معلومة

عند جمع محللات الخلية لطخة غربية ، كيف يمكنني تحفيز روابط ثنائي الكبريتيد؟


أرغب في إجراء تجربة تقطيع بسيطة لبعض البروتينات التي أقوم بجمعها من خلايا مستنبتة. فكرتي هي ، إذا كنت أقوم بتشغيل هلام PAGE غير مختزل ومغير طبيعة ، فإن إزالة بيتا مركابتوإيثانول / DTT من عينة المخزن المؤقت يجب أن يكون كافياً للسماح بتكوين روابط ثنائي الكبريتيد.

لقد رأيت العديد من المؤلفين يحتضنون الخلايا أولاً بدواء يسمى BSS ينتشر عبر الأغشية ويخلق روابط متقاطعة للبروتين. قد أكون مخطئًا ، لكن يبدو أن استخدام هذا الدواء أكثر ملاءمة عند محاولة المتابعة باستخدام ترسيب مناعي أو اختبار منسدلة.

إذا كان لدى أي شخص أي خبرة في هذا ، هل يمكنك أن تنورني من فضلك؟


لإدخال روابط سيستين جديدة ، ربما تحتاج إلى الحفاظ على إمكانات الأكسدة والاختزال المناسبة عند غسيل محلول الخلية للسماح لروابط السيستين بالتعافي. لكسر روابط ثنائي الكبريتيد الحالية ، قمنا بإضافة إيزوميراز ثنائي كبريتيد السندات (DsBC على وجه الدقة) والذي سيسمح للمحلل الخاص بك بالوصول إلى توازن مناسب.

بالنسبة لفحص تكوين رابطة ثاني كبريتيد التي حدثت بالفعل بين البروتينات في المحللة ، فإن إزالة المكافئات المختزلة مثل DTT وبيتا مركابتوإيثانول يجب أن تفعل الحيلة. يمكنك حتى تغيير طبيعة البروتينات الخاصة بك عن طريق احتضانها في LDS أو Laemmli العازلة عند 90 درجة مئوية لأن هذه المكونات لن تقلل من روابط السيستين الخاصة بك. في تجربتنا ، تعمل النطاقات عادةً بالوزن الجزيئي المتوقع على SDS-PAGE.


شاهد الفيديو: حساب الــpH لمحلول حمض ضعيف ومحلول احد املاحه الذي يحتوي قاعدة الحمض المرافقة (كانون الثاني 2022).