معلومة

ما هي الكثافة الضوئية في طريقة لوري لتقدير البروتين؟


لدي بضعة أسئلة:

  1. ما هي قيمة OD؟

  2. لماذا نستخدم المحلول الفارغ في طريقة Lowry لتقدير البروتين؟

  3. إذا كان OD للبروتين 0.01 ، فماذا يعني ذلك؟

شكرا لك مقدما.


  1. قياس OD هو ناتج ما يقيسه مقياس الضوء. إنها في الواقع كمية الضوء التي تشتت أو تمتصها عينتك - تسمى علميًا بالانقراض.
  2. يستخدم الفراغ ليكون قادرًا على استبدال تأثير الكواشف والضوء المنتشر على أسطح الكوفيت (والذي ربما يكون أيضًا غير نظيف تمامًا) وما إلى ذلك. كل هذه التأثيرات تقلل من كمية الضوء التي يجب أن تصل إلى الكاشف على الجانب الآخر من المسبار وتعطيك قراءات انقراض خاطئة. إذا كنت تستخدم عينة الكشف الملون (أي الألوان أعمق أو تفقد اللون أثناء التفاعل) فهذا أكثر وضوحًا. الحل قد انقرض بالفعل من تلقاء نفسه وهو ليس ذا فائدة. لذلك تقوم بعمل فراغ (والذي يستبدل بشكل أساسي كل هذه التأثيرات من قراءة العينة) لتصحيح ذلك. كيف يتم ذلك يعتمد على مقياس الضوء. يقوم البعض بقراءة تصحيح في البداية ، بينما يستخدم البعض الآخر كفيتًا ثانيًا (كفيت فارغ) يتم قياسه بشكل دائم.
  3. هذا يعني أن البروتين يمنحك هذا الانقراض. بدون منحنى معايرة (مصنوع من التخفيفات التسلسلية بتركيزات بروتينية معروفة) ، من المستحيل تقديم أي تعليق إضافي على هذا الرقم.

  • طول المسار ل عادة بوحدات من سم. (ملاحظة: معظم مقاييس الطيف الضوئي مصممة لقبول كفيت بعرض 1 سم)
  • معامل الانقراض المولي& إبسيلون لها وحدات من M -1 سم -1 وهي ثابتة التناسب التي تتعلق بامتصاص الضرس حلول
  • معامل الانقراض الجماعي& إبسيلون 1٪ يشير إلى امتصاص 1٪ بواسطة المحلول الشامل. عادةً ما يشير هذا إلى محلول مائي يمكننا استخدامه للحصول على كثافة 1000 جم / لتر. لذلك فإن محلول مائي بنسبة 1٪ بالكتلة يشير إلى انحلال 10 جم / لتر أو أ 10 ملغ / مل محلول جزيء الفائدة.
  • بما أن امتصاص الجزيء هو دالة لطول الموجة (أي الامتصاص لا يساوي كل طول موجي) معامل الانقراض يجب أن يشير أيضًا إلى الطول الموجي. يتم ذلك عادةً باستخدام رمز منخفض:

& إبسيلون 1٪ 280 نانومتر = 14.5 جم -1 لتر سم -1

& · في هذه الحالة محلول 10 مجم / مل من الجزيء سيكون له قراءة امتصاصية تبلغ 14.5 (وحدات بلا أبعاد) عند l = 280 نانومتر (قد لا يكون الامتصاص عند أطوال موجية أخرى معروفًا). وحدات التركيز هي g / L ، وبالتالي فإن e سيكون لها أبعاد g -1 L cm -1.

لماذا من المهم أن تكون قادرًا على قياس تركيز البروتين في العينة؟

أحد التطبيقات المهمة لـ & quot التكنولوجيا الحيوية & quot هو إنتاج البروتينات كمنتجات تجارية. قد تحتوي هذه المنتجات على تطبيقات صيدلانية (مثل الأنسولين وهرمون النمو البشري ومنشط البلازمينوجين النسيجي والإريثروبويتين وعامل تخثر الدم الثامن) ، والتطبيقات الصناعية (على سبيل المثال ، سبتيليزين (إنزيم في المنظفات) ، و 2.5-diketo-D-gluconate reductase ( إنزيم في إنتاج فيتامين ج) ، كمواد (مثل بروتين الحرير في المنسوجات ، وبروتين التصاق البرنقيل كغراء) ، وفي هذه الحالات ، هناك جوانب مختلفة للإنتاج الناجح تتطلب تحديد الكميات:

  • ما هي كمية البروتين التي يمكن إنتاجها (أي ما هي كفاءة الإنتاج)؟
  • ما مدى نقاوة البروتين الذي يتم إنتاجه (قد تتطلب التطبيقات الصناعية 90٪ نقيًا ، وقد تتطلب التطبيقات الصيدلانية 99.999٪ نقاء)

يمكن عزل هذه البروتينات من المصادر الطبيعية (على سبيل المثال ، يمكن استخراج عامل تخثر الدم الثامن من دم الإنسان) ، أو قد يتم إنتاجها بشكل متجانس (على سبيل المثال ، يمكن تعديل الخلايا البكتيرية للإشريكية القولونية وراثيًا لإنتاج هرمون النمو البشري). في كلتا الحالتين ، قد يكون من الضروري تنقية البروتين باستخدام سلسلة من خطوات التجزئة. سوف ندخل في مزيد من التفاصيل حول خطوات التجزئة هذه في محاضرة لاحقة ، ولكن الفكرة العامة هي أنه يمكن تجزئة خليط غير متجانس من الجزيئات بناءً على بعض الخصائص الفيزيائية للجزيئات. فيما يلي الخصائص التي يمكن استخدامها لتجزئة خليط غير متجانس من الجزيئات الحيوية:

  • الكتلة الجزيئية (مثل & quotbig & quot الجزيئات يمكن فصلها عن & quotsmall & quot الجزيئات)
  • pKa (يمكن فصل جزيئات & quotacidic & quot عن الجزيئات & quotbasic & quot؛
  • كره الماء (أي يمكن فصل الجزيئات غير القطبية عن الجزيئات القطبية)

بالنسبة لخطوات التجزئة هذه التي تشتمل على البروتينات ، نحتاج إلى تتبع مقدار البروتينات الملوثة التي دخلت في جزء واحد وكمية البروتين المطلوب التي تم إدخالها في الجزء الآخر. على الرغم من أن التفاصيل أكثر تعقيدًا إلى حد ما من هذا الوصف البسيط ، من المهم أن تكون قادرًا على تحديد كمية تركيز البروتين لتكون قادرًا على تنقية البروتين المطلوب بشكل فعال.

بمجرد أن يصبح البروتين نقيًا ، قد يكون من المفيد اقتصاديًا أن تكون قادرًا على تحديد كمية المحصول (وبالتالي ، القدرة على تحديد تكلفة إنتاج كتلة معينة من البروتين). على سبيل المثال ، كان المصدر الوحيد لهرمون النمو البشري (لعلاج قصر القامة) هو استخراجه من الغدد النخامية البشرية المأخوذة من أدمغة الجثث. يكفي القول ، أن هذا جعل البروتين مكلفًا للغاية. علاوة على ذلك ، فإن العزل من الأنسجة البشرية يعني أن العينة يمكن أن تكون ملوثة أيضًا بمسببات الأمراض البشرية (التهاب الكبد ، CJD ، الإيدز ، إلخ). مع ظهور الهندسة الوراثية ، كان إنتاج الخلايا البكتيرية لهرمون النمو البشري (مثل الإشريكية القولونية) يعني أنه يمكن إنتاج كميات كبيرة نسبيًا أرخص بكثير (وبدون تهديد من مسببات الأمراض البشرية).

لماذا لا تزن البروتين فقط؟

  • عادة ما تكون معظم العينات عبارة عن كميات من المليغرام أو حتى ميكروغرام ، وليس جرامات ، وبالتالي يصعب نقل وقياس مثل هذه الكميات الصغيرة
  • الماء موجود في البروتينات ، ومن الصعب للغاية إزالة كل الماء (بعض جزيئات الماء ترتبط الهيدروجين بإحكام شديد بالبروتينات). وبالتالي ، فإن قياس الكتلة سيشمل بعض المياه ، وسيزيد من الكتلة الظاهرية للبروتين

جدوى الخلية والسمية الخلوية: 5 فحوصات

نظرًا لإزالة الخلايا من البيئة الحية (في الجسم الحي) وإخضاعها للتلاعب التجريبي في أنظمة الاستزراع (في المختبر) ، فإن قابليتها للبقاء تفترض أهمية. تمثل قابلية بقاء الخلايا القدرة على وجودها وبقائها وتطورها.

يتم إجراء العديد من التجارب على الخلايا في المستنبت بدلاً من استخدام النماذج الحيوانية. هذا هو الحال بشكل خاص فيما يتعلق بتحديد السلامة والسمية الخلوية للعديد من المركبات (الأدوية ، مستحضرات التجميل ، الأدوية المضادة للسرطان ، المضافات الغذائية). يعتبر الاختبار في المختبر للسمية الخلوية وتقييم السلامة في الواقع فعالاً من حيث التكلفة ، إلى جانب تقليل استخدام الحيوانات.

تشمل الدراسات حول السمية الخلوية على نطاق واسع التغيرات الأيضية للخلايا ، بما في ذلك موت الخلايا نتيجة للتأثيرات السامة للمركبات. على سبيل المثال ، في حالة الأدوية المضادة للسرطان ، قد يبحث المرء عن موت الخلايا ، بينما بالنسبة لمستحضرات التجميل ، قد تكون التغيرات الأيضية والاستجابات التحسسية أكثر أهمية.

هناك عدة فحوصات تم تطويرها في المختبر لقياس قابلية الخلية للبقاء والسمية الخلوية.

يتم تصنيفها على نطاق واسع إلى الأنواع التالية:

أنا. فحوصات السمية الخلوية والجدوى.

أنا. فحوصات السمية الخلوية والجدوى:

تعتمد غالبية فحوصات السمية الخلوية والجدوى على قياس سلامة الغشاء ، والتنفس الخلوي ، ودمج النظائر المشعة ، والمقايسات اللونية ، والاختبارات القائمة على التلألؤ.

بناءً على سلامة الغشاء:

تستند القياسات الأكثر شيوعًا لصلاحية الخلية إلى سلامة الغشاء. قد يحدث تلف الغشاء بسبب تفكك الخلايا أو انفصالها أو تجميدها وذوبانها. يمكن تحديد سلامة الغشاء عن طريق امتصاص الأصباغ التي تكون الخلايا القابلة للحياة غير منفذة لها (مثل أسود النفثالين ، أو أزرق تريبان ، أو إريثروسين) أو إطلاق الأصباغ التي عادة ما يتم التقاطها والاحتفاظ بها بواسطة خلايا قابلة للحياة (مثل الأحمر المحايد ، ثنائي الأسيتيل فلوريسئين).

المقايسات الأخرى لسلامة الغشاء هي إطلاق الكروم المسمى (51 Cr) والإنزيمات واستخدام مجسات الفلورسنت. تعتبر قياسات صلاحية الخلية ، بناءً على سلامة الغشاء ، فورية ويمكن اكتشافها في غضون ساعات قليلة. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه القياسات التنبؤ بالبقاء النهائي للخلايا.

يعتمد مبدأ هذا الاختبار على حقيقة أن الخلايا القابلة للنفاذ غير منفذة للعديد من الأصباغ مثل النفثالين الأسود والأزرق الترباني ويوزين Y والأخضر النيجروسين والإريثروسين ب.تتكون التقنية أساسًا من خلط الخلايا في التعليق مع الصبغة وفحصها لهم تحت المجهر. يتم حساب الخلايا المصبوغة والعدد الإجمالي للخلايا. تمثل النسبة المئوية للخلايا غير الملوثة الخلايا القابلة للحياة.

فحص استبعاد الصبغ مناسب ومناسب للثقافات المعلقة من الطبقات الأحادية. هذا يرجع إلى حقيقة أنه عندما تنفصل الخلايا الميتة عن الطبقات الأحادية فإنها تفقد من الفحص. القيد الرئيسي لهذا الاختبار هو أن الخلايا الميتة التناسلية لا تأخذ الصبغة ، وسيتم احتسابها كما لو كانت قابلة للحياة.

يمكن للخلايا القابلة للحياة أن تمتص صبغة ثنائي الأسيتيل فلوريسين وتتحلل بالماء إلى فلوريسئين. يتم تعليق هذا الأخير بواسطة الخلايا القابلة للحياة ، لأنه غير منفذة للغشاء. وبالتالي فإن الخلايا القابلة للحياة تنبعث منها الفلورسين الأخضر بينما الخلايا الميتة لا تنبعث منها. وبالتالي ، يمكن تحديد الخلايا القابلة للحياة.

مقايسة امتصاص الكروم المسمى:

الكروم المسمى (51 Cr) يرتبط بالبروتينات داخل الخلايا من خلال الأحماض الأمينية الأساسية. عندما يتلف غشاء الخلية ، تتسرب البروتينات المصنفة من الخلية وتكون درجة التسرب متناسبة مع مقدار الضرر. يتم استخدام طريقة امتصاص 51 Cr في الدراسات المناعية لتحديد النشاط السام للخلايا اللمفاوية التائية ضد الخلايا المستهدفة.

فحوصات إطلاق الإنزيم:

يمكن أيضًا تقييم سلامة غشاء الخلايا عن طريق تقدير الإنزيمات المنبعثة. كان اللاكتات ديهيدروجينيز (LDH) هو الإنزيم الأكثر استخدامًا لهذا الغرض.

بناءً على التنفس الخلوي:

يمكن استخدام تنفس الخلايا المقاس باستخدام الأكسجين أو إنتاج ثاني أكسيد الكربون لتقييم صلاحية الخلية. يتم ذلك عادةً باستخدام مقياس ضغط Warburg.

بناءً على دمج النظائر المشعة:

باستخدام ركائز أو مستقلبات ذات علامات إشعاعية ، يمكن اكتشاف العلامة الإشعاعية في المنتجات المتكونة. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لفحوصات السمية الخلوية للأدوية. يتم تقديم بعض طرق دمج النظائر المشعة المهمة بإيجاز.

يتم استخدام دمج (3 H) thymidine في DNA و (3 H) uridine في RNA على نطاق واسع لقياس سمية الأدوية.

يتم تمييز الخلايا مسبقًا بـ 32 P. عندما يحدث الضرر للخلايا ، فإنها تطلق الفوسفات المسمى الذي يمكن قياسه. يمكن تقييم فعالية الأدوية من خلال هذا النهج.

على أساس المقايسات اللونية:

التطورات الأخيرة في المقايسات اللونية باستخدام قارئات متناهية الصغر متطورة تستخدم بشكل مثمر لتقدير الخلايا. لوحظ وجود علاقة جيدة بين رقم الخلية والمقايسة اللونية.

فيما يلي بعض النقاط البارزة في هذا النهج:

أنا. يمكن تقدير محتوى البروتين بواسطة الميثيلين الأزرق والأسود أميدو والسلفوروودامين. في طريقة Lowry لتقدير البروتين ، يتم استخدام كاشف Folin-Ciocalteau.

ثانيا. يمكن قياس كمية الحمض النووي عن طريق تلطيخ الأصباغ الفلورية على سبيل المثال 2-ديامينودينو- فينيليندون.

ثالثا. نشاط الجسم الليزوزومي وجولجي باستخدام اللون الأحمر المحايد.

رابعا. فحوصات نشاط الإنزيم على سبيل المثال هيكسوسامينيداز ، نازعة هيدروجين السكسينات الميتوكوندريا.

بناءً على اختبار اللمعان:

يمكن قياس صلاحية الخلايا بحساسية جيدة عن طريق تقدير مستويات ATP عن طريق الاختبار المعتمد على التلألؤ. يعتمد المبدأ على رد الفعل التالي.

تم الإبلاغ عن حساسية جيدة لهذا الاختبار للخلايا في نطاق 20 إلى 2 × 10 7 خلية / مل.

تقتل معظم الأدوية المضادة للسرطان الخلايا عن طريق الاستماتة والتي يمكن قياسها لتقييم السمية الخلوية. يمكن اكتشاف موت الخلايا المبرمج بالطرق التالية.

أنا. التغييرات في التشكل.

ثانيا. الكشف عن سيرين الفوسفاتيديل في الغشاء باستخدام الملحق V المترافق مع فلورسين أيزوثيوسيانات (FITC) أو البيوتين.

ثانيا. فحوصات البقاء على قيد الحياة:

الاختبارات الموصوفة أعلاه لقياس قابلية الخلية للبقاء والسمية الخلوية قصيرة الأجل ، وهي تحدد الخلايا الميتة / الحية في وقت الفحص. في كثير من الأحيان ، عندما تتعرض الخلايا للتسمم (أي تتعرض للعقاقير ، أو تشعيعها) ، فإن التأثيرات ليست فورية ، ولكن يمكن ملاحظتها بعد عدة ساعات أو أحيانًا حتى أيام. تُفضل الاختبارات القائمة على بقاء الخلايا (أي الاحتفاظ بالقدرة التجديدية أو السلامة الإنجابية).

في المقايسة المستنسخة ، يتم قياس بقاء الخلايا من خلال كفاءة الطلاء (أي النسبة المئوية للخلايا المصنفة في ثقافة فرعية والتي تؤدي إلى ظهور مستعمرات). تقيس كفاءة الطلاء القدرة التكاثرية لعدة أجيال من الخلايا.

يتكون اختبار كلونوجينيك على نطاق واسع من المراحل التالية:

1. معالجة الخلايا بتركيزات مختلفة من العامل التجريبي لحوالي 24 ساعة.

2. التربسين يليه بذر الخلايا بكثافة منخفضة.

3. حضانة الخلايا لمدة 1-3 أسابيع.

4. تلطيخ وحساب المستعمرات.

يوضح الشكل 38.1 منحنى البقاء (مخطط شبه السجل) الذي يمثل جزء بقاء الخلايا مقابل تركيز الدواء. يشير التركيز المثبط (IC) إلى تركيز الدواء المطلوب لتثبيط بقاء الخلايا. وهكذا ، IC50 وجيم90 تمثل تركيزات المركب التي تثبط على التوالي 50٪ و 90٪ من تكوين المستعمرة.

كما يتضح من الرسم البياني ، فإن المنحنى به ركبة حيث يوجد IC50 الأكاذيب ، بينما IC90 يقع في النطاق الخطي. لذلك ، ستكون الاختلافات أكثر أهمية في النطاق الخطي.

يتأثر المقايسة المستنسخة بعدة عوامل ، أهمها مذكورة:

أنا. تركيز العامل السام.

ثالثا. كثافة الخلايا أثناء التعرض.

رابعا. كثافة الخلية أثناء الاستنساخ.

مقايسة السمية الخلوية القائمة على MTT:

يُعرف ملح التيرازوليوم 3 ، (4.5-ثنائي ميثيل-ثيازول- 2-ييل) -2 ، 5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد) باسم MTT. إنه صبغ ، ويستخدم على نطاق واسع في فحوصات السمية الخلوية. تتعرض الخلايا النامية في مرحلة السجل لعقار سام للخلايا. ثم يتم إزالة الدواء والسماح للخلايا بالتكاثر لمضاعفة عدد السكان 2-3 مرات (PDTs). يمكن الكشف عن عدد الخلايا الباقية عن طريق تقليل صبغة MTT. يمكن تحديد تركيز MTT-formazan المتكون بطريقة طيفية.

يتم إجراء فحص السمية الخلوية القائم على MTT في المراحل التالية:

1. حضانة الثقافات أحادية الطبقة بتركيزات دوائية متفاوتة في ألواح المعايرة الدقيقة.

2. إزالة الدواء وتغذية الأطباق لتحقيق 2-3 PDTs.

3. معالجة الألواح مع MTT ، وإزالة الوسط و MTT.

4. قياس MTT-formazan في قارئ لوحة ELISA.

عندما يتم رسم امتصاص آبار الاختبار / آبار التحكم في الصفيحة الدقيقة مقابل تركيز الدواء السام للخلايا ، يتم الحصول على منحنى السيني.

ثالثا. فحوصات التمثيل الغذائي:

تستند فحوصات التمثيل الغذائي على قياسات الاستجابات الأيضية للخلايا. يتم إجراء هذا الاختبار بعد تعرض الخلايا للأدوية السامة للخلايا (إما فورًا أو بعد مضاعفة عدد السكان 2-3). القياسات الأيضية الأكثر شيوعًا هي الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو تخليق البروتين (عن طريق تقدير تركيزها) ، إلى جانب فحص بعض إنزيمات ديهيدروجينيز.

حدود المقايسات الأيضية:

قد يكون تقدير المحتوى الإجمالي لبروتين الحمض النووي مؤشراً أو لا يشير إلى زيادة في عدد الخلايا. وذلك لأن هذه المقايسات لا يمكن أن تميز بين النشاط التكاثري والتمثيل الغذائي للخلايا. لذلك يفضل بعض العمال تأكيد القياسات الأيضية عن طريق مقايسة بقاء القولون.

رابعا. فحوصات التحول:

فيما يلي المقايسات شائعة الاستخدام لقياس التحول في المختبر:

أنا. دليل على حدوث الطفرات.

ثانيا. استقلال أنكوراج.

ثالثا. انخفاض كثافة الحد من تكاثر الخلايا.

يمكن تقييم الطفرات عن طريق التبادل الكروماتيد الشقيق (SCE). تتضمن SCE بشكل أساسي التبادل المتبادل لشرائح الحمض النووي بين الكروماتيدات الشقيقة في مواضع متطابقة في المرحلة S من دورة الخلية. التبادلات الكروماتيدية الشقيقة أكثر حساسية للطفرات من الانكسارات الصبغية. لهذا السبب ، تُفضل SCEs في أبحاث الطفرات ومقايسة التحول. تتضمن تقنية SCE بشكل أساسي دمج النيوكليوتيدات المشعة في تكرار الحمض النووي واكتشاف SCEs عن طريق التألق بالإضافة إلى تقنية Giemsa (FPG).

V. فحوصات الالتهاب:

فحوصات الالتهاب مطلوبة لاختبار الأشكال المختلفة للحساسية التي تسببها مستحضرات التجميل والمستحضرات الصيدلانية وغيرها من الكائنات الحية الغريبة. هذه المقايسات هي في المراحل الأولى من التطور في خلايا الثقافة.


نتائج

لتقييم بروتوكولات معايرة OD الثلاثة المرشحة ، قمنا بتنظيم دراسة بين المختبرات كجزء من مسابقة 2018 الدولية للآلة المهندسة وراثيًا (iGEM). يتم تقييم دقة ومتانة كل بروتوكول على أساس التباين بين التكرارات ، وبين المستويات المرجعية ، وبين المختبرات. تم بعد ذلك تقييم الفعالية الإجمالية للبروتوكولات بناءً على قابلية استنساخ القياسات عبر المختبرات للفلورة الخلوية ، كما تم تطبيعها بواسطة قياسات OD التي تمت معايرتها.

جمع البيانات التجريبية

تم تزويد كل فريق مساهم بمجموعة من مواد المعايرة ومجموعة من ثمانية تركيبات وراثية هندسية للتعبير التأسيسي لـ GFP على مجموعة متنوعة من المستويات. على وجه التحديد ، تتألف التركيبات من عنصر تحكم سلبي ، وعنصر تحكم إيجابي ، وستة بنيات اختبار كانت متطابقة باستثناء المروجين من مكتبة Anderson 11 ، والتي تم اختيارها لإعطاء مجموعة من تعبير GFP (موضحة في الشكل 1 أ ، مع التفاصيل الكاملة الواردة في البيانات التكميلية 1). على وجه الخصوص ، تم اختيار عناصر التحكم الإيجابية والسلبية والمروجين J23101 و J23106 و J23117 بناءً على استخدامها الناجح السابق في دراسة iGEM المشتركة 9 2016 كعناصر تحكم ومستويات اختبار "عالية" و "متوسطة" و "منخفضة" ، على التوالى. أبعد من ذلك ، تم اختيار J23100 و J23104 كبدائل محتملة لـ J23101 (التي كانت هناك تقارير سابقة حول صعوبة التحويل) ، وتم اختيار J23116 كقيمة وسيطة في الفجوة الكبيرة في مستويات التعبير بين J23106 و J23117 (لم تكن القيم المتوقعة إلى الفرق ، ومع ذلك). تم استخدام هذه المواد بعد ذلك لاتباع بروتوكول المعايرة وقياس الخلية (انظر قسم "الطرق" ملاحظة تكميلية: قارئ اللوحة وبروتوكول CFU والملاحظة التكميلية: بروتوكول مقياس التدفق الخلوي).

أ قام كل فريق بتربية ثماني سلالات هندسية بكتريا قولونية التعبير عن GFP على مستويات مختلفة: الضوابط الإيجابية والسلبية بالإضافة إلى مكتبة من ستة بنيات اختبار مع المروجين المختارين لإعطاء مجموعة من مستويات التعبير. جمع كل فريق أيضًا أربع مجموعات من قياسات المعايرة ، ب معايرة الفلورسين لمعايرة مضان GFP ، بالإضافة إلى ثلاثة بروتوكولات بديلة لمعايرة الامتصاصية عند 600 نانومتر: ج التخفيف والنمو لوحدات تكوين المستعمرات (CFU) ، د LUDOX والماء ، و ه التخفيف التسلسلي لـ 0.961 ميكرومتر من جزيئات السيليكا أحادية التشتت.

كل فريق تحول بكتريا قولونية K-12 DH5-alpha مع التركيبات الجينية المقدمة ، زراعة مكررين بيولوجيين لكل من التركيبات الثمانية. قامت الفرق بقياس الامتصاصية عند 600 نانومتر (OD600) و GFP في قارئ لوحة من أربعة مكررات تقنية لكل تكرار بيولوجي (لما مجموعه ثماني مكررات وملائمة على لوحة 96 بئر) عند نقطتي الوقت 0 و 6 ساعات ، جنبًا إلى جنب مع الوسائط الفراغات ، وبالتالي إنتاج إجمالي 144 قياس OD600 و 144 GFP لكل فريق. تم اختيار ست ساعات كفترة كافية للنمو الأسي ، ويستخدم قياس ساعة الصفر فقط للمقارنة لاستبعاد العينات التي فشلت في النمو بشكل جيد. طُلب من الفرق التي لديها إمكانية الوصول إلى مقياس التدفق الخلوي جمع قياسات GFP ومبعثر لكل عينة ، بالإضافة إلى عينة من SpheroTech Rainbow Calibration Beads 12 لمعايرة التألق.

تمت معايرة قياسات مضان GFP باستخدام التخفيف التسلسلي للفلوريسين مع برنامج تلفزيوني رباعي المضاعفات ، باستخدام البروتوكول من المرجع. 9 ، كما هو موضح في الشكل 1 ب. البدء بتركيز معروف من الفلوريسين في برنامج تلفزيوني يعني أن هناك عددًا معروفًا من جزيئات الفلورسين لكل بئر. يمكن بعد ذلك تقدير عدد الجزيئات لكل وحدة مضان تعسفية عن طريق قسمة العدد المتوقع للجزيئات في كل بئر على التألق المقاس للبئر ، ويمكن إجراء حساب مماثل للتركيز.

تمت معايرة قياسات OD عبر الامتصاصية عند 600 نانومتر (OD600) باستخدام ثلاثة بروتوكولات ولكل منها تم تصميم نموذج لغرض ملاءمة البيانات التي تم الحصول عليها في الدراسة (الطرق):

معايرة وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) ، الموضحة في الشكل 1 ج: تم أخذ عينات من أربع ثقافات ليلية (اثنان من الضوابط الإيجابية والسلبية) ، في ثلاث نسخ ، وتم تخفيف كل عينة إلى 0.1 OD ، ثم تم تخفيفها بشكل متسلسل ، والتخفيفات الثلاثة الأخيرة تنتشر على لوحات الزراعة البكتيرية للحضانة وعد المستعمرات (ما مجموعه 36 لوحة لكل فريق). يتم تقدير عدد CFU لكل OD لكل مل بضرب عدد المستعمرات بواسطة التخفيف المتعدد. يتمتع هذا البروتوكول بميزة كونه راسخًا وغير حساس للخلايا والحطام غير القابل للحياة ، ولكن عيوب عدد غير واضح من الخلايا لكل وحدة زعمية متفرعة ، ومن المحتمل أن يكون هناك تباين إحصائي مرتفع عندما يكون عدد المستعمرات منخفضًا ، وتكون كثيفة العمالة.

مقارنة بين السيليكا الغروية (LUDOX CL-X) والماء ، موضحة في الشكل 1 د: هذا البروتوكول مقتبس من المرجع. 9 عن طريق استبدال تركيبة السيليكا الغروية الأكثر كثافة وتحمل التجمد (لتسهيل الشحن). يتم إجراء القياسات الرباعية لكل من LUDOX CL-X والمياه ، مع التحويل من الوحدات التعسفية إلى قياس OD في كفيت مقياس الطيف الضوئي القياسي المقدّر كنسبة اختلافها إلى قياس OD لـ LUDOX CL-X في مقياس الطيف الضوئي المرجعي. يتمتع هذا البروتوكول بميزة استخدام مواد رخيصة ومستقرة للغاية ، ولكن العيب هو أن LUDOX CL-X يوفر قيمة مرجعية واحدة فقط ، وأنه يقوم بمعايرة اختلافات الأداة في تحديد OD ولكن لا يمكن استخدامه لتقدير عدد الخلايا ، حيث أن جميع درجات جسيمات LUDOX أصغر بكثير من الخلايا (& lt50 نانومتر).

مقارنة مع التخفيف التسلسلي للكريات المجهرية من السيليكا ، كما هو موضح في الشكل 1 هـ: يستخدم هذا البروتوكول الجديد ، المستوحى من العلاقة بين حجم الجسيمات وعددها و OD 7 ، بروتوكول التخفيف التسلسلي رباعي المضاعفات من 0.961 ميكرون قطرها أحادي التشتت جزيئات السيليكا في الماء ، مماثلة لتخفيف الفلورسين ، ولكن بمواد مختلفة. يتم اختيار هذه الجسيمات لتتناسب مع الحجم التقريبي والخصائص البصرية بكتريا قولونية، مع الجسيمات التي لها معامل انكسار 1.4 (حسب مواصفات الشركة المصنعة) ونموذجي بكتريا قولونية تتراوح من 1.33 إلى 1.41 7. مع تركيز بداية معروف للجسيمات ، يتم تقدير عدد الجسيمات لكل وحدة OD بقسمة العدد المتوقع للجسيمات في كل بئر على OD المقاس للبئر. يتمتع هذا البروتوكول بمزايا التكلفة المنخفضة والتخطيط المباشر بين الجسيمات و OD ، ولكن العيب الذي تميل الكرات المجهرية إلى الاستقرار فيه وتكون حساسة للتجميد.

تم قبول البيانات من كل فريق فقط إذا استوفوا مجموعة من معايير جودة البيانات الدنيا (ملاحظة تكميلية: معايير قبول البيانات) ، بما في ذلك القيم غير السلبية ، والتحكم الإيجابي أكثر إشراقًا بشكل ملحوظ من عنصر التحكم السلبي ، والقيم المقاسة للمعايرة المتناقصة كلما زاد التخفيف. في المجموع ، قدم 244 فريقًا بيانات تستوفي هذه المعايير الدنيا ، مع 17 فريقًا قدموا أيضًا بيانات قياس التدفق الخلوي القابلة للاستخدام. تتوفر مجموعات بيانات كاملة مجهولة المصدر ونتائج التحليل في البيانات التكميلية 2.

متانة بروتوكولات المعايرة

قمنا بتقييم متانة بروتوكولات المعايرة قيد الاختبار بطريقتين: تكرار الدقة والبقايا. يمكن تقييم دقة النسخ المتماثل ببساطة من حيث تشابه القيم لكل تكرار تقني للبروتوكول. كلما كان معامل الاختلاف أصغر (أي نسبة الانحراف المعياري إلى المتوسط) ، كان البروتوكول أكثر دقة. فيما يتعلق بالبقايا ، من ناحية أخرى ، نظرنا في الآلية النموذجية التي تكمن وراء كل طريقة معايرة وتقييم مدى ملاءمتها للبيانات. هنا ، المتبقي هو المسافة بين كل قيمة مقاسة يقدمها الفريق والقيمة المتوقعة لنموذج مناسب باستخدام نفس مجموعة البيانات (انظر طرق للحصول على تفاصيل كل نموذج آلية والحسابات المتبقية). كلما كانت القيمة المتبقية أصغر ، زادت دقة البروتوكول. علاوة على ذلك ، كلما كانت دقة النسخ المتماثل والمخلفات عبر الفرق أكثر تشابهًا ، كلما كان البروتوكول أكثر قوة للتغيرات في ظروف التنفيذ.

يوضح الشكل 2 توزيع معاملات التباين (CVs) لجميع التكرارات الصالحة لكل مادة من مواد المعايرة (انظر طرق معايير الصلاحية). بالنسبة إلى CFU ، تشير نظرية أخذ العينات الأساسية إلى أن التخفيف مع أكبر عدد من المستعمرات المتميزة (أقل تخفيف) يجب أن يكون له أفضل سيرة ذاتية ، وهذا هو الحال بالفعل بالنسبة لـ 81.6٪ من العينات. هذه النسبة منخفضة بشكل مدهش ، ومع ذلك ، وتشير إلى درجة أعلى من الاختلاف مما يمكن تفسيره من خلال العشوائية المتأصلة في البروتوكول: يجب أن تتبع عينات CFU توزيعًا ذي حدين وأن يكون لها سيرة ذاتية أعلى قليلاً بأكثر من 3 أضعاف مع كل 10 أضعاف التخفيف ، ولكن في المتوسط ​​كان أقل من ذلك بكثير. يشير هذا إلى وجود مكون كبير من التباين بمصدر غير معروف ، وهو ما تؤكده حقيقة أنه حتى أفضل السير الذاتية عالية جدًا: أفضل التخفيفات الثلاثة لكل فريق يحتوي على CV 0.1 لـ 2.1٪ فقط من الكل مجموعات البيانات و CV 0.2 لـ 16.4٪ فقط من جميع مجموعات البيانات.

يتم إنشاء نماذج CFU من أفضل التخفيفات الأخرى فقط (الزرقاء) الموضحة أعلاه بشكل منفصل. ومع ذلك ، حتى أفضل تخفيفات CVU لديها توزيع أسوأ بكثير من الطرق الأربعة الأخرى ، وغالبًا ما لا تكون أقل تخفيف (الصلبان الحمراء). من بين الأنواع الأخرى ، فإن LUDOX (أرجواني) والماء (أزرق فاتح) لهما أفضل توزيعات شبه متطابقة ، في حين أن الكرات المجهرية (السوداء) والفلوريسين (الأخضر) أعلى قليلاً فقط.

يحتوي LUDOX والماء على أدنى سيرة ذاتية ، عند CV 0.1 لـ 86.9٪ (LUDOX) و 88.1٪ (ماء) من جميع مجموعات التكرار و CV 0.2 لـ 97.1٪ (LUDOX) و 98.0٪ (ماء) من جميع مجموعات التكرار. تحتوي الكرات المجهرية والفلورسين على سيرة ذاتية أعلى قليلاً ، عند CV 0.1 لـ 80.8٪ (كرات مجهرية) و 76.9٪ (فلوريسئين) من جميع مجموعات النسخ المتماثل و CV 0.2 لـ 93.9٪ (كريات مجهرية) و 92.4٪ (فلوريسئين) من جميع مجموعات التكرار. من المحتمل أن يكون الاختلاف بين هذين الزوجين مستمدًا من حقيقة أن كل من LUDOX وعينات الماء يتم إنتاجهما في خطوة واحدة فقط ، في حين أن التخفيف التسلسلي للكريات المجهرية والفلورسين يسمح بتراكم عدم الدقة في إنتاج عينات لاحقة.

يتم تحديد دقة بروتوكول المعايرة في النهاية من خلال كيفية تفسير مجموعات البيانات المكررة عبر الدراسة بشكل مشترك لتحديد معلمات نموذج بروتوكول المعايرة ، جزء منها هو وظيفة القياس التي تحدد بين الوحدات التعسفية والوحدات المعايرة. كما هو مذكور أعلاه ، يمكن تقييم ذلك من خلال النظر في البقايا في الملاءمة بين القيم المرصودة ومدى ملاءمتها لنموذج البروتوكول. للقيام بذلك ، قمنا أولاً بتقدير معلمات المعايرة من القيم التجريبية المرصودة (انظر طرق حساب قياس الوحدة لكل طريقة معايرة) ، ثم استخدمنا النموذج الناتج "للتنبؤ" بما يجب أن تكون عليه هذه القيم (على سبيل المثال ، 10 أضعاف مستعمرات أقل بعد تخفيف 10 أضعاف). كلما كانت النسبة أقرب إلى واحد ، زاد عمل البروتوكول وفقًا للنظرية التي تدعم استخدامه للمعايرة ، وبالتالي زاد احتمال أن تنتج عملية المعايرة قيمة دقيقة.

هنا نرى ضعفًا حرجًا في بروتوكول LUDOX / الماء: توفر عينات LUDOX والمياه قياسين فقط ، حيث يتم تعيين معلمتين نموذجيتين: الخلفية للطرح (المحددة بواسطة الماء) والقياس بين LUDOX المطروح في الخلفية و مرجع OD. وبالتالي ، فإن أبعاد النموذج تتطابق بدقة مع أبعاد العينات التجريبية ، ولا توجد بقايا للتقييم. على هذا النحو ، قد يكون بروتوكول LUDOX / الماء دقيقًا بالفعل ، ولكن لا يمكن تقييم دقته تجريبياً من البيانات التي ينتجها. إذا حدث خطأ ما في الكواشف أو تنفيذ البروتوكول أو الأداة ، فلا يمكن اكتشاف مثل هذه المشكلات ما لم تكن كبيرة لدرجة تجعل البيانات غير صالحة بشكل واضح (على سبيل المثال ، يكون OD للماء أقل من OD لـ LUDOX).

ومع ذلك ، فإن بروتوكول CFU وبروتوكولي التخفيف التسلسلي لهما مستويات تخفيف متعددة ، مما يؤدي إلى الإفراط في تقييد النموذج ويسمح بتقييم الدقة المحتملة. يوضح الشكل 3 توزيع المخلفات لهذه البروتوكولات الثلاثة ، في شكل نسبة بين المتوسط ​​المرصود لكل مجموعة مكررة والقيمة التي تنبأ بها النموذج تتناسب مع جميع مجموعات النسخ المتماثل. يعمل بروتوكول CFU مرة أخرى بشكل سيئ للغاية ، كما قد نتوقع بناءً على السيرة الذاتية الضعيفة حتى لأفضل التكرارات: 7.3 ٪ فقط من مجموعات النسخ المتماثلة الصالحة لها بقايا ضمن 1.1 ضعف ، و 14.0 ٪ فقط ضمن 1.2 ضعف ، وبشكل عام هندسية الانحراف المعياري للمخلفات هو 3.06 ضعف - مما يعني أن القيم يمكن الاعتماد عليها فقط في حدود اثنين تقريبًا من حيث الحجم! علاوة على ذلك ، التوزيع غير متماثل ، مما يشير إلى أن بروتوكول CFU قد يقلل بشكل منهجي من عدد الخلايا في العينة الأصلية. وبالتالي فإن دقة بروتوكول CFU تبدو غير موثوقة للغاية.

أ نموذج التوزيع المتبقي المناسب لكل نسخة متماثلة في بروتوكولات معايرة CFU (أزرق) ، و microsphere ، و fluorescein (جميع الفرق متضمنة). ب يُظهر توسيع المحور Y للتركيز على توزيعات الكرة الدقيقة والفلوريسين أن دمج معلمة نموذجية لخطأ الماصات المنهجي (الأسود والأخضر) ينتج توافقًا أفضل بشكل ملحوظ (وبالتالي من المحتمل أن تكون معايرة الوحدة أكثر دقة) من المتوسط ​​الهندسي البسيط على عوامل القياس ( أحمر ، أرجواني).

من ناحية أخرى ، أنتج بروتوكول التخفيف microsphere نتائج أكثر دقة. حتى مع وجود نموذج بسيط فقط للتخفيف التام ، فإن المخلفات تكون منخفضة جدًا (الخط الأحمر في الشكل 3 ب) ، حيث تحتوي على 61.0٪ من التكرارات الصالحة ضمن 1.1 ضعفًا ، و 83.6٪ ضمن 1.2 ضعفًا ، والانحراف المعياري الهندسي الإجمالي 1.152 -يطوى. ومع ذلك ، كما هو مذكور أعلاه ، مع التخفيف التسلسلي ، قد نتوقع أن يتراكم الخطأ بشكل منهجي مع كل تخفيف ، وبالفعل تميل تسلسلات القيمة في مجموعات البيانات الفردية إلى إظهار منحنيات تشير إلى خطأ نظامي في الماصات. عندما يتم توسيع النموذج ليشمل خطأ نظامي في الماصات (انظر القسم الفرعي للطرق في "نموذج خطأ الماص المنهجي") ، تتحسن النتائج بشكل ملحوظ (الخط الأسود في الشكل 3 ب) ، إلى 82.4٪ من التكرارات الصالحة ضمن 1.1 ضعف ، 95.5٪ داخل 1.2 ضعفًا ، وتحسن الانحراف المعياري الهندسي العام إلى 1.090 ضعفًا. يوفر التخفيف الفلوريسين نتائج متطابقة تقريبًا: مع نموذج تخفيف مثالي (خط أرجواني في الشكل 3 ب) ، يحتوي على 71.1٪ من التكرارات الصالحة ضمن 1.1 ضعفًا ، و 88.2٪ ضمن 1.2 ضعفًا ، وانحراف معياري هندسي إجمالي 1.148 ضعفًا ، وخطأ سحب منهجي يحسن النموذج (الخط الأخضر في الشكل 3 ب) ، إلى 88.1٪ من التكرارات الصالحة في حدود 1.1 ضعف ، و 98.0٪ ضمن 1.2 ضعف ، والانحراف المعياري الهندسي الإجمالي 1.085 ضعفًا.

بناءً على تحليل الخصائص الإحصائية لبيانات المعايرة ، قد نستنتج أن بروتوكولات التخفيف الدقيقة والفلورية قوية للغاية ، وتنتج نتائج دقيقة ، ومن المحتمل أن تكون دقيقة ، ويتم تقييمها بسهولة لجودة التنفيذ على أساس نموذج المعايرة المخلفات. كما أن بروتوكول LUDOX / الماء دقيق للغاية وقد يكون دقيقًا ، ولكن لا يمكن تقييم جودة تنفيذه بشكل مباشر نظرًا لافتقارها إلى المخلفات. من ناحية أخرى ، يبدو أن بروتوكول CFU يمثل مشكلة كبيرة ، مما ينتج عنه معايرات غير موثوقة ومن المحتمل أن تكون غير دقيقة.

استنساخ ودقة تقديرات عدد الخلايا

يمكن تقييم قابلية استنساخ ودقة بروتوكولات المعايرة من خلال تطبيقها على معايرة التألق من بكتريا قولونية، كما تم تطبيعه بواسطة قياسات OD معايرة. يوضح الشكل 4 قيم التألق المحسوبة لكل من مجموعات معايرة الفلورة / OD الثلاثة ، وكذلك لقياس التدفق الخلوي المعاير ، باستثناء البيانات ذات المعايرة الضعيفة أو القيم الخارجية لنمو المستعمرة أو مضان التحكم الإيجابي (لمزيد من التفاصيل ، انظر طرق تحديد صلاحية بكتريا قولونية البيانات). بشكل عام ، كان التباين من مختبر إلى آخر صغيرًا بشكل عملي ، حيث كان المتوسط ​​الهندسي للانحرافات المعيارية الهندسية لكل جهاز اختبار 2.4 ضعفًا لمعايرة CFU ، و 2.21 ضعفًا لمعايرة LUDOX / الماء ، و 2.21 ضعفًا لتخفيف الكرة الدقيقة معايرة. هذه القيم مشابهة تمامًا لتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقًا في المرجع. 9 ، والتي سجلت انحرافًا معياريًا هندسيًا بمقدار 2.1 ضعفًا لـ LUDOX / الماء.

مضان قياس أجهزة الاختبار بعد 6 ساعات من النمو باستخدام أ معايرة CFU ، ب LUDOX / معايرة الماء ، ج معايرة التخفيف microsphere ، و د التدفق الخلوي. في كل مربع ، يشير اللون الأحمر الزائد إلى المتوسط ​​الهندسي ، ويشير الخط الأحمر إلى الوسيط ، وتشير الحواف العلوية والسفلية إلى النسب المئوية 25 و 75 ، وتمتد الشعيرات من 9 إلى 91٪. عدد الفريق حسب الحالة المنصوص عليها في البيانات التكميلية 3.

لاحظ أن هذه الانحرافات المعيارية يهيمن عليها أيضًا التباين العالي الملاحظ في التركيبات مع J23101 و J23104 ، وكلاهما يبدو أنهما عانوا من صعوبات ملحوظة في الزراعة ، مع فشل العديد من عينات الفرق في النمو لهذه التركيبات ، بينما نمت البنى الأخرى كثيرًا بشكل أكثر موثوقية (انظر الشكل التكميلي 1). يؤدي حذف التركيبات الإشكالية إلى إيجاد اختلافات بمقدار 2.02 ضعفًا لمعايرة CFU ، و 1.84 ضعفًا لمعايرة LUDOX / الماء ، و 1.83 ضعفًا لمعايرة التخفيف المجهرية. يتشابه قياس التدفق الخلوي في هذه الحالة أيضًا ، على الرغم من وجود تباين أعلى إلى حد ما في هذه الحالة ، عند 2.31 ضعفًا (ربما يرجع ذلك إلى العدد الأصغر بكثير من التكرارات والفرص الإضافية للتباين في تنفيذ البروتوكول). تشير هذه القيم مجتمعةً إلى أنه عند ترشيحها باستخدام مراقبة الجودة بناءً على دقة النسخ المتماثل والإحصاءات المتبقية المحددة أعلاه ، فإن جميع طرق معايرة OD الثلاثة قادرة على إنتاج قياسات عالية التكرار عبر المختبرات.

لتحديد دقة تقديرات عدد الخلايا ، قمنا بمقارنة القياسات المجمعة الطبيعية (التألق الكلي مقسومًا على عدد الخلايا المقدر) مقابل قياسات وحيدة الخلية للتألق من قياس التدفق الخلوي المعاير ، والذي يوفر قياسًا مباشرًا للفلورة لكل خلية دون الحاجة إلى التقدير عدد الخلايا (انظر طرق "معالجة بيانات قياس التدفق الخلوي" للحصول على تفاصيل تحليلية). في هذه المقارنة ، من المتوقع أن يسمح العد الدقيق للخلايا بقياس الفلورة السائبة الذي تم تطبيعه بواسطة عدد الخلايا ليطابق بشكل وثيق قيمة التألق لكل خلية التي ينتجها قياس التدفق الخلوي. عند إجراء هذه المقارنة ، هناك بعض الاختلافات التي يجب مراعاتها بين الطريقتين. عادةً ما يكون للتعبير الجيني توزيع لوغاريتمي عادي 13 ، مما يعني أن القياسات السائبة سيتم تشويهها لأعلى مقارنة بالمتوسط ​​الهندسي للتوزيع اللوغاريتمي الطبيعي الذي يتم ملاحظته مع قياسات الخلية المفردة لمقياس التدفق الخلوي. في هذه التجربة ، بالنسبة للمستويات النموذجية للتباين من خلية إلى أخرى التي لوحظت في بكتريا قولونية، يجب أن يتسبب هذا التأثير في تقدير التألق لكل خلية ليكون أعلى بمقدار 1.3 ضعف تقريبًا من قارئ اللوحة من مقياس التدفق الخلوي. في الوقت نفسه ، تميل الجسيمات غير الخلوية في المزرعة إلى تشويه تقديرات الفلورة لكل خلية في الاتجاه المعاكس للقياس بالجملة ، حيث تساهم هذه عادةً في OD ولكن ليس التألق في قارئ اللوحة ، ولكن الغالبية العظمى من جزيئات الحطام عادة ما تكون قادرة على الخروج من بيانات التدفق الخلوي. مع وجود الخلايا السليمة بشكل عام في مرحلة النمو اللوغاريتمي ، من المتوقع أن تكون مستويات الحطام في هذه التجربة منخفضة نسبيًا. وبالتالي ، من المحتمل أن يكون هذان الاختلافان صغيرين وفي اتجاهين متعاكسين ، بحيث لا نزال نتوقع أن تتطابق تقديرات التألق لكل خلية لقارئ اللوحة وبيانات قياس التدفق الخلوي عن كثب إذا تمت معايرتها بدقة.

من بين طرق معايرة OD الثلاثة ، يتم استبعاد قياس LUDOX / الماء على الفور لأنه يعاير فقط مع OD نسبي ، وبالتالي لا يمكنه إنتاج وحدات مماثلة. يوضح الشكل 5. مقارنة CFU والتخفيف المجهري لقياس التدفق الخلوي. والقياسات المُعايرة CFU أعلى بكثير من القيم الناتجة عن قياس التدفق الخلوي ، وهو متوسط ​​هندسي أعلى بمقدار 28.4 ضعفًا ، مما يشير إلى أن طريقة المعايرة هذه تقلل بشكل سيئ من الرقم. من الخلايا. من غير الواضح الدرجة التي يعود بها ذلك إلى المشكلات المعروفة في CFU ، مثل الخلايا الملتصقة في كتل ، على عكس المشكلات المتعلقة بعدم الدقة المذكورة أعلاه أو الأسباب المحتملة الأخرى غير المحددة. مهما كان السبب ، من الواضح أن معايرة CFU تمثل مشكلة للحصول على أي شيء مثل تقدير دقيق لعدد الخلايا.

ينتج التخفيف المجهري قيمًا قريبة جدًا من الحقيقة الأساسية التي يوفرها قياس التدفق الخلوي المعاير ، في حين أن بروتوكول CFU ينتج قيمًا أكثر من ترتيب مختلف من حيث الحجم ، مما يشير إلى أن معايرة CFU تقلل إلى حد كبير من عدد الخلايا في العينة. تظهر الأشرطة الوسط الهندسي والانحراف المعياري. عدد الفريق حسب الحالة المنصوص عليها في البيانات التكميلية 3.

من ناحية أخرى ، ينتج التخفيف المجهري قيمًا قريبة بشكل ملحوظ من تلك الخاصة بقياس التدفق الخلوي ، وهو متوسط ​​هندسي أعلى بمقدار 1.07 مرة فقط ، مما يشير إلى أن طريقة المعايرة هذه دقيقة تمامًا في تقدير عدد الخلايا. علاوة على ذلك ، قد نلاحظ أن الاختلاف الكبير الوحيد بين القيم يأتي مع تألق منخفض للغاية لبنية J23117 ، وهو أمر غير مفاجئ نظرًا لأن مقاييس التدفق الخلوي تتمتع عمومًا بنطاق ديناميكي أعلى من أجهزة قراءة الألواح ، مما يسمح بحساسية أفضل للإشارات المنخفضة.


(الخطوة الأولى)

  1. ماصة 2.0 مل من مستحلب زيت الزيتون (A) في أنبوب اختبار وتتوازن عند 37 لمدة 5 دقائق.
  1. أضف 0.2 مل من محلول الإنزيم واخلطه.
  2. بعد 15 دقيقة بالضبط عند 37 ℃ ، أضف 2.0 مل من محلول TCA (E) لإيقاف التفاعل وإزالة الراسب بالترشيح من خلال ورق الترشيح (Toyo-Roshi No.131 أو Whatman رقم 42).

(الخطوة الثانية)

  1. يتم الحصول على الماصة 0.05 مل من المرشح في أنبوب اختبار.
  2. أضف 3.0 مل من كاشف تطوير اللون (G) واحتضان عند 37 ℃ لمدة 15 دقيقة.
  3. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 545 نانومتر مقابل الماء (اختبار OD).

في نفس الوقت ، قم بإعداد الفراغ بخلط 2.0 مل من مستحلب زيت الزيتون (A) بعد 15 دقيقة من الحضانة عند 37 ℃ مع 2.0 مل من محلول TCA ، متبوعًا بإضافة محلول الإنزيم (الخطوة الأولى). باستخدام المرشح الذي تم الحصول عليه من الخليط ، نفذ الخطوة الثانية باستخدام نفس الإجراء مثل الاختبار وقياس الكثافة الضوئية عند 545 نانومتر (OD فارغ).

* قم بإذابة مستحضر الإنزيم في مخفف الإنزيم المثلج (H) وخفف إلى 0.4-1.2 وحدة / مل بنفس المخزن المؤقت ، قبل الفحص مباشرة.


مقدمة

أحدثت تقنيات تسلسل الحمض النووي الحديثة ثورة في علم الجينوم [1] ، ولكن توسيع هذه الأساليب إلى التحليل الروتيني للبروتينات ، وعلى وجه التحديد إلى البروتينات أحادية الخلية ، لا يزال يمثل تحديًا عالميًا لم يتم التغلب عليه. يُعزى هذا إلى التعقيد الأساسي للبروتين: مستوى التعبير البروتيني يمتد على عدة مرات من حيث الحجم ، من نسخة واحدة إلى عشرات الآلاف من النسخ لكل خلية والعدد الإجمالي للبروتينات في كل خلية مذهل [2]. نظرا لعدم وجود في المختبر يقيس تضخيم البروتين القدرة على التحديد الكمي الدقيق لكل من البروتينات الوفيرة والنادرة يتوقف على تطوير طرق تحديد البروتين الفردي التي تتميز أيضًا بإنتاجية استشعار عالية للغاية. حتى الآن ، ومع ذلك ، فإن تقنيات تسلسل البروتين ، مثل قياس الطيف الكتلي ، لم تصل إلى دقة جزيء واحد ، وتعتمد على متوسط ​​الكتلة من مئات الخلايا أو أكثر [3]. يمكن أن تصل الطريقة القائمة على التقارب إلى حساسية بروتينية واحدة [4] ، ولكنها تعتمد على ذخيرة محدودة من الأجسام المضادة ، مما يعيق بشدة قابليتها للتطبيق في التحليلات على مستوى البروتين. وبالتالي ، في السنوات القليلة الماضية ، تم اقتراح نهج جزيء واحد لتحليل البروتين بناءً على تدهور Edman [5] أو FRET [6]. حتى الآن ، ومع ذلك ، لا يزال تحديد سمات البروتين الكامل للخلايا الفردية يمثل التحدي النهائي في علم البروتينات [7].

المسام النانوية عبارة عن مستشعرات حيوية أحادية الجزيء تم تكييفها لتسلسل الحمض النووي ، بالإضافة إلى تطبيقات الاستشعار الحيوي الأخرى [8،9]. وسعت دراسات المسام النانوية الحديثة اكتشاف الحمض النووي إلى البروتينات ، مما يدل على أن آثار التيار الأيوني تحتوي على معلومات حول حجم البروتين وشحنته وهيكله [10-17]. ومع ذلك ، حتى الآن ، ظل التحدي المتمثل في تفكيك أثر التيار الأيوني الكهربائي لتحديد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين من الإشارة الكهربائية المعتمدة على الوقت بعيد المنال. في تشبيه بمجال النسخ ، يكفي في العديد من الحالات العملية تحديد كل بروتين وتحديد كميته ضمن ذخيرة البروتينات المعروفة ، بدلاً من إعادة ترتيبها. أظهر ياو وزملاؤه نظريًا أن معظم البروتينات في قاعدة بيانات البروتينات البشرية يمكن تحديدها بشكل فريد من خلال ترتيب ظهور اثنين فقط من الأحماض الأمينية ، اللايسين والسيستين (K و C ، على التوالي) [18]. ولكن مع الأخذ في الاعتبار الأخطاء التجريبية ، على سبيل المثال بسبب استدعاء خاطئ لحمض أميني ، أو حمض أميني غير مسمى ، يقلل بشكل حاد من دقة المعرف. بدافع من التجارب الحديثة التي تشير إلى القدرة على نقل البروتينات المشوهة إلى SDS من خلال أي من الثقوب النانوية الصغيرة (

0.5 نانومتر) [19] ، أو مسام نانوية كبيرة [20] (

10 نانومتر) ، وإمكانية التمييز بين عديد الببتيدات على أساس الاستشعار البصري في نانوبور [21] ، نقدم هنا طريقة معرف البروتين التي تظل قوية وفقًا للمحاكاة ضد الأخطاء التجريبية المتوقعة. نوضح أن بصمات الأصابع الضوئية منخفضة الدقة وثلاثية الألوان نسبيًا التي يتم إنتاجها أثناء مرور البروتينات عبر ثقب نانوي ، تحافظ على معلومات كافية للسماح لخوارزمية تصنيف التعلم العميق بتحديد البروتين البشري بالكامل بدقة & gt95٪. حتى في الحالات التي تبدو فيها الدقة المكانية والزمانية الظاهرية للنظام البصري منخفضة بشكل مانع ، وتكون كفاءة وسم الأحماض الأمينية غير مكتملة ، تظل كفاءة معرف البروتين الكامل عالية وقوية. على وجه الخصوص ، فإن كفاءة معرف البروتين المتوقعة ذات صلة سريرية عالية للغاية. نوضح التطبيق الواسع لهذه الطريقة من خلال تحليل بروتين البلازما البشري ، بالإضافة إلى لوحة تحديد السيتوكين المتاحة تجاريًا استنادًا إلى الأجسام المضادة ، مما يوضح أن طريقتنا الخالية من الأجسام المضادة يمكنها بسهولة تجاوز التقنيات الحالية في عدد من المعلمات الرئيسية ، أثناء عرض دقة قريبة من الكمال.


إجراء

تحديد تركيز البروتين TIMING 30 دقيقة إلى 1 ساعة

تحديد تركيز محاليل مخزون البروتين. توفر الطرق الطيفية البسيطة التالية قياسات دقيقة سريعة لتركيز البروتين ومستقلة عن تكوين البروتين ، بشرط أن يكون البروتين مكشوفًا في 6M Guanidine-HCl أو 3٪ NaOH. تتطلب الخيارات A و B أن يحتوي البروتين على التيروزينات أو التربتوفان. لا يعمل الخيار ج مع البروتينات الشبيهة بالكولاجين التي تحتوي على نسبة عالية من البرولين.

الخيار (أ): تحديد تركيز البروتين من طيف الاختلاف للبروتين المذاب في 6 مولار جوانيدين عند الرقم الهيدروجيني 12.5 مقابل 7.1. 58 , 59

الماصة بنفس الحجم تمامًا (0.4 إلى 1 مل اعتمادًا على حجم عينة الكوفيت) لكل محلول في كفيتين بطول 1 سم ومسح خط الأساس من 320 إلى 270 نانومتر باستخدام محلول الأس الهيدروجيني 7.1 في الحجرة المرجعية و 12.5 محلول في حجرة العينة.

خطوة حاسمة يجب أن تكون تخفيفات العينات متطابقة تمامًا في المقصورة المرجعية والعينة.

أضف نفس الحجم بالضبط (على سبيل المثال 10 إلى 100 ميكرولتر) من محلول البروتين لكل كفيت واحصل على طيف الاختلاف. تصحيح الطيف لخط الأساس.

احسب تركيز البروتين. التركيز المولي (في المولات / لتر) للبروتين في الكوفيت = A / (2357Y + 830W) حيث A هي الامتصاصية عند 294 نانومتر ، Y هو عدد التيروزينات و W هو عدد التربتوفان 59. تصحيح التركيز المقاس للتخفيف. يمكن حساب متوسط ​​تركيز البقايا بضرب التركيز المولي في عدد الأحماض الأمينية في البروتين. يتم حساب عدد مليغرام لكل مليلتر من البروتين بضرب التركيز المولي بالوزن الجزيئي. إذا تم تغيير طبيعة البروتينات بواسطة محلول Guanidine ، فيجب أن تعطي طريقة الفرق نطاقًا واحدًا عند 294 نانومتر.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

الخيار (ب): تحديد تركيز البروتين من الطيف العطري المحدد في 6M guanidine-HCl ، ودرجة الحموضة 6.5 58

تشغيل طيف أساسي من خليتين بحجم متساوٍ من Guanidine-HCl في كل جانب.

أضف قسامة صغيرة من محلول البروتين إلى جانب العينة ، وحجمًا متساويًا من المخزن المؤقت إلى الجانب المرجعي.

خطوة حاسمة: يجب أن يكون البروتين خاليًا من مادة التشتت و 2-مركابتوإيثانول أو ديثيوثريتول. يمتص الشكل المؤكسد لهذه المركبات بقوة عند 280 نانومتر ومعدلات الأكسدة أسرع في المحاليل التي تحتوي على البروتين مقارنة بالمحاليل العادية ، لذلك من الصعب طرح مساهماتها.

اجمع طيف البروتين بين 350 و 250 نانومتر واحسب تركيز البروتين باستخدام الصيغ:

حيث W و Y و C هي أعداد التربتوفان والتيروزينات والسيستين (المؤكسدة) لكل مول من البروتين و & # x003b5288 و & # x003b5280 هي معاملات الانقراض المولي للبروتين عند 288 نانومتر و 280 نانومتر ، على التوالي 58. تركيزات البروتين في المولات / لتر هي قيمة الامتصاص عند 288 نانومتر / & # x003b5288 و 280 نانومتر / & # x003b5280. يجب أن تتفق التركيزات المحددة عند 288 و 280 نانومتر.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

الخيار ج. تحديد تركيز البروتين باستخدام إجراء ميكروبيوريت 60

عينات بروتين قسامة في المخزن المؤقت على سبيل المثال 0 ، 0.025 ، 0.05 ، و 0.1 مل وإضافة المخزن المؤقت إلى الحجم النهائي 0.1 مل في أنابيب اختبار صغيرة نظيفة.

قم بإعداد منحنى قياسي يحتوي على 0.02 و 0.04 و 0.06 و 0.08 و 0.10 مل من مساحة سطح الجسم المخففة إلى الحجم النهائي 0.1 مل لتركيزات 0.2 و 0.4 و 0.6 و 0.8 و 1.0 مجم / مل على التوالي.

أضف 0.5 مل من 3٪ هيدروكسيد الصوديوم و 0.02 مل من كاشف بنديكتس للمعايير والعينات. امزج مع خلاط دوامة.

اتركيه لمدة 15 دقيقة على الأقل حتى يتطور اللون.

اقرأ الامتصاصية عند 330 نانومتر

ارسم منحنى الامتصاص القياسي كدالة لتركيز البروتين بالملجم / مل. قم بتصحيح امتصاص كل عينة غير معروفة لمساهمة المخزن المؤقت واقرأ تركيز البروتين من المنحنى. الصحيح للتخفيف.

يمكن إجراء هذا الاختبار في لوحات ميكروتيتر باستخدام نصف حجم كل كاشف. يمكن قراءة الألواح عند 340 نانومتر على الرغم من أن كثافة اللون أقل عند هذا الطول الموجي منها عند 330 نانومتر. يجب أن تكون طريقة microbiuret باستخدام كاشف Benedict المحضر حديثًا خطية لتركيزات البروتين التي تتراوح بين 0 و 1.5 مجم / مل ، مع الامتصاص الذي يتراوح من تقريبًا. 0.2 للعينة الفارغة (100 & # x000b5l المخزن المؤقت) + 0.5 مل من 3 ٪ هيدروكسيد الصوديوم و 0.02 مل من كاشف بنديكتس إلى حوالي 0.5 & # x020130.6 للعينة مع 100 & # x000b5l من BSA ، 1.5 مجم / مل.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

إعداد عينة من 10 إلى 30 دقيقة

تحضير عينات البروتين. للقياسات النموذجية في خلية بحجم 0.1 سم ، اعتمادًا على المخزن المؤقت (انظر الجدول 1) ، قم بعمل محاليل من 0.05 إلى 0.2 مجم / مل من البروتين. للقياسات في الخلايا من 0.01 إلى 0.02 سم ، استخدم 0.2 إلى 1 مجم / مل من البروتين ، وبالنسبة للخلايا التي يبلغ سمكها 1 سم ، استخدم 0.005 إلى 0.01 مجم / مل من البروتين.

تحضير المعدات TIMING 30 إلى 40 دقيقة

قم بتشغيل النيتروجين وشطف حجرة البصريات لمدة 15 & # x0201320 دقيقة قبل بدء تشغيل الجهاز (انظر الشركة المصنعة والوقت المقترح # x02019s)

حذر. يحل النيتروجين محل الأكسجين. قم بتشغيل جهاز CD فقط في غرفة جيدة التهوية. لا تغلق الباب. إذا بدأ خزان من النيتروجين السائل في التنفيس بسبب تراكم الضغط ، غادر الغرفة واسمح للنيتروجين الزائد بالانتشار قبل الدخول مرة أخرى.

قم بتشغيل مصدر المياه أو مبرد حمام الماء المتداول إلى مبيت المصباح ، إذا كان المصباح مبردًا بالماء. إذا تم استخدام مصدر إمداد بالمياه ، فتأكد من نظافة الفلتر. في حالة استخدام الحمام ، تأكد من نظافة الماء.

خطوة حاسمة تجنب استخدام جلايكول الإيثيلين في الماء في الحمام الدائر لأنه يمكن أن يتلف المضخات.

قم بتشغيل الحمام المائي الدائر للتحكم في درجة الحرارة. إذا تم التحكم في درجة الحرارة باستخدام حجرة خلية منظمة لدرجة الحرارة تتطلب مشتتًا حراريًا ، فاضبط درجة حرارة الحمام على 20 أو 25 درجة. إذا تم التحكم في درجة الحرارة باستخدام خلايا مغلفة بالماء ، فاضبط درجة حرارة الحمام على درجة الحرارة المطلوبة (انظر الخطوة 9).

خطوة حاسمة تأكد من أن الماء يدور قبل تشغيل الطاقة إلى المنظمين الحراريين أو يمكنك حرق وحدات التدفئة.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

قم بتشغيل المصباح ، إذا كان يحتوي على مفتاح منفصل ، قبل تشغيل الطاقة لبقية جهاز القرص المضغوط أو أجهزة الكمبيوتر.

خطوة حاسمة قد يؤدي إطلاق المصباح إلى ارتفاع في الجهد يمكن أن يؤدي إلى تدمير اللوحات الإلكترونية أو أجهزة الكمبيوتر في بعض الأجهزة إذا تم تشغيلها قبل إضاءة المصباح.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

قم بتشغيل جهاز القرص المضغوط والكمبيوتر وابدأ برنامج تجميع الأقراص المضغوطة.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

قم بتعيين مسار بيانات برنامج التشغيل لتخزين بياناتك.

اضبط درجة الحرارة المطلوبة. بالنسبة لبروتين غير مميز سابقًا ، يجب على المرء أن يجمع الأطياف في درجات حرارة متعددة ويربط الأطياف ببعض قياس النشاط أو البروتين ، على سبيل المثال نشاط الإنزيم ، أو القدرة على ربط الروابط أو الأجسام المضادة. عادة ، يتم جمع الأطياف الأولية للبروتينات عند 4 و 25 و 37 و 50 و 60 و 70 & # x000b0C. بمجرد إنشاء نطاق استقرار ، يمكن جمع البيانات على فترات متقاربة للغاية لتحديد ما إذا كانت هناك تغييرات طيفية تشير إلى وسيطة قابلة للطي باستخدام خوارزمية CCA 44 أو تحلل القيمة المفردة 47 ، 61 ، 62

تجميع أطياف القرص المضغوط لتحديد البنية الثانوية - توقيت 2-4 ساعات لجمع 5 عينات و 5 خطوط أساس عند درجة حرارة واحدة ، اعتمادًا على نطاق الطول الموجي والفاصل الزمني وعدد الأطياف المتكررة

اضبط وقت الموازنة المطلوب. عادةً ما تصل البروتينات الكروية إلى التوازن خلال دقيقتين ، لكن بعض البروتينات ، على سبيل المثال الكولاجين ، يمكن أن يستغرق أيامًا لتثبيته (انظر تحضير البروتينات). إذا لم تكن متأكدًا من وقت الطي ، فاحتضن عينة القرص المضغوط على الجليد لعدة أيام قبل بدء قياسات القرص المضغوط للقياسات عند 4 & # x000b0C أو عند 25 & # x000b0C للقياسات بالقرب من درجة حرارة الغرفة.

اضبط عرض نصف النطاق بين 1 و 1.5 نانومتر. تعطي هذه القيم أطيافًا ذات إشارة جيدة لمستويات الضوضاء واستبانة طيفية مناسبة ، نظرًا لأن نطاقات الأشعة فوق البنفسجية واسعة (الشكلان 2 أ و 2 ب).

أ ، أطياف الهواء (الأسود) (الأحمر) الماء (الأخضر) العازلة و (البرتقالي والأزرق والأرجواني) ثلاثة أطياف مكررة من الليزوزيم ، 0.085 مجم / مل في خلية 0.1 سم. ب ، أطياف المخزن المؤقت (أسود ، أحمر ، أخضر) وثلاثة أطياف مكررة لكل من الليزوزيم عند (سماوي ، بنفسجي ، بني) 0.41 مجم / مل و (أزرق ، أرجواني ، برتقالي) تركيز 0.83 مجم / مل في خلية 0.01 سم . د ، التغيير في جهد داينود الأنبوب المضاعف الضوئي كدالة لطول الموجة للظروف الموضحة في 1 أ و 1 ب و 0.41 مجم / مل من الليزوزيم في خلية 0.1 سم. د ، متوسط ​​الإهليلجيه المتبقي من الليزوزيم في خلية 0.1 سم (أسود) 0.41 مجم / مل (البيانات الخام غير معروضة) (سماوي) 0.085 مجم / مل وفي خلية 0.01 سم (أخضر) 0.41 مجم / مل (أحمر) 0.83 ملغ / مل. e ، متوسط ​​إهليلجية بقايا الليزوزيم (الدوائر السوداء) الملائمة باستخدام طريقة المربعات الصغرى: (أزرق) باستخدام قاعدة بيانات ببتيد 20 (أسود) أربعة أطياف أساسية مستخرجة من 17 بروتينًا (1) 26 (برتقالي) خمسة أطياف أساسية مستخرجة من 33 بروتينًا 26 و (أرجواني) CONTIN 27 (سماوي) K2D 38 و (برتقالي) SELCON2 43. F ، متوسط ​​إهليلج بقايا الليزوزيم (الدوائر السوداء) مناسب باستخدام حزمة CDPro 33: (أرجواني) SELCON3 (سماوي) CDSSTR و (أسود) CONTIN. ملحوظة. تم الحصول على الليوسزيم من سيجما (L6876) وتم إذابته في فوسفات الصوديوم ، 10 ملي مولار. تم تحديد تركيز البروتين باستخدام معامل الانقراض المنشور & # x003b51% من 26.5 (& # x003b5م = 38.2 & # x000d7 I0 3) 65 للمقارنة مع البيانات السابقة 5. تم الحصول على البيانات باستخدام مطياف أفيف موديل 215 (Aviv Biomedical ، Lakewood ، NJ).

اضبط نطاق الطول الموجي: من 260 إلى 185 نانومتر لعينات بروتين 0.1 إلى 0.2 مجم / مل في مخازن شفافة (انظر الجدول 1) في خلايا 0.1 سم من 260 إلى 178 نانومتر لعينات 0.2 إلى 0.8 مجم / مل في خلايا 0.01 سم ومن 260 إلى 200 نانومتر مقابل 0.01 إلى 0.02 مجم / مل بروتينات في خلايا 1 سم.

اضبط الفاصل الزمني للطول الموجي ، 0.5 نانومتر للعينات ذات الإشارة إلى الضوضاء & # x0003e 20 إلى 1 أو 0.1 أو 0.2 أو 0.25 نانومتر للعينات ذات الإهليلجيه المنخفض. ستعطي البيانات التي تم جمعها على فترات من 0.10 إلى 0.5 نانومتر مع عرض نصف نطاق يتراوح من 1 إلى 1.5 نانومتر أطيافًا محددة جيدًا (انظر الشكل 2 أ و ب حيث تم جمع البيانات باستخدام عرض نصف نطاق يبلغ 1.5 نانومتر وتباعد طول موجي يبلغ 0.25 نانومتر ).

خطوة حاسمة اجمع البيانات فقط على فترات متساوية والتي هي جزء صغير من 1.0 نانومتر لأن معظم برامج تحليل البيانات لديها قواعد بيانات ذات قيم إهليلجية تم جمعها على فترات 1 نانومتر.

اضبط وقت جمع البيانات في كل نقطة (أي وقت متوسط ​​الإشارة). بالنسبة للعينات التي يبلغ تركيزها حوالي 0.1 مجم / مل في محلول شفاف ، يجب أن يكون التجميع لمدة 1 ثانية عند كل نقطة كافياً. إذا كان المرء يجمع أطياف مكررة ، على فترات من 0.1 إلى 0.5 نانومتر ، يجب أن تكون 0.5 ثانية / نقطة كافية. إذا كان تركيز البروتين منخفضًا أو كان المخزن المؤقت يحتوي على امتصاص عالي ، فقم بزيادة متوسط ​​الوقت. ستزداد الإشارة النسبية للضوضاء كجذر تربيعي لوقت متوسط ​​الإشارة.

اضبط وقت الصك بشكل ثابت. بالنسبة للتجميع الروتيني لأطياف القرص المضغوط ، يجب أن يكون هذا 100 مللي ثانية. لجمع البيانات بسرعة ، على سبيل المثال في قياسات القرص المضغوط للتدفق المتوقف ، يجب تقليل ثابت الوقت إلى 100 & # x000b5sec أو أقل (لا يزيد عن 1/10 متوسط ​​وقت البيانات في كل نقطة).

اضبط الجهاز لتسجيل الاهليلجيه والجهد الأنبوب المضاعف الضوئي (PMT). عندما يضرب الضوء المضاعف الضوئي لآلة القرص المضغوط ، يتم إحداث تيار. تحافظ معظم آلات الأقراص المضغوطة على تيار ثابت من خلال رفع الجهد مع انخفاض كمية الضوء. نظرًا لأنه يمسح لأطوال موجية أقل ، سيزداد الامتصاص ويزداد جهد PMT. سوف تتضاءل الإشارة إلى الضوضاء بشكل كبير بمجرد أن يتجاوز جهد الداينود 500 فولت وغالبًا ما تصبح البيانات صاخبة للغاية وغير موثوقة. (في جهاز أفيف ، يُطلق على جهد PMT اسم الجهد الدينودي ، ويسمى على جهاز Jasco جهد HT ، وفي آلة الفيزياء الضوئية التطبيقية يُطلق عليه كسب الكاشف ، ويسمى على آلة Olis PMT HV). بالنسبة لتركيزات البروتين التي تتراوح من 0.05 إلى 0.1 مجم / مل في خلايا 0.1 سم في محلول فوسفات 10 ملي مولار ، تكون نسب الإشارة إلى الضوضاء عادة أفضل من 10: 1 على مدى طول موجة من 260 إلى 185 نانومتر (الشكل 2 أ) مع جهد ديناميكي أدناه 500 فولت (الشكل 2 ج). مع خلايا 0.01 سم وتركيزات 0.4 إلى 0.8 مجم / مل ، تكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء في البيانات عادةً & # x0003e 30: 1 بين 260 إلى 178 نانومتر مع فولتات دينود أقل من 500 فولت (الشكل 2 ب ، 2 ج). عندما الجهد الدينود (2 ج) يتجاوز 500 فولت على سبيل المثال أقل من 185 نانومتر للبيانات التي تم جمعها في خلية بحجم 0.1 سم

0.1 مجم / مل ، عادة ما تصبح الإشارة إلى الضوضاء ضعيفة للغاية (الشكل 2 أ) على الرغم من أن الإشارة قد تظل خطية كدالة للتركيز على بعض الأجهزة حتى 700 فولت.

حدد طيف الفراغ. املأ الخلية بالماء وحدد طيفها. يجب ألا تحتوي المحاليل المعيارية المناسبة على إهليلجية ، لكن زيادة امتصاصها مقارنةً بالماء يقلل من الإشارة إلى الضوضاء. يجب أن يكون طيف الخلية المحتوية على الماء مسطحًا نسبيًا ، ولكن قد يتم إزاحته عن طيف الهواء النقي بسبب انكسار الخلية (الشكل 2 أ).

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

اجمع طيفًا من المخزن المؤقت للتأكد من أنه لا يحتوي على أي إهليلجي بسبب مكونات ثنائية اللون أو امتصاص عالي يؤدي إلى إشارة ضعيفة جدًا للضوضاء وربما قمم خاطئة. لاحظ أن الفسفوليبيدات غير متماثلة ولها نطاقات مضغوطة. إذا تم تعليق العينات في الدهون الفوسفورية ، فمن الضروري أن يحتوي الطيف الفارغ على نفس تركيز الدهون الخالية من البروتين.يجب أن يتراكب طيف المخزن المؤقت والماء على بعضهما البعض ، ضمن الخطأ التجريبي ، لكن طيف المخزن المؤقت عادةً ما يكون له إشارة أقل للضوضاء من طيف الماء عند أطوال موجية منخفضة (انظر الشكل 2 أ).

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

نظف الخلية واملأها بمحلول البروتين واجمع طيف القرص المضغوط. من الجيد جمع البيانات مرتين أو ثلاث مرات للعينات الجديدة للتأكد من أن العينة في حالة توازن وأن الإشارة لا تتغير كدالة زمنية. يمكن للعديد من آلات الأقراص المضغوطة تجميع أطياف متعددة تلقائيًا. إذا كان البروتين في حالة توازن ، فيجب أن تتراكب عمليات المسح المكررة لمحاليل البروتين مع بعضها البعض ولا تنجرف كدالة زمنية (الشكلان 2 أ و 2 ب).

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

إذا كانت مجموعات البيانات تتراكب مع بعضها البعض ، فقم بتوسيط مجموعات البيانات. للحصول على أدق التقديرات للبنية الثانوية للبروتين ، يجب جمع البيانات إلى 178 نانومتر أو أطوال موجية أقل ، في 0.01 إلى 0.02 سم من الخلايا. نظرًا لأن البيانات التي تقل عن 200 نانومتر قد يكون لها إشارة منخفضة للضوضاء ، يجب جمع ثلاث إلى خمس عمليات مسح وتحديد متوسطها.

احفظ البيانات الأولية على القرص الصلب أو القرص المرن أو وسائط أخرى!

خطوة حاسمة احفظ البيانات دائمًا على الفور لمنع الضياع في حالة انقطاع التيار الكهربائي.

قم بتنعيم أطياف العينة وفارغة. تحتوي معظم أجهزة الأقراص المضغوطة على خوارزميات تنعيم مدمجة وسيختار بعضها تلقائيًا أفضل معلمات التنعيم - ارجع إلى الدليل. تعتمد خوارزميات التنعيم المستخدمة على الشركة المصنعة. إذا كان الجهاز يستخدم Savitsky-Golay smoothing 63 ، وتم جمع البيانات على فترات 0.5 نانومتر ، فإن ترتيب متعدد الحدود من 3 ونافذة تجانس من 20 نقطة عادة ما تعطي ملاءمة جيدة. إذا تم جمع البيانات على فترات أقصر من الطول الموجي ، فقم بزيادة عدد النقاط. تعطي بعض بروتوكولات التنعيم تقديرات لجودة التسوية عن طريق حساب ما إذا كان الفرق بين البيانات الأولية والمتجانسة له الخصائص الإحصائية للضوضاء.

تحقق من أن البيانات لم يتم تنعيمها بشكل زائد عن طريق طرح المنحنى المصقول من البيانات الأولية. يجب توزيع النقاط بالتساوي حول الصفر. تقوم بعض أجهزة القرص المضغوط تلقائيًا بحساب المخلفات من التنعيم ويمكن عرضها على مقياس الطيف في وضع عرض البيانات الخاص به.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

اطرح خط الأساس السلس من الطيف السلس للعينة. يجب أن تكون الإهليلجية لمعظم البروتينات قريبة من الصفر بين 260 و 250 نانومتر.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

قم بتحويل البيانات إلى متوسط ​​إهليلجيه البقايا أو & # x00394 & # x003b5 باستخدام الصيغ:

الاهليلجيه ، [& # x003b8] ، بالدرجة. & # x000b7 cm 2 / dmol = (مرات الدرجات تعني وزن البقايا) / (طول المسار بالملليمتر مضروبًا في التركيز بالملجم / مل) أو

[& # x003b8] = ملي درجة / (طول المسار بالملم مضروبًا في تركيز البروتين مضروبًا في عدد البقايا)

متوسط ​​الوزن المتبقي للببتيد هو الوزن الجزيئي مقسومًا على عدد أميدات العمود الفقري (عدد الأحماض الأمينية -1 إذا لم يتم أستلة البروتين). إنها

115 لمعظم البروتينات إذا كان الوزن الجزيئي للعينة غير معروف ، ولكن يجب حسابه مباشرة إذا كان الوزن الجزيئي للبروتين معروفًا بنتائج دقيقة. إذا كان البروتين أو الببتيد أحادي اللون ولا يتجمع في ظل الظروف التجريبية المستخدمة لجمع بيانات القرص المضغوط ، فيجب أن تعطي الأطياف التي تم جمعها بتركيزات مختلفة من البروتين وأطوال المسار نفس متوسطات الإهليلجية المتبقية (الشكل 2 د)

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

احفظ البيانات المصححة لكل عينة في ملفات نصية منفصلة (ليست ثنائية) كمتوسط ​​إهليلجي للبقايا ، [& # x003b8] (y) كدالة لطول الموجة (x) ، أو في ملفات ذات قيم إهليلجية تحتوي أيضًا على معلومات حول بدء الطول الموجي ، وطول الموجة المنتهي ، وفاصل البيانات بحيث يمكن تحويلها إلى تنسيقات يمكن استخدامها لتقدير تكوين البروتين.

خطوة حاسمة احفظ البيانات بصيغة نصية (تنسيق ASCII) حيث أن الملفات الثنائية في تنسيقات خاصة لا يمكن الوصول إليها إلا بواسطة جهاز القرص المضغوط الصحيح. لا يمكن تحرير البيانات الثنائية بواسطة محرر نصوص أو استيرادها إلى ورقة انتشار أو تحويلها إلى تنسيقات يمكن استخدامها لبرامج التحليل.

إذا تم جمع البيانات في نطاقات أطوال موجية مختلفة ، على سبيل المثال 260 إلى 190 نانومتر في خلايا 0.1 سم و 200 إلى 178 نانومتر في خلايا 0.01 سم ، وتتفق البيانات بين 200 و 190 نانومتر ، تجمع البيانات التي تحتوي على متوسط ​​الإهليلجيه المتبقية في ملف واحد باستخدام محرر نصوص. إذا كانت البيانات لا تتفق مع بعضها البعض ، فتأكد من طرح خط الأساس المناسب لكل عينة وأن أطوال مسار الخلايا صحيحة. إذا لم يوافقوا بعد ، أعد القياسات!

خطوة حاسمة لتحليل البيانات ، تأكد من وجود إدخال واحد لكل طول موجي في الملف النهائي أو سيؤدي إلى إرباك برامج تحليل البيانات.

تحليل البيانات- توقيت 2 إلى 16 ساعة

تحليل البيانات باستخدام الطرق المناسبة (خيارات أ & # x02013D). من الأفضل استخدام أكبر عدد ممكن من الطرق للحصول على أكثر النتائج دقة.

الخيار أ: تقييم البنية الثانوية للبروتينات الكروية باستخدام البيانات التي تم جمعها بين 260 و 178 نانومتر

يوصى باستخدام حزمة CDPro أو برامج التحليل عبر الإنترنت في DicroWeb للحصول على أكثر التقديرات دقة للبنية الثانوية. تستخدم مجموعة برامج DicroProt إصدارات أقدم من البرامج المتوفرة في DicroWeb وفي CDPro ، لكن النتائج مماثلة لتلك الخاصة بالإصدارات الأكثر حداثة. من السهل تحويل البيانات إلى تنسيق CDPro وتنسيق DicroProt & # x0201cdic & # x0201d وواجهة المستخدم بسيطة لكلا البرنامجين. برنامج بسيط لتحويل بيانات القرص المضغوط في أعمدة من الاهليلجيه كدالة لطول الموجة إلى تنسيق مدينة دبي للإنترنت ، CONVERT.EXE ، في توقيت المواد التكميلية تحويل البيانات إلى التنسيقات المستخدمة بواسطة حزمة CDPro وتحليلها باستخدام SELCON و CONTINLL و CDSSTR سوف يستغرق حوالي 10 & # x0201315 دقيقة / طيف. يستغرق تحويل البيانات إلى تنسيق DIC ثم تحليلها بواسطة جميع البرامج الموجودة في حزمة DicroProt بما في ذلك VARSLC و SELCON2 و SELCON3 و CONTIN و K2D حوالي 10 & # x0201315 دقيقة / طيف.

الخيار ب.تقييم البنية الثانوية للبروتينات الكروية باستخدام بيانات مقطوعة تحت 260 نانومتر أو أعلى 178 نانومتر

بالنسبة لمجموعات البيانات التي تم جمعها عبر نطاقات الطول الموجي المقطوعة (مثل 240 إلى 200 نانومتر) ، استخدم البرامج SELCON أو VARSLC أو K2D أو CONTIN أو LINCOMB (مع قاعدة بيانات مستخرجة من البروتينات كمراجع). يتم تضمين جميع هذه البرامج في ملف CD.Zip في المواد التكميلية. يتضمن الملف أيضًا برامج التحويل التي ستقوم بتحرير مجموعات المراجع بحيث تتطابق مع نطاق البيانات في ملفات العينات. يتم أيضًا تضمين مجموعات مرجعية لـ LINCOMB.

توقيت سيستغرق تحويل بيانات القرص المضغوط الخام وتشغيل كل برنامج حوالي 10 دقائق / طيف لكل برنامج ، نظرًا لأن هذه الإصدارات القديمة من البرنامج لها تنسيق مختلف لملفات الإدخال الخاصة بها ، ويجب تحويل طيف القرص المضغوط بشكل منفصل لكل برنامج.

الخيار (ج). تحليل تأثير الطفرات على المحتوى الحلزوني أو & # x003b2-sheet للبروتين

استخدم الطريقة المقيدة للمربعات الصغرى (مثل LINCOMB) مع مجموعة مرجعية ثابتة بحيث يتم استخدام نفس المعايير لتحليل البروتينات من النوع البري والمتحولة. يجب أيضًا استخدام هذه الطريقة لتحديد التغييرات التوافقية استجابةً لإضافة يجند.

توقيت تحليل البيانات باستخدام برامج LINCOMB أو MLR بطيء ويستغرق حوالي 20 دقيقة / طيف لأن البرامج تعتمد على DOS وتستخدم شاشات رسوم DOS القديمة التي تستغرق وقتًا لعرض النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المرء أولاً تحويل البيانات إلى التنسيق الصحيح ، ثم تشغيل البرنامج واختبار النتائج باستخدام محرر نصوص.

الخيار د. تحليل التشكل من عديد الببتيدات أو شظايا البروتين القصيرة

استخدم LINCOMB (مع مراجع متعددة الببتيد) أو CONTIN أو K2D. هذه البرامج موجودة في ملف CD.Zip في مواد تكميلية.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها


استخدم الماء عالي النقاوة (مقاومة ≥18 MΩx سم عند 25 درجة مئوية) لتحضير الكواشف.

المخزن المؤقت (50 ملي محلول فوسفات البوتاسيوم ، درجة الحموضة 6.24 ، عند 25 درجة مئوية) - لتحضير 550 مل:

  • أضف 20.125 مل من محلول أحادي فوسفات البوتاسيوم 1.0 متر (P8709).
  • إضافة 7.375 مل من محلول ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم 1.0 متر (P8584).
  • أضف الماء عالي النقاوة لتعويض الحجم النهائي لـ 550 مل.
  • اضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.24 عند 25 درجة مئوية باستخدام 1 M KOH أو 1 M HCl.

تعليق الركيزة (0.015٪ [w / v] Micrococcus lysodeikticus تعليق الخلية) - تحضير معلق 0.15 مجم / مل في المخزن المؤقت باستخدام Micrococcus lysodeikticus، ATCC رقم 4698 ، خلايا مجففة بالتجميد (M3770).

ملاءمة الركيزة: ال450 من هذا التعليق يجب أن يكون بين 0.6–0.7 مقابل فارغ المخزن المؤقت. إذا لزم الأمر ، اضبط الامتصاص باستخدام كمية مناسبة من Buffer أو Micrococcus lysodeikticus الخلايا.

محلول الإنزيم (ليسوزيم) - مباشرة قبل الاستخدام ، قم بإعداد محلول يحتوي على 200-400 وحدة / مل من الليزوزيم في محلول بارد (2-8 درجة مئوية).


المواد والأساليب

الكائنات الدقيقة وظروف النمو

الإشريكية القولونية تمت زراعة DSMZ 613 (DSMZ ، ألمانيا) طوال الليل في وسط Luria-Bertani (LB) عند 37 درجة مئوية في شاكر حاضنة (100 دورة في الدقيقة). تم طرد الثقافات عند 4000 × ز لمدة 10 دقائق ومعلق في 1 مل من المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (PB ، الرقم الهيدروجيني = 7.2). تم قياس الكثافة الضوئية للمعلقات الخلوية عند 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي Smartspec Plus (Bio-rad ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تخفيفها إلى التركيز المطلوب باستخدام 0.1 M PB. تم تحديد التركيزات البكتيرية من خلال عدد الصفائح القابلة للتطبيق وتم التعبير عنها كوحدة تشكيل مستعمرة لكل مل (cfu / mL).

تم تقديم Bacteriophage T4 من قبل الدكتور M. Llagostera من قسم علم الوراثة والأحياء الدقيقة في جامعة برشلونة المستقلة. تم تحضير محللات Phage باتباع بروتوكول Bonilla et al. [36] باستخدام ه. القولونية كمضيف. 100 مل من ه. القولونية الثقافة المتنامية في مرق LB المضاف إليه CaCl2 (1 مم) و MgCl2 (1 مم) أصيبوا بـ 100 ميكرولتر من تعليق الفيروس. بعد تحقيق التحلل ، تم طرد المزرعة عند 4000 × ز لمدة 20 دقيقة. تم ترشيح المادة الطافية من خلال مرشح خلات السليلوز الغشائي 0.22 ميكرومتر (Whatman) ومعالجتها أيضًا بالكلوروفورم لإزالة الدهون. تم تركيز المعلق الناتج عن طريق الترشيح الفائق باستخدام أنابيب الطرد المركزي Amicon Ultra-15 بحجم انقطاع 100 كيلو دالتون. تمت إزالة السموم الداخلية الإضافية ، قبل تخزين العينة ، باستخدام 1-أوكتانول كما وصفه Szermer-Olearnik و Boratyński [37] متبوعًا بغسيل الكلى الغشائي في جهاز غسيل الكلى Spectra / Por Float-A-Lyzer G2 مع MWCO من 3.5-5 كيلو دالتون. تم تخزين المنتج المنقى في محلول SM [36] عند 4 درجات مئوية. تم تحديد تركيز الفيروس عن طريق حساب وحدة تشكيل البلاك (pfu) باستخدام طريقة أجار مزدوجة الطبقة التي وصفها آدمز [2]. قبل استخدامها ، تم تخفيف معلقات الفيروس في LB لتحقيق التركيز النهائي المطلوب.

تصميم تجريبي

كان هدفنا هو توصيف حركيات الكثافة الضوئية لتوليفات مختلفة من تركيزات الملتهمة / البكتيريا من أجل تقييم إلى أي مدى يمكن استخدام القياسات الحركية كمؤشر موثوق لوفرة الملتهمة في عينة معينة. لذلك ، تم تصميم تجربة يتم فيها اختبار تركيزات بكتيرية تتراوح من 10 5 إلى 5x10 8 cfu / mL بالاشتراك مع تركيزات T4 phage تتراوح من 0 إلى 5x10 8 pfu / mL.

الثقافات بين عشية وضحاها من ه. القولونية تم الطرد المركزي وأعيد تعليق الكريات في 0.1 ملي مولار PB لتحقيق تركيز 10 10 cfu / mL. خضعت المعلقات الناتجة للتخفيف المتسلسل بطريقة أنه بعد الخلط مع الملتهمة في وسط LB ، تم الحصول على التركيز النهائي المطلوب. بطريقة مماثلة ، تم تخفيف محلول مخزون T4 بشكل متسلسل في وسط LB من أجل تحقيق التركيزات المطلوبة. لكل اختبار ، تم خلط 160 ميكرولتر من LB مع 20 ميكرولتر من محلول الملتهمة ، و 20 ميكرولتر من محلول البكتيريا و 20 ميكرولتر من PB في أطباق شفافة بها 96 بئر (Thermo Scientific ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضين الألواح عند 37 درجة مئوية في قارئ لوحة Varioskan Flash (Thermo Scientific ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) و OD600 تم تسجيله على فترات منتظمة. تم دائمًا تقييم العينات والضوابط والفراغات على أنها ثلاث نسخ.

تحليل البيانات التجريبية

يوفر التصميم التجريبي المستخدم مجموعة واسعة من البيانات التي يجب معالجتها بشكل أكبر من أجل إجراء تفسير مناسب للنتائج. لكل تركيز بكتيريا مستخدم قمنا بحساب نقطة بداية الكشف (SPD) كوقت مطلوب لعناصر التحكم المختلفة (البكتيريا بدون العاثيات) للوصول إلى عتبة النمو القابل للاكتشاف. لقد حددنا هذه العتبة بشكل تعسفي على أنها معدل نمو قدره 0.002 وحدة OD لكل دقيقة. لمزيد من العمليات الحسابية ، حددنا أيضًا نقطة نهاية الاكتشاف (EPD) كوقت يتوافق مع SPD + 120 دقيقة ، وبالتالي تخصيص نافذة مدتها ساعتان لتطوير الفحص (الشكل 1).

تم دمج منحنيات الكثافة البصرية مقابل منحنيات الوقت لعنصر تحكم (●) وثقافة ملقحة بالعاثية (○) وطرحها. يشير الاختلاف ، الذي تمثله المنطقة المظللة ، إلى مدى التثبيط. يتم التعبير عن هذه المنطقة كنسبة مئوية من منطقة التحكم. في الحالات التي يكون فيها تأثير الملتهمة ضئيلًا أو معدومًا ، تكون المنطقة المظللة صغيرة جدًا وتقترب نسبة التثبيط من 0٪. في الحالات القصوى ، تتطابق المنطقة المظللة تقريبًا مع منطقة التحكم ، وتقترب نسبة التثبيط من 100٪. من أجل توحيد جميع الحسابات ، يتم إجراء التكامل بين نقطة بداية الاكتشاف (SPD) ونقطة الاكتشاف النهائية (EPD) كما هو محدد في النص.

تثبيط النمو بسبب التحلل

لكل مجموعة بكتيريا / فج ، قمنا بدمج منطقة المنحنى بين نقطتي SPD و EPD. تم تنفيذ التكامل العددي باستخدام طريقة أويلر مع فترة أخذ العينات كخطوة تكامل. تم استخدام المناطق المتكاملة لحساب النسبة المئوية للتثبيط (PI) باستخدام الصيغة التالية بناءً على الإجراء الموصوف بواسطة Xie et al [11]: (1) حيث أمراقبة يتوافق مع منطقة منحنى ثقافة التحكم دون تلقيح الملتهمة ، أفج يتوافق مع مساحة منحنى ثقافة معرضة لتركيز معين من الملتهمة ، و أفارغ يتوافق مع مساحة منحنى خط الأساس الذي يتكون فقط من وسط مستنبت بدون بكتيريا أو عاثيات (الشكل 1). تبسيط عوائد المعادلة 1: (2)

كقاعدة عامة ، في حالة عدم وجود تحلل الملتهمة ، فإن PI تساوي 0٪ والتحلل الكامل يعطي PI بنسبة 100٪. يمكن ربط النتائج الوسيطة بتركيز الملتهمة لكل تركيز بكتيري مستخدم.

احتمال وجود عينات باطلة

تم حساب احتمال العينات الفارغة (العينات التي لا تحتوي على لاقمات) باستخدام دالة الكتلة الاحتمالية لتوزيع بواسون [38] معبرًا عنها على النحو التالي: (3) حيث ن هو عدد العاثيات المتوقعة (0 في هذه الحالة) ، ج هو تركيز العاثيات في الوسط الخاضع لأخذ العينات و الخامس هو حجم العينة. لحالة محددة من ن = 0 ، يمكن تبسيط المعادلة 3 إلى: [4)


تطبيقات الطيف الضوئي

كيفية استخدام مقياس الطيف الضوئي؟ هناك استخدامات للقياس الطيفي في الكيمياء الحيوية مذكورة أدناه:

1. التحليل النوعي

يمكن استخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي والأشعة فوق البنفسجية لتحديد فئات المركبات في كل من المستحضرات النقية والبيولوجية. يتم ذلك عن طريق رسم منحنيات طيف الامتصاص. يعطي امتصاص المركب في مناطق مختلفة بعض التلميحات عن هيكله.

2. التحليل الكمي

يستخدم مقياس الطيف الضوئي في التحليل الكمي لتطبيقات الكيمياء الحيوية. تطوير طريقة التحليل الكمي لتحديد تركيز غير معروف للأنواع عن طريق مطياف الامتصاص.

تمتص معظم المركبات العضوية ذات الأهمية البيولوجية في نطاق الطيف المرئي للأشعة فوق البنفسجية.

وبالتالي ، يمكن قياس عدة فئات مهمة من المركبات البيولوجية بشكل شبه كمي باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية. تقدم الأحماض النووية عند 254 نانومتر بروتين عند 280 نانومتر أمثلة جيدة على هذا الاستخدام.

تعتمد امتصاص البروتينات عند 280 نانومتر على محتواها من "التيروزين" و "التربتوفان".

3. فحص الإنزيم

إنه التطبيق الأساسي للقياس الطيفي. يتم إجراء هذا الاختبار بسرعة وسهولة عندما تكون الركيزة (أو) المنتج ملونًا (أو) تمتص الضوء في نطاق الأشعة فوق البنفسجية.

على سبيل المثال 1: اللاكتات ديهيدروجينيز (LDH)

اللاكتات + NAD + ↔ بيروفات + NADH + H +

  • يعمل LDH في نقل الإلكترونات من اللاكتات إلى NAD +.
  • نواتج التفاعل هي البيروفات ، و NAD ، والبروتون
  • أحد المنتجات ، NADH ، يمتص الإشعاع في نطاق الأشعة فوق البنفسجية عند 340 نانومتر في حين أن نظيره المؤكسد ، NAD + ، لا يفعل ذلك.
  • يمكن اتباع التفاعل الأمامي بقياس الزيادة في امتصاص الضوء للنظام عند 540 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي.

على سبيل المثال 2: بيروفات كيناز

Phosphoenolpyruvate + ADP Pyruvate + ATP

بيروفات + NADH + H + ↔ لاكتات + NAD +

لقد أضفنا فائضًا كبيرًا من NADH إلى النظام. يمتص النظام الآن عند 340 نانومتر. وفقًا للتفاعلات الموضحة أعلاه ، تشكل كل جزيء من Pyruvate في التفاعل. أ يتأكسد جزيء NADH إلى NAD + في التفاعل الثاني عندما يحول النظام بيروفات إلى تحديد الموقع.

نظرًا لأن NAD + لا يمتص عند 340 نانومتر ، يستمر الامتصاص في التناقص مع زيادة توليد البيروفات. تُعرف هذه القياسات باسم "المقايسات المزدوجة".

4. تحديد الوزن الجزيئي

تم تحديد الأوزان الجزيئية لبيكرات الأمين والسكريات والكثير من مركبات الألدهيد والكيتون بهذه الطريقة. يمكن تحديد الأوزان الجزيئية للجزيئات الصغيرة فقط بهذه الطريقة.

  1. دراسة الايزومرية Cis-Trans isomerism: تختلف الأيزومرات الهندسية في الترتيب المكاني للمجموعات حول المستوى. كما تختلف أطياف الامتصاص للأيزومرات. عادة ما يكون الأيزومر العابر أكثر استطالة من نظيره في رابطة الدول المستقلة. يمكن استخدام مطياف الامتصاص لدراسة تماكب Cis-Trans isomerism.
  2. التحكم في التنقية: يمكن اكتشاف الشوائب في المركب بسهولة شديدة عن طريق الدراسات الطيفية. يمكن اكتشاف شوائب "ثاني كبريتيد الكربون" في رابع كلوريد الكربون بسهولة عن طريق قياس الامتصاصية عند 318 نانومتر ، حيث يمتص كبريتيد الكربون. يتم اختبار العديد من الحلول التجارية بشكل روتيني للتأكد من نقاوتها باستخدام التحليل الطيفي.

5. دراسات كيميائية فيزيائية أخرى

تم استخدام قياس الطيف الضوئي (UV-VIS) لدراسة الظواهر الفيزيوكيميائية التالية:

  • درجات حرارة تكوين مركب الإضافة الجزيئية والمجمعات في المحلول
  • تحديد الصيغة التجريبية
  • ثوابت تكوين المجمعات في المحلول
  • توازن ترطيب مركبات الكربونيل
  • ثوابت الرابطة للأحماض والقواعد الضعيفة في المذيبات العضوية
  • تفاعلات صبغ البروتين
  • مجمعات بروتين الكلوروفيل
  • فيتامين أ ألدهيد - مركب بروتين
  • تحديد معدلات التفاعل
  • ثوابت تفكك الأحماض والقواعد
  • رابطة أصباغ السيانين

هذه هي أدوات مقياس الطيف الضوئي الأساسية وتطبيقاتها.


شاهد الفيديو: مقدمة بسيطة عن الكثافة والوزن النوعي للمنتجات النفطية (كانون الثاني 2022).