معلومة

هل يمكنك ضرب مستقبلات معينة في شخص بالغ؟


عذرًا ، ليس لدي فهم جيد لهذا الموضوع ، لكنني أعتقد أن "خروج المغلوب للمستقبل" مرتبط / بجزء من "خروج المغلوب الجيني"؟

وإذا فهمت بشكل صحيح ، فإن الضربة القاضية للجينات غير ممكنة حاليًا في شخص بالغ (ربما يكون ذلك ممكنًا في منطقة صغيرة / عضو معين ، ولكن ليس بشكل منهجي)؟

فهل يعني ذلك أن خروج المستقبل الجهازي غير ممكن وربما يكون ممكنًا في مناطق محددة صغيرة؟


اجابة قصيرة: نعم هذا ممكن.

ولكن هناك بعض المتطلبات لنظام التسليم الخاص بك. يقصد بمصطلح "Gene knockout" ("gene KO") تعديل الحمض النووي بشكل دائم (يتم توريثه بواسطة ذرية الخلية) وضار بوظيفة الجينات (على سبيل المثال ، لم يعد يتم إنتاج البروتين).

لذلك يجب أن يقوم نظامك بإيصال "عامل طفرة" الحمض النووي إلى جميع الخلايا (من كائن حي أو منطقة محددة صغيرة). يمكن القيام بذلك باستخدام الفيروسات ، على سبيل المثال ، نظام CRISPR / Cas9 لتحرير الجينوم. الفكرة هي أن الفيروس سوف يدخل الخلية ، ويبدأ في التعبير عن عنصر لتحرير الجينوم ، ويتكاثر ويصيب الخلايا المجاورة. يمكن أن يؤدي التعديل في الفيروس إلى جعله غير قاتل وأقل ضررًا ، لذلك لا تقتل الأنسجة أثناء العملية. يمكن أن يكون توصيل الفيروس خاصًا بالموقع (مثل الحقن المباشر في المنطقة) ، وقد يكون أيضًا خاصًا بنوع الخلية إذا كان الفيروس مصممًا وفقًا لذلك.

تذكر أيضًا أن تقنية CRISPR / Cas9 وغيرها من التقنيات المماثلة لها كفاءة أقل بكثير من 100٪ وأيضًا أن لديك نسختين من نفس الجين. هذا يعني أن إجمالي احتمال KO يذهب كمربع من احتمالية KO لنسخة واحدة. إذا كان الاحتمال لحدث واحد هو 50٪ ، فسيكون 25٪ لكليهما ؛ 10٪ تصبح 1٪.

لذلك ، كل العناصر الأساسية لمثل هذه التجربة موجودة بالفعل.


إشارات TGF-في بيولوجيا الأوعية الدموية والخلل الوظيفي

عامل النمو المحول (TGF) - أفراد الأسرة عبارة عن سيتوكينات متعددة الوظائف تستحث تأثيرها على الخلايا ، بما في ذلك الخلايا البطانية والجدارية ، عبر النوع الأول والنوع الثاني من مستقبلات سيرين / ثريونين كيناز وعوامل النسخ داخل الخلايا. كشفت نماذج الفأر الضاربة لمكونات مسار إشارات عائلة TGF-β أهميتها الحاسمة في تكوين الأوعية الدموية في الكيس المحي. وقد ربطت الدراسات الجينية التي أجريت على البشر الطفرات في مكونات الإشارات هذه بمتلازمات قلبية وعائية معينة مثل توسع الشعيرات النزفي الوراثي وارتفاع ضغط الدم الرئوي الأولي ومتلازمة مارفان. في هذه المراجعة ، نقدم التطورات الحديثة في فهمنا لدور إشارات مستقبلات TGF-في بيولوجيا الأوعية الدموية والمرض ، ونناقش كيف يمكن تطبيق ذلك للعلاج.


يلعب موقع المستقبلات دورًا رئيسيًا في وظيفتها

يوجد في القلب نوعان فرعيان مختلفان من مستقبلات بيتا الأدرينالية - بيتا 1 وبيتا 2 - والتي يتم تنشيطها بواسطة هرمونات التوتر الأدرينالين والنورادرينالين. كلاهما يطلق أقوى تحفيز لمعدل ضربات القلب وقدرة الضخ التي نعرفها. النوعان الفرعيان متشابهان للغاية من الناحية الكيميائية الحيوية ، لكنهما يختلفان بشكل كبير من حيث علاقتهما الوظيفية والعلاجية.

يمكن لكلا النوعين من المستقبلات تحفيز القلب على المدى القصير ، ولكن عندما يتم تنشيط مستقبل بيتا 1 على مدى فترة طويلة من الزمن ، يكون له مجموعة من التأثيرات التي لا تظهر مع بيتا 2. يمكن أن يثير Beta1 عددًا من التغييرات المستمرة ويتمتع بالقدرة على بدء نمو خلايا عضلة القلب - الضار في كثير من الأحيان - عن طريق تنشيط الجينات المختلفة.

ألقت الدراسات الحديثة التي أجراها باحثون في جامعتي W & uumlrzburg و Erlangen ، ومركز Max Delbr & uumlck للطب الجزيئي في جمعية Helmholtz (MDC) في برلين ، ومعهد العلوم البيولوجية ISAR في ميونيخ-بلانيج الضوء الآن على الآليات الكامنة وراء هذه التأثيرات المختلفة. نشرت فرق البحث نتائج عملها في العدد الحالي من المجلة وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم.

الروابط الخاصة وطرق الفحص المجهري الجديدة

يوضح البروفيسور مارتن لوهس من معهد علم الأدوية والسموم في جامعة Julius Maximilians في W & uumlrzburg (JMU). وهو مؤلف مشارك في الدراسة إلى جانب الدكتور باولو أنيبالي ، الذي يشغل منصب رئيس مختبر إشارات مستقبلات MDC بالإنابة. يوضح أنيبالي: "يتم التعبير عن المستقبلات الذاتية عند مستويات منخفضة نسبيًا". "لاكتشاف حركتهم ، كان من الضروري استخدام شكل من أشكال التحليل الطيفي بناءً على تحليل تقلبات التألق الدقيقة للإشارة."

أظهر هذا أن مستقبلات بيتا 1 توجد على السطح الكامل لخلايا عضلة القلب ، بينما توجد مستقبلات بيتا 2 حصريًا في هياكل معينة في هذه الخلايا تسمى الأنابيب التائية. من خلال غزو سطح الخلية ، تخلق هذه الأنابيب شبكة تشبه الأنابيب تمر عبر الجزء الداخلي الكامل من خلايا عضلة القلب. ويضيف أنيبالي: "أحد محاور البحث لفريقنا في مركز تطوير العيادات هو العلاقة بين وظيفة المستقبل والتوطين تحت الخلوي". "لذا فإن البيئة الفيزيائية الحيوية للأنابيب التائية ذات الأغشية المنحنية تهمنا بشكل خاص."

لا تحتوي كل خلايا عضلة القلب على مستقبلات بيتا 1

يوضح لوهس: "يفسر الموقع الخلوي المحدد لمستقبلات بيتا 2 سبب امتلاكها نطاقًا وظيفيًا أضيق بكثير من مستقبلات بيتا 1 ولماذا تقتصر على التنبيه المباشر وقصير المدى للقلب". يتم التوسط في هذا التحفيز بواسطة إشارات مقيدة محليًا بغشاء الخلية. في المقابل ، يحدث تنشيط الجين وتحفيز نمو الخلايا عبر إشارات بعيدة المدى لا يمكن تشغيلها إلا على سطح الخلية ، حيث توجد مستقبلات بيتا 1 فقط.

من النتائج المدهشة الأخرى للدراسة أنه لا تحتوي جميع خلايا عضلة القلب على هذه المستقبلات. قال لوهسي: "يبدو أن هناك أنواعًا أو حالات مختلفة من خلايا عضلة القلب ، لذلك لا تستجيب كل الخلايا للأدرينالين". حتى الآن ، كان من المفترض أن تكون خلايا عضلة القلب في الغرف الكبيرة متشابهة.

هدف جديد لعلاج قصور القلب

من المعروف منذ سنوات عديدة أنه في حالات قصور القلب المزمن ، يدور الكثير من الأدرينالين والنورادرينالين في مجرى الدم ويحفز القلب لدرجة أنه يسبب تغيرات في القلب ونمو خلاياه. هذا يعوض في البداية عن قصور القلب ، ولكن على المدى الطويل يؤدي النمو المفرط إلى إتلاف القلب. لذلك ، استنادًا جزئيًا إلى النتائج السابقة التي توصل إليها فريق W & uumlrzburg ، أصبح منع مستقبلات بيتا هو العلاج المقبول لفشل القلب المزمن.

تظهر النتائج الجديدة الآن لماذا تلعب مستقبلات بيتا 1 دورًا أكبر بكثير في إنتاج هذه الآثار السلبية من مستقبلات بيتا 2. يتم تحديد مستقبلات بيتا 1 على سطح الخلية بالكامل ، مما يتيح لها أن يكون لها تأثير أكثر تنوعًا من مستقبلات بيتا 2. يمكن استغلال المعرفة الجديدة حول التوطين التفاضلي والتأثيرات الوظيفية المتميزة لمستقبلات بيتا 1 وبيتا 2 في القلب لتطوير علاجات أفضل لفشل القلب المزمن. هذه من شأنها أن تمنع بشكل انتقائي الآثار الضارة لمستقبلات بيتا (مثل نمو خلايا عضلة القلب) ، بينما تعمل في نفس الوقت على تنشيط التأثيرات المفيدة (مثل تحفيز وظائف القلب).


تكشف الفئران القاضية عن دور رئيسي للخلايا الظهارية السنخية من النوع الأول في إزالة السوائل السنخية

ينتج عن نقل الأيونات النشط بواسطة Na-K-ATPase الأساسي (مضخة Na) تدرج Na + الذي يدفع امتصاص السوائل عبر الظهارة السنخية الرئوية. تعد الوحدات الفرعية α1 و β1 أكثر الوحدات الفرعية لمضخة Na التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في الخلايا الظهارية السنخية (AEC). تم التحقيق في المساهمة المحددة للوحدة الفرعية 1 والمساهمات النسبية للخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني (AT2) مقابل الخلايا من النوع الأول (AT1) في تصفية السائل السنخي (AFC) باستخدام خطي خروج مغلوب من نوع الخلية خاص بالفأر حيث كانت الوحدة الفرعية 1. خرجت إما في خلايا AT1 أو في كل من خلايا AT1 و AT2. انخفض AFC بشكل ملحوظ في كلا خطي خروج المغلوب ، مما كشف ، كما نعتقد لأول مرة ، أن خلايا AT1 تلعب دورًا رئيسيًا في AFC وتوفر رؤى حول الأدوار الخاصة بـ AEC في التوازن السنخي. أظهرت طبقات AEC الأحادية المشتقة من فئران خروج المغلوب انخفاضًا في تيار الدائرة القصيرة وامتصاص Na + نشط ، بما يتوافق مع في الجسم الحي الملاحظات. لم يؤدي فرط الأكسجة ولا إصابات الرئة التي يسببها جهاز التنفس الصناعي إلى زيادة نسب وزن الرئة من الرطب إلى الجاف في الرئتين بالضربة القاضية مقارنةً بالتحكم في الرئتين. أظهرت الفئران الضربة القاضية زيادات في مضخة Na β3 تعبير الوحدة الفرعية و β2تعبير مستقبلات الأدرينالية. توضح هذه النتائج دورًا حاسمًا للوحدة الفرعية لمضخة Na β في الأيونات السنخية ونقل السوائل وتشير إلى أن خلايا AT1 و AT2 تقدم مساهمات كبيرة في هذه العمليات وفي AFC. علاوة على ذلك ، فهم يدعمون جدوى اتباع نهج عام لتغيير الوظيفة الظهارية السنخية بطريقة خاصة بالخلية تتيح رؤى مباشرة للأدوار الخاصة بخلايا AT1 مقابل الأدوار الخاصة بخلايا AT2 في الرئة.

توضح هذه الدراسة دورًا مهمًا للوحدة الفرعية Na-K-ATPase β1 في النقل الأيوني وتصفية السوائل السنخية وأن خلايا AT1 تساهم بجزء كبير من تصفية السائل السنخي في الرئة. آليات التعويض التي تنطوي على زيادة مستويات 3 الوحيدات وكذلك β2يمكن تنشيط التعبير البروتيني لمستقبلات الأدرينالية استجابةً لحذف الوحدة الفرعية β1.

تشكل ظهارة الرئة السنخية ، المكونة من الخلايا الظهارية السنخية من النوع الأول (AT1) والنوع الثاني (AT2) ، حاجزًا محكمًا يحد من تسرب المواد المذابة والماء من المقصورات الخلالية والأوعية الدموية إلى الفراغات الهوائية السنخية. يعتمد تنظيم استتباب السائل السنخي على النقل الأيوني النشط عبر الظهارة السنخية (1). يعد التوطين المستقطب ووظيفة قاعدة Na-K-ATPase القاعدية (مضخة Na) وقنوات الصوديوم القمية (2) ذات أهمية حاسمة في نقل أيون بطريق الظهارة وإزالة السوائل المصاحبة عبر الحاجز الظهاري السنخي (3 ، 4).

من المفترض أن خلايا AT2 ، على الرغم من تغطية 2.5٪ فقط من السطح السنخي (5) ، تساهم في الجزء الأكبر من نشاط النقل في الظهارة السنخية ، على أساس القناة العالية وكثافة المضخة في هذا النوع من الخلايا (6). ومع ذلك ، فإن خلايا AT1 تعبر عن كل من قناة الصوديوم الظهارية (ENaC) وبروتينات الوحدة الفرعية Na-K-ATPase (7-9) ، بالإضافة إلى تغطية مساحة سطح كبيرة ، تتمتع بنفاذية عالية جدًا للماء (10). لذلك من المحتمل أن تقدم خلايا AT1 مساهمة مهمة في تصفية السائل السنخي (AFC) (11 ، 12) ، على الرغم من أن المساهمات النسبية لخلايا AT1 و AT2 في نقل الأيونات و AFC في الرئة غير معروفة تمامًا.

تحفز مضخة Na النقل النشط لـ Na السيتوبلازمي في مقابل K خارج الخلية على سطح الخلية القاعدية (13 ، 14). Na-K-ATPase عبارة عن وحدة غير متجانسة مكونة من وحدة فرعية واحدة α وواحدة وواحدة γ. تؤوي الوحدة الفرعية α الوظيفة التحفيزية لمضخة Na ، في حين أن الوحدة الفرعية مهمة في نضوج الهيكل ووظيفة الإنزيم الهولندي ونقله وتوطينه في غشاء الخلية (15). وظيفة الوحدة الفرعية أقل وضوحًا ، لكن التجارب أظهرت دورًا تعديليًا لنشاط مضخة Na وتقارب أيون خاص بالأنسجة ، على أساس التعبير التفاضلي للوحدات الفرعية المختلفة (بروتينات FXYD) في الأنسجة المختلفة (16) . يتم التعبير عن الوحدة الفرعية β1 بشكل كبير في كل من خلايا AT1 و AT2 (17) ، ويُعتقد أن مضخات Na المكونة من وحدات فرعية α1 و β1 هي الإيزوزيم السائد المعبر عنه في كلا النوعين من الخلايا (18 ، 19) ، على الرغم من التعبير عن الوحدة الفرعية α2 في تم الإبلاغ عن خلايا الرئة وخلايا AT1 (12). عدد من في الجسم الحي تقدم الدراسات المستندة إلى الإفراط في التعبير عن الوحدة الفرعية لمضخة Na β1 في رئتي القوارض دليلاً لدعم دور مهم لهذه الوحدة الفرعية في وظيفة مضخة Na و AFC ، سواء عند خط الأساس أو أثناء إصابة الرئة (19-24). تم إظهار التعبير عن الوحدة الفرعية β3 في رئة الفئران (25) ، لكن دور هذه الوحدة الفرعية في الرئة غير معروف إلى حد كبير. سريريًا ، في المرضى الذين يعانون من إصابات الرئة الحادة / متلازمة الضائقة التنفسية الحادة ، ترتبط القدرة على المستويات الأعلى من AFC بنتائج أفضل (26 ، 27).

كانت الأهداف الأساسية لهذه الدراسة هي توضيح أدوار الوحدة الفرعية لمضخة Na β1 في النقل النشط للأيونات عبر الظهارة و AFC ولتحديد الإسهامات النسبية لخلايا AT1 مقابل خلايا AT2 في هذه العمليات. أنشأنا سطرين للماوس بالضربة القاضية الشرطية للوحدة الفرعية β1 في خلايا AT1 أو في كل من خلايا AT1 و AT2 في رئة الماوس. سمح لنا هذا النهج بتقييم مساهمة الوحدة الفرعية 1 بشكل مباشر في الجسم الحي ونعتقد للمرة الأولى ، أن نتحرى على وجه التحديد دور النوعين المختلفين من الخلايا الظهارية السنخية (AEC) في الوظيفة السنخية. تم الإبلاغ عن بعض نتائج هذه الدراسات سابقًا في شكل ملخص (28-30).

الفئران التي لديها أليل مفلوكسي لمضخة Na β1 جين الوحدة الفرعية (ATP1b1 تم إنشاء F / F) (ارى ملحق على الإنترنت). موجز، ATP1b1 و / واو تم عبور الفئران إلى Aqp5- كري الفئران (31) لتوليد ATP1b1 Aqp5-cre الفئران التي تعاني من نقص في الوحدة الفرعية -1 في خلايا AT1 ، وإلى Sftpc- كري الفئران (32) لتوليد ATP1b1 Sftpc- كري الفئران التي تعاني من نقص في الوحدة الفرعية -1 في الظهارة السنخية بأكملها (أي خلايا AT1 و AT2). تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها في جامعة جنوب كاليفورنيا.

محلول ملحي مخزّن بالفوسفات يحتوي على 5٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) (Sigma-Aldrich، St. الفئران. تم استنشاق السائل السنخي بعد 30 دقيقة. تم حساب AFC من التألق المقاس في التقطير والنضح.

نفاذية في الجسم الحي تم حسابه بعد حقن الوريد الوداجي بمقدار 10 ملليغرام من فلورسين- BSA (تقنيات الحياة) لكل كيلوغرام من وزن الجسم من مضان تم قياسه بعد ساعتين في سائل غسيل القصبات الهوائية ومصل الدم.

تمت إزالة الرئتين جراحياً ، ووزنها ، ثم تجفيفها عند 65 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تم تسجيل الوزن الجاف وحساب نسب الوزن الرطب إلى الجاف.

تم عزل خلايا AT2 من رئتي الفأر ، وزُرعت طبقات الخلايا الظهارية السنخية الفأرية أحادية الطبقة (MAECM) كما هو موصوف سابقًا (33).

المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (رتي) (kΩ · cm 2) وفرق الجهد العفوي (PD) تم قياس (mV) من MAECM باستخدام جهاز Millicell-ERS (Millipore ، Bedford ، MA) في اليوم السادس بعد تحول خلايا AT2 إلى نمط ظاهري يشبه خلية AT1. تيار ماس كهربائى مكافئ (أناالمعادل) (μA / سم 2) حسب PD/رتي. PD وقصر الدائرة الحالية (أناSC) (μA / سم 2) في غرف استخدام معدلة في وجود أو عدم وجود تيربوتالين ، أميلوريد ، وبيموزيد.

تم قياس التدفق أحادي الاتجاه لـ Na عبر MAECM عند 37 درجة مئوية باستخدام 22 NaCl (المواد الكيميائية المشعة الأمريكية ، سانت لويس ، MO).

يتم توفير التفاصيل المتعلقة بالطرق والأجسام المضادة المستخدمة في الملحق عبر الإنترنت.

تم استخدام الطرق القياسية كما هو موضح في الملحق على الإنترنت.

يتم وصف طرق التلوين ومعلومات الأجسام المضادة في الملحق عبر الإنترنت.

يتم توفير التفاصيل المتعلقة بالطرق في الملحق عبر الإنترنت. يتم سرد تسلسل التمهيدي في الجدول 1.

الجدول 1. إنزيم النسخ العكسي الكمي - مواد أولية لتفاعل البوليميراز المتسلسل

تعريف الاختصارات: bp ، زوج القاعدة FP ، التمهيدي الأمامي RP ، التمهيدي العكسي.

تم إيواء الفئران في أقفاص داخل غرفة فرط التأكسج مع 95٪ أكسجين لمدة 65 ساعة.

تم تهوية الفئران المخدرة بجهاز التنفس الصناعي Inspira ASV (جهاز هارفارد ، هوليستون ، ماساتشوستس) تحت ظروف تهوية غير ضارة أو ضارة (ارى ملحق على الإنترنت).

يتم عرض البيانات على أنها تعني ± SEM. الطالب غير المزاوج ر تم استخدام الاختبار لإجراء مقارنات بين اثنين من الوسائل الجماعية. تم تحليل وسائل المجموعة المتعددة (ثلاثة أو أكثر) عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه مع الاختبارات اللاحقة على أساس مناهج Student-Newman-Keuls. ص & lt 0.05 ذات دلالة إحصائية.

لقد أنشأنا خط فأر بأليل شرطي (مفلطح) لـ ATP1b1 الجين (ترميز الوحدة الفرعية Na-K-ATPase β1) لتمكين خروج الجين الخاص بالخلية عن طريق إعادة تركيب Cre / loxP (الشكل 1). الفأر ATP1b1 يحتوي على ستة أكواد exon 1 للمجال السيتوبلازمي لبروتين الوحدة الفرعية Na-K-ATPase β1 ، والجزء الأول من أكواد exon 2 لمجال الغشاء. ما تبقى من أكواد الجينات للمجال خارج الخلية الكبير الذي يشكل 243 من 305 حمض أميني في هذا البروتين. نحيط به إكسون 4 من ATP1b1 مع مواقع loxP لإنشاء أليل شرطي لهذا الجين (ATP1b1 و / واو ) ( شكل 1 ). ينتج عن حذف Cre / loxP بوساطة exon 4 طفرة تحول الإطار بعد ربط exon 3 إلى exon 5. لتوضيح أهمية الوحدة الفرعية β1 في توازن سائل رئة الفأر البالغ وأهميتها النسبية في خلايا AT1 مقابل خلايا AT2 ، أنشأ سطرين منفصلين ، أحدهما يؤوي ضربة قاضية مشروطة β1 على وجه التحديد في خلايا AT1 باستخدام Aqp5- كري الفئران (31) وواحد تم تعطيل نشاط β1 في كل من خلايا AT1 و AT2 (خروج المغلوب الخاص بالظهارة السنخية) باستخدام Sftpc- كري الفئران (32). يشار إلى هذين الخطين بالضربة القاضية باسم ATP1b1 Aqp5- كري و ATP1b1 Sftpc- كري ، على التوالى. تم تحليل خطوط الضربة القاضية للتحقق من حذف جين الوحدة الفرعية لمضخة Na β1 (ارى ملحق على الإنترنت). الجينوم PCR (ارى أكد الشكل E1A في الملحق عبر الإنترنت) أن الفلوكسيد ATP1b1 يمكن حذف الأليل بشكل صحيح عن طريق إعادة تركيب Cre / loxP. أكد التحليل الغربي (الشكل E1B) أن بروتين Na لمضخة 1 كان غائبًا في خلايا AT2 المعزولة من ATP1b1 Sftpc- كري الفئران بالضربة القاضية. أكدنا (الشكل E1C) ذلك Aqp5- كري ينشط تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) من أ روزا طن متري / ملغ التحوير المراسل على وجه التحديد في خلايا AT1 في الظهارة السنخية وأن كفاءة تنشيط المراسل بوساطة Cre / loxP عالية جدًا (& gt 90٪ من خلايا AT1) (31). أخيرًا ، أكدنا ذلك Sftpc- كري ينشط تعبير GFP في ملف روزا طن متري / ملغ التحوير المراسل في كل من خلايا AT1 و AT2 ، على الرغم من أن إشارة GFP أقوى بشكل كبير في خلايا AT2 ، مما يعكس جزئيًا بنية خلية AT1 الرقيقة جدًا في الجسم الحي (الشكل E1C).

شكل 1. استراتيجية استهداف الجينات. ان ATP1b1 تم إجراء ناقل استهداف الجينات عن طريق floxing exon 4 ، وإدخال علامة اختيار إيجابية PGK-Neo R أعلى موقع 3 ′ loxP ، ووضع HSV-tk علامة اختيار سلبية في موضع 3′ المرافقة في الجزء الجينومي. ال ATP1b1 تم إدخال ناقل استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية W2 (ES) ، وتم التعرف على الحيوانات المستنسخة التي خضعت لإعادة التركيب المتماثل بواسطة لطخة جنوبية باستخدام مسبار مرافقة (3 ′ FP) يربط شظية Xba I بحجم 6.5 كيلو بايت من الأليل المستهدف و 10.2 جزء -kb من أليل من النوع البري. ثم تم التحقق من النسخ الإيجابية بواسطة PCR ، مع تضخيم الاشعال جزء 3.0 كيلو بايت على الجانب 5 من الأليل المستهدف. بعد التنميط النووي للنسخات الإيجابية للخلايا الجذعية الجنينية ، تم إنتاج الفئران الكيميرية. تم تربيتها الكيميرات الناقلة للخط الجرثومي إلى فئران FLPeR لإزالة علامة الاختيار PGK-Neo R المحاطة بـ FRT ، مما أدى إلى توليد الفئران التي تأوي الفوهة النهائية. ATP1b1 أليل (ATP1b1 و / واو ). يؤدي حذف Cre / loxP بوساطة exon 4 إلى إنشاء أليل محذوف (ATP1b1 Δexon4 ) مع طفرة خارج الإطار تعطل تسلسل التشفير في exons 5 و 6 (ه 5 و ه 6). FRT ، هدف التعرف على flippase PGK ، محفز فوسفوجليسيرات كيناز WT ، النوع البري.

قمنا بقياس AFC في خطي خروج المغلوب للوحدة الفرعية β1 (ATP1b1 Aqp5- كري و ATP1b1 Sftpc- كري ) ومقارنتها مع الفئران ذات الصلة بالتحكم في القمامة المفلطحة (ATP1b1 و / واو ). AFC في ATP1b1 Aqp5- كري أظهرت الفئران الناقصة ، التي تعاني من نقص في الوحدة الفرعية β1 تحديدًا في خلايا AT1 ، أهمية عالية (ص = 0.006) انخفاض (43٪) في الاتحاد الآسيوي مقارنة مع ATP1b1 و / واو الفئران (الشكل 2 أ). ATP1b1 Sftpc- كري كشفت الفئران الخاضعة للمغادرة ، والتي تفتقر إلى الوحدة الفرعية β1 في كل من خلايا AT1 و AT2 ، عن انخفاض AFC ، والذي كان بشكل ملحوظ (ص = 0.002) انخفض بنسبة 78٪ مقارنة بفئران التحكم (الشكل 2 ب). توضح هذه البيانات أن الوحدة الفرعية لمضخة Na β1 لها أهمية حاسمة في AFC بعد تقطير السوائل وأن خلايا AT1 و AT2 تقدم مساهمات كبيرة في AFC في رئة الفأر البالغ. يمكن تقدير جزء AFC المنسوب إلى خلايا AT1 و AT2 بنسبة 55٪ (أي 43/78 = 0.55) و 45٪ (أي [78-43] / 78 = 0.45) ، على التوالي ، بافتراض أن AT1 / تتشابه نسب عدد خلايا AT2 في الفئران الخاضعة للتحكم والفئران بالضربة القاضية على أساس الفحص النسيجي للرئتين من فئران التحكم المحببة وكلا الخطين بالضربة القاضية التي لم تظهر أي اختلافات شكلية واضحة (الشكل E2). AFC في ATP1b1 Aqp5- كري و ATP1b1 Sftpc- كري من المحتمل أن تعتمد الفئران التي خرجت قاضية (57٪ و 22٪ ، على التوالي ، بالنسبة لفئران التحكم المفلطحة) على النقل النشط للصوديوم بسبب نشاط مضخة الصوديوم المتبقية.

الشكل 2. تصفية السوائل السنخية (AFC) ، نفاذية الرئة ، ونسبة الوزن الرطب إلى الجاف للرئة (W / D) في β1 فئران بالضربة القاضية. (أ) AFC (٪ لكل ساعة) في ATP1b1 Aqp5- كري الفئران (13.6 ± 1.5) (ن = 7) انخفض بشكل ملحوظ مقارنة مع ATP1b1 و / واو الفئران (23.7 ± 2.6) (ن = 7). (ب) AFC (٪ لكل ساعة) في ATP1b1 Sftpc- كري الفئران (6.6 ± 1.5) (ن = 4) انخفض بشكل ملحوظ مقارنة مع ATP1b1 و / واو الفئران (29.8 ± 4.2) (ن = 4). (ج و د) لم يكن هناك فرق كبير في في الجسم الحي نفاذية لألبومين المصل البقري فلوريسئين بين ATP1b1 و / واو (0.248 ± 0.047) (ن = 6) و ATP1b1 Aqp5- كري الفئران (0.232 ± 0.055) (ن = 7) (ج) أو بين ATP1b1 و / واو (0.196 ± 0.020) (ن = 6) و ATP1b1 Sftpc- كري الفئران (0.227 ± 0.038) (ن = 6) (د). (ه و F) في الأساس ، W / D من ATP1b1 و / واو (4.37 ± 0.15) (ن = 8) مقابل ATP1b1 Aqp5- كري (4.38 ± 0.05) (ن = 12) الفئران (ه) وبناءا على ATP1b1 و / واو (3.84 ± 0.08) (ن = 6) مقابل ATP1b1 Sftpc- كري (3.88 ± 0.08) (ن = 6) الفئران (F) لم تكن مختلفة بشكل كبير. **ص & لتر 0.01. NS ، لا تختلف اختلافًا كبيرًا عن بعضها البعض (ص & GT 0.05).

للتحقق مما إذا كانت الرئتان β1 الخارجتان عن المسار قد غيّرتا نفاذية الخلايا المجاورة التي قد تساهم في تقليل AFC ، قمنا بحقن fluorescein-BSA في الوريد الوداجي للفئران المصابة بالفلوكس والضربة القاضية. كما هو مبين في الشكلين 2C و 2 D ، لم تكن نفاذية الرئة إلى fluorescein-BSA مختلفة في 1 الفئران بالضربة القاضية مقارنة بفئران التحكم المفلطحة. تمشيا مع هذه النتائج ، الرئتين على حد سواء ATP1b1 Aqp5- كري و ATP1b1 Sftpc- كري كان لدى الفئران نسب وزن رطبة إلى جافة لم تكن مختلفة عن فئران التحكم الخاصة بها (الشكلان 2E و 2F) ، مما يشير إلى أنه ، في كل من خطوط خروج المغلوب للوحدة الفرعية ، يكون نشاط مضخة الصوديوم المتبقي كافياً للحفاظ على توازن سائل الرئة.

خصائص الكهرباء الحيوية (رتي و أناالمعادلتم تقييمها في الطبقة الواحدة للخلايا الظهارية السنخية للماوس (MAECM) المحضرة بزراعة خلايا AT2 المعزولة حديثًا والمشتقة من ATP1b1 و / واو السيطرة و ATP1b1 Sftpc- كري الفئران بالضربة القاضية. كما هو مبين في الشكل 3 أ ، رتي من ATP1b1 و / واو السيطرة و ATP1b1 Sftpc- كري لم تكن الطبقات الأحادية بالضربة القاضية في اليوم السادس مختلفة بشكل كبير. فى المقابل، أناالمعادل من ATP1b1 Sftpc- كري تم تخفيض الطبقات الأحادية بالضربة القاضية بشكل ملحوظ مقارنة مع ATP1b1 و / واو طبقات أحادية التحكم ، بما يتفق مع النتائج في الجسم الحي (الشكل 3 ب) ودعم الملاحظة التي مفادها أن الوحدة الفرعية لمضخة Na β1 تلعب دورًا مهمًا في النقل الأيوني النشط عبر MAECM.

الشكل 3. الخواص الكهربية الحيوية وامتصاص الصوديوم من β1 بطبقة من الخلايا الظهارية السنخية أحادية الطبقة بالضربة القاضية (MAECM). (أ) المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (رتي) عير ATP1b1 و / واو MAECM (1.72 ± 0.09 كيلو أوم · سم 2) (ن = 42) لا تختلف اختلافًا كبيرًا مقارنةً بـ ATP1b1 Sftpc- كري MAECM (1.95 ± 0.11 كيلو أوم · سم 2) (ن = 45). (ب) تيار ماس كهربائى مكافئ (أناالمعادل) كان أقل بشكل ملحوظ في ATP1b1 Sftpc- كري MAECM (3.81 ± 0.11 μA / سم 2) (ن = 45) مقارنة بـ ATP1b1 و / واو MAECM (7.00 ± 0.18 μA / سم 2) أناالمعادل (ن = 42). (ج) كانت تدفقات Na أحادية الاتجاه في الاتجاه القمي إلى القاعدي (A → B) أقل بكثير في ATP1b1 Sftpc- كري MAECM ، في حين أن التدفقات في الاتجاه القاعدي إلى القمي (B → A) لم يتغير (ن = 3). (د) صافي امتصاص الصوديوم + ATP1b1 و / واو و ATP1b1 Sftpc- كري MAECM (ن = 3) كانت مختلفة بشكل كبير ، مع امتصاص أقل في الطبقات الأحادية بالضربة القاضية. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001.

لمزيد من التقييم المباشر لنقل الأيونات النشط عبر ATP1b1 و / واو السيطرة و ATP1b1 Sftpc- كري تم تحديد الضربة القاضية MAECM ، وتدفق الصوديوم أحادي الاتجاه وصافي امتصاص الصوديوم تحت ظروف التدرج الكهربائي الصفري (أي ، ماس كهربائى) في غرف الاستخدام. يوضح الشكل 3 ج التدفق أحادي الاتجاه Na + في كل اتجاه (على سبيل المثال ، قمي إلى قاعدي جانبي [A → B] و Basolateral إلى قمي [B → A]). في كل من طبقات التحكم والطبقة الأحادية الضربة القاضية ، كان تدفق Na أحادي الاتجاه في الاتجاه A → B أكبر بكثير من ذلك في الاتجاه B → A. كان للطبقات الأحادية الضربة القاضية تدفق Na أحادي الاتجاه أقل بكثير في الاتجاه A → B (ص & lt 0.01) وتدفق Na + أحادي الاتجاه غير متغير في الاتجاه B → A ، مقارنة بطبقات التحكم الأحادية. كان صافي خط الأساس لامتصاص Na + للطبقات الأحادية بالضربة القاضية أقل بكثير من طبقة التحكم الأحادية (الشكل 3D). لم يكن امتصاص صافي الصوديوم في السيطرة والطبقات الأحادية الضربة القاضية مختلفًا بشكل كبير عن معدل نقل الأيونات النشط المرصود (أي ، أناSC) أثناء قياسات تدفق الصوديوم (لم تظهر البيانات) ، مما يشير إلى أن صافي امتصاص الصوديوم المقدر يمثل معظم نقل الأيونات النشط المرصود عبر MAECM.

تؤوي شركة الإلكترونيات المُتقدّمة قنوات كاتيونية غير انتقائية حساسة للأميلوريد القمي وحساسة للنيوكليوتيدات الحلقية (CNG) (4). لتحديد ما إذا كان الضربة القاضية للوحدة الفرعية لمضخة Na β1 لها أي تأثيرات على هذه القنوات الأيونية ، تم علاج MAECM بمثبطات قناة ENaC أو CNG ، وتم تقييم الخصائص الكهروضوئية. أدت إضافة أميلوريد إلى سائل قمي إلى انخفاض سريع بنسبة 70٪ في أناSC لكل من التحكم والضربة القاضية MAECM (الشكلان 4 أ و 4 ب). أدى العلاج اللاحق باستخدام بيموزيد قمي (10 ميكرومتر) في 60 دقيقة إلى انخفاض إضافي طفيف في أناSC من كلا الطبقتين. عندما تمت إضافة بيموزيد مثبط CNG أولاً ، أناSC من كل من الطبقات الأحادية الضابطة والضربة القاضية انخفضت تدريجياً بنسبة 45 ٪ (الشكلان 4C و 4 D). عندما تمت إضافة أميلوريد (10 ميكرومتر) لاحقًا إلى سائل قمي ، أناSC من كلتا الطبقتين الأحاديتين بسرعة أكبر بنسبة 35٪. تشير هذه البيانات إلى أن وظيفة قنوات الصوديوم القمية تظل دون تغيير في β1 بالضربة القاضية MAECM.

الشكل 4. تيار الدائرة القصيرة (أناSC) استجابة لأميلورايد وبيموزيد. (أ و ب) عند t = 0 ، تمت إضافة أميلوريد (10 ميكرومتر) إلى سائل قمي من (أ) ATP1b1 و / واو MAECM (ن = 3) و (ب) ATP1b1 Sftpc- كري MAECM (ن = 3). بعد 60 دقيقة ، تمت إضافة بيموزيد (10 ميكرومتر) إلى سائل قمي. (ج و د) عند t = 0 ، تمت إضافة بيموزيد (10 ميكرومتر) إلى سائل قمي من (ج) ATP1b1 و / واو MAECM (ن = 3) و (د) ATP1b1 Sftpc- كري MAECM (ن = 3). بعد 60 دقيقة ، تمت إضافة أميلوريد (10 ميكرومتر) إلى سائل قمي.

على الرغم من أن AFC المتبقي في كلا خطي خروج المغلوب 1 كان كافياً للحفاظ على توازن سوائل الرئة الطبيعي في الرئة غير المتصدية ، قمنا بتقييم ما إذا كان نقص AFC في الفئران التي تعاني من نقص في الوحدة الفرعية 1 قد أثر على قابليتها لإصابة الرئة من فرط الأكسجة أو إصابة الرئة التي يسببها جهاز التنفس الصناعي. (فيلي). طورت جميع الحيوانات زيادة في نسب وزن الرئة من الرطب إلى الجاف بعد التعرض للأكسجين و 95٪ لمدة 65 ساعة (الشكل 5 أ) ، ولكن لم يحدث ذلك. ATP1b1 Aqp5- كري ولا ATP1b1 Sftpc- كري أظهرت الفئران بالضربة القاضية نسب مختلفة عن ATP1b1 و / واو تعرضت الفئران الضابطة لنفس الظروف التجريبية. الفئران على حد سواء ATP1b1 و / واو و ATP1b1 Sftpc- كري يتم تهوية الأنماط الجينية ميكانيكيًا لمدة 3 ساعات مع ذروة ضغط الشهيق 40 سم ساعة2كان O وبدون ضغط الزفير الموجب أعلى بشكل ملحوظ في نسب وزن الرئة من الرطب إلى الجاف مقارنة بالفئران المهواة في ظروف غير ضارة عند 20 سم H2O ، أيضًا بدون ضغط الزفير الموجب (الشكل 5 ب) ، ولكن لم يكن هناك فرق كبير في نسب الوزن الرطب إلى الجاف بين فئران التحكم والفئران بالضربة القاضية بعد VILI.

الشكل 5. W / D في الفئران المعرضة لفرط الأكسجة أو تعرضت لإصابة الرئة التي يسببها جهاز التنفس الصناعي (VILI). (أ) لم يكن W / D مختلفًا بشكل كبير بين الفئران المصابة بالفلوكس والضربة القاضية بعد الإصابة بفرط التأكسج (65 ساعة في & GT95 ٪ أكسجين). W / D في ATP1b1 و / واو و ATP1b1 Aqp5- كري كانت الفئران 6.70 ± 0.22 مقابل 6.66 ± 0.09 (ن = 3) وفي ATP1b1 و / واو و ATP1b1 Sftpc- كري كانت الفئران 6.47 ± 0.30 مقابل 5.96 ± 0.40 (ن = 3). (ب) لم يلاحظ أي فرق كبير في W / D بين الأنماط الجينية بعد أي من غير ضار (PIP = 20 سم H2O) أو ضارة (PIP = 40 سم ارتفاع2س) التهوية. W / D في ATP1b1 و / واو و ATP1b1 Sftpc- كري كانت 4.70 ± 0.11 مقابل 4.72 ± 0.02 (ن = 3) بعد التهوية غير الضارة و 6.12 ± 0.17 مقابل 6.57 ± 0.26 (ن = 5) بعد VILI. PIP ، ذروة ضغط الشهيق. **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001.

على حد سواء ATP1b1 Aqp5- كري و ATP1b1 Sftpc- كري كان لدى الفئران التي خرجت قاضية نسب وزن رئة رطبة إلى جافة طبيعية عند خط الأساس (الشكلان 2E و 2 F) ، مما يشير إلى أن نشاط Na-K-ATPase المتبقي كان كافياً للحفاظ على توازن السوائل. الوحدة الفرعية لمضخة Na β3 هي ثاني أعلى وحدة فرعية معبرًا عنها في إلغاء الصدى الصوتي. كشف التحليل الغربي عن زيادة تعبير البروتين β3 في خلايا AT2 المعزولة حديثًا المشتقة من ATP1b1 Sftpc- كري أظهرت الفئران (الشكلان 6 أ و 6 ب) ، وتلطيخ الأجسام المضادة لـ MAECM من الفئران بالضربة القاضية زيادة في التعبير عن بروتين الوحدة الفرعية β3 مقارنةً بالتحكم في MAECM (الشكلان 6 ج و 6 د) ، على الرغم من التعبير عن الوحدة الفرعية β3 عند مستوى الرنا المرسال في الرئة بأكملها ، وخلايا AT2 المعزولة حديثًا ، أو MAECM لم يتغير (الأشكال 6E-6H). مستويات التعبير النسبي للـ mRNA لجينات الوحدة الفرعية α و في الرئة الكاملة لـ ATP1b1 Aqp5- كري كانت الفئران بالضربة القاضية إما على حالها أو كانت مختلفة بشكل معتدل عن ATP1b1 و / واو السيطرة على الرئتين ، بينما في ATP1b1 Sftpc- كري بالضربة القاضية للرئتين ، لوحظ انخفاض أكثر جوهرية في مستويات RNA للوحدة الفرعية (الشكل 6F) ، على الأرجح بسبب حذف الجين β1 في الظهارة بأكملها. بصورة مماثلة، ATP1b1 Sftpc- كري أظهرت خلايا AT2 بالضربة القاضية و MAECM تعبيرًا أقل بكثير للوحدة الفرعية (الشكلان 6G و 6H). تم الحصول على التعبير عن بروتين الوحدة الفرعية لمضخة Na α1 في خلايا AT2 من ATP1b1 Sftpc- كري لم تتغير الفئران بالضربة القاضية ، في حين كان بروتين الوحدة الفرعية 1 غائبًا (الشكل 6 أ). قد يساهم التعبير المتزايد عن بروتين الوحدة الفرعية β3 في AFC المتبقي في ATP1b1 Sftpc- كري الفئران بالضربة القاضية.

الشكل 6. التعبير عن الوحدات الفرعية لمضخة Na في فئران الصوديوم β1 بالضربة القاضية. (أ) تكشف اللطخات الغربية التمثيلية أن الوحدة الفرعية لمضخة Na α1 لم تتغير ، ولم يكن 1 قابلاً للاكتشاف ، وزاد β3 في الخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني (AT2) من الفئران التي خرجت من القاضية. يبدو أن الشريط العلوي في لطخة β1 غير محدد. (ب) أدى حذف الوحدة الفرعية لمضخة Na β1 إلى زيادة كبيرة في بروتين 3 في خلايا AT2 المعزولة منها ATP1b1 Sftpc- كري (KO) مقارنة مع ATP1b1 و / واو (F / F) الفئران (ن = 3). (ج و د) تلطيخ الأجسام المضادة لـ MAECM (يوم 6) لمضخة Na β3 وحدة فرعية في ATP1b1 و / واو خلايا (ج) و ATP1b1 Sftpc- كري خلايا (د) يُظهر زيادة التعبير في MAECM المتولدة من β 1 من الفئران بالضربة القاضية. (هح) تعبير مرنا نسبي لجينات الوحدة الفرعية α و في الرئة الكاملة من (ه) ATP1b1 Aqp5- كري و (F) ATP1b1 Sftpc- كري الفئران (ن = 4) و (جي) خلايا AT2 معزولة (ن = 3) و (ح) MAECM من ATP1b1 Sftpc- كري الفئران (ن = 3). المستويات مرتبطة بالتعبير في ATP1b1 و / واو التحكم في الرئة ، وخلايا AT2 المعزولة ، أو MAECM. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص & lt 0.001.

عندما تمت إضافة terbutaline إلى التقطير في تجارب AFC ، زاد AFC بشكل ملحوظ في كليهما ATP1b1 Aqp5- كري و ATP1b1 Sftpc- كري الفئران بالضربة القاضية ، ووصلت إلى مستويات قريبة من تلك التي تم قياسها ATP1b1 و / واو الفئران الضابطة (+ تيربوتالين في الشكلين 7 أ و 7 ب). كان هذا على النقيض من AFC في غياب terbutaline ، والذي أظهر انخفاضًا ملحوظًا في AFC في كل من الفئران بالضربة القاضية (−Terbutaline في الشكلين 7 أ و 7 ب). للتحقيق في احتمال أن تكون هذه الملاحظات ناتجة عن تعبير أعلى عن β2مستقبلات الأدرينالية (β2AR) في الفئران بالضربة القاضية ، أجرينا التحليل الغربي للرئة بأكملها. كما هو موضح في الشكلين 7C و 7 D ، β2كانت مستويات البروتين AR أعلى بشكل ملحوظ في رئتي الفئران من كلا الخطين بالضربة القاضية مقارنة بتلك الموجودة في الفئران الضابطة ، مما قد يساهم في زيادة الاستجابة لتحفيز تيربوتالين و AFC المتبقي في ATP1b1 Aqp5- كري و ATP1b1 Sftpc- كري الفئران بالضربة القاضية.

الشكل 7. AFC في غياب أو وجود تحليل terbutaline والغربي β2مستقبلات الأدرينالية (β2AR) التعبير في مضخة Na β1 الفئران بالضربة القاضية. (أ) أظهرت قياسات AFC في غياب تيربوتالين انخفاض AFC في ATP1b1 Aqp5- كري مقابل الفئران الضابطة. في المقابل ، يحفز تيربوتالين AFC في ATP1b1 Aqp5- كري وصلت الفئران إلى 22.5 ± 2.6٪ في الساعة (ن = 4) ، والذي لم يكن مختلفًا بشكل كبير عن ATP1b1 و / واو الفئران الضابطة (27.3 ± 4.7٪ في الساعة ، ن = 4). (ب) كان AFC في غياب تيربوتالين أقل بكثير في ATP1b1 Sftpc- كري مقابل الفئران الضابطة ، في حين أن AFC المحفز بالتيربوتالين في ATP1b1 Sftpc- كري كانت الفئران 30.9 ± 1.0٪ في الساعة (ن = 4) ، والذي لم يكن مختلفًا بشكل كبير عن ATP1b1 و / واو الفئران الضابطة (36.4 ± 2.9٪ في الساعة ، ن = 4). (ج و د) التحليل الغربي لـ β2بروتين AR في الرئة الكاملة في (ج) ATP1b1 Aqp5- كري و (د) ATP1b1 Sftpc- كري تُظهر الفئران تعبيرًا متزايدًا في كلا الخطين بالضربة القاضية مقارنةً بـ ATP1b1 و / واو السيطرة على الفئران. *ص & lt 0.05 **ص & لتر 0.01.

قمنا بإنشاء وتحليل سطرين من الماوس يؤويان خروج المغلوب للوحدة الفرعية Na-K-ATPase β1 ، إما في خلايا AT1 فقط (ATP1b1 Aqp5- كري الفئران) أو في كل من خلايا AT1 و AT2 (ATP1b1 Sftpc- كري الفئران) في الرئة. تم تخفيض AFC بنسبة 78 ٪ في ATP1b1 Sftpc- كري الفئران ، التي تقدم دليلاً على الدور المهم للوحدة الفرعية -1 في ظل ظروف حجم السائل السنخي الزائد. كما تم تخفيض AFC بشكل كبير في ATP1b1 Aqp5- كري الفئران (بنسبة 43 ٪) ، مما يشير إلى أن خلايا AT1 هي مساهم رئيسي في نقل الأيونات النشط وما يرتبط به من إزالة السوائل (∼55 ٪ من إجمالي AFC) في رئة الفأر. لم تكن هناك تغييرات في نفاذية الرئة في الفئران التي تعاني من نقص في مضخة Na β1.على الرغم من انخفاض نقل الأيونات النشط وانخفاض AFC ، كان لكل من خطي خروج المغلوب نسب وزن رطبة إلى جافة طبيعية عند خط الأساس ، ولم يلاحظ أي اختلافات في نسب وزن الرئة من الرطب إلى الجاف بين الأنماط الجينية بعد فرط التأكسج أو VILI. أظهر تحليل الخواص الكهربية الحيوية للطبقات الأحادية من AEC المستزرعة أن الخلايا الشبيهة بـ AT1 التي تعاني من نقص في مضخة الصوديوم β1 ظهرت بشكل ملحوظ في انخفاض امتصاص الصوديوم النشط و أناالمعادلأناSC) ، بما يتفق مع الملاحظة التي مفادها أن الفئران التي خرجت قاضية لم تكن قادرة على تنظيف السوائل بنفس معدل فئران التحكم المفلطحة وإثبات أن الوحدة الفرعية -1 مهمة للغاية بالنسبة لـ AFC. أخيرا، في المختبر كشف التحليل أن رتي لم يتأثر بنقص MAECM في الوحدة الفرعية β1 ، بما يتوافق مع النفاذية غير المتغيرة في الرئتين بالضربة القاضية.

في الشكل 6E ، الذي يُظهر مستويات التعبير عن الوحدة الفرعية في الرئة الكاملة في فئران خروج المغلوب الخاصة بخلايا AT1 ، لم يصل الانخفاض في 1 mRNA إلى دلالة إحصائية. بالنظر إلى حقيقة أن خلايا AT2 موجودة بأعداد أكبر من خلايا AT1 في الرئة (∼2: 1) (5) ، يمكن توقع تأثير محدود نسبيًا على مستويات التعبير عن الرئة الكاملة β1 في رئة خروج المغلوب الخاصة بخلايا AT1. من الممكن أيضًا أن يختلف مستوى التعبير β1 لكل خلية بين الخلايا البرية من النوع AT1 و AT2. إذا كان المستوى أعلى في خلايا AT2 ، فسيساهم هذا أيضًا في الانخفاض المحدود الواضح في 1 mRNA في الرئتين الكاملة لفئران خروج المغلوب الخاصة بخلايا AT1. إن الزيادة التعويضية في التعبير 1 في خلايا AT2 في الفئران المعزولة الخاصة بخلايا AT1 سيكون لها نفس التأثير لإخفاء مستوى الرنا المرسال المنخفض في خلايا AT1 عند تحليل التعبير في الرئة بأكملها. كانت مستويات الرنا المرسال المنخفضة للوحدات الفرعية α1 و α2 و 2 في خلايا AT2 المعزولة حديثًا الموضحة في الشكل 6G صغيرة نسبيًا ولكنها مع ذلك مهمة. على مستوى البروتين ، تمكنا من اكتشاف α1 ، والذي لم يتغير بشكل كبير (الشكل 6 أ) ، في حين أن بروتينات α2 و 2 كانت غير قابلة للاكتشاف. من الدراسات الأخرى التي تتضمن الوحدات الفرعية لمضخة الصوديوم ، من المعروف أن التغيرات في مستوى الرنا المرسال لا تنعكس دائمًا على مستوى البروتين (على سبيل المثال ، يتم زيادة الوحدة الفرعية β1 على مستوى الرنا المرسال في رئة الفئران المعرضة لفرط التأكسج ، في حين لم تكن هناك زيادة مقابلة في بروتين β1. وجدت [34]).

أظهرت الفئران β1 الخاصة بالضربة القاضية الخاصة بخلايا AT1 انخفاضًا بنسبة 43 ٪ في AFC ، بينما أظهرت الحيوانات التي تفتقر إلى 1 في كل من خلايا AT1 و AT2 انخفاضًا بنسبة 78 ٪ في AFC. كما هو مذكور أعلاه ، تشير هذه النتائج إلى أن جزءًا كبيرًا (55 ٪) من AFC في الرئة يتم تحريكه عادةً بواسطة خلايا AT1 ، مما يوفر ، كما نعتقد ، أول دليل مباشر يدعم مساهمة كبيرة لخلايا AT1 في AFC في الرئة . بالنظر إلى أن عدد خلايا AT2 في الرئة أكبر من عدد خلايا AT1 (5) ، فإن مساهمة AFC لكل خلية AT1 أكبر من عدد خلايا AT2. تتناقض هذه النتيجة مع الافتراض السابق بأن خلايا AT2 مسؤولة عن معظم نقل الأيونات (والسوائل المصاحبة) في الرئة (6). ومع ذلك ، نظرًا لأن المساحة الإجمالية لخلايا AT1 أكبر بكثير من مساحة خلايا AT2 (فرق 73 ضعفًا في رئة الفئران [5]) ، فمن المحتمل أن تكون كثافة مضخات Na لكل خلية AT2 أعلى بكثير من تلك الموجودة في كل خلية AT1. في هذه الحسابات للمساهمة النسبية في AFC من خلايا AT1 و AT2 ، افترضنا أن β1 تم إخراجه بكفاءة وبالمثل في كل من خلايا AT2 و AT1 في ATP1b1 Sftpc- كري بالضربة القاضية ، والذي من المحتمل أن يكون بسبب سفتبك المروج يقود كري يبدأ التحوير في التعبير مبكرًا أثناء نمو الرئة (35) و ATP1b1 وبالتالي سيتم حذف الجين في أسلاف كل من خلايا AT2 و AT1 (36). الشكل E1C (اللوحة اليمنى) يُظهر التنشيط الفعال لمراسل Cre بوساطة ، مما أدى إلى تعبير GFP في كل من خلايا AT1 و AT2 ، على الرغم من أن التعبير أضعف بشكل كبير في خلايا AT1. لأن بروتين مراسل GFP myristoylated المشفر بواسطة روزا طن متري / ملغ يتم إدخال الجينات المعدلة وراثيًا في غشاء البلازما ، ومن المتوقع أن تؤدي كمية متساوية من GFP معبر عن كل خلية في خلايا AT2 و AT1 إلى إشارة أضعف في خلايا AT1 نظرًا لمساحة سطح الخلية الأكبر بشكل ملحوظ. عند مقارنة خطي خروج المغلوب وحساب المساهمات النسبية لخلايا AT1 و AT2 ، افترضنا كفاءة خروج قاضية متساوية في خلايا AT1 في الخطين على أساس تنشيط المراسل الفعال في خلايا AT1 في كليهما. Aqp5 كري روزا طن متري / ملغ و سفتبك كري روزا طن متري / ملغ (الشكل E1C ، اليسار و اللوحة اليمنى، على التوالى).

تتحول خلايا AT2 المعزولة بالماوس المزروعة على مرشحات من البولي كربونات إلى خلايا تشبه AT1 ، وتشكل طبقات أحادية وظيفية عالية رتي مناسبة لتوصيف النقل الأيوني والخصائص الكهروضوئية (33). بالنظر إلى أن الوحدة الفرعية لمضخة Na هي الوحدة الفرعية الأكثر تعبيرًا في الرئة ، افترضنا أن الضربة القاضية ATP1b1 من شأنه أن يؤدي إلى انخفاض النقل النشط Na +. أظهر نقص MAECM في الوحدة الفرعية -1 صافي امتصاص الصوديوم أقل مقارنةً بـ MAECM من الفئران المصابة بالفلوكس. هذه النتائج ، التي توضح أهمية الوحدة الفرعية لمضخة Na β1 لنقل الأيونات في الخلايا الشبيهة بـ AT1 في الثقافة ، تتوافق مع النتائج التي توصلنا إليها في الجسم الحي في ATP1b1 Aqp5- كري الفئران التي أدى فيها حذف β1 تحديدًا في خلايا AT1 إلى انخفاض كبير في AFC. في تجارب لتقييم الاستجابات في MAECM لمثبط لقنوات ENaC (أميلوريد) أو CNG (بيموزيد) ، وجدنا تثبيطًا نسبيًا لنقل الأيونات النشط في الفئران بالضربة القاضية والتحكم ، مما يشير إلى أن نقص الوحدة الفرعية β لا يغير المساهمات النسبية لهذه القنوات لنقل أيون بطريق الظهارة. ومع ذلك ، لأنه من المعروف أن بيموزيد يؤثر على D.2-مستقبلات الدوبامين ، لا يمكننا استبعاد احتمال حدوث تأثيرات بيموزيد المرصودة أناSC قد تكون مختلفة بين الأنماط الجينية. زيادة التعبير عن الوحدة الفرعية β3 و β2AR في MAECM لم تكن كافية لاستعادة النقل الأيوني. على الرغم من الإبلاغ عن أن الوحدات الفرعية β1 في الخلايا المجاورة تتفاعل بشكل مباشر كجزيئات التصاق (37-39) ، رتي لم ينخفض ​​في β1 بالضربة القاضية MAECM. على الرغم من عدم تضمينه في هذه الدراسة ، فإن تقييم الخواص الكهربية الحيوية لـ MAECM المشتق من خلايا AT2 من ATP1b1 Aqp5- كري ستظهر الفئران آثار من جديد حذف β1 الجين. وبالتالي ، سيتم حذف جين الوحدة الفرعية تدريجيًا أثناء عملية تحويل خلايا AT2 إلى خلايا AT1 ، لأن الخلايا المتباينة تبدأ في التعبير عن Aqp5 و كري. في كلا النموذجين بالضربة القاضية ، يعتمد حذف جين الوحدة الفرعية على ملف تعريف التعبير الزماني المكاني للمروج الذي يقود تعبير Cre. Sftpc- كري يتم التعبير عنها بالفعل في أسلاف الرئة المبكرة في الجنين النامي ، بينما Aqp5- كري تصل إلى مستويات تعبير ملموسة في الفترة المحيطة بالولادة. نظرًا لأن جميع الدراسات أجريت على الفئران البالغة ، فقد تكون الآليات التعويضية قد تطورت في كلا خطي خروج المغلوب.

لم نكتشف أي اختلافات في نسب وزن الرئة من الرطب إلى الجاف بين الأنماط الجينية بعد فرط التأكسج أو VILI ، على الرغم من أن نسب وزن الرئة الجافة إلى الرطبة غير حساسة نسبيًا للتغيرات الصغيرة في حجم السائل السنخي. على الرغم من أن بيانات AFC كانت أكثر فائدة ، إلا أن التحديات التقنية حالت دون القياس الدقيق لـ AFC في الرئتين المصابة. قد يكون عدم وجود نسب أعلى لوزن الرئة من الرطب إلى الجاف بعد الإصابة في 1 من الفئران بالضربة القاضية مقابل الفئران الضابطة نتيجة ، جزئيًا ، لزيادة تعويضية في التعبير عن وحدة فرعية لمضخة الصوديوم β3 و / أو تعبير مرتفع عن β2مستقبلات الأدرينالية. تم الإبلاغ عن التعبير عن الوحدة الفرعية β3 في رئتي الفئران الطبيعية (25) ، ولكن لم تكن هناك تقارير عن دورها في إصابة الرئة. تعبير مرتفع عن β2ترتبط المستقبلات الأدرينالية في الفئران بالضربة القاضية بزيادة الاستجابة للتيربوتالين ، مما يدعم دورًا محتملاً للإشارات الأدرينالية كآلية تعويضية في β1 رئة خروج المغلوب. زيادة أعلى (∼4 أضعاف) في AFC استجابةً لتيربوتالين في ATP1b1 Sftpc- كري من المحتمل أن تكون الفئران الخاضعة للمغادرة انعكاسًا لزيادة الإشارات الأدرينالية في كل من خلايا AT1 و AT2 ، لأن كلا النوعين من الخلايا يفتقران إلى β1 في خط الضربة القاضية هذا. في ATP1b1 Aqp5- كري ومع ذلك ، فإن الفئران التي خرجت من قوتها ، 1 مفقودة فقط في خلايا AT1 ، وبالتالي فإن الاستجابة الأدرينالية ستكون أقل وضوحًا (ضعفًا) نظرًا لأن زيادة الإشارات الأدرينالية من المحتمل أن تحدث فقط في خلايا AT1. يعتمد هذا المنطق على افتراض أن زيادة الإشارات الأدرينالية هي استجابة جوهرية في الخلايا التي تفتقر إلى البروتين 1 وأن ​​الاستجابة الأدرينالية المتزايدة موجودة فقط في هذه الخلايا. لم نحقق في مستويات التعبير عن الوحدات الفرعية لمضخة Na في الفئران 1 بالضربة القاضية ، على الرغم من أن تقريرًا حديثًا أظهر تعبيرًا عن جميع الوحدات السبعة. FXYD الجينات (ترميز وحدات فرعية) في الرئة البشرية على مستوى mRNA (40). اقترحت هذه الدراسة أيضًا أن FXYD1 هو منظم سلبي لنشاط مضخة Na وأن زيادة التعبير عن FXYD1 في الرئتين من المرضى الذين يعانون من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة قد يشير إلى دور γ الوحدات الفرعية في النقل الأيوني الناقص وتصفية السوائل.

تظهر هذه النتائج من نوع الخلايا الظهارية الرئوية الخاصة بنوع الخلية الفرعية β1 ، مساهمة كبيرة لخلايا AT1 ، أكبر من تلك الموجودة في خلايا AT2 ، في نقل الأيونات السنخية و AFC. AFC المتبقي في β 1 الفئران بالضربة القاضية للوحدة الفرعية ، ربما تسبب جزئيًا في زيادة التعبير عن الوحدة الفرعية β3 و2AR ، يبدو كافيًا للحفاظ على توازن سوائل الرئة عند خط الأساس. تُظهر هذه الدراسات ، كما نعتقد لأول مرة ، أن أدوار الرئة من إلغاء الصدى الصوتي يمكن معالجتها بطريقة محددة لخلية AT1 مقابل AT2 في الجسم الحي، مما يؤدي إلى تحسين فهم الآثار السريرية المتعلقة بأنواع خلايا معينة في الظهارة السنخية. قد يساعد توضيح المساهمات النسبية لخلايا AT1 و AT2 في الوظيفة السنخية / التوازن في تطوير طرق علاجية جديدة لأمراض الرئة.

يشكر المؤلفون USC Transgenic Core تحت إشراف الدكتور روبرت ماكسون والدكتور نانسي وو على التعاون المثمر لإنشاء ATP1b1 و / واو الفئران الدكتور جوخان موتلو ، جامعة نورث وسترن ، لمشاركة بروتوكولات وخبرات AFC الفأرية بسخاء والدكتور أليسيا ماكدونو ، USC ، لمشاركة الأرانب polyclonal β3 الأجسام المضادة. تم توفير خدمات علم الأنسجة والميكروسكوب من قبل مركز تصوير الخلايا والأنسجة التابع لمركز أبحاث USC لأمراض الكبد (المعاهد الوطنية للصحة P30 DK048522 و S10 RR022508).


المناعة الفطرية المعيبة والالتهاب المفرط في منظم توصيل الغشاء عبر التليف الكيسي لحديثي الولادة & # x2013Knockout Ferret Lungs

يعتبر التصفية المخاطية الهدبية (MCC) والغدد تحت المخاطية من المكونات الرئيسية للمناعة الفطرية لمجرى الهواء والتي لها وظائف ضعيفة في التليف الكيسي (CF). على الرغم من أن كلا النظامين الدفاعيين يتطوران بعد الولادة في النمس ، إلا أن رئتي ابن مقرض حديثي الولادة تظلان عقيمتين في وجود جين منظم لتوصيل غشاء التليف الكيسي. قمنا بتقييم العديد من مكونات المناعة الفطرية في مجرى الهواء والالتهابات في الرئة النمس من التليف الكيسي المبكر. عند الولادة ، لم تختلف معدلات MCC بين الحيوانات CF و non-CF ، ولكن تم تقليل ارتفاع سائل سطح مجرى الهواء بشكل كبير في القوارض حديثي الولادة CF. كانت قوارض التليف الكيسي قد أضعفت مركز عملائي بعد 7 أيام من العمر ، على الرغم من المعدلات الطبيعية للتكوين الهدبي. تم استئصال القوارض فقط غير المجهزة بالتليف الكيسي الزائفة أدخلت مباشرة إلى الرئة بعد الولادة ، في حين أن كلا النمطين الجيني يمكن القضاء عليهما المكورات العنقودية. كان لسائل غسل القصبات الهوائية (BALF) نشاط أقل بكثير من مضادات الميكروبات بشكل انتقائي ضد الزائفة من non-CF BALF ، والتي كانت غير حساسة للتغيرات في الأس الهيدروجيني والبيكربونات. الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي وتحليل السيتوكين لـ BALF من الحيوانات القيصرية المعقمة وغير المعقمة المولودة بشكل طبيعي أظهرت الاضطرابات المرتبطة بالتليف الكيسي في IL-8 و TNF-α و IL-والمسارات التي تتحكم في المناعة والالتهابات ، بما في ذلك النظام التكميلي ، وظائف البلاعم ، هدف الثدييات لإشارات الرابامايسين ، وعامل بدء حقيقيات النوى 2. ومن المثير للاهتمام ، أنه أثناء انتقال الولادة ، تم تحفيز IL-8 بشكل انتقائي في CF BALF ، على الرغم من عدم وجود اختلاف في النمط الجيني في الحمل البكتيري بعد الولادة بوقت قصير. تشير هذه النتائج إلى أن قوارض التليف الكيسي حديثة الولادة بها عيوب في كل من المناعة الفطرية والإشارات الالتهابية التي قد تكون مهمة في البداية المبكرة لأمراض الرئة وتطورها في هذه الحيوانات.

النماذج الحيوانية هي أدوات لا تقدر بثمن للتحقيق في التسبب في مرض التليف الكيسي (CF) في الرئة. في هذه الدراسة ، قمنا بتمييز العديد من مكونات المناعة الفطرية في الرئة والالتهابات في منظم التوصيل عبر الغشاء التليف الكيسي - القوارض عند الولادة. لقد وجدنا أن المجاري التنفسية للمواليد الجدد تعاني من الجفاف ، وغير قادرة على القضاء على البكتيريا بسبب النشاط المضاد للميكروبات المستقل عن الرقم الهيدروجيني لإفرازات الرئة ، ولديها مسارات إشارات التهابية غير منتظمة في الرئة قبل الولادة وبعد التعرض للبكتيريا لأول مرة أثناء الولادة.

لا يزال مرض الرئة هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في التليف الكيسي (CF) ، وهو مرض تسببه عيوب في قناة كلوريد منظم توصيل الغشاء عبر التليف الكيسي (CFTR) (1). يفترض أحد نماذج التسبب في أمراض مجرى الهواء في التليف الكيسي أن غياب CFTR يؤدي إلى فرط نشاط قناة الصوديوم الظهارية وجفاف الطبقة المحيطة بالطبقة المخاطية والمخاط ، وهذا يخلق بيئة تجعل الضرب الهدبي غير فعال ، مما يضر بإزالة المخاط الهدبي (MCC) وتعزيز الاستعمار البكتيري (2-4). تستدعي النماذج المحتملة الأخرى دورًا مباشرًا أكثر لـ CFTR ، مع وجود عيوب في القتل المناعي الفطري للبكتيريا الناتجة عن تركيزات متغيرة من الكلوريد (5) أو البيكربونات (6) في السائل السطحي لمجرى الهواء بسبب النقل المعتمد على CFTR المعيب.

بالإضافة إلى MCC ، يمتلك مجرى الهواء العديد من آليات الدفاع المناعي الفطرية الأخرى التي تم العثور عليها ، أو افتراضها ، على أنها معيبة في التليف الكيسي (7 ، 8). تعد البروتينات المضادة للميكروبات والجزيئات الصغيرة التي تفرزها ظهارة مجرى الهواء أو الغدد تحت المخاطية (SMGs) ضرورية للدفاع عن مجرى الهواء ، وقد تتأثر وظيفيًا بفقدان CFTR (9-13). تلعب العدلات والضامة والخلايا التغصنية أيضًا أدوارًا مهمة في الاستجابة المناعية الخلوية لمسببات الأمراض الغريبة في الرئة ، وتشير الأدلة المتزايدة إلى أن وظائف مضادات الميكروبات لهذه الخلايا تتعرض للخطر في التليف الكيسي (7 ، 8 ، 14-17). على الرغم من هذه المؤشرات على أن العديد من جوانب الجهاز المناعي الفطري معرضة للخطر بشكل مباشر في التليف الكيسي ، فإن التكرار الوظيفي للمسارات المناعية الفطرية يجعل من الصعب تحديد مدى مساهمة كل مكون معيب في مرض الرئة التليف الكيسي.

ساعدت التطورات الأخيرة بشكل كبير مجال أبحاث التليف الكيسي في التحقيق في هذه الآليات من خلال إنشاء نماذج الخنازير والنمس CF (18). يتطور كلا النموذجين الحيوانيين من مرض رئوي تدريجي مشابه للإنسان المصاب بالتليف الكيسي ، بما في ذلك زيادة سماكة المخاط وانسداد المجاري الهوائية واستعمار الرئة بواسطة أنواع عديدة من البكتيريا (19-21). ومع ذلك ، يبدو أن النمس التليفزيوني أكثر حساسية بكثير لعدوى الرئة البكتيرية في فترة حديثي الولادة المبكرة ، مما يتطلب مضادات حيوية متعددة للبقاء على قيد الحياة حتى الفطام (20 ، 21). تولد الخنازير بظهارة مجرى هوائي مهدبة و SMGs مطورة بالكامل. على النقيض من ذلك ، تفتقر القوارض إلى الخلايا الهدبية و SMGs في مجاريها الهوائية عند الولادة ، وكلاهما يتطور خلال الشهر الأول من الحياة (22). نظرًا للاعتماد الكبير لرئة النمس حديثي الولادة على CFTR للوقاية من الالتهابات البكتيرية ، افترضنا أن هذا النموذج يوفر فرصة لتشريح الآليات الجديدة للدفاع المضيف التي قد تكون ذات صلة بالمجرى الهوائي البعيد في البشر التليف الكيسي (أي عدد أقل من الخلايا الهدبية ونقص من SMGs). افترضنا أيضًا أنه نظرًا لتطور الخلايا الهدبية و SMGs في مجرى الهواء النمس بعد الولادة ، فإن آليات المناعة الفطرية المعتمدة على CFTR في رئة هذا النوع تعتمد على خصائص سائل سطح مجرى الهواء (ASL). في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم مكونات متعددة للجهاز المناعي الفطري لحديثي الولادة ورئة النمس CF للجنين المتأخر. حددنا العديد من العيوب المهمة في المناعة الفطرية لرئة النمس حديثي الولادة ، بما في ذلك ارتفاع ASL ، وإفراز ووظيفة البروتينات المضادة للميكروبات ، وقتل البكتيريا. علاوة على ذلك ، حددت بروتينات سائل غسيل القصبات الهوائية (BALF) وتحليل السيتوكين اضطرابًا كبيرًا في مسارات الالتهاب والمناعة في رئة التليف الكيسي بعد الولادة الطبيعية. ومن المثير للاهتمام أن البروتينات والتحليل الخلوي لـ BALF المعقمة من قوارض الولادة القيصرية (C-sectioned) تشير إلى أن الاضطرابات في مسارات الالتهاب قد توجد في رئة التليف الكيسي قبل الولادة وتهيئ الرئة للالتهاب المفرط بعد التعرض البكتيري الأول. بشكل عام ، تكشف نتائجنا أن رئة نمس التليف الكيسي لحديثي الولادة بها العديد من عيوب المناعة الفطرية التي لا تعتمد على إزالة مجرى الهواء أو SMGs ، وتتصاعد الاستجابة الالتهابية للتعرض البكتيري المبكر عند الولادة.

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجان رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة أيوا. ال CFTR تم وصف قوارض القوارض (إكسون -10 المعطلة) المستخدمة في هذا التقرير سابقًا (20 ، 21 ، 23) وتم استخدامها إما بعد الولادة القيصرية أو في نقاط زمنية مختلفة بعد الولادة الطبيعية. للتفاصيل، ارى التكميلية M aterials و M ethods في الملحق عبر الإنترنت.

تم حصاد BALF من القوارض عن طريق جمع غسل متتالي من 5 ٪ مانيتول. تم تحديد مستويات IL-1β و IL-8 و TNF-α في BALF بواسطة ELISA. تم تحديد تركيزات أكسيد النيتريك (NO) في CF و non-CF ferret BALF باستخدام محلل أكسيد النيتريك Sievers 280i (الأدوات التحليلية GE ، بولدر ، CO). كما تم معالجة عينات BALF وتعريضها للكروماتوجرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS / MS). تم تحليل مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية باستخدام Scaffold (برنامج Proteome ، Portland OR) وتحليل مسار الإبداع (Ingenuity Systems ، Redwood City ، CA). للتفاصيل، ارى التكميلية M aterials و M ethods في الملحق عبر الإنترنت.

تم تلوين أقسام القصبة الهوائية من أجل الليزوزيم واللاكتوفيرين عن طريق التألق المناعي ، وتم تحليلها باستخدام الفحص المجهري الفلوري. تم تحليل عينات BALF من حديثي الولادة أو القوارض البالغة لوجود الليزوزيم واللاكتوفيرين واللاكتوبيروكسيديز (LPO) وبروتين الفاعل بالسطح (SP) -A بواسطة لطخة ويسترن. للتفاصيل، ارى التكميلية M aterials و M ethods في الملحق عبر الإنترنت.

تم تقييم معدلات MCC على القصبة الهوائية النمس خارج الجسم الحي عن طريق قياس حركة حبات الفلورسنت 1.0 ميكرومتر على سطح التجويف. كما تم تحليل القصبة الهوائية خارج الجسم الحي بواسطة التصوير المقطعي التوافقي البصري للمجال الطيفي الدقيق في جامعة ألاباما (برمنغهام ، ألاباما). للحصول على وصف مفصل لهذه الإجراءات ، ارى التكميلية M aterials و M ethods في الملحق عبر الإنترنت.

تم إجراء تجارب التحدي البكتيري في الجسم الحي بعد الحقن داخل الرغامى في قوارض حديثي الولادة ، و في المختبر عن طريق احتضان البكتيريا مع BALF المعزولة من CF وغير CF القوارض. للحصول على وصف مفصل لهذه الإجراءات ، ارى التكميلية M aterials و M ethods في الملحق عبر الإنترنت.

شرعنا أولاً في اختبار الفرضية القائلة بأن القصبة الهوائية النمس CF قد قللت من MCC على مدار الوقت الذي يحدث خلاله التكوّن الهدبي وتشكل SMG. كان التكوّن الهدبي خلال الأسابيع الثلاثة الأولى من الحياة متشابهًا بين الأنماط الجينية ، حيث تقدم من حوالي 7 ٪ إلى أكثر من 50 ٪ تغطية للظهارة مع الأهداب بين الولادة و 3 أسابيع من العمر ، على التوالي (الشكل 1 أ). كانت معدلات MCC في الحيوانات حديثي الولادة منخفضة للغاية ، ولم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين الأنماط الجينية في الحيوانات التي تتراوح أعمارها بين 0 و 3 أيام (الشكل 1 ب). ومع ذلك ، بين الأسبوعين الثاني والثالث من العمر ، كانت هناك زيادات كبيرة في معدلات MCC القصبة الهوائية للقوارض غير CF ، ولكن ليس الحيوانات CF (الشكل 1B). كانت معدلات MCC أقل بنسبة 3.4 و 8.1 أضعاف في الحيوانات CF (مقارنة مع غير CF) في نقاط زمنية تطورية تقابل حوالي 30 ٪ (7-12 يومًا) وحوالي 60 ٪ (13-24 د) تغطية أهداب من ظهارة القصبة الهوائية ، على التوالي. علاوة على ذلك ، أظهر الانحدار الخطي لمعدلات MCC كدالة للنسبة المئوية ارتباطًا إيجابيًا مهمًا في non-CF (ص & لتر 0.01 ص 2 = 0.5872) ، لكن ليس CF (ص = 0.06 ص 2 = 0.3200) ، حيوانات. تظهر هذه النتائج أن MCC غائب وظيفيًا إلى حد ما في القصبة الهوائية عند الولادة ، مما يشير إلى أن عيوب MCC من المحتمل ألا تساهم في مرض الرئة التليف الكيسي في فترة حديثي الولادة. ومع ذلك ، بحلول 1-3 أسابيع من العمر ، كان ضعف MCC في قوارض التليف الكيسي بالنسبة للحيوانات غير المصابة بالتليف الكيسي كبيرًا ، وبالتالي ، في هذه المرحلة التنموية ، يمكن أن يلعب دورًا محتملاً في التسبب في مرض الرئة.

شكل 1. خواص التليف الكيسي النامي (CF) والقصبة الهوائية غير المصابة بالتليف الكيسي. (أ) التكوّن الهدبي في قوارض حديثي الولادة. تم صبغ أقسام من القصبة الهوائية غير CF و CF في مراحل نمو مختلفة لتوبيولين الأسيتيل لتمييز الأهداب ، وتم تحديد النسبة المئوية للسطح الظهاري الذي تم هده بواسطة الفحص المجهري الفلوري. تم حساب النسبة المئوية للسطح الظهاري الرغامي المغطى بالأهداب لكل فئة عمرية كما هو موصوف. كان عدد الحيوانات في كل فئة عمرية على النحو التالي: اليوم 0 ، غير CF = 11 ، CF = 9 يوم 1 ، غير CF = 9 ، CF = 14 يومًا 2–3 ، غير CF = 7 ، CF = 4 الأيام 4-6 ، غير CF = 3 ، CF = 3 أيام 7-12 ، غير CF = 5 ، CF = 5 ، أيام 13-24 ، غير CF = 5 ، CF = 4. (ب) معدلات إزالة المخاطية المخاطية في القصبة الهوائية (MCC) أثناء التمايز. تم قياس MCC في القصبة الهوائية غير CF والمطابقة للعمر خارج الجسم الحي عن طريق تصوير حركة الخرز الفلوريسنت. تم تقسيم الحيوانات إلى مجموعات حسب العمر كما في (أ) ، وتم حساب متوسط ​​معدلات MCC للحيوانات في كل مجموعة. كان عدد الحيوانات في كل فئة عمرية على النحو التالي: اليوم 0 ، غير CF = 10 ، CF = 10 اليوم الأول ، غير CF = 10 ، CF = 10 أيام 2-3 ، غير CF = 3 ، CF = 4 الأيام 4-6 ، غير CF = 3 ، CF = 3 أيام 7-12 ، غير CF = 10 ، CF = 10 أيام 13-24 ، غير CF = 5 ، CF = 7. شريط الاخطاء تمثل SEM. *ص & lt 0.05 ، ****ص & lt 0.0001 من اختبار Bonferroni متعدد المقارنة اللاحق. (ج و د) يتم تقليل ارتفاع السائل السطحي للمجرى الهوائي (ASL) في القصبة الهوائية حديثي الولادة CF النمس. تم وضع القصبة الهوائية من مجموعات الأطفال حديثي الولادة غير CF و CF على Gelfoam المعدلة من نوع النسر المنقوع في وسط Dulbecco في غرفة رطبة وسمح لها بالتوازن لمدة 30 دقيقة. تم بعد ذلك إجراء التصوير المقطعي التوافقي البصري للمجال الطيفي الدقيق (μOCT) في الاتجاه الطولي ، وتم قياس ارتفاع ASL في تجويف القصبة الهوائية. (ج) صور μOCT تمثيلية من القصبة الهوائية غير CF و CF ، والتي تصور الطبقة الظهارية (ep) وارتفاع ASL (خط عمودي أبيض). أشرطة مقياس في ال الزاوية العلوية اليمنى، 20 ميكرومتر. (د) قطعة أرض لارتفاع ASL في القصبة الهوائية لحديثي الولادة من النوع non-CF و CF. شريط الاخطاء تمثل SEM. **ص = 0.0014 بواسطة اختبار Mann-Whitney U. ن = 12 قصبة هوائية مستقلة لكل نمط وراثي.

في الآونة الأخيرة ، تم تجديد الجدل حول ما إذا كان ارتفاع ASL يساهم في التسبب في مرض الرئة التليف الكيسي من خلال اكتشاف أن ارتفاع السائل المحيطي لا يختلف في التليف الكيسي والخنازير غير المصابة بالتليف الكيسي (24). في السابق ، اقترح آخرون أن وظيفة CFTR ضرورية لترطيب سطح مجرى الهواء اللمعي ، وبالتالي لنقل الغشاء المخاطي السليم (4 ، 25). لتحديد ما إذا كانت عيوب ASL موجودة في قوارض التليف الكيسي ، قمنا بتحليل ارتفاع ASL في الحالة المستقرة في القصبة الهوائية للحيوانات حديثي الولادة (1-2 د قديم) عن طريق التصوير المقطعي التوافقي البصري للمجال الطيفي ذو الدقة الدقيقة ، وهي تقنية تصوير حية تم استخدامها بنجاح لتحديد ارتفاع ASL في عينات مجرى الهواء البشرية والخنازير (26). وجدنا أن إإكسبلنتس القصبة الهوائية من قوارض حديثي الولادة غير CF أظهرت ارتفاعًا ملحوظًا (2.5 ضعف ص = 0.0014) ارتفاع ASL من نظرائهم في CF (الشكلان 1C و 1D). يشير هذا إلى أن ضعف إفراز السوائل أو امتصاص السوائل المعزز يحدث في المسالك الهوائية لقوارض التليف الكيسي ، ويمكن أن يلعب دورًا في تطور أمراض الرئة.

يصاب قوارض التليف الكيسي بعدوى بكتيرية سريعة في الرئة خلال الأسابيع القليلة الأولى من الحياة (20) ، ويلزم استخدام مضادات حيوية متعددة لتربية حيوانات التليف الكيسي إلى الفطام (21). افترضنا أن آليات المناعة الفطرية المسؤولة عن قتل البكتيريا معيبة بطبيعتها في النمس التليفزيوني عند الولادة. لاختبار هذه الفرضية بشكل مباشر ، قمنا بتحدي مجموعات الأطفال حديثي الولادة non-CF و CF مع سلالات مقاومة للمضادات الحيوية من أي منهما الزائفة الزنجارية (PA01) أو المكورات العنقودية الزائفة (تم عزله من رئة نمس بالغين من التليف الكيسي) (21) ومقايسة مباشرة لقتل هذه العوامل الممرضة في الجسم الحي (الشكل 2 أ). في هذه التجربة وفي التجارب التالية ، قمنا بتفسير وحدات CFU البكتيرية المقاسة التي تقل عن المدخلات على أنها قتل إجمالي ، وأعلى من المدخلات كنمو بكتيري شامل أو تكاثر. نجحت الحيوانات غير المليئة بالتليف الكيسي في القضاء على PA01 بالنسبة لمدخلات CFU (انخفاض بمقدار ∼ 100 ضعف ص & lt 0.001) وإلى حد أكبر بكثير (∼ 100 ضعف ص & lt 0.05) من حيوانات CF (الشكل 2 ب). ومع ذلك ، من الملاحظ أن التعداد البكتيري لم يزد في مجموعة التليف الكيسي ، مما يشير إلى عدم حدوث تكاثر بكتيري كبير في الجسم الحي. على النقيض من ذلك ، لاحظنا أن كلا من القوارض حديثة الولادة من غير CF و CF تم قتلها بنجاح S. pseudintermedius بنفس الدرجة (انخفاض بمقدار ∼ 50 ضعفًا ص & lt 0.05) (الشكل 2C). تشير هذه البيانات إلى أن في الجسم الحي يحتوي عيب المناعة الفطري في رئة التليف الكيسي لحديثي الولادة على مكونات خاصة بالبكتيريا.

الشكل 2. تفشل رئة النمس حديثي الولادة من التليف الكيسي في الإشعاع الزائفة الزنجارية. (أ) رسم تخطيطي لمقايسات التحدي البكتيري. تم تحدي مجموعات حديثي الولادة non-CF و CF (من 6 إلى 24 ساعة) عن طريق الحقن داخل الرغامى مع 1.5 × 10 4 CFU من مقاومة الأمبيسلين P. الزنجارية (PA01) أو مقاومة الاريثروميسين المكورات العنقودية الزائفة في الشعب الهوائية لمدة 6 ساعات. ثم تم حصاد أنسجة الرئة والقصبة الهوائية وتجانسها. تم تحديد العدد الإجمالي للـ CFU عن طريق تصفيح التخفيفات التسلسلية لجناسة الرئة على لوحات أجار Luria-Bertani التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة وعدد المستعمرات في اليوم التالي. (ب و ج) مؤامرة من نتائج في الجسم الحي التحدي البكتيري بعد الحقن داخل الرغامى. لكل تجربة ، تم تحديد إدخال CFU أيضًا للتحكم في التباين في أيام مختلفة ، وتم حساب إجمالي CFU للرئة كنسبة مئوية من CFU المدخلات. متوسط ​​المدخلات CFU (100٪) يرمز له بـ a خط على كل رسم بياني. شريط الاخطاء تمثل SEM. *ص & lt 0.05 ، ***ص & lt 0.001 ، باستخدام اختبار Kruskal-Wallis اللامعلمي مع اختبار Dunn للمقارنة المتعددة اللاحق. (ب) ن = 8 حيوانات غير CF ، 12 CF حيوانات (ج) ن = 9 حيوانات غير CF و 6 حيوانات CF.

مجرى الهواء قادر على إفراز مجموعة من العوامل ذات الوظائف المباشرة وغير المباشرة في المناعة الفطرية (27 ، 28). افترضنا أن عيوب CFTR تؤدي إلى انخفاض في إفراز العوامل المضادة للبكتيريا في مجرى الهواء CFTR قبل الولادة وبعدها. لذلك اتخذنا مقاربة البروتينات ، وتحليل تركيبة BALF من المولود الطبيعي (من هنا فصاعدًا يشار إليها باسم حديثي الولادة ، 6-24 ساعة من العمر) والولادة القيصرية ، وتنفس الهواء (يوم الجنين [E] 40-41) مقرض غير CF و CF بواسطة LC-MS / MS. يتم عرض البروتينات المختارة من الحيوانات حديثي الولادة والحيوانات المقطوعة في القسم C والتي تهم هذه الدراسة في الجدول 1 ، ويمكن العثور على القائمة الكاملة في الجدول E1A في الملحق عبر الإنترنت (حديثي الولادة) والجدول E1B (المقطع C). أظهرت نتائج هذا التحليل نسبة مئوية أكبر بكثير من الببتيدات الفريدة والبروتينات في كل من عينة CF BALF لحديثي الولادة وعينة CF BALF التي تمت ملاحظتها في عينات غير CF BALF (الأشكال 3A-3D) ، مما يدل على أن تركيبة البروتين للسوائل في تم تغيير الرئة التليف الكيسي بشكل كبير قبل الولادة وبعدها. كانت الرئوية SP-A و SP-B و SP-C و SP-D من بين البروتينات الأكثر وفرة في BALF حديثي الولادة ، وكانت مرتفعة في CF (الجدول 1 الجدول E1A). كانت وفرة هذه البروتينات الفاعل بالسطح أقل في BALF المقطوعة C وتفتقر إلى الاختلافات الوراثية (الجدول 1 الجدول E1B). تم رفع مستوى اللاكتوفيرين والليزوزيم في الأطفال حديثي الولادة CF BALF ، في حين أن العديد من البروتينات التكميلية ، α1- تم تقليل مضاد التريبسين والبروتين البروتينى A1 فى عينات التليف الكيسي لحديثي الولادة. تم تقليل بعض البروتينات المكملة بالمثل في CF C-sectioned BALF ، لكن البعض الآخر ، مثل C3 و C6 ، كان مرتفعًا. كان اللاكتوفيرين ، بشكل عام ، يتضاءل في CF BALF المقطوع في C ، بينما كان الليزوزيم قابلاً للاكتشاف فقط في واحدة من الأشواط الثلاثة في التليف الكيسي. α1- لم يتغير Antitrypsin و apolipoprotein A1 نسبيًا في CF C المقطع BALF. تم رفع العديد من البروتينات المرتبطة بوظيفة العدلات ، مثل myeloperoxidase و neutrophil elastase و neutrophil collagenase ، إما في CF BALF حديثي الولادة أو غائبة تمامًا في BALF غير CF ولم يتم اكتشاف أي من هذه البروتينات في النمس المقطوع C BALF.

الجدول 1. قياس الطيف الكتلي - البروتينات المحددة في سائل غسيل القصبات الهوائية

تعريف الاختصارات: التليف الكيسي المقطوع بالولادة القيصرية والتليف الكيسي ENSEMBL ، وهو مشروع مشترك بين المعهد الأوروبي للمعلومات الحيوية ومحطة خارجية لمختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي ومعهد ويلكوم ترست سانجر غير قابل للتطبيق.

تم إجراء الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي (MS) ثلاث مرات مستقلة على عينات سائل غسل القصبات الهوائية غير CF و CF من ثلاثة حيوانات مجمعة (في المجموع ، ن = 9 غير CF و ن = 9 حيوانات CF). يتم حساب تغيير الطية ، باستخدام متوسط ​​التغير في كثافة تأين MS ، على أنه CF / non-CF. يشير N / A إلى أنه لم يتم العثور على بروتين في أي من الأنماط الجينية أو أحدها.

* مثبط للاستجابة الالتهابية.

† مكون من مضادات الميكروبات / الدفاع المناعي الفطري.

معدل محتمل لمكونات سائل مجرى الهواء.

§ المكون الهيكلي / المعدل لسائل سطح مجرى الهواء.

الشكل 3. علم البروتينات وتحليل المسار لسائل غسل القصبات الهوائية والقصبات القيصرية لحديثي الولادة والقيصرية (BALF). تم إجراء الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS / MS) على كسور التبادل الكاتيوني القوية لحديثي الولادة (أ, ب, ه، و جي) أو C- مقطوع (ج, د, F، و ح) غير CF و CF BALF. تم تحديد الببتيدات والبروتينات باستخدام Mascot ، ونتائج ثلاث دورات منفصلة على عينات مجمعة من ثلاثة حيوانات من كل نمط وراثي (ن = 9 حيوانات ليست من النوع CF ن = 9 حيوانات CF في المجموع) تم تجميعها في برنامج Scaffold. (أد) مخططات فين تلخص العدد الإجمالي للببتيدات الحصرية وغير الحصرية (أ و ج) والبروتينات (ب و د) في كل تركيب وراثي. ال أرقام غامقة في كل مخطط Venn عدد الببتيدات أو البروتينات المحددة في كل فئة. ال قيم النسبة المئوية الواردة في مخططات Venn تمثل النسبة المئوية للببتيدات أو البروتينات الفريدة التي لوحظت في نمط وراثي معين. (هح) تعرضت قوائم البروتينات من كل نمط وراثي لتحليل المسار المتكامل (Qiagen) للمسارات الكنسية ، باستخدام (ه و F) جميع البروتينات الموجودة في كل نمط وراثي و (جي و ح) البروتينات المحددة حصريًا في نمط وراثي واحد فقط. ال إدراج تخطيطي في كل لوجة يشير إلى مجموعات البروتين التي تم استجوابها. تم تعيين تحديد المسار الإيجابي عند عتبة ص & lt 0.05 (يصور بواسطة خط متقطع في هح اختبار فيشر الدقيق). تم رسم النتائج من المسارات المحددة مقابل −log (ص القيمة). البيانات المستخدمة لتوليد ه و جي، و F و ح يمكن العثور عليها في الجدولين E2B و E2C والجداول E3B و E3C على التوالي. CCR5 ، مستقبلات chemokine (CC motif) 5 Cdc42 ، بروتين التحكم في انقسام الخلية 42 eIF2 ، عامل بدء حقيقيات النوى 2 ILK ، كيناز LXR المرتبط بإنتجرين ، مستقبلات الكبد X mTOR ، هدف الثدييات لـ rapamycin NCF ، non-CF nNOS ، سينثاز أكسيد النيتريك 1 لا ، أكسيد النيتريك ROS ، أنواع الأكسجين التفاعلية RXR ، مستقبلات الريتينويد X.

تشير هذه النتائج البروتينية إلى أن المناعة الفطرية والمسارات الالتهابية قد يتم تنظيمها بشكل مختلف في الرئة التليف الكيسي أثناء الانتقال من العقيم (أي ، في الرحم) إلى بيئة غير معقمة (أي أثناء الولادة وبعدها). باستخدام تحليل مسار الإبداع ، حددنا العديد من الاختلافات الجينية الرئيسية في المسارات الكنسية المشاركة في تنظيم المناعة والاستجابات الالتهابية. على سبيل المثال ، كانت الشبكات التي تم إنشاؤها باستخدام بروتينات CF BALF حديثي الولادة موجهة بشكل أكبر نحو المسارات الالتهابية ، بما في ذلك IL-8 ، هدف الثدييات من الراباميسين (mTOR) ، وإشارات تسرب الكريات البيض ، بالإضافة إلى المسارات ذات الصلة بالبلعم ، مثل البلعمة وإنتاج ال أنواع الأكسجين التفاعلية وأكسيد النيتروجين ، من تلك التي تم إنشاؤها باستخدام بروتينات غير CF لحديثي الولادة (الشكل 3E). لم تكن الاختلافات الوراثية في أهمية هذه المسارات واضحة في BALF المقطوعة C (الشكل 3F) ، مما يدعم المفهوم القائل بأن التعرض البكتيري الأول يؤدي إلى التهاب مفرط في الرئة التليف الكيسي. بالإضافة إلى ذلك ، تم إثراء مسار إشارات عامل بدء حقيقيات النوى 2 (eIF2) ، والذي يرتبط بتحريض البلاعم للسيتوكينات المسببة للالتهابات و NF-B بعد العدوى البكتيرية (29) ، بشكل كبير في حديثي الولادة ، ولكن ليس القسم C ، بروتينات CF BALF (الشكلان 3E و 3F). ومن المثير للاهتمام ، أنه تم تحديد مسارات إشارات mTOR و eIF2 فقط في CF BALF حديثي الولادة عندما تم استجواب البروتينات الحصرية للنمط الجيني (الشكل 3G). في المقابل ، حددت البروتينات المقطوعة C الحصرية للنمط الجيني مسارات إشارات mTOR و IL-17 فقط في إشارات non-CF و Granzyme A (مسار خلية T) فقط في CF ، وكان مسار إشارات eIF2 أكثر أهمية في CF (الشكل 3H ). تضمنت المسارات التي انخفضت أهميتها في CF BALF حديثي الولادة (أي المخصب في مجموعات بيانات البروتين غير CF BALF) النظام التكميلي (مكون مهم للمناعة الفطرية) ، وإشارات استجابة المرحلة الحادة (التي تتضمن تنظيمًا عاليًا للعديد من مثبطات ببتيداز السربين ، مثل α1-antitrypsin) ، وتفعيل مستقبلات الكبد X / مستقبلات الريتينويد X (LXR / RXR) (الشكل 3E) لم تظهر أي من هذه المسارات اختلافات كبيرة في النمط الجيني في ص القيمة باستخدام مجموعات بيانات BALF المقسمة C (الشكل 3F). يعد التنظيم النازل المحتمل لمسار LXR / RXR في CF BALF مثيرًا للاهتمام بشكل خاص ، حيث تم اقتراح الالتهاب المفرط بوساطة NF-κB في CF بسبب ضعف تعبير LXR / RXR في الضامة CF (30). يتم عرض قائمة كاملة بالمسارات الكنسية لحديثي الولادة والمولود C في الجدول E2 و E3 ، على التوالي. لقد قارنا أيضًا بشكل مباشر بالمسارات الكنسية لحديثي الولادة لكل نمط وراثي (الشكل E1). حدد هذا التحليل مرة أخرى التغييرات المرتبطة بـ CF في مسارات الاستجابة الالتهابية ، بما في ذلك إشارات IL-8 و mTOR و LXR / RXR و eIF2 ، والتي كانت مختلفة بشكل فريد عن non-CF (الشكل E1). على سبيل المثال ، باستخدام بروتينات حصرية لنمط وراثي واحد ، انخفضت أهمية مسارات إشارات mTOR و EIF2 بعد الولادة الطبيعية للحيوانات غير المصابة بالتليف الكيسي ، بينما حدث العكس في حيوانات التليف الكيسي (الأشكال E1E-E1F).

باستخدام جداول البيانات التي تشتمل على أسماء البروتين ومتوسط ​​تغير أضعاف في وفرة البروتينات بين الأطفال حديثي الولادة CF وغير CF BALF (الجدول E1A) ، تضمنت المسارات الكنسية البارزة ذات الأهمية العالية ما يلي: (1) تنشيط LXR / RXR (2) إشارات استجابة المرحلة الحادة و (3) نظام مكمل (الشكل E2A جدول E2A). تم تنظيم معظم البروتينات المشاركة في هذه المسارات الكنسية في CF BALF. ومن المثير للاهتمام ، أن أهمية هذه المسارات الثلاثة كانت أعلى في BALF المقطوع C (الشكل E3A والجدول E3A). تم تنظيم معظم البروتينات المحددة في إشارات استجابة المرحلة الحادة ومسارات تنشيط LXR / RXR في الحيوانات المقطوعة في C في التليف الكيسي ، مما يشير إلى وجود تشوهات موجودة مسبقًا في هذه المسارات الالتهابية قبل إصابة الرئة بالتليف الكيسي. تم تقليل معظم البروتينات التي تم تحديدها في حديثي الولادة BALF كجزء من النظام التكميلي في CF (الشكل E2A) ، من المتوقع أن تؤثر هذه التغييرات على عدة أجزاء من كل من المسارات التكميلية الثلاثة (الشكل E2B). ومن المثير للاهتمام ، أنه كانت هناك تعديلات مميزة ومعاكسة للعديد من هذه البروتينات المكملة في CF BALF المقطوعة في C (الشكل E3 والجدول 1) ، مما يشير مرة أخرى إلى أن التعديلات الموجودة مسبقًا في هذا المسار قد تسبق الإصابة.

أجرينا أيضًا تحليلًا للمسار على الأمراض والوظائف البيولوجية باستخدام تغيير الطية الوراثية في وفرة البروتينات من حديثي الولادة (الجدول E4A) أو المقطع C (الجدول E5A) BALF. والمثير للدهشة أن أعلى فئات المرض (حسب ص القيمة) التي تم تغييرها بواسطة النمط الجيني كانت متشابهة إلى حد كبير لكل من حديثي الولادة والمقارنات القيصرية ، وتضمنت الأمراض المناعية ، والأمراض الالتهابية ، والاتجار بالخلايا المناعية (الشكلان E4A و E4B). ومن المثير للاهتمام ، أن وظائف المرض الأكثر ارتفاعًا (حسب الدرجة z) في الأطفال حديثي الولادة CF BALF المتعلقة بالخلايا الليمفاوية والكريات البيض / الهجرة (الشكل E4C) ، في حين أن موت الخلايا وموت الخلايا المبرمج للخلايا الليمفاوية كانا من بين وظائف المرض الأكثر ارتفاعًا في CF BALF المقطوعة ( الشكل E4D). تضمنت العديد من وظائف المرض الأكثر خضوعًا للتنظيم في الأطفال حديثي الولادة CF BALF موت الخلايا المبرمج للخلايا المناعية وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (الشكل E4E) ، في حين كانت وظائف المرض المتعلقة بهجرة وتنشيط الخلايا البالعة والبلاعم والكريات البيض والخلايا الليمفاوية من بين انخفض بشكل ملحوظ (حسب درجة z) في CF C القسم BALF (الشكل E4F). باختصار ، انخفضت الوظائف البيولوجية ذات الصلة التي زادت في حديثي الولادة من التليف الكيسي في الحيوانات المقطوعة بالتليف الكيسي ، و والعكس صحيح.

أظهر تحليل المسار الذي يقارن التغييرات بين الولادة القيصرية والمولود بشكل طبيعي (أي حديثي الولادة) BALF داخل نمط وراثي معين أيضًا أن العديد من الوظائف الحيوية للمرض التي تم تنظيمها من خلال الولادة الطبيعية في حالة عدم التليف الكيسي ، تم تنظيمها في التليف الكيسي ، على وجه الخصوص المتورطين في الاتجار بالخلايا المناعية والهجرة (الجدول E6 والشكل E5 على وجه الخصوص ، ارى الشكل E5E). تشير مقارنات مسارات المرض هذه بين القسم C وحديثي الولادة BALF بقوة إلى أن التغييرات في وظيفة الخلايا المناعية في الرئة التليف الكيسي تسبق العدوى ، وقد تؤدي إلى استجابة التهابية مفرطة بعد التعرض الجرثومي الأول عند الولادة.

لقد اخترنا العديد من البروتينات الموجودة في شاشة LC-MS / MS الخاصة بحديثي الولادة لتحليلها بشكل أكبر عن طريق لطخة مناعية (الشكل 4 أ). أكدت هذه التحليلات أن مستويات الليزوزيم و LPO (مقارنة بالبالغين) كانت منخفضة للغاية أو لا يمكن اكتشافها في BALF للقوارض حديثي الولادة (كلا الطرز الوراثية) ، وبالمثل أكدت وجود اللاكتوفيرين و SP-A. كانت مستويات كل من الليزوزيم واللاكتوفيرين أقل بشكل ملحوظ في BALF من الأطفال حديثي الولادة غير CF و CF مقارنة بالعينات المقابلة من البالغين ، في حين لم يلاحظ أي فرق تنموي كبير في حالة SP-A (الشكل 4 ب). أكد تحليل التألق المناعي لتعبير الليزوزيم في القصبات الهوائية لحديثي الولادة والبالغين نتائج تحليل اللطخة الغربية ، مما يدل على تلطيخ واسع النطاق في SMGs للبالغين ، ولكن لا شيء في الوليد (الشكل 4C). بشكل ملحوظ ، في النمس حديثي الولادة ، كان اللاكتوفيرين موجودًا عند مستويات عالية داخل ظهارة مجرى الهواء السطحي العمودي البسيط ، ولكن في البالغين ، تم ترجمته إلى SMGs (الشكل 4 د). مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن اللاكتوفيرين ، بدلاً من الليزوزيم أو LPO ، قد يكون محددًا مهمًا للمناعة الفطرية في مجرى الهواء النمس النامي.

الشكل 4. تحليل اللطخة المناعية والتألق المناعي لبروتينات BALF المضادة للميكروبات. (أ) النشاف الغربي الذي يوضح التعبير عن مكونات BALF في البالغين غير CF ، وحديثي الولادة غير CF ، وحديثي الولادة CF BALF. تم جمع العينات ، وتم فصل 15 ميكروغرام من إجمالي بروتين BALF من ثلاثة حيوانات لكل مجموعة باستخدام SDS-PAGE. كانت الأجسام المضادة المستخدمة في النشاف الغربي ضد ما يلي: الليزوزيم (LYZ) ، اللاكتوفيرين (LTF) ، اللاكتوبيروكسيديز (LPO) ، والبروتين المرتبط بالسطح الرئوي (SP) -A. تظهر صور للعديد من تجارب لطخة غربية تمثيلية. (ب) القياس الكمي لبيانات التجلط المناعي. تم إجراء قياس الكثافة على نطاقات لكل بروتين باستخدام برنامج Metamorph. تم تطبيع القيم إلى متوسط ​​القيمة لعينات البالغين (تم ضبطها على 100٪). نظرًا لعدم وجود الحالة الطبيعية ، تم تحويل هذه القيم قبل التحليل بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه ، وتم تطبيق تصحيح Bonferroni للمقارنات الزوجية (SPSS الإصدار 18 SPSS ، Chicago ، IL). شريط الاخطاء تمثل SEM. تميزت الفروق الجوهرية بين مستوى البالغين وحديثي الولادة على النحو التالي: *ص & lt 0.05، † ص & lt 0.01 ، ^ ص & lt 0.001. (ج و د) توطين الليزوزيم (ج) واللاكتوفيرين (د) في القصبة الهوائية النمس. تم تلطيخ القصبات الهوائية لحديثي الولادة والبالغين غير المسببين للتليف الكيسي عن طريق التألق المناعي (أحمر) ، وتم التقاط الصور باستخدام مجهر مضان بتكبير إجمالي 200 ×. تمت مواجهة العينات بـ 4 ′ ، 6-Diamidino-2-phenylindole لتمييز النوى (أزرق). ملحوظة ، حديثي الولادة SAE ، ظهارة مجرى الهواء السطحية SMG ، غدد (غدد) تحت المخاطية.

تم اقتراح التهاب مجرى الهواء المفرط وغير الفعال كعنصر من مكونات مرض الرئة التليف الكيسي الذي يساهم في الاستعمار البكتيري (31). أشارت نتائج بروتينات BALF الخاصة بنا إلى أن التشوهات الالتهابية في رئة النمس التليف الكيسي قد تبدأ في الرحم ويؤدي إلى النمط الظاهري غير الطبيعي للالتهابات بعد التعرض الجرثومي عند الولادة. لمزيد من فحص هذا ، قمنا بقياس مستويات السيتوكينات ، IL-1β ، IL-8 ، و TNF-α ، في BALF من الأطفال حديثي الولادة والقوارض غير CF و CF القوارض. قمنا أيضًا بقياس مستويات NO ، وهو أمر مهم للمناعة الفطرية في الرئة ويتضاءل في زفير المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي والمسالك الهوائية لفئران التليف الكيسي (32 ، 33). كما هو مبين في الأشكال 5A-5D ، كانت تركيزات IL-1β و NO المكتشفة في CF BALF حديثي الولادة أقل بكثير من تلك الموجودة في non-CF BALF ، في حين كانت تركيزات IL-8 و TNF-α مرتفعة بشكل ملحوظ. كانت التغييرات في هذه السيتوكينات BALF ووفرة NO متوافقة مع تحليل البروتينات التي تنطوي على هذه المسارات. على النقيض من ذلك ، فإن BALF من القوارض غير CF و CF التي تم تسليمها بشكل معقم عن طريق القسم C في E40-41 ، وسمح لها بالتنفس لفترة قصيرة من الوقت ، لم تظهر اختلافات كبيرة في النمط الجيني في مستوى هذه السيتوكينات (الأشكال 5F-5H ). ومع ذلك ، لوحظت اختلافات كبيرة ومثيرة للاهتمام في النمط الجيني في تحريض هذه السيتوكينات بالولادة الطبيعية (الشكل 5I). أدت الولادة الطبيعية إلى تحريض كبير لـ TNF-α في كل من non-CF (ص & lt 0.0001) و CF (ص = 0.0007) بالف. ومع ذلك ، كان تحريض TNF-α بشكل كبير (ص & lt 0.0001) أعلى في CF (27.3 ضعفًا) عنها في غير CF (12.7 ضعفًا). على النقيض من ذلك ، أدت الولادة الطبيعية إلى تحريض كبير لـ IL-1β في BALF غير CF (5.4 أضعاف ص = 0.0014) ، ولكن لم يلاحظ أي تحريض كبير في CF BALF. الأكثر إثارة للاهتمام ، أن الولادة الطبيعية تسببت بشكل كبير في حدوث IL-8 في CF BALF (42.3 ضعفًا ، ص = 0.036) ، ولكن لم يلاحظ أي تحريض كبير في غير CF BALF. حدثت هذه التغييرات في السيتوكينات الرئوية المفرزة على الرغم من عدم وجود اختلافات في الحمل البكتيري BALF بين الأنماط الجينية ، على الرغم من أن حيوانين CF أظهروا BALF غير معقم ، وثلاثة حيوانات CF كان لديهم جينومات بكتيرية أعلى من مستويات الخلفية للكشف (الشكلان 5E و 5J). تشير هذه النتائج إلى أن رئة النمس حديثي الولادة من التليف الكيسي تتصاعد استجابة التهابية مبالغ فيها للتعرض البكتيري المبكر بعد الولادة وقبل الانتشار البكتيري المفرط.

الشكل 5. تتغير علامات الالتهاب ديناميكيًا في CF BALF عند الولادة أثناء الانتقال من بيئة معقمة إلى بيئة غير معقمة. (أج) تركيزات (أ) IL-1β ، (ب) IL-8 و (ج) تم تحديد عامل نخر الورم α في BALF من قوارض حديثي الولادة بواسطة ELISA. (د) تم قياس تركيز NO في BALF من قوارض حديثي الولادة باستخدام محلل أكسيد النيتريك Siever 280i. (ه) يتم تحديد CFU البكتيري في النمس حديث الولادة غير CF و CF الذي يحدده النمو على ألواح أجار الدم. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص & lt 0.001 بواسطة اختبار Mann-Whitney U. (Fح) تركيزات (F) IL-1β ، (جي) IL-8 و (ح) TNF-α في BALF من التنفس ، تم تحديد القوارض ذات المقطع C بواسطة ELISA. (أنا) أضعاف التغييرات في مستويات السيتوكين بين القسم C وحديثي الولادة لكل نمط وراثي. تظهر تركيزات السيتوكين (أج) تم تقسيمها على متوسط ​​تركيزات السيتوكينات في القسم C (Fح) للحصول على تغييرات الطية لكل نمط وراثي ، وتم رسم متوسطات هذه القيم على نفس المحور. تم إجراء اختبارات Mann-Whitney U بين مجموعات البيانات في أج و Fح لتحديد ما إذا كان التحريض بالولادة الطبيعية مهمًا لكل نمط وراثي ، كانت النتائج كما يلي: IL-1β ، non-CF ، ص = 0.0014 ، كلفن ، ص = 0.2954 IL-8 ، غير CF ، ص = 0.9664 ، كلفن ، ص = 0.036 TNF-α ، غير CF ، ص & lt 0.0001 ، CF ، ص = 0.0007. مقارنات النمط الجيني لتغير الطية في السيتوكينات بين القسم C والحيوانات حديثي الولادة الموضحة في أنا استخدم اختبار Mann Whitney U: **ص & lt 0.01 ، ***ص & lt 0.001 ، ****ص & lt 0.0001. (ي) تم تقييم الحمل البكتيري في النمس حديث الولادة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للحمض النووي الريبوزومي 16S. تم تعيين حدود الحساسية لهذا الاختبار إلى الصفر. شريط الاخطاء تمثل SEM طوال الوقت.

تم العثور على سائل سطح مجرى الهواء من مرضى التليف الكيسي (5 ، 34) ، وكذلك الخنازير حديثي الولادة (6) ، معيبًا في القتل البكتيري. سعينا إلى تحديد ما إذا كان BALF المعزول من قوارض CF حديثي الولادة ضعيف أيضًا في قدرته على قتل البكتيريا. كما هو مبين في الشكل 6 أ ، لم يتم العثور على فروق بين non-CF و CF BALF فيما يتعلق بالقدرة على منع انتشار الإشريكية القولونية، إلى جانب S. pseudintermedius (الشكل 6 ب). ومع ذلك ، لاحظنا زيادة ما يقرب من 10 أضعاف في CFU من P. الزنجارية المحتضنة في BALF من القوارض CF حديثي الولادة مقارنة مع BALF من الحيوانات غير CF (الشكل 6C). هذه النتيجة ، من خلل فطري معين في المناعة ضد P. الزنجارية، مشابه ل في الجسم الحي تجارب التحدي البكتيري (الشكل 2) ، وقد يكون لها تأثير على سبب كون هذا النوع من مسببات الأمراض الرئوية الشائعة في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (8).

الشكل 6. نشاط مضاد للميكروبات P. الزنجارية يتم تقليله في BALF من قوارض CF حديثي الولادة بطريقة مستقلة عن الأس الهيدروجيني والبيكربونات. (أج) تكاثر سلالات مختلفة من البكتيريا في BALF من قوارض حديثي الولادة من النوع non-CF و CF. تم تركيز BALF من القوارض حديثي الولادة غير CF و CF إلى 2-5 ميكروغرام / ميكرولتر عن طريق الطرد المركزي كما هو موصوف في M aterials و M ethods. تم تلقيح عينة 15 ميكروغرام من BALF بـ 5000 CFU من الإشريكية القولونية (EC838) (أ), S. pseudintermedius (عزل إكلينيكي من رئة نمس بالغ من التليف الكيسي) (ب)، أو P. الزنجارية (PA01) (ج) وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. ثم تم تحديد كمية البكتيريا الباقية عن طريق مقايسة CFU. (د) تكاثر بكتيريا PA01 في BALF عند مستويات مختلفة من الأس الهيدروجيني. مركز غير CF أو CF BALF (15 ميكروغرام محضر كما في أج) مع 5000 CFU PA01 في محلول فوسفات الصوديوم عند درجة الحموضة المشار إليها ، عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، قبل تقدير CFU. (ه) انتشار PA01 في وجود أو عدم وجود BALF بتركيزات مختلفة من البيكربونات. مركَّز غير CF أو CF BALF (15 ميكروغرام) في محلول فوسفات الصوديوم (مُعد كما في أج) بمركبة أو محلول بيكربونات مركز حتى التركيز النهائي المحدد. تم أيضًا نقل عينات وهمية (بدون BALF) كعناصر تحكم. تم تلقيح هذه العينات بعد ذلك بـ 5000 CFU PA01 عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات قبل تقدير CFU. البيانات الموجودة في د و ه تم تحويل السجل قبل أن يتم رسمها. متوسط ​​المدخلات CFU (100٪) يرمز له بـ a خط متقطع على كل رسم بياني. شريط الاخطاء تمثل SEM. ***ص & lt 0.001 بواسطة اختبار Mann-Whitney (جتم تمييز الفروق الجينية بين الأنماط الجينية عند كل تركيز pH أو بيكربونات على النحو التالي:ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص & lt 0.001 ، و ****ص & lt 0.0001 عن طريق اختبار Sidak للمقارنة المتعددة (د و ه) فرق كبير († ص & lt 0.05) بين non-CF pH 7.2 و non-CF pH 8.3 لوحظ أيضًا (ANOVA أحادي الاتجاه ، اختبار Sidak للمقارنة المتعددة).

يكون الرقم الهيدروجيني لسطح مجرى الهواء أقل بكثير في الخنازير حديثي الولادة من CF مقارنة بالخنازير غير المصابة بالتليف الكيسي ، وإضافة البيكربونات إلى مجرى الهواء الخنازير CF في الجسم الحي لقد ثبت أنه يعزز قتل البكتيريا (∼1.8 أضعاف) ، مع رفع درجة الحموضة في مجرى الهواء (6). اختبرنا خصائص مماثلة في النمس CF. لم تتغير الاختلافات في الأس الهيدروجيني ، التي تتراوح من 6.5 إلى 8.3 ، بشكل كبير P. الزنجارية قتل من قبل CF النمس BALF (الشكل 6 د). ومع ذلك ، لوحظ انخفاض كبير (∼ 10 أضعاف) في قتل البكتيريا بين non-CF BALF عندما تم رفع الرقم الهيدروجيني من 7.2 إلى 8.3 (ص & lt 0.05). في كل درجة حموضة تم اختبارها ، سهّل CF BALF نموًا أكبر بشكل ملحوظ لـ P. الزنجارية من non-CF BALF (ص & lt 0.0001 بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه). على الرغم من أننا وجدنا أن البيكربونات كان لها تأثير كبير على نمو البكتيريا بشكل عام (ص & lt 0.0001 16.21٪ إجمالي الاختلاف عن طريق ANOVA ثنائي الاتجاه) ، كان له هذا التأثير حتى في حالة عدم وجود BALF وفقط عند 200 ملم (ص & lt 0.05 بواسطة اختبار Sidak للمقارنة المتعددة اللاحق) (الشكل 6E). كان للنمط الجيني BALF تأثير إجمالي أكبر على نمو البكتيريا (ص & lt 0.0001 39.24٪ اختلاف إجمالي بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه) ، ولم يكن هناك تفاعل إحصائي بين التركيب الوراثي BALF وتركيز البيكربونات بشكل عام (ص = 0.0916). في كل تركيز من البيكربونات تم اختباره ، كان النمو البكتيري في CF BALF أكبر منه في غير CF BALF ، وكانت أهمية هذا الاختلاف أعلى في الوجود منها في غياب البيكربونات. بشكل جماعي ، النتائج الموضحة في الشكل 6 تشير إلى ذلك P. الزنجارية يتمتع بميزة بقاء فريدة في سائل مجرى الهواء من نمس حديثي الولادة CF ، وأن هذه الخاصية لا تعتمد على الأس الهيدروجيني أو البيكربونات.

كان تطوير نماذج حيوانية من أجل التليف الكيسي في الفأر والخنازير والنمس لا يقدر بثمن في فك رموز أصول التسبب في المرض في الرئة والأعضاء الأخرى (18). في الدراسة الحالية ، قمنا بفحص العديد من الجوانب الرئيسية للمناعة الفطرية في رئة النمس حديثي الولادة ، وما إذا كانت معيبة في حيوانات التليف الكيسي. سمح لنا الافتقار إلى الخلايا الظهارية الهدبية و SMGs في القصبة الهوائية عند الولادة بالتحقيق في الجوانب الأخرى للمناعة الفطرية للمجرى الهوائي المعتمدة على CFTR في هذا النوع. تظهر النتائج من هذه الدراسات بوضوح أن العمليات المعتمدة على CFTR في المسالك الهوائية بدون SMGs أو MCC تساهم في المناعة الفطرية. تبدو هذه العمليات أيضًا مختلفة بشكل فريد عن المسالك الهوائية لحديثي الولادة CF والتي تحتوي على SMGs وخلايا مهدبة وفيرة.

ما توصلنا إليه من عدم وجود قتل جرثومي خاص بالأنواع P. الزنجارية في الرئتين CF النمس حديثي الولادة و BALF أمر مثير للاهتمام ، بالنظر إلى ذلك المكورات العنقودية يتم ملاحظته في كثير من الأحيان في رئة نمس CF في نهاية المرحلة (20 ، 21). يشير علم بكتيريا CF ferret ورئتي الخنازير إلى وجود عيوب دفاعية جرثومية غير تمييزية ، مع تحديد مجموعة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية (19-21). تم اقتراح العديد من الآليات لحساب القدرة الفريدة لـ P. الزنجارية لتستمر في الرئتين التليف الكيسي البشري (3 ، 35) ، وعلى الرغم من ذلك الزائفة تم الحصول على عزلات من رئة نمس CF البالغة ، وهي تمثل مكونًا ثانويًا للحمل البكتيري الكلي (21). تشير دراساتنا أيضًا إلى أدوار مختلفة تعتمد على CFTR لمكونات المناعة الخلوية الخلوية في الرئة P. الزنجارية- يتم كبت النمو في حالة عدم وجود مكونات خلوية للرئة من غير التليف الكيسي (BALF وحده) ، بينما يحدث القتل (∼ 100 ضعف) في الجسم الحي. بالنظر إلى التشوهات المناعية والالتهابية التي لوحظت في التليف الكيسي النمس BALF قبل الولادة وبعدها ، قد يتضمن أحد التفسيرات التي توصلنا إليها النتائج التي توصلنا إليها عيوب المناعة الفطرية المكتسبة في رئة نمس التليف الكيسي في وقت لاحق من الحياة والتي يتم تعزيزها من خلال الاستجابات الالتهابية المفرطة للأنواع البكتيرية الصغيرة ، مثل الزائفة. علاوة على ذلك ، تفتقر المسالك الهوائية للمواليد الجدد من النمس إلى SMGs ، وبالتالي قد يكون لها جوانب من عيوب المناعة الفطرية التي تظهر بمرور الوقت مع تشكل هذه الهياكل. على سبيل المثال ، يتم إنتاج اللاكتوفيرين في الرئة حديثي الولادة من التليف الكيسي عن طريق الخلايا الظهارية السطحية للمجرى الهوائي ثم يتم استبداله لاحقًا بـ SMGs في قوارض CF القديمة (الشكلان 4C و 4 D). وبالتالي ، إذا كان اللاكتوفيرين مضادًا سائدًا للميكروبات المكورات العنقوديةعندما تنضج قوارض التليف الكيسي ، يتوقع المرء أن يبدأ هذا العامل الممرض في السيطرة حيث يتم إفراز كمية أقل من اللاكتوفيرين في الشعب الهوائية بسبب إفرازات الغدة المعيبة.

معيب P. الزنجارية لم يكن النشاط المضاد للميكروبات في CF ferret BALF يرجع بشكل أساسي إلى الاختلافات في درجة الحموضة أو تركيز البيكربونات ، لأن تغييرها في CF BALF لم يؤثر على نشاط مضادات الميكروبات. ومن المثير للاهتمام ، أن رفع درجة الحموضة في BALF غير CF يقلل بشكل انتقائي من قتل البكتيريا و / أو يعزز النمو. تتناقض هذه الملاحظات مع تلك التي لوحظت في سائل مجرى الهواء الخنازير (6) ، حيث يؤدي رفع درجة الحموضة أو إضافة البيكربونات إلى تعزيز النشاط المضاد للميكروبات في مائع مجرى الهواء بغض النظر عن نشاط CFTR. وبالتالي ، فقد تم اقتراح أن الزيادة في حموضة مائع سطح مجرى الهواء ، بسبب نقص إفراز البيكربونات المعتمد على CFTR ، هو سبب ضعف قتل البكتيريا في مجرى الهواء CF (6). الاختلافات في المنهجية أو الاختلافات المحتملة الخاصة بالأنواع في كيفية تنظيم درجة الحموضة في مجرى الهواء وتتعلق بالقتل البكتيري قد تفسر سبب عدم دعم النتائج في نموذج CF ferret هذه الآلية. تم اقتراح SMGs ، التي تفتقر عند الولادة في القوارض ، لتكون مصدرًا رئيسيًا لإفراز البيكربونات المعتمد على CFTR في الشعب الهوائية (36). وبالتالي ، فإن عدم مشاركة SMG في المناعة الفطرية لمجرى الهواء النمس حديثي الولادة قد يفسر جزئيًا هذه الاختلافات الخاصة بالأنواع ، وقد يكون له صلة بآليات بديلة للمناعة الفطرية في الممرات الهوائية البعيدة حيث تكون SMG غائبة. على الرغم من أن دراساتنا خلصت إلى أنه لا يؤثر الأس الهيدروجيني ولا البيكربونات على النشاط المضاد للميكروبات من CF ferret BALF ، لا يمكننا أن نستنتج أن التغييرات الخاصة بـ CF في البيكربونات أو درجة الحموضة في الجسم الحي ليس لها تأثير على نمو البكتيريا بسبب تأثيرها على المكونات الخلوية.

لا يبدو أن عيب المناعة الفطري في القوارض التليفزيونية حديثي الولادة يرجع إلى غياب النمط الجيني المحدد لمعظم العوامل الرئيسية المضادة للميكروبات في BALF ، مما يشير إلى أن الآليات الأخرى للمناعة الفطرية المعتمدة على CFTR تحمي رئتي النمس حديثي الولادة. قد تتضمن إحدى الآليات تعطيل النشاط المضاد للميكروبات بسبب الخصائص المتغيرة لـ ASL المركزة أو البيئة المسببة للالتهابات في غياب CFTR. على سبيل المثال ، وجد أن نشاط اللاكتوفيرين المضاد للميكروبات معيب في التليف الكيسي ، إما بسبب زيادة اللزوجة لإفرازات مجرى الهواء التليف الكيسي (3) ، أو ربما بسبب الانقسام بواسطة الكاتيبسين ب ، ل ، و (9) كاتيبسين أس. ثبت أنه يشق SP-A في CF BALF البشري (37). على الرغم من أننا اكتشفنا العديد من بروتينات الكاثيبسين في النمس حديثي الولادة BALF ، إلا أننا لم نلاحظ أي منتجات تحلل خاصة بـ CF لأي من اللاكتوفيرين أو SP-A في تحليل اللطخة الغربية ، لذلك يبقى أن نرى ما إذا كان الانقسام التحلل البروتيني الناجم عن الالتهاب لبروتينات أخرى مضادة للميكروبات يلعب دورًا في مرض الرئة التليف الكيسي في النمس.

وجدنا عيبًا كبيرًا في MCC في مجموعات التليف الكيسي التي يزيد عمرها عن أسبوع واحد ، وعلاقة متغيرة بين مركز عملائي في القصبة الهوائية والنسبة المئوية في قوارض التليف الكيسي الصغيرة. تشير هذه العلاقة المتغيرة إلى أن خصائص سائل مجرى الهواء قد تضعف MCC في مجموعات CF ، وقد يساهم انخفاض ارتفاع ASL الذي لاحظناه في النمس CF حديثي الولادة في ضعف MCC في هذه الحيوانات خلال الأسبوع الثاني من الحياة. ومع ذلك ، أظهر تحليل حديث لعمق ASL في الخنازير CF أنه لا يختلف عن ذلك في الخنازير غير CF ، ولم يكن هناك فرط نشاط ملحوظ لقناة الصوديوم الظهارية (24) الذي يُلاحظ عادةً في ظهارة مجرى الهواء البشري CF والفكر. لتعزيز جفاف ASL (4 ، 25). على الرغم من عدم وجود زيادة في التيار الحساس للأميلوريد في القوارض الصغيرة CF (21 ، 38) ، وجدنا انخفاضًا كبيرًا في ارتفاع ASL الرغامي عند الولادة في قوارض التليف الكيسي ، مما يشير إلى أن إفراز الكلوريد هو السائد في النمس في هذا العمر ، ويمكن أن يكون كذلك للتعويض عن غياب SMGs ، والتي تساهم عادةً في عمق ومحتوى ASL.يمكن أن يعكس هذا التناقض بين الخنازير والقوارض اختلافًا جوهريًا في تنظيم ديناميكيات السوائل بين الأنواع ، أو ببساطة اختلافًا في الأساليب المستخدمة لتقييم مستويات ASL.

يدعم تحليل البروتيوميات للقسم C-section BALF فكرة أن التغيرات المرتبطة بالتليف الكيسي في المسارات الالتهابية ووظيفة الخلايا المناعية موجودة في الرئة العقيمة من التليف الكيسي (الأشكال E4B و E4D و E4F) ، وأنه بعد التعرض لمسببات الأمراض عند الولادة ، تظهر حالة شديدة الالتهاب. موجود في رئة النمس CF (الأشكال E4A و E4C و E4E). ومن المثير للاهتمام ، أن العديد من أهم مسارات الوظائف الحيوية التي تم رفعها أو قمعها (بالدرجة z) قبل الولادة في الرئة التليف الكيسي بالمقارنة مع الرئة غير التليف الكيسي قد تغيرت بشكل كبير في الاتجاه المعاكس بعد الولادة (الشكل E4). فيما يتعلق بالمسارات المحددة الممثلة في تكوين بروتين BALF قبل وبعد الولادة الطبيعية (الشكل 3 والشكل E1) ، وجدنا اختلافات نمطية مثيرة للاهتمام في أهمية مسارات إشارات LXR / RXR و eIF2 و mTOR. هذه المسارات ملحوظة ، لأنها تنظم الاستجابات الالتهابية وتتفاعل مع مسار NF-B (29 ، 39-42) ، والذي بدوره ينظم التعبير عن السيتوكينات المسببة للالتهاب CF ، مثل IL-8 و TNF-α و IL-1β (27 ، 43 ، 44). تكملة لهذه النتائج البروتينية ، كانت التغييرات في BALF cytokine أثناء انتقال الولادة (أي الحيوانات المقطوعة C مقابل الحيوانات المولودة بشكل طبيعي) مختلفة بشكل فريد بين الأنماط الجينية (الشكل 5I) ، مما يشير إلى خلل في استجابة التهابات الرئة CF عند التعرض الأول للبكتيريا. هذه النتائج في تناقض صارخ مع ما هو معروف عن خنزير التليف الكيسي ، الذي يفتقر إلى التهاب الرئة عند الولادة (19 ، 45). لطالما نوقش ما إذا كانت الاستجابات الالتهابية غير المناسبة من الرئة التليف الكيسي تساهم في الاستعمار البكتيري. ثبت أن العديد من مسارات الإشارات ، بما في ذلك NF-B ، نشطة للغاية في خلايا مجرى الهواء التليف الكيسي ، ويُعتقد أنها تساهم في استجاباتها الخلوية غير الطبيعية (بما في ذلك IL-8 و TNF-α) للتحدي البكتيري و LPS (31). بعض علامات الالتهاب المرتفعة في الأطفال حديثي الولادة CF النمس BALF مرتفعة أيضًا عند الرضع المصابين بالتليف الكيسي (46 ، 47). النتائج التي توصلنا إليها ، أن NO يتضاءل في الأطفال حديثي الولادة CF النمس BALF ، يعكس الملاحظات في المرضى من البشر (32). NO له نشاط مضاد للميكروبات ويلعب أيضًا أدوارًا مهمة في تنظيم الالتهاب من خلال NF-B ومحول الإشارة ومنشط مسارات النسخ 3 (32) وبالتالي ، يمكن لهذا الجزيء أن يلعب دورًا في النمط الظاهري المرصود للرئة النمس CF لحديثي الولادة.

أظهر تحليل البروتينات أيضًا اختلافات في البروتينات داخل النظام التكميلي في CF BALF قبل الولادة وبعدها. على الرغم من أن عوامل النظام التكميلية قد تم قمعها بشكل عام بعد الولادة الطبيعية في الرئة التليف الكيسي ، إلا أن العديد من هذه العوامل كانت مرتفعة في الرئة التليف الكيسي المقطوعة. يلعب هذا النظام دورًا مهمًا في المناعة الفطرية ، مما يسمح بالقتل المباشر أو طمس الميكروبات الأجنبية في الرئة ، مثل P. الزنجارية (44). على غرار القوارض CF ، أظهر تحليل البروتينات لـ CF BALF البشري انخفاض مستويات أو عدم وجود العديد من البروتينات التكميلية (48). بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن CFTR ضروري للبلعمة من المكمل-opsonized P. الزنجارية بواسطة monocytes (49) ، وهو أمر مثير للاهتمام ، نظرًا للاضطرابات الوظيفية التي لوحظت في CF BALF التي تشمل الخلايا الوحيدة والبلاعم ، وكذلك في الجسم الحي عيب ل P. الزنجارية القتل في الرئة النمس CF. في الفئران ، كان المسار التكميلي البديل والمكون التكميلي C3 ضروريين للاستجابة المناعية ضد P. الزنجارية (50) ، وكانت مكونات المسار التكميلي البديلة هي الأكثر انخفاضًا في CF النمس المولود بشكل طبيعي BALF.

بشكل جماعي ، تُظهر نتائجنا أن أذرعًا متعددة من أجهزة المناعة الفطرية في مجرى الهواء ومسارات الالتهاب يتم تغييرها قبل الولادة وبعدها في القوارض التليفزيونية. علاوة على ذلك ، تعمل هذه المسارات بطريقة تعتمد على CFTR في غياب MCC و SMGs. من المحتمل أن تساهم الإشارات الالتهابية المتغيرة ، إلى جانب انخفاض وظيفة المكونات المضادة للميكروبات في BALF ، في عدم قدرة مجرى الهواء النمس لحديثي الولادة على الدفاع ضد مسببات الأمراض الغريبة. تم الكشف أيضًا عن اختلافات مثيرة للاهتمام في المناعة والالتهابات الفطرية بين قوارض التليف الكيسي والخنازير ، ومن المحتمل أن تعكس الاختلافات البيولوجية في كيفية عمل CFTR لحماية المسالك الهوائية مع الأهداب و SMGs وبدونها. قد يكشف تحديد الآليات المسؤولة عن هذه الاختلافات عن أهداف جديدة لعلاج مرض الرئة التليف الكيسي.


إشارات ثنائية الاتجاه

من الخصائص المهمة للتفاعلات بين مستقبلات Eph و ligands هي الإشارات ثنائية الاتجاه التي تنتج عن تنشيط مسارات الإشارة في كل من الخلايا المعبر عن المستقبل والخلايا التي تعبر عن الترابط [4]. يتم إحداث الإشارات إلى الأمام في الخلايا التي تعبر عن مستقبلات إفرين ، بينما يؤدي تفاعل مستقبل إيفرين-إفرين أيضًا إلى إحداث إشارات عكسية في الخلية التي تعبر عن إفرين [5]. إن الوظائف البيولوجية المتميزة لتفاعل إفرين هي نتيجة كل من تعدد الميرينات لمركب إفرين والتأشير ثنائي الاتجاه [6].

إشارات إلى الأمام

من المعروف أن مستقبلات Eph تشير من خلال عدد من المسارات والجزيئات المختلفة ، بما في ذلك GTPases الصغيرة لعائلة Rho و Ras ، وكيناز الالتصاق البؤري (FAK) ، ومسار Jak / Stat ومسار PI3K [7] [8]. تتوسط GTPases الصغيرة لعائلة Rho في تأثير تنشيط مستقبلات Eph على ديناميكيات الأكتين. يتم تنشيط Rho GTPases بواسطة مستقبلات EphA ، وتتحكم في شكل الخلية وحركتها ، من خلال تعزيز تكوين lamellipodia و filopodia وألياف الإجهاد [9]. يتم التوسط في تنشيط GTPase بواسطة عوامل التبادل وبروتينات المحول مثل ephexin و Crk على التوالي [9] [10]. يمكن لمستقبلات EphB أيضًا تنشيط عائلة Rho GTPases ، بوساطة عوامل التبادل intersectin و kalirin [11] [12]. يلعب هذا التنشيط دورًا في استطالة خيوط الأكتين وتشكل ونضج العمود الفقري التغصني. بالإضافة إلى Rho GTPases ، يمكن لمستقبلات Eph أيضًا تنظيم نشاط عائلة Ras من GTPases ، بما في ذلك H-Ras و R-Ras [13 ، 14]. يؤدي تنشيط H-Ras إلى تنشيط مسار كيناز MAP ، مما يؤدي إلى تنظيم النسخ ، والانتشار ، وترحيل الخلايا. على عكس تنشيط EphA لـ Rho GTPases ، فإن غالبية مستقبلات Eph تنظم بشكل سلبي مسار كيناز Ras-MAP [14]. يمكن لمستقبلات EphB أيضًا أن تنظم بشكل سلبي مسار كيناز R-Ras-MAP ، مما يؤدي إلى تقليل الالتصاق بوساطة الإنتجرين [13]. تم إثبات أن مستقبلات EphA تنظم مسار Jak / Stat ، بينما تعزز مستقبلات EphB الانتشار عبر تنشيط مسار كيناز PI3 [8]. يعتبر FAK مهمًا في التوسط في مستقبلات Eph وإشارات الإنتجرين [7].

عكس الإشارات

لا ينتج عن التفاعل بين روابط الإيفرين ومستقبلات إيفرين إرسال إشارات إلى الأمام من خلال مستقبل إيفرين فحسب ، بل يؤدي أيضًا إلى إرسال إشارات "عكسية" من خلال رابط الإيفرين نفسه [15]. أظهرت الدراسات الأولية أن المجال خارج الخلية لمستقبلات EphB يمكن أن يحفز فسفرة التيروزين ليجاندات ephrinB [16]. تم التعرف على عدد من البروتينات التي تحتوي على مجالات SH2 أو PDZ ، والتي ترتبط بروابط الإيفرين الفسفورية وتنقل الإشارة [17 ، 18]. يحتوي بروتين المحول ، Grb4 ، على مجال SH2 ومن المعروف أنه يربط نشاط ephrinB بمورفولوجيا الخلية [17]. آليات الإشارة العكسية لروابط ephrinA ليست مفهومة بشكل أقل ، ولكن يُعتقد أنها نتيجة لتجمع ephrinA وتجنيد البروتينات المنظمة [19].


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو وصول كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


مناقشة

السكان البلاعم من لويحات تصلب الشرايين غير متجانسة. بجانب الضامة M1 و M2 التي تم الإبلاغ عنها سابقًا ، تم أيضًا إثبات وجود أنماط ظاهرية فريدة من البلاعم في آفات تصلب الشرايين [6 ، 7]. تم الإبلاغ عن MR + الضامة لأول مرة بواسطة Bouhlel et al. في لويحات الشريان السباتي البشري [22]. بناءً على النتائج الحديثة التي تمثل التعبير السائد عن MR في الغطاء الليفي من لويحات تصلب الشرايين [23 ، 24] ، تم اقتراح MR كعلامة حيوية مستهدفة محتملة لتحديد الآفات الجانية. ومع ذلك ، لا يزال الدور الدقيق للبلاعم البديلة في تصلب الشرايين ومساهمتها في ضعف اللويحات موضع نقاش [25 ، 26].

Chinetti-Gbaguidi et al. أبلغت أن الضامة IL-4-polarized CD68 + MR + تعبر عن مستويات عالية من المستقبلات المشاركة في البلعمة ولكنها تظهر قدرة منخفضة على تناول البروتينات الدهنية الأصلية والمؤكسدة في المختبر. تشير قدرة هذه التجمعات الضامة على إزالة الخلايا المبرمجة دون تراكم الدهون إلى أنها قد يكون لها أدوار مفيدة في تثبيت آفات تصلب الشرايين [12]. من ناحية أخرى ، تم الإبلاغ عن وجود M2 (CD68 + CD163 +) ولكن ليس M1 الضامة في الغطاء الليفي بالقرب من موقع تمزق لويحات التخثر عديمة الأعراض في الشريان السباتي البشري ، مما يشير إلى أن الضامة البديلة قد تكون أيضًا تعديل عملية تمزق البلاك [27]. تم الإبلاغ أيضًا عن كثافة عالية من البلاعم MR + بواسطة Tahara et al. في لويحات عالية الخطورة تم الحصول عليها من الأشخاص الذين عانوا من الموت القلبي المفاجئ [28]. علاوة على ذلك ، يتم إنتاج البروتين المعدني المصفوف 9 (MMP-9 ، وهو MMP الأكثر انتشارًا في لويحات تصلب الشرايين) بواسطة الضامة M2 بدلاً من M1 [29 ، 30]. تم الإبلاغ عن أن تمزق اللويحات السباتية يرتبط بشكل كبير بتعبير MMP-9 في الآفات [31]. نظرًا لأن MMP-9 قادر على تحطيم الكولاجين من النوع الرابع [32] والتسبب في تمزق اللويحة ، فإن النمط الظاهري للبلاعم M2 قد يكون له دور رئيسي في عدم استقرار اللويحة. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن البلاعم MR + M4 الموصوفة حديثًا لها أدوار محتملة مؤيدة لتصلب الشرايين في اللويحات الضعيفة. إنهم ينتجون MMP12 ، وهو إنزيم قد يكون متورطًا أيضًا في تدهور الغطاء الليفي وبالتالي زعزعة استقرار آفات تصلب الشرايين [33 ، 34 ، 35]. بدافع من النتائج المذكورة أعلاه ، نهدف إلى التحقيق في جدوى التصوير بالرنين المغناطيسي في آفات تصلب الشرايين لنموذج الفئران باستخدام المشعات الإشعاعية المضادة لـ MMR Nb.

في الدراسة السابقة ، لم نتمكن من تقييم أهمية مضاد MMR الذي يحمل علامات التكنيشيوم 99 م (99 م Tc) لتصلب الشرايين ولم يتم العثور على ارتباط إيجابي بين عبء البلاك و 99 م Tc-anti-MMR3.49 ملحوظة امتصاص. كما أكده تلطيخ التألق المناعي ، فإن غياب امتصاص 99m Tc-anti-MMR3.49 Nb في اللويحات يؤكد عدم وجود تعبير MR في الآفات [36]. ومع ذلك ، فقد حذرنا من تعبير MR في النسيج العرضي. ومع ذلك ، في الدراسة الحالية ، تم تأكيد وجود MR + الضامة ، والتي كانت موجودة بشكل أساسي في الغطاء الليفي وفي مناطق الكتف من لويحات تصلب الشرايين ، من خلال تلطيخ التألق المناعي. بالتوافق مع ملاحظتنا السابقة ، لوحظ تعبير MR رائع في برانية الشريان الأورطي المعزول من كل من ApoE-KO وفئران التحكم. تم الإبلاغ سابقًا عن وجود البلاعم في برانية الشرايين الطبيعية [10 ، 24]. أظهرت البرانية الكامنة وراء لويحات تصلب الشرايين مزيدًا من التعبير بالرنين المغناطيسي مقارنة بالمناطق الخالية من البلاك لشرائح الأبهر المعزولة من ApoE-KO والفئران الضابطة ، والتي يمكن تفسيرها بوجود تسلل خلوي عرضي متعلق بالتصلب العصيدي [9 ، 37]. بالمقارنة مع 99m Tc ، فإن نصف العمر القصير لـ 68 Ga يتطابق بشكل أفضل مع التصفية السريعة للدم والتوطين المستهدف لمضاد MMR Nb. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لحساسيته العالية بطبيعته ودقة مكانية أفضل إلى حد كبير ، قد يحسن التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني من تصوير آفات تصلب الشرايين مقارنةً بـ SPECT.

على الرغم من الحجم الصغير للآفات ، فقد تم تصورها بنجاح في الشريان الأورطي لفئران ApoE-KO باستخدام ماسح PET / CT للحيوانات الصغيرة ، 1 ساعة في البوصة. من 68 Ga-NOTA-anti-MMR Nb. من أجل تقييم الإشارة المحددة من التعبير بالرنين المغناطيسي في لويحات تصلب الشرايين ، تمت إزالة النسيج العرضي على الشريان الأورطي عن طريق تشريح دقيق لدراسات التصوير الإشعاعي الذاتي خارج الجسم الحي. تم توطين امتصاص التتبع على الصور الشعاعية خارج الجسم الحي مع المناطق الموجبة للسودان IV والتي تتوافق مع لويحات تصلب الشرايين. نظرًا لأن مدى تصلب الشرايين الذي يؤثر على السطح الداخلي على طول الشريان الأورطي لم يكن متماثلًا في جميع الحيوانات ، فقد تم تطبيع إشارات التصوير الشعاعي لمنطقة اللويحات ، بعد تلطيخ سودان الرابع.

تم اعتماد التصوير بالرنين المغناطيسي كمؤشر حيوي لتحديد لويحات تصلب الشرايين المعرضة للتمزق ، وقد تم تطوير مجسات تصوير نووي مستهدفة مختلفة بهدف تصور التعبير بالرنين المغناطيسي في الآفات. تم الإبلاغ عن جدوى 18 D-mannose (2-deoxy-2- [18 F] fluoro-d-mannose ، 18 F-FDM) لتصوير آفات تصلب الشرايين بواسطة Tahara et al. [28]. لقد أظهروا أن امتصاص 18 F-FDM ليس أدنى من 18 F-FDG لتصوير التهاب اللويحة [28]. أبلغ Kim et al. كمقياس إشعاعي للكشف غير الجراحي عن الضامة M2 في لويحات تصلب الشرايين الضعيفة [38]. في الآونة الأخيرة ، أظهرنا جدوى 111 In-tilmanocept للاستهداف غير الغازي في الجسم الحي لالتهاب البلاك في نموذج الماوس ApoE-KO [39]. على الرغم من أن نجاح هذه المقتفيات المشعة في التصور الحي للويحات تصلب الشرايين قد تم توثيقه جيدًا - نظرًا لحقيقة أن المانوز عبارة عن أيزومر جلوكوز ، فإن 18 F-FDM بالإضافة إلى أجهزة التتبع الإشعاعي الأخرى المذكورة أعلاه قد يتم تناولها بواسطة جميع البلاعم ( بشكل مشابه لـ 18 F-FDG) وبالتالي قد يكون غير مناسب للتمييز بين الأنماط الظاهرية المختلفة. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، كان هدفنا هو تقييم إمكانات مكافحة MMR Nb من أجل استهداف محدد للبلاعم MR + والتصوير الحي للويحات تصلب الشرايين في فئران ApoE-KO.

تم تقييم أجهزة التتبع الإشعاعية القائمة على مضادات MMR Nbs جيدًا لتصوير الخلايا الضامة المتسللة إلى الورم [13 ، 14] والتهاب المفاصل في النماذج الحيوانية لالتهاب المفاصل الروماتويدي [15]. تم أيضًا تأكيد خصوصية أدوات التتبع إلى MR في فئران MR-KO [13 ، 14]. كما تم فحص 68 Ga-NOTA-anti-MMR Nb بدقة في نموذج الأرانب لتصلب الشرايين [40]. باستخدام ماسح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير بالرنين المغناطيسي ، لوحظ زيادة تدريجية في شدة الإشارة في الشريان الأورطي للأرانب المصابة بتصلب الشرايين مع تقدم المرض ، مما يؤكد قابلية الترجمة إلى أنواع حيوانية أخرى.

هذه الدراسة لها بعض القيود. بغض النظر عن التعبير الكافي عن طريق الضامة الموجودة في لويحات تصلب الشرايين للتصوير في الجسم الحي ، يتم التعبير عن MR أيضًا بواسطة بعض الخلايا في البرانية التي تسبب إشارة خلفية غير مهملة عند استخدام 68 Ga-NOTA-anti-MMR Nb. قد يكون وجود خلايا MR + في العديد من أعضاء منطقة البطن قد أعاق أيضًا الكشف في الجسم الحي عن امتصاص المشعة في الشريان الأورطي البطني ، بسبب صغر حجم جسم الفأر. على الرغم من أننا كنا قادرين على تقييم أهمية استهداف MR باستخدام 68 Ga-NOTA-anti-MMR Nb في نموذج الماوس ApoE-KO لتصلب الشرايين ، ما إذا كان 68 Ga-NOTA-anti-MMR Nb يتراكم أيضًا في لويحات تصلب الشرايين البشرية المعقدة. تم التحقق من صحتها في الدراسات المستقبلية.


الانتماءات

قسم علم الأمراض ، كلية الطب بجامعة ميريلاند ، بالتيمور ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية

Yuexing Zhang و Hua Zhou و amp Anne W Hamburger

مركز جرينباوم للسرطان ، كلية الطب بجامعة ماريلاند ، بالتيمور ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية

Yuexing Zhang و Hua Zhou و Myounghee Lee و Bret A Hassel و amp Anne W Hamburger

قسم جراحة الفم والوجه والفكين ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياوتونغ ، شنغهاي ، جمهورية الصين الشعبية

قسم علم الأوبئة ، كلية الطب بجامعة ميريلاند ، بالتيمور ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم الأحياء الدقيقة والمناعة ، كلية الطب بجامعة ماريلاند ، بالتيمور ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

المؤلف المراسل


معلومات الكاتب

العنوان الحالي: العنوان الحالي: قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية ، جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، 90095 ، الولايات المتحدة الأمريكية

العنوان الحالي: العنوان الحالي: قسم التكنولوجيا الحيوية ، جامعة Alagappa ، Karaikudi ، 630003 ، الهند

الانتماءات

قسم العلوم البيولوجية ، جامعة ولاية كاليفورنيا ، بومونا ، كاليفورنيا ، 91768 ، الولايات المتحدة الأمريكية

ميسا يو أوستن ، وي سيانغ لياو وكريغ دبليو لامونيون

المركز الطبي لشؤون المحاربين القدامى ، لونج بيتش ، كاليفورنيا ، 90822 ، الولايات المتحدة الأمريكية

كريشناسوامي بالاموروغان ، بالاسوبرامانييم أشوكومار وأمبير حميد إم سعيد

أقسام الطب وعلم وظائف الأعضاء / الفيزياء الحيوية ، جامعة كاليفورنيا ، إيرفين ، كاليفورنيا ، 92697 ، الولايات المتحدة الأمريكية


شاهد الفيديو: ماذا لو توقفت عن الإستحمام (كانون الثاني 2022).