسطة زوج T7 • T7. انقلبت قاعدة T3 في البستان الواسع. تصطف الأجزاء 5mC1-C2-C3-C4 و C6-T7-C8-T9 لكل دبوس شعر في الأخاديد الضيقة i-motif. بقايا واحدة ، A5 ، تدور عبر الأخدود الضيق. (ب) منظر طبيعي للأخدود الضيق لهيكل أقل طاقة. يتم رسم دبوس الشعر في الخلفية بخطوط رفيعة. (ج) عرض الوضع الطبيعي إلى الأخدود العريض لـ 10 من المطابقات المحددة. (د) يتم عرض ترتيب التراص في رباعي d (5mCCTCC) للمقارنة. [د (5mCCTCC)]4 يتكون من جهتين مزدوجتين غير متكافئتين. يؤدي الفتح المتزامن لـ T3 وإعادة إغلاق T3 إلى تحويل داخلي مزدوج (2). لم يتم ملاحظة هذه الحركة في [d (5mCCTCACTCC)]2 بسبب عدم معادلة الثيميدين.

هيكل ثنائي الحافز i لـ d (5mCCTCATCTCC). (أ) التمثيل التخطيطي. يتكون الهيكل المكون من بروتينات نصفية من دبابيس شعر متصلة ببعضها البعض مترابطة بواسطة ستة C • C + زوج وبواسطة زوج T7 • T7. انقلبت قاعدة T3 في البستان الواسع. تصطف الأجزاء 5mC1-C2-C3-C4 و C6-T7-C8-T9 لكل دبوس شعر في الأخاديد الضيقة i-motif. بقايا واحدة ، A5 ، تدور عبر الأخدود الضيق. (ب) منظر طبيعي للأخدود الضيق لهيكل أقل طاقة. يتم رسم دبوس الشعر في الخلفية بخطوط رفيعة. (ج) عرض الوضع الطبيعي إلى الأخدود العريض لـ 10 من المطابقات المحددة. (د) يتم عرض ترتيب التراص في رباعي d (5mCCTCC) للمقارنة. [د (5mCCTCC)]4 يتكون من جهتين مزدوجتين غير متكافئتين. يؤدي الفتح المتزامن لـ T3 وإعادة إغلاق T3 إلى تحويل داخلي مزدوج (2). لم يتم ملاحظة هذه الحركة في [d (5mCCTCACTCC)]2 بسبب عدم معادلة الثيميدين.

زوايا العمود الفقري ثنائية السطوح (α − ζ) ، زوايا الجليكوسيد (χ) ، زوايا الدوران الزائفة (P) ، الالتواء الحلزوني (h) في ثنائيات الحافز i لـ [d (5mCCTCACTCC)]4

بقايا. α (ϒ). β (ϒ). γ (ϒ). δ (ϒ). ε (ϒ). ζ (ϒ). χ (ϒ). Π (ϒ). η تحريف (°).
1 79 ± 3 140 ± 8 252 ± 5.6 305 ± 33 224 ± 6 103 ± 4 ب
2 أ أ 187 ± 22 81.9 ± 18 248 ± 2 308 ± 3 195 ± 2 56 ± 3 16 ± 3
3 279 ± 2 217 ± 3 53 ± 3 153 ± 2 297 ± 4 88.1 ± 6 258 ± 3 163 ± 4
4 190 ± 17 176 ± 8 103 ± 18 153 ± 4 253 ± 4 239 ± 24 225 ± 6 125 ± 45
5 297 ± 26 80 ± 15 165 ± 12 129 ± 20 266 ± 25 133 ± 35 261 ± 9 124 ± 7
6 أ أ 83 ± 7 105 ± 29 226 ± 9 263 ± 3 233 ± 5 35 ± 4
7 269 ± 10 105 ± 10 103 ± 7 121 ± 4 52 ± 9 137 ± 32 206 ± 2 32 ± 7 −4.1 ± 4
8 أ 128 ± 17 30 ± 4 99 ± 4 135 ± 2 269 ± 40 236 ± 4 46 ± 2 41 ± 4
9 أ أ 43.6 ± 23 113 ± 11 258 ± 3 28 ± 3 25 ± 2
بقايا. α (ϒ). β (ϒ). γ (ϒ). δ (ϒ). ε (ϒ). ζ (ϒ). χ (ϒ). Π (ϒ). η تحريف (°).
1 79 ± 3 140 ± 8 252 ± 5.6 305 ± 33 224 ± 6 103 ± 4 ب
2 أ أ 187 ± 22 81.9 ± 18 248 ± 2 308 ± 3 195 ± 2 56 ± 3 16 ± 3
3 279 ± 2 217 ± 3 53 ± 3 153 ± 2 297 ± 4 88.1 ± 6 258 ± 3 163 ± 4
4 190 ± 17 176 ± 8 103 ± 18 153 ± 4 253 ± 4 239 ± 24 225 ± 6 125 ± 45
5 297 ± 26 80 ± 15 165 ± 12 129 ± 20 266 ± 25 133 ± 35 261 ± 9 124 ± 7
6 أ أ 83 ± 7 105 ± 29 226 ± 9 263 ± 3 233 ± 5 35 ± 4
7 269 ± 10 105 ± 10 103 ± 7 121 ± 4 52 ± 9 137 ± 32 206 ± 2 32 ± 7 −4.1 ± 4
8 أ 128 ± 17 30 ± 4 99 ± 4 135 ± 2 269 ± 40 236 ± 4 46 ± 2 41 ± 4
9 أ أ 43.6 ± 23 113 ± 11 258 ± 3 28 ± 3 25 ± 2

تم قياس المعلمات و SD من 10 المطابقات المختارة. يتم إعطاء قيم متوسط ​​الزاوية عندما يتم تجميع 7 على الأقل من القيم العشر المقاسة داخل قطاع 60 درجة.

(أ) لم يتم الوصول إلى تقارب المعيار هذا.

(ب) الالتواء الحلزوني هو الزاوية بين إسقاط نواقل C1′-N1 للقواعد المتجاورة بالتتابع في مستوى عمودي على محور اللولب. لا يتم عرضه للقواعد غير المكدسة.

زوايا العمود الفقري ثنائية السطوح (α − ζ) ، زوايا الجليكوسيد (χ) ، زوايا الدوران الزائفة (P) ، الالتواء الحلزوني (h) في ثنائيات الحافز i لـ [d (5mCCTCACTCC)]4

بقايا. α (ϒ). β (ϒ). γ (ϒ). δ (ϒ). ε (ϒ). ζ (ϒ). χ (ϒ). Π (ϒ). η تحريف (°).
1 79 ± 3 140 ± 8 252 ± 5.6 305 ± 33 224 ± 6 103 ± 4 ب
2 أ أ 187 ± 22 81.9 ± 18 248 ± 2 308 ± 3 195 ± 2 56 ± 3 16 ± 3
3 279 ± 2 217 ± 3 53 ± 3 153 ± 2 297 ± 4 88.1 ± 6 258 ± 3 163 ± 4
4 190 ± 17 176 ± 8 103 ± 18 153 ± 4 253 ± 4 239 ± 24 225 ± 6 125 ± 45
5 297 ± 26 80 ± 15 165 ± 12 129 ± 20 266 ± 25 133 ± 35 261 ± 9 124 ± 7
6 أ أ 83 ± 7 105 ± 29 226 ± 9 263 ± 3 233 ± 5 35 ± 4
7 269 ± 10 105 ± 10 103 ± 7 121 ± 4 52 ± 9 137 ± 32 206 ± 2 32 ± 7 −4.1 ± 4
8 أ 128 ± 17 30 ± 4 99 ± 4 135 ± 2 269 ± 40 236 ± 4 46 ± 2 41 ± 4
9 أ أ 43.6 ± 23 113 ± 11 258 ± 3 28 ± 3 25 ± 2
بقايا. α (ϒ). β (ϒ). γ (ϒ). δ (ϒ). ε (ϒ). ζ (ϒ). χ (ϒ). Π (ϒ). η تحريف (°).
1 79 ± 3 140 ± 8 252 ± 5.6 305 ± 33 224 ± 6 103 ± 4 ب
2 أ أ 187 ± 22 81.9 ± 18 248 ± 2 308 ± 3 195 ± 2 56 ± 3 16 ± 3
3 279 ± 2 217 ± 3 53 ± 3 153 ± 2 297 ± 4 88.1 ± 6 258 ± 3 163 ± 4
4 190 ± 17 176 ± 8 103 ± 18 153 ± 4 253 ± 4 239 ± 24 225 ± 6 125 ± 45
5 297 ± 26 80 ± 15 165 ± 12 129 ± 20 266 ± 25 133 ± 35 261 ± 9 124 ± 7
6 أ أ 83 ± 7 105 ± 29 226 ± 9 263 ± 3 233 ± 5 35 ± 4
7 269 ± 10 105 ± 10 103 ± 7 121 ± 4 52 ± 9 137 ± 32 206 ± 2 32 ± 7 −4.1 ± 4
8 أ 128 ± 17 30 ± 4 99 ± 4 135 ± 2 269 ± 40 236 ± 4 46 ± 2 41 ± 4
9 أ أ 43.6 ± 23 113 ± 11 258 ± 3 28 ± 3 25 ± 2

تم قياس المعلمات و SD من 10 المطابقات المختارة. يتم إعطاء قيم متوسط ​​الزاوية عندما يتم تجميع 7 على الأقل من القيم العشر المقاسة داخل قطاع 60 درجة.

(أ) لم يتم الوصول إلى تقارب المعيار هذا.

(ب) الالتواء الحلزوني هو الزاوية بين إسقاط نواقل C1′-N1 للقواعد المتجاورة بالتتابع في مستوى عمودي على محور اللولب. لا يتم عرضه للقواعد غير المكدسة.


شاهد الفيديو: مفتاح الديمر تركيبه وانواعه DIMMER (كانون الثاني 2022).