معلومة

7.16: Cerego- بدائيات النوى - علم الأحياء


من المغري عرض مواضيع مختلفة على أنها منفصلة تمامًا ، ولكن في الواقع ، غالبًا ما ترتبط الأفكار التي نغطيها في هذه الدورة ببعضها البعض. يمكن أن يساعدك استخدام مجموعة التدريبات هذه على الأداء الجيد في هذه الوحدة وأثناء تنقلك خلال الدورة التدريبية.

انقر هنا لعرض مجموعة التدريبات الخاصة بدائيات النوى. ستحتاج إلى إنشاء تسجيل دخول مجاني لممارسة هذه العناصر ، إذا لم تكن قد فعلت ذلك بالفعل.


كان الناس قادرين على التحكم في انتشار الفيروسات حتى قبل أن يعرفوا بوجودها. في عام 1717 ، لاحظت ماري مونتاجو ، زوجة سفير إنجليزي في الإمبراطورية العثمانية ، نساء محليات يقمن بتلقيح أطفالهن ضد مرض الجدري ، وهو مرض فيروسي معدي كان غالبًا مميتًا. تحصين يتضمن إدخال كمية صغيرة من الفيروس في جسم الشخص و rsquos للسماح لجسمه ببناء مناعة ضد الفيروس. تضمن هذا التلقيح المبكر للجدري وضع قشور الجدري في فتحة أنف شخص سليم.

اللقاحات

نظرًا لأن الفيروسات تستخدم آلية الخلية المضيفة للتكاثر والبقاء داخلها ، فمن الصعب التخلص منها دون قتل الخلية المضيفة. تم استخدام اللقاحات للوقاية من الالتهابات الفيروسية قبل وقت طويل من اكتشاف الفيروسات. أ مصل عبارة عن مزيج من مادة مستضدية ومنشطات مناعية أخرى تنتج مناعة ضد أحد مسببات الأمراض أو المرض. مصطلح & quotvaccine & quot يأتي من استخدام إدوارد جينر لجدري البقر (فاكا تعني بقرة باللاتينية) لتحصين الناس ضد الجدري.

يمكن أن تكون المادة الموجودة في اللقاح إما أشكالًا ضعيفة من مسببات الأمراض الحية أو الفيروسات ، أو مسببات الأمراض الميتة (أو الفيروسات المعطلة) ، أو المواد المنقاة مثل البروتينات الفيروسية ، أو القطع المعدلة وراثيًا من العامل الممرض. ستؤدي المادة الموجودة في اللقاح إلى قيام الجسم بتكوين استجابة مناعية ، وبالتالي يتطور الشخص حصانة لهذا المرض. كان الجدري هو المرض الأول الذي حاول الناس الوقاية منه عن طريق تطعيم أنفسهم عمدا بأنواع أخرى من العدوى مثل جدري البقر. تلقيح طريقة فعالة للوقاية من الالتهابات الفيروسية. يمكن إعطاء التطعيمات في المدارس الموضحة في شكل أدناه ، العيادات الصحية ، وحتى في المنزل. أدى استخدامها إلى انخفاض كبير في معدلات الاعتلال (المرض) والوفيات (الموت) المرتبطة بالعدوى الفيروسية مثل شلل الأطفال والحصبة والنكاف والحصبة الألمانية. يتم إنتاج اللقاحات المعدلة وراثيًا من خلال تقنية الحمض النووي المؤتلف. يتم إنتاج معظم اللقاحات الجديدة بهذه التكنولوجيا.

طالب شاب يتلقى لقاحًا.

أدت حملة تلقيح عالمية من قبل منظمة الصحة العالمية إلى القضاء على الجدري في عام 1979. الجدري مرض معدٍ ينفرد به البشر وينتج عن اثنين فاريولا الفيروسات. كان القضاء على الجدري ممكنًا لأن البشر هم الناقلون الوحيدون للفيروس. حتى يومنا هذا ، يعد الجدري المرض البشري المعدي الوحيد الذي تم القضاء عليه تمامًا من الطبيعة. يأمل العلماء في القضاء على شلل الأطفال بعد ذلك.

الأدوية المضادة للفيروسات

بينما كان الناس قادرين على منع بعض الأمراض الفيروسية عن طريق التطعيمات لمئات السنين ، فإن تطوير الأدوية المضادة للفيروسات لعلاج الأمراض الفيروسية يعد تطورًا حديثًا نسبيًا. الأدوية المضادة للفيروسات هي أدوية تستخدم خصيصًا لعلاج أعراض الالتهابات الفيروسية. كان أول دواء مضاد للفيروسات مضاد للفيروسات، وهي مادة تنتجها خلايا مناعية معينة بشكل طبيعي عند اكتشاف العدوى. على مدى السنوات العشرين الماضية ، ازداد تطوير الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية (المعروفة أيضًا باسم العلاج المضاد للفيروسات القهقرية) بسرعة. وقد كان وباء الإيدز هو الدافع وراء ذلك.

مثل المضادات الحيوية ، تستخدم مضادات فيروسات معينة لفيروسات معينة. فهي غير ضارة نسبيًا للمضيف ، وبالتالي يمكن استخدامها لعلاج الالتهابات. تم تصميم معظم الأدوية المضادة للفيروسات المتوفرة حاليًا للمساعدة في التعامل مع فيروسات فيروس نقص المناعة البشرية والهربس. تتوفر أيضًا مضادات الفيروسات لفيروسات الأنفلونزا وفيروسات التهاب الكبد B و C ، والتي يمكن أن تسبب سرطان الكبد.

غالبًا ما تكون الأدوية المضادة للفيروسات تقليدًا لبنات بناء الحمض النووي التي تدمجها الفيروسات في جينوماتها أثناء التكاثر. ثم تتوقف دورة حياة الفيروس لأن الحمض النووي المركب حديثًا غير نشط. على غرار المضادات الحيوية ، تخضع مضادات الفيروسات لمقاومة الأدوية حيث تتطور العوامل الممرضة للبقاء على قيد الحياة من التعرض للعلاج. يتهرب فيروس نقص المناعة البشرية من جهاز المناعة عن طريق تغيير تسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات على سطح الفيروس باستمرار. يعمل الباحثون الآن على توسيع نطاق الأدوية المضادة للفيروسات لتشمل عائلات أخرى من مسببات الأمراض.


يكشف تعدين الجينوم عن إمكانات نشطة بيولوجيًا غير محدودة للبكتيريا البحرية سالبة الجرام

خلفية: تنتشر مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية بسرعة ، متجاوزة السرعة التي يتم بها اكتشاف المركبات الجديدة وهذا يؤكد الحاجة الفورية لاكتشاف مركبات جديدة للسيطرة على الأمراض المعدية. تم فحص البكتيريا الأرضية لعقود من الزمن كمصدر للمركبات النشطة بيولوجيًا التي تؤدي إلى تطبيقات ناجحة في صناعات الأدوية والتكنولوجيا الحيوية. لم يتم استغلال البكتيريا البحرية حتى الآن بنفس القدر ، ومع ذلك ، يُعتقد أنها تحتوي على العديد من الكيمياء الحيوية النشطة الجديدة. لاستكشاف هذه الإمكانية ، تم تسلسل جينومات 21 بكتيريا Alpha- و Gammaproteobacteria البحرية التي تم جمعها خلال رحلة Galathea 3 واستخراجها من أجل مجموعات جينات ترميز المنتجات الطبيعية.

نتائج: بصرف النظر عن حجم الجينوم ، حملت البكتيريا من جميع الأجناس المختبرة عددًا كبيرًا من المجموعات التي تشفر أنشطة بيولوجية محتملة مختلفة ، خاصة داخل عائلات Vibrionaceae و Pseudoalteromonadaceae. تم تحديد إمكانات عالية للغاية في pseudoalteromonads المصطبغة مع ما يصل إلى 20 مجموعة في سلالة واحدة ، معظمها NRPSs و NRPS-PKS الهجينة. علاوة على ذلك ، تم فحص العناصر التنظيمية في المسارات المتعلقة بالنشاط الحيوي بما في ذلك استقلاب الكيتين ، واستشعار النصاب وأنظمة كسح الحديد في السيليكو وفي المختبر. تم تحديد الجينات ذات وظيفة Siderophore في 50 ٪ من السلالات ، ومع ذلك ، فقد احتوت جميعها باستثناء واحد على الجين المنظم لامتصاص الحديد. تم العثور على الجينات التي تشفر سينسيز لاكتونات الهوموسرين المتآكلة في بكتيريا روزوباكتر ، ولكن ليس في سلالات Vibrionaceae وفقط في سلالة Pseudoalteromonas واحدة. يمكن أن يساعد فهم هذه العناصر ومعالجتها في اكتشاف وإنتاج مركبات جديدة لم يتم تحديدها في ظروف الزراعة المخبرية العادية. تم إثبات إمكانات تحلل الكيتين العالية والتحقق منها لأنواع Vibrio و Pseudoalteromonas التي تعيش عادة في ارتباط وثيق مع الكائنات حقيقية النواة في البيئة. يبدو أن تنظيم الكيتين بواسطة هيستيدين كيناز ChiS هو سمة عامة لعائلة Vibrionaceae ، ومع ذلك فهو غائب في Pseudomonadaceae. ومن ثم ، فإن الدرجة التي يؤثر بها الكيتين على الأيض الثانوي في البكتيريا البحرية غير معروفة.

الاستنتاجات: باستخدام تقنيات التسلسل المتطورة بسرعة وأدوات البرمجيات جنبًا إلى جنب مع فحوصات النمط الظاهري في المختبر ، أظهرنا إمكانات النشاط الحيوي العالية للبكتيريا البحرية بطريقة فعالة ومباشرة - وهو نهج سيسهل اكتشاف المنتج الطبيعي في المستقبل.


الاستنتاجات والآفاق المستقبلية للتصنيف التكاملي

شهدت السنوات الماضية انخفاضًا مهمًا في العوائق التصنيفية: يتم استبدال النزاعات حول مفاهيم الأنواع بإجماع على وجهة نظر الأنواع باعتبارها سلالات [انظر [25]] يتم تسهيل الوصول إلى المعلومات التصنيفية الهامة من خلال مجموعة متنامية من الإنترنت- البنى التحتية مثل قواعد بيانات أسماء الأنواع ، والأوصاف الأصلية الرقمية ، والصور عبر الإنترنت لعينات النوع والأدب التاريخي [83] تقدم مجلة Zootaxa الناجحة للغاية مثالاً لمنصة سريعة لنشر دراسات التصنيف الحيواني [3] الاستخدام الواسع لتسلسل الحمض النووي قادت البيانات التصنيف إلى تسارع هائل في تحديد الأنواع المشفرة [مراجعة بواسطة [64]] والأنواع المرشحة [8 ، 80 ، 81 ، 84-88]. نحن نفترض أن هذه التطورات قد ساهمت بشكل عام في معدلات وصف الأنواع لتظل مستقرة تقريبًا عند 14000-25000 سنويًا منذ عام 1970 [89] على الرغم من انخفاض عدد خبراء التصنيف [90]. ومع ذلك ، إذا كانت تقديرات 10 ملايين نوع من حقيقيات النوى على الأرض صحيحة [18] ، فسنحتاج ، بالوتيرة الحالية ، إلى 400 عام من النشاط المستمر للبحث التصنيفي للوصول إلى جرد "كامل" للحياة. هذا ليس وقتًا معقولًا نظرًا لأن النشاط البشري يقود الأنواع إلى الانقراض غير القابل للعلاج بمعدل لم نشهده من قبل [91]. نحدد خمسة خطوط عمل رئيسية للتطوير العلمي للتصنيف التكاملي الذي من شأنه تسريع وصف الأنواع دون المساس بالدقة [cf. [92]] (الجدول 1). ومع ذلك ، لن يعتمد النجاح حصريًا على تطوير مفاهيم وأساليب جديدة. والأهم من ذلك ، هناك حاجة ماسة إلى مزيد من خبراء التصنيف والمزيد من التمويل للتصنيف [90]. يجب أن يكون التركيز الأقوى على النشر الفعلي للمراجعات المنهجية وأوصاف الأنواع جزءًا من استراتيجية للتخفيف من العائق التصنيفي [93].

على الرغم من أن الإجراءات التقليدية ستظل مفيدة في كثير من الحالات ، إلا أن التصنيف يحتاج إلى أن يكون تعدديًا وأن يدمج مناهج جديدة لترسيم حدود الأنواع إذا كان سيصبح نظامًا تطوريًا حديثًا. وهكذا ، على سبيل المثال ، "اتحاد الأسرة" - على حد تعبير جو فيلسنشتاين - بين مجالات علم الوراثة السكانية وجغرافيا السلالات مع علم الوراثة من خلال نظرية الاندماج ، والتي اعتبرت واحدة من أكثر التطورات إثارة مؤخرًا في علم اللاهوت النظامي [69] ( راجع أيضًا http://treethinkers.blogspot.com/) ، والتي يجب أن تستفيد أيضًا بشدة من التصنيف. يجب أن تتلاشى الآن ظلال الصراعات السابقة بين علماء التشكل وعلماء الأحياء الجزيئية ، ولن تكون المناقشات مجرد دمج أنواع مختلفة من الشخصيات ، بل مفاهيم وأساليب مختلفة لتحليلات الجينات السكانية ، والتطور الجغرافي ، والتطور. ربما لا توجد رصاصة سحرية لاكتشاف الأنواع وترسيم حدودها ، لكن إطارًا تكامليًا وتطوريًا يوفر لعلماء التصنيف ترسانة أكبر لمواجهة حقائق جرد التنوع البيولوجي الفعلي للكوكب - والذي تم التقليل من شأنه بشكل مؤسف.


تعرض RNAs الدائرية المشتقة من المضيف أنشطة أولية في الخلايا المصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي C.

تفسد الفيروسات مسارات الجزيئات الكبيرة في الخلايا المضيفة المصابة للمساعدة في تضخيم الجينات الفيروسية أو لمواجهة الاستجابات المناعية الفطرية. تم العثور على أدوار RNAs غير المشفر وغير المشفر ، بما في ذلك microRNAs ، لتوفير وظائف مؤيدة ومضادة للفيروسات. في الآونة الأخيرة ، تم التورط في دور الحمض النووي الريبي الدائري (CircRNAs) ، الذي يتم إنشاؤه بواسطة آلية الربط الخلفي النووي للـ pre-mRNAs ، في أن يكون له دور في الخلايا المصابة بفيروس الحمض النووي. تفحص هذه الدراسة منظر الحمض النووي الريبي الدائري في خلايا الكبد غير المصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي سي (HCV). أظهرت النتائج أن وفرة فئات متميزة من الجزيئات الحلقية تم تنظيمها أو خفضها في الخلايا المصابة. عرضت الجزيئات الحلقية التي تم تحديدها تأثيرات مؤيدة للفيروسات. أظهر أحد الجزيئات الحلقية التي تم تنظيمها بشكل خاص ، وهو CircPSD3 ، تأثيرًا واضحًا جدًا على وفرة الحمض النووي الريبي الفيروسي في كل من الخلايا المصابة بفيروس التهاب الكبد C وفيروس حمى الضنك. على الرغم من أن CircPSD3 قد ثبت أنه يربط العامل eIF4A3 الذي يعدل مسار الانحلال الخلوي (NMD) ، فإن CircPSD3 ينظم تضخيم الحمض النووي الريبي بطريقة مؤيدة للفيروسات في خطوة ما بعد الترجمة ، بينما يعرض eIF4A3 الخاصية المضادة للفيروسات لـ NMD مسار. تشير النتائج المستخلصة من التحليلات العالمية للمناظر الطبيعية الدائرية للحمض النووي الريبي إلى أن الوظائف المؤيدة والمرجحة المضادة للفيروسات يتم تنفيذها بواسطة الجزيئات الحلقية التي تعدل التعبير الجيني الفيروسي بالإضافة إلى مسارات المضيف. بسبب نصف عمرها الطويل ، من المحتمل أن تلعب الجزيئات الحلقية دورًا مهمًا غير معروف حتى الآن في التسبب في المرض الفيروسي.

بيان تضارب المصالح

وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.

الأرقام

الشكل 1. يسبب التهاب الكبد الفيروسي (HCV) تعبيرًا تفاضليًا عن ...

التين 1. HCV يثير التعبير التفاضلي للحلقات الحلقية.

( أ ) نظرة عامة تجريبية لتحديد ...

الشكل 2. آثار الدورة الخارجية والدائرية ...

الشكل 2. تأثيرات السيركسوسك والنضوب الدائري على العدوى بفيروس التهاب الكبد (سي).

الشكل 3. آثار استنفاد مادة CircPSD3 على ...

الشكل 3. آثار استنفاد CircPSD3 على وفرة HCV RNA.

الشكل 4: آثار استنفاد مادة CircPSD3 على ...

الشكل 4. آثار استنفاد circPSD3 على وفرة DENV و CHIKV RNA.

الشكل 5. توطين circPSD3 RNA في ...

الشكل 5. توطين CircPSD3 RNA في خلايا الكبد.

الشكل 6. آثار استنفاد جزيء الحمض النووي الريبي CircPSD3 ...

الشكل 6. آثار استنفاد الحمض النووي الريبي circPSD3 على التعبير الجيني للنمط الجيني HCV 1a و 2.

الشكل 7. حركية الدائرة الدائرة 3 و NMD ...

الشكل 7. حركية تراكم الركيزة CircPSD3 و NMD mRNA أثناء الإصابة بفيروس HCV.

الشكل 8. آثار جزيء الحمض النووي الريبي CircPSD3 و ...

الشكل 8. آثار استنفاد circPSD3 RNA و eIF4A3 على وفرة الركيزة NMD وعلى ...


7.16: Cerego- بدائيات النوى - علم الأحياء

مطلوب الاشتراك في J o VE لعرض هذا المحتوى. ستتمكن من رؤية أول 20 ثانية فقط.

يتوافق مشغل الفيديو JoVE مع HTML5 و Adobe Flash. المتصفحات القديمة التي لا تدعم HTML5 وبرنامج ترميز الفيديو H.264 ستظل تستخدم مشغل فيديو يعتمد على Flash. نوصي بتنزيل أحدث إصدار من Flash هنا ، لكننا ندعم جميع الإصدارات 10 وما فوق.

إذا لم يساعد ذلك ، فيرجى إخبارنا بذلك.

في بدائيات النوى ، يبدأ تكرار الحمض النووي عندما ترتبط البروتينات البادئة بأصل التكرار ، وهي منطقة صغيرة من الحمض النووي تحتوي على تسلسل محدد من القواعد ، مما يؤدي إلى تكوين معقد.

يساعد هذا المركب في البداية على فصل الحمض النووي. ثم يرتبط إنزيم هليكاز الحمض النووي به ويستمر في فك الحمض النووي عن طريق كسر الروابط الهيدروجينية بين الخيوط التكميلية. يتم تثبيت المناطق المفتوحة حديثًا بواسطة بروتينات ربط الحمض النووي أحادية السلسلة. يمكن أن يعمل كل واحد الآن كقالب لتركيب خيط جديد من الحمض النووي.

يستمر الفك والتركيب في كلا الاتجاهين من الأصل ، مما يؤدي إلى إنشاء شوكتي نسخ متماثل. أمام الشوكات ، ترتبط إنزيمات توبويزوميراز بالحمض النووي وتقلل من الإجهاد الالتوائي مع فك الجزيء.

بمجرد فصل الخيوط ، يقوم إنزيم آخر ، وهو primase ، بتركيب مادة أولية من RNA ، وهي امتداد قصير من RNA مكمل لتسلسل الحمض النووي. يوفر التمهيدي مكانًا لإنزيم بوليميراز الحمض النووي لإضافة نيوكليوتيدات مكملة لتسلسل الحمض النووي ، مما يخلق خيطًا جديدًا للحمض النووي في عملية تسمى الاستطالة.

يقوم بوليميراز الحمض النووي بتوليف الحمض النووي في الاتجاه الخامس إلى الثالث للجزيء ، وبالتالي فإن تركيب هذا الخيط ، الخيط الرئيسي ، يستمر بشكل مستمر. الشريط الآخر ، الخيط المتأخر ، له اتجاه معاكس. ونتيجة لذلك ، يتم تصنيع الحمض النووي في قطع قصيرة تسمى شظايا Okazaki ، ممدودة من بادئات RNA إضافية إلى الوراء من الاتجاه العام لحركة شوكة النسخ المتماثل.

يتم بعد ذلك استئصال بادئات الحمض النووي الريبي بواسطة إنزيمات مثل RNAs ، واستبدالها بالحمض النووي ، ويتم ربط أجزاء الحمض النووي معًا بواسطة إنزيم DNA ligase ، مما يؤدي إلى تكوين خيط مستمر.

يستمر تكرار الحمض النووي حول الجزيء بأكمله ، مما ينتج عنه جزيئين دائريين من الحمض النووي. تعتبر هذه عملية شبه تحفظية ، لأن كل جزيء يحتوي على خيط قديم واحد وخيط واحد جديد.

6.1: النسخ المتماثل في بدائيات النوى

ملخص

يتألف تكرار الحمض النووي من ثلاث خطوات رئيسية: البدء والاستطالة والإنهاء. يبدأ النسخ المتماثل في بدائيات النوى عندما ترتبط البروتينات البادئة بالأصل الفردي للنسخ المتماثل (أوري) على الكروموسوم الدائري للخلية ورسكووس. ثم يستمر النسخ المتماثل حول الدائرة الكاملة للكروموسوم في كل اتجاه من شوكتي نسخ متماثل ، مما ينتج عنه جزيئين من الحمض النووي.

تعمل العديد من البروتينات معًا لتكرار الكروموسوم

يتم تنسيق النسخ المتماثل وتنفيذه بواسطة مجموعة من البروتينات المتخصصة. يكسر Topoisomerase جانبًا واحدًا من العمود الفقري للفوسفات والسكر مزدوج السلسلة ، مما يسمح للحلزون DNA بالفك بسرعة أكبر ، بينما يكسر الهليكاز الروابط بين أزواج القواعد عند الشوكة ، ويفصل الحمض النووي إلى شقين. تعمل البروتينات التي تربط جزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة على استقرار الخيوط بينما تنتقل شوكة النسخ على طول الكروموسوم. لا يمكن تصنيع الحمض النووي إلا في الاتجاه 5 & rsquo إلى 3 & rsquo ، لذا فإن خيطًا واحدًا من القالب و mdash ممدودًا بشكل مستمر ، بينما الخيط الآخر و mdashis يتم تصنيعه في قطع أقصر من 1000-2000 زوج أساسي يسمى شظايا Okazaki.

البوليميرات المتعددة تشارك في الاستطالة

تم إجراء الكثير من الأبحاث لفهم تكاثر الحمض النووي بدائية النواة في البكتيريا الإشريكية القولونية، وهو كائن نموذجي شائع الاستخدام. بكتريا قولونية يحتوي على 5 بوليميرات DNA: Pol I و II و III و IV و V. Pol III مسؤول عن غالبية تكاثر الحمض النووي. يمكنها بلمرة حوالي 1000 زوج قاعدي في الثانية. تسمح هذه الوتيرة المذهلة للآلات الموجودة في شوكتي النسخ المتماثل بتكرار ملف بكتريا قولونية كروموسوم و [مدش] 4.6 مليون زوج قاعدي و [مدشين] حوالي 40 دقيقة. يتميز DNA polymerase I جيدًا أيضًا أن دوره الأساسي هو إزالة بادئات RNA من بداية شظايا Okazaki على الخيط المتأخر.

عندما تتجاوز القسمة الازدواجية

في ظل ظروف النمو المواتية ، بكتريا قولونية كل 20 دقيقة ، أي حوالي نصف الوقت الذي يستغرقه تكرار الجينوم. كيف يكون هذا ممكنا عندما يجب أن يكون لكل من الخلايا البنت الحمض النووي الخاص بها؟ وجد العلماء أن البكتيريا يمكن أن تبدأ جولة أخرى من تكرار الحمض النووي من أصل التكاثر قبل اكتمال الجولة الأولى ، وهذا يعني أن الخلايا الوليدة تتلقى كروموسومًا قيد النسخ بالفعل وتكون مستعدة للانقسام مرة أخرى بسرعة كبيرة.


7.16: Cerego- بدائيات النوى - علم الأحياء


C2005 / F2401 '07 - المحاضرة رقم 13 - RNA & amp ؛ تخليق البروتين

النشرات: 13 أ - مقارنة بين تخليق الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي 13 ب - تخليق البروتين.

2007 ديبورا موشوفيتز ولورنس شاسين قسم العلوم البيولوجية جامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك. آخر تحرير 17/10/2007 04:51 مساءً

1. من أين يأتي الحمض النووي الريبي؟
أنت بحاجة إلى الكثير من أنواع الحمض النووي الريبي لصنع البروتين - الحمض الريبي النووي النقال ، الرنا الريباسي وأمبير الرنا (انظر المحاضرة الأخيرة). كيف تصنع ال RNA؟ يتم نسخ كل الحمض النووي الريبي من قالب الحمض النووي. انظر Sadava 12.5 (12.4) أو شكل بيكر. 21-9 أمبير 21-11 (19-9 أمبير 19-11).

II. تخليق الحمض النووي مقابل تخليق الحمض النووي الريبي. أسهل طريقة لتجاوز تخليق الحمض النووي الريبي ، بالنظر إلى أننا ناقشنا تخليق الحمض النووي بإسهاب ، هي مقارنة تخليق الحمض النووي والحمض النووي الريبي. انظر النشرة 13-أ

أ.الآلية الأساسية للاستطالة هي نفسها:

1. استخدام نوكليوزيد ثلاثي الفوسفات (تلك التي تحتوي على ريبوز ليست deoxyribose ، ولكن الآلية نفسها) & amp ينقسم PPأنا استخدم بيروفوسفاتاز.

2. تنمو السلسلة من 5 إلى 3 بالإضافة إلى 3 'النهاية .

3. تحتاج إلى قالب DNA مضاد للتوازي ، ضع في قواعد تكميلية - أزواج (في القالب) مع U وليس T ، ولكن بخلاف ذلك

4. جميع جزيئات الحمض النووي الريبي (mRNA و tRNA و rRNA) ، وليس فقط جزيئات الرنا المرسال ، مصنوعة من قالب DNA. جزيئات الرنا الريباسي و الرنا الريباسي هي ليس مصنوعة من نموذج & quotmRNA & quot.

انظر المشاكل 7-1 و 7-2.

  • يتم تحفيز نمو سلسلة الحمض النووي بواسطة بوليميراز الحمض النووي (والإنزيمات المرتبطة به)

  • يتم تحفيز نمو سلسلة RNA بواسطة بوليميراز RNA.

  • RNA pol. يستخدم ريبونوكليوزيد ثلاثي الفوسفات.

  • يستخدم DNA pol ثلاثي فوسفات deoxyribonucleoside.

انظر المشكلة 7-5 أ.

  • الحمض النووي طويل ومزدوج تقطعت به السبل

  • الحمض النووي الريبي قصير ومفرد تقطعت به السبل

  • تخليق الحمض النووي: تتحرك الشوكة أسفل مكملات الحمض النووي على حد سواء يتم عمل خصلة واحدة جديدة بشكل مستمر وواحدة بشكل متقطع. هناك حاجة إلى Ligase لتخليق الخيط المتأخر.

  • تخليق الحمض النووي الريبي (RNA): ينتقل بوليميراز الحمض النووي الريبي إلى أسفل مكونًا الحمض النووي مكملًا لخيط واحد أو الآخر (في أي منطقة معينة). لذلك فإن تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) مستمر ولا يحتاج إلى ligase.

راجع المشكلات 7-3 و7-5C و 7-9.

  • بدء التسلسلات كمواقع ربط. إشارة البدء للنسخ أو النسخ المتماثل عبارة عن تسلسل في الحمض النووي يتعرف عليه موقع البوليميراز المناسب = موقع الربط لهذا البوليميراز
  • أسماء تسلسلات البداية
    يبدأ في تخليق الحمض النووي = الأصول. بولي DNA. يتعرف على (يرتبط) إشارات البدء للنسخ المتماثل التي تسمى الأصول (أوري).
    يبدأ لتوليف الحمض النووي الريبي = المروجين. RNA pol. يتعرف على (يرتبط) إشارات البدء للنسخ التي تسمى المحفزات (P's).
  • تفاصيل المروج:

1. المروجين تحديد اتجاه النسخ. المروِّج والإنزيم غير متماثلين ، لذلك بمجرد ارتباط الإنزيم ، يكون الطرف التحفيزي لـ RNA pol. هو & quotfacing & quot في اتجاه واحد ، وهذا يحدد اتجاه النسخ (وبالتالي أي الخيط سيكون قالبًا).

2. سيكون المروج عبارة عن تسلسل مزدوج تقطعت به السبل في نهاية الجين حيث يبدأ بوليميراز الحمض النووي الريبي (= على 3 'نهاية حبلا القالب = على 5' نهاية خيط الإحساس). من خلال السير على طول خيط المعنى ، فإن الطريقة التي يُكتب بها الجين عادة (5 'إلى 3' ، من اليسار إلى اليمين) هي & quot؛ تيار & quot؛ الجين.

انظر المشكلة 7-8.

ثالثا. تحسس & أمبير ؛ مضاد

أ. لماذا استخدام خيط واحد فقط في أي منطقة واحدة؟

1. وسيطة الوظيفة: يجب أن يكون Messenger RNA منفردًا لتلائم الريبوسوم ويجب ترجمته. إذا كان RNA مكملًا لـ mRNA موجودًا ، فماذا سيحدث؟ تهجين & quotsense & quot mRNA و & quotanti-sense & quot الرنا التكميلي. الناتج المزدوج تقطعت بهم السبل RNA لن تترجم. لذلك ، على الرغم من وجود الجين ، ومنسوخًا ، إلا أنه لن يتم تصنيع منتج بروتيني. هذا ما سيحدث إذا تم نسخ كلا الجدولين. انظر شكل Sadava 16.14 (16.11 في الطبعة السابعة ، 17.12 في السادس).

2. الحجة التطورية: إذا تم استخدام كلا الخيطين لصنع mRNA ، فلا يمكنك تحسين أحدهما دون العبث بالآخر ، والعكس صحيح. إذا كان الانتقاء الطبيعي يفضل تسلسل خصلة واحدة بحيث يكون لها وظيفة أو نشاط ترميز مثالي ، فإن ذلك يحدد تلقائيًا تسلسل الخيط الآخر. لا يمكن للاختيار الطبيعي أن يختار في نفس الوقت التسلسل الأمثل لكلا الخيطين (إذا كان لكل خيط وظيفة مستقلة).

1. ما فائدة الحمض النووي الريبي المضاد للحس؟ يجب أن يسمح لك العلاج الجيني (إضافة الحمض النووي) باستبدال الجين المعيب الذي يصنع منتجًا غير فعال. ولكن ماذا تفعل حيال الجين الذي يصنع الكثير من المنتجات ، أو يصنعه عندما لا ينبغي؟ بمعنى آخر ، كيف يمكنك إسكات الجين المفرط النشاط؟ هذا سؤال مهم ، لأنه يُعتقد أن التعبير غير الملائم أو المفرط للجينات هو عامل رئيسي في المرض ، على سبيل المثال ، في السماح للخلايا السرطانية بالتكاثر عندما لا ينبغي. يجب أن يسمح لك استخدام التكنولوجيا المضادة للحواس بإسكات الجين المفرط النشاط أو النشط بشكل غير لائق. لم تكن هذه التكنولوجيا منتجة للغاية حتى الآن ، لكن المفهوم مهم وقد تكون هناك إمكانات كبيرة فيه. (ومع ذلك ، من المحتمل أن يكون استخدام RNAi أكثر عملية - انظر أدناه ونشرة أمبير من Times.)

2. كيفية إضافة الحمض النووي الريبي المضاد للحس؟ هناك طريقتان للقيام بذلك:

أ. يمكن إضافة مرنا مضاد المعنى إلى الخلايا . نظرًا لأن الحمض النووي الريبي يتحلل بسهولة ، يتم استخدام الحمض النووي الريبي المعدل ، الأكثر مقاومة للتحلل المائي ، بدلاً من الحمض النووي الريبي العادي. (لم ينجح هذا بشكل جيد ، وقد تم استبدال استخدام مضادات الحس لإسكات الجينات إلى حد كبير باستخدام RNAi ، كما هو موضح أدناه).

ب. يمكن صنع مرنا مضاد المعنى في الخلية من نسخة ثانية من الجين. تُضاف النسخة الثانية بطرق الهندسة الوراثية ، وهي مقلوبة (بالنسبة إلى المروج) ، بحيث يتم نسخ النسخة الثانية من الجين في الاتجاه المعاكس من النسخة الأصلية. إن قلب الجين بالنسبة إلى محرّكه يعادل تحريك المروِّج إلى الطرف الآخر من الجين (وإدارته) وبالتالي عكس اتجاه النسخ. يتم نسخ النسخة الأصلية من النموذج المعتاد (& quott translined & quot) لجعل mRNA النسخة الثانية يتم نسخها من الشريط التكميلي (& quotsense & quot) لعمل RNA مضاد للمعنى. يتم تهجين الرناين مع بعضهما البعض ولا يتم ترجمة أي من الرنا.

3. تدخل الحمض النووي الريبي - تأثيرات أخرى لمضاد الشعور

غالبًا ما يؤدي وجود شرائح RNA مزدوجة تقطعت بهم السبل في حقيقيات النوى إلى تدمير و / أو منع ترجمة جميع الرنا المرسال من الجين المقابل. (في بعض الحالات ، قد يمنع أيضًا إنتاج mRNA من الجين المقابل.) تسمى هذه الظاهرة & quotRNAi & quot أو تداخل RNA.
يستخدم RNAi العديد من إنزيمات الخلايا الطبيعية ، ويبدو أنه وظيفة خلوية طبيعية. تقطع الإنزيمات الرنا المزدوج المجدول إلى قطع قصيرة تسمى siRNAs (رنا قصير التداخل). ثم يتحلل أحد الخيطين ، ويهجن الشريط المتبقي "المضاد للحساسية" إلى الحمض النووي الريبوزي التكميلي. تشكيل الكتل الهجينة ترجمة و / أو يؤدي إلى تدهور mRNA بواسطة إنزيمات الخلية.

أ. تستخدم الخلايا RNAi كدفاع ضد العديد من الفيروسات. (يتضمن تكاثر العديد من الفيروسات الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة).

ب. تنظيم الترجمة في الكائنات متعددة الخلايا. يتم تصنيع الحمض النووي الريبي الميكروي القصير جدًا (الذي تقطعت به السبل) واستخدامه بواسطة الخلايا في عملية تشبه إلى حد كبير RNAi. تعمل هذه الرنا الميكروي القصيرة كمضاد للحساسية لتنظيم الترجمة. يتم تصنيع سلائف الحمض النووي الريبي التي تنثني مرة أخرى على نفسها لتشكيل دبابيس الشعر. تتم معالجة دبابيس الشعر المزدوجة التي تقطعت بها السبل بواسطة إنزيمات الخلايا المستخدمة في RNAi لصنع رنا قصيرة جدًا "مضادة للحساسية" (تسمى microRNAs). يتم تهجين microRNAs إلى mRNAs وتمنع الترجمة. يبدو أن هذا النوع من التنظيم مهم جدًا أثناء التطور في الكائنات الخلوية العادية. انظر الروابط أعلاه وأمبير مرات مقالات.

ج. يستخدم RNAi في المختبرات لمنع إنتاج بروتينات معينة ("إسقاط" التعبير). تُضاف RNAs المزدوجة القصيرة جدًا إلى الخلايا ، أو تتم هندسة الخلايا وراثيًا لإنتاج RNAs مزدوج الشريطة. هناك الكثير من الاهتمام بتداخل الرنا ، لأنه أسهل في الاستخدام وأكثر فاعلية من منع الترجمة باستخدام الرنا المضاد للمعنى. تم استخدام RNAi على نطاق واسع (في التجارب المعملية) لإسكات جينات حقيقية النواة ومعرفة ما يحدث (من أجل تحديد وظيفة الجينات).

د. الاستخدامات العلاجية. يتم حاليًا اختبار العديد من الاستخدامات الممكنة ، وتم الحصول على نتائج واعدة لعلاج الضمور البقعي. لمراجعة الاستخدامات العلاجية المحتملة لـ RNAi انقر هنا. (قد تحتاج إلى استخدام كمبيوتر CU للوصول إلى هذا الموقع.) توجد معلومات إضافية على موقع Nova / PBS. انظر بيكر فيجز. 23-35 & amp 23-36 أو Sadava شكل 16.14 (16.11).

مُنحت جائزة نوبل لعام 2005 في علم وظائف الأعضاء والطب لشركة Fire & amp Mello لاكتشافها تداخل الحمض النووي الريبي. انظر المقال من نيويورك تايمز. لمزيد من المعلومات حول RNAi ، جرب موقع Nova / PBS أو موقع Ambion. للحصول على رسم تخطيطي لكيفية عملها ، انقر هنا.

للتحقق من فهمك لمضادات المعنى ، انظر المشكلة 7-16 ، الجزء ج.

رابعا. التدقيق اللغوي أو التحرير. يشير الجدول الموجود في النشرة رقم 13-أ إلى أن تعديلات DNA polymerase (تدقيقها) ولا يمكنها بدء سلاسل جديدة لا يتم تحرير بوليميراز RNA (لا يتم تدقيقه) ويمكنه بدء سلاسل جديدة. هذه الخصائص مرتبطة. لن ندخل في كل التفاصيل ، لكن بنية بوليميراز الحمض النووي التي تسمح بالتحرير (التدقيق اللغوي) تمنع بدء سلاسل جديدة. (ملاحظة: يُستخدم مصطلح التحرير أحيانًا في عملية أخرى ، لذا يفضل استخدام مصطلح "التدقيق اللغوي" أدناه.)

1. ما هي القراءة الإثباتية؟

فيما يلي تفاعل الاستطالة الطبيعي المحفز بواسطة بوليميراز الحمض النووي (إلى اليمين):

rxn1: سلسلة (ن وحدات طويلة) + XTP & # 8596 سلسلة (n + 1 وحدة طويلة) + PPأنا

بولي DNA. يمكنه إجراء النسخ الاحتياطي والتحلل المائي (كسر) روابط الفوسفوديستر التي صنعتها للتو (إذا تم وضع القاعدة الخاطئة). هذا يسمى تدقيق القراءة أو التحرير. عندما يقرأ الدليل ، DNA pol. يحفز التفاعل التالي:

rxn 2: سلسلة (n + 1 وحدة طويلة) + H2سلسلة O & # 8596 (بطول ن وحدة) + XMP

2. التدقيق اللغوي ليس هو نفسه تحفيز عكس تفاعل البلمرة.

يمكن لأي إنزيم أن يحفز تفاعله في كلا الاتجاهين ، مع الأخذ في الاعتبار التركيز الصحيح للركائز والمنتجات. قد يعني عكس تفاعل البوليميراز كسر رابطة الفوسفودايستر عن طريق إضافة البيروفوسفات مرة أخرى وإعادة توليد dXTP كما يلي:

(rxn 1 إلى اليسار): سلسلة (n + 1 وحدة طويلة) + PPأنا & # 8596 سلسلة (ن وحدات طويلة) + XTP

ومع ذلك ، فإن ما تفعله قراءة الإثبات ليس عكس rxn 1 - إنه التحلل المائي لرابطة الفوسفودايستر (rxn 2). يؤدي التحلل المائي أو إضافة الماء عبر رابطة الفوسفودايستر المصنوعة حديثًا إلى تحرير dXMP (وليس dXTP). لذلك يختلف التحلل المائي عن عكس تفاعل البلمرة.

تسمى القدرة على إزالة النيوكليوتيدات واحدة تلو الأخرى من نهاية السلسلة نشاط نوكلياز خارجي. (exo = من الخارج أو النهاية).

القدرة الأنزيمية لبوليميراز الحمض النووي المستخدمة في قراءة الدليل تزيل النيوكليوتيدات واحدة تلو الأخرى من نهاية السلسلة الثلاثة. لذلك يطلق عليه نشاط نوكلياز خارجي من 3 إلى 5.

النشاط الإنزيمي لبوليميراز الدنا الذي يزيل مادة RNA له نشاط نوكلياز خارجي مختلف - هذا الإنزيم يزيل النيوكليوتيدات واحدًا تلو الآخر من نهاية 5 'من التمهيدي (وليس من الطرف 3). له نشاط نوكلياز خارجي من 5 إلى 3.

بوليميرات الدنا هي إنزيمات معقدة لها وحدات فرعية متعددة (سلاسل الببتيد) وأنشطة إنزيمية متعددة. يمكن تحفيز الأنشطة الأنزيمية المختلفة بواسطة وحدات فرعية مختلفة.

3. يمكن قراءة بوليميراز الحمض النووي ، ولكن بوليميريز الحمض النووي الريبي. ربما لا

يحتوي بوليميريز الحمض النووي على 3 إلى 5 نشاط خارجي ولكن يُفترض عمومًا أن RNA pol. * لا - بمجرد أن يحفز بوليميراز RNA تكوين رابطة فوسفوديستر ، لا يمكن تحلل الرابطة بواسطة RNA pol. تسمح قراءة الإثبات لبوليميراز الحمض النووي بالنسخ الاحتياطي وإزالة القواعد (النيوكليوتيدات حقًا) التي تم إدخالها عن طريق الخطأ. إذا تمت إضافة G في نهاية سلسلة متنامية حيث يجب أن يكون A (مقابل T في القالب) ، يمكن للإنزيم عمل نسخة احتياطية وكسر G. ثم يمكنه المحاولة مرة أخرى لإضافة القاعدة الصحيحة (في هذه الحالة أ). يسمح هذا لبوليميراز الحمض النووي بالحفاظ على معدل الخطأ منخفضًا ، كما يتناسب مع إنزيم يكرر النسخة الأرشيفية للمعلومات الجينية. انظر شكل Sadava. 11.22 (أ) (11.19 (أ)). من المفترض عمومًا أن RNA pol. لا يحتاج إلى التدقيق اللغوي ، لأن جزيئات الحمض النووي الريبي هي نسخ عاملة يمكنها تحمل بعض الأخطاء (ويمكن استبدالها بنسخ جديدة منسوخة من الحمض النووي).

* ملحوظة: هناك بعض الأدلة على أن بعض بوليميرات RNA لها نشاط exo 3 'إلى 5' ويمكن تصحيحها. لم يتم تحديد مدى انتشار هذا ، وأهميته في تقليل الأخطاء (مقارنة بمراجعة الحمض النووي). إذا كنت مهتمًا بالأدلة التجريبية لمراجعة الحمض النووي الريبي ، انقر هنا. نظرًا لأن تصحيح الحمض النووي الريبي (RNA) ليس ثابتًا جيدًا ، فسوف نتجاهله. النقطة المهمة هي فهم كيفية عمل بوليميراز التدقيق اللغوي وكيف يختلف عن البوليميراز الذي لا يصحح لغويًا.

القسمان المتبقيان ، 4 و 5 أمبير ، لمعلوماتك فقط. نحن لا ندخل في التفاصيل في المحاضرة ، وأنت لست مسؤولاً عنها.

4. لمعلوماتك. كيف تعمل قراءة الإثبات؟

يحتوي كل بوليميراز على موقع ربط الركيزة الذي يتضمن القالب ، والنيوكليوتيدات الأخيرة المضافة إلى السلسلة المتنامية و dXTP التالي الذي سيتم إضافته. باستخدام بوليميراز الحمض النووي ، يتم فحص القاعدتين ، التي تمت إضافتها للتو والأخرى التي سيتم إضافتها ، في كل جولة للتأكد من تطابق القواعد مع مكملاتها في القالب. أولاً ، آخر تطابق للقالب الأساسي هو & quot؛ التحقق & quot قبل أن تنمو السلسلة لفترة أطول. إذا تبين أن آخر قاعدة تمت إضافتها كانت خاطئة (ربما كانت في شكل توتوميري خاطئ مؤقتًا وتم إقرانها بشكل خاطئ مع القالب؟) ، عندئذٍ يقوم الإنزيم بعمل نسخة احتياطية ويزيل القاعدة الأخيرة قبل محاولة إضافة أخرى. بمجرد أن يتحقق الإنزيم من أن القاعدة المضافة الأخيرة على ما يرام ، فإنه يتحقق من التطابق بين القاعدة المراد إضافتها والقالب. إذا كان هناك تطابق ، فإن الإنزيم يحفز تكوين رابطة الفوسفوديستر. لذلك يتم فحص كل تطابق أساسي - قالب مرتين - مرة واحدة عندما تكون القاعدة على وشك الإضافة إلى السلسلة المتنامية ومرة ​​قبل إضافة القاعدة التالية إليها.
RNA pol. يحتوي أيضًا على 2 نيوكليوتيدات على وشك الارتباط برابطة فوسفوديستر والقالب. لكن RNA pol. يتحقق فقط من الاقتران بين القاعدة المراد إضافتها ومكملتها في القالب. لذلك إذا كانت القاعدة الأخيرة التي تم وضعها خاطئة ، فليكن. لا نسخ احتياطي أو تصحيحات.

5. لمعلوماتك. لماذا تؤثر قراءة الإثبات على القدرة على بدء السلاسل؟

لا يمكن لبوليميراز الحمض النووي بدء السلاسل لأن موقع ربط الركيزة لبوليميراز الحمض النووي يجب أن يحتوي على نيوكليوتيد بالفعل جزء من سلسلة (الذي تمت إضافته للتو) بالإضافة إلى النيوكليوتيد التالي الذي سيتم وضعه فيه. يجب أن يكون هناك رابط فوسفوديستر موجود بالفعل لذلك فإن نوكلياز 3 'إلى 5' سيكون له شيء يتحلل بالماء ، فقط في حالة عدم التطابق. في بداية السلسلة ، لا يوجد نوكليوتيد متصل بالفعل بنهاية السلسلة - لا توجد سلسلة. لا يوجد سوى نوعين من النيوكليوتيدات غير المرتبطة. لذا DNA pol. لا يمكن أن تبدأ.
نحن نفترض أن RNA pol. يمكن أن يبدأ السلاسل لأن موقع ربط الركيزة الخاص به لا يحتاج إلى الاحتفاظ بنوكليوتيد متصل بالفعل بسلسلة. يمكن أن يحمل اثنين من النيوكليوتيدات وربطهما.

مثال على إثبات القراءة (وهو ما يجب أن تكون قادرًا على القيام به) في المشكلة 6-14 ، الجزء ب -4.

تذكير: يتم تصنيع جميع أنواع الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي ، الحمض النووي الريبي ، الحمض النووي الريبي) بنفس الطريقة من قالب الحمض النووي. يمكن أن يكون منتج النسخ عبارة عن tRNA أو mRNA أو rRNA. لا يتم استخدام RNA كقالب لعمل المزيد من RNA. إذن ، كيف تصنع الأنواع الثلاثة من RNA & quotmake البروتين؟ & quot هذا هو السؤال التالي.

V. تفاصيل تخليق البروتين / ترجمته

ما هي القضايا الكبرى؟ مثل كل البوليمرات غير المتكررة = الترتيب والطاقة والإنزيمات !! سنركز على الطلب أولاً.

أ. كيف يتم استخدام الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) لتصطف الأحماض الأمينية (AA)؟ كيف تقرأ mRNA؟

1. تتم قراءة mRNA من 5 إلى 3. " تبدأ الترجمة عادةً في أول AUG وتنتهي عند كود التوقف الأول بعد AUG.

أ. قادة ومقطورة. لم تتم ترجمة المنطقة قبل أول AUG. يطلق عليه قائد ، أو 5'UTR (منطقة غير مترجمة) أو 5'UTS (تسلسل غير مترجم). تتوقف الترجمة عمومًا قبل نهاية الرنا المرسال (عند توقف كودون - UAG أو UAA أو UGA). المنطقة غير المترجمة بعد كود الإيقاف تسمى مقطورة ، أو 3 'UTR أو 3' UTS.

ب. جدول الكود. انظر النشرة 12 ب أو النصوص لجدول الكود. لاحظ أن جدول الكود يسرد الكودونات = التسلسل في mRNA وهو ما يعادل التسلسل في خيط إحساس الحمض النووي. جدول الكود لا يسرد anticodons. للحصول على تفاصيل وصور بدء الترجمة ، انظر شكل Sadava. 12.11 (12.10) أو شكل بيكر. 21-8 (20-8). مزيد من التفاصيل أدناه أو في المرة القادمة. لاحظ أن بعض الكودونات تشير إلى & quotstop & quot ، وليس حمض أميني. AUG يقوم بواجب مزدوج مثل & quotstart & quot و & quotmethionine. & quot

للتأكد من فهمك لكيفية استخدام جدول الأكواد ، جرب المشكلة 7-12 ، الأجزاء أ و ب.

2. 2 AA في وقت واحد في مكانها بواسطة الحمض الريبي النووي النقال (لتشكيل رابطة الببتيد) - انظر النشرة 13 ب. لماذا 2؟ لأن الريبوسوم يمكنه حمل 2 فقط محمل tRNAs في الوقت الذي يرتبط فيه الهيدروجين بـ mRNA. (انظر الى التفاصيل بالاسفل.)

3. جزيئات الحمض الريبي النووي النقال لها بنية ثانوية وثالثية كما هو موضح سابقًا انظر شكل Sadava. 12.8 (12.7) أو شكل بيكر. 22-3 (20-3).
يتم مضاعفة كل جزيء tRNA مرة أخرى على نفسه لتشكيل ورقة البرسيم مع أقسام مزدوجة تقطعت بهم السبل (= بنية ثانوية) ، ثم يتم طي أجزاء من ورقة البرسيم مرة أخرى على نفسها (= الهيكل الثالث). يبلغ عرض جزيء tRNA النهائي المطوي حوالي كودون واحد. بهذه الطريقة يمكن ربط اثنين من الحمض النووي الريبي (tRNAs) بالكودونات المجاورة دون الاصطدام ببعضهما البعض.

3. كيف يتم توصيل الحمض الريبي النووي النقال و AA؟ يتم إرفاق AA بالنهاية 3 من tRNA الخاص به عن طريق رابطة استر بين نهاية COOH لـ AA و 2 'أو 3' OH على الريبوز النهائي (في نهاية 3 '). هذا يترك amino من AA مجانيًا.

4. الاقتران tRNA / mRNA عكسي - تتزاوج جميع الأحماض النووية بطريقة معاكسة. لذلك إذا تمت كتابة mRNA بالطريقة المعتادة (5 '& # 8594 3') ، فإن الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) يصطف في الاتجاه المعاكس ، 3 '& # 8594 5'. (مع وجود الحمض الأميني أو السلسلة على يساره ، نهاية 3.) غالبًا ما تتم كتابة Anticodon 3 '& # 8594 5' لتوضيح ذلك. على سبيل المثال ، إذا كان الكودون هو AUG ، فعادة ما يكتب anticodon 3 'UAC 5' وليس CAU (أو يتم كتابته رأسًا على عقب).

ب. كيف تنمو سلسلة الببتيد الجديدة؟ انظر النشرة 13B أو شكل Sadava. 12.12 (12.11) أو شكل بيكر. 22-10 (20-10).

1. سلسلة تضيف إلى أحدث AA. عندما يتم تكوين كل رابطة ببتيدية ، يتم نقل سلسلة النمو (من الحمض النووي الريبي الذي احتفظ به سابقًا) إلى الحمض الأميني التالي (الذي لا يزال مرتبطًا بالـ tRNA الخاص به) ، وليس العكس ، لأسباب لوجستية. لا يتم إضافة أحدث حمض أميني إلى النهاية الحرة للسلسلة. بدلاً من ذلك ، تضاف السلسلة إلى أحدث حمض أميني. (يسمح النظام الحالي لآلة الترجمة بالانزلاق إلى الأسفل لقراءة mRNA لقراءة كودونين متجاورين في وقت واحد. والطريقة الأخرى لا تفعل ذلك).

يسمى محفز تكوين روابط الببتيد peptidyl transferase لأنه يتم نقل السلسلة كما هو موضح أعلاه. هذا المحفز هو جزء من الريبوسوم.

2. سلسلة الببتيد تنمو الأمينية & # 8594 كربوكسيل. يتبع ذلك لأن الأحماض الأمينية يتم تثبيتها (متصلة بـ tRNA) بنهايات COOH الخاصة بهم. لذلك إذا كان يجب أن تضيف السلسلة إلى النهاية المجانية لـ AA التالي ، فيجب أن تضيف إلى النهاية الأمينية لـ AA التالية. (ملاحظة لأولئك الذين لديهم عضوية: من وجهة نظر الآلية ، تسير الإلكترونات في الاتجاه الآخر تهاجم إلكترونات الأمينية الكربوكسيل).

3. الطاقة لتخليق الببتيد. الطاقة المشتقة من تقسيم الحمض الريبي النووي النقال

سلسلة) تدفع السندات تخليق السندات الببتيد. وبعبارة أخرى ، فإن اتصال AA-tRNA عبارة عن رابطة طاقة عالية. كيف يتم تشكيلها على حساب ATP ستتم مناقشتها في المرة القادمة.(الطاقة الإضافية مطلوبة لربط AA

الحمض الريبي النووي النقال وتحريك الريبوسوم إلى أسفل الرنا المرسال ، لكننا سنتجاهل تفاصيل الطاقة لهذه الخطوات ، وكذلك البروتينات اللازمة لتعزيزها.)

4. يبدأ ويوقف أمبير. تبدأ سلسلة الببتيد في أول أغسطس وتتوقف عن النمو عندما تتوقف آلة الترجمة عن كودون التوقف. يوجد لا الحمض الريبي النووي النقال بالنسبة لشفرات الإيقاف ، لذلك لا توجد طريقة يمكن للسلسلة أن تستمر في النمو إذا جاء رمز الإيقاف بعد ذلك. انظر شكل Sadava. 12.13 (12.12) أو شكل بيكر. 22-11 (20-11) مزيد من التفاصيل أدناه أو في المرة القادمة.

نرى ما يحدث إذا كان لديك الكثير من الحمض الريبي النووي النقال المحمّل. كيف تحصل على AA على الحمض الريبي النووي النقال في المقام الأول و / أو كيف يمكنك إعادة تحميل الحمض النووي الريبي بمجرد أن يعطي AA الخاص به بعيدًا؟ يتطلب التحميل إنزيمات وطاقة - سننظر في الأمر بعناية في المرة القادمة. في الوقت الحالي ، سنفترض فقط أن كل حمض tRNA محمل بالأحماض الأمينية الخاصة به ،

لمراجعة تركيب البروتين حتى الآن ، ودور الحمض الريبي النووي النقال ، جرب المشكلة 7-21.

د. كيف تتلاءم الريبوسومات؟

1. السمة الهيكلية الهامة للريبوسومs (انظر بيكر ، الشكل 22-2 (20-2) أو Sadava شكل 12.10 (12.9.) الهيكل التفصيلي وتجميع أمبير للريبوزومات سيتم مناقشتها في المرة القادمة. تجاهل موقع T الموضح في الطبعة السابعة. من Purves / Sadava.

أ. 1 موقع أو أخدود لـ mRNA.

ب. 2 موقع لتحميل الحمض الريبي النووي النقال (مهجن إلى مرنا) لكل ريبوسوم - يطلق عليهما A و P مزيد من التفاصيل أدناه. تربط هذه المواقع كلاً من الحمض الريبي النووي النقال (الرنا المرسال) و (المحملة).

ج. موقع واحد لتفريغ الحمض الريبي النووي النقال يربط هذا الموقع الروابط الفارغة المستخدمة قبل أن تصطدم بالريبوسوم. (يطلق عليه E لموقع الخروج). يتم حذف هذا الموقع أحيانًا في مخططات الاستطالة. (ربما لا يوجد موقع T الموضح في الطبعة السابعة من Purves ويجب تجاهله). يربط موقع E الحمض الريبي النووي النقال وليس mRNA.

د. جميع الريبوسومات متشابهة. أي بروتين مصنوع لا يعتمد على الريبوسوم.

2. كيف تعمل الريبوسومات (انظر شكل بيكر 22-7 وأمبير 22-10 (20-7 وأمبير 20-10) أو شكل سادافا 12.12 (12.11.)

أ. مرفق. عندما لا تكون قيد الاستخدام ، تنقسم الريبوسومات إلى وحدات فرعية. (انظر النشرة 12 ب). تحتوي الخلية على مجموعة من الوحدات الفرعية. عندما تبدأ الترجمة ، يتم تثبيت وحدة فرعية واحدة صغيرة ووحدة فرعية كبيرة على الرنا المرسال لتشكيل الريبوسوم والبدء في الترجمة. عندما تنتهي الترجمة ، تتفكك الوحدتان الفرعيتان ، وتسقطان من mRNA ، وتعودان إلى المجموعة - جاهزة للاستخدام مرة أخرى.

ب. الاتجاهات : يتحرك الريبوسوم لأسفل mRNA 5 'إلى 3' (أو ينزلق mRNA عبر الريبوسوم) حيث يتكون الببتيد من amino to carboxyl. كلا الببتيدات والأحماض النووية كلاهما مصنوع / يقرأ كما هو مكتوب ، من اليسار إلى اليمين.
كيف يتم صنع الرنا المرسال وكيف تتم ترجمته يكون في نفس الاتجاه ، ولكن النسخ والترجمة عمليتان منفصلتان (عادة ما تقترن بدائيات النوى ولكن ليست حقيقيات النوى).

ج. مواقع A & amp P. يختلف موقعي الربط الخاصين بـ tRNA المحمّل - 1 يسمى الروابط A. أmino acyl tRNA & amp 1 يسمى روابط P. صeptidyl tRNA.

د . النقل - حركة mRNA (& amp tRNA's) بالنسبة إلى الريبوسوم.

(1). الاختلافات بين مواقع A & amp P تسمح بالحركة أحادية الاتجاه.قبل تكوين رابطة الببتيد ، يكون AA-tRNA في موقع A ويكون peptidyl-tRNA في موقع P. بمجرد تكوين رابطة الببتيد ، يصبح الحمض النووي الريبي في الموقع عبارة عن ببتيدل-رنا ، ويصبح الحمض الريبي النووي الريبي في موقع P فارغًا أو فارغًا ، نظرًا لأن & quotwrong & quot أنواع من الحمض النووي الريبي (tRNA) موجودة الآن في مواقع A & amp P ، لم يعد الريبوسوم مناسبًا بشكل صحيح ويتحرك أكثر كودون واحد ، يتحول peptidyl-tRNA إلى موقع P ، ويفرغ tRNA إلى موقع E ويترك موقعًا فارغًا لعقد AA-tRNA التالي. ثم يتم تحرير الحمض الريبي النووي النقال الفارغ أو غير المحمل ليتم إعادة تحميله واستخدامه مرة أخرى.

(2). أي جزء يتحرك فعلا؟ الريبوسوم أم الرنا؟

mRNA & amp ribosome: حرك كودون واحدًا بالنسبة لبعضهما البعض. في النشرة 13 ب ، في الخطوتين 5 و 6 ، يبدو أن الريبوسوم يحرك كودونًا واحدًا باتجاه نهاية الرسالة. من المحتمل أن يبقى الريبوسوم في موضع ثابت ويقوم mRNA بدفع كودون واحد عبر الريبوسوم في اتجاه 5 ، كما هو موضح في الخطوة 2 & # 8594 3. (بمعنى آخر ، إذا تم رسمه بشكل صحيح ، يتحرك mRNA إلى اليسار بدلاً من الريبوسوم يتحرك إلى اليمين.)

Messenger RNA و amp tRNA: لا يتحركان بالنسبة لبعضهما البعض ولكن يتم تجميعهما معًا.

لاحظ أن التأثير هو نفسه سواء تحرك الريبوسوم أو الرنا المرسال (وأمبير الحمض الريبي النووي المتصل) - يتم إزاحة الكودون الريبوسوم والرنا المرسال بالنسبة لبعضهما البعض وكل تحولات الرنا الريباسي تنحرف إلى أسفل موقع واحد. في كلتا الحالتين ، فإن النتيجة الإجمالية هي:

  • ينتقل الحمض الريبي النووي النقال الفارغ إلى موقع E ،
  • ينتقل peptidyl tRNA إلى موقع P ، و
  • يصبح الموقع A فارغًا وجاهزًا لـ AA-tRNA التالي.

(3). يستهلك تخليق البروتين الكثير من الطاقة . تتطلب الحركة وربط الحمض النووي الريبي (tRNA) طاقة نتجاهلها. ربما تحتاج إلى تقسيم 5 P على الأقل من ATP (أو GTP) لكل AA مضاف إذا قمت بحساب جميع الخطوات المعنية ، وليس فقط نمو سلسلة الببتيد. لذا فإن صنع البروتينات هو إجراء مكلف للغاية ، كما أن تصنيع البروتينات غير الضرورية يعد إهدارًا كبيرًا. نتيجة لذلك ، كان هناك اختيار قوي للتنظيم الفعال لتخليق البروتين كيف سيتم شرح عمل التنظيم في المرة القادمة. (لمشاركة GTP في الترجمة ، انظر أشكال Becker. 22-8 & amp22-10 [20-8 & amp 20-10].)

لمراجعة كيفية ملاءمة مواقع A & amp P ، جرب المشكلة 7-12 ، الجزء ج.

د. Polysomes.
يمكن لأكثر من ريبوسوم قراءة رسالة واحدة في وقت واحد. يلتصق الريبوسوم الأول بالقرب من نهاية الرنا المرسال 5 '. ثم يتحرك الريبوسوم (انظر الملاحظة أدناه) أسفل mRNA باتجاه النهاية 3 ، مكونًا البروتين. بمجرد أن يتحرك الريبوسوم بعيدًا بدرجة كافية لأسفل ، يمكن أن يلتصق الريبوسوم الثاني خلفه (على الجانب 5 ') ويتبع الريبوسوم الأول أسفل الرسالة. عندما يتحرك كل ريبوسوم نحو النهاية 3 ، مما يجعل البروتين ، يلتصق ريبوسوم آخر بعده حتى يتم تغطية الرنا المرسال بأكمله بالريبوسومات. يظل الرنا المرسال مغطى بالريبوسومات على الرغم من أن بعض الريبوسومات تنتهي وتتساقط من الطرف الثالث ، بينما يلتصق البعض الآخر باستمرار عند الطرف الخامس. يسمى الرنا المرسال المغطى بالعديد من الريبوسومات متعدد الريبوسوم أو متعدد الجسيمات باختصار. شكل سادافا 12.14 (12.13).

ملاحظة: يفترض هذا الوصف أن الريبوسومات تتحرك أسفل mRNA ، من 5 'إلى 3'. والنتيجة هي نفسها إذا افترضت أن الريبوسومات تبقى في مكانها بينما يتحرك الرنا المرسال عبر الريبوسومات ، نهاية 5 أولاً. بمجرد انزلاق ما يكفي من الرنا المرسال عبر الريبوسوم الأول ، يمكن للريبوسوم الثاني أن يلتصق بالفراغ الموجود في الطرف 5 'ويمكن أن يخترق الرنا المرسال خلال ذلك الريبوسوم التالي ، وهكذا.

لمراجعة الأشكال المتعددة ، جرب المشكلة 7-16 ، الجزء ب.

السادس. يبدأ ويوقف أمبير. كيف تبدأ سلاسل الببتيد؟ كيف يتوقف نمو سلسلة الببتيد؟

أ. يبدأ - يستخدم AUG لكل من "البدء" و "الميثيونين"

1. كيف يبدأ تخليق البروتين؟ - أنت بحاجة إلى met-tRNA خاص لـ ص موقع.

إذا كان موقع P يحمل فقط الحمض الريبي النووي النقال بسلاسل ، فكيف سيكون أول AA-tRNA مناسبًا للريبوسوم؟ الجواب هو أن هناك tRNA خاص (البادئ tRNA أو tRNAالتقىط) الذي يستخدم فقط في سلاسل البداية. يحمل هذا الحمض النووي الريبي استيفاء ويتعرف على كودون AUG ، وهو كودون (فقط) من أجل ميت وكودون البدء (فقط). هذا AA-tRNA خاص لأنه يناسب فقط موقع P.

2. كيف يتم إدخالها في منتصف السلاسل؟ - أنت بحاجة إلى met-tRNA مختلف لـ أ موقع.

إذا كان الحمض النووي الريبي (tRNA) الخاص بالتوافق في موقع P ، فكيف ستتم إضافته إلى سلسلة متنامية؟ هناك ثاني & quot الوضع العادي & quot؛ tRNA لمقابلة ، واحد يناسب الموقع A. يتعرف كل من الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) على نفس الكودون ويحملان نفس الحمض الأميني ، لكن أحدهما يناسب موقع P وواحد فقط في موقع A. الأول (البادئ tRNA) يستخدم فقط لبدء السلاسل والآخر يستخدم فقط في منتصف السلاسل. سادافا تين. 12.10 أو بيكر تين. 22-8 (20-8) إذا كنت مهتمًا بكل تفاصيل التنشئة.

3. المعالجة. لماذا لا تبدأ كل سلاسل البروتين بالميثيونين؟ عادة ما تتم إزالة Met من النهاية الأمينية للبروتين قبل أن تطوى سلسلة الببتيد. يتم اختيار طريقة التوليف هذه (الحصول على جميع البروتينات تبدأ بالامتثال) لسهولة التصنيع ، وليس لأن التقابل ضروري لوظيفة البروتين. إنه يجعل التوليف أسهل ولكنه ينتج منتجًا يحتاج إلى تعديلات قبل الاستخدام (إزالة التقابل). تعد التعديلات التركيبية اللاحقة مثل إزالة التقابل شائعة (لجميع الجزيئات الكبيرة ، وليس البروتينات فقط) وغالبًا ما تسمى المعالجة. ليس من غير المعتاد على الإطلاق أن يخلع تعديل أو معالجة إنزيم قليلًا من الأحماض الأمينية أو النيوكليوتيدات هنا أو هناك ، أو إضافة مجموعة أو عامل مساعد ، وما إلى ذلك. هذه التعديلات أكثر شمولاً في حقيقيات النوى منها في بدائيات النوى وستتم مناقشتها باستفاضة في المحاضرات اللاحقة و / أو الفصل الدراسي التالي.

باء توقف - لا تدخل الحمض الريبي النووي النقال

لا توجد جزيئات الحمض النووي الريبي (tRNA) لإيقاف الكودونات ، لذلك يتوقف الريبوسوم عندما يتعلق الأمر بإيقاف الكودون. يوجد الآن الحمض النووي الريبي ذو السلسلة الببتيدية في موقع P ، ولكن لا يوجد tRNA يناسب الموقع A. يرتبط بروتين يسمى عامل الإطلاق بكودون الإيقاف في الموقع A ويؤدي إلى إطلاق سلسلة الببتيد المكتملة. بمجرد إطلاق الببتيد من الحمض الريبي النووي النقال الخاص به ، يسقط الحمض النووي الريبي من الريبوسوم ثم ينفصل الريبوسوم إلى وحدات فرعية وتسقط الوحدات الفرعية من الرنا المرسال. تطوى سلسلة الببتيد وتنطلق لتؤدي وظيفتها ، ويمكن استخدام الحمض النووي الريبي والوحدات الفرعية الريبوسومية و mRNA مرة أخرى. سادافا تين. 12.12 أو بيكر تين. 22-11 (20-11).

لمراجعة عمليات البدء والتوقف ، جرب المسائل 7-12 ز ، 7-17 ، وأمبير 7-20 ب.

في المرة القادمة: أي تفاصيل لما سبق لم نصل إليها ، بالإضافة إلى تفاصيل بنية الريبوسوم ووظيفة الأمبير ، وتحميل الحمض الريبي النووي النقال ، واختتام الترجمة. ثم (1) ماذا يحدث عندما يخطئ التركيب الجزيئي ، و (2) كيف يتم تنظيم تخليق البروتين في بدائيات النوى؟

حقوق الطبع والنشر 2007 ديبورا موشوفيتز ولورنس شاسين قسم العلوم البيولوجية جامعة كولومبيا نيويورك ، نيويورك


النتائج

تقوم نواقل nS / MARt من الجيل التالي بتعديل الخلايا البشرية بكفاءة مما يوفر تعبيرًا مستمرًا عن التحوير

تم تحسين التركيب الجيني لناقلات S / MARt الموصوفة هنا وتحسينه لإنتاج مجموعة من ناقلات الحمض النووي المصممة حديثًا والتي يمكنها تعديل الخلايا التائية الأولية بكفاءة دون أي تأثير جزيئي أو وراثي (الشكل 1 أ). أولاً ، قمنا بتعديل pEPI (19) توليد pS ​​/ MARt ، ناقل بلازميد قمنا فيه بتقليل حجم العمود الفقري للبكتيريا من 3 إلى 1.5 كيلو بايت عن طريق إزالة تسلسلات الحمض النووي غير الضرورية والاحتفاظ فقط بالأصل البكتيري للتكرار (أوري) وعلامة اختيار المضادات الحيوية البكتيرية كاناميسين (KanR) . في كاسيت التعبير حقيقيات النوى ، مدفوعًا بالمروج الفيروسي المضخم للخلايا (CMV) ، قمنا بربط تعبير علامة التحديد بوروميسين (Puro) مباشرة إلى البروتين الفلوري الأخضر للجين المراسل (GFP) من خلال تسلسل الانقسام الذاتي P2A (20). ينتهي نسخ كاسيت التعبير GFP-Puro داخل تسلسل S / MAR المعزول من مجموعة الإنترفيرون البشري (IFN-β) (IFN-β S / MAR) ، مما يعزز وظائفه التي تؤدي إلى الصيانة خارج الصبغية للبلازميد الحمض النووي (21). من خلال إدخال هذه التغييرات ، أنشأنا ناقلًا يتمتع بقدرة محسّنة على توليد مستنسخات منقولة بشكل ثابت في خطوط الخلايا البشرية الكلية الجنينية البشرية (HEK) 293T و HeLa (الشكل 1 ب). تم تحسين ناقل pS / MARt بشكل أكبر في ناقل nS / MARt ذي الحجم الأدنى من خلال الاحتفاظ بكاسيت التعبير وتبادل العمود الفقري البكتيري الذي يحتوي على Ori و KanR لنظام الاختيار الخالي من المضادات الحيوية الموصوف بواسطة Luke وآخرون. (18). ستهل وآخرون. (22) أظهر أن نشاط النسخ من خلال عزر S / MAR ضروري للوظيفة. ومع ذلك ، يتم التعرف على نسخ mRNA الخلوية التي تتضمن امتدادات من العناصر الغنية بـ AU (AREs) وتتحلل بسرعة بواسطة المستضد البشري R (23). نظرًا لأن أشكال S / MAR عبارة عن امتدادات من الحمض النووي الجيني المخصب في الأدينين والثيميدين ، فقد قدمنا ​​مواقع الربط لتلائم IFN-β MAR لتوليد ناقل SP-nS / MARt-B الذي ينتج عنه نسخ أكثر استقرارًا لا تحمل دخيلة ومضاد. ARE مشتق من النسخ غير الضروري لعزر S / MAR. تم توضيح الربط النشط بواسطة اللطخة الشمالية (الشكل S1A) حيث تم فحص طول نص التراكيب الناتجة من pS / MARt و nS / MARt و SP-nS / MARt. كخطوة تطويرية أخيرة ، استبدلنا IFN-β S / MAR بنسخة أكثر إحكاما ، معزولة عن مجموعة الجينات صميم البروتين البشري B (ApoB) (24) ، والتي نحيط بها أيضًا مواقع الربط. تتكون مواقع ارتباط المصفوفة النووية الموجودة في مناطق معينة من الجينات الغنية بـ AT في الغالب من أشكال ATTA-ATTTA ، ومواقع التعرف على بروتينات المجال المنزلي المحفوظة بشكل كبير في أوري الخميرة ، والفيروسات ، والميتوكوندريا ، والبلاستيدات الخضراء ، والثدييات أوري. يتكون ApoB MAR بالكامل تقريبًا من امتداد متجاور يبلغ 555 نقطة أساس مصنوعة من فسيفساء من أشكال TAAT و TAAAT و ATTA و ATTTTA و TAAAAT و ATTTA. أظهرت فعالية التأسيس ، المقاسة بعدد المستعمرات التي تم إنشاؤها بواسطة كل ناقل ، أن النسخة النهائية ، SP-nS / MARt-A nanovector ، كانت الأكثر كفاءة ، وتشكل أكبر عدد من المستعمرات مقارنة بالأجيال السابقة من النواقل على حد سواء. في خلايا HEK293T و هيلا (الشكل 1 ب). لم ينتج عن SP-nS / MARt-A أكبر عدد من المستعمرات فحسب ، بل قدم أيضًا أفضل كفاءة تعداء مع أعلى مستوى من تعبير GFP [شدة الفلورسنت المتوسطة (MFI)] بعد 24 ساعة من تسليم الحمض النووي. تم تأكيد النتيجة أيضًا عندما تم تحليل الخلايا بعد 30 يومًا من توصيل الحمض النووي (الشكل S1B). في الخلايا المعدلة ، تم توضيح الحالة العرضية للناقلات المستندة إلى S / MAR بواسطة لطخة جنوبية (الشكل 1C) ، حيث أظهر وجود نطاقات مفردة في إجمالي مقتطفات الحمض النووي للخلايا المنشأة الأشكال العرضية لهذه الفئة من النواقل. تم تجزئة البنية المتكررة لتسلسل ApoB MAR للتحقق مما إذا كانت الأشكال القصيرة لهذا التسلسل كافية للحفاظ على وظائف المتجهات. أنشأنا سبعة إصدارات مختلفة تختلف تسلسلها باختلاف تكوين النوكليوتيدات واتجاهها وطولها (الشكل S1C) والتي تم فحصها لقدرتها على إنشاء خلايا مستقرة في HEK293T و HeLa. في كلا سطري الخلايا البشرية ، وجد أن تسلسل ApoB MAR كامل الطول من النوع البري هو الأكثر نشاطًا. قمنا بعد ذلك بإنشاء متجه SP-nS / MARt-A حيث قمنا بتبديل مروج CMV لمروج EF1α البشري (25) ، واختبرنا هذا البناء في خط خلايا سرطان الخلايا التائية البشرية Jurkat76 (J76) (26). أثبتنا أنه يمكن توصيل النواقل بكفاءة وثبات عن طريق التثقيب الكهربائي مع أكثر من 80٪ من الخلايا القابلة للحياة التي تعبر عن الجين المراسل (الشكل 1 د). لعزل الخلايا التي تم فيها الحفاظ على الناقل بشكل نشط عن بقية السكان ، بعد 15 يومًا من الولادة ، تم عزل خلايا GFP + من خلال فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) ثم تم تربيتها لمدة 360 يومًا. تمكنا بنجاح من إنشاء ثلاثة خطوط خلوية مستقلة تمت مراقبتها بشكل روتيني للنسبة المئوية لخلايا GFP + (GFP ٪) وكثافة التعبير (GFP MFI) (الشكل 1 د) ، وأثبتنا أنه خلال هذه الفترة الممتدة ، كان GFP ٪ و ظلت مؤسسة GFP MFI مستقرة. تم التحقق من انتقال البلازميدات العرضية في اليوم 360 من خلال اللطخة الجنوبية (الشكل S1D) ، ورقم نسخة من

تم تحديد 1.71 نسخة لكل خلية (الشكل S1E). وفقا للتقارير السابقة (19, 27, 28) ، يتم تكرار النواقل التي تحمل S / MARs خارج الصبغية في نوى الخلايا المنقسمة حيث تنشأ عند عدد نسخ منخفض. تم اختبار التعبير المستمر عن جين المراسل GFP أيضًا في خلايا CD3 + البشرية الأولية لمدة 27 يومًا. تم نقل خلايا CD3 + المعزولة من أربعة متبرعين أصحاء مختلفين مع نواقل nS / MARt التي تحمل IFN-β و ApoB MAR مقارنة بـ pEPI (الشكل 1E). لم يغير توصيل المتجه عن طريق التثقيب الكهربائي نسبة CD4: CD8 مقارنة بالخلايا المزخرفة بالكهرباء (الشكل S1F). ومع ذلك ، فإن 60 ٪ من إجمالي الخلايا المنقولة عن طريق pEPI لم تظهر أي تعبير GFP بعد 10 أيام من تسليم الحمض النووي (الشكل S1G) ، والذي فقد بالكامل تقريبًا بحلول اليوم 27 ، بينما تم نقل 40 ٪ من الخلايا باستخدام SP-nS / MARt-A نواقل ظلت GFP +. عرض SP-nS / MARt-A نسبة مخفضة بشكل كبير من فقدان خلايا GFP + مقارنة بـ pEPI ومتجهات nS / MARt بناءً على IFN-. علاوة على ذلك ، أوضحنا أن تكاثر الخلايا التائية المنقولة بواسطة ناقل SP-nS / MARt-A كان مشابهًا لعناصر تحكم CD3 + غير المعالجة ، مما يشير إلى وجود تأثير ضئيل لناقلات الحمض النووي ونظام توصيل الحمض النووي على تكاثر الخلايا (الشكل. S1H). تم إثبات الثبات العرضي للنواقل في الخلايا الليمفاوية الأولية من خلال تضخيم الدائرة المتداول (RCA) (الشكل 1F).

المتجهات pS / MARt و nS / MARt و SP-nS / MARt-B و SP-nS / MARt-A [(أ) تم اختبار BB ، العمود الفقري البكتيري T ، الجينات المعدلة وراثيًا] من حيث فعاليتها في توليد مستنسخات مستقرة بمقايسة تشكيل مستعمرة في HEK293T و HeLa (ب). ن = 4. في الرسم البياني ، يكون الخط عند المتوسط ​​، وتم إجراء التحليل بتحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار Tukey اللاحق للمقارنات المتعددة. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، و ****ص & lt 0.0001. تم التحقيق في الصيانة العرضية للناقلات بواسطة لطخة جنوبية (ج) عند الاستخراج الكلي للحمض النووي الجيني (gDNA) والهضم باستخدام نوكلياز Bam HI. تم حل الحمض النووي المهضوم على هلام الاغاروز ، ونقله ، وتهجينه باستخدام مسبار GFP المشع. باستخدام SP-nS / MARt-EF1a ، تم إنشاء ثلاثة خطوط خلوية مستقرة J76-GFP مستقلة. تمت مراقبة عدد GFP + القابل للحياة وشدة الفلورسنت المتوسطة (MFI) للخلايا ، وبعد 15 يومًا من تسليم الحمض النووي ، تم عزل خلايا GFP + من خلال FACS وزرعها لمدة 360 يومًا. تمت مراقبة GFP٪ و GFP MFI مرة واحدة في الشهر (د). تم التحقيق في تعبير GFP المطول من نواقل SP-nS / MARt في خلايا CD3 البشرية الأولية المعزولة من أربعة متطوعين أصحاء. تمت مراقبة عدد خلايا CD3 / GFP + في الأيام 1 و 5 و 10 و 15 و 21 و 27 بعد تسليم الحمض النووي (ه) ، وتم التحقيق في الصيانة العرضية للناقلات عن طريق تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA). تم هضم تفاعل RCA باستخدام نوكلياز Bam HI وحلها على هلام agarose 0.8٪ [(F) M ، الوزن الجزيئي لعلامة الحمض النووي Wt ، خلايا CD3 + غير المعدلة]. تم تحسين متجهات SP-nS / MARt التي تعبر عن CEA-CAR ليتم تسليمها بكفاءة مع قابلية عالية للبقاء في خلايا CD3 + البشرية مع جهازي كهربائي واسع النطاق ، وحدة Lonza LV ومنصة MaxCyte ExPERT GTx (جي).

لمزيد من التحقيق في إمكانية استخدام تقنية ناقل الحمض النووي الجديدة هذه في التطبيق السريري ، استبدلنا جين مراسل GFP في ناقل SP-nS / MARt-A للسيارة ضد المستضد السرطاني الجنيني البشري (CEA) ومروج CMV لـ PGK مروج (كيناز فسفوغليسيرات) يولد ناقل SP-nS / MARt-CEA. تم تقييم كفاءة التسليم والتعبير CAR المعدّل وراثيًا باستخدام جهازي كهربي مختلفين على نطاق واسع: وحدة Lonza LV ومنصة MaxCyte ExPERT GTx ، مع 1 × 10 8 و 3 × 10 8 CD3 + خلايا ، على التوالي.مع كلا الجهازين ، مقارنةً بخلايا CD3 + المزودة بالكهرباء ، أسفر توصيل المتجه عن صلاحية خلوية تراوحت بين 50 و 75٪ اعتمادًا على المتبرع مع النسبة المئوية لخلايا CAR + T التي تتراوح من 65 إلى 80٪ ، 24 بعد ساعات من تسليم الحمض النووي (الشكل 1G). أظهرت هذه النتائج الحد الأدنى من تأثير تقنية الناقل على الخلايا التائية الأولية عبر أجهزة التثقيب الكهربائي ، مما يدعم إمكانية استخدامها لتصنيع الخلايا التائية المؤتلفة للتطبيقات السريرية.

نواقل nS / MARt لها تأثير ضئيل على الخلايا التائية البشرية وتوفر قدرة وظيفية فائقة

للتحقيق في تأثير نواقل nS / MARt على الخلايا التائية البشرية الأولية ، تمت مقارنة خلايا CD3 + المعزولة المصنعة باستخدام nS / MARt-CEA-CAR مع الخلايا التائية المنقولة بالفيروس البطيء الذي يحمل نفس شريط التعبير. كلا النهجين يؤديان إلى نسب مئوية مماثلة من خلايا CAR-T ، بينما أظهرت خلايا CAR-T التي تم إنشاؤها باستخدام nS / MARt تعبيرًا متوسطًا أكبر لـ CAR (الشكل 2A). ثم تم تحليل الخلايا التائية المعدلة باستخدام منصة ESCAPE RNA لتسلسل البروتينات الجينية (RNA-seq) (Proteona) (الشكل 2 ب). من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) ، أظهرنا أن الخلايا التائية المجهزة بالكهرباء باستخدام nS / MARt أو المنقولة باستخدام الفيروس البطيء تشكل مجموعات منفصلة عند مقارنتها بالخلايا الأبوية الوهمية على مستوى النسخ. عندما تمت مقارنة الملف النسخي للخلايا التائية المنقولة بواسطة نواقل الفيروسة البطيئة بالخلايا الأبوية غير المعدلة ، تمكنا من العثور على 106 جينات معبر عنها تفاضليًا ، مع أكثر الجينات تنظيمًا بشكل بارز والتي تنتمي إلى عائلة IFIT (البروتينات المستحثة بالإنترفيرون مع تكرارات Tetratricopeptide) أو ترميز الكيموكينات ( الشكل 2 و C و D). تم أيضًا تنظيم تعبير CAR بشكل سلبي في هذه المجموعة الفرعية من الخلايا التائية. من ناحية أخرى ، يمكننا ملاحظة 61 جينًا منظمًا تفاضليًا عند توصيل الجينات باستخدام nS / MARt (الشكل 2D) في هذه الحالة ، كان تعبير CAR mRNA من بين الجينات الأكثر تنظيمًا. أكد تحليل الكتلة الجينية اللاحق لأعلى 100 جينة خاضعة للتنظيم في الخلايا التائية المنقولة بشكل بطيء بين مجموعات الخلايا الفرعية العلاقة البعيدة بين الخلايا المعدلة nS / MARt والخلايا المعدلة بشكل فطري. تم بعد ذلك التحقيق في الحد الأدنى من تأثير نواقل nS / MARt على مستوى الخلية المفردة حيث لا السيتوكين IFN-ولا الجينات التي يتم تنظيمها عادةً عند الإصابة مثل cGAS (سينسيز GMP-AMP الدوري) - STING ( ظهر مسار محفز للإنترفيرون) منظمًا (الشكل S2A). تم تأكيد هذه الملاحظة بعد ذلك عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) (الشكل S2B) ، حيث لم نتمكن من اكتشاف الاختلافات بين الخلايا المجهزة بالكهرباء باستخدام nS / MARt أو بدون الحمض النووي ، في حين أن تلك الخلايا عولجت باستخدام الحمض النووي الريبي الاصطناعي المحفز المزدوج (RNA) ( dsRNA) جرعات كبيرة من IFN-. تعكس هذه الملاحظات المظهر الجانبي المنخفض للمناعة لتقنية nS / MARt التي تقدم العمود الفقري المستنفد بالكامل لـ CpG. في متجه nS / MARt-CEA ، لاحظنا 11 نموذجًا CpG سبعة موجودة داخليًا داخل مروج PGK ، وأربعة تحدث داخل CEA-CAR cDNA. علاوة على ذلك ، لوحظ وجود علاقة أوثق بين n / SMARt - وخلايا T غير المعدلة. أجرينا تحليلًا لمصطلح علم الجينات (GO) لجميع الجينات المنظمة في كلتا المجموعتين الفرعيتين من الخلايا التائية المعدلة ووجدنا العديد من مجموعات الجينات المتميزة التي تم إثرائها بشكل كبير. أظهرت الخلايا المتحولة إثراءً لمجموعات الجينات المشاركة في معالجة الببتيدات من خلال مسار الدرجة الثانية من معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) والمرتبط بموت الخلية (الشكل 2 د). اقترح التنظيم النازل المصاحب للجينات المسؤولة عن إنتاج IFN-(الشكل 2C) أن هذه الخلايا اكتسبت نمطًا ظاهريًا غير فسيولوجي ، بينما في الخلايا المنقولة بواسطة nS / MARt ، اكتشفنا التنظيم الأعلى لـ 12 جينًا متورطًا في العمليات التي بدأها مجمع RNA polymerase II. بالإضافة إلى ذلك ، كشف تحليل إثراء مجموعة الجينات المقارن (GSEA) الذي يطبق لوحة مجموعات الجينات المناعية C7 لقاعدة بيانات التوقيع الجزيئي (MSigDB) على بيانات scRNA-seq أن الخلايا التائية المعدلة باستخدام نواقل nS / MARt تعرض نمطًا ظاهريًا أكثر سذاجة من CD8 + و CD4 + T الخلايا من نظيراتها المنقولة بالعدوى.

تم تحليل خلايا CEA-CAR T التي تم إنشاؤها عن طريق التثقيب الكهربائي باستخدام nS / MARt أو عن طريق التنبيغ مع فيروس التهاب الفم الحويصلي - الفيروس البطيء النمط الكاذب بواسطة FACS للتعبير عن الجينات المحورة مقارنة بالخلايا الوهمية (أ). ثم تم تحليل الخلايا المعدلة باستخدام المنصة البروتينية ESCAPE RNA-seq (Proteona). يتم عرض إسقاط t-SNE (تضمين الجار العشوائي الموزع) لقراءات RNA-seq. تشير الألوان إلى مجموعات من الخلايا التي تم تحديدها بواسطة طريقة تعداء (ن = 2757 خلية) (ب). تعرض مخططات البركان الملف الشخصي النسخي لخلايا CAR-T المنقولة بشكل بطيء وخلايا CAR-T الكهربية nS / MARt مقابل الخلايا التائية الوهمية (ج). خضع أفضل 100 جين منظم في الخلايا المنقولة بالفيروس البطيء لتحليل كتلة هرمي مقارنة بالخلايا غير المنقولة والكهربائية. تم إجراء تحليل مصطلح GO على القائمة الكاملة للجينات المنظمة بشكل كبير في كل طريقة تعداء ذات صلة باستخدام مصطلحات GO ونظام تصنيف PANTHER. تكشف GSEA لجميع الجينات المعبر عنها تفاضليًا لكل نهج للخلايا التائية المعدلة عن النمط الظاهري لخلايا T أكثر سذاجة بعد تعداء nS / MARt (د). تم التحقيق في فعالية قتل الورم المستهدف في الوقت الحقيقي في اختبار السمية الخلوية في المختبر. تم زرع الخلايا المستهدفة (2.5 × 10 4) ، إما بتعبير مرتفع (MCF-7) أو منخفض (HT-29) للحلقة المستهدفة CEA ، في اليوم 0 ، وتمت إضافة خلايا المستجيب CEA-CAR T في اليوم الأول بنسب مختلفة من المستجيب إلى الهدف. المفوضية الأوروبية50 بالنسبة لخلايا المستجيب CAR-T التي تم إنشاؤها باستخدام الفيروس البطيء وتم تقدير nS / MARt (ه).

تم اختبار فعالية قتل الورم المستهدف لخلايا CEA-CAR-T التي تم إنشاؤها باستخدام تقنية nS / MARt في المختبر في اختبار السمية الخلوية في الوقت الفعلي باستخدام خطوط الخلايا السرطانية البشرية HT-29 و MCF-7 كأهداف ومقارنة بالخلايا التائية المنقولة مع الفيروس البطيء CEA (الشكل 2E). لكل من أهداف الخلايا السرطانية ، بغض النظر عن التعبير المرتفع أو المنخفض للمستضد المستهدف ، وجدنا أن خلايا nS / MARt-CEA-CAR-T تتمتع بقدرة قتل أكثر كفاءة. عندما كان الهدف هو خلايا MCF-7 ، أظهرنا أن المستجيب إلى النسبة المستهدفة 2.5: 1 ضروري للخلايا التائية المنقولة عن طريق العدسة لتتناسب مع وظائف خلايا 1: 1 nS / MARt-CEA-CAR-T. تم تأكيد فعالية قتل الورم المحسّن بعد ذلك عندما كان الهدف هو خلايا HT-29 ، حيث كانت هناك حاجة إلى 2.7: 1 خلية متولدة بالفيروس لمطابقة زراعة 1: 1 مع خلايا مصممة باستخدام نواقل nS / MARt. متوسط ​​التركيز الفعال المحسوب (EC50) بعد 24 ساعة من الزراعة وأكدت الملاحظة. بعد التقارير السابقة ، أكدنا أيضًا أن التحلل الخلوي للخلايا المستهدفة تم بوساطة IFN-(الشكل S3A) (29).

تتوسط خلايا nS / MARt T في قتل الورم بكفاءة في الجسم الحي في ثلاثة نماذج طعم أجنبي للورم الفئران

لإثبات وظائف خلايا nS / MARt T بشكل أكبر ، قمنا بتصميم خلايا CD3 + البشرية للتعبير عن مضادات- CEA-CARs أو مضادات- NY-BR1-CARs أو مضادات CD19-CARs ، وقمنا بالتحقيق في قدرة قتل الورم في الخلايا المعدلة. خلايا CAR-T في نماذج الماوس xenografted. في نموذج الفأر CEA ، تمت مقارنة خلايا nS / MARt-CEA-CAR-T مع الخلايا التائية المنقولة باستخدام ناقل SIN القياسي (تعطيل ذاتي) - ناقل للفيروسات البطيئة. أظهرت الفئران التي عولجت بالخلايا التائية المعدلة nS / MARt انخفاضًا واضحًا في حجم الورم وتأخر نمو الورم (الشكل 3 أ والتين. خلايا CAR-T. ومع ذلك ، لم يتم تحقيق إزالة كاملة للورم في أي من المجموعات ، وذلك بسبب فقدان التعبير عن المستضد في خلايا الورم المستهدفة (الشكل 3 ب) ، وهي آلية شائعة للهروب من الورم أثناء علاج الأورام الصلبة (30). في أورام الفئران التي عولجت بخلايا nS / MARt T ، تمكنا من اكتشاف تردد تسلل أعلى للورم (الشكل 3C) ، في حين كان التطعيم بالخلايا CAR-T في الطحال قابلاً للمقارنة في كلا النهجين (الشكل ثلاثي الأبعاد). أظهر اختبار RCA الذي تم إجراؤه على الحمض النووي المستخرج من الدم الكلي والطحال وأورام الفئران التي تلقت العلاج الصيانة العرضية لنواقل nS / MARt في الخلايا المعدلة وراثيًا (الشكل 3F). تم عرض النشاط المضاد للورم طويل المدى للخلايا التائية المعدلة مع نواقل nS / MARt من خلال زراعة الخلايا الطحالية المسترجعة من الفئران المعالجة وخط الخلايا السرطانية MCF-7 (الشكل S3D) ، حيث تم اكتشاف نشاط كبير من خلايا CAR-T 40 يوما بعد العلاج.

تم تقييم فعالية استهداف الخلايا السرطانية التي تعبر عن الحلقات البشرية CEA و NY-BR1 و CD19 في النماذج قبل السريرية. بالنسبة لنموذج CEA ، تم زرع خلايا 1 × 10 6 تحت الجلد في فئران NSG ، وفي اليوم السابع ، عولجت الفئران باستخدام صور وهمية ، وتم إنشاء خلايا CAR-T باستخدام الفيروس البطيء و nS / MARt. نمو الورم (أ) وبقاء الفئران (ب) تم رصدها. أظهرت خلايا nS / MARt CAR-T تسللًا أعلى للورم مقارنة بخلايا Lenti CAR-T (ج) ، بينما ظهر انصهار الخلايا التائية البشرية في كلا المجموعتين متشابه (د). أظهرت الأورام المتضخمة فقدًا للمستضد في المجموعات المعالجة ، بينما يظل معبرًا عنه في المجموعة الضابطة (ه). تم عزل خلايا CAR-T من الطحال والأورام والدم الكلي للفئران المعالجة ، وأظهر RCA وجود البلازميدات اللاصقة [(F). M. علامة جزيئية للحمض النووي V ، nS / MARt-CEA تحليل تقييد الحمض النووي + ، RCA على nS / MARt-CEA المنقى تم هضمه لاحقًا باستخدام إنزيمات التقييد]. وبالمثل ، بالنسبة لنموذج NY-BR1 ، تم زرع الخلايا التي تعبر عن الحاتمة في فئران NSG. تم تسجيل فعالية قتل الورم كنمو الورم (جي) والبقاء (ح). تم العثور على خلايا CAR-T في الأورام والطحال ودم الفئران المعالجة بعد 30 يومًا من الحقن (أنا) ، وتم توضيح الصيانة العرضية للناقل بواسطة RCA (ي). تم حقن خلايا Nalm-6 (1 × 10 5) المعدلة للتعبير عن لوسيفيراز بشكل أساسي في فئران NSG عن طريق حقن الوريد الذيل. بعد ثلاثة أيام من حقن الخلايا السرطانية ، تم إعطاء 1 × 10 6 CD19-CAR-T خلايا تم إنشاؤها باستخدام وهمي ، nS / MARt ، أو الفيروس البطيء. تمت مراقبة نمو الورم من خلال التصوير الحيوي (ك) ، مثل التألق (p / s / cm 2 / sr) ، وتم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا بالتحليل اللاحق (**ص & lt 0.001 و ***ص & lt 0.001).

وبالمثل ، عندما عالجنا الفئران بـ CAR ضد خلايا سرطان الثدي ، استهدفت خلايا NY-BR1 (31, 32) ، أظهرنا تأخر نمو الورم (الشكل 3G) ، جنبًا إلى جنب مع زيادة بقاء الفئران (الشكل 3H). علاوة على ذلك ، تمكنا من اكتشاف نسبة كبيرة من الخلايا التائية nS / MARt في الأورام والطحال ودم الحيوانات المعالجة (الشكل 3I) مقارنة بالخلايا التائية الضابطة الوهمية. تم توضيح صيانة ناقلات خارج الصبغيات أيضًا بواسطة RCA في الأنسجة التي تم تحليلها (الشكل 3J). في النهاية ، اختبرنا خلايا nS / MARt-CD19 CAR-T في نموذج Nalm-6 / CD19. تم حقن الخلايا التائية غير المعدلة ، nS / MARt-CD19 CAR-T ، وخلايا CAR-T المنتجة lentivirally (Lenti-CD19) في الفئران NSG (NOD.Cg-Prkdc Il2rg / SzJ) التي عولجت سابقًا بخلايا Nalm-6 luciferase ، و تمت مراقبة فعالية قتل الورم من خلال التصوير الحيوي ، بعد 4 و 11 يومًا من العلاج بالخلايا التائية CAR-T (الشكل 3K). الفئران التي عولجت بخلايا CD19-CAR-T أدت إلى تأخير كبير في نمو الورم مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل 3K). ومع ذلك ، لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات التي تلقت CD19-CARs. تُظهر هذه النتائج معًا أن الخلايا التائية المعدلة باستخدام تقنية ناقل الحمض النووي الجديدة لدينا يمكنها استهداف الخلايا السرطانية في الجسم الحي وقتلها ، بفاعلية أعلى ، أو على الأقل قابلة للمقارنة ، مع خلايا CAR-T المعدلة وفقًا للحالة. نهج الفن lentiviral.

إنتاج واسع النطاق متوافق مع GMP لخلايا nS / MARt T.

للترجمة إلى تطبيق ذي صلة إكلينيكيًا للخلايا التائية nS / MARt ، تم تطوير بروتوكول تصنيع يسمح بتوليد الخلايا التائية المؤتلفة من الدرجة السريرية (الشكل 4). لهذا الغرض ، قمنا بربط جهاز CliniMACS Prodigy (Miltenyi) ، وهو نظام مؤتمت بالكامل ومغلق لعزل وثقافة CD3 البشري الأساسي ، مع منصة GTx ExPERT (MaxCyte) الكهربائية واسعة النطاق. باستخدام هذا البروتوكول ، كنا نهدف إلى إنشاء خلايا T المؤتلف في أقل من 7 أيام من عزل العينة. تم استخدام ناقل nS / MARt-CEA-CAR لمحاكاة إنتاج منتج من الدرجة السريرية. بدأت العملية بمنتج فصل الخلايا البيضاء يحتوي على 10.35 × 10 9 خلايا دم تم عزل 1 × 10 9 خلايا تائية منها بواسطة CliniMACS Prodigy باستخدام عملية TCT (نقل الخلايا التائية) المنفذة و GMP (ممارسات التصنيع الجيدة) - CD8 / CD4 الدرجة ميكروبيدات. في هذه المرحلة ، تم أخذ عينة من الثقافة والاحتفاظ بها لمزيد من التحليل لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي للتجارب النهائية. تمت زراعة الخلايا لمدة 3 أيام في TransAct و interleukin-7 (IL-7) و IL-15 في وسط TexMACS بعد بروتوكول التغذية المحسن للجهاز وباستخدام مجموعة أنابيب TS520. تم إجراء المراقبة المستمرة باستخدام المجهر الداخلي (الشكل S4) ، وتم تأكيد تنشيط الخلايا التائية. في اليوم الرابع ، تم نقل خلايا CD3 + المنشط إلى المخزن المؤقت HyClone electroporation (MaxCyte) باستخدام إجراء الصياغة النهائي الآلي. تم إجراء التثقيب الكهربائي للحمض النووي في منصة GTx ExPERT باستخدام مجموعة معالجة CL-2 و "T Cell Program 3" كرمز نابض مع nS / MARt-CEA-CAR (125 ميكروغرام / مل) لخلايا CD3 + (1 × 10 8 / مل). بعد فترة وجيزة من التثقيب الكهربائي ، تمت إعادة توصيل حقيبة التجميع الخاصة بتجميع معالجة MaxCyte CL-2 بـ CliniMACS Prodigy ، وتم نقل الخلايا إلى غرفة الاستزراع. بعد أربع وعشرين ساعة من تسليم الحمض النووي ، تم أخذ عينة للتحليل ، وأظهر هذا تعبيرًا قويًا لـ CAR مع قابلية للبقاء بنسبة 72 ٪. تم اختبار وظائف خلايا CAR-T لاحقًا في اختبار قتل في الوقت الحقيقي في المختبر باستخدام خط الخلايا السرطانية البشرية HT-29 كهدف للورم. تبين أن خلايا CAR-T تقتل الخلايا السرطانية بنسب مختلفة مقارنة بخلايا CD3 + غير المعدلة (mock T). علاوة على ذلك ، أنتجت خلايا CAR-T IFN-استجابةً لهدف خلية الورم. باستخدام هذا البروتوكول الجديد ، تمكنا من توليد 3.6 × 10 8 خلايا CAR-T وظيفية في غضون 5 أيام.

لتوليد الخلايا التائية المؤتلفة على نطاق سريري ، تم تطوير بروتوكول تصنيع. بدأت العملية بمنتج فصل خلايا الدم البيضاء الذي تعرض لعزل خلية CD3 + مع عملية TCT في CliniMACS Prodigy. تم بعد ذلك زراعة خلايا CD3 + المعزولة في وجود TransAct و IL-7 و IL-15 لمدة 3 أيام عندما تم حساب الخلايا ونقلها إلى كيس electroporation لجهاز MaxCyte ExPERT GTx. تم إجراء التثقيب الكهربائي باستخدام 1 × 10 8 خلية / مل و DNA (125 ميكروغرام / مل). بعد فترة وجيزة من التثقيب الكهربائي ، تم إعادة نقل الخلايا إلى غرفة الاستزراع في CliniMACS Prodigy وتم تغذيتها بوسط مكمل بـ IL-7 و IL-15 لمدة يوم واحد ، عندما تم حصاد الخلايا وتحليلها من أجل تعبير CAR. تم اختبار قدرتها على قتل الخلايا السرطانية في اختبار قتل في المختبر ، حيث تم أيضًا تقييم إنتاج IFN-.


7.16: Cerego- بدائيات النوى - علم الأحياء


C2005 / F2401 '10 - المحاضرة رقم 13 - تركيب الحمض النووي الريبي وأمبير البروتين

2010 ديبورا موشوفيتز ولورنس شاسين قسم العلوم البيولوجية جامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك. آخر تحرير 26/10/2010 09:32 ص

النشرات: 13A - جدول الكود وبنية amp tRNA.
13 ب - تخليق البروتين
12B - من المحاضرة الأخيرة - تخليق الحمض النووي مقابل تخليق الحمض النووي الريبي

ملحوظة: لهذه المحاضرة شكل. وأرقام الجدول في الطبعة 6 و 7 أمبير. بيكر كلها نفس الشيء. في الطبعة الخامسة ، الترجمة في الفصل. 20 بدلا من 22 ، ولكن التين. والجدول # هي نفسها.

I. توليف الحمض النووي مقابل توليف الحمض النووي الريبي. أسهل طريقة لتجاوز تخليق الحمض النووي الريبي ، بالنظر إلى أننا ناقشنا تخليق الحمض النووي بإسهاب ، هي مقارنة تخليق الحمض النووي والحمض النووي الريبي. انظر النشرة 12-ب.

أ. ما هو نفس الشيء؟ انظر المحاضرة 12.

  • يتم تحفيز نمو سلسلة الحمض النووي بواسطة بوليميراز الحمض النووي (والإنزيمات المرتبطة به)

  • يتم تحفيز نمو سلسلة RNA بواسطة بوليميراز RNA.

  • RNA pol. يستخدم ثلاثي الفوسفات الريبونوكليوزيد (يحتوي على U ، وليس T).

  • يستخدم DNA pol ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوزيد (يحتوي على T ، وليس U).

  • الحمض النووي طويل ومزدوج تقطعت به السبل

  • الحمض النووي الريبي قصير ومفرد تقطعت به السبل

  • القالب = مقطع قصير ، خيط واحد في كل مرة (لتوليف الحمض النووي الريبي.) مقابل كل الخيوط (لتخليق الحمض النووي).

  • لماذا ا؟ لأن البدايات والتوقفات مختلفة. يبدأ ويوقف أمبير = المتواليات في الحمض النووي التي تتعرف عليها الإنزيمات = الأماكن التي يبدأ فيها (أو ينتهي) النسخ المتماثل أو النسخ. يجب أن تكون هذه مختلفة بالنسبة للأنزيمين.

  • أسماء تسلسلات البدء = القسم الذي يرتبط فيه البوليميراز
    يبدأ في تخليق الحمض النووي = الأصول. بولي DNA. يتعرف على (يرتبط) إشارات البدء للنسخ المتماثل التي تسمى الأصول (أوري).
    يبدأ لتوليف الحمض النووي الريبي = المروجين. RNA pol. يتعرف على (يرتبط) إشارات البدء للنسخ التي تسمى المحفزات (P's).

انظر المشكلة 7- 6

  • توليف الحمض النووي: تتحرك شوكة النسخ المتماثل إلى أسفل مما يجعل الحمض النووي مكملاً إلى على حد سواء يتم عمل خصلة واحدة جديدة بشكل مستمر وواحدة بشكل متقطع. هناك حاجة إلى Ligase لتخليق الخيط المتأخر.

  • تخليق الحمض النووي الريبي (RNA): ينتقل بوليميراز الحمض النووي الريبي إلى أسفل مكونًا الحمض النووي مكملًا لخيط واحد أو الآخر (في أي منطقة معينة). لذلك فإن تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) مستمر ولا يحتاج إلى ligase.

راجع المشاكل 7-3 ، 7-4 ، 7-8 وأمبير 7-9.

1. المروجين تحديد اتجاه النسخ. المروج والإنزيم غير متماثلين ، لذلك بمجرد ارتباط الإنزيم ، يكون الطرف المحفز لـ RNA pol. هو & quotfacing & quot في اتجاه واحد ، وهذا يحدد اتجاه النسخ (وبالتالي أي الخيط سيكون قالبًا).

2. سيكون المروج عبارة عن تسلسل مزدوج تقطعت به السبل في نهاية الجين حيث يبدأ بوليميريز الحمض النووي الريبي (= على 3 'نهاية حبلا القالب = على 5' نهاية حبلا الإحساس). على طول خيط المعنى ، الطريقة التي يكتب بها الجين عادة (5 'إلى 3' ، من اليسار إلى اليمين) يكون المروج هو & quot؛ تيار & quot من الجين.

II. تحسس & أمبير ؛ مضاد

أ. لماذا استخدام خيط واحد فقط في أي منطقة واحدة؟

1. وسيطة الوظيفة: يجب أن يكون Messenger RNA منفردًا لتلائم الريبوسوم ويجب ترجمته. إذا كان RNA مكملًا لـ mRNA موجودًا ، فماذا سيحدث؟ تهجين & quotsense & quot mRNA و & quotanti-sense & quot الرنا التكميلي. الناتج المزدوج تقطعت بهم السبل RNA لن تترجم. لذلك ، على الرغم من وجود الجين ، ومنسوخًا ، إلا أنه لن يتم تصنيع منتج بروتيني. هذا ما سيحدث إذا تم نسخ كلا الجدولين.

2. الحجة التطورية: إذا تم استخدام كلا الخيطين لصنع mRNA ، فلا يمكنك تحسين أحدهما دون العبث بالآخر ، والعكس صحيح.إذا كان الانتقاء الطبيعي يفضل تسلسل خصلة واحدة بحيث يكون لها وظيفة أو نشاط ترميز مثالي ، فإن ذلك يحدد تلقائيًا تسلسل الخيط الآخر. لا يمكن للاختيار الطبيعي أن يختار في نفس الوقت التسلسل الأمثل لكلا الخيطين (إذا كان لكل خيط وظيفة مستقلة).

1. ما فائدة الحمض النووي الريبي المضاد للحس؟ يجب أن يسمح لك العلاج الجيني (إضافة الحمض النووي) باستبدال الجين المعيب الذي يصنع منتجًا غير فعال. ولكن ماذا تفعل حيال الجين الذي يصنع الكثير من المنتجات ، أو يصنعه عندما لا ينبغي؟ بمعنى آخر ، كيف يمكنك إسكات الجين المفرط النشاط؟ هذا سؤال مهم ، لأنه يُعتقد أن التعبير غير الملائم أو المفرط للجينات هو عامل رئيسي في المرض ، على سبيل المثال ، في السماح للخلايا السرطانية بالتكاثر عندما لا ينبغي. يجب أن يسمح لك استخدام التكنولوجيا المضادة للحواس بإسكات الجين المفرط النشاط أو النشط بشكل غير لائق. (عادة ما يتم إضافة الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل بدلاً من الحمض النووي الريبي المنفرد المضاد للاندماج ، كما هو موضح أدناه. انظر أشكال بيكر 23-35 وأمبير 23-36 أو شكل سادافا 18.8 (16.14).

2. كيف تحصل على الحمض النووي الريبي المضاد للحس في الخلايا؟ هناك 3 طرق للقيام بذلك:

أ. يمكن إضافة مرنا مضاد المعنى إلى الخلايا . نظرًا لأن الحمض النووي الريبي يتحلل بسهولة ، يتم استخدام الحمض النووي الريبي المعدل ، الأكثر مقاومة للتحلل المائي ، بدلاً من الحمض النووي الريبي العادي.

ب. يمكن صنع مرنا مضاد المعنى في الخلية من نسخة ثانية من الجين. تُضاف النسخة الثانية بطرق الهندسة الوراثية ، وهي مقلوبة (بالنسبة إلى المحفز) ، بحيث يتم نسخ النسخة الثانية من الجين في الاتجاه المعاكس من النسخة الأصلية. إن عكس الجين بالنسبة إلى محفزه يعادل تحريك المحفز إلى الطرف الآخر من الجين (وقلبه) وبالتالي عكس اتجاه النسخ. يتم نسخ النسخة الأصلية من النموذج المعتاد (& quott translined & quot) لجعل mRNA النسخة الثانية يتم نسخها من الشريط التكميلي (& quotsense & quot) لعمل RNA مضاد للمعنى. يتم تهجين الرناين مع بعضهما البعض ولا يتم ترجمة أي من الرنا.

ج. يمكن للحمض النووي الريبي المزدوج تقطعت بهم السبل (ds) أن يولد الحمض النووي الريبي المضاد للتردد - انظر شكل بيكر. 23-35 (الطبعة السادسة أو السابعة وليست في الخامسة).

  • يمكن إضافة ds RNA إلى الخلية (أو يمكن للخلية أن تصنع بعض ds RNA من حمضها النووي إما بشكل طبيعي - انظر ** أدناه - أو بسبب الهندسة الوراثية ، على النحو الوارد أعلاه)
  • تحتوي الخلايا على إنزيمات طبيعية تقطع ds RNA الطويل إلى قطع ds قصيرة ، تسمى RNA قصير التداخل (siRNA)
  • تعمل الإنزيمات الأخرى على تحطيم خيط `` الإحساس '' الخاص بـ ds RNA القصير
  • يتم تهجين الجزء القصير المتبقي من الحمض النووي الريبي المضاد للتفاعل إلى mRNA ويمنع الترجمة ، و / أو يؤدي إلى تدهور mRNA بواسطة إنزيمات الخلية.
  • تسمى هذه الظاهرة تدخل RNA أو RNAi.

** يمكن للخلايا أيضًا أن تصنع الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة "الطبيعي" الخاص بها. (يتم تصنيعه كخيط واحد ، ولكنه يتضاعف مرة أخرى على نفسه لتشكيل دبوس شعر قصير نسبيًا.) ثم يتم قطع دبوس الشعر بواسطة الإنزيمات لتوليد RNA قصير يمنع الترجمة كما هو مذكور أعلاه. يُطلق على هذه الرنا القصيرة المضادة للحساسية اسم microRNAs بدلاً من الرنا المسبب للتدخل. انظر بيكر الشكل. 23-36 (الطبعة السادسة أو السابعة وليست في الخامسة).

3. لماذا RNAi & amp / أو microRNA؟ لماذا تحتوي الخلايا على إنزيمات للقيام بذلك والمختبرات تستخدمها؟

أ. تستخدم الخلايا RNAi كدفاع ضد العديد من الفيروسات. (يؤدي تكرار العديد من الفيروسات إلى توليد RNA مزدوج طويل الشريطة).

ب. تنظيم الترجمة في الكائنات متعددة الخلايا. هذه هي وظيفة microRNAs. يتم تصنيع سلائف الحمض النووي الريبي التي تنثني مرة أخرى على نفسها لتشكيل دبابيس الشعر. تتم معالجة دبابيس الشعر المزدوجة التي تقطعت بها السبل بواسطة إنزيمات الخلية المستخدمة في RNAi لصنع رنا قصيرة جدًا "مضادة للحساسية" (تسمى هنا microRNAs). يتم تهجين microRNAs إلى mRNAs وتمنع الترجمة. يبدو أن هذا النوع من التنظيم مهم جدًا أثناء التطور في الكائنات الخلوية العادية.

تم منح جائزة هورويتز لعام 2009 (من قبل كولومبيا يو) لاثنين من مكتشفي الرنا الميكروي. وقد ألقى الفائزون محاضرات في نوفمبر الماضي. لمزيد من المعلومات حول الجائزة والمحاضرات وأبحاث الفائزين ، انتقل إلى http://www.cumc.columbia.edu/horwitz/

ج. يستخدم RNAi في المختبرات لمنع إنتاج بروتينات معينة ("إسقاط" التعبير). تُضاف RNAs المزدوجة القصيرة جدًا إلى الخلايا ، أو تتم هندسة الخلايا وراثيًا لإنتاج RNAs مزدوج الشريطة. من الأسهل والأكثر فاعلية منع الترجمة باستخدام RNAi (قصير ds RNA) مقارنةً بالحمض النووي الريبي المضاد (الأطول ، ss RNA). تم استخدام RNAi على نطاق واسع (في التجارب المعملية) لإسكات جينات حقيقية النواة ومعرفة ما يحدث (من أجل تحديد وظيفة الجينات).

د. الاستخدامات العلاجية. يتم حاليًا اختبار العديد من الاستخدامات الممكنة ، وتم الحصول على نتائج واعدة لعلاج الضمور البقعي. لمراجعة الاستخدامات العلاجية المحتملة لـ RNAi انقر هنا. (قد تحتاج إلى استخدام كمبيوتر CU للوصول إلى هذا الموقع.) توجد معلومات إضافية على موقع Nova / PBS.

مُنحت جائزة نوبل لعام 2006 في علم وظائف الأعضاء والطب لشركة Fire & amp Mello لاكتشافها تداخل الحمض النووي الريبي. لمزيد من المعلومات حول RNAi ، جرب موقع Nova / PBS أو موقع Ambion. للحصول على رسم تخطيطي لكيفية عملها ، انقر هنا.

للتحقق من فهمك لمضادات المعنى ، انظر المشكلة 7-16 ، الجزء ج.

ثالثا. التدقيق اللغوي. تم تقديم هذا آخر مرة. هنا مراجعة ووصف أطول. لن يتم مناقشة هذا في الفصل بإسهاب ، حيث تم بالفعل طرح النقاط الرئيسية.

1. ما هي القراءة الإثباتية؟

بولي DNA. يمكنه إجراء النسخ الاحتياطي والتحلل المائي (كسر) روابط الفوسفوديستر التي صنعتها للتو (إذا تم وضع القاعدة الخاطئة). هذا يسمى إثبات القراءة. (في بعض النصوص القديمة يطلق عليه التحرير ، لكن مصطلح "التحرير" عادة ما يكون محجوزًا الآن لعملية مختلفة.) عند DNA pol. يقرأ الدليل ، فإنه يحفز التفاعل التالي:

rxn A: سلسلة (n + 1 وحدة طويلة) + H2سلسلة O & # 8596 (بطول ن وحدة) + XMP

2. تذكير: التدقيق اللغوي ليس مثل تحفيز عكس تفاعل البلمرة.

3. يمكن قراءة بوليميراز الحمض النووي ، ولكن بوليميريز الحمض النووي الريبي. ربما لا

يحتوي بوليميريز الحمض النووي على 3 إلى 5 نشاط خارجي ولكن يُفترض عمومًا أن RNA pol. لا - بمجرد أن يحفز بوليميراز RNA تكوين رابطة فسفودايستر ، لا يمكن تحلل الرابطة بواسطة RNA pol. (لكن انظر ** أدناه.) تسمح قراءة الإثبات لبوليميراز الحمض النووي بدعم وإزالة القواعد (النيوكليوتيدات حقًا) التي تم إدخالها عن طريق الخطأ. إذا تمت إضافة G في نهاية سلسلة متنامية حيث يجب أن يكون A (مقابل T في القالب) ، يمكن للإنزيم عمل نسخة احتياطية وكسر G. ثم يمكنه المحاولة مرة أخرى لإضافة القاعدة الصحيحة (في هذه الحالة أ). يسمح هذا لبوليميراز الحمض النووي بالحفاظ على معدل الخطأ منخفضًا ، كما يتناسب مع إنزيم يكرر النسخة الأرشيفية للمعلومات الجينية. انظر شكل Sadava. 13.21 أ (11.22 أ). من المفترض عمومًا أن RNA pol. لا يحتاج إلى التدقيق اللغوي ، لأن جزيئات الحمض النووي الريبي هي نسخ عاملة يمكنها تحمل بعض الأخطاء (ويمكن استبدالها بنسخ جديدة منسوخة من الحمض النووي).

** ملحوظة: هناك بعض الأدلة على أن بعض بوليمرات الرنا يمكنها النسخ الاحتياطي والتدقيق اللغوي (على الرغم من وجود آلية مختلفة نوعًا ما). لم يتم تحديد مدى انتشار هذا ، وأهميته في تقليل الأخطاء (مقارنة بمراجعة الحمض النووي). من المعروف أن معدل الخطأ في تخليق الحمض النووي أقل بكثير من معدل الخطأ في تخليق الحمض النووي الريبي. (الفرق هو ترتيب واحد على الأقل من حيث الحجم ، وقد يكون أكبر من ذلك بكثير.) إذا كنت مهتمًا بالدليل التجريبي لمراجعة الحمض النووي الريبي ، فانقر هنا. نظرًا لأن تصحيح الحمض النووي الريبي (RNA) ليس ثابتًا جيدًا ، فسوف نتجاهله.

4. إثبات القراءة والقدرة على بدء السلاسل مرتبطان

يشير الجدول الموجود في النشرة 12-B إلى أن عمليات تدقيق بوليميراز الحمض النووي ولا يمكنها بدء سلاسل جديدة لا يقوم بوليميراز الحمض النووي الريبي بالتدقيق ويمكنه بدء سلاسل جديدة. ترتبط هذه الخصائص ، لأن بنية بوليميراز الحمض النووي التي تسمح بالتدقيق اللغوي تمنعه ​​من بدء سلاسل جديدة. نظرًا لأن بوليميريز الحمض النووي يمكن أن يضيف إلى السلاسل الموجودة مسبقًا ، ولكن لا يمكنه بدء تشغيلها بنفسه ، فإنه يتطلب مادة أولية (أو بريماز) للبدء.

القسمان المتبقيان ، 5 و 6 أمبير ، لمعلوماتك فقط. إنهم موجودون هنا في حال كنت مهتمًا ، فلن يتم طرح أسئلة حول هذه التفاصيل. إذا كنت تريد معرفة المزيد ، فاستشر نصًا متقدمًا.

5. لمعلوماتك. كيف تعمل قراءة الإثبات؟

يحتوي كل بوليميراز على موقع ربط الركيزة الذي يتضمن القالب ، والنيوكليوتيدات الأخيرة المضافة إلى السلسلة المتنامية و dXTP التالي الذي سيتم إضافته. باستخدام بوليميراز الحمض النووي ، يتم فحص القاعدتين ، التي تمت إضافتها للتو والأخرى التي سيتم إضافتها ، في كل جولة للتأكد من تطابق القواعد مع مكملاتها في القالب. أولاً ، آخر تطابق للقالب الأساسي هو & quot؛ التحقق & quot قبل أن تنمو السلسلة لفترة أطول. إذا تبين أن آخر قاعدة تمت إضافتها كانت خاطئة (ربما كانت في شكل توتوميري خاطئ مؤقتًا وتم إقرانها بشكل خاطئ مع القالب؟) ، عندئذٍ يقوم الإنزيم بعمل نسخة احتياطية ويزيل القاعدة الأخيرة قبل محاولة إضافة أخرى. بمجرد أن يتحقق الإنزيم من أن القاعدة المضافة الأخيرة على ما يرام ، فإنه يتحقق من التطابق بين القاعدة المراد إضافتها والقالب. إذا كان هناك تطابق ، فإن الإنزيم يحفز تكوين رابطة الفوسفوديستر. لذلك يتم فحص كل تطابق أساسي - قالب مرتين - مرة واحدة عندما تكون القاعدة على وشك الإضافة إلى السلسلة المتنامية ومرة ​​قبل إضافة القاعدة التالية إليها.
RNA pol. يحتوي أيضًا على 2 نيوكليوتيدات على وشك الارتباط برابطة فوسفوديستر والقالب. لكن RNA pol. يتحقق فقط من الاقتران بين القاعدة المراد إضافتها ومكملتها في القالب. لذلك إذا كانت القاعدة الأخيرة التي تم وضعها خاطئة ، فليكن. لا نسخ احتياطي أو تصحيحات.

6. لمعلوماتك. لماذا تؤثر قراءة الإثبات على القدرة على بدء السلاسل؟

لا يمكن لبوليميراز الحمض النووي بدء السلاسل لأن موقع ربط الركيزة لبوليميراز الحمض النووي يجب أن يحتوي على نيوكليوتيد بالفعل جزء من سلسلة (الذي تمت إضافته للتو) بالإضافة إلى النيوكليوتيد التالي الذي سيتم وضعه فيه. يجب أن يكون هناك رابط فوسفوديستر موجود بالفعل لذلك فإن نوكلياز 3 'إلى 5' سيكون له شيء يتحلل بالماء ، فقط في حالة عدم التطابق. في بداية السلسلة ، لا يوجد نوكليوتيد متصل بالفعل بنهاية السلسلة - لا توجد سلسلة. لا يوجد سوى نوعين من النيوكليوتيدات غير المرتبطة. لذا DNA pol. لا يمكن أن تبدأ.
نحن نفترض أن RNA pol. يمكن أن يبدأ السلاسل لأن موقع ربط الركيزة الخاص به لا يحتاج إلى الاحتفاظ بنوكليوتيد متصل بالفعل بسلسلة. يمكن أن يحمل اثنين من النيوكليوتيدات وربطهما.

مثال على إثبات القراءة (وهو ما يجب أن تكون قادرًا على القيام به) في المشكلة 6-14 ، الجزء ب -4.

تذكير: يتم تصنيع جميع أنواع الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي ، الحمض النووي الريبي ، الحمض النووي الريبي) بنفس الطريقة من قالب الحمض النووي. يمكن أن يكون منتج النسخ عبارة عن tRNA أو mRNA أو rRNA. لا يتم استخدام RNA كقالب لعمل المزيد من RNA. إذن ، كيف تصنع الأنواع الثلاثة من RNA & quotmake البروتين؟ & quot هذا هو السؤال التالي.

رابعا. تفاصيل تخليق البروتين / الترجمة

ما هي القضايا الكبرى؟ مثل كل البوليمرات غير المتكررة = الترتيب والطاقة والإنزيمات !! سنركز على الطلب أولاً.

1. يُقرأ في ثلاثة توائم من 5 إلى 3 . تبدأ القراءة عند نقطة ثابتة ثم تتم قراءة mRNA واحدًا ثلاثيًا أو كودونًا واحدًا في كل مرة في اتجاه 5 'إلى 3'.

2. جدول التعليمات البرمجية انظر النشرة 13 أ أو النصوص لجدول الكود. لاحظ أن الجدول يسرد الكودونات = ثلاثة توائم موجودة في الرنا المرسال (ليست مكملة للكودونات) والأحماض الأمينية المقابلة. يحدد كودون واحد حمض أميني واحد. على سبيل المثال ، CUA تعني leucine UUU تعني فينيل ألانين ، AUG تعني ميثيونين.

3. علامات الترقيم. لاحظ أن بعض الكودونات تشير إلى & quotstop & quot ، وليس حمض أميني. AUG يقوم بواجب مزدوج مثل & quotstart & quot و & quotmethionine. & quot تبدأ الترجمة في AUG وتنتهي عندما تصل إلى كود التوقف الأول بعد AUG. تختلف كيفية اختيار AUG المناسب بدائيات النوى وحقيقيات النوى. (راجع النصوص إذا كنت مهتمًا بالتفاصيل.) المزيد من التفاصيل حول التوقفات & أمبير يبدأ في المرة القادمة.

4. القادة والمقطورات. لم تتم ترجمة المنطقة قبل أول AUG. يطلق عليه قائد ، أو 5'UTR (منطقة غير مترجمة) أو 5'UTS (تسلسل غير مترجم). تتوقف الترجمة عمومًا قبل نهاية الرنا المرسال (عند توقف كودون - UAG أو UAA أو UGA). المنطقة غير المترجمة بعد كود الإيقاف تسمى مقطورة ، أو 3 'UTR أو 3' UTS.

5. إطارات القراءة. هناك أكثر من طريقة لقراءة تسلسل الحمض النووي في مجموعات غير متداخلة من ثلاثة ، حسب المكان الذي تبدأ منه. الطرق المختلفة تسمى إطارات قراءة مختلفة. إذا بدأت بالأول أو الرابع أو السابع. في الأساس ، تحصل على إطار قراءة واحد إذا بدأت بالإطار الثاني أو الخامس أو الثامن. تحصل على الثانية ، وهكذا. هناك 3 إطارات قراءة ممكنة.

للتأكد من فهمك لكيفية استخدام جدول الأكواد ، جرب المشكلة 7-12 ، الأجزاء أ و ب.

ب. هيكل / وظيفة tRNA للحصول على مقطع فيديو من العرض التوضيحي للفصل ، انظر الفيديو (ملف وسائط Windows) بواسطة Peter Sloane على http://www.columbia.edu/cu/biology/courses/c2005/lectures/tRNA.wmv

1. وظيفة المحول - كيف تعرف الخلية أن AUG قد استوفى وأن CUA هو ليو؟ لديك النص أو النشرة مع جدول التعليمات البرمجية ، لكن الخلية ليست كذلك.

أ. نقل RNA (tRNA) = محول . تستخدم الخلية الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) لمطابقة الكودون في الرنا المرسال (على سبيل المثال AUG أو CUA) مع الأحماض الأمينية المقابلة (ميت أو ليو ، على التوالي).

ب. تحميل الانزيمات. يجب أن يحمل المحول الحمض الأميني الصحيح. تستخدم الخلية إنزيمات التحميل لوضع الأحماض الأمينية الصحيحة على الحمض الريبي النووي النقال الخاص بها. مزيد من التفاصيل في المرة القادمة.

  • جزء واحد (في منتصف السلسلة) مكمل للكودون (= anticodon)

  • جزء واحد (على الطرف 3) هو طرف متقبل - يلتقط الحمض الأميني المناسب بمساعدة الإنزيم المناسب.

  • عندما يتم طي الحمض النووي الريبي (tRNA) في شكل ثلاثي الأبعاد ، يكون الطرف المستقبِل و anticodon على طرفي نقيض للجزيء

3. كيف يتم استخدام الحمض الريبي النووي النقال لتصنيف الأحماض الأمينية (AA)؟ 2 AA في كل مرة يتم تثبيتها في مكانها بواسطة الحمض الريبي النووي النقال (لتشكيل رابطة الببتيد) - انظر النشرة 13 ب. لماذا 2؟ لأن الريبوسوم يمكنه حمل 2 فقط محمل tRNAs في الوقت الذي يرتبط فيه الهيدروجين بـ mRNA. (انظر الى التفاصيل بالاسفل.)

4. الاقتران tRNA / mRNA عكسي - تتزاوج جميع الأحماض النووية بطريقة معاكسة. لذلك إذا تمت كتابة mRNA بالطريقة المعتادة (5 '& # 8594 3') ، فإن الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) يصطف في الاتجاه المعاكس ، 3 '& # 8594 5'. (مع وجود الحمض الأميني أو السلسلة على يساره ، نهاية 3.) غالبًا ما تتم كتابة Anticodon 3 '& # 8594 5' لتوضيح ذلك. على سبيل المثال ، إذا كان الكودون هو CGG ، فعادة ما تتم كتابة anticodon 3 "GCC 5" وليس CCG (أو يتم كتابته رأسًا على عقب كما في النشرة 13A).

5. كيف يتم توصيل الحمض الريبي النووي النقال و AA؟ يتم إرفاق AA بالنهاية 3 من tRNA الخاص به عن طريق رابطة استر بين نهاية COOH لـ AA و 2 'أو 3' OH على الريبوز النهائي (في نهاية 3 '). هذا يترك amino من AA مجانيًا.

6. تحميل الحمض الريبي النووي النقال. كيف تحصل على AA الصحيح على الحمض الريبي النووي النقال المقابل في المقام الأول ، و / أو كيف تعيد تحميل الحمض النووي الريبي بمجرد أن يعطي AA الخاص به بعيدًا؟ يتطلب التحميل إنزيمات وطاقة - سننظر في الأمر بعناية في المرة القادمة. في الوقت الحالي ، سنفترض فقط أن كل حمض tRNA محمل بالأحماض الأمينية الخاصة به ،

جيم - كيف تنمو سلسلة الببتيد الجديدة؟ انظر النشرة 13B أو شكل Sadava. 14.16 (12.12) أو شكل بيكر. 22-10.

للحصول على مقطع فيديو من العرض التوضيحي للفصل الدراسي ، انظر الفيديو (ملف وسائط Windows) بواسطة Peter Sloane على http://www.columbia.edu/cu/biology/courses/c2005/lectures/translation.wmv

1. سلسلة تضيف إلى أحدث AA. عندما يتم تكوين كل رابطة ببتيدية ، يتم نقل سلسلة النمو (من الحمض النووي الريبي الذي احتفظ به سابقًا) إلى الحمض الأميني التالي (الذي لا يزال مرتبطًا بالـ tRNA الخاص به) ، وليس العكس ، لأسباب لوجستية. لا يتم إضافة أحدث حمض أميني إلى النهاية الحرة للسلسلة. بدلاً من ذلك ، تضاف السلسلة إلى أحدث حمض أميني. (يسمح النظام الحالي لآلة الترجمة بالانزلاق إلى الأسفل لقراءة mRNA لقراءة كودونين متجاورين في وقت واحد. والطريقة الأخرى لا تفعل ذلك).

يسمى محفز تكوين روابط الببتيد peptidyl transferase لأن سلسلة الببتيد المتنامية يتم نقلها كما هو موضح أعلاه. هذا المحفز هو جزء من الريبوسوم.

2. سلسلة الببتيد تنمو الأمينية & # 8594 كربوكسيل. يتبع ذلك لأن الأحماض الأمينية يتم تثبيتها (متصلة بـ tRNA) بنهايات COOH الخاصة بهم. لذلك إذا كان يجب أن تضيف السلسلة إلى النهاية المجانية لـ AA التالي ، فيجب أن تضيف إلى النهاية الأمينية لـ AA التالية. (ملاحظة لأولئك الذين لديهم عضوية: من وجهة نظر الآلية ، تسير الإلكترونات في الاتجاه الآخر تهاجم إلكترونات الأمينية الكربوكسيل).

3. الطاقة لتخليق الببتيد. الطاقة المشتقة من تقسيم الحمض الريبي النووي النقال

سلسلة) تدفع السندات تخليق السندات الببتيد. وبعبارة أخرى ، فإن اتصال AA-tRNA عبارة عن رابطة طاقة عالية. كيف يتم تشكيلها على حساب ATP ستتم مناقشتها في المرة القادمة. (الطاقة الإضافية مطلوبة لربط AA

الحمض الريبي النووي النقال وتحريك الريبوسوم إلى أسفل الرنا المرسال ، لكننا سنتجاهل تفاصيل الطاقة لهذه الخطوات ، وكذلك البروتينات اللازمة لتعزيزها.)

4. توقف. تتوقف سلسلة الببتيد عن النمو عندما تتوقف آلة الترجمة عن كودون التوقف. يوجد لا الحمض الريبي النووي النقال بالنسبة لشفرات الإيقاف ، لذلك لا توجد طريقة يمكن للسلسلة أن تستمر في النمو إذا جاء رمز الإيقاف بعد ذلك. انظر شكل Sadava. 14.17 (12.13) أو شكل بيكر. 22-11.

لمراجعة تركيب البروتين حتى الآن ، ودور الحمض الريبي النووي النقال ، جرب المشكلة 7-21.

د. كيف تتلاءم الريبوسومات؟

1. الوظيفة. أنت بحاجة إلى شيء لتثبيت الحمض الريبي النووي النقال (اثنان محملين في وقت واحد) على mRNA أثناء توصيل الأحماض الأمينية وتحتاج إلى توفير الإنزيمات اللازمة لصنع رابطة الببتيد وما إلى ذلك (كم عدد الروابط الضعيفة التي تحمل الحمض النووي الريبي (الحمض الريبي النووي النقال) و mRNA معًا؟)

2. يحتوي الريبوسوم على كل من RNA والبروتين. يتم الاحتفاظ بالـ tRNA وما إلى ذلك من خلال بنية تحتوي على كل من RNA (s) والبروتين (s). أي شيء مصنوع من كليهما يسمى RNP = صإيبونucleoصبروتين أو صإيبونبروتين كلي صمقالة - سلعة. يسمى هذا الهيكل الخاص بـ RNP = RNA الريبوسوم بداخله يسمى RNA أو rRNA. احرص على عدم الخلط بين RNA الريبوسوم (الرنا الريباسي) والريبوسومات الأمبير.

للحصول على صور لهيكل الريبوسوم ، انظر شكل Sadava. 14.14 (12.10) و / أو بيكر تين. 22-1 أمبير 22-2 & أمبير الجدول 22-1. ) التفاصيل الجزيئية للهيكل في المرة القادمة.

3. السمات الهيكلية الهامة (انظر بيكر ، الشكل 22-2 أو شكل سادافا 14.14 (12.10) انظر النشرة 13-أ.

أ. 1 موقع أو أخدود لـ mRNA.

ب. 2 موقع لتحميل الحمض الريبي النووي النقال (مهجن إلى مرنا) لكل ريبوسوم - يطلق عليهما A و P مزيد من التفاصيل أدناه. تربط هذه المواقع كلاً من الحمض الريبي النووي النقال (الرنا المرسال) و (المحملة).

ج. موقع واحد لتفريغ الحمض الريبي النووي النقال يربط هذا الموقع الروابط الفارغة المستخدمة قبل أن تصطدم بالريبوسوم. (يطلق عليه E لموقع الخروج). يتم حذف هذا الموقع أحيانًا في مخططات الاستطالة. (ربما لا يوجد موقع T الموضح في الطبعة السابعة من Purves ويجب تجاهله). يربط موقع E الحمض الريبي النووي النقال وليس mRNA.

د. جميع الريبوسومات متشابهة. أي بروتين مصنوع لا يعتمد على الريبوسوم.

4. كيف الريبوسومات نقل (انظر شكل بيكر 22-7 وأمبير 22-10 أو شكل سادافا 14.16 (12.12)

أ. الاتجاهات : يتحرك الريبوسوم لأسفل mRNA 5 'إلى 3' (أو ينزلق mRNA عبر الريبوسوم) حيث يتكون الببتيد من amino to carboxyl. كلا الببتيدات والأحماض النووية كلاهما مصنوع / يقرأ كما هو مكتوب ، من اليسار إلى اليمين.
كيف يتم صنع الرنا المرسال وكيف تتم ترجمته يكون في نفس الاتجاه ، ولكن النسخ والترجمة عمليتان منفصلتان (عادة ما تقترن بدائيات النوى ولكن ليست حقيقيات النوى).

ب. مواقع A & amp P. يختلف موقعي الربط الخاصين بـ tRNA المحمّل - 1 يسمى الروابط A. أmino acyl tRNA & amp 1 يسمى روابط P. صeptidyl tRNA.

ج . النقل - حركة mRNA (& amp tRNA's) بالنسبة إلى الريبوسوم.

(1). الاختلافات بين مواقع A & amp P تسمح بالحركة أحادية الاتجاه.قبل تكوين رابطة الببتيد ، يكون AA-tRNA في موقع A ويكون peptidyl-tRNA في موقع P. بمجرد تكوين رابطة الببتيد ، يصبح الحمض النووي الريبي في الموقع عبارة عن ببتيدل-رنا ، ويصبح الحمض الريبي النووي الريبي في موقع P فارغًا أو فارغًا ، نظرًا لأن & quotwrong & quot أنواع من الحمض النووي الريبي (tRNA) موجودة الآن في مواقع A & amp P ، لم يعد الريبوسوم مناسبًا بشكل صحيح ويتحرك أكثر كودون واحد ، يتحول peptidyl-tRNA إلى موقع P ، ويفرغ tRNA إلى موقع E ويترك موقعًا فارغًا لعقد AA-tRNA التالي. عند وصول AA-tRNA التالي ، يتم تحرير الحمض الريبي النووي النقال الفارغ أو الفارغ ليتم إعادة تحميله واستخدامه مرة أخرى.

(2). أي جزء يتحرك فعلا؟ الريبوسوم أم الرنا؟

mRNA & amp ribosome: حرك كودون واحدًا بالنسبة لبعضهما البعض. في النشرة 13 ب ، في الخطوتين 5 و 6 ، يبدو أن الريبوسوم يحرك كودونًا واحدًا باتجاه نهاية الرسالة. من المحتمل أن يبقى الريبوسوم في موضع ثابت ويقوم mRNA بدفع كودون واحد عبر الريبوسوم في اتجاه 5 ، كما هو موضح في الخطوة 2 & # 8594 3. (بمعنى آخر ، إذا تم رسمه بشكل صحيح ، يتحرك mRNA إلى اليسار بدلاً من الريبوسوم يتحرك إلى اليمين.)

Messenger RNA و amp tRNA: لا يتحركان بالنسبة لبعضهما البعض ولكن يتم تجميعهما معًا.

لاحظ أن التأثير هو نفسه سواء تحرك الريبوسوم أو الرنا المرسال (وأمبير الحمض الريبي النووي المتصل) - يتم إزاحة الكودون الريبوسوم والرنا المرسال بالنسبة لبعضهما البعض وكل تحولات الرنا الريباسي تنحرف إلى أسفل موقع واحد. في كلتا الحالتين ، فإن النتيجة الإجمالية هي:

  • ينتقل الحمض الريبي النووي النقال الفارغ إلى موقع E ،
  • ينتقل peptidyl tRNA إلى موقع P ، و
  • يصبح الموقع A فارغًا وجاهزًا لـ AA-tRNA التالي.

(3). يستهلك تخليق البروتين الكثير من الطاقة . تتطلب الحركة وربط الحمض النووي الريبي (tRNA) طاقة نتجاهلها. ربما تحتاج إلى تقسيم 5 P على الأقل من ATP (أو GTP) لكل AA مضاف إذا قمت بحساب جميع الخطوات المعنية ، وليس فقط نمو سلسلة الببتيد. لذا فإن صنع البروتينات هو إجراء مكلف للغاية ، كما أن تصنيع البروتينات غير الضرورية يعد إهدارًا كبيرًا. نتيجة لذلك ، كان هناك اختيار قوي للتنظيم الفعال لتخليق البروتين كيف سيتم شرح عمل التنظيم في المرة القادمة. (لمشاركة GTP في الترجمة ، انظر أشكال Becker. 22-8 & amp 22-10.)

لمراجعة كيفية ملاءمة مواقع A & amp P ، جرب المشكلة 7-12 ، الجزء ج.

5. كيف ترتبط الريبوسومات بالـ mRNA

أ. مرفق. عندما لا تكون قيد الاستخدام ، تنقسم الريبوسومات إلى وحدات فرعية. تحتوي الخلية على مجموعة من الوحدات الفرعية. عندما تبدأ الترجمة ، يتم تثبيت وحدة فرعية واحدة صغيرة ووحدة فرعية كبيرة على الرنا المرسال لتشكيل الريبوسوم والبدء في الترجمة. عندما تنتهي الترجمة ، تتفكك الوحدتان الفرعيتان ، وتسقطان من mRNA ، وتعودان إلى المجموعة - جاهزة للاستخدام مرة أخرى.

ب. Polysomes - يمكن لأكثر من ريبوسوم قراءة رسالة واحدة في وقت واحد.
يلتصق الريبوسوم الأول بالقرب من نهاية الرنا المرسال 5 '. ثم يتحرك الريبوسوم (انظر الملاحظة أدناه) أسفل mRNA باتجاه النهاية 3 ، مكونًا البروتين. بمجرد أن يتحرك الريبوسوم بعيدًا بدرجة كافية لأسفل ، يمكن أن يلتصق الريبوسوم الثاني خلفه (على الجانب 5 ') ويتبع الريبوسوم الأول أسفل الرسالة. عندما يتحرك كل ريبوسوم نحو النهاية 3 ، مما يجعل البروتين ، يلتصق ريبوسوم آخر بعده حتى يتم تغطية الرنا المرسال بأكمله بالريبوسومات. يظل الرنا المرسال مغطى بالريبوسومات على الرغم من أن بعض الريبوسومات تنتهي وتتساقط من الطرف الثالث ، بينما يلتصق البعض الآخر باستمرار عند الطرف الخامس. يسمى الرنا المرسال المغطى بالعديد من الريبوسومات متعدد الريبوسوم أو متعدد الجسيمات باختصار. سادافا تين. 14.18 (12.14).

ملاحظة: يفترض هذا الوصف أن الريبوسومات تتحرك أسفل mRNA ، من 5 'إلى 3'. والنتيجة هي نفسها إذا افترضت أن الريبوسومات تبقى في مكانها بينما يتحرك الرنا المرسال عبر الريبوسومات ، نهاية 5 أولاً. (وهو الأرجح.) بمجرد انزلاق ما يكفي من الرنا المرسال عبر الريبوسوم الأول ، يمكن للريبوسوم الثاني أن يلتصق بالفراغ الموجود على الطرف 5 'ويمكن أن يخترق الرنا المرسال خلال ذلك التالي ، وهكذا.

لمراجعة الأشكال المتعددة ، جرب المشكلة 7-16 ، الجزء ب.

E. Peptidyl Transferase هو ريبوزيم

البيبتيديل ترانسفيراز هو جزء من الريبوسوم. النشاط التحفيزي هو خاصية للرنا الريباسي في الوحدة الفرعية الكبيرة ، وليس بروتينًا ، لذلك هذا ليس إنزيمًا (محفزًا مصنوعًا من البروتين) ولكنه ريبوزيم (محفز مصنوع من الحمض النووي الريبي). يُفترض أنه من بقايا عالم & quotRNA & quot الذي كان موجودًا قبل تولي الحمض النووي والبروتين العديد من الوظائف المبكرة للحمض النووي الريبي (الذي له خصائص تحفيزية وإعلامية). البيبتيديل ترانسفيراز ليس الريبوزيم الوحيد - من المعروف أن الحمض النووي الريبي التحفيزي الآخر معروف.
لمزيد من التفاصيل ، راجع http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/289/5481/878 يمكنك الوصول إلى هذا الموقع من أي كمبيوتر كولومبيا لا أعرف ما إذا كان يمكنك الحصول عليه من جهاز كمبيوتر شخصي إذا كنت لست مشتركًا في Science Online. لاحظ أن هذا الموقع يحتوي على ملاحظات تفصيلية & quothypernotes & quot ؛ والتي تسرد العديد من المواقع المفيدة لعلماء الأحياء الجزيئية. إذا وجدت أيًا من هذه الأشياء مفيدًا ، فيرجى إخبار الدكتورة م. حتى تتمكن من إخبار الطلاب الآخرين. (قد يكون الموقع بطيئًا في التحميل ، لكن الرابط يعمل.)

في المرة القادمة: لا نتطرق إلى أي تفاصيل حول ما سبق ، بالإضافة إلى بعض التفاصيل الأكثر أهمية لإنهاء الترجمة. ثم (1) ماذا يحدث عندما يخطئ التركيب الجزيئي ، و (2) كيف يتم تنظيم تخليق البروتين في بدائيات النوى؟

حقوق النشر 2010 Deborah Mowshowitz and Lawrence Chasin Department of Biological Sciences Columbia University New York، NY


7.16: Cerego- بدائيات النوى - علم الأحياء

حقوق النشر 2010 Deborah Mowshowitz and Lawrence Chasin Department of Biological Sciences Columbia University New York، NY. آخر تعديل: 10/26/10 10:02 ص.

ملاحظة: جداول التين و أمبير في الطبعة السادسة و السابعة. بيكر هي نفسها. في الطبعة الخامسة ، الفصل الخاص بالترجمة هو الفصل. 20 ، وليس 22 ، ولكن التين. الأرقام هي نفسها تقريبا. حتى التين. 22-x في الطبعة السادسة أو السابعة. هو 20 × في الخامس.

I. دور الريبوسومات في الترجمة

أ. كيف تتلاءم الريبوسومات؟

1. الوظيفة.

أ. أنت بحاجة إلى شيء لتثبيت الحمض الريبي النووي النقال (اثنان محملين في وقت واحد) على mRNA أثناء توصيل الأحماض الأمينية. (كم عدد الروابط الضعيفة التي تربط الحمض الريبي النووي النقال و الرنا المرسال معًا؟)

ب. أنت بحاجة إلى توفير الإنزيمات اللازمة لصنع رابطة الببتيد وما إلى ذلك.

2. يحتوي الريبوسوم على كل من RNA والبروتين. يتم الاحتفاظ بالـ tRNA وما إلى ذلك من خلال بنية تحتوي على كل من RNA (s) والبروتين (s). أي شيء مصنوع من كليهما يسمى RNP = صإيبونucleoصبروتين أو صإيبونبروتين كلي صمقالة - سلعة. يسمى هذا الهيكل الخاص بـ RNP = RNA الريبوسوم بداخله يسمى RNA أو rRNA. احرص على عدم الخلط بين RNA الريبوسوم (الرنا الريباسي) والريبوسومات الأمبير.

للحصول على صور لهيكل الريبوسوم ، انظر شكل Sadava. 14.14 (12.10) و / أو بيكر تين. 22-1 وأمبير 22-2 وجدول أمبير 22-1.) التفاصيل الجزيئية للهيكل أدناه.

3. السمات الهيكلية الهامة (انظر بيكر ، الشكل 22-2 أو شكل سادافا 14.14 (12.10) انظر النشرة 13-أ.

أ. 1 موقع أو أخدود لـ mRNA.

ب. 2 موقع لتحميل الحمض الريبي النووي النقال (مهجن إلى مرنا) لكل ريبوسوم - يطلق عليهما A و P مزيد من التفاصيل أدناه. تربط هذه المواقع كلاً من الحمض الريبي النووي النقال (الرنا المرسال) و (المحملة).

ج. موقع واحد لتفريغ الحمض الريبي النووي النقال يربط هذا الموقع الروابط الفارغة المستخدمة قبل أن تصطدم بالريبوسوم. (يطلق عليه E لموقع الخروج). يتم حذف هذا الموقع أحيانًا في مخططات الاستطالة. (ربما لا يوجد موقع T الموضح في الطبعة السابعة من Purves ويجب تجاهله). يربط موقع E الحمض الريبي النووي النقال وليس mRNA.

د. جميع الريبوسومات متشابهة. أي بروتين مصنوع لا يعتمد على الريبوسوم.

ه. بيبتيديل ترانسفيراز وهو جزء من الريبوسوم. (التفاصيل أدناه.)

1. كيف الريبوسومات نقل (انظر شكل بيكر 22-7 وأمبير 22-10 أو شكل سادافا 14.16 (12.12).

أ. الاتجاهات : يتحرك الريبوسوم لأسفل mRNA 5 'إلى 3' (أو ينزلق mRNA عبر الريبوسوم) حيث يتكون الببتيد من amino to carboxyl. كلا الببتيدات والأحماض النووية كلاهما مصنوع / يقرأ كما هو مكتوب ، من اليسار إلى اليمين.
كيف يتم صنع الرنا المرسال وكيف تتم ترجمته يكون في نفس الاتجاه ، ولكن النسخ والترجمة عمليتان منفصلتان (عادة ما تقترن بدائيات النوى ولكن ليست حقيقيات النوى).

ب. مواقع A & amp P. يختلف موقعي الربط الخاصين بـ tRNA المحمّل - 1 يسمى الروابط A. أmino acyl tRNA & amp 1 يسمى روابط P. صeptidyl tRNA.

ج . النقل - حركة mRNA (& amp tRNA's) بالنسبة إلى الريبوسوم.

(1). الاختلافات بين مواقع A & amp P تسمح بالحركة أحادية الاتجاه.قبل تكوين رابطة الببتيد ، يكون AA-tRNA في موقع A ويكون peptidyl-tRNA في موقع P. بمجرد تكوين رابطة الببتيد ، يصبح الحمض النووي الريبي في الموقع عبارة عن ببتيدل-رنا ، ويصبح الحمض الريبي النووي الريبي في موقع P فارغًا أو فارغًا ، نظرًا لأن & quotwrong & quot أنواع من الحمض النووي الريبي (tRNA) موجودة الآن في مواقع A & amp P ، لم يعد الريبوسوم مناسبًا بشكل صحيح ويتحرك أكثر كودون واحد ، يتحول peptidyl-tRNA إلى موقع P ، ويفرغ tRNA إلى موقع E ويترك موقعًا فارغًا لعقد AA-tRNA التالي. عند وصول AA-tRNA التالي ، يتم تحرير الحمض الريبي النووي النقال الفارغ أو الفارغ ليتم إعادة تحميله واستخدامه مرة أخرى.

(2). أي جزء يتحرك فعلا؟ الريبوسوم أم الرنا؟

mRNA & amp ribosome: حرك كودون واحدًا بالنسبة لبعضهما البعض. في النشرة 13 ب ، في الخطوتين 5 و 6 ، يبدو أن الريبوسوم يحرك كودونًا واحدًا باتجاه نهاية الرسالة. من المحتمل أن يبقى الريبوسوم في موضع ثابت ويقوم mRNA بدفع كودون واحد عبر الريبوسوم في اتجاه 5 ، كما هو موضح في الخطوة 2 & # 8594 3. (بمعنى آخر ، إذا تم رسمه بشكل صحيح ، يتحرك mRNA إلى اليسار بدلاً من الريبوسوم يتحرك إلى اليمين.)

Messenger RNA و amp tRNA: لا يتحركان بالنسبة لبعضهما البعض ولكن يتم تجميعهما معًا.

لاحظ أن التأثير هو نفسه سواء تحرك الريبوسوم أو الرنا المرسال (وأمبير الحمض الريبي النووي المتصل) - يتم إزاحة الكودون الريبوسوم والرنا المرسال بالنسبة لبعضهما البعض وكل تحولات الرنا الريباسي تنحرف إلى أسفل موقع واحد. في كلتا الحالتين ، فإن النتيجة الإجمالية هي:

  • ينتقل الحمض الريبي النووي النقال الفارغ إلى موقع E ،
  • ينتقل peptidyl tRNA إلى موقع P ، و
  • يصبح الموقع A فارغًا وجاهزًا لـ AA-tRNA التالي.

(3). يستهلك تخليق البروتين الكثير من الطاقة . تتطلب الحركة وربط الحمض النووي الريبي (tRNA) طاقة نتجاهلها. ربما تحتاج إلى تقسيم 5 P على الأقل من ATP (أو GTP) لكل AA مضاف إذا قمت بحساب جميع الخطوات المعنية ، وليس فقط نمو سلسلة الببتيد. لذا فإن صنع البروتينات هو إجراء مكلف للغاية ، كما أن تصنيع البروتينات غير الضرورية يعد إهدارًا كبيرًا. نتيجة لذلك ، كان هناك اختيار قوي للتنظيم الفعال لتخليق البروتين كيف سيتم شرح كيفية عمل التنظيم في البكتيريا في المرة القادمة. (لمشاركة GTP في الترجمة ، انظر أشكال Becker. 22-8 & amp 22-10.)

لمراجعة كيفية ملاءمة مواقع A & amp P ، جرب المشكلة 7-12 ، الجزء ج.

2 . كيف ترتبط الريبوسومات بـ mRNA

أ. مرفق. عندما لا تكون قيد الاستخدام ، تنقسم الريبوسومات إلى وحدات فرعية. تحتوي الخلية على مجموعة من الوحدات الفرعية. عندما تبدأ الترجمة ، يتم تثبيت وحدة فرعية واحدة صغيرة ووحدة فرعية كبيرة على الرنا المرسال لتشكيل الريبوسوم والبدء في الترجمة. عندما تنتهي الترجمة ، تتفكك الوحدتان الفرعيتان ، وتسقطان من mRNA ، وتعودان إلى المجموعة - جاهزة للاستخدام مرة أخرى.

ب. Polysomes - يمكن لأكثر من ريبوسوم قراءة رسالة واحدة في وقت واحد.
يلتصق الريبوسوم الأول بالقرب من نهاية الرنا المرسال 5 '. ثم يتحرك الريبوسوم (انظر الملاحظة أدناه) أسفل mRNA باتجاه النهاية 3 ، مكونًا البروتين. بمجرد أن يتحرك الريبوسوم بعيدًا بدرجة كافية لأسفل ، يمكن أن يلتصق الريبوسوم الثاني خلفه (على الجانب 5 ') ويتبع الريبوسوم الأول أسفل الرسالة. عندما يتحرك كل ريبوسوم نحو النهاية 3 ، مما يجعل البروتين ، يلتصق ريبوسوم آخر بعده حتى يتم تغطية الرنا المرسال بأكمله بالريبوسومات. يظل الرنا المرسال مغطى بالريبوسومات على الرغم من أن بعض الريبوسومات تنتهي وتتساقط من الطرف الثالث ، بينما يلتصق البعض الآخر باستمرار عند الطرف الخامس. يسمى الرنا المرسال المغطى بالعديد من الريبوسومات متعدد الريبوسوم أو متعدد الجسيمات باختصار. Sadava شكل 14.18 (12.14).

ملاحظة: يفترض هذا الوصف أن الريبوسومات تتحرك أسفل mRNA ، من 5 'إلى 3'. والنتيجة هي نفسها إذا افترضت أن الريبوسومات تبقى في مكانها بينما يتحرك الرنا المرسال عبر الريبوسومات ، نهاية 5 أولاً. (وهو الأرجح.) بمجرد انزلاق ما يكفي من الرنا المرسال عبر الريبوسوم الأول ، يمكن للريبوسوم الثاني أن يلتصق بالفراغ الموجود على الطرف 5 'ويمكن أن يخترق الرنا المرسال خلال ذلك التالي ، وهكذا.

لمراجعة الأشكال المتعددة ، جرب المشكلة 7-16 ، الجزء ب.

ج- الهيكل التفصيلي وتجميع الأمبير للريبوزومات: (انظر أسفل النشرة 14 أ). انظر النصوص للصور.

1. الأجزاء. يتكون كل ريبوسوم من وحدتين فرعيتين. كل وحدة فرعية عبارة عن بروتين نووي ريبي أو RNP مصنوع من نوع واحد على الأقل من الرنا الريباسي والعديد من البروتينات. تتكون كل وحدة فرعية بشكل منفصل من وحدتين فرعيتين (واحدة كبيرة وواحدة صغيرة) مثبتة على الرسالة لتشكيل ريبوسوم كامل للترجمة. تنفصل الوحدتان الفرعيتان عن بعضهما البعض (و mRNA) عندما يصلان إلى نهاية الرنا المرسال. انظر شكل Sadava. 14.14 (12.10) بيكر تين. 22-1.

2. أسماء الأجزاء. يتم تحديد الوحدات الفرعية للريبوسوم والحمض النووي الريبي الريبوزومي المختلف من خلال ثوابت الترسيب (قيم S) في جهاز طرد مركزي فائق. يتم إعطاء قيمتين في النشرة لأحجام الحمض النووي الريبي والوحدات الفرعية - العدد الأصغر هو بدائيات النوى والأكبر بالنسبة لحقيقيات النوى. انظر النشرة و / أو جدول بيكر 22-1.

3. التجميع الذاتي - كيف تتشكل بنية الريبوسوم؟ يتم تحديد بنية كل وحدة فرعية من خلال التسلسل الأولي للـ rRNA والبروتينات الموجودة فيه. تمامًا كما ينثني البروتين إلى التشكل ثلاثي الأبعاد الأكثر ثباتًا (أقل طاقة) ، فإن بروتينات rRNA + من كل وحدة فرعية تطوى إلى جسيم بروتين نووي أو RNP مع شكل ووظيفة ثلاثية الأبعاد مناسبة.

4. الرنا الريباسي مقابل الريبوسومات . احرص على عدم الخلط الريبوسومات مع RNA الريبوسوم.

D. Peptidyl Transferase هو ريبوزيم

البيبتيديل ترانسفيراز هو جزء من الريبوسوم. النشاط التحفيزي هو خاصية للرنا الريباسي في الوحدة الفرعية الكبيرة ، وليس بروتينًا ، لذلك هذا ليس إنزيمًا (محفزًا مصنوعًا من البروتين) ولكنه ريبوزيم (محفز مصنوع من الحمض النووي الريبي). يُفترض أنه من بقايا عالم & quotRNA & quot الذي كان موجودًا قبل أن يتولى الحمض النووي والبروتين العديد من الوظائف المبكرة للحمض النووي الريبي (الذي له خصائص تحفيزية وإعلامية). البيبتيديل ترانسفيراز ليس الريبوزيم الوحيد - من المعروف أن الحمض النووي الريبي التحفيزي الآخر معروف.
لمزيد من التفاصيل ، راجع http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/289/5481/878 يمكنك الوصول إلى هذا الموقع من أي كمبيوتر كولومبيا لا أعرف ما إذا كان يمكنك الحصول عليه من جهاز كمبيوتر شخصي إذا كنت لست مشتركًا في Science Online. لاحظ أن هذا الموقع يحتوي على ملاحظات تفصيلية & quothypernotes & quot ؛ والتي تسرد العديد من المواقع المفيدة لعلماء الأحياء الجزيئية. إذا وجدت أيًا من هذه الأشياء مفيدًا ، فيرجى إخبار الدكتورة م. حتى تتمكن من إخبار الطلاب الآخرين. (قد يكون الموقع بطيئًا في التحميل ، لكن الرابط يعمل.)

II. يبدأ ويوقف أمبير. كيف تبدأ سلاسل الببتيد؟ كيف يتوقف نمو سلسلة الببتيد؟

أ. يبدأ - يستخدم AUG لكل من "البدء" و "الميثيونين"

1. كيف يبدأ تخليق البروتين؟ - أنت بحاجة إلى met-tRNA خاص لـ ص موقع.

إذا كان موقع P يحمل فقط الحمض الريبي النووي النقال بسلاسل ، فكيف سيكون أول AA-tRNA مناسبًا للريبوسوم؟ الجواب هو أن هناك tRNA خاص (البادئ tRNA أو tRNAالتقىط) الذي يستخدم فقط في سلاسل البداية. يحمل هذا الحمض النووي الريبي استيفاء ويتعرف على كودون AUG ، وهو كودون (فقط) من أجل ميت وكودون البدء (فقط). هذا AA-tRNA خاص لأنه يناسب فقط موقع P.

2. كيف يتم إدخالها في منتصف السلاسل؟ - أنت بحاجة إلى met-tRNA مختلف لـ أ موقع.

إذا كان الحمض النووي الريبي (tRNA) الخاص بالتوافق في موقع P ، فكيف ستتم إضافته إلى سلسلة متنامية؟ هناك ثاني & quot الوضع العادي & quot؛ tRNA لمقابلة ، واحد يناسب الموقع A. يتعرف كل من الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) على نفس الكودون ويحملان نفس الحمض الأميني ، لكن أحدهما يناسب موقع P وواحد فقط في موقع A. الأول (البادئ tRNA) يستخدم فقط لبدء السلاسل والآخر يستخدم فقط في منتصف السلاسل. سادافا تين. 14.15 (12.11) أو شكل بيكر. 22-8 إذا كنت مهتمًا بكل تفاصيل التنشئة.

3. المعالجة. لماذا لا تبدأ كل سلاسل البروتين بالميثيونين؟ عادة ما تتم إزالة Met من النهاية الأمينية للبروتين قبل أن تطوى سلسلة الببتيد. يتم اختيار طريقة التوليف هذه (الحصول على جميع البروتينات تبدأ بالامتثال) لسهولة التصنيع ، وليس لأن التقابل ضروري لوظيفة البروتين. إنه يجعل التوليف أسهل ولكنه ينتج منتجًا يحتاج إلى تعديلات قبل الاستخدام (إزالة التقابل). تعد التعديلات التركيبية اللاحقة مثل إزالة التقابل شائعة (لجميع الجزيئات الكبيرة ، وليس البروتينات فقط) وغالبًا ما تسمى المعالجة. ليس من غير المعتاد على الإطلاق أن يخلع تعديل أو معالجة إنزيم قليلًا من الأحماض الأمينية أو النيوكليوتيدات هنا أو هناك ، أو إضافة مجموعة أو عامل مساعد ، وما إلى ذلك. هذه التعديلات أكثر شمولاً في حقيقيات النوى منها في بدائيات النوى وستتم مناقشتها باستفاضة في المحاضرات اللاحقة و / أو الفصل الدراسي التالي.

4. العثور على AUG الصحيح - كيف تختار الريبوسومات AUG المناسب للبدء منها؟ تختلف العملية في حقيقيات النوى وبدائيات النوى ، ونترك التفاصيل لمزيد من الدورات التدريبية المتقدمة. انظر النصوص إذا كنت مهتمًا.

باء توقف - لا تدخل الحمض الريبي النووي النقال

1. لا توقف الحمض الريبي النووي النقال. لا توجد جزيئات الحمض النووي الريبي (tRNA) لإيقاف الكودونات ، لذلك يتوقف الريبوسوم عندما يتعلق الأمر بإيقاف الكودون. يوجد الآن الحمض النووي الريبي ذو السلسلة الببتيدية في موقع P ، ولكن لا يوجد tRNA يناسب الموقع A.

2. دور عامل إطلاق البروتين. يرتبط بروتين يسمى عامل الإطلاق بكودون الإيقاف في الموقع A ويؤدي إلى إطلاق سلسلة الببتيد المكتملة. يتم تحرير سلسلة الببتيد من الحمض الريبي النووي النقال الخاص بها ، وتنطوي ، وتنطلق لتؤدي وظيفتها.

3. مصير آخر الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي وأمبير الريبوسوم. بمجرد إطلاق الببتيد من الحمض الريبي النووي النقال الخاص به ، يسقط الحمض النووي الريبي من الريبوسوم ثم ينفصل الريبوسوم إلى وحدات فرعية وتسقط الوحدات الفرعية من الرنا المرسال. يمكن استخدام الوحدتين الفرعيتين tRNA و amp ribosomal مرة أخرى. سادافا تين. 14.17 (12.13) أو شكل بيكر. 22-11.

لمراجعة عمليات البدء والتوقف ، جرب المسائل 7-12 ز ، 7-17 ، وأمبير 7-20 ب.

ثالثا. دور نقل الحمض النووي الريبي في الترجمة ، تابع. - Wobble & amp التحميل

أ . التذبذب والانحلال - كم عدد الحمض الريبي النووي النقال المختلف الذي تحتاجه لقراءة جميع الكودونات الـ 61 للأحماض الأمينية؟

1. الانحطاط مقابل الغموض

الشفرة الجينية ليست غامضة - فمن الواضح دائمًا ما تعنيه كلمة معينة (كودون) ، ولكن هناك مرادفات - كلمات متعددة (كودونات) لنفس الشيء (AA). على سبيل المثال. UUU / C (بمعنى UUU أو UUC) هو phe. رموز XYU / C دائمًا ما تفعله عادةً لنفس AA XYA / G. (X ، Y = أي من الأسس الأربعة.) انظر النص أو النشرة مع جدول الكود. أي كود بهذه الخاصية - كلمات متعددة لنفس الشيء - يسمى منحط. لذا فإن الشيفرة الجينية متدهورة.

أ. فكرة: نظرًا لأن الكود متدهور ، يمكنك توفير عدد مختلف من الحمض الريبي النووي النقال المطلوب إذا كان من الممكن استخدام نفس الحمض النووي الريبي لمدة اثنين أو أكثر مرادف الكودونات. يمكن استخدام نفس الحمض الريبي النووي النقال لاثنين أو أكثر من هذه الكودونات إذا سمحت بمرونة قليلة في الاقتران بين القاعدة في الموضع 3 من الكودون وقاعدتها المقابلة (الموضع 1) في anticodon. تُعرف هذه المرونة في الاقتران بـ & quotwobble. & quot بسبب التذبذب ، يُعرف الموضع 3 من الكودون والموضع 1 من anticodon باسم & quotthe wobble position & quot في الكودونات / anticodons الخاصة بهما.

ملحوظة: Wobble = عدة أكواد مختلفة تمت قراءتها بواسطة tRNA واحد ليس عدة الحمض الريبي النووي النقال المختلفة المستخدمة لنفس الكودون. (قد يكون هناك العديد من الحمض الريبي النووي النقال لنفس الكودون ، ولكن هذا يسمى شيئًا آخر.)

ب. آلية: من خلال التذبذب ، فإننا نعني أن القاعدتين المتضمنتين في الاقتران (القواعد الموجودة في وضع التذبذب للكودون والمضاد على التوالي) يمكن أن تتطور قليلاً بالنسبة لبعضهما البعض. بسبب هذه المرونة في المحاذاة ، تكون روابط H ممكنة بين المجموعات التي لا أساسها عادة الزوج في أحماض نووية مزدوجة الجديلة تمامًا. . تم رسم بعض الأمثلة في شكل بيكر. 22-4 وفي النشرة 14 أ.

ج . قواعد التذبذب: التطابقات المعتادة المسموح بها في وضع التذبذب هي كما يلي:

نوع الحمض النووي الريبي موقف القاعدة يتمركز
الحمض الريبي النووي النقال المركز الأول في أنتيكودون أ ج يو جي أنا **
مرنا المركز الثالث من كودون يو جي أ أو ز C أو U U أو C أو A.

** I = إينوزين (اسم النيوكليوزيد) أو هيبوكسانثين (اسم القاعدة) = أ بدون الأمينو (يحتوي على C = O بدلاً من C-NH2 في الموضع 6.)
كيف أقوم بالاقتران مع U أو C أو A وكيف يتم عرض أزواج U مع G في النشرة 14 A (أو انظر Becker ، الشكل 22-4).

د. مثال: يمكن أن يقترن نفس الحمض الريبي النووي النقال (مع anticodon 3 'AAG 5') مع كل من كودون UUU وكودون UUC في mRNA. (تذكر أن الاقتران متناقض ، لذا يجب أن يكون anticodon & quot ؛ مقلوبًا & quot ؛ بالنسبة إلى mRNA. 3'AAG 5 'في أزواج tRNA مع 5'UUU أو 5' UUC في mRNA.) نظرًا لأن رمز UUU و UUC لنفس الحمض الأميني (phe) ، كلاهما يمكن أن يقترن مع نفس الحمض الريبي النووي النقال الذي يحمل phe ، ويتم وضع الحمض الأميني الصحيح (phe) في كل مرة. لذلك هناك حاجة إلى tRNA واحد فقط ، بدلاً من اثنين ، لقراءة كل من UUU و UUC. (انظر النشرة 14 أ أو الشكل 22-4 لبيكر.)

ملاحظة مهمة: ليست كل التركيبات المسموح بها في قواعد & quotwobble & quot متوافقة مع الشفرة الجينية.

  • ليست كل الحمض الريبي النووي النقال الممكن موجودًا. المجموعات التي لا تتناسب مع الكود غير مسموح بها - أي أن الحمض الريبي النووي النقال المقابل غير موجود.
  • يجب أن يقرأ الحمض الريبي النووي النقال واحد الكودونات المتزامنة فقط. تشير قواعد التذبذب (انظر الجدول أعلاه & amp في النشرة) إلى أن بعض مضادات الكودونات من الحمض النووي الريبي (tRNA) يمكن أن تتزاوج مع العديد من أكواد mRNA المختلفة. ومع ذلك ، يجب أيضًا أن تتأكد من أن كل حمض tRNA يقرأ فقط الكودونات المترادفة - كل الكودونات التي يقرأها يجب أن ترمز لنفس AA.
  • مثال: لا يمكنك الحصول على tRNA مع AAI في Anticodon. لما لا؟ يمكن أن تقترن AAA أو AAG أو AAI (جميعها مكتوبة من 3 إلى 5) مع الكودون UUU. إذا كان لديك tRNA مع AAI في anticodon ، فسيتم إقرانه مع UUU و UUC و amp UUA. هذه الكودونات الثلاثة ليست متشابهة - فهي لا ترمز جميعها لنفس الأحماض الأمينية. أنت بحاجة إلى tRNA يقترن بـ UUU و / أو UUC ، ولكن ليس UUA. لذلك فإن الحمض الريبي النووي النقال مع AAG أو AAA في المضاد لا بأس به ، لكن الحمض الريبي النووي النقال مع AAI ليس كذلك.

ه. كم عدد الحمض الريبي النووي النقال المختلفة؟ في المتوسط ​​، تحتاج إلى اثنين من الحمض الريبي النووي النقال لكل & quotbox & quot في جدول الكود الجيني. لاحظ أن الحمض الريبي النووي النقال واحد لا يمكنه قراءة أكثر من 3 أكواد معظم الحمض الريبي النووي النقال يقرأ اثنين ، وبعض الحمض النووي الريبي يقرأ كودونًا واحدًا فقط. لذا فأنت بحاجة إلى حوالي 30 جزيءًا مختلفًا من الحمض الريبي النووي النقال ، وليس قريبًا من 64.

ما هو الرقم الدقيق المطلوب لقراءة جميع الكودونات؟ لنبدأ بحد أقصى ممكن. عدد 64 والنظر في تأثيرات عمليات البدء والتوقف والتذبذب وما إلى ذلك.

  • كيف تؤثر البدايات على # (2 مع tRNA's - انظر أعلاه) +1
  • كيف تؤثر التوقفات على # (لا يوجد tRNA للتوقف) -3
  • لذلك إذا لم يكن هناك تذبذب ، فسيكون الإجمالي 62.
  • تقطع Wobble (aprox.) # إلى النصف - انظر التفاصيل أعلاه.
  • إذن ما هو المجموع الكلي؟ تحتاج إلى حوالي 30 tRNA مختلفًا ، وليس 20 أو 64. (إذا كنت تريد تخمين الرقم الدقيق ، فراجع مربع الرمز تلو الآخر. التقدير المعتاد لـ min. # مطلوب هو 32.)

لمراجعة Wobble and Degeneracy ، راجع المشكلات 7-15 و7-19 و 7-25.

B. تحميل L من tRNA - من أين تأتي الطاقة لتحميل الحمض الريبي النووي النقال؟

1. الرصيد الكلي للاعبي التنس المحترفين - كيف تتناسب ATP مع؟ هناك طريقتان لشرح كيفية تناسب ATP هنا:

المقاربة رقم 1 - صورة شاقة / منحدرة. انظر النشرة 14 ب. (قارن بالصورة المماثلة لصنع الحمض النووي.)

الفكرة الأساسية: إنه صعود من سلسلة AA & # 8594 ، ولكنه ينحدر من سلسلة AA-tRNA & # 8594. يتم فصل 2 P عن ATP للحصول على AA على الحمض الريبي النووي النقال ، وهي انحدار من هناك (AA-tRNA) لصنع السلسلة. لاحظ أن اتصال الحمض الريبي النووي النقال - AA مقطوع لإضافة حمض أميني ، ولكن الاتصال المقطوع يكون بين آخر حمض أميني في سلسلة الببتيد و tRNA ، وليس بين AA الجديد و tRNA الخاص به. (تضيف سلسلة الببتيد إلى AA على الحمض الريبي النووي النقال التالي ، وليس العكس.)

النهج رقم 2 - لخص ردود الفعل للشحن

(rxn 1) tRNA + AA & # 8594 AA

الحمض الريبي النووي النقال (+ ماء)

(rxn 2) ATP (+ ماء) & # 8594 AMP + PP أنا

(rxn 3) بيروفوسفاتيز: PPأنا (+ ماء) & # 8594 2 صأنا

Rxn1 شاق ، لذا يجب عليك إقران rxn (1) بالتحلل المائي لـ ATP (rxn 2).

& # 916 G o لـ (1) + (2) حوالي صفر ، لكن PP 'tase = بيروفوسفاتاز يزيل المنتج (rxn. 3) ويسحب رد الفعل الكلي إلى اليمين (كما في تركيب الحمض النووي). بمعنى آخر ، مجموع & # 916 G o لـ (1) + (2) + (3) سالب. (يظهر صافي التفاعل في أسفل النشرة 14 ب).

يمكن استخدام الحمض الريبي النووي النقال في تخليق البروتين لتوفير طاقة مجانية لتكوين روابط الببتيد.

لاحظ أن هناك طريقتان مختلفتان للحصول على الطاقة من اثنين & quothigh energy & quot ؛ روابط من ATP.

الطريقة الأولى: تقوم بتقسيم جزيئين من 2ATP ، وإزالة فوسفات واحد في كل مرة:

الطريقة الثانية: تقوم بفصل جزيء واحد من ATP ، وإزالة اثنين من الفوسفات:

في كلتا الحالتين ، تكون & quotenergy cost & quot هي نفسها. يستخدم توليف XTP لتخليق الحمض النووي الطريقة الأولى لتخليق AA

يستخدم الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) لتخليق البروتين الطريقة الثانية.

2. كيف يتم دمج التفاعلات (1) و (2) بالفعل؟

أ. إنزيم واحد في الواقع يحفز خطوتين rxn. لكل زوج من الحمض الريبي النووي الريبي وأمبير ، مثله و tRNAله. إن وجود خطوتين (باستخدام نفس الإنزيم ومطابقة نفس AA ونفس الحمض الريبي النووي النقال) يزيد من الدقة كما هو الحال مع التدقيق اللغوي بواسطة بوليميريز الحمض النووي.

ب. النتيجة الصافية هي إقران التحلل المائي لـ ATP وتحميل الحمض الريبي النووي النقال على النحو التالي (أيضًا في النشرة):

(أ) ATP + AA & # 8594 AMP

net = ATP + AA + tRNA & # 8594 AMP + PP أنا + AA

كما هو موضح أعلاه ، & # 916G o لهذا هو حوالي صفر ، لكن بيروفوسفاتاز يسحبه كما هو الحال بالنسبة لتخليق الحمض النووي. إذا قمت بتضمين عمل بيروفوسفاتيز ، فإن الصافي الكلي = نفس (1) + (2) + (3) أعلاه.

ج. رد فعل الشحن / التحميل معقد للغاية ، لكنه يخدم وظيفتين : الدقة / الخصوصية والطاقة. الجزء المكون من خطوتين يزيد الدقة / الخصوصية بشكل عام rxn. يربط التحلل المائي ATP بتخليق البروتين.

للحصول على رسم تخطيطي ، انظر شكل Sadava. 14.13 (12.9) أو شكل بيكر. 22-5.

د. أسماء الانزيم المعنية التأكيد على وظائف متعددة لردود الفعل أعلاه. يسمى الإنزيم تحميل الإنزيم أو تنشيط / شحن الإنزيم أو إنزيم aminoacyl-tRNA synthetase. تؤكد الأسماء المختلفة على الوظيفة (الوظائف) المختلفة للإنزيم:

  • تحميل الإنزيم - العبارات AA ("عبارات الحمل") إلى mRNA
  • تنشيط الإنزيم - يحبس الطاقة لتشكيل رابطة الببتيد
  • AA-tRNA synthase (أو synthetase) - هل المطابقة الدقيقة لـ AA و tRNA يضمن الخصوصية

انقر هنا للحصول على تخليق البروتين المتحرك (في Netscape & gt = 4 ، يمكنك التحكم في الرسوم المتحركة عبر الزر الأيمن للفأرة. في Netscape 3 ، يمكنك إعادة تشغيل الرسوم المتحركة باستخدام زر إعادة التحميل وإيقافها في أي وقت باستخدام الزر "إيقاف"). تم عمل هذه الرسوم المتحركة بواسطة TA في هذا الفصل. هناك العديد من الرسوم المتحركة على الويب. انتقل إلى Google واكتب "رسوم متحركة لتخليق البروتين" لمجموعة كاملة. (دع Dr. M يعرف إذا وجدت واحدة مفيدة حقًا.) توجد رسوم متحركة أخرى في http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120077/micro06.swf.


رابعا
. ملخص كيف تصنع & quotRNA البروتين& مثل

أ. كم عدد الأنواع المختلفة من الحمض النووي الريبي اللازمة؟ للمراجعة:

1. دور mRNA. أكواد الحمض النووي لـ mRNA ، وأنت تستخدم mRNA لصنع البروتين. لكن هل mRNA كل ما تحتاجه؟ بالطبع لا.

2. تحتاج أيضًا إلى الحمض الريبي النووي النقال والريبوزومات (التي تحتوي على الرنا الريباسي) وكذلك مرنا.

أ. من أين تأتي الحمض الريبي النووي الريبي (الرنا الريباسي) والرنا الريباسي (الرنا الريباسي)؟ يتم ترميز جميع الحمض النووي الريبي بواسطة الحمض النووي تمامًا مثل mRNA. لذلك هناك جينات لـ tRNA و rRNA على الحمض النووي. (لا تقوم الجينات فقط بترميز البروتينات ، كما أن جينات mRNA المعنية ترمز أيضًا إلى RNA الأخرى اللازمة جنبًا إلى جنب مع mRNA لصنع البروتينات.)

ب. لا يتم استخدام الحمض الريبي النووي الريبي (tRNA) والرنا الريباسي (rRNA) كقوالب . عندما يتم نسخ جينات الرنا الريباسي (الرنا الريباسي) والرنا الريباسي (الرنا الريباسي) ، تنطوى المنتجات وترتبط بالبروتينات إذا لزم الأمر (للرنا الريباسي) وتقوم بوظائفها. لا تتم ترجمة هذه الحمض النووي الريبي - فهي وكلاء تساعد في ترجمة الحمض النووي الريبي (mRNA) الآخر.

3. أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي لها نصف عمر مختلف

أ. الرنا الريباسي و الرنا الريباسي طويل العمر نسبيًا. تدوم الجزيئات الفردية لفترة طويلة وتستخدم مرارًا وتكرارًا قبل أن تتحلل.

ب. mRNA بدائية النواة قصير العمر نسبيًا. يتم تصنيع mRNA باستمرار ، واستخدامها لفترة قصيرة ، وتتحلل.

ج. تختلف mRNAs حقيقية النواة - بعضها وليس كلها قصيرة العمر وبعضها طويل العمر. أمثلة على المدى التالي.

ب. هل الحمض النووي الريبي وحده يصنع البروتين؟ لا ، ربما ينبغي أن نقول & quot؛ البروتين والحمض النووي الريبي يصنعان البروتين & quot

أنت بحاجة إلى الإنزيمات ، عوامل البدء (IF's) وعوامل الاستطالة (EF's) ، بروت الريبوسوم. إلخ أيضًا ، ليس فقط mRNA أو فقط mRNA و tRNA و rRNA. (للحصول على جميع تفاصيل IF و EF وما إلى ذلك ، انظر Becker fig.22-10.) لكنك تحتاج إلى بروتين للقيام بكل شيء فهو جزء RNA غير المعتاد. نعم ، هذه مشكلة دجاجة وبيضة. لهذا السبب تحتاج إلى خلية - بها كل ما هو مطلوب لصنع بروتين - لصنع خلية (أخرى).

C. كم عدد مختلف هناك حاجة لأنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي؟ دعنا نفكر في ما يتطلبه الأمر لصنع بولي ببتيد واحد ، ثم ما الذي يجب عليك تغييره إذا كنت تريد صنع ببتيد آخر مختلف.

1. ما الذي يتطلبه الأمر لصنع ببتيد واحد؟

أ. مرنا -- أنت بحاجة إلى نوع واحد لصنع بولي ببتيد واحد.

ب. الرنا الريباسي - أنت بحاجة إلى عدة أنواع (3-4) لعمل ريبوسوم واحد دقيق يعتمد على ما إذا كان ريبوسوم حقيقي النواة أو بدائية النواة.

ج. الحمض الريبي النووي النقال - أنت بحاجة إلى مجموعة كاملة واحدة (لالتقاط جميع الأحماض الأمينية وقراءة جميع الكودونات ولكن توقف). هذا على افتراض أن الببتيد الذي تصنعه يحتوي على جميع الأحماض الأمينية العشرين وأن mRNA يستخدم جميع الكودونات الممكنة. حسبنا أعلاه ، ستحتاج إلى حوالي 30 نوعًا مختلفًا.

ملاحظة: السؤال هنا كم مختلف الأنواع التي تحتاجها ، وليس عدد كل نوع. إذا حدث نفس الكودون مرتين على التوالي ، فستحتاج إلى نسختين من النوع المقابل من الحمض الريبي النووي النقال.

2. ماذا لو كنت تريد صنع بروتين مختلف؟

أ. مرنا - هل ستحتاج إلى مرنا مختلف لصنع ببتيد ثان (مختلف)؟ نعم (لكن انظر الملاحظة *) - أنت بحاجة إلى تسلسل فريد من النيوكليوتيدات (في قالب الرنا المرسال) لصنع كل ببتيد فريد.

*ملحوظة: يمكن أن يحمل مرنا واحد في بعض الأحيان عدة أقسام مختلفة ، كل ترميز لببتيد مختلف. في هذه الحالة ، يمكنك استخدام قسم مختلف من نفس الرنا المرسال لصنع ببتيد مختلف.
تُسمى Messenger RNAs التي تحمل المعلومات لصنع ببتيدات متعددة & quot؛ polycistronic mRNAs & quot وسيتم مناقشتها عندما نصل إلى الأوبرا. إن مرنا متعدد الكريات شائع في بدائيات النوى ولكنه نادر في حقيقيات النوى.

ب. الرنا الريباسي - بمجرد حصولك على مجموعة كاملة من الرنا الريباسي (والريبوسوم) ، هل تحتاج إلى مجموعة جديدة لصنع الببتيد الثاني؟ لا ، نفس الريبوسوم يمكنه قراءة أي رسالة. (تحتوي الخلية الحقيقية على العديد من الريبوسومات ، لكن جميعها متشابهة).

ج. الحمض الريبي النووي النقال - بمجرد حصولك على مجموعة كاملة من الحمض الريبي النووي النقال ، هل ستحتاج إلى مجموعة جديدة لصنع ببتيد مختلف؟ لا ، يمكن استخدام نفس المجموعة مرارًا وتكرارًا لصنع أي عدد من الببتيدات المختلفة. (تحتوي الخلية الحقيقية على العديد من الجزيئات من كل نوع من أنواع الحمض النووي الريبي ، تمامًا كما تحتوي على العديد من الريبوسومات).

3. الملخص: mRNA هو البرنامج الفريد للبروتين الذي يتم تصنيعه ، tRNA و amp rRNA (والبروتينات المرتبطة بأمبير) هي الأجهزة التي يمكن استخدامها لصنع أي بروتين.

لمراجعة عدد الحمض النووي الريبي المختلف الذي يتطلبه الأمر & quot؛ لصنع البروتين & & quot؛ حل المشكلات 7-14 & amp7-17.

V. الطفرات (إذا لم نصل إلى هذا ، فسنقوم بذلك في المرة القادمة)

توليف الحمض الريبي النووي النقال أو الرنا الريباسي. إذا أخطأت في تحديد النيوكليوتيدات في جزيء واحد من الحمض الريبي النووي النقال أو الرنا الريباسي ، فإن النتائج متشابهة.

توليف مرنا. إذا أخطأت في تحديد النيوكليوتيدات في الرنا المرسال ، احصل على بعض جزيئات البروتين السيئة. أسوأ ، لكن يمكن تحمله. بعد التخلص من جزيء mRNA هذا ، سيكون mRNA الجديد والبروتين المصنوع على ما يرام.

تكرار الحمض النووي. إذا أخطأت في تحديد النيوكليوتيدات في الحمض النووي ، فماذا بعد ذلك؟ يمكن إصلاح الأخطاء ، الخلايا لديها إنزيمات لذلك. إذا لم يتم إصلاحه ، عند النسخ المتماثل التالي ، يحصل أحد المتسللين على DNA متغير تمامًا ويتم تمرير التسلسل المتغير إلى الأبد. سيتم تغيير كل RNA والبروتين الجديد. إذن هذا أمر خطير حقًا ، وهذا هو المقصود بالطفرة. (الأخطاء في الحمض النووي الريبي وتخليق البروتين - طالما أن الحمض النووي على ما يرام - لا تسمى الطفرات. إنها تسمى الأخطاء.)

ب. كيف تحدث أخطاء في تركيب الحمض النووي؟

يمكن للقواعد أن تتعطل (إذا كانت في شكل توتوميري خاطئ أو تالفة) - انظر شكل Sadava. 15.5 (12.20). يمكن أن ينزلق بوليميراز الحمض النووي بالنسبة للقالب ويضيف قواعد إضافية أو يترك بعضها. التدقيق اللغوي يحافظ على أخطاء الاقتران منخفضة ولكن ليس صفرًا. إنزيمات الإصلاح تصحح بعض الأخطاء. (انظر أدناه لمعرفة سبب ضرورة الطفرات.) بعد حدوث خطأ (وضع قاعدة خاطئة) ، لا يزال الخيط الآخر على ما يرام. ولكن إذا تم نسخ الحمض النووي الذي يحتوي على خطأ في خيط واحد قبل تصحيح الخطأ ، فسيكون لأحد الجزيئات الوليدة خيطان متغيران. (سيكون جزيء الابنة الآخر على ما يرام.)

لا يزال من الممكن تصحيح جزيء الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل مع خيط واحد متغير (عن طريق إنزيمات الإصلاح) ولكن لا يمكن تصحيح الجزيء الذي يحتوي على خيطين متغيرين. بمجرد تغيير كلا الخيطين ، غالبًا ما يُقال إن الطفرة "ثابتة" بمعنى "دائمة". لاحظ أنه في هذا السياق ، تعني كلمة "ثابت" ضد من "تصحيح".

ج- تعريف / مصطلحات الطفرات ، انظر Becker Box 22B p. 694 (ص 700) أو شكل سادافا. 15.2 (الفصل 12.6 ص 275-276).

1. أخطاء مقابل الطفرات. تسمى الأخطاء في الحمض النووي الريبي أو تخليق البروتين بالأخطاء ، ولكن الأخطاء في تركيب الحمض النووي (التي لم يتم تصحيحها) تسمى الطفرات. أي شيء يغير الحمض النووي يسمى طفرة ، والكائن الحي الذي لديه طفرة يسمى متحولة. غالبًا ما يُطلق على الكائن الطبيعي أو البدئي (أو القياسي) & quot ؛ النوع البري. & quot ؛ التغيير في الحمض النووي الريبي أو البروتين الذي لا يؤثر على الحمض النووي لا يسمى طفرة.

2. أنواع الطفرات - المصطلحات انظر شكل Sadava. 15.2 (الفصل 12.6) أو Becker Box 22B

أ. الاستبدال = التغيير في القاعدة (القواعد).

ب. الحذف / الإدراج = إزالة أو إضافة القاعدة (القواعد).

ج. Frameshift. يُطلق على إدخال / حذف قاعدة واحدة أو قاعدتين (في منطقة الترميز) تغيير الإطارات لأن mRNA مع مثل هذه الطفرة يساء فهمه في الإطار المقتبس الخاطئ & quot (مجموعات خاطئة من ثلاثة نيوكليوتيدات) طوال الطريق حتى نهاية الجين (أو حتى يصل الريبوسوم إلى كودون توقف). لاحظ الاختلاف الكبير في التأثيرات بين الاستبدالات وانزياحات الإطارات.

د. هراء مقابل سوء الفهم . تسمى الطفرة التي تولد كودون توقف أحيانًا & quotnonsense & quot الطفرة التي تغير أحد الأحماض الأمينية إلى أخرى تسمى طفرة & quotmis-sense & quot.

3. النمط الظاهري والنمط الجيني

تُعرف حالة الحمض النووي باسم الطراز العرقى تُعرف الخصائص التي يمكن ملاحظتها للكائن الحي باسم النمط الظاهري. تغير الطفرة النمط الجيني ، ولكنها قد تغير أو لا تغير النمط الظاهري. انظر مشاكل التلاوة # 8.

د. لماذا تعتبر الطفرات مهمة؟

1. مصدر التنوع التطوري - مصدر جميع الاختلافات في النمط الظاهري للانتخاب للعمل على سبب وجود أنواع مختلفة (وسبب وجودنا هنا على الإطلاق). هذا جيد بشكل عام ، لكنه ليس جيدًا بالنسبة لنا عندما يكون فيروس نقص المناعة البشرية أو الأنفلونزا أو أي عامل معدي آخر يتحور.

2. مصدر التنوع الفردي (& amp ؛ غير وظيفي). تؤدي الطفرة إلى اختلافات في الحمض النووي غير المشفر. هذا له عواقب وظيفية قليلة أو معدومة ، ولكن الاختلافات في متناول اليد لتتبع خطوط النسب التطورية وتحديد الهوية. (هذا هو أساس جميع معرفات الطب الشرعي.) الاختلافات التي لا تؤثر على النمط الظاهري تستمر لأنه لا يوجد اختيار مع أو ضد أي إصدار معين. (الأفراد الذين يحملون أي طفرة معينة ليسوا في أي ميزة إنجابية أو عيب.)

3. تسبب الأمراض الوراثية مثل الهيموفيليا ، تاي ساكس ، وما إلى ذلك (يمكن أن تسبب السرطان في الخلايا الجسدية.) للحفاظ على مزايا (1) وتجنب عيوب (3) ، تحافظ الكائنات الحية على مستوى الطفرة منخفضًا ولكن غير معدوم عن طريق التحرير الشامل ، الإصلاح ، إلخ.

4. تعتبر الطفرات أداة مفيدة للغاية لمعرفة كيفية عمل الأشياء.

  • سمحت لنا تأثيرات الدراسة لتغيير الإطارات بالبدء في فك الشفرة الجينية - انظر كتاب الاحتمالات ومشكلات التلاوة والنصوص (لمزيد من التفاصيل ، انظر `` طفرات تغيير الإطارات '' في كتاب بيكر)

  • يسمح لنا بالتخلص من بروتين واحد في كل مرة ومعرفة ما يحدث - يشير إلى وظيفة البروتين التي كانت في المقام الأول. (كما هو الحال في اكتشاف المسارات في كتاب المشاكل.) يمكن تحقيق نفس التأثير غالبًا باستخدام RNAi (أو مضادات الحس) ، أو مع الأدوية.

ملاحظة: في هذه الدورة ، غالبًا ما نخبرك بكيفية عملها أولاً ثم نمنحك الطفرات لاختبار فهمك. من الناحية التاريخية ، عادةً ما تعمل بشكل عكسي - تتم دراسة الطفرات أولاً ويتم التعرف على تفاصيل "كيفية عملها" من خلال تحليل المسوخ. على سبيل المثال ، تم "تكسير" الشفرة الجينية جزئيًا من خلال النظر في الطفرات ورؤية كيفية ارتباط التغييرات في الحمض النووي بالتغيرات في البروتين المقابل. (استغرق الأمر الكيمياء الحيوية لإنهاء المهمة.) انظر النصوص للحصول على التفاصيل.

لمراجعة الطفرات انظر مشاكل التلاوة # 8 و7-22. (7-23 و 7-24 و 7-26 تتعامل أيضًا مع الطفرات.)

حقوق النشر 2010 Deborah Mowshowitz and Lawrence Chasin Department of Biological Sciences Columbia University New York، NY.


شاهد الفيديو: الفرق بين خلايا بدائيات النواه و حقيقيات النواه - شرح Difference between Prokaryotes and Eukaryotes (كانون الثاني 2022).