معلومة

لماذا تعتبر السلسلة الخفيفة للجسم المضاد ضرورية للوظيفة؟


ينتج البشر ومعظم الثدييات الأخرى أجسامًا مضادة تتكون من سلسلتين ثقيلتين ، كل منهما مرتبطة بسلسلة خفيفة. تساهم كل من السلسلة الثقيلة والخفيفة في المنطقة المتغيرة ، وبالتالي خصوصية مستضد الجسم المضاد.

في المقابل ، تم العثور على الأسماك الغضروفية والإبل لإنتاج أجسام مضادة ثقيلة السلسلة فقط ، وبفضل صغر حجمها وسهولة تركيبها ، يُتوقع أن تحدث الأجسام المضادة للإبل (الأجسام النانوية) ثورة في علاجات الأجسام المضادة.

هذا يجعلني أتساءل: لماذا هذا غير ممكن مع الأجسام المضادة البشرية (المهندسة وراثيا)؟ بصرف النظر عن حقيقة أن إزالة السلسلة الخفيفة من شأنه أن يغير خصوصية المستضد ، فما الذي يعيق عمل الجسم المضاد البشري ثقيل السلسلة فقط؟ ما هو الاختلاف الجوهري بين السلسلة الثقيلة للإبل (ومنطقتها المتغيرة) والمكافئ البشري؟


أظن أن الأمر له علاقة بحقيقة أنه نظرًا لأنه يتم التعبير عن scAbs الجملي في الجسم الحي ، فإنها تخضع لعملية إعادة التركيب الطبيعي ونضج التقارب هناك كمناطق متغيرة فردية. وبالتالي ، يمكن بسهولة عزل جزيئات الرنا المرسال scAb عالية التقارب من دم جمل تم تحصينه بشكل مناسب والمضي قدمًا في الاستنساخ والإنتاج.

تخضع السلاسل البشرية الثقيلة لاختيار التقارب بينما تقترن بالسلاسل الخفيفة وبالتالي لن تعمل العمليات في الجسم الحي لتوليد سلاسل ثقيلة ترتبط بشكل جيد بمولد الضد المحدد. أفترض أنه يمكن للمرء إنشاء مكتبة عرض تحتوي على جينات سلسلة ثقيلة فقط ، ولكن في حالة تعقيد مكتبة نموذجي يبلغ 10 ^ 7 لن تتمكن من تغطية أكبر قدر من "مساحة التشكل" كما هو الحال مع عملية نضج تقارب سلسلة واحدة في الجسم الحي .

ملاحظة - يبدو الجزء المتعلق بـ "إحداث ثورة في علاجات الجسم المضاد" بمثابة دعاية تسويقية لفكرة عمرها أكثر من 20 عامًا.


هيكل جزيء الجسم المضاد (مع رسم بياني)

الجسم المضاد هو نوع من جزيء البروتين الذي تنتجه الخلايا الليمفاوية البائية استجابةً لمسببات الأمراض. لا تفرز الخلايا التائية الأجسام المضادة بشكل مباشر ، ولكنها تساعد الخلايا البائية على إنتاجها. يحتوي كل جزيء من الأجسام المضادة على أربع سلاسل من الببتيد.

من بين السلاسل الأربعة:

(ط) سلسلتان صغيرتان تسمى سلاسل Light (L).

(2) سلسلتان كبيرتان تسمى سلاسل ثقيلة (H).

يتم تمثيل الجسم المضاد كـ H2إل2 مركب. في أجسامنا ، يتم إنتاج أنواع مختلفة من الأجسام المضادة مثل IgA و IgM و IgE و IgG.

تسمى الاستجابة عن طريق الأجسام المضادة أيضًا بالاستجابة المناعية الخلطية. تم العثور على هذه الأجسام المضادة في الدم.

1. معظم فئة منع الجسم المضاد 75-80٪ من إجمالي الجسم المضاد.

2. يحمي من الفطريات والبكتيريا والسموم وما إلى ذلك.

3. يمكن أن تعبر المشيمة من الأم إلى الطفل وتوفر الحماية المناعية لحديثي الولادة.

4. مسؤولة عن عوامل الصحة الإنجابية في الدم.

1. ثالث أكثر الأجسام المضادة شيوعًا. يشكل 5-10٪ من إجمالي الأجسام المضادة.

2. يتم إنتاجها أولاً كاستجابة لمواجهة أحد العوامل الممرضة.

3. مسؤول عن تفاعل نقل الدم في نظام الدم ABO.

1. منع الأجسام المضادة الثانية الأكثر.

2. تشكل 15٪ من إجمالي الأجسام المضادة.

3. يفرز من خلال أجزاء مبطنة بالجهاز المخاطي.

4. توجد في إفرازات الأنف والعينين والرئتين والجهاز الهضمي واللعاب والدموع وغيرها.

5. يوجد أيضا في اللبأ أي حليب الثدي لحماية مناعة الأطفال حديثي الولادة.

1. الجسم المضاد الأقل شيوعًا.

2. تشكل 0.002٪ فقط من إجمالي الأجسام المضادة وتشارك في تفاعلات الحساسية.


ملخص

  1. هناك 5 فئات أو أنماط متماثلة من الأجسام المضادة البشرية أو الغلوبولين المناعي: IgG و IgM و IgA و IgD و IgE.
  2. أبسط الأجسام المضادة ، مثل IgG و IgD و IgE ، هي & quotY & quot ؛ جزيئات كبيرة على شكل & quot ؛ تسمى المونومرات وتتكون من أربع سلاسل بروتين سكري: سلسلتان ثقيلتان متطابقتان وسلسلتان خفيفتان متطابقتان.
  3. يشار إلى نصي المونومر & quotY & quot على أنهما شظايا ربط مولد الضد أو أجزاء Fab من الجسم المضاد وتوفر هذه الأجزاء خصوصية لربط حاتمة على مولد ضد.
  4. في وقت مبكر من تطورها ، تصبح كل خلية لمفاوية B مبرمجة وراثيًا من خلال سلسلة من تفاعلات الربط الجيني لإنتاج Fab بشكل فريد ثلاثي الأبعاد قادر على تركيب بعض الحاتمة مع الشكل المقابل.
  5. يصبح جزء Fc نشطًا بيولوجيًا فقط بعد أن يرتبط مكون Fab بمستضده المقابل. تشمل الأنشطة البيولوجية تنشيط المسارات التكميلية ، والارتباط بالمستقبلات الموجودة على الخلايا البلعمية وخلايا الدفاع الأخرى لتعزيز المناعة التكيفية.
  6. IgM عبارة عن خماسي ، يتكون من 5 مونومرات متصلة في أجزاء Fc الخاصة بهم.
  7. IgA عبارة عن ثنائى يتكون من 2 مونومرات متصلة بأجزاء Fc الخاصة بهم.

3-1. تتكون الأجسام المضادة IgG من أربع سلاسل متعددة الببتيد

الأجسام المضادة IgG هي جزيئات كبيرة ، لها وزن جزيئي يبلغ حوالي 150 كيلو دالتون ، وتتكون من نوعين مختلفين من سلسلة عديد الببتيد. واحد ، من حوالي 50 كيلو دالتون ، يسمى ثقيل أو سلسلة H.والآخر 25 كيلو دالتون يسمى ضوء أو سلسلة L (الشكل 3.2). يتكون كل جزيء IgG من سلسلتين ثقيلتين وسلسلتين خفيفتين. ترتبط السلسلتان الثقيلتان ببعضهما البعض عن طريق روابط ثاني كبريتيد وترتبط كل سلسلة ثقيلة بسلسلة خفيفة بواسطة رابطة ثاني كبريتيد. في أي جزيء جلوبيولين مناعي ، السلاسل الثقيلة والسلسلتان الخفيفتان متطابقتان ، مما يمنح جزيء الجسم المضاد موقعين متطابقين لربط مولد الضد (انظر الشكل 3.1) ، وبالتالي القدرة على الارتباط في وقت واحد بهيكلين متطابقين.

الشكل 3.2

تتكون جزيئات الغلوبولين المناعي من نوعين من سلاسل البروتين: سلاسل ثقيلة وسلاسل خفيفة. يتكون كل جزيء غلوبولين مناعي من سلسلتين ثقيلتين (خضراء) وسلسلتين خفيفتين (أصفر) متصلتين بروابط ثنائي كبريتيد بحيث تكون كل سلسلة ثقيلة (أكثر).

نوعان من السلاسل الخفيفة ، يسمى لامدا (& # x003bb) و كابا (& # x003ba) ، توجد في الأجسام المضادة. يحتوي الغلوبولين المناعي المحدد إما على سلاسل & # x003ba أو & # x003bb سلاسل ، وليس واحدًا من كل منهما. لم يتم العثور على فرق وظيفي بين الأجسام المضادة التي لها سلاسل ضوء & # x003bb أو & # x003ba ، ويمكن العثور على أي نوع من السلاسل الخفيفة في الأجسام المضادة لأي من الفئات الخمس الرئيسية. تختلف نسبة نوعي السلسلة الخفيفة من نوع لآخر. في الفئران ، متوسط ​​& # x003ba إلى & # x003bb هو 20: 1 ، بينما في البشر 2: 1 وفي الماشية 1:20. سبب هذا الاختلاف غير معروف. يمكن أحيانًا استخدام تشوهات هذه النسبة للكشف عن التكاثر غير الطبيعي لنسخة من الخلايا البائية. هذه كلها تعبر عن السلسلة الخفيفة المتطابقة ، وبالتالي قد يشير وجود فائض من سلاسل الضوء & # x003bb في الشخص إلى وجود ورم خلية B ينتج سلاسل & # x003bb.

على النقيض من ذلك ، يتم تحديد الفئة ، وبالتالي وظيفة المستجيب ، للجسم المضاد ، من خلال بنية سلسلته الثقيلة. هناك خمسة رئيسية فئات السلسلة الثقيلة أو الأنماط المتساوية ، وبعضها يحتوي على عدة أنواع فرعية ، وهذه تحدد النشاط الوظيفي لجزيء الجسم المضاد. الفئات الخمس الرئيسية من الغلوبولين المناعي هي الغلوبولين المناعي M (IgM) والغلوبولين المناعي D (IgD) والغلوبولين المناعي G (IgG) والغلوبولين المناعي A (IgA) والغلوبولين المناعي E (IgE). يتم الإشارة إلى سلاسلها الثقيلة بالحرف اليوناني الصغير المقابل (& # x003bc ، & # x003b4 ، & # x003b3 ، & # x003b1 ، و & # x003b5 ، على التوالي). IgG هو إلى حد بعيد الغلوبولين المناعي الأكثر وفرة وله عدة فئات فرعية (IgG1 و 2 و 3 و 4 في البشر). يتم منح خصائصها الوظيفية المميزة من خلال الجزء الكربوكسي الطرفي للسلسلة الثقيلة ، حيث لا ترتبط بالسلسلة الخفيفة. سوف نصف بنية ووظائف الأنماط النظيرية ذات السلسلة الثقيلة المختلفة في الفصل 4. تتشابه السمات الهيكلية العامة لجميع الأنماط النظيرية وسنعتبر IgG ، وهو النمط النظري الأكثر وفرة في البلازما ، كجزيء نموذجي للجسم المضاد.


وظيفة الأجسام المضادة (الغلوبولين المناعي)

تشير وظيفة الجسم المضاد (Ab) إلى التأثير البيولوجي الذي يحدثه الجسم المضاد على العامل الممرض أو السم الخاص به.

بالإضافة إلى الارتباط بمستضد (Ag) ، تشارك الأجسام المضادة في أنشطة بيولوجية مختلفة. على الرغم من أنها لا تقتل أو تزيل مسببات الأمراض فقط من خلال الارتباط بها ، إلا أنها يمكن أن تبدأ الاستجابات التي ستؤدي إلى إزالة المستضد أو موت العامل الممرض. تشارك منطقة المتغيرات في الجسم المضاد في ارتباط المستضد ، والمنطقة الثابتة للسلسلة الثقيلة (CH) مسؤولة عن التفاعلات التعاونية المختلفة مع الأنسجة أو الخلايا أو البروتينات التي تؤدي إلى وظيفة المستجيب للمناعة الخلطية.

يرجى تذكر أنه "ليست كل فئات الغلوبولين المناعي لها نفس الوظائف".

  1. تحييد العدوى ،
  2. السمية الخلوية المعتمدة على الجسم المضاد (ADCC) ،
  3. التحلل التكميلي لمسببات الأمراض أو الخلايا المصابة: تعمل الأجسام المضادة على تنشيط النظام التكميلي لتدمير الخلايا البكتيرية عن طريق التحلل
  4. استئصال الخلايا والمناعة المخاطية والمناعة الوليدية

وظيفة أخرى تنفرد بها الغلوبولين المناعي E (IgE) ، وهي "تنشيط الخلايا البدينة والحمضات والخلايا القاعدية".

تحييد العدوى أو السموم

تُفرز الأجسام المضادة في الدم والأغشية المخاطية ، حيث يمكنها منع عدوى مسببات الأمراض (البكتيريا والفيروسات والطفيليات والفطريات) ، وتعطيل أو تحييد المواد الغريبة مثل السموم. يحدث التحييد عمومًا نتيجة للتدخل في ارتباط الكائن الحي بالأنسجة المضيفة.

لقد ثبت أن بعض الأجسام المضادة تثبط العدوى عن طريق الارتباط بالكائنات الحية وتجمعها. قد يسمح التجمع أو التراص بواسطة IgA باحتجاز البكتيريا بشكل أكثر كفاءة في الأغشية المخاطية والتخليص اللاحق عن طريق التمعج. على الرغم من أنه من المرجح أن يحدث التجميع مع IgA البوليمري و IgM ، فإن بعض الأجسام المضادة IgG المعادلة يمكن أن تجمع فيروس شلل الأطفال وتقلل من العدوى. وبالمثل ، تتداخل الأجسام المضادة ضد HIV-1 gp120 مع ارتباط gp120 بـ CD4.

البلعمة

تسهل الأجسام المضادة عملية البلعمة للمواد الغريبة من خلال عملية تسمى طين. استيعاب وتحلل مسببات الأمراض المغلفة بالأجسام المضادة بواسطة الضامة والعدلات عبر FcRs (مستقبلات Fc هي جزيئات بروتينية موجودة على أسطح البلاعم والعدلات التي يمكن أن تربط المنطقة الثابتة من جزيئات الغلوبولين المناعي) هي وظيفة الجسم المضاد الحرجة لإزالة مسببات الأمراض في الجسم الحي.

يؤدي ارتباط مستقبلات الخلايا البلعمية Fc مع العديد من جزيئات الجسم المضاد المركبة مع الهدف نفسه إلى بدء مسار نقل الإشارة الذي ينتج عنه البلعمة لمركب الأجسام المضادة للمستضد. داخل البلعمة ، يصبح العامل الممرض هدفًا للعديد من العمليات المدمرة التي تشمل الأضرار التأكسدية ، والهضم الإنزيمي ، وتأثيرات تعطيل الغشاء للببتيدات المضادة للبكتيريا ، إلخ.

التحلل التكميلي لمسببات الأمراض أو الخلايا المصابة

تعمل الأجسام المضادة (IgM ومعظم فئات IgG الفرعية) على تنشيط النظام التكميلي الذي يمكن أن يؤدي إلى تحلل الكائنات الحية أو الخلايا المصابة. منتج ثانوي مهم من سلسلة التكملة هو C3b ، وهو جزء من البروتين يمكن أن يرتبط بشكل غير محدد بمجمعات الخلية و Ag-Ab. العديد من أنواع الخلايا ، على سبيل المثال ، خلايا الدم الحمراء أو البلاعم لديها مستقبلات لـ C3b وبالتالي تربط الخلايا أو المجمعات التي يلتزم بها C3b.

يسمح ربط مجمعات Ag-Ab بواسطة مستقبلات C3b لكرات الدم الحمراء بتوصيل المجمعات إلى الكبد أو الطحال حيث تزيلها الضامة المقيمة دون تدمير خلايا الدم الحمراء. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استيعاب الكائنات الحية أو مجمعات Ag-Ab المرتبطة بالمكمل بواسطة الخلايا البلعمية ، مع التصفية الناتجة. يمكن أن يؤدي التداخل من خلال المستقبلات التكميلية على الخلايا العارضة للمستضد (APCs) أيضًا إلى معالجة المستضد لتقديمه إلى الخلايا اللمفاوية التائية.

السمية الخلوية المعتمدة على الجسم المضاد (ADCC)

أظهرت الأجسام المضادة نشاطًا مضادًا للميكروبات إما بشكل مباشر أو من خلال التفاعلات مع FcRs أو المكمل. يحدث ADCC عندما يشكل الجسم المضاد جسرًا بين الخلية المستهدفة المصابة (الخلايا المصابة بالفيروس في المضيف) وخلية المستجيب الحاملة للـ FcR ، وخاصة الخلايا القاتلة الطبيعية (NK). نتيجة هذا التفاعل الثلاثي هو موت الخلية المستهدفة ، إما عن طريق التحلل أو موت الخلايا المبرمج.

كثرة الخلايا ، مناعة الغشاء المخاطي ومناعة حديثي الولادة

يمكن لبعض الأجسام المضادة أن تتحرك عبر الطبقات الظهارية (تعتمد على خاصية المنطقة الثابتة لجزيء الجسم المضاد) عبر عملية تسمى التحويل الخلوي. IgA هو الغلوبولين المناعي الرئيسي الذي يخضع لعملية الترانزيت ويتوفر في شكل إفرازي (sIgA) في الأسطح المخاطية للجهاز التنفسي والجهاز الهضمي والجهاز البولي التناسلي.

في أنواع الثدييات بما في ذلك البشر ، يمكن لمعظم الفئات الفرعية من IgG عبور حاجز المشيمة (بما أن الدورة الدموية للأم والجنين منفصلة) وبالتالي منح عينة من ذخيرة الأم للأجسام المضادة للجنين النامي كوقف وقائي ضد مسببات الأمراض. هذه التحصين السلبي الجنين النامي يحدث أثناء الربع الثالث من الحمل.


الجزء 2: شظايا غير عادية من الأجسام المضادة: الأجسام النانوية Camelid

00: 00: 0724 اسمي Hidde Ploegh.
00: 00: 0824 أنا باحث أول في مستشفى بوسطن للأطفال في برنامج الطب الخلوي والجزيئي.
00: 00: 1519 وفي هذا الجزء من عرضي التقديمي ، سأناقش بعض الأعمال الحديثة التي تصف
00: 00: 2205 جهود لتسخير السمات غير العادية للأجسام المضادة التي تنتجها الإبل.
00: 00: 3001 لماذا يكون هذا ممتعًا؟
00: 00: 3407 هذه هي الحيوانات التي نعمل معها.
00: 00: 3606 هذان نوعان من أحداث الألبكة ، بريسون وسانشيز.
00: 00: 4011 والسبب الذي جعل هذه الحيوانات تجذب انتباهي كانت محاضرة
00: 00: 4507 حضرت ، حيث لم يتم تخصيصي للقسم الخطأ.
00: 00: 4813 وهذه هي المرة الأولى التي أسمع فيها عن الخصائص غير العادية للأجسام المضادة التي تصنعها أنواع الجمل ،
00: 00: 5322 وهذا يشمل الألبكة ، اللاما ، جواناكوس ، فيكوناس ، الجمال ، الجمل العربي -
00: 01: 0005 تشترك جميع الجمال في هذه الميزة الفريدة.
00: 01: 0401 ما أتحدث عنه هو حقيقة أنه ، على عكس أنواع الثدييات النموذجية ،
00: 01: 0905 تنتج أجسامًا مضادة تتكون من سلاسل ثقيلة وسلاسل خفيفة ، وتنتج الإبل أيضًا ،
00: 01: 1501 بالإضافة إلى الأشكال التقليدية ، الأجسام المضادة ثقيلة السلسلة فقط.
00: 01: 1816 وهذا مهم لأنه في العديد من التطبيقات يكون حجم الجسم المضاد بالحجم الكامل
00: 01: 2520 غير متوافق مع بعض التطبيقات التي نسعى للحصول عليها.
00: 01: 3002 ولهذا السبب نحاول تقليص جزيئات الجسم المضاد السليمة إلى الحد الأدنى من الوحدات
00: 01: 3517 يمكنه التعرف على المستضد.
00: 01: 3724 كما ناقشت في العرض التقديمي السابق ، يمكن القيام بذلك عن طريق الهضم المُحلل للبروتين.
00: 01: 4411 باستخدام غراء ، يمكننا إنتاج ما يسمى شظايا Fab المكونة من مناطق متغيرة
00: 01: 4905 للسلسلة الثقيلة والسلسلة الخفيفة وأحد نطاقاتهما الثابتة ، على التوالي.
00: 01: 5405 تحتفظ هذه بخصائص ارتباط مولد الضد ، ولكنها تتطلب جهدًا كبيرًا
00: 01: 5903 قم بإنتاجها بطريقة صحيحة.
00: 02: 0123 يمكن لصديقك ، عالم الأحياء الجزيئية ، مساعدتك في تقليص أجزاء Fab هذه بشكل أكبر ،
00: 02: 0610 لإنشاء ما يسمى بأجزاء Fv أحادية السلسلة ، حيث تكون المناطق المتغيرة من
00: 02: 1111 ترتبط السلسلة الثقيلة والسلسلة الخفيفة بواسطة رابط.
00: 02: 1428 المشكلة التي تظهر غالبًا عند التعبير عن أجزاء Fv أحادية السلسلة هي أنه
00: 02: 2012 لم يمروا بالمسار الإفرازي لخلية حقيقية النواة ، وبالتالي
00: 02: 2507 تميل إلى أن تكون عرضة للتجميع وقد تتطلب تحسينًا كبيرًا قبل أن ينتهي بك الأمر
00: 02: 3013 بمنتج ثابت.
00: 02: 3302 الأجسام المضادة ثقيلة السلسلة فقط التي تصنعها الإبل ليس لها مثل هذه العيوب بسبب
00: 02: 3805 يمكنك تقليص وحدة التعرف إلى المنطقة المتغيرة للسلسلة الثقيلة فقط.
00: 02: 4220 وخلافًا لما ينطبق على الأجسام المضادة التقليدية ، فإن كل سمات الهيكل مطلوبة
يتم تضمين 00: 02: 4814 للتعرف على مولد الضد في المناطق المتغيرة للسلسلة الثقيلة.
00: 02: 5409 تسمى هذه الأجزاء شظايا VHH ويشار إليها عادةً باسم الأجسام النانوية أيضًا.
00: 03: 0106 تتضمن بعض الخصائص التي تجعل هذه الأجسام النانوية جذابة بشكل غير عادي حقيقة ذلك
00: 03: 0706 يمكن إنتاجها في البكتيريا ذات الإنتاجية العالية.
00: 03: 1012 العديد منها لا يتطلب روابط بالجليكوزيل ولا روابط ثاني كبريتيد من أجل الاستقرار.
00: 03: 1413 وصغر حجمها يمكّن التطبيقات التي يمكن أن تكون Fvs أحادية السلسلة لها
00: 03: 1927 من الصعب القيام بالمهمة.
00: 03: 2115 إذن ، كيف نصنع أجزاء المنطقة المتغيرة ذات السلسلة الواحدة؟
00: 03: 2615 نمارس ما يسمى بالتحصين المتعدد ، وهي كلمة خيالية تشير إلى ما يصل إلى عشرين
00: 03: 3112 مستضدات مختلفة في حيوان.
00: 03: 3327 وبعد التعزيز المتكرر للحيوان للحصول على أجسام مضادة عالية التقارب ، نقوم بعزل
00: 03: 3925 خلية ليمفاوية من الدم المحيطي.
00: 03: 4204 وباستخدام البادئات المصممة لتضخيم المناطق المتغيرة بشكل فريد
00: 03: 4624 هذه الأجسام المضادة ذات السلسلة الثقيلة فقط ، يمكننا إنشاء مجموعة خالدة من سلاسل VHH هذه.
00: 03: 5503 كيف يمكن تحديد تسلسلات VHH المهمة؟
00: 03: 5904 يتم ذلك عن طريق استنساخها في ناقل عرض الملتهمة ، حيث يمكن للمرء تحديد الملتهمة التي تعبر عن ،
00: 04: 0703 كدمج لبروتين P3 ، من غلاف الملتهمة ، جسم نانوي أو جزء VHH.
00: 04: 1306 وعن طريق إجراء ما يسمى تفاعل بالغسل ، عن طريق تثبيت المستضد على دعامة صلبة ،
00: 04: 1816 يمكننا استرجاع جسيمات العاثيات التي تعبر عن الجسم النانوي محل الاهتمام ،
00: 04: 2406 خاص بالمستضد الذي قمنا بطلاء اللوحة به.
00: 04: 2805 لذا ، على الرغم من أننا قد نبدأ بالحيوانات المحصنة بعشرين مستضدًا مختلفًا ،
00: 04: 3208 من خلال فحصها بشكل فردي على هذه الألواح المطلية بالمستضد ، ينتهي بنا الأمر بأجسام نانوية من
00: 04: 3812 خصوصية محددة وفريدة من نوعها ، والتي قد ننتجها بعد ذلك في بكتيريا ذات إنتاجية عالية.
00: 04: 4411 هذه هي الوسيلة التقليدية لفحص هذه الأجسام النانوية المزعومة.
00: 04: 4828 لكننا أخذنا في الاعتبار أيضًا حقيقة أن هذه الأجسام النانوية لا تتطلب الارتباط بالجليكوزيل
00: 04: 5417 ولا روابط ثاني كبريتيد ، والتي تمكن من التعبير عنها في البيئة المختزلة من العصارة الخلوية.
00: 05: 0006 وقد أتاح لنا ذلك إجراء شاشات وظيفية لاختيار الأجسام النانوية التي
00: 05: 0511 ردود فعل مضطربة داخل السيتوبلازم ، في مثالي ، لخلية من الثدييات.
00: 05: 1024 حسنًا ، دعني أعطيك مثالاً.
00: 05: 1210 الاستفادة من حقيقة أن هذه الأجسام النانوية لا تتطلب غالبًا روابط بالجليكوزيل ولا روابط ثاني كبريتيد ،
00: 05: 1818 ابتكرنا إجراء فحص يعتمد على التعبير السيتوبلازمي لهذه الأجسام النانوية
00: 05: 2509 لإعاقة الإصابة بالفيروس.
00: 05: 2820 في هذه الحالة بالذات ، أخذنا حيوانًا وقمنا بتحصينه بفيروس الأنفلونزا المعطل
00: 05: 3403 وفيروس التهاب الفم الحويصلي ، يُختصر بـ IAV و VSV ، على التوالي ، في الشرائح التالية.
00: 05: 4211 وعند التحصين واستخراج الحمض النووي الريبي بدلاً من استنساخ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل
00: 05: 4727 في ناقل عرض الملتهمة ، كما هو موضح في الشريحة السابقة ، نقوم باستنساخها
00: 05: 5228 منتجات مكبرة في ناقل بطني مثل هذا التعبير عن الجسم النانوي يكون تحت السيطرة
00: 05: 5806 من محفز يحفز الدوكسيسيكلين.
00: 06: 0114 الخلايا المنقولة مع ناقل بطني لينتج الجسم النانوي فقط عندما
00: 06: 0600 تتعرض بشكل صحيح للدوكسيسيكلين.
00: 06: 0802 لذلك ، نقوم بتحويل مجموعة من خلايا الثدييات بهذه النواقل الفيروسية البطيئة بحيث ،
00: 06: 1409 في المتوسط ​​، ستتلقى كل خلية تركيبة واحدة مضادة للفيروسات.
00: 06: 1825 عند التحريض باستخدام الدوكسيسيكلين ، ستنتج تلك الخلية الجسم النانوي المقابل
00: 06: 2313 في سيتوبلازمه ، ويمكننا بعد ذلك اختبار هذا الجسم النانوي لخصائصه الوظيفية.
00: 06: 2818 بتعريض المتحولين ، كمجموعة كاملة ، لتحدي قاتل
00: 06: 3319 - في هذه الحالة ، جرعة محللة من فيروس الأنفلونزا أو فيروس التهاب الفم الحويصلي - يمكننا الاختيار
00: 06: 3915 للناجين ، المنطق الأساسي هو أن أي جسم نانوي يعيق جانبًا من
00: 06: 4420 ستمنح دورة تكرار الفيروس ميزة نمو لتلك الخلية.
00: 06: 4924 يمكننا بعد ذلك أخذ الناجين وإنقاذ تسلسل VHH أو الجسم النانوي ، ثم
00: 06: 5506 التحقق من صحتها بوسائل مستقلة.
00: 06: 5722 إذن ، هذا مثال على شاشة كهذه ، حيث اختبرنا استنساخًا فرديًا لإنتاج الأجسام النانوية
00: 07: 0605 في غياب ووجود تحريض الدوكسيسيكلين.
00: 07: 0911 سترى شريطين لكل خط خلية تم تحليله.
00: 07: 1312 تشير القضبان المفتوحة إلى الوضع في غياب تحريض الدوكسيسيكلين ، ونحن
00: 07: 1911 مراقبة الحالة المصابة بوسائل مستقلة.
00: 07: 2122 وكما تظهر القضبان المفتوحة ، في غياب تحريض الدوكسيسيكلين ،
00: 07: 2627 كل من هذه التنبيغ. المحولات قابلة للعدوى تمامًا بواسطة فيروس الأنفلونزا.
00: 07: 3221 ولكن كما تظهر الأشرطة المصمتة ، هناك العديد من الحيوانات المستنسخة المختارة في هذه الحالة كـ
00: 07: 3723 وقاية من عدوى الإنفلونزا. العدوى ، التي قللت بشكل كبير من قدرة الفيروس
00: 07: 4227 للتكرار.
00: 07: 4328 عندما نختبر تلك الحيوانات المستنسخة نفسها استجابةً لعدوى بفيروس التهاب الفم الحويصلي ،
00: 07: 4900 الحيوانات المستنسخة المحمية تمامًا ضد فيروس الأنفلونزا لا تستجيب للعدوى
00: 07: 5602 مع VSV على الإطلاق.
00: 07: 5711 لا يهم ما إذا كنا نحث على التعبير عن الجسم النانوي
00: 08: 0014 تستمر الإصابة بالفيروس غير ذي الصلة بشكل طبيعي.
00: 08: 0326 يمكننا إجراء التجربة العكسية عن طريق اختيار الحيوانات المستنسخة التي تعيق تكرار VSV ،
00: 08: 0905 وهذا بدوره يترك تكرارًا لفيروس الأنفلونزا. لم يمسها.
00: 08: 1404 الآن ، واحدة من السمات الجذابة للأجسام النانوية ، وهذا أحد أسباب علماء البيولوجيا البنيوية
00: 08: 2005 استعدوا لهم ، حقيقة أنهم غالبًا ما يعملون كمرافقين للبلورة.
00: 08: 2524 هذا يعني أنه بالنسبة للبروتينات التي يصعب بلورتها ، يتم تضمين
00: 08: 3020 سيسهل الجسم النانوي ذو الخصوصية المناسبة التبلور.
00: 08: 3501 هذا بالطبع له ميزة هائلة في تحديد الدقة الذرية
00: 08: 4003 بالضبط الحلقة التي يرتبط بها الجسم النانوي المعني.
00: 08: 4401 وقد قام بذلك فلوريان شميدت وليو هانكي ، وهما طالبان وباحثان بعد الدكتوراة في مختبري.
00: 08: 5027 قاموا معًا بحل التركيب البلوري ، في هذه الحالة ، لهدف مضاد الإنفلونزا
00: 08: 5814 الأجسام النانوية التي تعيق التكاثر في مركب مع جسم نانوي تمثيلي.
00: 09: 0603 باللون الأحمر والبرتقالي يشار إلى تلك التسلسلات في البروتين النووي المسؤول عن الإنفلونزا
00: 09: 1308 للتفاعل مع الحمض النووي الريبي (RNA) - لأن فيروس الإنفلونزا هو فيروس RNA سلبي تقطعت به السبل -
00: 09: 1900 وبالذهب إشارة التوطين النووي.
00: 09: 2204 وما تكشفه هذه التجربة هو أن الجسم النانوي يرتبط بمنطقة من بروتين NP
00: 09: 2704 لم يتم تحديده سابقًا على أنه مهم وظيفيًا.
00: 09: 3017 وبهذا المعنى ، فإن امتلاك هذا الجسم النانوي يزودنا بزاوية هجوم جديدة
00: 09: 3600 في دورة حياة الفيروس.
00: 09: 3701 الآن ، إذا سأل أحدهم ، بأي آلية جزيئية يمكن أن يعيق هذا الجسم النانوي تكاثر الفيروس ؟،
00: 09: 4409 استخدمنا بنية منشورة لجسيم البروتين النووي الفيروسي.
00: 09: 5009 هذا رنا فيروسي مركب مع بروتين نووي.
00: 09: 5413 قد يكون التشابه لربط هيستون بالحمض النووي.
00: 09: 5726 وما وجدناه هو أن الجسم النانوي ، عند ارتباطه بالبروتين النووي ، يغلق
00: 10: 0304 إشارة توطين نووية على وحدة فرعية NP مجاورة ، وبالتالي تعيق استيراد الفيروس
00: 10: 1027 جسيم بروتين نووي في النواة ، وهي خطوة أساسية لتكاثر الإنفلونزا.
00: 10: 1713 تم إجراء تجارب مماثلة للأجسام النانوية المثبطة لـ VSV.
00: 10: 2114 وفي هذه الحالة بالذات وجدنا مرة أخرى أن الجسم النانوي يرتبط ببروتين N ،
00: 10: 2713 وهو المكافئ المفاهيمي لبروتين NP في فيروس الأنفلونزا.
00: 10: 3212 معقدات البروتين N RNA ، بالكاد مرئية هنا مثل هذه المادة الحمراء الموجودة بينهما
00: 10: 3806 فصين من البروتين N.
00: 10: 4019 يشكل البروتين N حلقة عشرية.
00: 10: 4404 وفي التركيب البلوري تم حله للمركب بين البروتين N والجسم النانوي ،
00: 10: 5004 نجد وجود حلقتين عشريتين من هذا القبيل ، تتوج كل وحدة فرعية منها بـ
00: 10: 5502 جسم نانوي فردي كجزء من التركيب البلوري.
00: 10: 5816 إذن ، لدينا 40 وحدة فرعية للوحدة غير المتماثلة.
00: 11: 0202 وهذا أحد أكبر هياكل البروتين التي ساهم فيها مختبري.
00: 11: 0508 تم ذلك مع توم شوارتز في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا.
00: 11: 1002 إذا سألنا الآن ، هل ستساعدنا هذه البنية المحددة على فهم كيفية عمل الجسم النانوي بالضبط
00: 11: 1603 يعوق تكاثر الفيروس؟ الجواب هو نعم.
00: 11: 1908 اتضح أن الجسم النانوي يرتبط بجزء من بروتين N الذي يرتبط به أيضًا
00: 11: 2408 العامل المساعد للبوليميراز P.
00: 11: 2709 من أجل تكرار جينوم VSV ،
00: 11: 2928 يجب أن يتفاعل البوليميراز مع العامل المساعد P لتمكين هذا التفاعل من المضي قدمًا.
00: 11: 3514 وكما لاحظنا ، يتنافس الجسم النانوي على الارتباط ببروتين P ، وبالتالي بشكل كاف
00: 11: 4018 يشرح لماذا يمنع تكاثر الفيروس.
00: 11: 4418 وما لا يظهر في هذه الشريحة هو حقيقة أننا إذا زرعنا الفيروس الآن في الوجود
00: 11: 4900 من هذا الجسم النانوي المعين ، يمكننا بسهولة اختيار متغيرات الهروب التي لم تعد
00: 11: 5404 عرضة للتثبيط بواسطة هذا الجسم النانوي.
00: 11: 5714 وكما قد تتوقع ، فإن الطفرات التي تفسر متغيرات الهروب هذه ترسم بدقة
00: 12: 0214 بالموقع الذي يرتبط به الجسم النانوي دون التأثير على ارتباط العامل المساعد P.
00: 12: 0808 إذن لدينا هنا دورة كاملة ، يمكننا من خلالها تحصين حيوان ببعض المستضدات ،
00: 12: 1506 إجراء شاشة المظهرية ، وتحديد الحاتمة المعترف بها عند الدقة الذرية ،
00: 12: 2023 ثم استخدم تجربة بيولوجية في الجسم الحي للتحقق من صحة هذه الاستنتاجات عن طريق الاختيار
00: 12: 2517 لمتغيرات الهروب.
00: 12: 2817 مثال ثانٍ يستغل قدرة الأجسام النانوية على العمل في السيتوبلازم
00: 12: 3420 من خلية الثدييات تتعلق بالأجسام النانوية التي صنعناها ضد المكون
00: 12: 3926 لهيكل شديد التعقيد نشير إليه باسم الجسيم الملتهب.
00: 12: 4314 وبدون الخوض في تفاصيل غير ضرورية ، فإن الالتهابات هي تجمعات فوق الجزيئية
00: 12: 4906 مطلوب لجانب معين من المناعة الفطرية.
00: 12: 5225 عندما يستشعر الالتهاب مكونًا ميكروبيًا ، فإنه يتقلص ، ويستفيد من
00: 13: 0009 سلسلة من المهايئات لتجنيد أعداد هائلة من إنزيم يسمى pro-caspase-1.
00: 13: 0615 بمجرد تجميع هذا الجسيم الملتهب بشكل صحيح ، فإنه يؤدي إلى تنشيط pro-caspase-1 ،
00: 13: 1306 وهذا بدوره يسمح بتحويل السيتوكين المسمى pro-IL-1 إلى نظيره النشط ،
00: 13: 1926 IL-1.
00: 13: 2026 هذا جانب رئيسي من جوانب الالتهاب.
00: 13: 2322 اتضح أن الالتهاب يحدث في العديد من المظاهر الجزيئية ، اثنان منها
00: 13: 2904 معروضة هنا.
00: 13: 3004 على اليسار ، الجزء الملتهب NLRP3 ، المكون من مكررات غنية باللوسين
00: 13: 3506 - هذه هي الهياكل المتكررة الموضحة في الأعلى
00: 13: 3828 مجال pyrin يقوم من خلاله بتجنيد المحول ASC
00: 13: 4218 وبروتين ASC نفسه لديه مجال تفاعل بروتين-بروتين آخر يسمى
00: 13: 4612 مجال تنشيط وتوظيف caspase والذي من خلاله ، كما يوحي الاسم ،
00: 13: 5104 كاسباس يتم تجنيده.
00: 13: 5321 تحدث هذه الالتهابات في العديد من النكهات المختلفة.
00: 13: 5608 الثاني ، ليس الوحيد الموجود ، هو NAI.
00: 14: 0205 NAIP أو NLRC4 الملتهب ، حيث تم اعتبار مشاركة محول ASC قيد المناقشة.
00: 14: 1222 لذلك ، أقمنا الأجسام النانوية ضد بروتين ASC ، ووجدنا أن هذه الأجسام المضادة يمكن في الواقع
00: 14: 2017 يعيق الإطلاق الصحيح للإنترلوكين 1 ، مما يوحي بأنه لدينا بالفعل جسم مضاد مثبط ،
00: 14: 2806 ومرة ​​أخرى ، من خلال استغلال حقيقة أن الأجسام النانوية تعمل كمرافقين للبلورة ،
00: 14: 3404 كنا محظوظين بما يكفي لتمكننا من تحديد كيفية ارتباط هذا الجسم النانوي بشكل خاص
00: 14: 3823 بنيته المضادة ، مجال CARD لبروتين ASC.
00: 14: 4304 ما هو جدير بالملاحظة في هذه الحالة بالذات هو أن الجسم النانوي يرتبط بهدفه
00: 14: 4808 ليس من خلال التكاملية المحددة للمنطقة 3 ، والتي غالبًا ما تقدم المساهمة الرئيسية
00: 14: 5307 لربط المستضد ، ولكن مع مساهمة مهمة جدًا لـ CDR2 للتوسط في تفاعل معين
00: 14: 5923 مع مجال CARD.
00: 15: 0106 وقد تم هذا العمل بالتعاون مع Hao Wu في مستشفى بوسطن للأطفال.
00: 15: 0608 الآن ، وجود جسم نانوي يرتبط ببروتين ASC يمكننا من القيام بمجموعة متنوعة من
00: 15: 1322 تجارب مختلفة.
00: 15: 1505 وتتضمن إحدى هذه التجارب بناء جهاز استشعار يمكنه الإبلاغ عن التجميع
00: 15: 2112 من المونومرات الالتهابية ومونومرات ASC في الهياكل البوليمرية التي تعد شرطًا أساسيًا
00: 15: 2718 للتفعيل.
00: 15: 3006 بدمج الجسم النانوي الخاص بنا المخصص لـ ASC في البروتين الفلوري الأخضر ، لأول مرة
00: 15: 3722 يمكننا أن ننظر إلى توزيع بروتين ASC بوفرة طبيعية.
00: 15: 4122 أحد مضاعفات دراسة الجسيمات الالتهابية هو الإفراط في التعبير عن المكونات الفردية
00: 15: 4725 يمكن أن يؤدي إلى الفن. التنشيط المصطنع وسابق لأوانه.
00: 15: 5113 وما نود أن نعرفه هو كيف يبدو سلوك هذه المكونات
00: 15: 5526 في ظل ظروف الوفرة الطبيعية.
00: 15: 5803 لذلك في هذه الحالة بالذات ، أخذنا خط خلية بشرية أحادية الخلية قادرة على الحفاظ على تنشيط NLRP3 ،
00: 16: 0625 قدمنا ​​المراسل المكون من جسم نانوي خاص بـ ASC مدمج في GFP ،
00: 16: 1215 وفي غياب التحفيز الصريح ، بحثنا عن توزيع بروتين ASC
00: 16: 1720 بحكم حقيقة أنها مستهدفة من قبل بناء الانصهار الخاص بنا nanobody-GFP.
00: 16: 2306 وما تراه في غياب أي تنشيط علني هو هذا التوزيع المنتشر
00: 16: 2817 من بروتين ASC.
00: 16: 3016 إذا عرضنا الآن تلك الخلايا نفسها لمحفزات مسببة للالتهاب ، فيمكننا البدء في رؤية
00: 16: 3509 بدء البلمرة.
00: 16: 3620 نرى تشكيل هذه الخيوط.
00: 16: 3928 لا يكتمل تجميع الجسيم الملتهب ، وهو ما يفسر ذلك
00: 16: 4412 التأثير المثبط لهذا الجسم النانوي المحدد ، لكنه يعطيك مثالًا على كيف يمكننا
00: 16: 4914 استخدم الأجسام النانوية للإبلاغ ، في الخلايا الحية ، عن الظواهر التي قد تكون صعبة للغاية لولا ذلك
00: 16: 5610 للدراسة.
00: 16: 5821 تطبيق رئيسي آخر كنا مهتمين به لفترة طويلة وهو الاستخدام
00: 17: 0302 شظايا الأجسام المضادة أحادية المجال أو الأجسام النانوية لأغراض التصوير.
00: 17: 0718 إذا كنت ترغب في تطوير كاشف من نوع الجسم المضاد للتصوير ، فيجب أن يتوافق
00: 17: 1123 مجموعة معينة من المعايير.
00: 17: 1408 يجب أن يتم تمييزه حتى نتمكن من الكشف عن المنتج المصنف.
00: 17: 1728 يجب إزالته من الدوران بسرعة لتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء مناسبة.
00: 17: 2323 ويحتاج إلى تحقيق اختراق مناسب للأنسجة.
00: 17: 2616 وهنا يصبح حجمها الصغير سمة مميزة رئيسية بالمقارنة
00: 17: 3113 بأجسام مضادة كاملة الحجم.
00: 17: 3400 يبلغ حجم الأجسام المضادة كاملة الحجم حوالي 150 كيلو دالتون في الكتلة الجزيئية.
00: 17: 3824 شظايا الجسم النانوي التي نعمل معها يبلغ حجمها تقريبًا عُشر الحجم.
00: 17: 4216 وهذا يفسر اختراقها المتفوق للأنسجة وتطهيرها المتسارع
00: 17: 4707 من الدورة الدموية ، وبالتالي اعتقدنا أن هذه ستكون عوامل مثالية لأغراض التصوير.
00: 17: 5204 الآن ، من أجل تسمية جزء من الجسم المضاد ، أو أي بروتين لهذا الأمر ، فأنت تريد
00: 17: 5820 تجنب الأضرار الجانبية.
00: 18: 0120 معظم إجراءات الوسم الكيميائي المستخدمة بشكل شائع تنطوي على مخاطر التعديل
00: 18: 0717 من المخلفات المهمة لوظيفة هذا البروتين.
00: 18: 1000 وهكذا ، في تصميم وكلاء التصوير لدينا ، نرغب في تجنب إدخال
00: 18: 1517 أي ضرر كيميائي يصيب بروتين الفائدة.
00: 18: 1822 لذلك ، لتحقيق ذلك ، نستخدم ما يسمى برد فعل الفرز.
00: 18: 2410 إنزيم الفرز هو عبارة عن ترانساسيلاز يتعرف على تسلسل ببتيد قصير
00: 18: 3107 عند أو بالقرب من الطرف C لأي بروتين مستهدف مهم.
00: 18: 3528 إنه في الأساس عبارة عن بروتياز ثيول ينشق بين الثريونين والجليسين ،
00: 18: 4020 مشار إليه في رمز أحادي الحرف في هذه الشريحة ، لينتج عن إنزيم الثيوآسيل التساهمي الوسيط ،
00: 18: 4711 مشار إليه في أسفل اليسار هنا.
00: 18: 4827 الآن ، نقدم ، خارج الجسم الحي ، ببتيد اصطناعي قصير ، يتكون بشكل ضئيل من جلايسين واحد
00: 18: 5712 - من الناحية المثالية ، اثنان ، ثلاثة أو أكثر - والتي يمكن للمرء أن يلحق بها إلى حد كبير أي حمولة من الفائدة ،
00: 19: 0318 يُشار إليها هنا على أنها مسبار.
00: 19: 0514 تعمل هذه الببتيدات الاصطناعية مثل nucleophiles القادم الذي يهاجم هذا الإنزيم thioacyl
00: 19: 1015 متوسط.
00: 19: 1123 وينتج عن ذلك تكوين رابطة تساهمية بين البروتين المستهدف الذي لديك
00: 19: 1617 تم تعديله باستخدام تسلسل LPXT (G) n هذا في ارتباط ببتيد جيد تمامًا مع المسبار ،
00: 19: 2413 مرفقة عبر امتداد oligoglycine هذا.
00: 19: 2626 إذن ، هذه طريقة يمكن تعديلها إلى حد كبير لأي بروتين مهم ،
00: 19: 3200 إذا تم تحسينها بشكل صحيح.
00: 19: 3418 الآن ، أنواع الحمولات التي يمكن للمرء أن يربطها بالبروتينات محدودة فقط بما
00: 19: 4024 صديقك الكيميائي. يمكن للكيميائيين إنتاجها.
00: 19: 4405 في هذا المثال ، أشرت إلى بعض الأشياء التي تمكنا من لصقها بنجاح
00: 19: 4900 باستخدام هذا التفاعل الفردي.
00: 19: 5105 يشتمل على ارتباط حيوي خاص بالموقع ، ومرفق كمي خاص بالموقع
00: 19: 5619 من الفلور ، تنفيذ اندماج البروتين البروتين ، ربط جزيئات الحمض النووي ، و ،
00: 20: 0300 سيكون مناسبًا لما سأقوله في ما يلي ، مرفق النظائر المشعة.
00: 20: 0926 الشيء المهم الذي يجب تذكره هنا هو أن التفاعل يستمر - تحديدًا الموقع و
00: 20: 1503 تقريبًا متكافئ ، مما يجعلها جذابة جدًا لأغراض هندسة البروتين.
00: 20: 2023 لذا ، لكي نستخدم الأجسام النانوية ضد البروتينات السطحية ذات الأهمية لأغراض التصوير ،
00: 20: 2924 نحتاج إلى تثبيت ملصق يسمح لنا باكتشافها.
00: 20: 3321 وبدونها. دون الخوض في الفيزياء ، كنا مهتمين بالتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.
00: 20: 3908 هذه طريقة يمكن استخدامها في العيادة لتشخيص الخلايا النشطة الأيضية من الخلايا غير النشطة.
00: 20: 4501 إنها طريقة غير جراحية.
00: 20: 4702 لكنها. يستخدم نظائر مشعة يصعب التعامل معها في بعض الأحيان.
00: 20: 5205 بدون الخوض في التفاصيل الكيميائية ، قمنا بتطوير إجراءات لتثبيت هذه النظائر
00: 20: 5625 مناسب للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني لأجسامنا النانوية باستخدام تفاعل سورتاس.
00: 21: 0120 إذن ، على اليسار ترى بعض الكيمياء السيئة التي تؤدي إلى تكوين مركب يحمل علامة F-18.
00: 21: 0926 الفلور 18 هو النظير المناسب للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.
00: 21: 1312 على اليمين ، ترى مسار العمل لتثبيته رد الفعل المحفز باستخدام Sortase
00: 21: 1727 كيان كيميائي يسمح الآن. يسمح لنا بدمج الاثنين في ظل ظروف أصلية صارمة ،
00: 21: 2400 دون إلحاق أي ضرر جانبي ببروتين الفائدة.
00: 21: 2800 إذن ، هذه هي الطريقة التي يمكننا بها جعل الأجسام النانوية جاهزة للتصوير عن طريق التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.
00: 21: 3327 وما يظهر في هذا الجزء الصغير ، هنا ، هو فأر قمنا بتصويره بجسم مضاد
00: 21: 3800 مقابل منتجات MHC من الدرجة الثانية.
00: 21: 4102 هذه جزيئات موجودة في الخلايا العارضة للمستضد.
00: 21: 4328 في هذه الحالة ، نتعامل مع فأر يحمل الورم حيث تواجد الخلايا العارضة للمستضد
يمكن تصور 00: 21: 4920 في الورم من خلال طريقة التصوير غير الغازية هذه.
00: 21: 5618 لقد كنا مهتمين أيضًا ، على وجه الخصوص ، بتصوير الاستجابات المناعية غير. غير جراحي.
00: 22: 0305 أشرت إلى حقيقة أن الخلايا الليمفاوية التائية تتعرف على المستضد بحكم هذا المستضد المحدد
00: 22: 0918 مستقبل يتعرف على منتجات معقد التوافق النسيجي الكبير المركب مع الببتيد المناسب ، ولكن التفاعلية
00: 22: 1606 من هذه الخلايا التائية يمكن أن تكون أحادية. مراقبة. يمكن تعديلها بالتعبير عن
00: 22: 2106 ما يسمى بجزيئات التكلفة أو نقاط التفتيش.
00: 22: 2321 ويمكن أن يكون ذلك محفزًا أو مثبطًا.
00: 22: 2610 ولكي نتمكن من تصوير الاستجابات المناعية بشكل غير جراحي ، للتركيز عليها
00: 22: 3121 أصبحت جزيئات التكلفة أو نقاط التفتيش هذه نقطة اهتمام.
00: 22: 3711 هذا أكثر أهمية عندما نعلم الآن أن جزيئات نقاط التفتيش هذه مهمة
00: 22: 4219 هدفًا للعلاج المناعي للسرطان.
00: 22: 4612 هذه الشريحة مأخوذة من عمل جيم أليسون ، الذي أظهر ذلك بإغلاق إحدى نقاط التفتيش هذه
00: 22: 5120 جزيء يمكن للمرء أن يحقق تحسنًا ملحوظًا في الاستجابة المضادة للأورام.
00: 22: 5801 في هذه الحالة ، سترى ما يحدث لنمو الورم ، مُقاسًا بقطر الورم.
00: 23: 0328 في حالة عدم وجود أي علاج ، إذا أعطيت جسمًا مضادًا يفشل في إعاقة هذا التفاعل التنظيمي ،
00: 23: 1211 لا يوجد تأثير على نمو الورم.
00: 23: 1418 ولكن إذا قمت بحظر جزيء نقطة تفتيش يمنح تثبيطًا للخلايا التائية
00: 23: 1926 الخصوصية المناسبة ، مجرد حجب هذا الجزيء المثبط يمنحك تحسنًا كبيرًا
00: 23: 2526 في الاستجابة المضادة للورم.
00: 23: 2720 الآن ، كان هذا ناجحًا بشكل كبير في العيادة ، وقد تم تحقيق الشفاء ، ولكن فقط
00: 23: 3319 يستجيب جزء من المرضى لمثل هذا العلاج وسيكون من المهم جدًا معرفة ذلك
00: 23: 3806 لماذا يستجيب بعض الناس للعلاج والبعض الآخر لا يستجيب.
00: 23: 4212 ونعتقد أن القدرة على تصوير الاستجابات المناعية غير الغازية قد تساعدنا
00: 23: 4701 قدم بعض الإجابات على هذا السؤال.
00: 23: 5003 بالإضافة إلى بروتين CTLA-4 الذي كان محور اهتمام العمل في مختبر أليسون ،
00: 23: 5510 ركز الكثير من العمل منذ ذلك الحين على أعداد أخرى من عائلة الحاجز ،
00: 24: 0112 ولا سيما بروتين PD-L1.
00: 24: 0302 حسنًا ، دعني آخذك خلال هذا المثال.
00: 24: 0517 لدينا هنا الخلايا اللمفاوية التائية التي تشغل خلية عرض مستضد عبر مستقبل الخلية التائية الخاصة بها
00: 24: 1108 لمستضد.
00: 24: 1226 ولكن إذا كانت هذه الخلية العارضة للمستضد تعبر أيضًا عن PD-L1 ، فإنها تشغل بنية مضادة
00: 24: 1908 على الخلية التائية التي تمنح الآن إشارة مثبطة لتلك الخلية التائية مما يجعلها غير قادرة على
00: 24: 2505 تمارس وظائفها المعتادة ، سواء كان ذلك إنتاج السيتوكين أو وظيفة التحلل.
00: 24: 3018 إذا كان لدى الشخص أجسام مضادة تحجب إما PD-1 أو PD-L1 ، فيمكن تخفيف هذا التثبيط.
00: 24: 3711 ومثل المثال المضاد لـ CLTA-4 الذي عرضت عليه الرسم البياني الذي يحظر PD-1 أو PD-L1
00: 24: 4317 ثبت أن لها تأثير مضاد للأورام.
00: 24: 4800 لذلك ، قمنا بتطوير أجسام نانوية ضد PD-L1.
00: 24: 5305 ونحن قادرون على إظهار أن الورم الميلانيني B16 ، وهو نموذج فأر يستخدم بشكل متكرر من سرطان الجلد ،
00: 24: 5909 يعبر عن بروتين PD-L1.
00: 25: 0213 ما تراه هنا هو فئران محقونة بجزء مشع إشعاعي من جسم نانوي يتعرف
00: 25: 0728 PD-L1.
00: 25: 0922 تحمل هذه الفئران الموجودة على كتفها الأيسر ورمًا.
00: 25: 1315 ويمكن الكشف عن وجود بروتين PD-L1 على الورم بوضوح من خلال هذا العلاج غير الجراحي
00: 25: 1922 طريقة التصوير.
00: 25: 2110 نحن دائمًا نستخدم الضوابط الجينية لاستنتاج خصوصية تفاعلات الوسم التي نراها.
00: 25: 2717 على اليمين ، ترى فأر PD-L1 تم تطعيمه بنفس الورم.
00: 25: 3220 وعلى الرغم من أنه أكثر خافتًا إلى حد ما ، لا يزال بإمكاننا اكتشاف إشارة PD-L1 في هذا الإعداد أيضًا.
00: 25: 3817 الاستنتاج من هذه التجربة هو أن PD-L1 إيجابية في البيئة المكروية للورم
00: 25: 4405 هي النتيجة النهائية للتعبير عن هذا البروتين على الخلايا الغازية ذات الأصل المكونة للدم ،
00: 25: 5028 وكذلك عن طريق التعبير عن PD-L1 بواسطة الورم نفسه.
00: 25: 5504 لذلك ، في حين أنه من الممكن استخدام نظير مشع للفلور ، F-18 ، لأغراض وضع العلامات ،
00: 26: 0222 عمر النصف القصير ، 110 دقيقة ، يفرض قيودًا.
00: 26: 0628 لهذا السبب ، لحسن الحظ لدينا وصول إلى نظائر أخرى متوافقة مع PET ،
00: 26: 1107 مثل الزركونيوم 89.
00: 26: 1317 ولدينا الوسائل الكيميائية لتركيب تلك المواقع - على وجه التحديد أيضًا.
00: 26: 1805 في اللوحة A ، نشير إلى التركيب الكيميائي للمخلب المطلوب للربط على وجه التحديد
00: 26: 2501 زركونيوم -89.
00: 26: 2700 وبنفس الطريقة التي نستخدم بها sortase لتثبيت F-18 ، لدينا الكيمياء التي
00: 26: 3121 تمكننا من تثبيت هذه المركبات التي تحمل علامة الزركونيوم.
00: 26: 3522 يوضح النصف السفلي من هذه الشريحة الطريقة الأنزيمية الأساسية التي نتبعها
00: 26: 4020 نعلق هذا الزركونيوم.
00: 26: 4219 مرة أخرى ، نستخدم تفاعل الفرز لتركيب الهيكل الموضح في اللوحة A.
00: 26: 4727 ولدينا إمكانية إضافية لتعديل هذه الهياكل بشكل أكبر من خلال التثبيت
00: 26: 5402 من البولي إيثيلين جلايكول ، على سبيل المثال ، للتأثير على التوازن المحب للماء
00: 26: 5916 المنتج النهائي.
00: 27: 0018 إذن ، ترون هنا تجربة أخذنا فيها جسمًا نانويًا يتعرف على CD8.
00: 27: 0626 هذه هي علامة البروتين السكري لتشخيص الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا.
00: 27: 1018 وفي أقصى اليسار ترى النتيجة الأولية بجسم نانوي مُسمى ببساطة بالزركونيوم -89.
00: 27: 1810 الهيكلان الهائلان الظاهران في الأسفل هما الكلى والمثانة.
00: 27: 2226 وهذا الجسم النانوي المحدد ، عند تسميته ، يميل إلى التركيز في أعضاء الإزالة ،
00: 27: 2807 مع وضع علامات باهتة جدًا في الغدة الصعترية ، الغدد الليمفاوية
00: 27: 3127 - بالضبط حيث تتوقعه.
00: 27: 3420 ولكن الآن يتم إضافة مسافات PEG من 5 و 10 و 20 كيلو دالتون ، وبالتالي تحسين مقاومة الماء
00: 27: 4303 من عامل الوسم ، نرى انخفاضًا هائلاً في هذا الامتصاص في أعضاء الإزالة.
00: 27: 4917 وبدأنا نرى ، بوضوح كبير ، الهياكل اللمفاوية لهذه الأجسام النانوية
00: 27: 5319 صممت للكشف في المقام الأول.
00: 27: 5528 مرة أخرى ، نستخدم التحكم الجيني.
00: 27: 5900 في أقصى اليمين ، ترى فأرًا يفتقر إلى أي وجميع الخلايا الليمفاوية ، بسبب حقيقة
00: 28: 0413 أنه تحور في نفس المكان المسؤول عن إعادة ترتيب VDJ.
00: 28: 1018 والتركيبات اللمفاوية الواضحة جدًا في هذه اللوحة غائبة تمامًا في
00: 28: 1620 خروج المغلوب RAG ، الذي يفتقر إلى الخلايا الليمفاوية تمامًا.
00: 28: 1928 لذلك ، مع وجود هذه الأداة في متناول اليد ، يمكننا أخيرًا البدء في تصوير الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا
00: 28: 2504 وطرح السؤال ، هل يمكننا اكتشاف تدفق الخلايا التائية القاتلة إلى بيئة الورم المكروية؟
00: 28: 3211 ما تعرضه هذه الشريحة هو فأر تم تلقيحه بخط خلية سرطانية في البنكرياس.
00: 28: 3810 وعلى جانبه الأيسر ، يمكنك رؤية الورم بوضوح بحكم حقيقة أن الخلايا الليمفاوية CD8
00: 28: 4515 قم بالتسلل إليه ، موضحًا أنه يمكننا بالفعل استخدام هذا النوع من الصور غير الغازية. التصوير
00: 28: 5108 لتتبع سلوك الخلايا الليمفاوية التائية في الفئران الحية.
00: 28: 5418 والمهم حقًا في هذا النوع من التجارب هو حقيقة أننا لم نعد
00: 28: 5816 بحاجة لقتل الحيوان لفحص ما يجري بداخله.
00: 29: 0223 عادةً ، علماء المناعة ، من أجل الوصول إلى الأعضاء اللمفاوية أو الوصول إلى الخلايا الليمفاوية
00: 29: 0908 التي تعيش في الورم ، يجب أن تقتل الفأر ، وتستأصل الأعضاء ذات الأهمية ،
00: 29: 1417 ثم عدّد وصف الخلايا الليمفاوية الموجودة.
00: 29: 1810 باستخدام طريقة التصوير غير الغازية هذه ، وإن كانت بدقة متواضعة ، يمكننا الآن تتبع
00: 29: 2313 حيوان بمرور الوقت وراقب الاستجابة المناعية تتكشف.
00: 29: 2713 إذن ، هذا هو فأرنا الدوار الشهير.
00: 29: 3018 ومرة ​​أخرى ، يمكنك رؤية الورم بوضوح على الجانب الأيمن.
00: 29: 3511 في الواقع ، سترى أيضًا أن هذه النقاط تمثل العقد الليمفاوية.
00: 29: 4024 ويتم تصنيف العقد الليمفاوية القريبة من الورم بشكل مكثف
00: 29: 4600 من الغدد الليمفاوية. العقد الليمفاوية على الجانب الآخر ، بما يتفق مع تهريب الخلايا الليمفاوية
00: 29: 5018 بين هذه الأعضاء اللمفاوية المختلفة.
00: 29: 5226 إذن ، كيف يمكننا استخدام هذه المعلومات لمعالجة أحد الأسئلة التي طرحتها سابقًا؟
00: 29: 5905 لماذا تستجيب بعض الأورام للأجسام المضادة التي تحجب نقاط التفتيش ،
00: 30: 0318 مثل anti-CTLA-4 أو anti-PD-1 / PL-L1 ، والبعض الآخر لا؟
00: 30: 0903 هل يمكننا استخدام طريقة التصوير هذه لإلقاء بعض الضوء على ما يحدث في
00: 30: 1321 هذا المكان المحدد؟
00: 30: 1514 إذن ، هذه شريحة معقدة ، لكن المفهوم بسيط للغاية.
00: 30: 2027 نستخدم نموذج الورم الميلانيني B16 الخاص بنا في مكان تتقدم فيه بعض الحيوانات
00:30: 2703 لنمو الورم بالكامل وسيستجيب الآخرون للسيطرة على الورم استجابة لذلك
00: 30: 3322 الأجسام المضادة التي تحجب نقاط التفتيش.
00: 30: 3624 لذلك في هذه الحالة ، نستخدم الأجسام المضادة لـ CTLA-4 ، الأجسام المضادة كاملة الحجم ، كعامل علاجي.
00: 30: 4301 ونحن ببساطة نصور في البيئة المكروية للورم ما يحدث للخلايا الليمفاوية التائية CD8
00: 30: 4802 التي يجدها المرء في الموقع.
00: 30: 4922 وما وجدناه هو ارتباط قوي جدًا بين توزيع خلايا CD8 T.
00:30: 5603 وقدرة الحيوان على السيطرة على الورم.
00: 30: 5906 إذا رأينا توزيعًا أحادي البؤرة للخلايا اللمفاوية التائية ، فهذا يوازيه انخفاض في حجم الورم
00: 31: 0520 وتحسين بقاء الحيوانات.
00: 31: 0824 في الحيوانات التي لا تستجيب لحصار الحاجز ، وحيث تنمو الأورام ،
00: 31: 1310 نرى هذا التوزيع غير المتجانس لخلايا CD8 T ، وهذا يصبح مؤشرًا ،
00: 31: 1822 إذا صح التعبير ، من نتيجة التجربة النهائية.
00: 31: 2319 تم التحقق من صحة ذلك ، بالتعاون مع مختبر Bob Weinberg ، في نموذج سرطان الثدي
00: 31: 2711 حيث يوجد متغيران.
00: 31: 3010 واحد هو متغير طلائي مناعي ويمكن التحكم فيه بسهولة استجابة لحصار نقطة التفتيش ،
00: 31: 3610 وهناك نوع آخر من اللحمة المتوسطة يكون أقل تمايزًا ، وعدوانيًا للغاية ،
00: 31: 4101 وسوء الاستجابة لحصار نقطة التفتيش.
00: 31: 4404 إذا قمنا الآن بتصوير حيوانات من أي نوع. ترى مثالاً على متغير اللحمة المتوسطة ،
00: 31: 4909 يسيطر عليها بشكل سيء الحصار على الحواجز. الأورام تستمر في النمو والحيوانات
00: 31: 5406 لا تنجو.
00: 31: 5510 في الأسفل ، ترى البديل الظهاري ، توزيع أحادي البؤرة لخلايا CD8 T ،
00: 32: 0204 استجابة ممتازة للأجسام المضادة التي تحجب نقاط التفتيش ، وبالتالي نعتقد أن هذه الطريقة
00: 32: 0620 أول مرة تبدأ في إلقاء بعض الضوء على ما يحدث في البيئة المكروية للورم.
00: 32: 1024 ما زال أمامنا طريق طويل وهناك قائمة طويلة من جزيئات السطح التي نرغب في تصويرها.
00: 32: 1618 هناك الكثير الذي نحتاج إلى معرفته حول الجوانب المختلفة للاستجابة المناعية.
00: 32: 2015 ولكن سيكون من المهم قياس هذه الأشياء في سياق حيوان تجريبي حي
00: 32: 2519 وفي النهاية ، ربما ، في العيادة.
00: 32: 2725 لذا ، فقد أظهر المقطع السابق جهودنا في تصوير جانب معين من المناعة التكيفية ،
00: 32: 3417 ولا سيما خلايا CD8 T.
00: 32: 3711 ولكن كما أشرت ، فإن دفاع المضيف هو نظام متكامل لا يشمل فقط المناعة التكيفية
00: 32: 4409 ولكن حصانة فطرية أيضًا.
00: 32: 4525 وتتركز الجهود المستقبلية على محاولة تصوير هذه الاستجابات المناعية الفطرية بشكل غير جراحي
00: 32: 5118 أيضًا.
00: 32: 5218 أعتقد أن للالتهاب جانبًا رئيسيًا يمكن أن يستفيد من هذا النهج.
00: 32: 5712 تتمتع الأجسام النانوية التي استخدمناها ببعض مزايا التوقيع:
00: 33: 0028 صغر حجمها يجعل التصوير ممكنًا
00: 33: 0320 سهولة التصنيع في الإشريكية القولونية ميزة إضافية
00: 33: 0613 حقيقة أنها لا تتطلب ارتباطًا بالجليكوزيل ولا روابط ثاني كبريتيد تسمح لنا بالتعبير عنها
00: 33: 1201 في سيتوبلازم خلايا الثدييات واستخدمها لإجراء شاشات نمطية ، كما أوضحت
00: 33: 1900 أخيرًا ، حجمها الصغير يجعل من الممكن استغلال رد فعل Sortase على
00: 33: 2403 تثبيت إلى حد كبير أي. أي كيان مفضل دون إلحاق ضرر بالجسم النانوي نفسه ،
00: 33: 2903 وهذه هي الطريقة التي طبقناها لجعل الأجسام النانوية مناسبة للتصوير بواسطتها
00: 33: 3506 التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.
00: 33: 3725 اسمحوا لي أن أنهي كلامي بالإقرار بالأفراد الذين قاموا بهذا العمل.
00: 33: 4123 عمل الفيروس الذي لخصته قام به فلوريان شميدت ، باحث ما بعد الدكتوراة ،
00: 33: 4709 وليو هانكي ، طالب دراسات عليا.
00: 33: 5017 تم إنشاء منصة nanobody بواسطة Jessica Ingram ، عضو هيئة التدريس حاليًا في Dana-Farber.
00: 33: 5611 تم إجراء الكيمياء الإشعاعية بواسطة محمد رشيديان.
00: 33: 5910 وأجريت تجارب مناعة الورم مع مدخلات مهمة للغاية
00: 34: 0406 ومشاركة مايك دوجان.
00: 34: 0705 لقد ذكرت حقيقة أننا نتعاون مع Bob Weinberg في نماذج سرطان الثدي لدينا ،
00: 34: 1113 هاو وو على الملتهب ،
00: 34: 1424 ستيف ألمو معنا كمصدر للبروتينات. مع ماذا
00: 34: 1703 يمكننا تحصين الألبكة والحصول على الأجسام المضادة التي نعمل معها.
00: 34: 2107 شكرًا جزيلاً.

  • الجزء 1: علم المناعة: أساسيات تنوع الأجسام المضادة

مناقشة

لقد بحثنا في آثار العديد من ببتيدات إشارة الجسم المضاد (SP) على إنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة في نظام عابر للعدوى المشتركة باستخدام خلايا HEK293 ، والتطبيع باستخدام نفس عوامل تعداء العدوى والبلازميدات الأساسية لتغيير فقط ببتيدات الإشارة. وجدنا أن IgE SP أعطت بشكل عام عوائد أفضل من SPs الأصلية (الشكل 2).

لدراسة التأثيرات المحتملة لـ SP من السلاسل الثقيلة والخفيفة (13) ، قمنا بتطعيم V & # x3ba1 SP على النوع البري V & # x3ba1 | VH3 من Pertuzumab و Trastuzumab المؤتلف (الشكل 3) للمقارنة بـ IgE SP و نظرائهم في SP. أسفر كل من IgE و V & # x3ba1 SPs عن إنتاج أفضل. مع احتمال أن ينتج المايلوما SP إنتاجًا أفضل ، درسنا SP آخر مرتبط بالورم النخاعي & # x2013 متغيرًا من V & # x3ba1 SP - مع P18R أو P18S مختلفًا عن V & # x3ba1 SP في IMGT (32).

أظهر تطعيم المايلوما V & # x3ba1 SP على النوع البري V & # x3ba1 | VH3 المؤتلف Pertuzumab و Trastuzumab أن الطفرة P18S زادت الإنتاج في نموذج Trastuzumab ولكنها أدت إلى انخفاض الإنتاج في نموذج Pertuzumab ، بينما أدت الطفرة P18R إلى انخفاض الإنتاج في كل من نماذج Trastuzumab و Pertuzumab ، مقارنةً بنموذج V & # x3ba1 SP الأصلي (الشكل 4). بالنظر إلى نتائج طفرة المايلوما SP هذه ، لم نجد دعمًا لدور SP في التسبب في فرط جلوبولين الدم داخل المايلوما ، ولا تزال هناك علاقة غامضة بين SP وإنتاج الأجسام المضادة.

تحليل محتوى الأحماض الأمينية الأساسية التسعة (EAA) في متواليات SP ، لا سيما بالنظر إلى أن التجارب السابقة أظهرت أن إضافة المكملات الغذائية قد تكون مفيدة في إنتاج البروتين ، وجدنا أن سلسلة SPs الخفيفة لديها تنوع وعدد أقل من استخدام EAAs من الثقيلة سلسلة SPs (الجدول 1) ، مما يوفر دليلًا على مساهمتها المحتملة في إنتاج المؤتلف.

توسيع تحليل الأحماض الأمينية الأساسية وغير الأساسية (الشكلان 5 و 6) إلى كل من متغيرات Pertuzumab و Trastuzumab كاملة الطول ، وجدنا أن وجود الأحماض الأمينية F و H و I و A و N و L و S قد تكمن وراء ضعف إنتاج متغيرات V & # x3ba5 ​​Pertuzumab و Trastuzumab. من ناحية أخرى ، قد تسمح الأحماض الأمينية L و R و I و K و D بإنتاج أفضل كما هو واضح مع المتغيرات المحددة المقترنة بـ V & # x3ba3 (Pertuzumab) و V & # x3ba4 (Trastuzumab). ضمن هذه الاتجاهات ، كانت هناك استثناءات معينة مثل Pertuzumab V & # x3ba6 أنه على الرغم من وجود أعداد مماثلة من الأحماض الأمينية المعنية (على سبيل المثال F و H) ، لم يكن لديها مستويات إنتاج قابلة للمقارنة مع العائلات المنتجة الأفضل مثل VK1-4l أو Trastuzumab VH2 ، كلاهما التي كان لها عدد مماثل لـ Q كما هو الحال مع VH3 و 5 و amp 7 عالية الإنتاج ولكنها أدت إلى انخفاض الإنتاج.

قدمت تركيبة DMEM (الجدول 2) عددًا غير كافٍ من الأحماض الأمينية لدعم إنتاج الأجسام المضادة الأمثل ، خاصة وأن EEA: W و NEAAs: A و D و E و N و P ، لم يتم توفيرها على الإطلاق ولا موجودة بكميات غير كافية. وهذا ما يفسر زيادة الإنتاج عند إضافة مكملات مثل الببتون والكازين (34 & # x201337). في تجربتنا للمتابعة (الشكل 7) ، وجدنا أيضًا مكملات EAA لزيادة إنتاج الجسم المضاد الكلي في كل من نماذج Pertuzumab و Trastuzumab ، وبالتالي توفير مكمل محتمل لإنتاج الأجسام المضادة الأكاديمية والصناعية.

كان نموذجنا التنبئي المستند إلى حسابات الأحماض الأمينية (الشكل 8) قادرًا على تحديد مستويات الإنتاج الترتيبية (منخفضة أو متوسطة أو عالية) بدقة عالية (ROC AUC

0.79 & # x20130.95). ومع ذلك ، فإن النموذج حساس لمجموعات البيانات غير المتوازنة (على سبيل المثال 15 & # x201320٪ من المنتجين & # x201chigh & # x201d) على الرغم من التحسين باستخدام المعلمات الموزونة. بالإضافة إلى ذلك ، فهي مقيدة بشروط التعبير العابر المستخدمة في تجاربنا. ومع ذلك ، يمكن دمج بيانات أخرى مماثلة لترنسفكأيشن لمواصلة تحسين النموذج للتطبيق على نطاق أوسع في العمل في المستقبل.

نظرًا لكون عدد الأحماض الأمينية عاملاً في معدلات إنتاج الأجسام المضادة ، فإن السبب الكامن وراء استخدام جينات الجسم المضاد لمثل هذه الذخيرة الكبيرة من SPs قد يكون منطقيًا. من الممكن أن يعمل المرجع في التخفيف من الاعتماد المفرط على EAAs المحددة التي تؤثر على إنتاج الجسم المضاد. بالنظر إلى أن جينات VDJ للجسم المضاد شديدة التغير (38) تستخدم تقليبًا واسعًا للأحماض الأمينية ، فإن إشارة ببتيد ثابتة لجميع الأجسام المضادة يمكن أن تزيد من احتمال التحيز الشديد تجاه أحماض أمينية معينة. يمكن أن تؤدي مثل هذه التحيزات إلى اختناقات في بعض EAA (ق) (ق) (ق) وتعوق ليس فقط إنتاج الأجسام المضادة ، ولكن أيضا إنتاج البروتين الخلوي الأساسي. لذلك ، من خلال تغيير SPs مع اختلاف محتوى EAA ، يمكن تخفيف مثل هذه الاختناقات في EAAs ، وبالتالي شرح الوظيفة المحتملة للذخيرة الكبيرة من SP في جينات الجسم المضاد.

في الختام ، توفر دراسة الأجسام المضادة SP مع عوامل EAA نهجًا جديدًا لفهم إنتاج البروتين العابر للثدييات والرؤى المحتملة لمخزون SP التي تستخدمها الأجسام المضادة. يمكن أن يكون لعوامل EAA الجديدة هذه إمكانية للتطبيق على نطاق واسع لأنظمة الإنتاج الأخرى من أجل فهم أفضل لإنتاج البروتين.


دعم المعلومات

S1 التين.

أ. رسم خرائط التحمل الطفري للجسم المضاد لليزوزيم D44.1. يتم تمييز الطفرات التي تم تخصيبها أو استنفادها أو عدم وجود بيانات كافية في التسلسل العميق باللون الأزرق والأحمر والرمادي على التوالي. يشار إلى الأحماض الأمينية البرية في رموز من حرف واحد لكل موضع. يتم تمييز السيستين المرتبط بالكبريتيد في مثلثات سوداء ، ومواضع واجهة السلسلة الثقيلة الخفيفة التي تظهر فيها طفرات النقطة على إثراء ثلاثي بالنسبة للنوع البري ، يتم تمييزها في مثلثات وردية. ب. معايرة الربط النوعي باستخدام عرض الخميرة لـ D44.1 و D44.1 des و 7 المسوخات التي تشتمل على D44.1des باستخدام عرض سطح الخميرة. كثافة التألق الملزمة مرتبطة بأعلى تركيز من الليزوزيم 1 ميكرومتر.

S2 التين.

أ. يُظهر التركيب البلوري لـ D44.1 des (الأصفر والأخضر للسلاسل الثقيلة والخفيفة ، على التوالي) دقة عالية بالنسبة للتصميم الحسابي (الخزامى). كثافة الإلكترون عند 2 σ. ب. يُظهر التحليل البلوري لـ D44.1 des اتفاقًا كبيرًا مع D44.1 (انحراف الجذر التربيعي 0.7 Å Cα) ، بما في ذلك اتجاهات مخلفات سطح الربط (العصي D44.1 باللون الرمادي).

S3 Fig. يُثري رسم خرائط تحمل الطفرات الحسابية للتصاميم منخفضة الطاقة.

(باللون الأزرق) توزيع طاقات Rosetta بالنسبة إلى G6 لمجموعة مختارة من & gt 150000 متحولة متعددة النقاط فريدة في 11 موضعًا مشفرة في مساحة التسلسل المسموح بها المحسوبة بواسطة PSSM (≥-1) و ΔΔجي (≤ + 1 R.e.u.) فلاتر. (باللون الأخضر) مجموعة عشوائية من المسوخ متعدد النقاط بواجهة 30 vL-vH (تم السماح بجميع مواضع الواجهة) ، حيث تم السماح بأي من طفرات الأحماض الأمينية التسعة عشر في كل موضع متحور. في كلتا المجموعتين ، تم تحليل نفس العدد من الطفرات متعددة النقاط ، وتم تنفيذ نفس التوزيع لعدد الطفرات المتعلقة بـ G6. 37٪ من المسوخات متعددة النقاط كانت تمتلك طاقات أكثر تفضيلًا من G6 ، بينما أقل من 0.03٪ من الطفرات العشوائية كان لديها طاقات مواتية أكثر من G6. وبالتالي فإن رسم خرائط تحمل الطفرات الحسابية يثري التحولات المحسنة بأكثر من 1100 ضعف بالنسبة للطفرات العشوائية متعددة النقاط.

S4 الشكل. G6 و G6 des1 و G6 des13 تعبير وتنقية Fab.

(أ) بعد تنقية Ni-NTA ، يعرض G6 النطاق المتوقع عند 50 كيلو دالتون ، ونطاقات إضافية عند حوالي 100 كيلو دالتون ، مما يدل على عدم تجانس العينة. على النقيض من ذلك ، تتم إزالة G6 des13 و G6 des1 بشكل أساسي عند نطاق حجم 50 كيلو دالتون مع عدم وجود نطاقات ذات كتلة أعلى يمكن اكتشافها. (ب) تصميمات G6 des13 و G6 des1 بعد تشغيل ترشيح الهلام بأحجامها المتوقعة. يشار إلى حالة ظروف الاختزال (بدون DTT والغليان) في الجزء السفلي من المواد الهلامية.

S5 الشكل. تم تقليل الأجسام المضادة IgG1 G6 و G6 des13 كاملة الطول المفرزة وتحليلها بواسطة مواصفات الكتلة الأصلية مباشرة من وسط النمو.

تظهر اللوحات العلوية الأطياف الكاملة. يتم تمييز سلسلة حالة الشحن لكلا الجسمين المضادين بواسطة دوائر زرقاء داكنة وزرقاء فاتحة ، على التوالي. تم عزل حالة الشحن +23 لكل جسم مضاد في رباعي القطب وتعريضه لارتفاع تدريجي لجهد التصادم بطريقة تدريجية ، تتراوح من 50 إلى 200 فولت. والدوائر البرتقالية.

شكل S6 تم التعبير عن جميع تصاميم 20 ساعة 492.1 ، وتم قياس أنشطتها من طاف الثقافة كما هو موضح في الطرق.

تعكس أعلى القيم في اللطخة أكبر كميات من الركيزة المتبقية في نهاية اختبار نشاط QSOX1 sulfhydryl oxidase ، مما يشير إلى أكبر تثبيط لـ QSOX1 بواسطة الجسم المضاد. بسبب الاختلافات في مستويات التعبير (الشكل 5 أ و 5 ب) ، يعكس النشاط المثبط في هذه التجربة مزيجًا من عائد التعبير والنشاط الداخلي. تم التعبير عن التصميمات ذات النتائج المرسومة باللون (الأصفر والوردي) بأحجام أكبر ، وتم تنقيتها ومقارنتها كميًا للنشاط المثبط مقارنةً بالجسم المضاد الأبوي 492.1 المنقى من ورم هجين (الشكل 5 ج).


الأجسام المضادة الثانوية: أسئلة وأجوبة

اعثر على إجابات علمية فنية عن الأسئلة المتداولة (FAQs) المتعلقة بما يلي:

  • الأجسام المضادة الثانوية
  • فئات الأجسام المضادة والفئات الفرعية
  • شكل الأجسام المضادة الثانوية
  • اختيار الجسم المضاد الثانوي
  • شظايا F (ab ') 2 و F (ab') و F (ab)
  • الأجسام المضادة الثانوية التي تم امتصاصها مسبقًا
  • استكشاف أخطاء الأجسام المضادة الثانوية وإصلاحها
  • الكشف المباشر وغير المباشر
  1. ما هو الجسم المضاد الثانوي؟
  2. ما هي فئات الأجسام المضادة / الفئات الفرعية أو الأنماط المتماثلة؟
  3. ما هو الفرق بين استخدام جسم مضاد أولي مترافق مباشرة مقابل ثانوي مترافق؟
  4. هل من الضروري استخدام نمط متساوي / فئة فرعية معينة من الجسم المضاد الثانوي عند استخدام الجسم المضاد الأولي أحادي النسيلة؟

ما هو الجسم المضاد الثانوي؟
الجسم المضاد الثانوي هو جسم مضاد موجه ضد جزيء آخر من الغلوبولين المناعي (الجسم المضاد). في ظل ظروف المقايسة المناعية المثلى ، يرتبط الجسم المضاد الثانوي المسمى على وجه التحديد بالنوع والفئة (النمط المتماثل) للجسم المضاد الأولي (الاكتشاف غير المباشر). يتم إنتاج وحصاد الجسم المضاد الثانوي من حيوان تم تحصينه بجسم مضاد من نوع آخر. تحدد مواصفات الجسم المضاد المناعي (مثل الأنواع ، والفئة الفرعية ، والشظية ، وما إلى ذلك) خصوصية الجسم المضاد الثانوي المنتج. على سبيل المثال ، يتم إنتاج الجسم المضاد الثانوي IgG (H + L) للماعز عن طريق تحصين الماعز بجزيء IgG الكامل أو سلاسل ثقيلة وخفيفة من جزيء IgG المناعي للفأر (انظر الشكل 1).

الشكل 1. توليد جسم ثانوي

هل توجد فروق بنيوية بين الأجسام المضادة الأولية والثانوية؟
تتشابه الأجسام المضادة الأولية والثانوية في التركيب وتشترك في فئات / فئات فرعية متشابهة. من الناحية الهيكلية ، يكون الجسم المضاد عبارة عن جزيء على شكل Y يتكون من ثلاث مناطق متساوية الحجم. ينضم مفصل مرن إلى ساق الجسم المضاد (Fc) بأذرع الجسم المضاد [F (ab)]. يعمل الذراعين على ربط المستضد ، بينما تحدد منطقة القصبة النمط المتماثل للجسم المضاد والخصائص الوظيفية. يتكون كل ذراع من سلسلة ثقيلة وسلسلة خفيفة واحدة. علاوة على ذلك ، تتكون هذه السلاسل الثقيلة والخفيفة من مجال واحد متغير (VL أو VH) ومجال واحد ثابت (CL أو CH). تختلف المناطق المتغيرة (V) من السلاسل الثقيلة والخفيفة بين الأجسام المضادة وتمنح خصوصية الجسم المضاد لمولد الضد التكميلي. توضح منطقة ساق Fc تباينًا ضئيلًا للغاية ، ولكنها مهمة لتفاعل الجسم المضاد مع جزيئات وخلايا المستجيب (انظر الشكل 2 أ). من حيث التسمية ، يتم تسمية الأجسام المضادة الثانوية وفقًا لمضيفها وتنسيقها وتفاعلها ومستضدها المستهدف وخصوصية وسمها ودرجة تنقيةها (انظر المثال في الشكل 2 ب).

الشكل 2 أ. هيكل الجسم المضاد

الشكل 2 ب. مثال على تسمية الأجسام المضادة الثانوية

الماعز F (ab) المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي [HRP] (قبل كثف)

في هذا المثال ، إليك ما يشير إليه كل مصطلح:

  • الماعز: مضيف الجسم المضاد الثانوي
  • F (ab): تنسيق الجسم المضاد الثانوي
  • الفأر: التفاعلية ، مضيف الجسم المضاد الأساسي
  • مفتش: الهدف ، فئة Ig من الجسم المضاد الأساسي)
  • H + L: الخصوصية ، يتم التعرف على منطقة Ig المستهدفة.
  • HRP: ملصق كشف مترافق مع الجسم المضاد الثانوي.
  • قبل كثف: درجة تنقية الجسم المضاد

ما هي فئات الأجسام المضادة / الفئات الفرعية أو الأنماط المتماثلة؟
يسمح التباين في جزء Fc من السلسلة الثقيلة للجسم المضاد بتقسيم الأجسام المضادة إلى خمس فئات فريدة: IgA و IgD و IgE و IgG و IgM. يُشار إلى السلاسل الثقيلة للفئات الخمس بالحرف اليوناني المقابل: & alpha (Alpha) ، & delta (Delta) ، & epsilon (Epsilon) ، & gamma (Gamma) ، و & mu (Mu) ، على التوالي. علاوة على ذلك ، يمكن تقسيم الأنماط النظيرية IgG و IgA إلى فئات فرعية بسبب مزيد من التباين الثقيل في السلسلة. على عكس السلاسل الثقيلة لجسم مضاد ، فإن السلاسل الخفيفة ، & lambda (lambda) و & kappa (kappa) ، يتم مشاركتها بين جميع الفئات. ومع ذلك ، فمن الملائم ملاحظة أن كل جسم مضاد يمكن أن يكون له سلسلة خفيفة واحدة فقط أو سلسلة ثقيلة ، ولكن ليس كلاهما مطلقًا.

فئات الأجسام المضادة الثانوية والفئات الفرعية

ما هي الفوائد الرئيسية لاستخدام الجسم المضاد الثانوي؟
بالاقتران مع الجسم المضاد الأولي الخاص بالمستضد ، يسمح الجسم المضاد الثانوي باكتشاف تسلسلات الأحماض الأمينية عالية التحديد داخل البروتين المستهدف. ومن ثم ، فإن الجسم المضاد الثانوي يسهل اكتشاف التعبير البروتيني في عينة من الخلايا أو الأنسجة. خصوصية الجسم المضاد الثانوي لمنطقة معينة [على سبيل المثال F (ab)] أو مناطق الجسم المضاد الأولي (مثل Fc) تسمح لأجسام مضادة ثانوية متعددة بالارتباط بجسم مضاد أولي واحد ، مما يؤدي إلى تضخيم الإشارة وزيادة حساسية الفحص. يزيد تضخيم الإشارة الناتج عن قدرة الأجسام المضادة الثانوية المتعددة على الارتباط بجسم مضاد أولي واحد من حساسية الفحص. يوفر استخدام الجسم المضاد الثانوي أيضًا مزيدًا من المرونة في تجربة وضع العلامات المتعددة حيث يتم تقديم الأجسام المضادة الثانوية المتاحة تجاريًا مقترنة مسبقًا بملصقات متنوعة. يعد تضخيم الإشارة وزيادة مرونة الفحص نظرًا لتنوع الأجسام المضادة الثانوية المتاحة تجاريًا ميزتين متميزتين يجب مراعاتهما عند تصميم تجربتك. تعرف على المزيد حول: الفرق بين طرق الاكتشاف المباشرة وغير المباشرة.

ما هو الفرق بين استخدام جسم مضاد أولي مترافق مباشرة مقابل ثانوي مترافق؟
سيسمح لك استخدام جسم مضاد أولي مترافق مباشرة بدلاً من إعداد أساسي / ثانوي قياسي مترافق بتدفق تجربتك وتلطيخ أهداف متعددة في عينة واحدة مع القليل من التداخل في الخلفية أو بدونه. ومع ذلك ، إذا تم التعبير عن البروتين المطلوب بكمية منخفضة في العينة التي يتم فحصها ، فمن الأفضل استخدام ثانوي مترافق. سيوفر الثانوي المقترن تضخيمًا كبيرًا للإشارة لأن العديد من الأجسام المضادة الثانوية يمكن أن ترتبط بجسم أساسي واحد. لاحظ أن الجسم المضاد الثانوي لا يرتبط مباشرة بحلقة البروتين المستهدفة ولا يمنح خصوصية الحاتمة المستهدفة ، والتي يتم تحديدها بواسطة الجسم المضاد الأولي (الشكل 3). يحدد الجسم المضاد الثانوي المسمى طريقة الكشف.

الشكل 3. الكشف المباشر وغير المباشر

ما هي أنواع الأجسام المضادة الثانوية التي يجب أن أستخدمها؟

يجب أن يتم توجيه الجسم المضاد الثانوي ضد نفس الأنواع مثل مضيف الجسم المضاد الأولي المقابل ، ولكن لا يتم رفعه فيها. على سبيل المثال ، يتطلب الجسم المضاد الأساسي للفأر جسمًا مضادًا ثانويًا مضادًا للفأر يتم تربيته في أي نوع آخر غير الفئران (على سبيل المثال ، فأر مضاد للأرانب وماعز مضاد للفأر وما إلى ذلك). كلما كان ذلك ممكنًا ، يجب اشتقاق الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في تجربة وضع العلامات المتعددة من نفس الأنواع المضيفة. ومع ذلك ، يجب أن تثار جميع الأجسام المضادة الأولية في أنواع مضيفة فريدة أو مختلفة. يسمح هذا باستخدام أجسام مضادة ثانوية خاصة بالأنواع موجهة ضد جسم مضاد أولي واحد مما يحد من التفاعل التبادلي بين الجسم المضاد الثانوي والأجسام المضادة الأولية من الأنواع الأخرى.

لتقليل إشارة الخلفية (تلطيخ غير محدد) ، يُنصح بحظر العينات مع مصل من نفس الأنواع المضيفة مثل الجسم المضاد الثانوي. علاوة على ذلك ، للحد من ارتباط الجسم المضاد الثانوي بجسم مضاد أولي يتم تربيته في نوع ذي صلة وثيقة ، استخدم جسمًا مضادًا ثانويًا تم امتصاصه مسبقًا ضد الأنواع ذات الصلة. على سبيل المثال ، قد يتفاعل جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر مع جسم مضاد أولي للفأر في تجربة توسيم متعددة. قد يؤدي استخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر يتم امتصاصه ضد الفئران إلى تقليل التفاعل التبادلي. (الشكل 4).

الشكل 4. مزيج مثالي من الأجسام المضادة لتجربة وضع العلامات المتعددة

كيف أختار جسمًا مضادًا ثانويًا لجسمي المضاد الأساسي؟
تختلف معايير اختيار الجسم المضاد الثانوي اعتمادًا على الجسم المضاد الأساسي الذي تستخدمه. القاعدة العامة هي أنك سترغب في تحديد نوع ثانوي يتطابق مع كل من الأنواع المضيفة والنمط المتماثل للجسم المضاد الأساسي الذي تستخدمه. على سبيل المثال ، إذا كان جسمك الأساسي عبارة عن VEGF مضاد للإنسان مع أنماط متماثلة IgG2a ، يمكن أن يكون الجسم المضاد الثانوي المقترح هو IgG2a الماعز المضاد للفأر المصنف على اقتران من تفضيلك. للحصول على المساعدة في اختيار الأجسام المضادة الثانوية ، خاصةً عندما تتضمن التجارب أجسامًا مضادة ثانوية متعددة ، يمكنك الاتصال بالدعم الفني لشركة Novus Biologicals عبر الهاتف أو البريد الإلكتروني أو الدردشة الحية.

كيف أختار الشكل الصحيح لجسم مضاد ثانوي؟
يشير شكل الجسم المضاد الثانوي إلى بنية الجسم المضاد الثانوي نفسه. يمكن شق الجسم المضاد بالكامل بواسطة البيبسين لإزالة جزء Fc من الجسم المضاد ، مما ينتج عنه جزء من الجسم المضاد F (ab ') 2: ذراعا من الجسم المضاد ومنطقة المفصلة. مزيد من الانقسام للجزء F (ab ') 2 مع β-mercaptoethanol يزيل ذراع واحدة من جزء F (ab') 2 ، مما ينتج عنه جزء F (ab '): ذراع واحد من الجسم المضاد ومنطقة المفصلة. لاحظ أن جزء F (ab ') يختلف هيكليًا عن جزء F (ab): يتكون جزء F (ab) من انشقاق غراء من الغلوبولين المناعي الكامل ويفتقر إلى منطقة المفصلة الموجودة في جزء F (ab') (الشكل 5 ). عند التفكير في جسم مضاد ثانوي ، من المهم عدم الخلط بين التنسيق والخصوصية. ضع في اعتبارك هذا الجسم المضاد الثانوي: Goat F (ab ') 2 Anti-Human IgG F (ab) الأجسام المضادة الثانوية. في هذا المثال ، يتكون الجسم المضاد الثانوي من الجزء F (ab ') 2 (التنسيق) وهو خاص بمنطقة F (ab) من الجسم المضاد الأولي الذي يستهدفه (الخصوصية).

الشكل 5: تنسيقات / أجزاء من الجسم المضاد

متى يجب استخدام الجسم المضاد الثانوي لشظية Fab؟
يمكن لمستقبلات Fc التي يتم التعبير عنها على سطح الخلية لمجموعات الكريات البيض (مثل البلاعم ، والخلايا الليمفاوية B ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، وما إلى ذلك) ربط جزء Fc من الجسم المضاد مما يؤدي إلى زيادة الارتباط غير المحدد (إشارة الخلفية). عندما تكون إشارة الخلفية عالية جدًا ، فقد يؤدي ذلك إلى نتائج إيجابية خاطئة أو سوء تفسير للبيانات. للتعامل مع هذه المشكلة ، يوصى باستخدام الجسم المضاد الثانوي للجزء F (ab) لفحوصات المناعة ، خاصة عند تلطيخ الأنسجة أو الخلايا التي تعبر عن كميات كبيرة من مستقبلات Fc (مثل العقدة الليمفاوية والطحال والدم المحيطي ، إلخ). يؤدي عدم وجود جزء Fc من الجسم المضاد الثانوي في تحضير F (ab) إلى إزالة ارتباط الكاشف الثانوي بمستقبلات Fc المعبر عنها في العينة (انظر الشكل 6).

الشكل 6: عرض توضيحي لجزيء كامل مقابل ارتباط شظية الجسم المضاد في المقايسة المناعية

الجسم المضاد الثانوي Ig الكامل

F (ab ') 2 جزء من الجسم المضاد الثانوي

ما هي التسمية التي يجب أن أختارها لجسم مضاد ثانوي؟
اختيار التسمية يعتمد على التطبيق. تتطلب الاختبارات التي تتطلب كشف الفلورسنت (مثل قياس التدفق الخلوي ، والكيمياء الخلوية المناعية ، والتألق المناعي ، وما إلى ذلك) جسمًا مضادًا ثانويًا مترافقًا مع الفلوروكروم. يجب مراعاة أطياف الإثارة والانبعاثات لكل فلوروكروم عند تصميم كل تجربة. تشمل الفلوروكرومات الشائعة FITC و PE و APC و DyLight & trade AlexaFluor & trade أو Atto dyes. يتطلب الكشف الأنزيمي وجود جسم مضاد ثانوي مترافق مع HRP أو Alkaline Phosphatase (AP) أو biotin. تتيح قدرة أفيدين وستربتافيدين على ربط البيوتين وتشكيل المركب تضخيم الإشارة بشكل مستقل عن الأنواع المضيفة للجسم المضاد الثانوي. نظرًا لأن البيروكسيداز اقتصادي وأكثر ثباتًا من AP ، فإن HRP أكثر شيوعًا لأنظمة الكشف الكيميائي. ومع ذلك ، فإن الحساسية المعززة لـ AP مقارنة بـ HRP تجعل AP أكثر شيوعًا في فحوصات الكشف اللوني. تعرف على المزيد على: الأجسام المضادة المقترنة

ما فئة الغلوبولين المناعي أو الفئة الفرعية التي يجب أن أستخدمها للجسم المضاد الأساسي؟
يجب توجيه الجسم المضاد الثانوي ضد فئة أو فئة فرعية من الجسم المضاد الأساسي. على سبيل المثال ، يتطلب الجسم المضاد الأولي IgM للفأر جسمًا مضادًا ثانويًا IgM مضادًا للفأر. في بعض الأحيان ، قد يوصى بفئة فرعية محددة (مثل IgG2 البشري ، IgG1). في هذه الحالة ، يمكن استخدام جسم مضاد ثانوي موجه ضد الفئة الأكثر عمومية (أي مضاد IgG البشري) في تجارب وضع العلامات الفردية ، حيث إن معظم الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالفئة ستتعرف على الفئات الفرعية الفردية. ومع ذلك ، يجب استخدام الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالفئة الفرعية للتمييز بين الأجسام المضادة الأولية في تجارب الوسم المتعددة عند استخدام أكثر من جسم مضاد أولي خاص بفئة فرعية. على سبيل المثال ، تتطلب تجربة التلوين المتعدد باستخدام الأجسام المضادة الأولية IgG2 و IgG1 أجسامًا مضادة ثانوية مضادة لـ IgG2 ومضادة لـ IgG1. عند استخدام جسم مضاد أولي متعدد النسيلة ، يوصى باستخدام مضاد IgG ثانوي نظرًا لأن معظم الأجسام المضادة متعددة النسيلة هي غلوبولين مناعي من فئة IgG.

ما هو ما قبل الامتزاز؟
الامتزاز المسبق هو طريقة لزيادة خصوصية الجسم المضاد الثانوي وتقليل الارتباط غير النوعي عن طريق تمرير جسم مضاد عبر عمود يحتوي على بروتينات مصل معطلة أو غلوبولين مناعي من أنواع متصالبة محتملة. ترتبط الأجسام المضادة التفاعلية بالبروتينات المعطلة ، بينما تتدفق الأجسام المضادة غير التفاعلية من خلالها (انظر الشكل 7).

الشكل 7: عملية ما قبل الامتزاز موضحة

ما هي ميزة استخدام الجسم المضاد الثانوي الذي تم امتصاصه مسبقًا؟
لمنع الارتباط غير المحدد ، يوصى باستخدام جسم مضاد ثانوي تم امتصاصه مسبقًا عند تحديد تعبير البروتين في تجارب وضع العلامات المتعددة أو عند تلطيخ الأنسجة أو الخلايا الغنية بالجلوبيولين المناعي. سيؤدي استخدام الجسم المضاد الثانوي الذي تم امتصاصه مسبقًا ضد أنواع العينة التي يتم فحصها (مثل الفئران والجرذان والخنازير وما إلى ذلك) إلى تقليل الارتباط غير المحدد للجسم المضاد الثانوي بالعينة. على سبيل المثال ، عند تلطيخ أنسجة الفأر ، يوصى باستخدام جسم مضاد ثانوي ممتز ضد الغلوبولين المناعي للفأر أو مصل كامل لأنه لن يرتبط بالجلوبيولينات المناعية الذاتية في قسم أنسجة الفأر.

كيف يتم إنتاج الأجسام المضادة المنقاة من التقارب؟
نظرًا للتماثل العالي لبنية الجسم المضاد بين الفئات ، فمن المستحسن تنقية تقارب الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالفئة لتقليل التفاعل التبادلي بين الفئات. لإنتاج الأجسام المضادة الثانوية المنقاة IgG المضادة للأرانب ، يتم تمرير IgG المضاد للأرنب فوق عمود يحتوي على أرنب ثابت IgG. يتم بعد ذلك تمرير الأجسام المضادة IgG المعزولة من خلال عمود إضافي (امتزاز متقاطع) يحتوي على بروتينات الأرانب IgA و IgD و IgE و IgM. هذا يلغي تفاعل الأجسام المضادة المتصالبة مع نظائر غير IgG (أي IgA و IgD و IgE و IgM). يجب أن يُظهر الجسم المضاد الثانوي IgG المنقى والممتاز للأرنب الناتج عن تقارب مولد الضد الحد الأدنى من التفاعل مع فئات الأجسام المضادة بخلاف IgG.

هل يجب أن أستخدم جسمًا مضادًا منقى تقارب مستضد أو جزء كامل من الغلوبولين المناعي؟
تحتوي كسور الغلوبولين المناعي الكاملة غير المنقاة على المجموعة الكاملة من الأجسام المضادة. يمكن أن تكون الكسور الكاملة (التي يتم الحصول عليها عادةً عن طريق تنقية البروتين أ) عبارة عن تقارب إضافي للمستضد يتم تنقيته لإزالة الفئات الفرعية للأجسام المضادة أو الأجسام المضادة غير المحددة لمولد الضد من العينة. تضمن الأجسام المضادة الثانوية المنقاة ذات تقارب المستضد ارتباطًا أقل غير محدد وإشارة خلفية أقل بالنسبة إلى كسور IgG الكاملة. ومع ذلك ، يمكن لعملية التنقية القضاء على الأجسام المضادة عالية التقارب بسبب التقارب القوي لبعض الأجسام المضادة لمصفوفة الربط. لذلك ، غالبًا ما يوصى باستخدام جزء IgG للأهداف ذات الوفرة المنخفضة.

هل يجب أن أستخدم الأجسام المضادة الثانوية التي أثيرت في نفس النوع في تجربة وضع العلامات المتعددة؟
نعم ، إن أمكن ، يجب دائمًا استخدام الأجسام المضادة الثانوية التي تربى في نفس النوع في تجارب وضع العلامات المتعددة. يتطلب إنشاء بيانات دقيقة في تجارب وضع العلامات المزدوجة أو المتعددة أن يتعرف كل جسم مضاد ثانوي بشكل خاص على جسم مضاد أولي واحد. بالإضافة إلى التفاعل المتبادل مع الأجسام المضادة الأولية ، يمكن أن يرتبط الجسم المضاد الثانوي بالأجسام المضادة الثانوية الأخرى أو الغلوبولين المناعي الداخلي المعبر عنه في العينة قيد الفحص. يعد الحد من ردود الفعل هذه أمرًا أساسيًا لإنتاج بيانات دقيقة ، خاصة في تطبيقات ICC / IF و IHC.

متى أحتاج إلى استخدام الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالجزء ، مثل Fc و F (ab) و F (ab ') 2؟
يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالجزء عندما يتكون الجسم المضاد الأولي الذي تحاول اكتشافه من جزء معين فقط أو عندما تحاول اكتشاف هذا الجزء المحدد فقط من مجموعة من جزيئات الغلوبولين المناعي المتعددة. يمكن أن يكون مفيدًا أيضًا عندما يكون جسم مضاد قيد الدراسة به منطقة Fc أو F (ab) مكشوفة ، بسبب الارتباط المحدد لذلك الأساسي.

هل يجب علي استخدام الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بـ Fab عند استخدام الجسم المضاد الأساسي للفأر على أنسجة الفأر؟
قد تساعد الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بـ F (ab) في تقليل إشارة الخلفية عن طريق إزالة الارتباط غير المحدد لبروتينات IgG الموجودة في الأنسجة بواسطة الجسم المضاد الثانوي. سترغب في التأكد من أن الجسم المضاد الأساسي الذي ستكتشفه سيكون به منطقة F (ab) مكشوفة للكشف عنها بواسطة المرحلة الثانوية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد ترغب في التفكير في استخدام كاشف مانع لحظر الماوس على الماوس أو IgG غير مقترن مضاد للفأر ثانوي قبل الحضانة الأولية كطرق بديلة لتقليل إشارة الخلفية.

أنا أستخدم مجموعة أدوات الكشف القائمة على البوليمر بدلاً من الجسم المضاد الثانوي القياسي. أنا أحصل على بعض الخلفية العالية. هل لديك توصية للمساعدة في تحسين تلطيبي؟
قد لا تكون خطوة حجب المصل مطلوبة عند استخدام ثانوي قائم على البوليمر ولكن إذا كنت تواجه مشكلات في الخلفية ، فقد يتم استخدام حجب 5٪ من مصل الماعز. ما زلنا نوصي بتنفيذ خطوة حجب البيروكسيداز أيضًا إذا كان البوليمر يستخدم طريقة الكشف عن البيروكسيداز.

هل سيؤثر اقتران جسم مضاد أولي مع البيوتين على تقاربه مع جسم مضاد ثانوي؟
إذا كنت تستخدم وصول ضرس منخفض / تركيز البيوتين لتفاعل الاقتران ، فلا ينبغي أن يكون هناك تأثير على تقارب الجسم المضاد الثانوي. أيضًا ، فإن غالبية الأجسام المضادة الثانوية متعددة النسيلة بطبيعتها ويمكن أن تربط أكثر من حاتمة واحدة على الأجسام المضادة الأولية.

في المدونة الغربية ، هل يمكنني استخدام BSA-TBST كمادة مانعة ومخففة للأجسام المضادة للفوسفور ثم حليب 5٪ لتخفيف واحتضان الأجسام المضادة الثانوية؟
يعد الحصول على لطخة نظيفة للأجسام المضادة المحددة للفوسفو مع عازل قائم على الحليب / محلول تخفيف الأجسام المضادة تحديًا يواجهه معظم الباحثين في تجاربهم. يعتمد توافق الجسم المضاد للفوسفو مع المخفف المعتمد على الحليب على مدى قوة ارتباط الجسم المضاد للفوسفو بالبروتين محل الاهتمام أو ما إذا كان يمكن عزله بواسطة بروتينات الفوسفو من الحليب. يُنصح باستخدام مانع أو عازل مخفف يعتمد على مصل الأبقار (BSA) أكثر من 5٪ من الحليب لمعظم الأهداف.

لماذا أحصل على بقع في تلطيخ التألق المناعي؟
عند استخدامها بتركيز أعلى / تخفيف منخفض ، تظهر بعض الأجسام المضادة ميلًا لتشكيل مجاميع ينتج عنها إشارة مرقطة في فحوصات المناعة. يمكن إزالة الركام من مخزون الجسم المضاد عن طريق الطرد المركزي لقنينة الجسم المضاد بسرعة عالية لمدة 5-10 دقائق متبوعًا بالمصاص الدقيق للخروج من محلول المادة الطافية / الجسم المضاد دون لمس قاع القارورة. مصدر آخر لتلطيخ الأرقط هو استخدام الشرائح و / أو الأغطية غير النظيفة. إذا اشتبه في وجود جسيمات على الشرائح أو زلات البرسيم ، تحقق مرة أخرى من خلال مراقبتها تحت المجهر. يمكن تنظيف الشرائح باستخدام مناديل ورقية وكحول مطلقة أو قطعة قطن.

ما التخفيف الذي يجب أن أستخدمه في طلبي؟
سيختلف هذا حسب المنتج. يمكنك العثور على نطاق التخفيف الموصى به ضمن قسم "التطبيقات / التخفيفات" في ورقة بيانات المنتج (انظر أدناه للحصول على مثال).

رجوع إلى الأسئلة

لدي بعض بقايا الأجسام المضادة الثانوية التي تم تخفيفها في حليب 5٪. كم من الوقت يمكنني التخزين قبل أن يفقد نشاطه؟
يمكن أن يختلف العمر الافتراضي للأجسام المضادة الثانوية المخففة بشكل كبير اعتمادًا على عدد الاستخدامات ودرجة حرارة التخزين وعمر مخازن التخزين وعوامل المعالجة الأخرى. نوصي بالحفاظ على الجزء الأكبر من الجسم المضاد الثانوي في قنينة أصلية ، وإزالة ما يكفي من المواد للاستخدام الفردي فقط. إذا قررت تخزين المرحلة الثانوية المخففة مسبقًا ، فقد تحتاج إلى إجراء اختبارات ثبات الجسم المضاد الثانوي مع الانتخابات التمهيدية الخاصة بك لإنشاء جدول زمني للعمل لاحتياجاتك. بينما نقدم ضمانًا بنسبة 100٪ على منتجاتنا عند تخزينها بشكل صحيح ، فإن تخزين الجسم المضاد في مادة مخففة للأجسام المضادة ليس ما نوصي به.


تنقية تقارب خاص بالفئة من الأجسام المضادة

نظرًا لأن الأجسام المضادة لها بنية شاملة محفوظة تطوريًا ، بما في ذلك المجالات الثابتة نسبيًا ، وتتضمن وظيفتها الأصلية الارتباط والدفاع ضد مسببات الأمراض ، فليس من المستغرب أن تكون بعض البكتيريا المسببة للأمراض قد طورت بروتينات لها وظائف محددة مرتبطة بالأجسام المضادة. تم التعرف على العديد من هذه البروتينات المرتبطة بالجلوبيولين المناعي وعزلها من أنواع معينة من البكتيريا. بالطريقة نفسها التي تفيد بها الوظائف الأصلية للأجسام المضادة كمجسات خاصة بالهدف لأبحاث البروتين ، فإن هذه البروتينات الأصلية المضادة لـ Ig مفيدة أيضًا باعتبارها روابط تقارب لتنقية الجسم المضاد.

حدد المنتجات

روابط البروتين A و G و L المرتبطة بالأجسام المضادة

البروتين A والبروتين G والبروتين L عبارة عن ثلاثة بروتينات بكتيرية تتميز خصائص الارتباط بالأجسام المضادة بشكل جيد. تم إنتاج هذه البروتينات بشكل متجانس وتستخدم بشكل روتيني لتنقية التقارب لأنواع الأجسام المضادة الرئيسية من مجموعة متنوعة من الأنواع. تحتوي معظم الأشكال المؤتلفة والمتاحة تجاريًا من هذه البروتينات على تسلسلات غير ضرورية تمت إزالتها (بما في ذلك مجال ربط HSA من البروتين G) وبالتالي فهي أصغر من نظيراتها الأصلية. يتوفر أيضًا على نطاق واسع شكل مؤتلف معدل وراثيًا من البروتين A والبروتين G ، يسمى بروتين A / G. يتم استخدام جميع البروتينات الأربعة المؤتلفة المرتبطة بالـ Ig بشكل روتيني من قبل الباحثين في العديد من تطبيقات الكشف المناعي والانجذاب المناعي.

مصادر وخصائص بروتينات Ig الرابطة الأصلية. يتم جمع المعلومات الواردة في هذا الجدول من مصادر مختلفة. راجع صفحات "اعرف المزيد" ذات الصلة للمراجع والتفاصيل حول الأشكال المؤتلفة المستخدمة لتطبيقات الانجذاب المناعي.
بروتين أ (سبا)بروتين جي (اس بي جي)بروتين L (SpL)
صنفالمكورات العنقودية
المذهبة
العقدية النيابة.
(المجموعة C و G)
Peptostreptococcus magnus
بشر
علم الأمراض
مكون من فلورا جسم الإنسان يسبب التهابات "العنقوديات"الأصل. معزولة عن مرضى التهاب البلعوم (اللوزتين أو الدم)البكتيريا المتعايشة و / أو المسببة للأمراض اللاهوائية موجبة الجرام
محلي
الحجم (الأحجام)
40 إلى 60 كيلو دالتون
(عدد متغير من المجالات المتكررة)
40 إلى 65 كيلو دالتون
(عدد متغير من المجالات المتكررة)
76 كيلو دالتون
المجالات الملزمة5 لـ IgG (الشكل الأكثر شيوعًا)1 إلى 2 لـ IgG
0 إلى 2 لـ HSA
5 لـ Ig
هدف ملزم Igالمنطقة الثابتة ذات السلسلة الثقيلة (Fc) من IgG (منطقة CH2-CH3)سلسلة ثقيلة. المنطقة (Fc) من IgG (منطقة CH2-CH3)سلاسل كابا الخفيفة من Igs (VL-kappa)

مواقع ربط البروتينات المرتبطة بالأجسام المضادة. تُظهر البروتينات المستخدمة لشل حركة الأجسام المضادة لدعم الخرز خصوصية لمجالات الأجسام المضادة المختلفة. يرتبط البروتين A و G بالسلاسل الثقيلة لمنطقة الجسم المضاد Fc ، بينما يرتبط البروتين L بشكل خاص بالسلاسل الخفيفة لمنطقتين Fab من جزء الجسم المضاد F (ab ') 2. † يمكن للبروتين G أيضًا ربط شظايا Fab في ظروف معينة.

يتعلم أكثر

تنقية الجسم المضاد بالبروتين A و G و L.

لإنجاز تنقية الجسم المضاد باستخدام البروتين A أو البروتين G أو البروتين A / G أو البروتين L ، يتم تثبيتها تساهميًا في راتنجات مسامية (مثل الأغاروز المُخرَّز) أو خرز مغناطيسي. نظرًا لأن هذه البروتينات تحتوي على العديد من مجالات ربط الأجسام المضادة ، فإن كل جزيء مُثبت تقريبًا ، بغض النظر عن اتجاهه ، يحافظ على مجال ربط وظيفي واحد على الأقل وبدون عوائق. علاوة على ذلك ، نظرًا لأن البروتينات ترتبط بالأجسام المضادة في مواقع أخرى غير مجال ربط مولد الضد ، يمكن استخدام الأشكال المعطلة من هذه البروتينات في مخططات التنقية ، مثل الترسيب المناعي ، حيث يتم استخدام بروتين ربط الجسم المضاد لتنقية مستضد من عينة بواسطة ربط الجسم المضاد أثناء ارتباطه بمولد الضد الخاص به.

يحتوي البروتين A و G و A / G و L على خصائص ارتباط مختلفة ، مما يجعل كل منها مناسبًا لأنواع مختلفة من أهداف الجسم المضاد (على سبيل المثال ، فئة الأجسام المضادة الفرعية أو الأنواع الحيوانية). من المهم إدراك أن استخدام البروتين A أو G أو L ينتج عنه تنقية الغلوبولين المناعي العام من عينة خام. اعتمادًا على مصدر العينة ، قد يمثل الجسم المضاد النوعي للمستضد جزءًا صغيرًا فقط من إجمالي الغلوبولين المناعي في العينة. على سبيل المثال ، بشكل عام فقط 2-5٪ من إجمالي IgG في مصل الفئران يكون مخصصًا للمستضد المستخدم لتحصين الحيوان.

باستخدام عمود من راتينج البروتين أ الاغاروز ومصل الأرانب كمثال ، يكون الإجراء العام لتنقية الأجسام المضادة باستخدام هذه الروابط كما يلي:


شاهد الفيديو: LANAC BMW N47 UHVATILA CORONA (كانون الثاني 2022).