معلومة

هل نعرف ما إذا كانت الكلاب ناقلة أعراض لـ sars-cov-2؟

هل نعرف ما إذا كانت الكلاب ناقلة أعراض لـ sars-cov-2؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لا تستخدم الكلاب القناع عند المشي ولا تراقب مسافة الأمان. على العكس من ذلك ، فهم كثيرًا ما ينضمون إلى أنوفهم ، ويضعون أنوفهم في الأماكن التي وضعتهم فيها الكلاب الأخرى من قبل أو تبولوا. لذلك ، نظرًا لأنها حيواناتنا الأليفة ، من المهم معرفة ما إذا كان يمكن أن تكون أجهزة إرسال بدون أعراض لـ sars-cov-2. هل نعرفه؟ على الأقل ، هل اختبرنا حيوانات أليفة بدون أعراض لأشخاص مصابين بـ sars-cov-2؟


قد يكون من السابق لأوانه معرفة ذلك.

لم يكشف اختبار الكلاب في ووهان عن أي كلاب مصابة "تم اختبار 487 كلبًا بما في ذلك 90 كلبًا بيجل و 147 كلبًا أليفًا و 250 كلابًا شوارع أثناء تفشي مرض السارس CoV ‐ 2 سلبيًا مصليًا." من https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/tbed.13577

"فيروس كورونا يمكن أن يصيب القطط - الكلاب ، ليس كثيرا." https://www.nature.com/articles/d41586-020-00984-8

تم العثور عليها من خلال البحث عن "كلب" على LitCovid على https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/coronavirus/


هل يمكن للحيوانات الأليفة الحصول على اللقاح؟ 5 أسئلة حول فيروس كورونا Covid-19 أجاب الخبراء عنها

يمكن أن يصيب Covid-19 أصدقائنا ذوي الفراء - وهنا 101 على Covid-19 والحيوانات الأليفة.

عندما أعلنت منظمة الصحة العالمية لأول مرة عاد Covid-19 إلى الوباء في مارس 2020 ، ولم يمض وقت طويل قبل أن يبدأ البشر في الخوف من حيواناتهم الأليفة.

بدأت التقارير المخيفة في الظهور ، مثل أول كلب أثبتت إصابته بموت Covid-19 - على الرغم من أنه ليس من الواضح ما إذا كان Covid-19 هو سبب الوفاة - أو تقارير عن تفشي جماعي في مزارع المنك ، مما دفع العديد من أصحاب الحيوانات الأليفة إلى التساؤل عما إذا كان فرويهم يمكن أن يصاب الأصدقاء بشكل خطير من Covid-19.

ولكن الآن بعد مرور أكثر من عام على ظهور Covid-19 ، كيف تغير فهمنا لعدوى Covid-19 في الحيوانات الأليفة؟

بالنسبة للمبتدئين: يمكننا الآن الإجابة على عدة أسئلة حول Covid-19 والحيوانات الأليفة ، بما في ذلك:

  • ما إذا كان بإمكان البشر إصابة الحيوانات (والعكس صحيح)
  • الانتقال بين الإنسان والحيوان
  • كيف تصاب الحيوانات الأليفة وما إذا كانت تحمل الأجسام المضادة لـ Covid-19
  • ما إذا كان من المحتمل أن تمرض الحيوانات الأليفة بشكل خطير
  • ما هي الحيوانات الأكثر عرضة للإصابة بـ Covid-19؟
  • كيف نحمي أصدقاءنا ذوي الفراء من Covid-19

ونشرت دراسة حديثة الشهر الماضي في المجلة بلوس واحد قد يكون قادرًا على إلقاء المزيد من الضوء ، والكشف عن معلومات جديدة حول عدوى Covid-19 في القطط والكلاب في البرازيل.


ماذا تفعل إذا كان لديك حيوانات أليفة

إذا كان لديك حيوانات أليفة ، تعامل معها كما تفعل مع أفراد الأسرة البشرية الآخرين لحمايتها من الإصابة بعدوى COVID-19 المحتملة.

نظرًا لوجود خطر من أن الأشخاص المصابين بـ COVID-19 يمكن أن ينشروا الفيروس إلى الحيوانات ، يجب على أصحاب الحيوانات الأليفة الحد من تفاعلهم مع الحيوانات الأليفة و rsquos مع أشخاص خارج منازلهم.

  • احتفظ بالقطط بالداخل قدر الإمكان ولا تسمح لها بالتجول بحرية بالخارج.
  • قم بتمشية الكلاب على مقود على بعد 6 أقدام على الأقل من الآخرين لحمايتها من التفاعل مع الناس خارج المنزل.
  • تجنب الأماكن العامة التي يتجمع فيها عدد كبير من الناس.
  • لا تضع قناعًا على الحيوانات الأليفة. يمكن للأقنعة أن تؤذي حيوانك الأليف.

لا يوجد دليل على أن الفيروس يمكن أن ينتشر إلى الناس من جلد أو فراء أو شعر الحيوانات الأليفة. لا تمسح حيوانك الأليف أو تحممه بمطهرات كيميائية أو كحول أو بيروكسيد الهيدروجين أو أي منتجات أخرى ، مثل معقم اليدين أو مناديل التنظيف المضادة أو غيرها من المنظفات الصناعية أو السطحية. تحدث إلى طبيبك البيطري & # 8203 إذا كانت لديك أسئلة حول المنتجات المناسبة للاستحمام أو تنظيف حيوانك الأليف & # 8203 & # 8203.

الحيوانات الأليفة المصابة بهذا الفيروس قد تمرض أو لا تمرض. عادة ما يكون لدى الحيوانات الأليفة التي تظهر عليها أعراض مرض خفيف يمكن الاعتناء به في المنزل. إذا كنت تعتقد أن حيوانك الأليف مريض بالفيروس أو إذا كانت لديك مخاوف بشأن صحة حيوانك الأليف و rsquos ، فتحدث إلى طبيبك البيطري. أصيبت معظم الحيوانات الأليفة التي أصيبت بالفيروس المسبب لـ COVID-19 بعد الاتصال الوثيق بشخص مصاب بـ COVID-19.


نتائج الجائحة المحتملة

يشرح الدكتور رينيه ف. ناجيرا ، عالم الأوبئة ومحرر مشروع تاريخ اللقاحات من كلية الأطباء في فيلادلفيا ، أن عددًا كبيرًا من السكان المناعي هو ما أنهى عادةً الأوبئة التاريخية الأخرى. تقول الدكتورة نجيرة: "إما أن عددًا كبيرًا من الناس أصيبوا بالمرض وأصبحوا محصنين ، أو مات عدد كبير منهم ، أو تم تطوير لقاح ناجح ونشره بنجاح". هدأ جائحة إنفلونزا عام 1918 بسبب السيناريو الأول ، ولكن فقط بعد إصابة ما يقرب من ثلث سكان العالم وقتل ما لا يقل عن 50 مليون شخص. لقد نجحت اللقاحات في القضاء على آفة الجدري ، بينما خفضت لقاحات شلل الأطفال الحالات إلى أقل من 100 حالة سنويًا.

الآن ، بمجرد أن يصبح العامل الممرض وباءً ، هناك ثلاثة مسارات محتملة يمكن أن يسلكها. يمكن أن يهدف مسؤولو الصحة إلى القضاء على المرض في بلد أو منطقة جغرافية أكبر (الولايات المتحدة أو أمريكا الشمالية) ، كما فعلنا في الولايات المتحدة مع الحصبة والنكاف والحصبة الألمانية. يعني القضاء أن الفيروس غير موجود بشكل عام في البلاد ولكن قد يتم استيراده من حين لآخر ويسبب أوبئة محلية بسبب سفر الأشخاص بعد تعرضهم خلال الفاشيات المستمرة في مناطق أخرى من العالم.

والاحتمال الثاني هو أنه يمكن استئصال العامل الممرض ، كما حدث للجدري وجاري الآن لشلل الأطفال: الإبادة الكاملة للكائن الحي من البرية على الأرض. يوضح الدكتور نجيرا أن هذا يمثل تحديًا كبيرًا وربما مستحيلًا بالنسبة لـ SARS-CoV-2 ، نظرًا لطبيعة الفيروس حيوانية المصدر وقدرته على القفز بين الأنواع. "إذا تم العثور عليها في الأنواع الأخرى ، فإنها تنتقل من نوع إلى آخر ، وتختبئ وتعود مع تغير الظروف." تشارلز كيني ، دكتوراه ، زميل أول في مركز التنمية العالمية ومؤلف كتاب دورة الطاعون: الحرب التي لا تنتهي بين البشرية والأمراض المعدية، يوافق على مسألة الاستئصال: "سأكون مندهشًا بعض الشيء إذا تعاملنا مع SARS-Cov-2 ، والذي وجدناه في القطط والكلاب والمنك والغوريلا والنمور ، على سبيل المثال ، والتي قد نشأت في الخفافيش ".

بالإضافة إلى ذلك ، نحن غير متأكدين مما إذا كانت لقاحات COVID-19 المستخدمة ستوفر مناعة طويلة الأمد ، كما تفعل لقاحات الجدري وشلل الأطفال. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد يترك ذلك الأفراد غير محميين حيث تتضاءل مناعة اللقاح. علاوة على ذلك ، لمحاولة الاستئصال ، يجب أن يكون اللقاح متاحًا للجميع ، وهو أمر غير ممكن في الوقت الحالي ، على الرغم من أنه من المتوقع تكثيف التصنيع في بقية عامي 2021 و 2022. لشلل الأطفال ، مما يسمح بانتشار غير مكتشفة. وجود أعراض مميزة للغاية ، كما هو الحال مع طفح الجدري ، سهّل تحديد الحالات والسيطرة على انتقال الجدري أثناء حملة الاستئصال.

لذا فإن الاستئصال قد انتهى ، والقضاء سيكون صعبًا للغاية ، على الأقل في هذه المرحلة من الزمن. هذا يترك لنا الاحتمال الثالث: فيروس مستوطن. هذا يعني أنه سيكون موجودًا عند مستوى منخفض من السكان في المستقبل المنظور. يقترح الدكتور ناجيرا أن SARS-CoV-2 سيصبح أكثر شبهاً بالفيروسات التاجية البشرية الأربعة المستوطنة التي تسبب بشكل عام نزلات البرد: "فيروس مزعج آخر للبعض وشديد بما يكفي لقتل الآخرين." ومع ذلك ، مع تلقيح جزء كبير من السكان ، سنشهد عددًا أقل بكثير من الإصابات والوفيات التي شهدناها خلال الأشهر الستة عشر الماضية ، وحتى عند حدوث الفاشيات ، سيكون من غير المرجح أن تطغى على المستشفيات.

يتوافق هذا الاستنتاج المتوطن مع نتائج وباء H1N1 "أنفلونزا الخنازير" عام 2009. في 10 أغسطس 2010 ، بعد حوالي 16 شهرًا من ظهوره لأول مرة ، أعلنت منظمة الصحة العالمية (WHO) أن الوباء "انتهى" لكنها حذرت: "مع دخولنا فترة ما بعد الجائحة ، لا يعني هذا أن فيروس H1N1 قد ذهب بعيدا. بناءً على التجربة مع الأوبئة السابقة ، نتوقع أن يتخذ فيروس H1N1 سلوك فيروس الأنفلونزا الموسمية ويستمر في الانتشار لعدة سنوات قادمة ". لقد تحقق هذا. بعد أكثر من عقد من الزمان ، لا يزال أحفاد الفيروس الوبائي لعام 2009 ينتشر ، كما فعلت فيروسات الإنفلونزا الجائحة بعد أوبئة الإنفلونزا 1918 و 1957 و 1968. في مرحلة ما ، ستصدر منظمة الصحة العالمية إعلانًا مشابهًا لـ COVID-19 ، عندما تكون مستويات الحالات الجديدة منخفضة بدرجة كافية في معظم البلدان حول العالم. لكن هذه لن تكون نهاية الفيروس.


هل يمكن للكلاب أن تنشر الفيروس أكثر؟

لم يتم إثبات أن الكلاب في الدراسات التجريبية قادرة على تكرار الفيروس (داخل أجسامهم). ببساطة ، هم أنفسهم ليسوا مصدرًا للعدوى.

يوجد حاليًا تقريران عن حالة كلاب يحتمل أن تكون ملوثة بفيروس COVID-19 من قبل أصحابها. تلك الكلاب لم تمرض.

لتقليل أي خطر محتمل للانتقال إلى كل من الأشخاص والكلاب ، لا يسمح الجهاز المستخدم لتدريب الكلاب بأي اتصال مباشر بين أنف الكلب وعينة العرق.

يذهب أنف الكلب إلى مخروط من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مع وجود عينة العرق في وعاء خلفه. هذا يسمح بالوصول المجاني إلى المركبات الشمية المتطايرة ولكن بدون اتصال جسدي.

علاوة على ذلك ، يتم فحص جميع الكلاب المدربة على اكتشاف COVID-19 بانتظام عن طريق اختبارات مسحة الأنف واختبارات مسحة المستقيم واختبارات الدم لتحديد الأجسام المضادة. حتى الآن ، لم يتم العثور على أي من كلاب الكاشف مصاب.


الوضع في المنظور

للتحقق من فرضية جهاز الكمبيوتر الخاص به ، سيحتاج Xia إلى العثور على منحة أو موارد أخرى لاختبار الكلاب الضالة في البرية.

وقال شيا: "هذا يشير إلى أهمية مراقبة فيروسات كورونا الشبيهة بالسارس في الكلاب الضالة في مكافحة السارس- CoV-2".

في حين أن هذه فرضية معقولة تستند إلى دراسة الفيروسات ، إلا أن الأمر سيستغرق وقتًا ، وقد تدعم النتائج النظرية وقد لا تدعمها ، تمامًا كما سقطت الفرضيات الأخرى على جانب الطريق.

وقال نيومان: "أنا واثق من أن الإجابات حول أصل السارس- CoV-2 لا تزال موجودة في مكان ما في العالم الطبيعي ، لكننا لم نعثر عليها بعد".

لوضع استنتاجات الدراسة في منظورها الصحيح بالنسبة لمالكي الحيوانات الأليفة في جميع أنحاء العالم ، يشير شافنر إلى ما يسميه الخط الرئيسي في الورقة: "يجب أن يكون انتقال الأمراض حيوانية المصدر حدثًا نادرًا جدًا".

قال شافنر: "هناك احتمال بنسبة 100٪ أن يكون هناك انتقال واحد فقط". "هذا بيان قوي - انتقال واحد من مصدر حيواني إلى إنسان حدث على الأرجح في سوق رطب في الصين.

"لقد حدث مرة واحدة فقط ، وجميع الإصابات الأخرى التي حدثت في البشر جاءت من حالة انتقال واحدة."


تهدف دراسة جديدة إلى رفع مستوى ممارسات مراقبة COVID-19 بدون أعراض

شارع. بول ، مين. - يتعاون أعضاء هيئة التدريس في كلية الطب البيطري بجامعة مينيسوتا (CVM) مع الباحثين في كلية الصحة العامة (SPH) لبدء دراسة مراقبة COVID-19 بين السكان الذين لا تظهر عليهم أعراض. ستقارن الدراسة حدوث العدوى لدى الأفراد المشاركين في مراقبة COVID-19 بدون أعراض مع الأفراد الذين تم الإبلاغ عن إصابتهم بمرض COVID-19 ، مع التحقيق أيضًا في أداء وكفاءة نظام المراقبة الذي يستخدم الاختبار المجمع بدلاً من الاختبار الفردي.

"قدرت مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) أن 40-50 بالمائة من الأفراد المصابين بفيروس COVID-19 مصابون بعدوى بدون أعراض ، وبدون إجراء اختبار ، فمن المرجح أن يلعب هؤلاء الأفراد دورًا رئيسيًا في انتشار المرض" ، كما يقول سكوت ويلز ، DVM ، دكتوراه ، أستاذ في قسم طب السكان البيطري (VPM) التابع لـ CVM ، والذي يقود الدراسة. "نتوقع أن الاستخدام مرتين في الأسبوع للاختبار المجمع منخفض التكلفة نسبيًا سيحدد هؤلاء الأفراد المصابين ، مما سيسمح لهم بالعزل الذاتي وتقليل خطر انتشار العدوى." اكتسبت Wells عقودًا من الخبرة في استخدام علم الأوبئة لإجراء تدابير المراقبة والوقاية والسيطرة على الأمراض المعدية في الماشية وغيرها من أماكن زراعة الحيوانات الغذائية.

يجب أن تساعد نتائج هذه الدراسة في توضيح متى يجب استخدام اختبار العينة المجمعة على اختبار العينة الفردية. كما سيساعد في تعزيز الفهم العلمي لمخاطر انتقال المرض من حاملي COVID-19 المعدية بدون أعراض. سيختبر مختبر الجينوم بجامعة مينيسوتا مجموعات من خمس عينات ويتوقع تحويل النتائج في غضون 24 ساعة. إذا حصلت مجموعة عينات على نتيجة إيجابية ، فسيتم اختبار الأفراد الذين استخدمت عيناتهم في البركة لتحديد الشخص المصاب.

ستعتمد الدراسة على متطوعين في مجتمع CVM. يشمل المشاركون المؤهلون طلاب الطب البيطري في السنة الرابعة ، بالإضافة إلى الفنيين البيطريين وأعضاء هيئة التدريس والمقيمين وطلاب الدراسات العليا والمتدربين الذين يوجهون هؤلاء الطلاب في الدورات السريرية. سيتم اختبار المشاركين مرتين أسبوعيا لـ SARS-CoV-2 لمدة 13 أسبوعًا متتاليًا. "يصبح هذا المشروع بمثابة تمرين" لحظة قابلة للتعليم "في الحياة الواقعية يمكن للطلاب من خلاله اكتساب فهم شخصي لهذه الأدوات والمفاهيم نفسها التي نستخدمها في الطب البيطري - مراقبة الأمراض وإمكانيات الاختبار والقيود - جميع العناصر التي سيستخدمونها في الممارسة . " يقول جيري توريسون ، DVM ، دكتوراه ، DACVPM ، مدير مختبر مينيسوتا للتشخيص البيطري (VDL). "بالطبع ، الجزء الواقعي للمساعدة في الحفاظ على أمان مجتمعنا هو أمر بالغ الأهمية."

يجمع هذا المشروع خبراء في التشخيص في VDL ومركز UMN لعلم الجينوم ، وفي علم الأوبئة ونمذجة الأمراض في CVM ، وفي الصحة العامة من برنامج الإقامة CVM للصحة العامة البيطرية والطب الوقائي وكلية الصحة العامة. يقول ويلز: "نحن متحمسون لأن نكون قادرين على استخدام خبراتنا وخبراتنا الجماعية لحماية صحة طلابنا والمدربين البيطريين في CVM ، ودعم التدريب الآمن لطلاب الطب البيطري أثناء هذا الوباء".

يقول Kim VanderWaal ، دكتوراه ، أستاذ مساعد في VPM: "هذه الدراسة هي مثال رئيسي على كيف يمكن للنماذج الرياضية لانتشار المرض أن توجه المراقبة". يتمتع Vanderwaal ، الذي يتم تمويل منصبه جزئيًا من قبل برنامج نقل تكنولوجيا البحوث والتعليم والإرشاد الزراعي التابع للهيئة التشريعية لولاية مينيسوتا ، بخبرة واسعة في دمج البيانات الوبائية المتنوعة والمعقدة لفهم وتوقع انتشار العوامل الممرضة بشكل أفضل داخل أنظمة الإنتاج الزراعي الكبيرة. "نموذجنا لانتقال COVID بدون أعراض في إعدادات مكان العمل يحدد مدى أهمية الاختبار المتكرر مع زيادة الحالات في مقاطعتنا."

تعتبر الدورات السريرية جزءًا حيويًا من التعليم البيطري والتمريض وطب الأسنان والتعليم الطبي ، وقد جعل الوباء التدريب السريري الشخصي أمرًا صعبًا بشكل متزايد. عملت CVM بجد لضمان أن الطلاب في السنة الرابعة من برنامج DVM يحتفظون بأمان بالوصول إلى هذا التدريب السريري. يمكن للمعلومات المستقاة من هذه الدراسة أن تساعد البرامج المهنية الصحية الأخرى في جميع أنحاء البلاد على التنقل بأمان في المياه المجهولة لهذا الوباء العالمي.

سيقوم المشاركون في الدراسة المتطوعون ببساطة بمسح من الداخل من أنفهم وإعادة اختبارهم إلى مواقع التجميع عبر الحرم الجامعي U of M مرتين في الأسبوع طوال مدة الدراسة. يعمل محققو الدراسة أيضًا على إضافة مواقع إضافية لجمع الاختبارات في مواقع التدريب الإضافية التابعة لـ CVM مثل مرفق الألبان الجديد في السويد وعيادة ويست مترو للخيول. ستتم مشاركة نتائج الاختبار من هذه الدراسة مع وزارة الصحة في مينيسوتا لأغراض تتبع جهات الاتصال لحماية الصحة العامة.

تم تمويل هذه الدراسة من قبل مكتب نائب عميد البحث بكلية الطب بجامعة مينيسوتا. بالإضافة إلى Wells و Torrison و Vanderwal ، يضم فريق CVM و SPH Michael Mahero و DVM و PhD Tim Goldsmith و DVM Sandra Godden و DVM Maxim Cheeran و MVSc و PhD Scott Madill و DVcs و DACT Perle Zhitnitsky و DVM و MSpVM جيف بندر ، DVM ، MS وكريغ هيدبرج ، دكتوراه.

بدأ فريق الدراسة التوظيف الآن. إذا كنت مؤهلاً ومهتمًا ، فاتصل بـ Jan Mladonicky على [email & # 160protected].

اتصال وسائل الإعلام
سكوت ويلز - [البريد الإلكتروني & # 160 المحمي]


قد يتم تحديد احتمالية الإصابة بفيروس COVID الشديد و "الطويل" في وقت مبكر جدًا بعد الإصابة

تظهر جزيئات فيروس SARS-CoV-2 الخارجة من سطح الخلايا المزروعة في المختبر الائتمان: معرض صور المعاهد الوطنية للصحة

يوفر بحث جديد رؤى مهمة حول الدور الذي يلعبه الجهاز المناعي في منع أعراض COVID-19 لدى المرضى وزيادة شدتها في بعض الحالات. كما أنه يجد أدلة على سبب تعرض بعض الأشخاص لـ "COVID طويل".

من بين النتائج الرئيسية ، التي لم تخضع بعد لمراجعة الأقران ، ما يلي:

  • الأفراد الذين يعانون من مرض خفيف أو بدون أعراض يظهرون استجابة مناعية قوية في وقت مبكر أثناء الإصابة.
  • يعاني المرضى الذين يحتاجون إلى دخول المستشفى من ضعف الاستجابات المناعية والالتهابات الجهازية (أي الالتهاب المزمن الذي قد يؤثر على العديد من الأعضاء) من وقت ظهور الأعراض.
  • قد يسهم التشوهات المستمرة في الخلايا المناعية والتغير في الاستجابة الالتهابية للجسم في "COVID الطويل".

الاستجابة المناعية المرتبطة بـ COVID-19 معقدة. معظم الأشخاص الذين يصابون بفيروس SARS-CoV-2 يستجيبون بنجاح لمضادات الفيروسات ، مما يؤدي إلى ظهور أعراض قليلة إن وجدت. ومع ذلك ، ففي عدد قليل من المرضى ، هناك دليل على أن الجهاز المناعي يتفاعل بشكل مفرط ، مما يؤدي إلى تدفق الخلايا المناعية (عاصفة خلوية) وإلى التهاب مزمن وتلف أعضاء متعددة ، مما يؤدي غالبًا إلى الوفاة.

لفهم العلاقة بين الاستجابة المناعية وأعراض COVID-19 بشكل أفضل ، قام العلماء في جامعة كامبريدج ومستشفى أدينبروك ، صندوق مؤسسة NHS لمستشفيات جامعة كامبريدج ، بتجنيد الأفراد الذين ثبتت إصابتهم بفيروس SARS-CoV-2 إلى COVID-19 مجموعة من الموارد الحيوية للمؤسسة الوطنية لحقوق الإنسان. يتراوح هؤلاء الأفراد من العاملين في الرعاية الصحية بدون أعراض الذين تم الكشف عن الفيروس لديهم في الفحص الروتيني ، وحتى المرضى الذين يحتاجون إلى مساعدة التنفس الصناعي. يأخذ الفريق عينات دم من المرضى على مدى عدة أشهر ، بالإضافة إلى متابعة قياس أعراضهم.

في بحث نُشر اليوم ، حلل الفريق عينات مأخوذة من 207 مريضًا مصابًا بفيروس كوفيد -19 يعانون من مجموعة من شدة المرض التي تم أخذها في مقابلات منتظمة على مدى ثلاثة أشهر بعد ظهور الأعراض. قارنوا العينات مع تلك المأخوذة من 45 عنصر تحكم سليم.

بسبب الحاجة الملحة لمشاركة المعلومات المتعلقة بالوباء ، نشر الباحثون تقريرهم على MedRXiv. لم يتم حتى الآن استعراض الأقران.

قال البروفيسور كين سميث ، المؤلف المشارك الأول ومدير معهد كامبريدج للمناعة العلاجية والأمراض المعدية (CITIID): "لقد سمحت لنا NIHR BioResource بمعالجة سؤالين مهمين بخصوص SARS-CoV-2.أولاً ، كيف تقارن الاستجابة المناعية المبكرة جدًا للمرضى الذين تعافوا من المرض مع أعراض قليلة أو معدومة ، مع أولئك الذين عانوا من مرض حاد؟ وثانيًا ، بالنسبة لأولئك المرضى الذين يعانون من مرض حاد ، ما مدى سرعة تعافي جهاز المناعة لديهم وكيف يمكن أن يرتبط هذا بـ "COVID الطويل"؟ "

وجد الفريق دليلاً على وجود استجابة مناعية تكيفية مبكرة وقوية لدى الأفراد المصابين الذين كان مرضهم بدون أعراض أو أعراض خفيفة. الاستجابة المناعية التكيفية هي المكان الذي يحدد فيه الجهاز المناعي العدوى ثم ينتج الخلايا التائية والخلايا البائية والأجسام المضادة الخاصة بالفيروس لمكافحتها. أنتج هؤلاء الأفراد المكونات المناعية بأعداد أكبر من المرضى الذين يعانون من COVID-19 الأكثر شدة ، وخلال الأسبوع الأول من الإصابة - وبعد ذلك عادت هذه الأرقام بسرعة إلى طبيعتها. لم يكن هناك دليل لدى هؤلاء الأفراد على وجود التهاب جهازي يمكن أن يؤدي إلى تلف أعضاء متعددة.

في المرضى الذين يحتاجون إلى دخول المستشفى ، تأخرت الاستجابة المناعية التكيفية المبكرة ، وظهرت تشوهات عميقة في عدد من مجموعات الخلايا البيضاء الفرعية. كما ظهر أيضًا في عينة الدم الأولى المأخوذة من هؤلاء المرضى دليلاً على زيادة الالتهاب ، وهو أمر لم يُلاحظ في أولئك الذين يعانون من مرض خفيف أو بدون أعراض. يشير هذا إلى وجود مكون التهابي غير طبيعي للاستجابة المناعية حتى في وقت قريب من التشخيص لدى الأفراد الذين يتطورون إلى مرض شديد.

وجد الفريق أن الإشارات الجزيئية الرئيسية التي تم إنتاجها استجابةً للالتهاب كانت موجودة في المرضى الذين تم إدخالهم إلى المستشفى. يقولون إن هذه التوقيعات يمكن أن تستخدم للتنبؤ بخطورة مرض المريض ، وكذلك الارتباط بخطر الوفاة المرتبطة بـ COVID-19.

قال الدكتور بول ليونز ، كبير المؤلفين المشاركين ، من CITIID أيضًا: "تشير أدلةنا إلى أن الرحلة إلى COVID-19 الشديدة قد يتم تحديدها مباشرة بعد الإصابة ، أو على أبعد تقدير في الوقت الذي تبدأ فيه الأعراض في الظهور. هذا يمكن أن يكون لهذا الاكتشاف تداعيات كبيرة على كيفية إدارة المرض ، حيث يشير إلى أننا بحاجة إلى بدء العلاج لإيقاف الجهاز المناعي عن التسبب في الضرر في وقت مبكر جدًا ، وربما حتى بشكل استباقي في المجموعات المعرضة لخطر كبير والتي يتم فحصها وتشخيصها قبل ظهور الأعراض. . "

لم يجد الباحثون أي دليل على وجود علاقة بين الحمل الفيروسي وتطور المرض الالتهابي. ومع ذلك ، بمجرد تحديد المرض الالتهابي ، ارتبط الحمل الفيروسي بالنتيجة اللاحقة.

توفر الدراسة أيضًا أدلة على الحالات البيولوجية الكامنة وراء `` COVID الطويل '' - حيث أبلغ المرضى عن أعراض المرض ، بما في ذلك التعب ، لعدة أشهر بعد الإصابة ، حتى عندما لم يعد اختبارهم إيجابيًا لـ SARS-CoV-2.

وجد الفريق أن التغيرات العميقة في العديد من أنواع الخلايا المناعية غالبًا ما تستمر لأسابيع أو حتى أشهر بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2 ، وقد حلت هذه المشاكل نفسها بشكل مختلف تمامًا اعتمادًا على نوع الخلية المناعية. يتعافى البعض عندما يتحلل الالتهاب الجهازي نفسه ، بينما يتعافى البعض الآخر حتى في مواجهة الالتهاب الجهازي المستمر. ومع ذلك ، تظل بعض مجموعات الخلايا غير طبيعية بشكل ملحوظ ، أو تظهر تعافيًا محدودًا فقط ، حتى بعد حل الالتهاب الجهازي وخروج المرضى من المستشفى.

قالت الدكتورة لورا بيرجامشي ، مؤلفة الدراسة الأولى: "إن مجموعات الخلايا المناعية هذه هي التي لا تزال تظهر تشوهات حتى عندما يبدو أن كل شيء آخر قد حل بنفسه ، وهو ما قد يكون ذا أهمية في COVID الطويل. بالنسبة لبعض أنواع الخلايا ، قد يكون ذلك إنها بطيئة في التجدد ، ولكن بالنسبة للآخرين ، بما في ذلك بعض أنواع الخلايا التائية والخلايا البائية ، يبدو أن شيئًا ما يستمر في دفع نشاطهم. وكلما فهمنا هذا الأمر ، زادت احتمالية قدرتنا على علاج المرضى الذين يعانون من حياتهم بشكل أفضل لا تزال تعاني من آثار ما بعد COVID-19 ".

قال البروفيسور جون برادلي ، كبير الباحثين في NIHR BioResource: "إن NIHR BioResource هو مورد فريد أصبح ممكنًا بفضل الروابط القوية الموجودة في المملكة المتحدة بين الأطباء والعلماء في NHS وفي جامعاتنا. إنه بسبب التعاون مثل هذا ما تعلمناه كثيرًا في مثل هذا الوقت القصير عن SARS-CoV-2 ".


نتائج

الخصائص الديموغرافية

في 6 فبراير 2020 ، قامت اللجنة الوطنية للصحة في الصين بتحديث خطة الوقاية والسيطرة على COVID-19 (الإصدار الرابع) لإدارة الاتصالات الوثيقة ، والتأكيد على تحديد الأشخاص الذين لا تظهر عليهم أعراض وحجرهم الصحي 1. لتحديد الأفراد الذين لا يعانون من أعراض ، أجرت مراكز Wanzhou District لمكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) فحصًا مكثفًا لـ RT-PCR لـ 2088 من المخالطين القريبين تحت الحجر الصحي. تم بعد ذلك فحص الأفراد الذين لديهم نتائج إيجابية لـ RT-PCR من خلال استطلاعات انتشار النقطة التي أجراها مركز السيطرة على الأمراض المحلي وتقييم الأعراض التي أبلغ عنها الأطباء. من بين هؤلاء ، لم يدعي 60 فردًا عدم ظهور أعراض في الأربعة عشر يومًا السابقة ، وفقًا لسجلات مركز السيطرة على الأمراض المحلية ، وتم نقلهم إلى مستشفى حكومي مخصص للعزل المركزي. عند القبول ، تم استبعاد 17 فردًا بسبب الأعراض الخفيفة أو غير النمطية بناءً على تقييمات الأعراض التي أبلغ عنها الأطباء ، وقد تم أيضًا استبعاد ستة أفراد ظهرت عليهم الأعراض بعد 4-17 يومًا من القبول. أخيرًا ، تم تضمين 37 حالة بدون أعراض ، تم تعريفها على أنها أفراد لديهم نتيجة اختبار الحمض النووي إيجابية ولكن دون أي أعراض سريرية ذات صلة في 14 يومًا السابقة وأثناء الاستشفاء ، في هذه الدراسة. تم تحديد ما مجموعه 178 مريضًا يعانون من إصابات مؤكدة بفيروس SARS-CoV-2 في منطقة Wanzhou قبل 10 أبريل 2020 ، وفقًا لأنظمة مراقبة CDC. في هذه الدراسة كانت نسبة المرضى المصابين بعدوى بدون أعراض 20.8٪ (37/178).

لاكتشاف الأجسام المضادة وقياسات السيتوكينات ، تم اختيار 37 مريضًا مصابًا بأعراض خفيفة متطابقة مع الجنس والعمر والتردد والاعتلال المشترك للمقارنة مع الأفراد الذين لا يعانون من أعراض (الجدول التكميلي 1). تم أيضًا اختيار سبعة وثلاثين فردًا من أفراد التحكم المتطابقين مع الجنس والعمر من منطقة Wanzhou مع نتائج RT-PCR سلبية لـ SARS-CoV-2 لمقارنة السيتوكينات.

من بين 37 فردًا بدون أعراض ، كان متوسط ​​العمر 41 عامًا (المدى ، 8-75 عامًا) وكان 22 من الإناث. كان لدى ثمانية وعشرين شخصًا تاريخ مؤكد للاتصال بمريض مؤكد من RT-PCR مصاب بـ COVID-19 ، وكان تسعة منهم من سكان ووهان أو كان لديهم تاريخ سفر إلى ووهان قبل ظهور العدوى (الجدول التكميلي 2).

النتائج الإشعاعية والمخبرية

تم قياس تعداد الدم الكامل ، والكيمياء الحيوية للدم ، ووظيفة التخثر ، ووظائف الكبد والكلى ، والمؤشرات الحيوية للعدوى عند القبول (الجدول التكميلي 2) لمراقبة تطور المرض المحتمل ، وفقًا لإرشادات علاج COVID-19 (الإصدار الخامس) من الصحة الوطنية مفوضية الصين 7. من بين 37 شخصًا بدون أعراض ، كان ثلاثة منهم يعانون من قلة اللمفاوية وواحد يعاني من نقص الصفيحات. ستة أفراد لديهم مستويات مرتفعة من ألانين أمينوترانسفيراز ، و 11 لديهم مستويات بروتين سي التفاعلي.

عند القبول ، أظهرت فحوصات التصوير المقطعي المحوسب (CT) للصدر عتامة بؤرية للزجاج الأرضي في 11 فردًا بدون أعراض (11/37 ، 29.7٪) وظلال شريطية و / أو دمج منتشر في عشرة أفراد (10/37 ، 27.0٪) ، في حين 16 الأفراد (16/37 ، 43.2٪) ليس لديهم تشوهات (الشكل 1). طور خمسة أفراد عتامات زجاجية أرضية بؤرية أو ظلال شريطية على الصدر بالأشعة المقطعية خلال 5 أيام من دخول المستشفى. لم يكن هناك انصباب الجنبي ، علامات القصبات الهوائية أو تضخم الغدد الليمفاوية ، والتي كانت تغيرات نموذجية في المرضى الذين يعانون من أعراض خطيرة 8،9،10. تم تحديد النتائج الإشعاعية غير الطبيعية المحصورة في رئة واحدة في 66.7٪ (14/21) من الأفراد الذين لا يعانون من أعراض ، في حين أن 33.3٪ (7/21) لديهم تشوهات في كلا الرئتين.

أ، فحص بالأشعة المقطعية لامرأة تبلغ من العمر 45 عامًا تظهر عتامة زجاجية أرضية بؤرية في الفص السفلي من الرئة اليسرى (السهم). ب، فحص بالأشعة المقطعية لإمرأة تبلغ من العمر 50 عامًا تظهر عتامات زجاجية وخطوط تتعايش في الفص السفلي من الرئة اليمنى (الأسهم).

النتائج الفيروسية

قارنا قيم عتبة دورة RT-PCR (Ct) لأول مسحات من البلعوم الأنفي إيجابية لجميع الأفراد الـ 37 الذين لا يعانون من أعراض و 37 مريضًا يعانون من الأعراض. بدت قيم Ct الأولية لـ 37 فردًا بدون أعراض و 37 مريضًا يعانون من أعراض متشابهة (ORF1b 32.8 (معدل الذكاء ، 30.9-35.8) مقابل 31.7 (معدل الذكاء ، 30.3-35.1) ، ص = 0.336 ن 32.6 (معدل الذكاء ، 29.5-34.6) مقابل 33.5 (معدل الذكاء ، 31.3-37.2) ، ص = 0.126) (الشكل 2 أ). كان متوسط ​​مدة تساقط الفيروس ، والذي تم تعريفه على أنه الفترة من أول إلى آخر مسحة بلعومية إيجابية ، في الأفراد بدون أعراض 19 يومًا (معدل الذكاء ، 15-26 يومًا). كانت أقصر مدة تم ملاحظتها لتساقط الفيروس 6 أيام ، بينما كانت الأطول 45 يومًا. كان متوسط ​​مدة تساقط الفيروس 14 يومًا (معدل الذكاء ، 9-22 يوم) في المرضى الذين يعانون من أعراض خفيفة. كان لدى المجموعة عديمة الأعراض مدة أطول بكثير في التخلص من الفيروس من المجموعة التي ظهرت عليها الأعراض (رتبة لوغاريتمية ص = 0.028) (الشكل 2 ب). ومع ذلك ، فإن التخلص من الفيروس القابل للقياس لا يعادل العدوى الفيروسية ، وهناك حاجة إلى مزيد من التقييم لتحديد الحمل الفيروسي لـ SARS-CoV-2 التنفسي المرتبط بالفيروس القابل للاستزراع 11.

أ، قيم Ct لـ ORF1b و ن تم الحصول عليها باستخدام RT-PCR التي تم اكتشافها في مسحات البلعوم الأنفي من بدون أعراض (ن = 37) وأعراض (ن = 37) مجموعة. تُظهر المخططات الصندوقية المتوسطات (الخط الأوسط) والربيعين الأول والثالث (المربعات) ، بينما تُظهر الشعيرات 1.5 × معدل الذكاء أعلى وأسفل المربع. اختبار Mann – Whitney U على وجهين ص يتم تصوير القيم في المؤامرات ، والأهمية ص تم تحديد قطع القيمة عند 0.05. ب، تم استخدام طريقة كابلان-ماير لتقدير المعدل الإيجابي للحمض النووي الريبي الفيروسي ، وتم تطبيق اختبار اللوغاريتمات على الوجهين لتقييم الاختلاف المعنوي في مدة تساقط الفيروس في المجموعات المصحوبة بالأعراض وغير المصحوبة بأعراض.

IgG و IgM الخاصين بالفيروس في الأفراد بدون أعراض

للتحقيق في استجابة الجسم المضاد الحادة لعدوى SARS-CoV-2 ، تم قياس IgG و IgM الخاصين بالفيروس في عينات مصل من الأفراد الذين لا يعانون من أعراض أو أعراض. في المجموعة غير المصحوبة بأعراض ، كان اختبار 81.1٪ (30/37) إيجابيًا لـ IgG ، و 83.8٪ (31/37) من المجموعة المصحوبة بأعراض كانت نتيجة اختبار IgG إيجابية بعد 3-4 أسابيع تقريبًا من التعرض. علاوة على ذلك ، كان 62.2٪ (23/37) من المجموعة بدون أعراض موجبة لـ IgM ، بينما 78.4٪ (29/37) من مجموعة الأعراض كانت موجبة IgM. ومن المثير للاهتمام ، أن مستويات IgG في مجموعة الأعراض (متوسط ​​S / CO ، 20.5 IQR ، 5.8-38.2) كانت أعلى بكثير من تلك الموجودة في المجموعة بدون أعراض (متوسط ​​S / CO ، 3.4 IQR ، 1.6-10.7) في المرحلة الحادة (الفترة عندما يمكن العثور على الحمض النووي الريبي الفيروسي في عينة الجهاز التنفسي) (ص = 0.005) (الشكل 3 أ).

أ، مقارنة مستويات الأجسام المضادة الخاصة بالفيروس في المرضى الذين لا يعانون من أعراض (ن = 37) ومرضى الأعراض (ن = 37) المصابين بالتهابات حادة. ب، مستويات IgG في المرضى الذين يعانون من COVID-19 في مرحلة النقاهة والذين خرجوا من المستشفى. ج، التغيرات الديناميكية في مستويات IgG الخاصة بالفيروس في المراحل الحادة والنقاهة. د، التغيرات الديناميكية في تحييد الأجسام المضادة في المصل في مرحلتي النقاهة والحادة. يتم التعبير عن النتائج كمتوسط ​​تجربتين مستقلتين. ه، نسب إيجابية IgG للمرضى المصابين بـ COVID-19 في مرحلتي النقاهة والحادة. المربع مؤامرات في أ و ب عرض المتوسطات (الخط الأوسط) والربيعين الأول والثالث (مربعات) ، وتظهر الشعيرات 1.5 × معدل الذكاء أعلى وأسفل المربع. اختبار Mann – Whitney U على وجهين ص القيم التي تم تصويرها في المؤامرات ، والأهمية ص تم تحديد قطع القيمة عند 0.05.

تابعنا أيضًا 37 شخصًا بدون أعراض و 37 مريضًا يعانون من الأعراض في مرحلة النقاهة المبكرة (بعد 8 أسابيع من خروجهم من المستشفى). كانت مستويات IgG في مجموعة الأعراض لا تزال أعلى بكثير من تلك الموجودة في المجموعة بدون أعراض في مرحلة النقاهة المبكرة (ص = 0.002) (الشكل 3 ب). والمثير للدهشة أن مستويات IgG في 93.3٪ (28/30) من المجموعة التي لم تظهر عليها أعراض و 96.8٪ (30/31) من مجموعة الأعراض انخفضت خلال مرحلة النقاهة المبكرة (الشكل 3 ج). كان متوسط ​​النسبة المئوية للانخفاض 71.1٪ (المدى ، 32.8-88.8٪) لمستويات IgG في المجموعة بدون أعراض ، في حين أن متوسط ​​النسبة المئوية للانخفاض كان 76.2٪ (المدى ، 10.9-96.2٪) في مجموعة الأعراض. باستخدام مقايسة التعادل المعتمد على الفيروس الكاذب (الطرق) ، لاحظنا أيضًا انخفاضًا في تحييد مستويات الأجسام المضادة في المصل في 81.1٪ (30/37) من المجموعة التي لا تظهر عليها أعراض وفي 62.2٪ (23/37) من مجموعة الأعراض. كانت النسبة المئوية المتوسطة للنقص 8.3٪ (المدى 0.5 - 22.8٪) من أجل تحييد الأجسام المضادة في المصل في المجموعة التي لا تظهر عليها أعراض ، في حين كانت النسبة المئوية المتوسطة للانخفاض 11.7٪ (المدى ، 2.3-41.1٪) في مجموعة الأعراض (الشكل 3 دي). ). علاوة على ذلك ، فإن 40.0٪ (12/30) من الأفراد الذين لا يعانون من أعراض ، ولكن فقط 12.9٪ (4/31) من الأفراد الذين يعانون من أعراض ، أصبحوا سلبيين لـ IgG (الشكل 3 هـ).

السيتوكينات في الأفراد بدون أعراض

لتوضيح الاستجابات المناعية المرتبطة بعدوى SARS-CoV-2 ، تمت مقارنة مستويات السيتوكينات المصلية والكيموكينات بين المجموعات بدون أعراض ومجموعات الأعراض. لوحظ ارتفاع تركيزات 18 السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات في مجموعة الأعراض بالمقارنة مع مجموعة الأعراض. من بين هؤلاء ، يجند يحفز موت الخلايا المبرمج المرتبط بعامل نخر الورم (TRAIL) (ص = 3.39 × 10 14) ، عامل تحفيز مستعمرة الضامة (M-CSF) (ص = 5.08 × 10 −13) ، الجين الورمي المنظم النمو α (GRO-α) (ص = 1.5 × 10 −10) ، عامل تحفيز مستعمرة المحببات (G-CSF) (ص = 2.05 × 10 −9) وانترلوكين 6 (IL-6) (ص = 6.33 × 10 −9) أهم التغييرات (الشكل 4 والبيانات الموسعة الشكل 1). علاوة على ذلك ، تم تحليل السيتوكينات بشكل أكبر في المجموعة بدون أعراض والضوابط الصحية البالغ عددها 37. كانت مستويات البلازما لـ 32 سيتوكينات متشابهة بين الأشخاص الأصحاء والأفراد بدون أعراض. مستويات أعلى بشكل ملحوظ من عامل الخلايا الجذعية (SCF) (ص = 1.48 × 10 −9) ، IL-13 (ص = 3.75 × 10 −7) ، IL-12 ص 40 (ص = 7.08 × 10 6) والعامل المثبط لسرطان الدم (LIF) (ص = 1.33 × 10 −3) في المجموعة بدون أعراض (البيانات الموسعة الشكل 2). بشكل جماعي ، تُظهر بياناتنا أن الأفراد الذين لا يعانون من أعراض لديهم استجابة التهابية منخفضة تتميز بتركيزات منخفضة في الدورة الدموية من السيتوكينات والكيموكينات.

عينات من بدون أعراض (ن = 37) وأعراض (ن = 37) مريضًا مصابًا بـ COVID-19 تم جمعهم في المرحلة الحادة أثناء الاستشفاء ، وأجريت فحوصات لقياس تركيزات 48 السيتوكينات والكيماويات. تُظهر المخططات الصندوقية المتوسطات (الخط الأوسط) والربيعين الأول والثالث (المربعات) ، وتظهر الشعيرات 1.5 × معدل الذكاء أعلى وأسفل الصندوق. اختبار Mann – Whitney U على وجهين ص القيم التي تم تصويرها في المؤامرات ، والأهمية ص تم تحديد قطع القيمة عند 0.001.


إعتراف

يتم تمويل مبادرة خطة الطوارئ الخاصة بالحيوانات الأليفة من قبل برنامج القدرة على مواجهة الكوارث الطبيعية ، وقد تم تطويرها من قبل RSPCA جنوب أستراليا بالشراكة مع الكومنولث وحكومة ولاية جنوب أستراليا.

إذا كنت تواجه تحديات في رعاية حيواناتك ، فيرجى الاتصال بـ RSPCA المحلي لديك لمناقشة الخيارات التي نحن هنا لتقديم الدعم والمساعدة إذا كان ذلك ممكنًا.

يرجى ملاحظة أن هناك العديد من الأشياء غير المعروفة حاليًا حول هذا الفيروس والمخاطر التي يمثلها على الحيوانات الأليفة ومن الحيوانات الأليفة إلى البشر. تم إعداد هذه المعلومات بأفضل وأحدث المعلومات المتاحة في ذلك الوقت ولكن الأمور تتغير بسرعة مع تطور الوضع. يتم تحديث معلوماتنا في كثير من الأحيان قدر الإمكان.


المواد والطرق التكميلية

الأفواج السريرية

مجموعة خزعة الأمعاء

شمل المشاركون مرضى في المستشفى في MSH وكذلك أولئك الذين شوهدوا في العيادات الخارجية GI ممارسات الذين خضعوا للتنظير الداخلي بين 17 أبريل 2020 و 2 يونيو 2020. تم تحديد مرضى COVID-19 والأفراد الضابطين على أساس السارس الأنفي البلعومي SARS-CoV- 2 اختبار مسحة PCR. تضمنت معايير التضمين (1) نتيجة إيجابية لاختبار NP SARS-CoV-2 PCR ، والأعراض السريرية ذات الصلة ، والأدلة المصلية للأجسام المضادة & # x02013SARS-CoV-2 (لمرضى الحالات) واختبار NP SARS-CoV-2 السلبي و غياب الحمى والسعال وضيق التنفس وتاريخ الاتصال ذي الصلة (للأفراد الضابطين) (2) المؤشرات السريرية لإجراء التنظير الداخلي و (3) قدرة المريض و / أو وكيل الرعاية الصحية الخاص به على تقديم الموافقة المستنيرة. تضمنت معايير الاستبعاد (1) الحالات المرضية المشتركة بما في ذلك تجلط الدم الشديد ، (2) ما يصاحب ذلك من استخدام مضاد للتخثر ، (3) مرض خطير وأي معلمة سريرية أخرى يمكن أن تزيد من خطر خزعات بحثية إضافية و (4) الفشل في الحصول على الموافقة. تم تحديد شدة COVID-19 بناءً على نظام التسجيل الداخلي الذي طوره قسم الأمراض المعدية في MSH. تم تطوير نظام التسجيل هذا وفقًا لمنظمة الصحة العالمية & # x000a0 مقياس التقدم / التحسين السريري العادي (https://www.who.int/publications/i/item/covid-19-therapeutic-trial-synopsis) وبناءً على حالة الأوكسجين وتلف الأعضاء ، مع التعريفات التالية:

  • & # x02022 خفيف: SpO2 & # x0003e94٪ على هواء الغرفة وعدم وجود التهاب رئوي في التصوير
  • & # x02022 متوسط: SpO2 & # x0003c94٪ على هواء الغرفة أو الالتهاب الرئوي في التصوير
  • & # x02022 شديد: قنية أنفية عالية التدفق ، وقناع غير قابل لإعادة التنفس ، وضغط مجرى الهواء الإيجابي ثنائي المستوى (تهوية مجرى الهواء الإيجابية غير الغازية) ، أو التهوية الميكانيكية وبدون أدوية الضغط وتصفية الكرياتينين بمقدار & # x0003e30 مل / دقيقة وناقل أمين ألانين لـ & # x0003c5 أضعاف الحد الأعلى للعادي
  • & # x02022 شديد مع وجود دليل على التخلص من الذخائر المتفجرة: قناة أنفية عالية التدفق ، أو قناع غير قابل لإعادة التنفس ، أو ضغط مجرى هوائي إيجابي ثنائي المستوى (تهوية إيجابية لمجرى الهواء) ، أو تهوية ميكانيكية وأدوية ضاغطة أو تصفية الكرياتينين بمقدار & # x0003c30 مل / دقيقة أو علاج استبدال كلوي جديد أو ألانين aminotransferase من & # x0003e5 مرات الحد الأعلى الطبيعي (الجدول التكميلي & # x000a03).

مجموعة الاكتشاف

تم تجنيد المرضى الذين تم قبولهم في MSH بين 1 أبريل 2020 و 15 أبريل 2020 في مجموعة الاكتشاف إذا كانوا مصابين بـ SARS-CoV-2 PCR ، وإذا كانوا أكبر من 18 عامًا ، وإذا كانت لوحة ELLA من السيتوكينات (IL6 و IL8 و IL1 & # x003b2 و TNF - & # x003b1) كجزء من الرعاية السريرية. تم استخراج التفاصيل السريرية من المرضى المؤهلين من مستودع بيانات Mount Sinai بموجب بروتوكول معتمد من IRB (سجل IRB-20-03297A في أمريكا الشمالية للمظاهر الهضمية لـ COVID-19).تضمنت معايير التضمين (1) نتيجة إيجابية لاختبار NP SARS-CoV-2 PCR داخل نظام Mount Sinai الصحي بين 1 و 15 أبريل 2020 ، والقبول في MSH (2) بعمر & # x0003e18 عامًا و (3) مرضى لديهم لوحة خلوية ELLA يتم إجراؤها أثناء الاستشفاء. تضمنت معايير الاستبعاد (1) الاختبار في موقع خارج MSH في بيئة متنقلة أو أولئك الذين تم اختبارهم في قسم الطوارئ ولكن لم يتم قبولهم (2) عمر & # x0003c18 عامًا و (3) مرضى بدون لوحة خلوية ELLA.

تم تضمين ما مجموعه 634 مشاركًا في مجموعة الاكتشاف (الشكل التكميلي & # x000a011). بالإضافة إلى المعلومات الديموغرافية (بما في ذلك العرق والعرق والعمر والجنس) ، تم استخراج الخصائص السريرية والبيانات المختبرية وبيانات النتائج من المخططات الطبية. تضمنت المتغيرات المشتركة التي تمت دراستها مؤشر كتلة الجسم (تم تعريف السمنة على أنها مؤشر كتلة الجسم & # x0003e30 كجم / م 2) والحالات المرضية المصاحبة بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم والسكري وأمراض الرئة المزمنة (بما في ذلك الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن [COPD]) وأمراض القلب (بما في ذلك الشريان التاجي والرجفان الأذيني وفشل القلب) وأمراض الكلى المزمنة والسرطان وفيروس نقص المناعة البشرية ومرض التهاب الأمعاء.

تم تعريف أعراض الجهاز الهضمي على أنها أكثر من نوبة واحدة من الإسهال والغثيان و / أو القيء في وقت القبول. إذا تم توثيق نوبة واحدة فقط من الإسهال والغثيان و / أو القيء على وجه التحديد ، فلا يُنظر إلى المرضى الذين يعانون من أعراض الجهاز الهضمي. بالإضافة إلى ذلك ، لم نأخذ في الاعتبار أعراض الجهاز الهضمي التي تطورت أثناء العلاج في المستشفى ، لأنها يمكن أن تعكس آثارًا متعلقة بالمستشفى أو متعلقة بالعلاج ، ولم نأخذ في الاعتبار سوى أعراض الجهاز الهضمي التي كانت موجودة وقت دخول المستشفى لتجنب تضمين الإرباك علاجي المنشأ ( العلاجات أو الأمراض المكتسبة من المستشفى التي يمكن أن تؤدي إلى الإسهال والغثيان والقيء).

اعتبرت شدة المرض (كما هو موصوف) والوفيات متغيرات النتائج. تم حساب الوفيات على أنها حالة المريض (ميتًا أو حيًا) بعد 25 يومًا من القبول. في حالة عدم توفر أي معلومات بعد الخروج من المستشفى ، تم فرض الرقابة على المرضى في وقت الخروج من المستشفى.

مجموعة التحقق الخارجية

تتألف هذه المجموعة من 287 مريضًا تم قبولهم في مركز رعاية من الدرجة الثالثة في ميلانو ، إيطاليا ، بين 22 فبراير 2020 و 30 مارس 2020 ، مع نتيجة إيجابية مؤكدة لـ SARS-CoV-2 PCR والذين لم يموتوا أو لم يتم نقلهم إلى تمت دراسة وحدة العناية المركزة في غضون 24 ساعة من القبول كما هو مفصل في Aghemo et & # x000a0al. 1 تم تسجيل وجود القيء والإسهال (يُعرف بأنه على الأقل 3 حركات أمعاء رخوة يوميًا) في أو قبل الدخول. تم تحليل النتائج باستخدام القبول في وحدة العناية المركزة أو الوفاة أو نقطة نهاية الدراسة المركبة لقبول وحدة العناية المركزة أو الوفاة في غضون 20 يومًا من الاستشفاء.

مجموعة التحقق الداخلية

مجموعة التحقق الداخلية هي مجموعة متميزة من المرضى الذين تم قبولهم في MSH بين 16 أبريل 2020 و 30 أبريل 2020 ، ويستخدمون لاختبار نموذج تنبؤي لشدة COVID-19 ووفياته. تم استخدام نفس معايير التضمين والاستبعاد كما في مجموعة الاكتشاف مع الاختلافات التالية: (1) نتيجة إيجابية لاختبار SARS-CoV-2 PCR بين 16 أبريل 2020 و 30 أبريل 2020 (2) واستبعاد إضافي للمرضى الذين تم تضمينهم بالفعل في مجموعة الاكتشاف. من إجمالي 408 مريضًا ، استوفى 242 معايير الاشتمال وبالتالي تم تضمينهم في مجموعة التحقق الداخلية. تم استخراج البيانات الديموغرافية والسريرية والمتعلقة بالنتائج من سجلات المرضى & # x02019 الطبية ، كما هو موضح لمجموعة الاكتشاف.

اختبار SARS-CoV-2

تم تشغيل SARS-CoV-2 PCR في مختبر علم الأحياء الدقيقة السريري كجزء من الرعاية الروتينية على منصة Roche cobas ، والتي تقوم بالتضخيم الانتقائي لهدفين ، جين ORF-1 (الهدف 1) والجين الإلكتروني لعموم ساربيكوفيروس (الهدف 2) (يكتشف السارس- CoV-2 وكذلك فيروسات الالتهاب التنفسي الحاد الوخيم أو فيروسات متلازمة الشرق الأوسط التنفسية ، ولكن ليس فيروسات كورونا الموسمية الروتينية). أشارت النتيجة الإيجابية إلى أنه تم اكتشاف كل من الهدف 1 والهدف 2 (غالبية الحالات) أو تم اكتشاف الهدف 1 وحده. تشير النتيجة الإيجابية المفترضة إلى نتيجة سلبية للهدف 1 ونتيجة إيجابية للهدف 2 ، والتي ، وفقًا للشركة المصنعة ، يمكن أن تكون نتيجة لما يلي: & # x0201c (1) عينة بتركيزات قريبة أو أقل من حد الكشف عن الاختبار ، (2) طفرة في المنطقة المستهدفة 1 المستهدفة في مواقع ربط oligo ، أو (3) عدوى ببعض الفيروسات الساربيك الأخرى (على سبيل المثال ، SARS-CoV أو بعض الفيروسات الساربيك الأخرى غير المعروفة سابقًا لإصابة البشر) ، أو (4) عوامل أخرى. & # x0201d تم تضمين المرضى الذين يعانون من SARS-CoV-2 PCR إيجابيًا في التحليل إذا تم علاجهم سريريًا على أنهم مصابون بـ COVID-19.

الفحص المجهري المناعي

تم إزالة شمع المقاطع (5 & # x003bcm) من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين في زيلين وإعادة ترطيبها في كحول متدرج ثم غسلها في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS). تم إجراء استرجاع الحاتمة المستحثة بالحرارة عن طريق احتضان الشرائح في قدر الضغط لمدة 15 دقيقة على أعلى مستوى في محلول الاسترجاع المستهدف (داكو ، S1699). بمجرد تبريد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة ، تم غسلها مرتين في برنامج تلفزيوني ثم تم نفاذها لمدة 30 دقيقة في 0.1٪ tritonX-100 في PBS. تم منع الارتباط غير النوعي باستخدام 10٪ من مصل الماعز لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة. تم تحضين المقاطع بعد ذلك في الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول منع طوال الليل عند 4 & # x000b0C. تم تلخيص الأجسام المضادة الأولية والثانوية في الجدول التكميلي & # x000a016. تم غسل الشرائح في 0.1 ٪ توين 20 بالإضافة إلى PBS ثلاث مرات ثم تم تحضينها في جسم مضاد ثانوي و 4 & # x02032،6-diamidino-2-phenylindole (1 & # x003bcg / mL) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم غسل المقاطع مرتين في 0.1 ٪ توين 20 بالإضافة إلى برنامج تلفزيوني ومرة ​​واحدة في برنامج تلفزيوني ثم تركيبها باستخدام فلورومونت- G (علوم المجهر الإلكتروني ، 1798425). تضمنت الضوابط حذف الجسم المضاد الأولي (بدون تحكم أولي) أو استبدال الأجسام المضادة الأولية بأجسام مضادة غير تفاعلية من نفس النمط النظوي (التحكم في النمط المتماثل). تم تصور الأنسجة وتصويرها باستخدام مجهر نيكون Eclipse Ni وكاميرا SLR رقمية (نيكون ، DS-Qi2).

تحديد كمية الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة

تم التقاط ثلاث صور IF غير متداخلة 10 & # x000d7 لكل عينة خزعة. تم تحليل اثنتي عشرة عينة خزعة (10 اثني عشر ، 2 دقاق) من 11 مريضًا مصابًا بـ COVID-19 في مجموعة الخزعة مع 9 أفراد غير مصابين بالعدوى (5 دقاق ، 4 دقاق). تم تحديد كمية CD3 + IELs و CD3 + CD8 + IELs لكل صورة. تم قياس طول الظهارة في كل صورة في ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة). تمت مقارنة 2 عينة خزعة من المرضى الذين يعانون من COVID-19 والأفراد الضابطة عن طريق غير مزدوج ر اختبار.

الفحص المجهري الإلكتروني السريري الروتيني

بعد تثبيت نقاط البيع في 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم ، تم تجفيف الأنسجة بشكل متسلسل ودمجها في راتنجات الايبوكسي بطريقة قياسية. تم تحضير المقاطع الكشفية الملطخة بتولويدين واحد ميكرون للتوجيه المجهري الخفيف 80 نانومتر أقسام فائقة الرقة للفحص المجهري الإلكتروني ملطخة بخلات اليورانيل وسيترات الرصاص وفحصها في مجهر هيتاشي الإلكترونى لنقل الحركة 7650 عند 80 كيلو فولت.

إصابة الخلايا المزروعة بالمجهر الإلكتروني وتحليلات التصوير المقطعي بالإلكترون

أجريت العدوى الفيروسية للخلايا المستنبتة في مرفق UVM BSL-3 بموجب بروتوكول مؤسسي للسلامة الأحيائية معتمد. تم توفير سلالة SARS-CoV-2 2019-nCoV / USA_USA-WA1 / 2020 (WA1) بسخاء من قِبل Kenneth Plante والمركز المرجعي العالمي للفيروسات الناشئة وفيروسات Arbovirus في الفرع الطبي بجامعة تكساس وانتشرت في خلايا الكلى القرد الأخضر الأفريقي ( Vero E6) ، والتي تم توفيرها من قبل JL Whitton. تم الحفاظ على خلايا Vero E6 في وسط Dulbecco & # x02019s المعدل النسر (Thermo Fisher Scientific ، الكتالوج رقم 11965 & # x02013092) يحتوي على 10 ٪ من مصل بقري جنيني (Gibco ، Thermo Fisher Scientific ، الكتالوج رقم 16140 & # x02013071) ، 1 ٪ HEPES عازلة محلول (15630 & # x02013130) ، و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (Thermo Fisher Scientific ، كتالوج رقم 15140 & # x02013122). نمت الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 & # x000b0C مع 5 ٪ CO2. تم زرع خلايا Vero E6 في 6 أطباق جيدة وإصابتها بـ SARS-CoV-2 بتعدد إصابة 0.01 لمدة 48 ساعة قبل التثبيت والتحضير للفحص المجهري الإلكتروني. تم تحضير الخلايا بـ 3 ٪ جلوتارالدهيد ، 1 ٪ بارافورمالدهيد ، 5 ٪ سكروز في 0.1 مول / لتر ثلاثي هيدرات كاكوديلات الصوديوم ، وإزالتها من الألواح ، وتحضيرها عن طريق التجميد عالي الضغط واستبدال التجميد ، كما سيتم وصفه.

الفحص المجهري الإلكتروني والتصوير المقطعي ثنائي المحور لأنسجة خزعة الأمعاء

تم تثبيت عينات الأنسجة بنسبة 3٪ من الجلوتارالدهيد لتلبية متطلبات السلامة الحيوية. تم شطف الأنسجة باستخدام بارد 0.1 مول / لتر من ثلاثي هيدرات كاكوديلات الصوديوم بالإضافة إلى 5 ٪ سكروز وتم تشريحها بشكل أكبر لتكتل أحجام كافية للتجميد عالي الضغط. تم شطف الأنسجة أو الخلايا المستنبتة باستخدام محلول كاكوديلات 0.1 مول / لتر يحتوي على 10 ٪ Ficoll (واقي خارجي من البرد) ، ووضعها في ألواح نحاسية (Ted Pella ، Inc) ، وتم تجميدها بسرعة فائقة باستخدام جهاز تجميد عالي الضغط HPM-010 (Bal-Tec / أبرا). تم نقل العينات المجمدة الزجاجي تحت النيتروجين السائل إلى قوارير Nalgene المبردة (Thermo Fisher Scientific) التي تحتوي على خليط مجمد بنسبة 2 ٪ OsO4، 0.05٪ يورانيل أسيتات في الأسيتون. تم وضع القوارير في آلة استبدال التجميد AFS-2 (Leica Microsystems) ، وتم استبدال العينات بالتجميد لمدة 72 ساعة عند & # x0201390 & # x000b0C. تم بعد ذلك تسخين العينات إلى & # x0201320 & # x000b0C على مدار 24 ساعة والاحتفاظ بها في درجة الحرارة هذه لمدة 12 ساعة أخرى قبل تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة ، وشطفها 3 مرات بالأسيتون ، ثم تسللها إلى راتنج Epon-Araldite (علوم المجهر الإلكتروني). كانت العينات مثبتة بشكل مسطح بين شريحتين مجهر زجاجيين مطليين بالتفلون ، وتمت بلمرة الراتنج عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لوحظت كتل الأنسجة المدمجة بواسطة الفحص المجهري الضوئي للتأكد من جودة الحفظ واختيار المناطق ذات الأهمية (أي ظهارة قمي). تم استخراج الكتل بمشرط ولصقها على بذرة تقطيع بلاستيكية قبل التقسيم. تم قطع المقاطع التسلسلية Semithin (150 نانومتر) باستخدام UC6 ultramicrotome (Leica Microsystems) باستخدام سكين الماس (Diatome ، Ltd). تم وضع المقاطع على شبكات فتحات النحاس والروديوم المطلية فورًا (علوم المجهر الإلكتروني) وملطخة بـ 3 ٪ من أسيتات اليورانيل وسيترات الرصاص. تم وضع جزيئات الذهب الغروية (10 نانومتر) على كلا سطوح الشبكات لتكون بمثابة علامات إيمانية لمحاذاة الصورة المقطعية. تم وضع الشبكات في حامل تصوير مقطعي ثنائي المحور (موديل 2010 ، أدوات EA Fischione) وتم تصويرها باستخدام مجهر إلكتروني ناقل الحركة Tecnai G2 T12 (120 KeV ، Thermo Fisher Scientific). تم تسجيل الصور بكاميرا 2k & # x000a0 & # x000d7 2k CCD (XP1000 ، Gatan). تم الحصول على سلسلة إمالة التصوير المقطعي ومونتاج مساحة كبيرة تلقائيًا باستخدام حزمة برامج SerialEM. 3 للتصوير المقطعي ثنائي المحور ، تم جمع الصور على فترات 1 & ​​# x000b0 حيث تم إمالة العينات & # x000b162 & # x000b0. ثم تم تدوير الشبكة 90 & # x000b0 ، وتم الحصول على سلسلة إمالة ثانية حول المحور المتعامد. تم حساب الرسوم المقطعية وتحليلها ونمذجتها باستخدام حزمة برامج IMOD 4 و 5 على أجهزة كمبيوتر MacPro و iMac Pro (Apple ، Inc).

تم تحديد فيريونات SARS-CoV-2 الافتراضية من إعادة بناء عينات الأنسجة بالتصوير المقطعي من خلال مراقبة الهياكل التي تشبه الفيروسات الموصوفة في دراسات التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد & # x02013 التصوير المقطعي الإلكتروني لتنقية SARS-CoV-2 و SARS-CoV-2 في الخلايا المصابة 6 ، 7 ، 8 ، 9 وبالمقارنة مع الفيروسات المحددة داخل الخلايا المستنبتة المصابة بـ SARS-CoV-2 & # x02013 (الشكل التكميلي & # x000a06). استخدمنا المعايير التالية لتحديد SARS-CoV-2 virion في الأنسجة: (1) الهياكل التي كانت كروية في 3 أبعاد وليست متصلة مع الهياكل المجاورة الأخرى ، بأقطار 60 & # x02013120-nmol / L تقريبًا و (2) هياكل كروية ذات كثافات مطابقة لطبقة ثنائية غشائية مميزة ، ونقاط نقطية داخلية متوافقة مع البروتينات النووية 6 ، والكثافات المقابلة لارتفاعات السطح على الأطراف الخارجية للكرات. تم فحص الجسيمات التي تشبه الفيروسات في 3 أبعاد بواسطة التصوير المقطعي قبل المهام (الأفلام التكميلية 1 و 2). نلاحظ أن الحويصلات الداخلية للأجسام متعددة الخلايا (MVBs) قد تم تعريفها بشكل خاطئ على أنها SARS-CoV-2 بواسطة المجهر الإلكتروني. لذلك قمنا بمقارنة قياسات الحويصلات الداخلية لـ MVB وفيروسات الفيروس التاجي المفترضة من ما حددناه على أنه مقصورات خروج داخل الخلايا داخل نفس التصوير المقطعي (نتائج غير منشورة) مع عمليات إعادة البناء التصويرية المقطعية السابقة لـ MVBs. 11 ، 12 قمنا بتمييز الفيروسات داخل حجرة الخروج السيتوبلازمية من الحويصلات الداخلية لـ MVB بناءً على الاختلافات في الحجم (تكون الفيروسات الداخلية MVB عمومًا أصغر في القطر من فيروسات كورونا) ووجود طفرات سطحية ونقاط داخلية (الحويصلات الداخلية MVB لا تفعل ذلك. المسامير السطحية الحالية أو النقاط الداخلية).

تجارب زراعة الخلايا وعزل الفيروسات

تم شراء الخلايا الظهارية الكلوية الخضراء الأفريقية (Vero E6) في الأصل من American Type Culture Collection. تم الحفاظ على الخلايا في وسط Dulbecco & # x02019s المعدّل Eagle & # x02019s مع l -glutamate ، بيروفات الصوديوم (Corning) المضاف إليه 10 ٪ من مصل بقري جنيني (FBS) ، 100 U بنسلين / مل ، و 100 مجم ستربتومايسين / مل. بالنسبة لجميع التجارب ، تم الحفاظ على الخلايا دائمًا في طبقات أحادية.

تم إجراء عدة محاولات لعزل الجسيمات الحية المعدية من عينات الخزعة هذه. باختصار ، تم جمع عينات الخزعة وتخزينها في برنامج تلفزيوني حتى التجانس. بعد التجانس والطرد المركزي (10000ز، 20 دقيقة ، 4 & # x000b0C) ، تم تلقيح المادة الطافية الناتجة على طبقة أحادية من Vero E6 تم الحفاظ عليها في وسائط نمو الفيروسات المثلى لفيروس SARS-CoV-2 (وسيط Eagle المعدل Dulbecco & # x02019s مع l -glutamate ، بيروفات الصوديوم ، 2٪ FBS ، 100 U بنسلين / مل ، و 100 مجم ستربتومايسين / مل 10 مليمول / لتر أحماض أمينية غير أساسية ، 1 مليمول / لتر بيروفات الصوديوم ، و 10 مليمول / لتر HEPES). تم تحضين خلايا Vero E6 عند 37 & # x000b0C و 5 ٪ CO2 لمدة أسبوع ومراقبتها يوميًا لاحتمال تأثير اعتلال الخلايا.

تم أيضًا جمع المواد الطافية للثقافة الخلوية وتقييمها لوجود الجسيمات المعدية عن طريق فحص البلاك. باختصار ، تم إجراء تخفيفات متسلسلة بمقدار 10 أضعاف في وسط العدوى لـ SARS-CoV-2 وتم تلقيحها على طبقة أحادية الخلية متكدسة Vero E6 في لوحة 6 آبار. بعد ساعة واحدة من الامتزاز ، تمت إزالة المواد الطافية ، وتم تراكب الطبقات أحادية الخلية مع الحد الأدنى من الوسائط الأساسية التي تحتوي على 2 ٪ FBS والأجار المنقى (Thermo Scientific Oxoid) بتركيز نهائي قدره 0.7 ٪. ثم تم تحضين الخلايا لمدة 3 أيام عند 37 & # x000b0 درجة مئوية. تم إصلاح الخلايا بين عشية وضحاها مع 10٪ فورمالدهايد لتعطيل فيروس SARS-CoV-2 المحتمل. تمت إزالة التراكب وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. تم استخدام محلول من الكريستال البنفسجي 2٪ لتصور الصفائح وعدّها. أجريت التجارب تحت شروط BSL 3.

الكشف عن فيروس SARS-CoV-2 RNA في أنسجة خزعة الأمعاء

للكشف عن SARS-CoV-2 RNA من عينات الخزعة المعوية ، تم استخدام نسخة معدلة من RT-qPCR في الوقت الحقيقي لمراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها 2019-nCoV. كانت البادئات والمجسات متوفرة تجارياً (تقنيات DNA المتكاملة ، كتالوج رقم 10006713 ، RUO Kit). تتألف مجموعات التمهيدي والمسبار SARS-CoV-2 من مجموعتين خاصتين بـ 2019-nCoV (N1 و N2). تم استخدام مجموعة أولية ثالثة لاكتشاف RNaseP الخلوي المضيف. تم تشغيل التفاعلات باستخدام QuantiFast Pathogen RT-PCR & # x000a0 + IC Kit (Qiagen ، الكتالوج رقم 211454). تم إجراء الاختبارات باستخدام USA / WA-1/2020 SARS-CoV-2 RNA كعنصر تحكم إيجابي ومياه خالية من نوكلياز كعنصر تحكم غير نموذجي بتنسيق 384 بئر. تم استخدام بلازميد يحتوي على تسلسل الجينوم للبروتين N (تقنيات DNA المتكاملة ، كتالوج رقم 10006625 ، RUO Kit) لحساب رقم نسخة الجينوم من عتبات الدورة الخاصة بكل منها باستخدام المعادلة الخطية من المنحنيات المعيارية البلازميدية ذات الصلة. تم تحديد حد الكشف كـ 1 & # x0201310 نسخ / & # x003bcL. تم إجراء ردود الفعل في نسختين باستخدام ظروف ركوب الدراجات التالية على Roche LightCycler 480 Instrument II (Roche Molecular Systems ، 05015243001): 50 & # x000b0C لمدة 20 دقيقة ، 95 & # x000b0C لمدة ثانية واحدة ، و 95 & # x000b0C لمدة 5 دقائق ، تليها 45 دورات 95 & # x000b0C لمدة 15 ثانية و 60 & # x000b0C لمدة 45 ثانية. تم تحديد حد اكتشاف SARS-CoV-2 باستخدام عنصر تحكم البلازميد المتاح تجاريًا (تقنيات الحمض النووي المتكاملة ، كتالوج رقم 10006625).

جمع الخزعة ومعالجتها لقياس الكتلة الخلوية

تم نقل عينات الخزعة إلى 10 مل من محلول التفكك (1 مول / لتر HEPES [Lonza] ، 5 مللي مول / لتر EDTA [Invitrogen] ، 10 ٪ FBS في HBSS العازلة [Gibco]). تم الاحتفاظ بالأنابيب في شاكر (180 دورة / دقيقة ، 37 & # x000b0C) لمدة 20 دقيقة ثم تم تحريكها برفق. تم جمع المعلقات الخلوية بعد تمرير عينات الخزعة من خلال مصافي الخلايا 100 & # x003bcm. تم إجراء جولة ثانية من تفكك EDTA كما هو مفصل سابقًا. تم طرد المعلق الخلوي عند 1800 دورة / دقيقة لتكوير EC والاحتفاظ به على الجليد. تم نقل الأنسجة المتبقية إلى أنابيب جديدة تحتوي على محلول هضم (2٪ FBS ، 0.005 جم كولاجيناز من النوع الرابع لكل عينة [Sigma] ، و 100 & # x003bcl DNase I [Sigma] في RPMI). تم وضع الأنابيب في شاكر (180 دورة / دقيقة ، 37 & # x000b0C) لمدة 40 دقيقة وبعد ذلك يتم تحريكها برفق. تم ترشيح الأنسجة المهضومة من خلال 100 & # x003bcm مصافي الخلايا ، تليها جولة أخرى من الترشيح من خلال 40 & # x003bcm مصافي الخلايا. تم تعليق الخلايا بالطرد المركزي عند 1800 دورة / دقيقة للحصول على خلايا LP أحادية النواة. تم بعد ذلك تعليق كل من حبيبات EC و LP في 500 & # x003bcL من RPMI (Gibco) التي تحتوي على 10 ٪ FBS + 1 & # x003bcl Rh103 & # x000a0 + 1 & # x003bcl 5-Iodo-2 & # x02019-deoxyuridine واحتضانها في 37 & # x000b0C لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، تمت إضافة 5 مل RPMI (+ 10٪ FBS) إلى كل أنبوب ونسجها عند 1800 دورة / دقيقة لخلايا الحبيبات. بعد ذلك ، تمت إضافة 700 & # x003bcL من مثبت Prot1 (SmartTube Inc) إلى كل أنبوب ونقله إلى قوارير مبردة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تم نقل Cryovials على الفور إلى & # x0201380 & # x000b0C حتى تم الحصول على العينة لقياس الكتلة ، كما هو مفصل في القسم التالي.

جمع الدم ومعالجته لقياس الكتلة الخلوية

باختصار ، تمت إضافة 15 مل من وسط فصل الخلايا الليمفاوية LymphoSep (MP Bio) إلى كل أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. تم تخفيف الدم باستخدام برنامج تلفزيوني لرفع الحجم إلى 30 مل ، وتم وضع طبقات الدم المخففة برفق فوق LymphoSep. تم بعد ذلك طرد الأنابيب عند 2000 دورة / دقيقة لمدة 20 دقيقة مع إيقاف تشغيل الفرامل والتسارع. بعد الطرد المركزي ، تم نقل الطبقة العازلة التي تحتوي على خلايا أحادية النواة في الدم المحيطي إلى أنبوب آخر وتم طردها عند 1800 دورة / دقيقة لتكوير الخلايا. تم إعادة تعليق الكريات في برنامج تلفزيوني ، وتم طرد الأنابيب بسرعة 1800 دورة / دقيقة.أخيرًا ، تم تعليق الكريات في وسط التجميد (10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد + 44٪ FBS في RPMI) وحفظها بالتبريد عند & # x0201380 & # x000b0C.

معالجة الكتلة الخلوية واكتساب البيانات

تمت معالجة الخلايا كما هو موضح سابقًا بواسطة Geanon et & # x000a0al. 13 باختصار ، تم إذابة العينات المستقرة البروتينية EC و LP SmartTube في حمام مائي 10 & # x000b0C وغسلها باستخدام محلول تلطيخ الخلايا (Fluidigm). لتسهيل الحصول على البيانات وإزالة المضاعفة ، تم أيضًا تشفير عينات متعددة باستخدام مجموعات التشفير الشريطي Fluidigm Pd ثم غسلها وتجميعها للحصول على البيانات. مباشرة قبل الحصول على البيانات ، تم غسل العينات باستخدام محلول تلطيخ الخلايا ومحلول اكتساب الخلية (Fluidigm) وأعيد تعليقها بتركيز 1 مليون خلية / مل في محلول اكتساب الخلية الذي يحتوي على تخفيف 1:20 من حبات تطبيع EQ (Fluidigm). تم الحصول على العينات بعد ذلك على مقياس خلوي للكتلة من هيليوس مزود بحاقن عينة واسع التجويف بمعدل حدث & # x0003c400 أحداث في الثانية. بعد الاستحواذ ، كانت عمليات الاستحواذ المتكررة على نفس العينة متسلسلة وتطبيعها باستخدام برنامج Fluidigm ، وتم فك تعدد العينات المشفرة باستخدام أداة إزالة الترميز أحادية الخلية Zunder.

تحليل بيانات الكتلة الخلوية

تم تحميل الملفات المشفرة إلى Cytobank لتحليلها. تم تحديد الخلايا المناعية بناءً على كثافة الحمض النووي Ir-193 وتعبير CD45 + حبات التطبيع Ce140 + ، الحطام المنخفض CD45 / Ir-193-low ، والعينات المتقاطعة والسحابة الأيونية الغوسية المتعددة من التحليل اللاحق. تم تفصيل القياس الخلوي حسب وقت الرحلة في ملف البيانات التكميلية 1. تم التعرف على أنواع الخلايا المناعية الرئيسية باستخدام نهج الإسطرلاب الآلي ، والنتيجة التي ارتبطت بشكل جيد مع نهج البوابات اليدوية لدينا. تم تقييم تأثير كل حالة تم اختبارها على جودة التلوين النسبية بطريقتين: (1) تم تحديد الارتباطات الكلية من خلال حساب معاملات ارتباط بيرسون للتعبير الوسيط لكل علامة عبر كل مجموعة فرعية مناعية محددة و (2) مؤشر تلطيخ (SI) ) باستخدام مجموعات محددة تُظهر أعلى وأدنى مستويات تعبير لكل علامة: SI & # x000a0 = (Medianpos & # x02013 Medianneg) / 2 & # x000a0 & # x000d7 Std.Devneg. لقد تم بالفعل وصف أن بروتوكولات التثبيت المستندة إلى SmartTube تأخذ في الاعتبار القطع الأثرية لقياس الكتلة الخلوية الموصوفة سابقًا مثل الخلايا الخلوية المتعددة ، والانتشار النظائري أو الأكسدة ، أو تكوين أداة قياس الكتلة الخلوية. 13

التحليل الإحصائي للقياس الخلوي الكتلي

تم تجميع خلايا CD45 + القابلة للحياة مسبقًا أولاً ووضع تعليقات توضيحية عليها باستخدام منصة الإسطرلاب للقياس الخلوي (الإسطرلاب للتشخيص ، وشركة) ، والتي تتضمن استخدام خوارزمية خرائط التنظيم الذاتي للتدفق (SOMs) القائمة على التسلسل الهرمي لتمييز مجموعات الخلايا في العينات الفردية. تم بعد ذلك تجميع مجموعات التنميط الإسطرلاب هذه من كل نوع من أنواع الأنسجة عبر جميع العينات باستخدام خريطة الحرارة التفاعلية Clustergrammer2 & # x02019s كطريقة لاستجواب تعبير الجسم المضاد عبر كل مجموعة وتنظيم وتعيين فئات السكان الخلوية. تم أيضًا تصور مجموعات عينة واحدة باستخدام UMAP. تم إجراء مقارنات زوجية على ترددات كل مجموعة خلايا محددة بين مجموعات المرضى (COVID-19 مقابل السيطرة ، و COVID-19 الشديد مقابل السيطرة ، و COVID19- بدون أعراض / معتدل / معتدل مقابل السيطرة) لتحديد تغير الطية (FC) ، ص القيم و FDR المعدل ص القيم باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg 14 لحساب المقارنات المتعددة.

تسلسل الحمض النووي الريبي

إعداد المكتبة وتسلسلها

تم تحضير مكتبات RNA-seq الاتجاهية من 50 نانوغرام من إجمالي عينات الحمض النووي الريبي من عينات EC و LP باستخدام TruSeq Stranded Total RNA الإعدادية مع مجموعة Ribo-Zero (كتالوج رقم 20020599). تم إجراء تسلسل مزدوج (100 & # x02013base) لمكتبات الحمض النووي على أداة Illumina NovaSeq على خلية تدفق NovaSeq S1 ، بمتوسط ​​عائد 39 مليون قراءة / عينة.

تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي

تم إجراء الاتصال الأساسي وجودة بيانات التسلسل من خلال برنامج تحليل الوقت الحقيقي Illumina & # x02019s. تم إجراء معالجة بيانات RNA-seq ورسم الخرائط المرجعية باستخدام نصوص تحليل مخصصة تجمع بين الأدوات المتاحة للجمهور كما هو موضح سابقًا 15 مع التعديلات على النحو التالي ، وتم تعيين القراءات إلى مرجع مخصص يجمع بين الجينوم المرجعي البشري hg38 (الإصدار 34 ، GRCh38.p13) وجينوم SARS-CoV-2 (المرجع: NC_045512) للتقدير الكمي المتزامن لنصوص المضيف والفيروسات.

تم إجراء تحليل التعبير الجيني التفاضلي باستخدام حزمة حافة الموصل الحيوي 16 باستخدام ، كمدخل ، مصفوفة مشتركة من التعدادات الأولية للقراءة الزوجية المعينة ، مع الجينات في الصفوف والعينات في الأعمدة. قبل تحليل التعبير الجيني التفاضلي ، تم تحويل تعداد الجينات إلى شظايا لكل كيلو قاعدة لكل مليون قراءة (FPKM) باستخدام حزمة RSEM مع الإعدادات الافتراضية في الوضع الخاص بالخيوط. 17

تمت إزالة الجينات التي تحتوي على أقل من 1 FPKM في 50 ٪ على الأقل من العينات. تم بعد ذلك تطبيع تعداد الجينات المتبقية عبر العينات باستخدام المتوسط ​​الموزون المشذب م طريقة القيم. 18 تم تقدير التشتت من خلال تركيب نموذج خطي معمم كما تم تنفيذه في edgeR ، وتم تركيب الجنس كمتغير مشترك على تصميم مقترن لكل مريض. تم إجراء مقارنات زوجية بين مجموعات العينة (أي بين أقسام الأنسجة وكذلك بين مرضى الحالة والأفراد الضابطة). تم اختيار اختلافات كبيرة في التعبير بناءً على تعديل بايز التجريبي ص تم تصحيح القيم للاختبار المتعدد باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg (ف & # x02264 .05).

علم الوجود الجيني وتحليل إثراء المسار

تم إجراء تحليلات مسار KEGG والعملية البيولوجية و / أو الوظيفة الجزيئية و / أو إثراء المكونات الخلوية باستخدام حزمة gProfileR R الإصدار 0.6.8. تم تقييد مجموعة الجينات الخلفية مع التعبير المكتشف (تم تعريفه على أنه جينات ذات مستويات تعبير أعلى من 1 FPKM في 50 ٪ على الأقل من العينات). تم تصنيف الجينات ذات التعبير التفاضلي حسب السجل2 أضعاف التغيير واستخدامها كاستعلام مرتب. ص تم تصحيح القيم باستخدام خوارزمية g: SCS لحساب المقارنات المتعددة.

تفكيك نوع الخلية وتحليل إثراء التوقيع الجيني

بالنسبة لفك التحول من نوع الخلية لبيانات RNA-seq السائبة ، تم إجراء تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) لمقارنات DEGs للمريض مقابل التحكم الفردي مقابل توقيعات الخلية المفردة للتعبير الجيني من نوع الخلية من الغشاء المخاطي المعوي 20 والتعبير الجيني التوقيعات من مجموعات فرعية ileal DC. 21 وبالمثل ، تم اختبار DEGs لإثراء التواقيع الجينية المرتبطة بالاستجابة المضادة للفيروسات والالتهاب وإشارات السيتوكين في أنسجة ما بعد الوفاة المصابة بشدة بفيروس SARS-CoV-2 وتم اختبارها بحثًا عن أهمية (ص & # x02264 .05) الإثراء باستخدام اختبارات فيشر الدقيقة واستخدام تصحيح Bonferroni لإجراء مقارنات متعددة.

بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء GSEA 23 على قائمة مرتبة مرتبة للتحليل الجزيئي للمجموعة المصابة مقابل مجموعة التحكم. كان مقياس الترتيب المستخدم هو log (FC) & # x000a0 & # x000d7 & # x02013log (ص القيمة) ومع ذلك ، كانت النتائج متشابهة عند استخدام مقياس السجل (FC) أيضًا (البيانات غير معروضة). بالنسبة لمجموعات البيانات المرتبطة بـ COVID-19 & # x02013 ، قمنا برعاية توقيعين من العضيات المصابة ، 24 hSIOs-COVID-19: عضويات الأمعاء الدقيقة البشرية (hSIOs) المزروعة في أي من (1) وسيط Wnt عالي التوسع (عند التعديل ص & # x0003c .05) أو (2) وسط تمايز (عند التعديل ص & # x0003c .1). تم استخدام إعدادات GSEA القياسية ، وهي متوسط ​​التقسيم لوضع التطبيع وإحصاء التخصيب الموزون و 1000 تبديل. تم أيضًا تنفيذ GSEA باستخدام قاعدة بيانات Hallmark (الإصدار 7.1 25) بنفس الإعدادات.

التحليلات الحسابية

نموذج متعدد المتغيرات يعتمد على مجموعة الاكتشاف

من أجل هذا التحليل ، أخذنا في الاعتبار 570 مريضًا لديهم واصفات سريرية بما في ذلك العمر والجنس والعرق / العرق ومؤشر كتلة الجسم والأمراض المصاحبة (بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم والسكري وأمراض الرئة المزمنة (بما في ذلك الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن) وأمراض القلب (بما في ذلك مرض الشريان التاجي والرجفان الأذيني و فشل القلب) ، وأعراض الجهاز الهضمي. تم استخدام الانحدار اللوجستي متعدد المتغيرات لنمذجة الشدة والوفيات كدالة لكل من أعراض الجهاز الهضمي والمتغيرات السريرية بما في ذلك العرق والعمر والجنس ومؤشر كتلة الجسم وأمراض القلب والرئة وارتفاع ضغط الدم.

على وجه الخصوص ، تم تصنيف العرق على أنه أبيض ، أسود (أمريكي من أصل أفريقي) ، من أصل إسباني ، وأمراض الرئة الأخرى تم تعيينها مساوية لـ 1 إذا كان المريض مصابًا بمرض الانسداد الرئوي المزمن أو الربو و 0 بخلاف ذلك ، تم تعيين أمراض القلب على أنها تساوي 1 إذا كان المريض تأثرت بمرض الشريان التاجي ، أو الرجفان الأذيني ، أو قصور القلب وإلى الصفر بخلاف ذلك. تم تعيين مؤشر الشدة مساويًا لـ 1 للمرضى الذين يعانون من مرض التخلص من الذخائر المتفجرة الشديدة والحادة و 0 للمرضى الذين يعانون من معدل وفيات COVID-19 الخفيف والمتوسط ​​تم ضبطه على يساوي 1 للمرضى المتوفين و 0 بخلاف ذلك.

تم تحديد الارتباطات المهمة بناءً على فواصل الثقة 95٪ (CIs) بناءً على 1000 تكرار للتمهيد. في كل تكرار للتمهيد ، تم أخذ عينات من المرضى مع بدائل ، وتم تقدير الانحدار اللوجستي باعتباره شدة النتيجة والوفاة. بعد ذلك ، تم تقدير 95٪ من مجالات الموثوقية للمعاملات ونسبة الأرجحية عبر تكرارات التمهيد.

مجموعة التحقق الخارجية

بالنسبة لهذا التحليل ، أخذنا في الاعتبار 228 مريضًا لديهم بيانات سريرية مثل العمر والجنس وأعراض الجهاز الهضمي ، كما وصفها Aghemo et & # x000a0al. 1 تم استخدام الانحدار اللوجستي متعدد المتغيرات لنمذجة الوفيات ، والقبول في وحدة العناية المركزة ، والنتيجة المركبة لدخول وحدة العناية المركزة أو الوفيات كدالة لوجود أو عدم وجود الإسهال والمتغيرات السريرية بما في ذلك العمر والجنس ومؤشر كتلة الجسم وأمراض القلب ومرض الانسداد الرئوي المزمن والسكري ، وارتفاع ضغط الدم. تم ضبط أمراض القلب على 1 إذا كان المريض مصابًا بمرض الشريان التاجي أو الرجفان الأذيني و 0 بخلاف ذلك. تم حساب 95٪ CI من نسب الأرجحية بناءً على 1000 تكرار للتمهيد ، كما هو موصوف.

في 270 مريضًا من هذه المجموعة ، كانت بيانات العلاج متاحة. تضمنت العلاجات علاجات هيدروكسي كلوروكين المضادة للفيروسات ، بما في ذلك لوبينافير-ريتونافير ودارونافير-كوبيسيستات توسليزوماب ، والمنشطات ، والمضادات الحيوية بما في ذلك سيفترياكسون ، أزيثروميسين ، وبيبراسيلين تازوباكتام ستاتين مثبطات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين ، وحاصرات مستقبلات الأنجيوتنسين 2. باستخدام هذه البيانات ، أجرينا اختبار فيشر الدقيق لتحديد ما إذا كانت أي علاجات مرتبطة بالإسهال. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بحساب 95٪ CIs من OR على أساس 1000 تكرار bootstrap.

الأداء التنبئي بناءً على مجموعة التحقق الداخلية

من أجل هذا التحليل ، أخذنا في الاعتبار 233 مريضًا لديهم بيانات سريرية بما في ذلك العمر ومؤشر كتلة الجسم وأعراض الجهاز الهضمي. لتقييم الأداء التنبئي لكل نموذج ، تم إجراء التمهيد. على وجه التحديد ، في كل تكرار للتمهيد ، قمنا بأخذ عينات عشوائية من المرضى في مجموعة الاكتشاف مع الاستبدال وتقدير الانحدار اللوجستي لنمذجة كل نتيجة كدالة لأعراض GI معينة ، والعمر ، ومؤشر كتلة الجسم. في هذا التحليل ، تم تعديل العمر ومؤشر كتلة الجسم فقط لأنهما كانا المتغيرين الوحيدين المرتبطين بشكل كبير بكلتا النتيجتين عبر نماذج أعراض الجهاز الهضمي المختلفة في مجموعة الاكتشاف (الشكل & # x000a05 ب والجدول التكميلي & # x000a09). بعد ذلك ، تم استخدام النموذج المقدر للتنبؤ بنتيجة المرضى في مجموعة التحقق الداخلية. تم تكرار هذا الإجراء لـ 1000 تكرار للتمهيد. لكل تكرار ، تم حساب منحنى خاصية التشغيل المستقبلة (ROC) و AUC. لأغراض المقارنة ، تم النظر في توزيع AUC عبر 1000 تكرار تمهيد من النموذج التنبئي بناءً على العمر ومؤشر كتلة الجسم فقط. الشكل & # x000a05 ديُظهر Boxplot الخاص بقيم AUC عبر 1000 تكرار للتمهيد. ثم ، مع الأخذ في الاعتبار النموذج التالي ،

قمنا بتقييم تأثير كل متغير على النتيجة عن طريق حساب التخفيض في AUC الذي تم الحصول عليه بعد إزالة متغير واحد في كل مرة. لهذا الغرض ، تمت مقارنة AUC للنموذج 1 بالنماذج الثلاثة التالية:

النتيجة & # x000a0 = F(العمر & # x000a0 + أي أعراض الجهاز الهضمي) نموذج 3

النتيجة & # x000a0 = F(مؤشر كتلة الجسم # x000a0 + أي من أعراض الجهاز الهضمي) نموذج 4

لـ 1000 تكرار للتمهيد. باتباع هذه الاستراتيجية ، في & # x000a0each تكرار التمهيد ، تم أخذ عينات من المرضى مع الاستبدال. الشكل & # x000a05 ه يُظهر 95٪ CIs للاختلاف في & # x000a0the AUCs بين النموذج 1 والنماذج 2 و 3 و 4 (على سبيل المثال ، & # x000a0AUCالموديل 1 & # x02013 AUCالموديل 2، الجامعة الأمريكية بالقاهرةالموديل 1 & # x02013 AUCالموديل 3، والجامعة الأمريكية بالقاهرةالموديل 1 & # x02013 AUCالموديل 4) عبر 1000 تكرار للتمهيد. تم حساب الفرق في AUC مع الأخذ في الاعتبار كل من الوفيات والشدة كنتيجة.

متوسط ​​تأثير العلاج

تم حساب ATE لفوج Mount Sinai (MSH) ، الذي يجمع بين الاكتشاف ومجموعات التحقق الداخلية ، وبالنسبة لفوج التحقق الخارجي تم حسابه عبر حزمة TMLE في R. 26 بالنسبة لمجموعة MSH ، تم حساب ATE لكل عرض من أعراض الجهاز الهضمي باستخدام نتائج شدة المرض والوفيات. تم حساب التأثير الهامشي بعد تعديل المتغيرات المشتركة مثل العمر والعرق ومؤشر كتلة الجسم والجنس والسكري وأمراض الرئة وأمراض القلب وارتفاع ضغط الدم. بالنسبة لفوج التحقق الخارجي ، تم حساب ATE للإسهال عند قبول وحدة العناية المركزة والوفيات ومركب قبول وحدة العناية المركزة والوفيات. تم حساب التأثير الهامشي بعد التعديل بالنسبة للمتغيرات المشتركة مثل العمر ومؤشر كتلة الجسم والجنس والسكري وأمراض الرئة وأمراض القلب وارتفاع ضغط الدم.

التحديد الكمي للأحمال الفيروسية في البلعوم الأنفي SARS-CoV-2

تم تحديد الأحمال الفيروسية لـ SARS-CoV-2 على النحو المفصل في Pujadas et & # x000a0al. 27 باختصار ، تم استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من عينة مسحة NP ، متبوعًا بـ RT-PCR في الوقت الفعلي باستخدام بادئات N2. فقط العينات مع N2م من & # x0003c38 تم تضمينها. تم حساب الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 باستخدام طريقة دلتا CT ومنحنى قياسي. يتم تقديم الأحمال الفيروسية كقيمة السجل 10 & # x02013 ، قيمة N2 غير المصححة المحولة & # x000a0 + 1000 (مضافة ثابتة قبل التحويل). 27 بالنسبة للمرضى الذين لديهم العديد من مسحات NP المتاحة ، تم استخدام المسحة الأولى للتحليل.

لوحة سيتوكين ELLA

منصة ELLA هي طريقة لقياس السيتوكين السريع باستخدام مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ميكروفلويديكس. قام الفحص بقياس TNF - & # x003b1 و IL6 و IL8 و IL1 & # x003b2 ، والتي تم التحقق من صحتها مسبقًا من قبل مركز مراقبة المناعة البشرية Mount Sinai باستخدام البلازما من المرضى الذين يعانون من المايلوما المتعددة وتم الإبلاغ عنها مؤخرًا لمجموعة كبيرة من المرضى الذين يعانون من COVID-19 الذين تم قبولهم في MSH .

الفحص البروتيني المتعدد (أولينك)

لتحليل السيتوكينات المتداولة ، استخدمنا لوحة التهاب بروتينية متعددة الإرسال (Olink) ، والتي تتكون من 92 بروتينًا مرتبطًا بالالتهاب محددًا كميًا عن طريق امتداد القرب بوساطة الأجسام المضادة والمقايسة المستندة إلى x02013. تم استبعاد العينات ذات قيم تعبير البروتين الطبيعي التي تقل عن حد الكشف في & # x0003e75٪ من العينات من التحليل الإضافي. بالنسبة لبقية التحليلات ، تم تعيين قيمة لحد الاكتشاف مقسومة على الجذر التربيعي للرقم 2 لأي عينة تقع تحت حد الاكتشاف.2(FC) على متوسط ​​تعبير بروتين التحكم الصحي ثم تم حسابه ، وتم استخدام إجراء Benjamini-Hochberg لضبط ص قيم للاختبار المتعدد.

تجميع توافق بيانات Olink

بالنسبة لهذا التحليل ، نظرنا في 238 عينة مع شرح توضيحي لأعراض الجهاز الهضمي. تم إجراء التجميع الإجماعي بناءً على وفرة 92 سيتوكينات في جميع العينات البالغ عددها 238. تم إجراء التجميع الإجماعي باستخدام حزم R ConsensusClusterPlus استنادًا إلى ض-نتائج & # x02013 بيانات غير طبيعية. على وجه التحديد ، تم تقسيم العلامات إلى 6 مجموعات باستخدام ك- تعني الخوارزمية التي تكررت 1000 مرة. بعد ذلك ، تم اعتبار العلامات في كل مجموعة مشتقة عنقود ض-تسجيل الدرجات عبر حزمة GSVA. بناءً على هذه التواقيع ، تم اشتقاق الارتباطات بين المجموعات المختلفة وأعراض الجهاز الهضمي عبر الانحدار اللوجستي مع النتائج المقابلة لكل عرض من أعراض الجهاز الهضمي. الشكل & # x000a06 ج يعرض FDR الموقع (& # x02013log10 مقياس). ص تم تعديل القيم عبر Benjamini-Hochberg. تم إجراء تحليل المسار للمجموعات الموصوفة مع مراعاة قواعد بيانات KEGG و Hallmark بأكملها.

تخصيص عينة لفحوصات مختلفة في المرضى المصابين بـ COVID-19 والأفراد الضابطين. توضح مخططات Venn عينات الدم والخزعة المستخدمة في قياس الكتلة الخلوية (#) وتسلسل الحمض النووي الريبي (& # x00394) في المرضى الذين يعانون من COVID-19 (أحمر) وضبط الأفراد (أزرق). تشير الأرقام الموجودة في مخططات Venn إلى حالات المريض والمراقبة الخاصة بالجدول التكميلي المفصل & # x000a02. يلخص الجدول العدد الإجمالي لعينات الدم والخزعة المخصصة للقياس الخلوي الكتلي و RNA-seq. لا ينطبق ، لا ينطبق.

الممثل H & # x00026E تلطيخ عينات خزعة الأمعاء الدقيقة للمرضى المصابين بـ COVID-19. رقم المريض في الزاوية اليسرى العلوية يتوافق مع رقم المريض في الجدول التكميلي & # x000a02. جميع عينات الخزعة هي عينات من الاثني عشر باستثناء المريض 12 ، وهو من اللفائفي النهائي. شريط المقياس: 100 & # x003bcm.

لا يتم زيادة IELs في عينات الخزعة المعوية الدقيقة من مرضى COVID-19 مقارنة بالأفراد الضابطة. (أ) CD3 + و CD8 + IELs لكل مليمتر من الظهارة في المرضى الذين يعانون من COVID-19 وأفراد التحكم غير المصابين في الاثني عشر (أسود) والدقاق (رمادي). ص القيم التي تم إنشاؤها من غير المزاوجة ر الاختبارات. (ب) صور تمثيلية لعينات خزعة الأمعاء الدقيقة تظهر CD3 (لون أخضر) ، CD8 (أحمر) و DAPI (أزرق). ممثل CD8 + IELs (رأس السهم) وممثل CD8 & # x02013 IELs (سهم) يشار إلى. شريط المقياس: 100 & # x003bcm. م ، ليست كبيرة.

صور تمثيلية لعينات خزعة الأمعاء الدقيقة لمرضى COVID-19. كبسولة نوكليوكابسيد SARS-CoV-2 (لون أخضر) ، EPCAM (أحمر) و DAPI (أزرق) في جميع المرضى المصابين بـ COVID-19 حيث كانت الأنسجة متاحة لـ IF. رقم المريض في الزاوية اليمنى العليا يتوافق مع رقم المريض في الجدول التكميلي & # x000a02. جميع عينات الخزعة هي عينات من الاثني عشر باستثناء المريض 12 ، وهو من اللفائفي النهائي. المريض 8 مفقود بسبب صعوبات فنية أثناء تلطيخ IF. شريط المقياس: 100 & # x003bcm.

صور مناعية تمثيلية لعينات خزعة الأمعاء الدقيقة للأفراد الضابطين. كبسولة نوكليوكابسيد SARS-CoV-2 (لون أخضر) ، EPCAM (أحمر) و DAPI (أزرق) في عينات خزعة الاثني عشر (العلوي) وعينات خزعة اللفائفي (أدنى). شريط المقياس: 100 & # x003bcm.

الفحص المجهري الإلكتروني عن طريق التجميد عالي الضغط / التثبيت البديل للتجميد لعدوى SARS-CoV-2 المفترضة في خلايا Vero المزروعة. (أ) نظرة عامة على Montaged لخلية مصابة (قسم 150 نانومتر) (مقدمة للمقارنة مع الهياكل المماثلة الموجودة في عينات الأنسجة (الشكل & # x000a02 والفيلم التكميلي 1) ، والتي لا يمكن حفظها في ظل الظروف المثلى المماثلة للفحص المجهري الإلكتروني). تعرض الخلية أعدادًا كبيرة من الفجوات السيتوبلازمية ، والنزيف السطحي ، والإمراض الخلوي العام. (ب) إعادة بناء مقطعي مونتاج للجزء المركزي من الخلية الموضح في أ. توجد أعداد كبيرة من فيروسات SARS-CoV-2 المفترضة داخل المقصورات السيتوبلازمية التي تكون معظمها متاخمة للمقصورة & # x02019s الطرفية. (ج) معرض لـ 30 فيريونا افتراضية من SARS-CoV-2 مأخوذة من الرسم المقطعي الموضح في ب. يتم عرض كل مثال كعرض استوائي بسمك تصوير مقطعي يبلغ 4.7 ​​نانومتر.

تغيرت المجموعات المناعية في EC للمرضى المصابين بـ COVID-19 مقارنة بالأفراد الضابطة. (أ) تُظهر الخريطة الحرارية تجميع وتوزيع أنواع الخلايا المختلفة في المجموعة الأوروبية. الترددات النسبية لـ (ب) IELs و (ج) خلايا البلازما في EC من الأفراد الضابطين والمرضى المصابين بـ COVID-19. الدوائر الحمراء المفتوحة تشير إلى المرضى الذين يعانون من مرض عديم الأعراض / خفيف / متوسط ​​، والدوائر الحمراء المملوءة تشير إلى المرضى المصابين بفيروس COVID-19 الشديد. تعرض مخططات الشريط الترددات المتوسطة. NK ، القاتل الطبيعي NKT ، القاتل الطبيعي T.

تغير السكان المناعي في دم المرضى المصابين بـ COVID-19 مقارنة بالأفراد الضابطين. (أتُظهر الخريطة الحرارية تجميع وتوزيع أنواع مختلفة من الخلايا المناعية في الدم. الترددات النسبية لـ (ب) كلاسيكي (قضبان منقطة) والوحيدات غير الكلاسيكية (قضبان مفتوحة), (ج) CD4 + الخلايا التائية التنظيمية ، و (د) خلايا البلازما IgG + في دم الأفراد المتحكمين والمرضى المصابين بـ COVID-19. تشير الدوائر الحمراء المفتوحة إلى المرضى الذين يعانون من مرض عديم الأعراض / خفيف / متوسط ​​، والدوائر الحمراء المملوءة تشير إلى المرضى المصابين بفيروس COVID-19 الشديد. تعرض مخططات الشريط الترددات المتوسطة. CM ، الذاكرة المركزية EM ، ذاكرة المستجيب PBMC ، خلية أحادية النواة في الدم المحيطي.

السكان المناعيون المتغيرون في LP للمرضى المصابين بـ COVID-19 مقارنة بالأفراد الضابطة. (أ) الترددات النسبية للخلايا المناعية LP في الأفراد المتحكمين والمرضى المصابين بـ COVID-19. الدوائر الحمراء المفتوحة تشير إلى المرضى الذين يعانون من مرض عديم الأعراض / خفيف / متوسط ​​، والدوائر الحمراء المملوءة تشير إلى المرضى المصابين بفيروس COVID-19 الشديد. تعرض مخططات الشريط الترددات المتوسطة. (بتُظهر الرسوم البيانية الشريطية المكدسة توزيع متوسط ​​ترددات الخلايا الساذجة والذاكرة CD4 + و CD8 + T في LP للمرضى المصابين بـ COVID-19 والأفراد الضابطين. EMRA ، خلايا ذاكرة المستجيب T التي تعيد التعبير عن CD45RA Freq. ، التردد T.ريج، تي التنظيمية.

تم تغيير مجموعات الخلايا التائية في عينات الدم وخزعة الأمعاء للمرضى المصابين بـ COVID-19 مقارنة بأفراد المجموعة الضابطة بناءً على التحليل الخاضع للإشراف. مؤامرات CyTOF التمثيلية ومخططات الشريط التي تقارن ترددات CD29 + CD38 + CD4 + و CD29 + CD38 + CD8 + T الخلايا في (أ) الدم و (ب) LP من أفراد التحكم (أزرق) والمرضى المصابون بـ COVID-19 (أحمر). الدوائر الحمراء المفتوحة تشير إلى المرضى الذين يعانون من مرض عديم الأعراض / خفيف / متوسط ​​، والدوائر الحمراء المملوءة تشير إلى المرضى المصابين بفيروس COVID-19 الشديد. تعرض مخططات الشريط الترددات المتوسطة. CyTOF ، القياس الخلوي حسب وقت الرحلة.

ملامح تعبير مميزة في الأمعاء EC و LP. (أ) تحليل المكون الرئيسي لكسور EC و LP للمرضى المصابين بـ COVID-19 والأفراد الضابطين. يتم فصل كسري النسيج عن المكون الرئيسي 1 (x-محور). (ب) التجميع الهرمي لمتوسط ​​تغيرات التعبير لـ 6636 جينًا (صفوف) تميز المفوضية الأوروبية (أحمر) أو LP (أزرق) الكسور (FDR ، & # x022640.05) في عينات الخزعة المعوية للمرضى المصابين بـ COVID-19 والأفراد الضابطين. تشير اللوحة اليسرى إلى جينات مهمة باللون الأصفر لكل جزء من الأنسجة. شريط الألوان (حق) يشير إلى متوسط ​​السجل2(FC).

التواقيع المناعية في EC للمرضى المصابين بـ COVID-19. تم إجراء GSEA باستخدام قائمة مرتبة مرتبة من الجينات المعبر عنها تفاضليًا في EC مقابل مجموعة التحكم EC المصابة. كان مقياس الترتيب هو log (FC) & # x000a0 & # x000d7 & # x02013log (ص القيمة). (أ) تم إجراء GSEA على مجموعة جينات EC المرتبة المرتبة باستخدام مجموعات بيانات SARS-CoV-2 & # x02013 المصابة. كانت مجموعات الجينات التي تم اختبارها عبارة عن توقيعات جزيئية برعاية SARS-CoV-2 & # x02013 مجموعات بيانات تجريبية عضوية مصابة باستخدام hSIOs المزروعة في إما (1) Wnt عالية التوسع (EXP) (فيص & # x0003c .05) أو (2) وسيط التمايز (DIF) (عندص & # x0003c .1). يتم عرض مجموعات الجينات المخصبة بشكل كبير فقط (عند FDR لـ & # x0003c0.05). (ب) تم إجراء GSEA لنفس مجموعة جينات EC مرتبة مرتبة باستخدام مجموعات بيانات مسار Hallmark. تم العثور على مسارين مخصبين بشكل كبير مرتبطين بالجينات المنظمة في EC المصابة بالنسبة إلى الأفراد الضابطين (عند FDR of & # x0003c0.05). يتم تحديد درجة الإثراء الطبيعية (NES) وقيم FDR كما هو محدد.

مخطط تدفق مجموعة الاكتشاف. يوضح الرسم البياني العدد الإجمالي للمرضى الذين تم قبولهم في نظام Mount Sinai الصحي بين 1 و 15 أبريل 2020 ، وعملية الاختيار التي تم اعتمادها لاختيار المرضى في مجموعة الاكتشاف. قسم الطوارئ.

ارتبط الغثيان والقيء بانخفاض معدل الوفيات والشدة. منحنيات كابلان ماير للوفيات مرتبة حسب (أ) غثيان و (ب) القيء للمرضى في مجموعة الاكتشاف. ص يتم عرض القيم من اختبار رتبة السجل و 95٪ CIs لمنحنيات Kaplan-Meier. أسفل كل منحنى Kaplan-Meier ، يتم الإبلاغ عن عدد المرضى المعرضين لخطر نقاط زمنية مختلفة.

المرضى الذين يعانون من COVID-19 الذين يعانون من أعراض الجهاز الهضمي قللوا من مستويات انتشار IL6 و IL8. (أ) IL6 ، (ب) IL8 ، (ج) TNF - & # x003b1 و (د) IL1 & # x003b2 في وقت الإدخال للمرضى الذين يعانون من أعراض الجهاز الهضمي وبدون أعراض. تمثل Boxplots المدى المتوسط ​​والربيعي. ص تم حساب القيم باستخدام 2-الطرف غير المزاوجة ر اختبار.

مصفوفة الارتباط (بيرسون) لـ 92 علامة موجودة في منصة Olink. (أ) مصفوفة الارتباط عبر مرضى الغثيان (اليسار) مقارنة بالمرضى الذين لا يعانون من الغثيان (حق) و (ب) مرضى القيء (اليسار) مقارنة بالمرضى الذين لا يعانون من القيء (حق). تم الإبلاغ عن تعيين الكتلة المشتق باستخدام تجميع الإجماع غير الخاضع للإشراف في الجزء العلوي من خريطة الحرارة.

الجدول التكميلي & # x000a03

معايير تسجيل شدة المرض لدى المرضى المصابين بـ COVID-19

درجة الخطورةالمعايير
خفيفس س 2 & # x0003e94٪ على هواء الغرفة وعدم وجود التهاب رئوي في التصوير
معتدلس س 2 & # x0003c94٪ على هواء الغرفة أو الالتهاب الرئوي في التصوير
شديدةقنية أنفية عالية التدفق ، وقناع غير قابل لإعادة التنفس ، وضغط مجرى الهواء الإيجابي ثنائي المستوى (تهوية مجرى الهواء الإيجابية غير الغازية) ، أو التهوية الميكانيكية وبدون أدوية ضغط وتصفية الكرياتينين # x0003e30 مل / دقيقة وناقل أمين ألانين بمقدار & # x0003c5 أضعاف الحد الأعلى لـ عادي
شديد مع التخلص من الذخائر المتفجرةقنية أنفية عالية التدفق ، أو قناع غير قابل لإعادة التنفس ، أو ضغط مجرى هوائي إيجابي ثنائي المستوى (تهوية إيجابية لمجرى الهواء) ، أو تهوية ميكانيكية وأدوية الضغط أو تصفية الكرياتينين لـ & # x0003c30 أو علاج استبدال كلوي جديد أو ألانين aminotransferase من & # x0003e5 أضعاف العلوي حد طبيعي

الجدول التكميلي & # x000a06

ديموغرافيات مجموعة الاكتشاف الأساسية ، الخصائص السريرية ، والنتائج


شاهد الفيديو: لن تصدقوا ماذا يفعل الكلب قبل وفاته. لو شاهدته قلبك يتقطع من الأحساس!! (أغسطس 2022).