معلومة

9.1: عزل الحمض النووي ، التسلسل ، والتوليف - علم الأحياء


5.1 عزل الحمض النووي ، والتسلسل ، والتوليف

الحمض النووي الجيني مقابل الحمض النووي المجاني

حمض الجينوم deoxyribonucleic هو DNA الكروموسومي ، على عكس الحمض النووي خارج الكروموسومات مثل ذلك الموجود في الميتوكوندريا للثدييات أو الهياكل البلازميدية في البكتيريا (الشكل 5.1). ثم يتم اختصارها أيضًا باسم جدنا. تمتلك معظم الكائنات الحية نفس الحمض النووي الجيني في كل خلية. ومع ذلك ، تنشط جينات معينة فقط في كل خلية للسماح بوظيفة الخلية والتمايز داخل الجسم.

إن جينوم الكائن الحي (المشفر بواسطة الحمض النووي الجيني) هو المعلومات (البيولوجية) للوراثة التي تنتقل من جيل من الكائنات الحية إلى الجيل التالي. يتم نسخ هذا الجينوم لإنتاج أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي ، والتي تعتبر ضرورية لوظيفة الكائن الحي. يتم نسخ السلائف mRNA (pre-mRNA) بواسطة RNA polymerase II في النواة. ثم تتم معالجة pre-mRNA عن طريق التضفير لإزالة الإنترونات ، تاركًا exons في الرسول الناضج RNA (mRNA). تتضمن المعالجة الإضافية إضافة غطاء 5 'وذيل بولي (A) إلى pre-mRNA. يمكن بعد ذلك نقل الرنا المرسال الناضج إلى العصارة الخلوية وترجمته بواسطة الريبوسوم إلى بروتين. تشمل الأنواع الأخرى من الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبوزي (الرنا الريباسي) ونقل الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي). يتم نسخ هذه الأنواع بواسطة RNA polymerase II و RNA polymerase III ، على التوالي ، وهي ضرورية لتخليق البروتين. ومع ذلك ، فإن الرنا الريباسي 5s هو الرنا الريباسي الوحيد الذي يتم نسخه بواسطة RNA Polymerase III.

في علم الوراثة ، الحمض النووي التكميلي (كدنا) هو DNA مركب من الحمض النووي الريبي أحادي الخيط (على سبيل المثال ، قالب RNA الرسول (mRNA) أو microRNA) في تفاعل محفز بواسطة النسخ العكسي للإنزيم (الشكل 5.1). إن إنزيم النسخ العكسي هو إنزيم موجود في الفيروسات القهقرية مثل فيروس نقص المناعة البشرية الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي كمادة وراثية أساسية. عند دخول الخلية المضيفة ، يتم نسخ الحمض النووي الريبي بشكل عكسي لإنتاج نسخة من الحمض النووي الريبي (cDNA) التي يمكن أن تندمج بعد ذلك في الحمض النووي الجيني للمضيف. في التكنولوجيا الحيوية ، غالبًا ما يتم استخدام النسخ العكسي لإنشاء cDNA من mRNA المعبر عنه في خلايا أو أنسجة معينة. بهذه الطريقة ، يمكن استنساخ جينات حقيقيات النوى بدون أي إنترونات موجودة في الهيكل. هذا مفيد بشكل خاص إذا كان الهدف هو التعبير عن البروتين في مضيف بدائي النواة (بكتيري). تذكر أن الحمض النووي البكتيري لا يحتوي على أي تسلسلات intron داخل الحمض النووي الصبغي. وبالتالي ، إذا كنت تستخدم نظامًا بدائية النواة للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة ، فيجب عليك استخدام cDNA ، لأن النظام بدائيات النواة لن يكون قادرًا على إزالة تسلسلات intron بعد النسخ الجيني.

المصطلح كدنا يستخدم أيضًا ، عادةً في سياق المعلوماتية الحيوية ، للإشارة إلى تسلسل نسخة mRNA ، معبرًا عنه كقواعد DNA (GCAT) بدلاً من قواعد RNA (GCAU).

  • مشتق cDNA من mRNA ، لذلك فهو يحتوي على exons فقط ولكن لا يحتوي على إنترونات.

الشكل 5.1. الحمض النووي الجيني (جدنا) مقابل الحمض النووي التكميلي (كدنا). يوضح الرسم البياني الأيسر معالجة الحمض النووي الجيني داخل الخلية لإنتاج بروتين (اللوحة الزرقاء العلوية يوضح العناصر الهيكلية المشتركة للجينات حقيقية النواة. تنتج عملية النسخ الجيني جزيء مرسال RNA (mRNA) يجب تعديله بعد الترجمة ، لوحة رمادية ، لإزالة تسلسلات intron غير المشفرة وإضافة المقاطع 5'-CAP و Poly-A-Tail. يتم نقل mRNA الناضج من النواة إلى السيتوبلازم حيث يتم ترجمته بواسطة الريبوسوم إلى تسلسل البروتين ، لوحة حمراء.) يوضح الرسم البياني الأيمن أنه يمكن استخدام عزل mRNA من خلية لتوليف cDNA باستخدام إنزيم النسخ العكسي. يحتوي cDNA الناتج فقط على عناصر من mRNA الناضج ، بما في ذلك exons و poly-a tail.

تم تعديل الصورة من ويكيبيديا


تقنيات عزل الحمض النووي

عزل الحمض النووي هي عملية تنقية الحمض النووي من العينة باستخدام مجموعة من الطرق الفيزيائية والكيميائية. تم إجراء أول عزل للحمض النووي في عام 1869 بواسطة فريدريش ميشر. وهو حاليًا إجراء روتيني في البيولوجيا الجزيئية أو تحليلات الطب الشرعي. بالنسبة للطريقة الكيميائية ، هناك العديد من المجموعات المختلفة المستخدمة في الاستخراج ، واختيار المجموعة الصحيحة سيوفر الوقت في إجراءات الاستخراج والتحسين. يعتبر اكتشاف حساسية PCR لإظهار التباين بين المجموعات التجارية.

هناك ثلاث تقنيات قياسية لتنقية الحمض النووي موصوفة أدناه:

  • يجب جمع الخلايا المراد دراستها.
  • كسر أغشية الخلايا لفضح الحمض النووي مع السيتوبلازم داخل (تحلل الخلية).
    • يتم تكسير الدهون من غشاء الخلية والنواة بالمنظفات والمواد الخافضة للتوتر السطحي.
    • تكسير البروتينات بإضافة البروتياز (اختياري).
    • كسر الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة RNase (اختياري).
  • يتم معالجة المحلول بمحلول ملحي مركز (محلول ملحي) لجعل الحطام مثل البروتينات المكسورة والدهون والحمض النووي الريبي تتجمع معًا.
  • الطرد المركزي للمحلول ، الذي يفصل الحطام الخلوي المتكتل عن الحمض النووي.
  • تنقية الحمض النووي من المنظفات والبروتينات والأملاح والكواشف المستخدمة أثناء خطوة تحلل الخلية. الإجراءات الأكثر شيوعًا هي:
    1. ترسيب الإيثانول عادة عن طريق الإيثانول المثلج أو الأيزوبروبانول. نظرًا لأن الحمض النووي غير قابل للذوبان في هذه الكحوليات ، فسوف يتجمع معًا ، مما يعطي حبيبات مضغوطة عند الطرد المركزي. يتم تحسين ترسيب الحمض النووي عن طريق زيادة القوة الأيونية ، عادة عن طريق إضافة أسيتات الصوديوم.
    2. استخراج الفينول والكلوروفورم حيث يفسد الفينول البروتينات في العينة. بعد الطرد المركزي للعينة ، تبقى البروتينات الممسوحة في الطور العضوي بينما يتم خلط الطور المائي الذي يحتوي على حمض نووي مع الكلوروفورم الذي يزيل بقايا الفينول من المحلول.
    3. تنقية العمود الصغير هذا يعتمد على حقيقة أن الأحماض النووية قد ترتبط (الامتزاز) بالمرحلة الصلبة (السيليكا أو غيرها) اعتمادًا على الرقم الهيدروجيني وتركيز الملح في المخزن المؤقت (الشكل 5.2).

يمكن إزالة البروتينات الخلوية والهيستون المرتبطة بالحمض النووي إما عن طريق إضافة البروتياز أو عن طريق ترسيب البروتينات مع أسيتات الصوديوم أو الأمونيوم ، أو استخلاصها بمزيج الفينول وكلوروفورم قبل ترسيب الحمض النووي.

بعد العزل ، يتم إذابة الحمض النووي في محلول قلوي قليل ، عادة في محلول Tris-EDTA ، أو في ماء نقي للغاية. غالبًا ما يتم إجراء التعديلات التي يتم إجراؤها على هذه التقنيات القياسية إذا كان من الصعب تحطيم الأنسجة المستخدمة ، أو إذا استمرت الملوثات في محلول التحلل التي تمنع المزيد من التفاعلات ، أو إذا كانت العينة ضئيلة للغاية ، كما هو الحال في كثير من الأحيان في تحقيقات الطب الشرعي. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم تصميم مجموعات تجارية مختلفة لعزل الحمض النووي الجيني الأكبر أو DNA البلازميد الأصغر.

الشكل 5.2 عمود تدور السيليكا المستخدم لتنقية الحمض النووي. تنقية الأحماض النووية القائمة على عمود الدوران هي طريقة استخراج المرحلة الصلبة لتنقية الأحماض النووية بسرعة. تعتمد هذه الطريقة على حقيقة أن الحمض النووي سيرتبط بالطور الصلب للسيليكا في ظل ظروف معينة ثم يتم إطلاقه عند تغيير تلك الظروف. للربط ، يضاف محلول عازل إلى محلول الحمض النووي مع الإيثانول أو الأيزوبروبانول. هذا يشكل الحل الملزم. يتم نقل محلول الربط إلى عمود دوران ويوضع العمود في جهاز طرد مركزي. يفرض جهاز الطرد المركزي محلول الربط من خلال غشاء هلام السيليكا الموجود داخل عمود الدوران. إذا كان تركيز الأس الهيدروجيني والملح في محلول الربط مثاليًا ، فإن الحمض النووي سيرتبط بغشاء هلام السيليكا أثناء مرور المحلول من خلاله. لغسل المكونات الخلوية غير المحددة من العمود ، تتم إزالة التدفق من خلال وإضافة مخزن مؤقت للغسيل إلى العمود. يتم وضع العمود في جهاز طرد مركزي مرة أخرى ، مما يجبر عازلة الغسيل عبر الغشاء. هذا يزيل أي شوائب متبقية من الغشاء ، تاركًا الحمض النووي فقط مرتبط بجل السيليكا. للتخلص ، تتم إزالة المخزن المؤقت للغسيل وإضافة محلول شطف منخفض الملح (أو ببساطة الماء) إلى العمود. يتم وضع العمود في جهاز طرد مركزي مرة أخرى ، مما يجبر المخزن المؤقت للشطف عبر الغشاء. يقوم محلول الشطف بإزاحة الحمض النووي من العمود مما يسمح بجمعه في التدفق خلاله. على عكس الحمض النووي الريبي الذي يتحلل بسرعة كبيرة ، فإن الحمض النووي مستقر تمامًا ويمكن تخزينه لفترات طويلة من الوقت عند -20اج.

الصورة بواسطة سكويدونيوس

العودة إلى الصدارة


تقنيات تسلسل الحمض النووي

تسلسل الحمض النووي هي عملية تحديد تسلسل الحمض النووي - ترتيب النيوكليوتيدات في الحمض النووي. يتضمن أي طريقة أو تقنية تُستخدم لتحديد ترتيب القواعد الأربعة: الأدينين ، والجوانين ، والسيتوزين ، والثايمين. أدى ظهور طرق تسلسل الحمض النووي السريع إلى تسريع البحث والاكتشاف البيولوجي والطبي بشكل كبير.

أصبحت معرفة تسلسل الحمض النووي لا غنى عنها للبحث البيولوجي الأساسي ، وفي العديد من المجالات التطبيقية مثل التشخيص الطبي والتكنولوجيا الحيوية وعلم الأحياء الشرعي وعلم الفيروسات والنظاميات البيولوجية. يمكن لمقارنة تسلسل الحمض النووي الصحي والمتحور تشخيص الأمراض المختلفة بما في ذلك السرطانات المختلفة ، وتمييز ذخيرة الأجسام المضادة ، ويمكن استخدامها لتوجيه علاج المريض. إن وجود طريقة سريعة لتسلسل الحمض النووي يسمح بتقديم رعاية طبية أسرع وأكثر تخصيصًا ، وللتعرف على المزيد من الكائنات الحية وفهرستها.

كانت السرعة السريعة للتسلسل التي تم تحقيقها باستخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الحديثة مفيدة في تسلسل تسلسل الحمض النووي الكامل ، أو الجينوم ، لأنواع وأنواع عديدة من الحياة ، بما في ذلك الجينوم البشري وتسلسلات الحمض النووي الكاملة الأخرى للعديد من الحيوانات والنباتات والميكروبات. محيط.

تم الحصول على تسلسلات الحمض النووي الأولى في أوائل السبعينيات من قبل باحثين أكاديميين باستخدام أساليب شاقة تعتمد على كروماتوغرافيا ثنائية الأبعاد. بعد تطوير طرق التسلسل المستندة إلى الفلورة باستخدام مُسلسِل الحمض النووي ، أصبح تسلسل الحمض النووي أسهل وأسرع من حيث الحجم.

يتكون التركيب القانوني للحمض النووي من أربع قواعد: الثايمين (T) والأدينين (A) والسيتوزين (C) والجوانين (G). تسلسل الحمض النووي هو تحديد الترتيب المادي لهذه القواعد في جزيء الحمض النووي. ومع ذلك ، غالبًا ما يتم تعديل قواعد الحمض النووي بواسطة عمليات الوراثة اللاجينية للتحكم في التعبير الجيني. وهكذا ، فإن العديد من القواعد المعدلة الأخرى التي قد تكون موجودة في جزيء DNA غير القواعد الأربعة القياسية. على سبيل المثال ، في بعض الفيروسات (على وجه التحديد ، العاثية) ، يمكن استبدال السيتوزين بهيدروكسي ميثيل أو هيدروكسي ميثيل جلوكوز سيتوزين. في الحمض النووي حقيقيات النوى ، يمكن العثور على قواعد متغيرة مع مجموعات الميثيل أو الفوسفوسلفات (الشكل 5.3). اعتمادًا على تقنية التسلسل ، قد يتم أو لا يتم اكتشاف تعديل معين ، على سبيل المثال ، 5mC (5 -methylcytosine) الشائع في البشر.

الشكل 5.3 تعديلات الحمض النووي مع الوظائف التنظيمية اللاجينية وترابطها. يتم ميثلة السيتوزين (C) إلى 5-ميثيل سيتوزين (5mC) بواسطة DNA methyltransferases (DNMT) ثم يتأكسد إلى 5hmC و 5fC و 5caC بواسطة Tet dioxygenases. يتم إنتاج 5-Hydroxyuracil (5hmU) عن طريق أكسدة الثايمين (T) المحفزة بـ Tet. من المحتمل أن يتم تحفيز N6-methyladenine (6mA) بواسطة DNA N6 adenine methyltransferases (DAMT-1 in C. ايليجانس) ، على الرغم من أن النشاط الكيميائي الحيوي لهذه الإنزيمات لا يزال يتعين وصفه. تم إثبات أن إنزيمات ALKB التي تشبه Tet NMAD (N6-methyl adenine demethylase 1) و DMAD (DNA 6mA demethylase) متورطة في إزالة الميثيل 6mA في C. ايليجانس و في ذبابة الفاكهة، على التوالي ، ربما باستخدام آلية ديوكسجيناز محفوظة.

الصورة بواسطة بريلينج وليكو (2015) علم التخلق والكروماتين 8:24


  • طرق تسلسل الحمض النووي المبكر

تضمنت الطريقة الأولى لتحديد تسلسل الحمض النووي استراتيجية تمديد التمهيدي الخاصة بالموقع والتي وضعها راي وو في جامعة كورنيل في عام 1970. تم استخدام تحفيز بوليميراز الحمض النووي ووسم النوكليوتيدات المحدد ، وكلاهما يظهر بشكل بارز في مخططات التسلسل الحالية ، لتسلسل النهايات المتماسكة من DNA phage lambda. بين عامي 1970 و 1973 ، أوضح Wu و R Padmanabhan وزملاؤه أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد أي تسلسل DNA باستخدام بادئات اصطناعية خاصة بالموقع. تبنى فريدريك سانجر بعد ذلك استراتيجية التمديد التمهيدي هذه لتطوير طرق أكثر سرعة لتسلسل الحمض النووي في مركز MRC ، كامبريدج ، المملكة المتحدة ونشر طريقة "لتسلسل الحمض النووي مع مثبطات إنهاء السلسلة" في عام 1977. كما طور والتر جيلبرت وألان ماكسام في جامعة هارفارد طرق التسلسل ، بما في ذلك طريقة "تسلسل الحمض النووي بالتحلل الكيميائي". في عام 1973 ، أبلغ جيلبرت وماكسام عن تسلسل 24 زوجًا أساسيًا باستخدام طريقة تُعرف باسم تحليل بقعة التجوال. تم تعزيز التقدم في التسلسل من خلال التطوير المتزامن لتقنية الحمض النووي المؤتلف ، مما سمح بعزل عينات الحمض النووي من مصادر أخرى غير الفيروسات.

تسلسل ماكسام جيلبرت يتطلب وضع العلامات المشعة في نهاية واحدة 5 'من الحمض النووي وتنقية جزء الحمض النووي ليتم تسلسلها. تولد المعالجة الكيميائية بعد ذلك فواصل عند نسبة صغيرة من قاعدة أو اثنتين من قواعد النوكليوتيدات الأربعة في كل تفاعل من التفاعلات الأربعة (G ، A + G ، C ، C + T). يتم التحكم في تركيز المواد الكيميائية المعدلة لإدخال تعديل واحد في المتوسط ​​لكل جزيء DNA. وهكذا يتم إنشاء سلسلة من الأجزاء ذات العلامات ، من النهاية ذات العلامات الإشعاعية إلى موقع "القطع" الأول في كل جزيء. يتم فصل الشظايا في التفاعلات الأربعة جنبًا إلى جنب في تغيير طبيعة المواد الهلامية من مادة الأكريلاميد لفصل الحجم. لتصور الأجزاء ، يتم تعريض الهلام لفيلم الأشعة السينية للتصوير الشعاعي الذاتي ، مما ينتج عنه سلسلة من النطاقات المظلمة ، كل منها يتوافق مع جزء DNA المسمى إشعاعيًا ، والذي يمكن استنتاج التسلسل منه.

تسببت الجوانب التقنية لتسلسل Maxam-Gilbert في الخروج عن صالحها بمجرد أن تكون طريقة تسلسل Sanger ثابتة ، كما هو موضح أدناه.

سرعان ما أصبحت طريقة إنهاء السلسلة التي طورها فريدريك سانجر وزملاؤه في عام 1977 هي الطريقة المفضلة ، نظرًا لسهولتها النسبية وموثوقيتها. عند اختراعها ، استخدمت طريقة إنهاء السلسلة مواد كيميائية سامة أقل وكميات أقل من النشاط الإشعاعي مقارنة بطريقة Maxam-Gilbert. نظرًا لسهولتها النسبية ، سرعان ما أصبحت طريقة Sanger آلية وكانت الطريقة المستخدمة في الجيل الأول من متواليات الحمض النووي.

تتطلب طريقة إنهاء السلسلة الكلاسيكية قالب DNA أحادي الجديلة ، وبادئة DNA ، وبوليميراز DNA ، و deoxynucleotidetriphosphates (dNTPs) ، و di-deoxynucleotidetriphosphates (ddNTPs) المعدل ، وهذا الأخير ينهي استطالة الحمض النووي. تفتقر هذه النيوكليوتيدات المنتهية بالسلسلة إلى مجموعة 3'-OH المطلوبة لتكوين رابطة فوسفوديستر بين نيوكليوتيدات ، مما يتسبب في توقف بوليميريز الحمض النووي عن تمديد الحمض النووي عندما يتم دمج ddNTP المعدل. قد يتم تمييز ddNTPs بشكل إشعاعي أو فلوري للكشف عن أجهزة التسلسل الآلي.

تنقسم عينة الحمض النووي إلى أربعة تفاعلات تسلسلية منفصلة ، تحتوي على كل أربعة من الديوكسينوكليوتيدات القياسية (dATP ، dGTP ، dCTP و dTTP) وبوليميراز الحمض النووي. يضاف إلى كل تفاعل واحد فقط من أربعة ديوكسينوكليوتيدات (ddATP ، ddGTP ، ddCTP ، أو ddTTP) ، في حين أن النيوكليوتيدات المضافة الأخرى هي النيوكليوتيدات العادية (الشكل 5.4).

الشكل 5.4. ddNTPs الفلورية لتسلسل سانجر. يتم استخدام Dideoxynucleotides للتسلسل حيث لا يمكن تمديدها أكثر بمجرد دمجها في الحمض النووي المجاور.

الصورة بواسطة فيبوناتشي

العودة إلى الصدارة


يجب أن يكون تركيز ديوكسينوكليوتيد أقل بحوالي 100 ضعف من تركيز ديوكسينوكليوتيد المقابل (على سبيل المثال 0.005 ملي مولار دي دي تي تي بي: 0.5 ملي مولار دي تي تي بي) للسماح بإنتاج شظايا كافية مع استمرار نسخ التسلسل الكامل. في المجموع ، هناك حاجة إلى أربعة تفاعلات منفصلة في هذه العملية لاختبار جميع ddNTPs الأربعة (الشكل 5.5).

الشكل 5.5. طريقة سانجر (إنهاء السلسلة) لتسلسل الحمض النووي. (1) يتم تلدين مادة أولية إلى تسلسل ، (2) تتم إضافة الكواشف إلى التمهيدي والقالب ، بما في ذلك: بوليميريز الحمض النووي ، dNTPs ، وكمية صغيرة من جميع النوكليوتيدات الأربعة (ddNTPs) المسمى بالفلوروفور. أثناء استطالة التمهيدي ، يؤدي الإدخال العشوائي لـ ddNTP بدلاً من dNTP إلى إنهاء تخليق السلسلة لأن بوليميريز الحمض النووي لا يمكن أن يتفاعل مع الهيدروكسيل المفقود. ينتج عن هذا كل الأطوال الممكنة للسلاسل. (3) يتم فصل المنتجات على هلام شعري مفرد ، حيث تتم قراءة العصابات الناتجة بواسطة نظام تصوير. (4) ينتج عن ذلك مئات الآلاف من النيوكليوتيدات يوميًا ، وهي بيانات تتطلب التخزين والتحليل الحسابي اللاحق.

الصورة بواسطة استيفيج


بعد جولات من تمديد قالب الحمض النووي من التمهيدي المرتبط ، يتم تغيير طبيعة أجزاء الحمض النووي الناتجة وفصلها حسب الحجم باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. تم تنفيذ هذه التقنية بشكل متكرر باستخدام هلام البولي أكريلاميد واليوريا المغير طبيعة مع كل من التفاعلات الأربعة التي تعمل في واحد من أربعة ممرات فردية (الممرات A ، T ، G ، C). يمكن بعد ذلك تصور نطاقات الحمض النووي عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي أو ضوء الأشعة فوق البنفسجية ويمكن قراءة تسلسل الحمض النووي مباشرة من فيلم الأشعة السينية أو صورة الهلام (الشكل 5.6).

الشكل 5.6. جل الترطيب التقليدي سانجر. التسلسل المرئي بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي. يحتوي كل حارة على تفاعلات واحدة تحتوي على جميع النيوكليوتيدات الأربعة العادية وكمية صغيرة من أحد ديوكسينيوكليوتيدات (ddNTPs). مع مرور الوقت ، سيتم دمج ddNTPs في كل موضع يحتوي على هذا النوكليوتيد المحدد. يمكن بعد ذلك قراءة الهلام من الأسفل إلى الأعلى ، حيث أن أصغر الأجزاء (تنتهي تلك الشظايا الأقرب إلى التمهيدي عند الطرف 5') ستمتد إلى أبعد مسافة في الهلام. تسلسل هذه القطعة هو:

-تاكجاجاتاتجكجتاتاكجاتاتججاكتكتاتجك 5 '3'

الصورة بواسطة جون شميت


أصبح من الممكن أتمتة طريقة تسلسل Sanger عندما تم التحول من النيوكليوتيدات الموسومة إشعاعيًا إلى النيوكليوتيدات ذات العلامات الفلورية. داخل أجهزة التسلسل الآلية ، يتم إجراء الفصل الكهربائي للهلام الشعري بدلاً من فصل العينات باستخدام الفصل الكهربائي للهلام. الناتج من الرحلان الكهربائي الشعري هو ذروة تتبع الاستشراب الفلوري (الشكل 5.7). يمكن لأدوات تسلسل الحمض النووي الآلية (متسلسلات الحمض النووي) تسلسل ما يصل إلى 384 عينة من الحمض النووي في دفعة واحدة. قد تحدث عمليات التشغيل المجمعة حتى 24 مرة في اليوم مما يعزز بشكل كبير السرعة التي يمكن بها تسلسل العينات وتحليلها. تتضمن التحديات الشائعة لتسلسل الحمض النووي باستخدام طريقة Sanger جودة رديئة في أول 15-40 قاعدة من التسلسل بسبب ارتباط التمهيدي وتدهور جودة آثار التسلسل بعد 400-500 قاعدة.

الشكل 5.7 مقارنة جنبًا إلى جنب بين الرحلان الكهربائي للهلام والرحلان الكهربائي الشعري. رسم تخطيطي لليسار يُظهر التصوير الشعاعي التلقائي التقليدي لعينات تسلسل سانجر. ال رسم تخطيطي لليمين يُظهر نفس التفاعلات باستخدام ddNTPs الموسومة الفلورية مفصولة بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري. يظهر إخراج الكروماتوجرام في أقصى اليمين.

الصورة بواسطة أبيزار


تسلسل سانجر هو الطريقة التي سادت من الثمانينيات حتى عام 2005. خلال تلك الفترة ، تم إحراز تقدم كبير في هذه التقنية ، مثل وضع العلامات الفلورية ، والرحلان الكهربائي الشعري ، والأتمتة العامة. سمحت هذه التطورات بتسلسل أكثر كفاءة ، مما أدى إلى انخفاض التكاليف. طريقة سانجر ، في شكل الإنتاج الضخم ، هي التكنولوجيا التي أنتجت أول جينوم بشري في عام 2001 ، إيذانا ببدء عصر علم الجينوم.

  • تسلسل موائع جزيئية سانجر

تسلسل موائع جزيئية سانجر هو أ تطبيق lab-on-a-chip لتسلسل الحمض النووي ، حيث يتم دمج خطوات تسلسل سانجر (الدراجات الحرارية ، وتنقية العينة ، والرحلان الكهربائي الشعري) على شريحة على نطاق رقاقة باستخدام أحجام عينة نانوليتر (الشكل 5.8). تولد هذه التقنية قراءات طويلة ودقيقة للتسلسل ، مع تجنب العديد من أوجه القصور الكبيرة في طريقة Sanger التقليدية (على سبيل المثال ، الاستهلاك العالي للكواشف باهظة الثمن ، والاعتماد على المعدات باهظة الثمن ، والتلاعب المكثف للأفراد ، وما إلى ذلك) من خلال دمج وأتمتة خطوات التسلسل Sanger .

الشكل 5.8 تقنيات Lab-On-A-Chip. مثال لمختبر ميكروفلويديك على جهاز رقاقة يجلس على طبق من البوليسترين. تعمل إبر الفولاذ المقاوم للصدأ التي يتم إدخالها في الجهاز كنقاط وصول للسوائل إلى القنوات الصغيرة داخل الجهاز ، والتي تكون بحجم شعرة الإنسان تقريبًا.

الصورة بواسطة المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST)


  • تسلسل الجيل القادم

تسلسل الجيل التالي (NGS) ، المعروف أيضًا باسم التسلسل عالي الإنتاجية ، هو المصطلح الشامل المستخدم لوصف عدد من تقنيات التسلسل الحديثة المختلفة. تسمح هذه التقنيات بتسلسل الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) بسرعة أكبر وبتكلفة أقل بكثير من تسلسل سانجر المستخدم سابقًا ، وبالتالي أحدثت ثورة في دراسة علم الجينوم والبيولوجيا الجزيئية. تشمل هذه التقنيات:

تسلسل Illumina - في NGS ، يتم ترتيب أعداد كبيرة من القراءات القصيرة بضربة واحدة باستخدام تقنية lab-on-a-chip الموصوفة أعلاه. للقيام بذلك ، يجب تقسيم عينة الإدخال إلى أقسام قصيرة. في تسلسل Illumina ، يتم استخدام قراءات 100-150 نقطة أساس. يتم ربط الأجزاء الأطول إلى حد ما بالمحولات العامة وتصلبها إلى شريحة باستخدام المحولات. يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم كل قراءة ، مما يؤدي إلى إنشاء مكان به نسخ عديدة من نفس القراءة. ثم يتم فصلها إلى حمض نووي منفرد تقطعت به السبل ليتم تسلسلها (الشكل 5.9).

الشكل 5.9 إجراء تسلسل Illumina. (أ) يتم غمر الشريحة مع شظايا PCR المضخمة للحمض النووي بالنيوكليوتيدات وبوليميراز الحمض النووي. يتم تمييز هذه النيوكليوتيدات بشكل فلوري مع كل لون يتوافق مع قاعدة معينة. تحتوي التفاعلات أيضًا على فاصل موجود ، بحيث تتم إضافة قاعدة واحدة فقط في كل مرة. (ب) تؤخذ صورة للشريحة. في كل موقع رد فعل ، ستكون هناك إشارة فلورية تشير إلى أنه تمت إضافة قاعدة معينة. (ج) يتم تسجيل البيانات ثم يتم إعداد الشريحة للدورة التالية. أثناء التحضير ، تتم إزالة أدوات الإنهاء ، مما يسمح بإضافة القاعدة التالية ، ويتم قطع إشارة الفلورسنت ، مما يمنع إشارة الفلورسنت من تلويث الصورة التالية. تتكرر العملية ، بإضافة نيوكليوتيد واحد في كل مرة (G ، A ، T ، أو C) والتصوير بينهما. ستكون جميع قراءات التسلسل بنفس طول إضافة القواعد الفردية في كل دورة.

تم تعديل الصورة من EMBL-EBI

العودة إلى الصدارة


روش 454 التسلسليشبه عملية Illumina ولكن يمكنه تسلسل القراءات الأطول بكثير. مثل Illumina ، يقوم بذلك عن طريق تسلسل عدة قراءات مرة واحدة عن طريق قراءة الإشارات الضوئية عند إضافة القواعد.

كما هو الحال في Illumina ، يتم تجزئة الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي إلى قراءات أقصر ، تصل في هذه الحالة إلى 1 كيلوبايت (1،000 نقطة أساس). تتم إضافة محولات عامة إلى النهايات ويتم تلدينها في الخرز ، جزء واحد من الحمض النووي لكل حبة. يتم بعد ذلك تضخيم الأجزاء بواسطة PCR باستخدام بادئات مخصصة للمهايئ. ثم يتم وضع كل خرزة في بئر شريحة واحدة. لذلك سيحتوي كل بئر على حبة واحدة مغطاة بالعديد من نسخ PCR من تسلسل واحد. تحتوي الآبار أيضًا على بوليميراز الحمض النووي ومخازن للتسلسل (الشكل 5.10).

5.10 إجراء تسلسل Roche 454. (أ) بمجرد توصيل منتج PCR بالخرز ، تغمر الشريحة بأحد أنواع NTP الأربعة. عندما يكون هذا النيوكليوتيد هو التالي في التسلسل ، فإنه يضاف إلى تسلسل القراءة. إذا تكررت هذه القاعدة الفردية ، فسيتم إضافة المزيد. لذلك إذا غمرنا قواعد Guanine ، والتالي في التسلسل هو G ، فسيتم إضافة G واحد ، ولكن إذا كان الجزء التالي من التسلسل هو GGGG ، فسيتم إضافة أربعة Gs. (ب) تؤدي إضافة كل نوكليوتيد إلى إطلاق إشارة ضوئية. يتم الكشف عن مواقع الإشارات هذه واستخدامها لتحديد الحبيبات التي تمت إضافة النيوكليوتيدات إليها. (ج) يتم غسل مزيج NTP. تمت الآن إضافة مزيج NTP التالي وتكرار العملية ، مع التنقل عبر NTPs الأربعة. ستكون جميع قراءات التسلسل من 454 تسلسلًا بأطوال مختلفة ، لأنه سيتم إضافة أعداد مختلفة من القواعد مع كل دورة.

تم تعديل الصورة بواسطة EMBL-EBI


أحدث التقنيات مثل تقنية ايون تورنتو ال نظام MinION الكشف عن بيانات التسلسل باستخدام الإشارات الكهربائية على شريحة أشباه الموصلات ، بدلاً من القراءة البصرية للنيوكليوتيدات ذات العلامات الصبغية. هذا ممكن لأن إضافة dNTP إلى بوليمر DNA يتسبب في إطلاق H+ أيون (الشكل 5.11). كما هو الحال في الأنواع الأخرى من NGS ، يتم تجزئة الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المدخلات ، هذه المرة ~ 200 نقطة أساس. تضاف المحولات ويوضع جزيء واحد على حبة. يتم تضخيم الجزيئات على الحبة بواسطة مستحلب PCR. يتم وضع كل حبة في بئر واحد للشريحة.

الشكل 5.11 تقنية تسلسل أيونات السيل. (أ) على غرار التسلسل 454 ، تغمر الشريحة بنوع واحد من dNTP ، جنبًا إلى جنب مع المخازن المؤقتة والبوليميراز. يتم مراقبة الأس الهيدروجيني في كل من الآبار بعد إضافة dNTP المحدد. سينخفض ​​الأس الهيدروجيني عندما يتم دمج dNTP في البوليمر مما يتسبب في إطلاق بروتون (H+). تسمح لنا التغييرات في الرقم الهيدروجيني بتحديد ما إذا كانت تلك القاعدة وعددها قد أضيفت إلى تسلسل القراءة. (ب) يتم غسل dNTPs وتكرار العملية بالدورة عبر أنواع dNTP المختلفة. (ج) يتم استخدام تغيير الرقم الهيدروجيني ، إن وجد ، لتحديد عدد القواعد (إن وجدت) التي تمت إضافتها مع كل دورة.

تم تعديل الصورة من EMBL-EBI


مثل هذه التقنيات الأيونية التي لا تتطلب الكشف البصري ، قد مكنت من إنتاج أجهزة تسلسل الحمض النووي المحمولة الصغيرة التي يمكن توصيلها بمحرك USB على كمبيوتر محمول واستخدامها في الميدان في ظل ظروف التجميع في الوقت الفعلي (الشكل 5.12).

الشكل 5.12 جهاز التسلسل في الوقت الحقيقي المحمول MinION. يمكن لجهاز MinION إنتاج ما يصل إلى 30 جيجا بايت من بيانات تسلسل الحمض النووي لكل عينة

الصورة بواسطة أكسفورد نانوبور تكنولوجيز


المزايا الأربع الرئيسية لـ NGS على تسلسل Sanger الكلاسيكي هي:

حجم العينة

NGS أرخص بكثير وأسرع وتحتاج إلى حمض نووي أقل بكثير وهي أكثر دقة وموثوقية من تسلسل سانجر. دعونا ننظر إلى هذا عن كثب. لتسلسل سانجر ، هناك حاجة إلى كمية كبيرة من قالب الحمض النووي لكل قراءة. هناك حاجة إلى عدة خيوط من الحمض النووي للقالب لكل قاعدة يتم تسلسلها (على سبيل المثال ، بالنسبة لتسلسل 100 نقطة أساس ، ستحتاج إلى عدة مئات من النسخ ، لتسلسل 1000 نقطة في البوصة ، ستحتاج إلى عدة آلاف من النسخ) ، حيث أن الشريط الذي ينتهي عند كل قاعدة هو اللازمة لبناء تسلسل كامل. في NGS ، يمكن الحصول على تسلسل من حبلا واحد. في كلا النوعين من التسلسل ، يتم أخذ نسخ متعددة متداخلة من أجل البناء المستمر والتحقق من صحة التسلسل.

سرعة

NGS أسرع من تسلسل سانجر بطريقتين. أولاً ، يمكن دمج التفاعل الكيميائي مع كشف الإشارة في بعض إصدارات NGS ، بينما في تسلسل Sanger ، هاتان عمليتان منفصلتان. ثانيًا ، والأهم من ذلك ، أنه يمكن أخذ قراءة واحدة فقط (بحد أقصى 1 كيلو بايت تقريبًا) في كل مرة في تسلسل Sanger ، في حين أن NGS متوازية بشكل كبير ، مما يسمح بقراءة 300 جيجا بايت من الحمض النووي في جولة واحدة على شريحة واحدة.

كلفة

يعني تقليل الوقت والقوى العاملة والكواشف في NGS أن التكاليف أقل بكثير. تكلف أول تسلسل للجينوم البشري في المنطقة 2.7 مليار دولار في عام 2003. وباستخدام طرق Sanger الحديثة للتسلسل ، بمساعدة بيانات من التسلسل المعروف ، لا يزال الجينوم البشري الكامل يكلف 300000 دولار في عام 2006. تسلسل الجينوم البشري باستخدام NGS اليوم يكلف حوالي 1000 دولار.

صحة

تعد التكرارات جوهرية في NGS ، حيث يتم تضخيم كل قراءة قبل التسلسل ، ولأنها تعتمد على العديد من القراءات القصيرة المتداخلة ، لذلك يتم تسلسل كل قسم من DNA أو RNA عدة مرات. أيضًا ، نظرًا لأنه أسرع وأرخص بكثير ، فمن الممكن إجراء عمليات تكرار أكثر من إجراء تسلسل Sanger. يعني المزيد من التكرارات تغطية أكبر ، مما يؤدي إلى تسلسل أكثر دقة وموثوقية ، حتى لو كانت القراءات الفردية أقل دقة لـ NGS.

يمكن استخدام تسلسل Sanger لإعطاء قراءات تسلسلية أطول بكثير. ومع ذلك ، فإن الطبيعة الموازية لـ NGS تعني أنه يمكن تكوين القراءات الأطول من العديد من القراءات القصيرة المتجاورة.

تقنيات تخليق الحمض النووي

تخليق الحمض النووي هو الخلق الطبيعي أو الاصطناعي لجزيئات الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA). يمكن أن يشير مصطلح تخليق الحمض النووي تكرار الحمض النووي (والتي سيتم تناولها بمزيد من التفصيل في الفصل العشرون) ، تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)أو التوليف الجيني (إنشاء تسلسل جيني اصطناعي فيزيائيًا).

  • تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

يشير تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) إلى تقنية مستخدمة على نطاق واسع في العلوم الأساسية والطبية الحيوية. PCR هي تقنية معملية تستخدم لتضخيم أجزاء معينة من الحمض النووي لمجموعة واسعة من التطبيقات المختبرية و / أو السريرية. بناءً على عمل بانيت و Khorana الناجح في تضخيم الحمض النووي في المختبر، قام كاري موليس وزملاؤه بتطوير PCR في أوائل الثمانينيات ، بعد أن حصلوا على جائزة نوبل بعد عقد واحد فقط. من خلال السماح بتضخيم أكثر من مليار ضعف لمناطق مستهدفة محددة ، أصبح مفيدًا في العديد من التطبيقات بما في ذلك استنساخ الجينات وتشخيص الأمراض المعدية وفحص الأطفال قبل الولادة بحثًا عن تشوهات وراثية ضارة.

الأساسيات

المكونات الرئيسية لـ PCR هي القالب ، والبادئات ، وقواعد النوكليوتيدات الحرة ، وإنزيم بوليميريز الحمض النووي. ال قالب الحمض النووييحتوي على المنطقة المحددة التي ترغب في تضخيمها ، مثل الحمض النووي المستخرج من قطعة من الشعر على سبيل المثال. الاشعال، أو oligonucleotides ، هي خيوط قصيرة من الحمض النووي أحادي السلسلة مكمل للنهاية 3 من كل منطقة مستهدفة. كل من التمهيدي الأمامي والخلفي مطلوبان ، واحد لكل خيط مكمل من الحمض النووي. بوليميريز الحمض النووي هو الإنزيم الذي ينفذ تكاثر الحمض النووي. تعتبر نظائرها الحرارية لبوليميراز الحمض النووي I ، مثل Taq polymerase ، الذي تم العثور عليه في الأصل في بكتيريا تنمو في الينابيع الساخنة ، خيارًا شائعًا نظرًا لمقاومتها لدورات التسخين والتبريد اللازمة لـ PCR.

يستفيد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من الاقتران الأساسي التكميلي والطبيعة المزدوجة الشريطة ودرجة حرارة انصهار جزيئات الحمض النووي. تتضمن هذه العملية التدوير من خلال 3 جولات متتالية من التفاعلات المعتمدة على درجة الحرارة: ذوبان الحمض النووي (تمسخ) ، التلدين وتكرار الحمض النووي (الاستطالة) الذي يحركه الإنزيم. تمسخيبدأ بتسخين التفاعل إلى حوالي 95اC ، مما يؤدي إلى تعطيل الروابط الهيدروجينية التي تربط شريطين من قالب الحمض النووي معًا. بعد ذلك ، يتم تقليل التفاعل إلى حوالي 50 إلى 65اC ، اعتمادًا على المتغيرات الفيزيائية والكيميائية للاشعال ، التمكين التلدينمن أزواج القواعد التكميلية. البادئات ، التي تمت إضافتها إلى المحلول الزائد ، ترتبط ببداية 3 'نهاية كل خيط قالب وتمنع إعادة تهجين خيط القالب بنفسه. أخيرًا ، استنساخ الحمض النووي الذي يحركه الإنزيم ، أو استطالة، من خلال ضبط درجة حرارة التفاعل على الكمية التي تعمل على تحسين نشاط بوليميراز الحمض النووي ، والتي تتراوح من 75 إلى 80اج. عند هذه النقطة ، فإن بوليميراز الحمض النووي ، الذي يحتاج إلى DNA مزدوج الشريطة لبدء النسخ المتماثل ، يصنع خيطًا جديدًا من الحمض النووي عن طريق تجميع النيوكليوتيدات الحرة في محلول في اتجاه 3 إلى 5 لإنتاج مجموعتين كاملتين من الخيوط التكميلية. أصبح الحمض النووي المركب حديثًا متطابقًا الآن مع حبلا القالب وسيتم استخدامه على هذا النحو في دورات PCR التقدمية (فيديو 5.1).

[عرض الفيديو = "1280" الارتفاع = "720" mp4 = "https://wou.edu/chemistry/files/2019/09/Figs1.mp4"] [/ video]

فيديو موسى غنام

العودة إلى الصدارة


بالنظر إلى أن خيوط الحمض النووي المركبة مسبقًا تعمل كقوالب ، فإن تضخيم الحمض النووي باستخدام PCR يزداد بمعدل أسي ، حيث تتضاعف نسخ الحمض النووي في نهاية كل خطوة تكرار. في النهاية ، يصل التكاثر الأسي للحمض النووي المستهدف إلى حوالي 30 إلى 40 دورة ويرجع ذلك أساسًا إلى قيود الكاشف ، ولكن يمكن أن يكون أيضًا بسبب مثبطات تفاعل البوليميراز الموجود في العينة ، والتلدين الذاتي للمنتج المتراكم ، وتراكم جزيئات البيروفوسفات.

الوقت الحقيقي PCR

عند ظهورها ، اقتصرت تقنية PCR على التحليل النوعي أو شبه الكمي بسبب القيود المفروضة على القدرة على تقدير الأحماض النووية. في ذلك الوقت ، للتحقق مما إذا كان الجين المستهدف قد تم تضخيمه بنجاح ، تم فصل منتج الحمض النووي بالحجم عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. يمكن أن يعطي إيثيديوم بروميد ، وهو جزيء يتألق عندما يرتبط بـ dsDNA ، تقديرًا تقريبيًا لكمية الحمض النووي عن طريق مقارنة سطوع النطاقات المنفصلة تقريبًا ، ولكنه لم يكن حساسًا بدرجة كافية لإجراء تحليل كمي صارم.

أدت التحسينات في تطوير الفلوروفور والأجهزة إلى معالجات حرارية لم تعد تتطلب قياس الحمض النووي للمنتج النهائي فقط. هذه العملية ، والمعروفة باسم الوقت الحقيقي PCR ،أو PCR الكمي (qPCR) ، سمح باكتشاف dsDNA أثناء التضخيم. تم تجهيز المعالجات الحرارية qPCR بالقدرة على إثارة الفلوروفورات بأطوال موجية محددة ، واكتشاف انبعاثها باستخدام كاشف ضوئي ، وتسجيل القيم. عززت المجموعة الحساسة للقيم العددية أثناء التضخيم بقوة التحليل الكمي.

هناك نوعان رئيسيان من الفلوروفورات المستخدمة في qPCR: تلك التي ترتبط على وجه التحديد بتسلسل هدف معين وتلك التي لا ترتبط. كانت حساسية الفلوروفور جانبًا مهمًا من جوانب تطوير qPCR. واحدة من العلامات غير المحددة الأكثر فاعلية والمستخدمة على نطاق واسع ، SYBR Green ، بعد الارتباط بالأخدود الصغير لـ dsDNA ، تُظهر زيادة في التألق بمقدار 1000 ضعف مقارنة بكونها مجانية في المحلول (فيديو 5.1). ومع ذلك ، في حالة الرغبة في المزيد من التحديد ، يمكن إضافة أليغنوكليوتيد خاص بالتسلسل ، أو مسبار التهجين ، والذي يرتبط بالجين المستهدف في نقطة ما أمام التمهيدي (بعد نهاية 3). تحتوي مجسات التهجين هذه على جزيء مراسل في الطرف 5 وجزيء تقطير في الطرف 3. يمنع جزيء التبريد بشكل فعال المراسل من التألق بينما يكون المسبار سليمًا. ومع ذلك ، عند ملامسة بوليميراز الحمض النووي I ، يتم شق مسبار التهجين ، مما يسمح بتألق الصبغة (فيديو 5.1).

عكس النسخ PCR

منذ ظهورها ، تم توسيع تقنية PCR بشكل إبداعي و النسخ العكسي PCR (RT-PCR) هو أحد أهم التطورات. كثيرًا ما يتم الخلط بين تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي وبين النسخ العكسي لـ PCR ، لكنهما تقنيات منفصلة. في RT-PCR ، يتم اشتقاق الحمض النووي المتضخم من mRNA باستخدام إنزيمات النسخ العكسي ، لإنتاج نسخة cDNA من الجين. باستخدام متواليات البادئات للجينات ذات الأهمية ، يمكن استخدام طرق PCR التقليدية مع (كدنا) لدراسة التعبير عن الجينات نوعيًا. حاليًا ، يتم استخدام PCR النسخ العكسي بشكل شائع مع PCR في الوقت الفعلي ، والذي يسمح للمرء بقياس التغيير النسبي في التعبير الجيني عبر عينات مختلفة كميًا.

مواضيع الاهتمام

إحدى عيوب تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل هي أنها حساسة للغاية. يمكن أن تؤدي الكميات الضئيلة من تلوث الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي في العينة إلى نتائج مضللة للغاية. عيب آخر هو أن البادئات المصممة لـ PCR تتطلب بيانات متسلسلة ، وبالتالي لا يمكن استخدامها إلا لتحديد وجود أو عدم وجود مسببات الأمراض أو الجينات المعروفة. القيد الآخر هو أنه في بعض الأحيان يمكن للبادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل أن تصلب بشكل غير محدد للتسلسلات التي تشبه الجين المستهدف ولكنها ليست متطابقة.

هناك مشكلة أخرى محتملة لاستخدام PCR وهي إمكانية تكوين ثنائي التمهيدي (PD). PD هو منتج ثانوي محتمل ويتكون من جزيئات أولية تم تهجينها مع بعضها البعض بسبب سلاسل القواعد التكميلية في البادئات. يضخم بوليميراز الحمض النووي PD ، مما يؤدي إلى التنافس على كواشف PCR التي يمكن استخدامها لتضخيم التسلسلات المستهدفة.

الأهمية السريرية

يعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل أداة لا غنى عنها مع تطبيقات مختلفة في الطب. في كثير من الأحيان ، يتم استخدامه لاختبار وجود أليلات معينة ، كما هو الحال في حالة فحص الوالدين المحتملين للحوامل الجينية ، ولكن يمكن أيضًا استخدامه لتشخيص وجود المرض بشكل مباشر وللتشخيص في حدوث طفرات في الجنين النامي. على سبيل المثال ، كانت المرة الأولى التي تم فيها استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بهذه الطريقة لتشخيص فقر الدم المنجلي من خلال الكشف عن طفرة جينية واحدة.

بالإضافة إلى ذلك ، أحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ثورة كبيرة في القدرة التشخيصية للأمراض المعدية ، حيث يمكن استخدامه لتحديد هوية الميكروبات التي لم يكن من الممكن استزراعها تقليديًا ، أو التي تطلبت أسابيع للنمو. تشمل العوامل الممرضة التي يتم اكتشافها بشكل روتيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، المتفطرة السلية ، وفيروس نقص المناعة البشرية ، وفيروس الهربس البسيط ، والزهري ، والعديد من مسببات الأمراض الأخرى. علاوة على ذلك ، لا يتم استخدام qPCR فقط لاختبار الوجود النوعي للميكروبات ولكن أيضًا لتحديد الأحمال البكتيرية والفطرية والفيروسية.

تحسنت حساسية أدوات التشخيص للطفرات في الجينات المسرطنة والجينات المثبطة للورم بما لا يقل عن 10000 ضعف بسبب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يسمح بالتشخيص المبكر للسرطانات مثل اللوكيميا. أتاح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أيضًا علاجات أكثر دقة وفردية لمرضى السرطان. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في تصنيف الأنسجة الذي يعد أمرًا حيويًا لزرع الأعضاء ، وقد تم اقتراحه أيضًا كبديل للاختبارات القائمة على الأجسام المضادة لفصيلة الدم. يحتوي تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضًا على تطبيقات سريرية في مجال الاختبارات السابقة للولادة لمختلف الأمراض الوراثية و / أو الأمراض السريرية. يتم الحصول على العينات إما عن طريق بزل السائل الأمنيوسي أو أخذ عينة من خلايا المشيمة.

في الطب الشرعي ، يتم تضخيم قطع قصيرة من الحمض النووي التكراري متعدد الأشكال للغاية ، والتكرار الترادفي القصير المصاغ (STRs) ، واستخدامها لمقارنة التباين المحدد داخل الجينات للتمييز بين الأفراد. يتم استخدام مواد أولية محددة لمواقع تقارير المعاملات المشبوهة هذه وتضخيمها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. تحتوي المواقع المختلفة على تقارير المعاملات المشبوهة في الجينوم البشري ، ويتم تعزيز القوة الإحصائية لهذه التقنية عن طريق فحص مواقع متعددة.

التوليف الجيني الاصطناعي، يُعرف أحيانًا باسم طباعة الحمض النووي هي طريقة في البيولوجيا التركيبية تُستخدم لإنشاء جينات اصطناعية في المختبر. استنادًا إلى تخليق الحمض النووي للطور الصلب ، يختلف عن الاستنساخ الجزيئي وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في أنه لا يجب أن يبدأ بتسلسلات الحمض النووي الموجودة مسبقًا.لذلك ، من الممكن صنع جزيء DNA مزدوج الشريطة اصطناعي بالكامل بدون حدود واضحة على تسلسل أو حجم النوكليوتيدات.

تم استخدام هذه الطريقة لتوليد كروموسومات بكتيرية أو خميرة وظيفية تحتوي على ما يقرب من مليون زوج قاعدي. يمكن أن يؤدي إنشاء أزواج جديدة من القاعدة النووية بالإضافة إلى الزوجين الأساسيين في الطبيعة إلى توسيع الشفرة الجينية بشكل كبير.

تم عرض توليف أول جين كامل ، وهو عبارة عن خميرة tRNA ، بواسطة Har Gobind Khorana وزملاؤه في عام 1972. تم إجراء توليف أول جينات ترميز الببتيد والبروتين في مختبرات هربرت بوير وألكسندر ماركهام ، على التوالي.

خدمات تصنيع الجينات التجارية متاحة الآن. غالبًا ما تعتمد المناهج على مزيج من تقنيات الكيمياء العضوية والبيولوجيا الجزيئية ويمكن تصنيع الجينات بأكملها "de novo" ، دون الحاجة إلى قالب DNA. يعد التوليف الجيني أداة مهمة في العديد من مجالات تقنية الحمض النووي المؤتلف بما في ذلك التعبير الجيني غير المتجانسة وتطوير اللقاح والعلاج الجيني والهندسة الجزيئية. يمكن أن يكون تخليق تسلسل الحمض النووي أكثر اقتصادا من إجراءات الاستنساخ والطفرات التقليدية. وهي أيضًا أداة هندسية قوية ومرنة لإنشاء وتصميم تسلسلات جديدة للحمض النووي ووظائف البروتين.

تحسين الجينات

في حين أن القدرة على عمل امتدادات طويلة بشكل متزايد من الحمض النووي بكفاءة وبأسعار منخفضة هي المحرك التكنولوجي لهذا المجال ، يتركز الاهتمام بشكل متزايد على تحسين تصميم الجينات لأغراض محددة. في وقت مبكر من عصر تسلسل الجينوم ، تم استخدام التخليق الجيني كمصدر (مكلف) لـ cDNAs التي تم التنبؤ بها بواسطة معلومات cDNA الجينية أو الجزئية ولكن كان من الصعب استنساخها. مع توفر مصادر عالية الجودة للتسلسل الذي تم التحقق منه (كدنا) المستنسخة ، أصبحت هذه الممارسة أقل إلحاحًا.

قد يكون إنتاج كميات كبيرة من البروتين من تسلسل الجينات (أو على الأقل مناطق ترميز البروتين للجينات ، إطار القراءة المفتوح) الموجودة في الطبيعة أمرًا صعبًا في بعض الأحيان وهي مشكلة ذات تأثير كافٍ حيث تم تخصيص المؤتمرات العلمية للموضوع. عادة ما يتم تنظيم العديد من البروتينات الأكثر إثارة للاهتمام التي يبحث عنها علماء الأحياء الجزيئية بحيث يتم التعبير عنها بكميات منخفضة جدًا في الخلايا البرية. تقدم إعادة تصميم هذه الجينات وسيلة لتحسين التعبير الجيني في كثير من الحالات. إعادة كتابة إطار القراءة المفتوحة ممكنة بسبب انحطاط الشيفرة الجينية. وبالتالي من الممكن تغيير ما يصل إلى حوالي ثلث النيوكليوتيدات في إطار قراءة مفتوح مع استمرار إنتاج نفس البروتين. العدد المتاح للتصميمات البديلة الممكنة لبروتين معين فلكي. للحصول على تسلسل بروتيني نموذجي يتكون من 300 حمض أميني ، يوجد أكثر من 10150 مجموعات الكودون التي ستشفر بروتينًا متطابقًا. إن تحسين Codon ، أو استبدال الكودونات التي نادرًا ما تستخدم بكودونات أكثر شيوعًا ، يكون لها أحيانًا تأثيرات دراماتيكية. يمكن أيضًا تضمين مزيد من التحسينات مثل إزالة الهياكل الثانوية للحمض النووي الريبي. على الأقل في حالة بكتريا قولونية، يتم تعظيم تعبير البروتين عن طريق استخدام الكودونات المقابلة لـ tRNA التي تحتفظ بشحن الأحماض الأمينية أثناء الجوع. برامج الكمبيوتر المكتوبة لأداء هذه ، وغيرها من التحسينات المتزامنة تستخدم للتعامل مع التعقيد الهائل للمهمة. يمكن للجين المُحسَّن جيدًا تحسين تعبير البروتين من 2 إلى 10 أضعاف ، وفي بعض الحالات تم الإبلاغ عن أكثر من 100 ضعف. بسبب الأعداد الكبيرة من التغييرات النوكليوتيدية التي تم إجراؤها على تسلسل الحمض النووي الأصلي ، فإن الطريقة العملية الوحيدة لإنشاء الجينات المصممة حديثًا هي استخدام التوليف الجيني.

تخليق قليل النوكليوتيد

يتم تصنيع قليل النوكليوتيدات كيميائيًا باستخدام لبنات بناء تسمى نيوكليوزيد فوسفوراميديت. يمكن أن تكون هذه نيوكليوسيدات طبيعية أو معدلة لها مجموعات حماية تمنع تفاعل الأمينات ومجموعات الهيدروكسيل ومجموعات الفوسفات بشكل غير صحيح. تتم إضافة فوسفوراميديت واحد في كل مرة ، ويتم إزالة مجموعة الهيدروكسيل 5 بوصات ويتم إضافة قاعدة جديدة وما إلى ذلك. تنمو السلسلة في اتجاه 3 إلى 5 ، وهو اتجاه عكسي بالنسبة إلى التخليق الحيوي للحمض النووي في الجسم الحي. في النهاية ، تتم إزالة جميع المجموعات الحامية.

الشكل 5.13 دورة تخليق فوسفوراميديت من أربع خطوات. إن طريقة الفوسفوراميديت ، التي ابتكرها مارفن كاروثرز في أوائل الثمانينيات ، وعُزِّزت من خلال تطبيق تكنولوجيا المرحلة الصلبة والأتمتة ، أصبحت الآن طريقة راسخة في الاختيار. يستمر تخليق أليغنوكليوتيد الفوسفوراميديت في الاتجاه من 3 إلى 5 (عكس اتجاه 5 إلى 3 للتخليق الحيوي للحمض النووي في تكرار الحمض النووي). يضاف نوكليوتيد واحد لكل دورة تخليق. تتكون دورة تخليق الحمض النووي للفوسفوراميديت من سلسلة من الخطوات الموضحة في الشكل

الصورة بواسطة Ni، S.، et al (2017) المجلة الدولية للعلوم الجزيئية 18 (8): 1683


ومع ذلك ، لكونها عملية كيميائية ، تحدث العديد من التفاعلات غير الصحيحة مما يؤدي إلى بعض المنتجات المعيبة. كلما طالت مدة تصنيع تسلسل قليل النوكليوتيدات ، زاد عدد العيوب الموجودة ، وبالتالي فإن هذه العملية عملية فقط لإنتاج متواليات قصيرة من النيوكليوتيدات. يبلغ الحد العملي الحالي حوالي 200 نقطة أساس (أزواج قاعدية) للأوليغنوكليوتيد بجودة كافية لاستخدامها مباشرة في التطبيقات البيولوجية. يمكن استخدام HPLC لعزل المنتجات بالتسلسل الصحيح. وفي الوقت نفسه ، يمكن تصنيع عدد كبير من الأوليجوس بالتوازي على رقائق الجينات. للحصول على الأداء الأمثل في إجراءات التوليف الجيني اللاحقة ، يجب تحضيرها بشكل فردي وفي نطاقات أكبر.

  • تخليق الحمض النووي والبيولوجيا التركيبية

أدى الانخفاض الكبير في تكلفة تخليق الجينات في السنوات الأخيرة بسبب المنافسة المتزايدة للشركات التي تقدم هذه الخدمة إلى القدرة على إنتاج بلازميدات بكتيرية كاملة لم تكن موجودة في الطبيعة. يستخدم مجال البيولوجيا التركيبية التكنولوجيا لإنتاج دوائر بيولوجية اصطناعية ، وهي عبارة عن امتدادات من الحمض النووي يتم التلاعب بها لتغيير التعبير الجيني داخل الخلايا وتسبب في إنتاج الخلية للمنتج المطلوب.

ستمكن القدرة على إنتاج الحمض النووي الصناعي من تطوير المنتجات البيئية والطبية والتجارية ذات الصلة. على سبيل المثال ، في عام 2015 ، قامت شركة Novartis بالتعاون مع شركة Synthetic Genomics Vaccines inc. وأعلنت الهيئة الأمريكية للبحث والتطوير في مجال الطب الحيوي المتقدم ، أنهما قد ابتكرتا بشكل فعال لقاح إنفلونزا DNA الاصطناعي. لقاحات الدنا الاصطناعية الجديدة تبشر بتوفير بديل للقاحات التقليدية الحالية المنتجة من البيض والتي يمكن أن تعاني من انخفاض الفعالية.

لقاحات الحمض النووي قادرة على تجنب العديد من المشكلات المرتبطة بإنتاج لقاح قائم على البيض عن طريق إنتاج بروتينات فيروسية داخل الخلايا المضيفة. لإنشاء لقاح DNA ، يتم استنساخ الجين المشفر للمستضد في بلازميد تعبير غير متماثل ، والذي يتم تسليمه إلى المضيف عن طريق طرق التطعيم التقليدية. تعبر الخلايا المضيفة التي تتناول البلازميد عن مستضد اللقاح الذي يمكن تقديمه للخلايا المناعية عبر مسارات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC). يعد تنشيط الخلايا المساعدة CD4 + T بعد عرض MHC من الدرجة الثانية لبروتين لقاح الحمض النووي المفرز أمرًا بالغ الأهمية لإنتاج الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد (الشكل 5.14).

الشكل 5.14 إنشاء لقاح DNA. يتم تصنيع الجين المستضدي واستنساخه في ناقل بلازميد. (تم وصف الخطوات المتعلقة بعملية الاستنساخ بمزيد من التفصيل في القسم 5.3). يتم تسليم لقاح الحمض النووي إلى المضيف ، حيث سيتم التعبير عنه لإنتاج مستضد وتقديمه إلى جهاز المناعة المضيف.

الشكل بقلم Lee، L.Y.Y.، Izzard، L.، and Hurt، AC (2018) Frontiers in Immunology، doi: 10.3389 / fimmu.2018.01568

العودة إلى الصدارة


بعد عقدين من البحث ، تكتسب تقنية لقاح الحمض النووي مرحلة النضج - تم ترخيص العديد من لقاحات الحمض النووي البيطرية حاليًا لفيروس غرب النيل وسرطان الجلد ، وبشكل ملحوظ ، تمت الموافقة مؤخرًا على أول لقاح تجاري للحمض النووي ضد H5N1 في الدجاج من قبل وزارة الزراعة الأمريكية. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم التجارب الكبيرة الجارية على الحيوانات لقاحات الحمض النووي ضد أمراض أخرى مثل فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد وفيروس زيكا رؤى قيمة يمكن تطبيقها على تصميم لقاح إنفلونزا الحمض النووي. نشأت مناهج واعدة من الدراسات العديدة التي تقيم تركيبات مختلفة من لقاح الدنا وأنظمة توصيله ، ولكن لم تظهر بعد استراتيجية تحمي باستمرار من الإنفلونزا في النماذج الحيوانية الكبيرة. يظل التسليم الناجح للبلازميد واستخدام المواد المساعدة المناسبة من التحديات الرئيسية التي يجب معالجتها قبل أن تصبح لقاحات DNA الإنفلونزا فعالة للاستخدام البشري.


كيفية إنشاء مكتبات الجينات (مع رسم تخطيطي)

تمثل مجموعة أجزاء الحمض النووي (خاصة الجينات) من نوع معين مكتبات الجينات.

يتم إنشاء أو بناء مكتبات الجينات (مكتبات الجينوم على نطاق واسع) عن طريق عزل الجينوم الكامل (الحمض النووي الكامل من الخلية) الذي يتم تقطيعه إلى أجزاء ، واستنساخه في نواقل مناسبة.

ثم يمكن تحديد الاستنساخ المحدد الذي يحمل الحمض النووي (الهدف) المطلوب ، وعزله وتوصيفه. بهذه الطريقة ، يمكن إنشاء مكتبة من الجينات أو الحيوانات المستنسخة (تعتبر بشكل مناسب كبنك جينات) لكامل جينوم أحد الأنواع. تختلف أحجام الجينوم في الأنواع المختلفة (الجدول 9.1). تحتوي مكتبة الجينات الكاملة لكل كائن حي على كل الحمض النووي الجيني.

يهتم علماء التكنولوجيا الحيوية بشكل خاص بعزل الجينات (وبالتالي إنشاء مكتبات الجينات) التي تشفر البروتينات. هناك اختلاف واضح في جينات الخلايا بدائية النواة وخلايا حقيقية النواة. في الكائنات بدائية النواة ، تكون الجينات الهيكلية المشفرة للبروتينات مستمرة. ومع ذلك ، في حالة حقيقيات النوى ، يتم فصل مناطق الترميز (exons) للجينات الهيكلية عن طريق مناطق غير مشفرة (الإنترونات). لهذا السبب ، فإن بناء مكتبات الجينات لحقيقيات النوى أكثر تعقيدًا.

إنشاء مكتبة الجينات:

يتم هضم الحمض النووي من الكائن المصدر عن طريق نوكلياز تقييد (على سبيل المثال ، EcoRI) ، لينتج عنه شظايا. من المستحسن تهيئة الظروف بحيث يحدث الهضم الجزئي وليس الهضم الكامل. بهذه الطريقة ، يمكن إنتاج جميع أجزاء الحمض النووي ذات الأحجام المتغيرة. يوضح الشكل 9.1 الهضم الجزئي للحمض النووي الذي يحتوي على نوكلياز داخلي.

تحدث الانقسامات في مواقع مختلفة لتؤدي إلى أجزاء من الحمض النووي بأطوال متفاوتة ، قد يكون بعضها كبيرًا والبعض الآخر صغيرًا. في الممارسة العملية ، يتم استخدام مزيج من إنزيمات التقييد لهضم مصدر الحمض النووي لإطلاق عدد كبير من شظايا الحمض النووي. يمكن عزل الأجزاء المرغوبة واستنساخها.

يستخدم بعض العمال مصطلح تجربة البندقية (أو نهج البندقية) لإنشاء استنساخ عشوائي (دون تحديدهم جميعًا بالضرورة) من الحمض النووي الجيني. في نهج البندقية ، يتعرض الحمض النووي لانقسام عشوائي عن طريق نوكليازات تقييدية.

تقنية Maniatis لإنشاء مكتبة الجينات:

في التقنية التي طورها Maniatis et aI (1978) ، يتم استخدام نوعين من نوكليازات تقييدية لقطع الحمض النووي المستهدف. يسمح الهضم الجزئي بتكوين غالبية أجزاء الحمض النووي بطول يتراوح من 10 إلى 30 كيلو بايت. تتداخل الأجزاء بشكل متكرر ويمكن تجزئتها بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. يتم إدخال الأجزاء المعزولة (حوالي 20 كيلو بايت في الحجم) في متجه الملتهمة ويتم استنساخها.

إنشاء مكتبة جينية للإنسان:

قد يخضع الحمض النووي الخلوي البشري (الجينوم بأكمله) للهضم عن طريق تقييد نوكلياز (على سبيل المثال ، EcoRI). تكون الأجزاء المتكونة في المتوسط ​​من أحجام حوالي 4 كيلو بايت ، (أي 4000 نيتروجين & # 8217 قواعد). يمكن تقطيع كل كروموسوم بشري ، يحتوي على ما يقرب من 100000 كيلو بايت إلى حوالي 25000 جزء من الحمض النووي. نظرًا لأن البشر لديهم 23 كروموسومًا مختلفًا (24 في الإنسان) ، هناك ما مجموعه 575000 جزء من 4 كيلو بايت طول. من بين 575000 شظية من الحمض النووي هناك الحمض النووي أو الجين المعني (لنقل جين الأنسولين).

الآن هو اختيار المتجه وعملية الاستنساخ. الإشريكية القولونية ، وهي بكتيريا غير ضارة للإنسان هي الأكثر استخدامًا. يتم عزل البلازميدات من الإشريكية القولونية. يتم هضمها بنفس إنزيم التقييد الذي تم استخدامه لقطع الجينوم البشري لتكوين بلازميدات مفتوحة. يتم ربط شظايا الحمض النووي الصبغي البشري والبلازميدات المفتوحة لإنتاج بلازميدات معاد تجميعها.

تحتوي هذه البلازميدات على أجزاء مختلفة من الحمض النووي للإنسان. يتم إدخال البلازميدات المعاد تجميعها في الإشريكية القولونية وتتكاثر الخلايا (الشكل 9.2). تمتلك خلايا الإشريكية القولونية جميع الحمض النووي البشري في أجزاء. ومع ذلك ، يجب أن نتذكر أن كل خلية من خلايا الإشريكية القولونية تحتوي على أجزاء مختلفة من الحمض النووي. تمثل جميع خلايا الإشريكية القولونية مجتمعة مكتبة جينومية (تحتوي على حوالي 575000 جزء من الحمض النووي).

نواقل أخرى لإنشاء مكتبات الجينوم:

بدلاً من العاثيات والبلازميدات ، يتم استخدام نواقل أخرى لبناء مكتبات DNA كبيرة الحجم. وتشمل هذه الكوسميدات والكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs) والكروموسومات الاصطناعية الخميرة (YACs). تعتبر هذه نواقل عالية السعة. على الرغم من أنها مثالية لبناء مكتبات الجينات ، إلا أن هناك العديد من الصعوبات العملية المرتبطة باستخدامها.

PCR كبديل لبناء مكتبة الجينوم:

PCR هي تقنية لتضخيم تسلسل DNA معين. يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل مع البادئات لعزل الحمض النووي المستهدف مباشرة من الجينوم. وبالتالي ، يعمل PCR كبديل لبناء مكتبة DNA (مكتبة الجينات) عن طريق الاستنساخ. هذا ليس ممكنًا دائمًا حيث يمكن استخدام تقنية PCR لتضخيم الحمض النووي قصير الطول (عادةً 1-2 كيلو بايت بحد أقصى 5 كيلو بايت). علاوة على ذلك ، تؤدي درجة الحرارة المرتفعة المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل أحيانًا إلى إتلاف القواعد وتولد شقوقًا في خيوط الحمض النووي.

مع بعض التعديلات في PCR ، أصبح من الممكن الآن تضخيم شظايا الحمض النووي حتى طول 22 كيلو بايت من الحمض النووي الجيني البشري. يتم تحقيق ذلك باستخدام مزيج من إنزيمي بوليميريز DNA ، بالإضافة إلى خفض درجة حرارة التفاعل. يحتوي أحد بوليمرات الحمض النووي على نشاط تدقيق للقراءة لإزالة القواعد غير المتطابقة.

في الواقع ، تقدم بعض الشركات التجارية كوكتيلات إنزيمية مناسبة بشكل مثالي للـ PCR الطويل ، على سبيل المثال ، نظام TaqPlus Long PCR الذي يتم تسويقه بواسطة جين ستراتا. يحتوي على Taq polymerase وإنزيم Pfee polymerase المقاوم للحرارة.

تم تطبيق PCR الطويل للتحليل المنظم للجينات البشرية وجينومات فيروس نقص المناعة البشرية. من غير المحتمل أن يحل PCR الطويل محل بناء مكتبات الجينوم. هذا لأن إنشاء مكتبات الحمض النووي أمر دائم بينما يكون تفاعل البوليميراز المتسلسل الطويل مؤقتًا. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام PCR لتضخيم شظايا الحمض النووي المحددة (ذات الأهمية) من المكتبات الجينية.

مكتبات مجزأة:

غالبًا ما يصادف علماء التكنولوجيا الحيوية كميات صغيرة من المواد الأولية ، مثل الخلايا المفردة والأنسجة الثابتة والحفريات وما إلى ذلك. من الصعب جدًا تطبيق التقنية التقليدية لبناء مكتبات الجينوم من هذه العينات. يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل مناسبًا بشكل مثالي لعزل وتضخيم الجينات من عينات صغيرة جدًا. وبالتالي ، يمكن استخدام PCR لإنشاء مكتبات شظايا جينومية عشوائية.

مكتبات الحمض النووي التكميلية:

إن استنساخ الجينات حقيقية النواة أمر معقد نوعًا ما ويتطلب تقنيات خاصة. هذا يرجع بشكل أساسي إلى التسلسلات غير المشفرة (الإنترونات) في الحمض النووي. في الخلية حقيقية النواة حيث يتم نسخ الجين ، يخضع الحمض النووي الريبي لتغييرات عديدة في النواة (يشار إليها باسم التضفير) لتحرير mRNA الناضج والوظيفي في السيتوبلازم.

بهذه الطريقة ، يتم إزالة الإنترونات. في بعض الجينات ، تشكل الإنترونات الجزء الأكبر من الجين. على سبيل المثال ، في جين الديستروفين البشري ، يتكون ما يصل إلى 99٪ من تسلسل الحمض النووي من الإنترونات. هناك ما يصل إلى 79 إنترون!

بدائيات النوى ، وخاصة البكتيريا ، لا تمتلك القدرة على إزالة الإنترونات. ومن ثم لا يتم تشكيل الرنا المرسال الوظيفي بشكل صحيح في خلية بدائية النواة لجين حقيقي النواة. وبالتالي ، يصبح استنساخ الجينات حقيقية النواة مهمة صعبة.

تخليق الحمض النووي التكميلي:

الحمض النووي التكميلي (cDNA) هو مكمل مزدوج الشريطة من الرنا المرسال. يمكن تصنيع (كدنا) من الرنا المرسال عن طريق النسخ العكسي. mRNA وظيفي حقيقي النواة الذي لا يحتوي على إنترونات يمتلك غطاء G عند 5 & # 8242 وذيل بولي (A) في الطرف 3 & # 8242 (حوالي 200 من بقايا الأدينين).

يتم عزل وتنقية الرنا المرسال المطلوب (خاصة من الخلايا الغنية بالمرنا المحدد مثل خلايا البنكرياس للأنسولين الرنا المرسال). يضاف برايمر oligo-dT لربط الجزء القصير من منطقة ذيل بولي A (عن طريق التلدين). يوفر هذا التمهيدي مجموعة 3 & # 8242-hydroxyl لتخليق خيط DNA.

مع إضافة إنزيم النسخ العكسي للإنزيم وأربعة ديوكسينوكليوتيدات (dATP و dTTP و dGTP و dCTP) ، يستمر تصنيع الحمض النووي. بالنسبة للقواعد A و G و C و U في القالب (mRNA) ، فإن القواعد التكميلية المقابلة في الحمض النووي على التوالي هي T و C و G و A. عدد قليل من النيوكليوتيدات لتشكيل حلقة دبوس الشعر (الشكل 9.3).

تعمل حلقة خيط DNA الأول كقالب لتركيب خيط DNA الثاني. من خلال إضافة بوليميراز E. coli DNA (جزء Klenow) ، يحدث تخليق الحمض النووي الثاني بدءًا من نهاية حلقة دبوس الشعر. عند العلاج باستخدام إنزيم RNase H ، تتحلل جزيئات الرنا المرسال. ينشق الإنزيم SI nuclease ، ، حلقات دبوس الشعر ويحلل امتدادات الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل. المنتجات النهائية عبارة عن نسخ DNA تكميلية من mRNA الأصلي ، بعضها مكتمل بينما البعض الآخر غير مكتمل.

حدود التقنية:

العيب الرئيسي في طريقة دبوس الشعر هو فقدان تسلسل صغير في 5 & # 8242 نهاية cDNA بسبب الانقسام بواسطة نوكلياز SI.

طريقة محسنة لتوليف [كدنا]:

للتغلب على القيد الموصوف أعلاه ، تم إجراء بعض التحسينات في تخليق (كدنا). يظهر أحد هذه التقنيات المحسنة في الشكل 9.4.

نظرًا لتصنيع الخيط الأول من (كدنا) ، يتم ذيله بمخلفات السيتدين بمساعدة الإنزيم الطرفي ترانسفيراز. يتم تحلل خيوط الرنا المرسال بالقلويات ، ويتم استرداد (كدنا) كامل الطول. يتم بعد ذلك تلدين مادة أولية اصطناعية oligo-dG إلى oligo-dC. وهذا بدوره يتيح تخليق الخيط الثاني من (كدنا). من خلال هذه التقنية المحسنة ، يتم الحصول على طول كامل من (كدنا) يتوافق مع mRNA (بدوره الجين). لكن كفاءة هذه الطريقة أقل نسبيًا.

بناء مكتبات (كدنا):

يمكن استنساخ جزيئات الحمض النووي التكميلية في ناقلات الاستنساخ (على سبيل المثال ، البلازميد) ، لإنشاء مكتبات (كدنا). يجب أن يكون لإدخال (كدنا) في المتجه الاتجاه الصحيح. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة رابط اصطناعي إلى cDNA مزدوج الشريطة. في تقنية طورها Okayama and Berg (1982) ، يتم ربط mRNA أولاً بناقل استنساخ البلازميد ثم يتم إجراء تخليق cDNA.

RT-PCR كبديل لاستنساخ (كدنا):

يمكن أن يؤدي النسخ العكسي الذي يتبعه PCR (RT-PCR) إلى تضخيم mRNA لإعطاء cDNA. يعتبر RT-PCR سريعًا جدًا وبالتالي يمكن الحصول على جزيئات (كدنا) في فترة قصيرة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام mRNAs طويلة الطول بشكل ملائم في RT-PCR. هناك بعض العيوب أيضًا في RT-PCR.إن بوليميراز الحمض النووي المستخدم في RT-PCR معرض للخطأ ، وحتى تلوث دقيق جدًا بالـ mRNA (مع mRNAs الأخرى) سيعطي نتائج خاطئة.

استراتيجيات الفرز:

بمجرد إنشاء مكتبة DNA أو مكتبة cDNA ، يجب فحص الحيوانات المستنسخة (أي خطوط الخلايا) لتحديد استنساخ معين. تعتمد تقنيات الفرز في الغالب على تسلسل الاستنساخ أو هيكل / وظيفة منتجها.

الفحص عن طريق تهجين الحمض النووي:

يمكن تحديد التسلسل المستهدف في DNA باستخدام مسبار DNA (الشكل 9.5). بادئ ذي بدء ، يتم تحويل الحمض النووي ذي الأهمية المزدوجة إلى خيوط مفردة عن طريق الحرارة أو القلويات (تمسخ). يتم فصل خيوط DNA عن طريق الارتباط بمصفوفة صلبة مثل النيتروسليلوز أو غشاء النايلون.

الآن ، تتم إضافة الخيوط المفردة لمسبار الحمض النووي (100-1000 سنة مضت) المسمى بالنظائر المشعة. يحدث التهجين (أي الاقتران الأساسي) بين متواليات النوكليوتيدات التكميلية للحمض النووي المستهدف والمسبار. من أجل اقتران قاعدة مستقرة ، يجب أن تكون 80٪ على الأقل من القواعد في الخيطين (الحمض النووي المستهدف والمسبار) متطابقة. يمكن الكشف عن الحمض النووي المهجن بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي.

مجسات الحمض النووي:

يمكن تصنيع مجسات الحمض النووي المستخدمة لغرض الفحص بعدة طرق.

طريقة عشوائية التمهيدي:

يمكن إنتاج بادئات الحمض النووي التي تحمل علامات النظائر المشعة بواسطة هذه التقنية (الشكل 9.6). يتم تغيير طبيعة الحمض النووي مزدوج الشريطة الذي يحتوي على التسلسل اللازم للعمل كمسبار. خليط من الأوليغنوكليوتيدات الاصطناعية ، مع كل التوليفات الممكنة من القواعد (A ، G ، C ، T) ، بطول 6 نيوكليوتيدات تعمل كل منها كأساس. سيتم تهجين بعض هذه البادئات ذات التسلسلات التكميلية مع قالب الحمض النووي. يحدث هذا بالصدفة تمامًا والاحتمال جيد إلى حد معقول.

من خلال إضافة أربعة ديوكسي ريبونوكليوتيدات (أحدها مُلصق إشعاعيًا) وفي وجود إنزيم بوليميريز DNA للإشريكية القولونية (جزء Klenow) ، يتم تمديد البادئات على قالب DNA. منذ استخدام الملصق المشع ، يتم تصنيف أجزاء الحمض النووي المركبة حديثًا في الأماكن المناسبة ، وهذه هي مجسات الحمض النووي. يمكن إنتاج عدد من تحقيقات الحمض النووي المسمى من نموذج DNA غير محدد.

تحقيقات الحمض النووي غير النظيرية:

لإنتاج مجسات الحمض النووي غير النظيرية ، يتم تمييز أحد الديوكسينوكليوتيدات الأربعة (المستخدمة لتمديد التمهيدي الموصوف أعلاه) بعلامة (على سبيل المثال ، البيوتين). يمكن الكشف عن ملصق تحقيقات الحمض النووي باستخدام التفاعلات الكيميائية والإنزيمية.

الفرز بواسطة تهجين المستعمرة:

يمكن اكتشاف تسلسل الحمض النووي في المستعمرات المحولة عن طريق التهجين باستخدام مجسات الحمض النووي المشعة (يمكن أيضًا استخدام تحقيقات RNA المسمى أحيانًا). يشار إلى تقنية تهجين المستعمرة أيضًا باسم الطلاء المتماثل من قبل بعض المؤلفين. الطريقة الموضحة في الشكل 9.7 موصوفة بإيجاز.

تزرع الخلايا المحولة كمستعمرات على الصفيحة الرئيسية. يتم نقل عينات من كل مستعمرة إلى مصفوفة صلبة مثل النيتروسليلوز أو غشاء النايلون. يتم إجراء النقل بعناية للاحتفاظ بنمط المستعمرات على اللوحة الرئيسية. وهكذا ، تحتوي ورقة النيتروسليلوز على نمط نسخ من مستعمرات اللوحة الرئيسية. يتم فصل خلايا المستعمرة وإزالتها.

يتم تغيير طبيعة الحمض النووي وربطه بالمصفوفة بشكل لا رجعة فيه. الآن يضاف مسبار DNA ذو العلامات الإشعاعية والذي يتهجين مع الحمض النووي المستهدف التكميلي. يتم غسل جزيئات المسبار غير المهجنة. يمكن التعرف على المستعمرة ذات المسبار المهجن على جهاز التصوير الشعاعي. يمكن عزل خلايا هذه المستعمرة (من اللوحة الرئيسية) واستزراعها.

في كثير من الأحيان يتم اكتشاف مستعمرات متعددة عند التهجين بواسطة مسبار الحمض النووي. هذا بسبب التسلسلات المتداخلة. لتحديد أي مستعمرة لديها التسلسل الكامل للجين المستهدف ، ستكون البيانات التي تمت ملاحظتها من تحليل نوكلياز التقييد مفيدة.

تعديلات تقنية تهجين المستعمرة:

تم إجراء العديد من التحسينات في تقنية تهجين المستعمرات ، الموصوفة أعلاه ، في السنوات الأخيرة. في تقنية رفع البلاك ، يتم تطبيق ورق النيتروسليلوز مباشرة على السطح العلوي للوحة أجار الرئيسية مما يجعل الاتصال المباشر. بهذه الطريقة ، يمكن رفع اللويحات ويمكن عمل العديد من طبعات الحمض النووي المتطابقة من لوحة واحدة. هذه التقنية تزيد الموثوقية. في الآونة الأخيرة ، يتم فحص مكتبات الحمض النووي بواسطة تقنيات آلية.

الفرز بواسطة PCR:

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) جيد مثل تقنية التهجين لفحص مكتبات الحمض النووي. لكن المعلومات الكافية (عن تسلسل الصراخ للحمض النووي المستهدف) يجب أن تكون متاحة لإعداد البادئات لهذه الطريقة. يتم الحفاظ على المستعمرات في ألواح متعددة الجدران ، ويتم فحص كل بئر بواسطة PCR ويتم تحديد الآبار الإيجابية.

الفحص بالمقايسة المناعية:

يمكن استخدام تقنيات المناعة للكشف عن بروتين أو عديد ببتيد ، يتم تصنيعه بواسطة جين (من خلال النسخ متبوعًا بالترجمة). الإجراء المتبع للمقايسة المناعية وتقنية التهجين (الموصوفة بالفعل) قابلة للمقارنة تمامًا. تم توضيح إجراء الفحص بالمقايسة المناعية في الشكل 9.8 ، وتم وصفه بإيجاز أدناه.

تزرع الخلايا كمستعمرات على لوحات رئيسية والتي يتم نقلها إلى مصفوفة صلبة (أي النيتروسليلوز). ثم تتعرض المستعمرات للتحلل وترتبط البروتينات المنبعثة بالمصفوفة. يتم بعد ذلك معالجة هذه البروتينات بجسم مضاد أولي يرتبط على وجه التحديد بالبروتين (يعمل كمستضد) ، مشفرًا بواسطة الحمض النووي المستهدف. بعد إزالة الجسم المضاد غير المرتبط عن طريق الغسيل ، يتم إضافة جسم مضاد آخر يرتبط بشكل خاص بالجسم المضاد الأول.

مرة أخرى ، يتم إزالة الأجسام المضادة غير المقيدة عن طريق الغسيل. يحمل الجسم المضاد الثاني ملصق إنزيم (على سبيل المثال ، بيروكسيداز محمر الحصان أو فوسفاتيز قلوي) مرتبط به. تم تصميم عملية الكشف بحيث يتم تشكيل منتج ملون باعتباره ركيزة عديمة اللون. يتم تحديد المستعمرات التي تعطي نتيجة إيجابية (أي البقع الملونة). يمكن استنبات خلايا مستعمرة معينة من الصفيحة الرئيسية.

الفرز بوظيفة البروتين:

إذا كان الحمض النووي المستهدف لمكتبة الجينات قادرًا على تخليق بروتين (خاصة إنزيم) لا يتم إنتاجه عادةً بواسطة الخلية المضيفة ، فيمكن استخدام نشاط البروتين للفحص. يتم استخدام ركيزة معينة ، ويشير استخدامها من قبل مستعمرة من الخلايا إلى وجود إنزيم. على سبيل المثال ، يمكن تحديد ترميز الجينات لأنزيمات α-amylase و β-glucosidase بواسطة هذه التقنية.


عزل الجينات واستنساخ الحمض النووي | التكنولوجيا الحيوية

في هذه المقالة سوف نناقش حول عزل الجينات واستنساخ الحمض النووي.

تكوين مجموعات جديدة من المادة الوراثية عن طريق إدخال الحمض النووي المنتج خارج الخلية في فيروس أو بلازميد بكتيري أو أي نظام ناقل آخر للسماح بدمجها في كائن حي مضيف يكون فيه قادرًا على التكاثر المستمر والتعبير يسمى الهندسة الوراثية.

يشار إلى التقنيات المعنية أيضًا باسم الاستنساخ الجيني ، أو التلاعب الجيني في المختبر أو التكنولوجيا المؤتلفة. يحدث نقل المادة الجينية بين الأفراد في الطبيعة عن طريق الاقتران والتنبيغ والتحول.

مهما كان الهدف طويل المدى لمشروع البيولوجيا الجزيئية ، فإن الهدف الأولي عادة هو عزل جين واحد أو جزء آخر محدد من الحمض النووي من الكائن الحي قيد الدراسة. هذه هي الخطوة الأولية الأساسية لتسلسل الحمض النووي ، لفحص ملف تعريف التعبير للجين ، أو لتنقية البروتين المشفر بواسطة الجين.

يمكن تحقيق هذا الهدف الأولي بإحدى طريقتين:

أنا. عن طريق استنساخ الحمض النووي ، والذي يتضمن إدخال جزيء الدنا المرغوب في ناقل الاستنساخ متبوعًا بتكرار ناقل الاستنساخ في مزرعة بكتيريا الإشريكية القولونية؟

ثانيا. عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل ، الذي ينطوي على تضخيم إنزيمي لجزء الحمض النووي المطلوب؟

& # 8216Gene Cloning & # 8217 هي طريقة لعزل منطقة معينة من الحمض النووي وإنتاج ملايين النسخ المتطابقة من الحمض النووي (الجين) داخل ثقافة الخلايا الميكروبية.

الخطوات الأساسية في تجربة استنساخ الجينات هي:

أنا. عزل وتنقية الحمض النووي

ثانيا. قطع الحمض النووي في المواقع المطلوبة بنفس إنزيمات التقييد.

ثالثا. ربط (ربط) قطعة الحمض النووي المطلوبة إلى ناقل

رابعا. غرس المتجه في الخلية المضيفة عن طريق التحول

v. اختيار المحولات

السادس. تتكاثر جزيئات الحمض النووي المؤتلف داخل الخلايا المضيفة.

السابع. عندما تنقسم الخلية المضيفة ، يتم تمرير نسخ من جزيئات الحمض النووي المؤتلف إلى النسل.

ثامنا. ينتج عن النسخ المتماثل المستمر للخلايا المضيفة استنساخ ، يتكون كل منها من خلايا متطابقة تحتوي جميعها على نسخ من جزيء DNA مؤلف واحد.

ينتج عن هذه السلسلة من التلاعبات مكتبة استنساخ ، تضم العديد من الحيوانات المستنسخة المختلفة ، كل منها يحمل جزءًا مختلفًا من الحمض النووي الأصلي. وبالتالي فإن الخطوة التالية هي تحديد الاستنساخ الذي يحتوي على الجين محل الاهتمام PCR في الخطوط العريضة - يعتبر PCR نهجًا مختلفًا تمامًا لعزل قطعة DNA.

بدلاً من سلسلة طويلة من التلاعب بالخلايا الحية ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل عبارة عن تفاعل أنبوب اختبار يتم تنفيذه ببساطة عن طريق خلط الكواشف المناسبة معًا واحتضانها في دورة حرارية ، وهي قطعة من المعدات التي تتيح تغيير درجة حرارة الحضانة على مدى الوقت بطريقة مبرمجة مسبقًا.

الخطوات الأساسية في تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل هي كما يلي ، يتم تحضير الحمض النووي من الكائن الحي الذي تتم دراسته وتحريفه عن طريق التسخين إلى 94 درجة مئوية. يضاف زوج من النيوكليوتيدات إلى الحمض النووي ، حيث تمكنها تسلسلات هذه الأوليغنوكليوتيدات من أن تصلب جانبي الجين أو قطعة أخرى من الحمض النووي التي سيتم عزلها ، ويتم تبريد الخليط إلى 50-60 درجة مئوية بحيث تلتصق هذه الأوليغنوكليوتيدات مواقعهم المستهدفة.

يضاف بوليميراز DNA القابل للحرارة مع إمداد ديوكسي ريبونوكليوتيدات ويتم تسخين الخليط إلى درجة الحرارة المثلى لتخليق الحمض النووي. تتكرر دورة التمسخ - التلدين - التمديد من 25 إلى 30 مرة ، مع مضاعفة عدد جزيئات الدنا المركبة حديثًا خلال كل دورة. ينتج عن هذا التضخيم الأسي تخليق عدد كبير من نسخ تسلسل الحمض النووي المحاط بزوج من قليل النيوكليوتيدات.

التقنيات الأساسية اللازمة للاستنساخ و PCR هي:

4. فصل DNA و RNA بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام

5. تنقية جزيئات الحمض النووي من المواد الهلامية الكهربائية

6. بناء جزيئات الحمض النووي المؤتلف

7. إدخال الجزيئات المؤتلفة في الخلايا المضيفة واختيار المؤتلف

تعد القدرة على زراعة ثقافات نقية من البكتيريا بما في ذلك الثقافات المصابة بالعاثيات واحدة من أهم المهارات العملية التي يمكنك القيام بها كعالم ميكروبيولوجي. وذلك لأن معظم تجارب استنساخ الجينات تستخدم بكتيريا E. coli ككائن حي مضيف. حتى لو كان الهدف على المدى الطويل هو استنساخ جين في كائن حي غير الإشريكية القولونية ، فسيتم تنفيذ التلاعب الأولي في الإشريكية القولونية بسبب السهولة التي يمكن بها التعامل مع هذه البكتيريا.

بالنسبة للكثيرين ، فإن أول بيولوجيا جزيئية حقيقية يتم تجربتها هي تنقية الحمض النووي من الكائن الحي قيد الدراسة.

يعد تحضير الحمض النووي الريبي النقي والسليم أمرًا صعبًا نسبيًا بسبب انتشار الإنزيمات الملوثة التي تعمل على تحلل جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA). يمكن تعطيل RNases الموجودة في الخلايا التي يتم استخراج الحمض النووي الريبي منها أثناء إجراء التنقية بواسطة مثبط RNase مناسب ، ولكن يمكن تقديم مشاكل كبيرة بواسطة الأواني الزجاجية والمحاليل الملوثة بـ RNases المستمدة من إفرازات الجلد. هذه الإنزيمات شديدة المقاومة للعلاجات الفيزيائية ، حتى أن بعضها يتحمل التعقيم ويمكن أن يكون التحكم فيها مشكلة. يمكن أيضًا استخدام RNA بدلاً من DNA كمواد أولية لـ PCR.

فصل الحمض النووي والحمض النووي الريبي بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي:

يتم فصل جزيئات الحمض النووي والحمض النووي الريبي ذات الأحجام المختلفة عن طريق الرحلان الكهربائي في [اغروس) أو ، في حالات نادرة ، هلام بولي أكريلاميد. يتم تشغيل المواد الهلامية Agarose بشكل روتيني لتقدير أحجام جزيئات DNA و RNA ، مما يتيح تقييم نجاح تقنية تحضيرية أو معالجة إنزيمية. الاغاروز الكهربائي للهلام هو أيضا أولية لتحليل جزيئات الحمض النووي من خلال تقنيات مثل التهجين الجنوبي.

تنقية جزيئات الحمض النووي من المواد الهلامية الكهربائية:

يوجد في بعض مجالات البيولوجيا الجزيئية عدد من الإجراءات البديلة لتحقيق نفس الهدف.

1. إن تنقية جزيئات الدنا من المواد الهلامية هي إحدى هذه الحالات. في كثير من الأحيان ، سيوفر هلام agarose أو polyacrylamide نطاقًا يمكن التعرف عليه بثقة على أنه يحتوي على جزء من الحمض النووي موضع الاهتمام.

2. قد تكون الخطوة التالية هي استئصال الشريط وتنقية جزيئات الحمض النووي قبل بناء جزيئات الحمض النووي المؤتلف وإجراء مزيد من الدراسة.

بناء جزيئات الحمض النووي المؤتلف:

تتمثل الخطوة الحقيقية الأولى في تجربة استنساخ الجينات في بناء جزيئات مؤتلفة عن طريق إدخال شظايا الحمض النووي في جزيئات ناقلات.

إدخال الجزيئات المؤتلفة في الخلايا المضيفة واختيار المؤتلف:

بمجرد تكوين جزيئات الحمض النووي المؤتلف يجب إدخالها في خلايا الإشريكية القولونية. هذا هو أسلوب مستقيم للأمام ومعيار لأنواع مختلفة من المتجهات.

يجب أن يكون واضحًا الآن أن اختيار متجه الاستنساخ هو أمر مهم. يجب أن تحدد طبيعة الإجراء المستخدم لإدخال الجزيئات المؤتلفة في الخلايا المضيفة ويجب أن تحدد الطريقة التي يتم بها اختيار المواد المؤتلفة.

من المهم اختيار ناقل مناسب لحجم شظايا الحمض النووي التي ترغب في استنساخها ، حيث أن بعض النواقل مصممة لشظايا صغيرة نسبيًا (5 كيلو بايت وأقل) بينما يتطلب البعض الآخر شظايا أكبر من حجم معين.


عزل الحمض النووي الجيني

تعتبر الإنتاجية والنقاء والنزاهة ضرورية للأداء في تطبيقات المصب مثل PCR والتسلسل. تحسين منهجيات الاستخراج هو مفتاح النجاح مع أنواع العينات الصعبة وتطبيقات المصب. يجب أن يكون الحمض النووي المستهدف المنقى خاليًا من الملوثات ، بما في ذلك البروتينات والمكونات الخلوية الأخرى والأحماض النووية غير المرغوب فيها.

قد تكون هناك حاجة إلى مجموعات تنقية خاصة من نوع العينة لعينات أكثر تعقيدًا وصعوبة تحتوي على DNA متحلل أو تحتوي على تركيزات منخفضة من الحمض النووي. تشمل أنواع العينات الصعبة أنسجة FFPE أو البلازما أو المصل المحتوي على حمض نووي خالٍ من الخلايا أو عينات الطب الشرعي أو أي مصدر تكون فيه كمية العينة محدودة.

كانت Promega واحدة من أوائل الشركات التي قدمت مجموعات لتنقية الحمض النووي ، وكذلك البلازميدات ، مع أكثر من 30 عامًا من الخبرة في استخراج الحمض النووي. نحن نقدم مجموعة واسعة من مجموعات استخراج الحمض النووي الجينومي المناسبة لمجموعة متنوعة من أنواع العينات واحتياجات الإنتاجية ، مما ينتج عنه عوائد عالية وحمض نووي عالي الجودة لاستخدامه في تطبيقاتك النهائية. تغطي منتجاتنا مجموعة متنوعة من خيارات الإنتاجية وطرق المعالجة المناسبة لاحتياجاتك الخاصة و [مدش] من الإعدادات الفردية اليدوية إلى الأنظمة الآلية الصغيرة أو الكبيرة الحجم.

باستخدام الطرق القائمة على الدوران أو الفراغ أو المغناطيسية ، فإن حلول الإعداد الفردي اليدوية لدينا هي الأفضل لمعالجة أقل من 24 عينة في المرة الواحدة. إذا كنت تبحث عن حل تلقائي ، فإن أطقمنا التي تعتمد على الخرطوشة للاستخدام مع Maxwell & reg Instruments يمكنها معالجة ما يصل إلى 48 عينة في نفس التشغيل. نقدم أيضًا خيارات استخراج عالية الإنتاجية مؤتمتة بالكامل باستخدام طرق معالجة قائمة على الألواح ، متوافقة تمامًا مع منصات معالجة السوائل.

على الرغم من أن تقنيات مثل النشاف الجنوبي ، والتي تتطلب كميات ميكروغرام من الحمض النووي ، لا تزال تُجرى في مختبرات البيولوجيا الجزيئية ، إلا أن معظم تقييمات الحمض النووي الصبغي تتم بواسطة تقنيات تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). وتشمل هذه PCR أحادي أو متعدد الإرسال ، مصفوفات SNP ، التحليل و PCR في الوقت الحقيقي ، ddPCR وتسلسل الجيل التالي (NGS). تستخدم هذه التقنيات الأخيرة كميات نانوجرام من الحمض النووي لكل تفاعل. بغض النظر عن النظام المختار ، توفر مجموعات تنقية الحمض النووي الجينومي من Promega العوائد المطلوبة من الحمض النووي عالي الجودة مع الحد الأدنى من الملوثات.

أنظمة التنقية اليدوية

الأنظمة القائمة على الحلول

تقدم Promega أنظمة عزل الجينوم DNA على أساس تحلل العينة بواسطة المنظفات والتنقية بطرق مختلفة. وتشمل هذه الأنظمة القائمة على الغشاء (على سبيل المثال ، نظام تنقية الحمض النووي الجيني (Cat. # A2360 ، A2361) أو نظام تنقية الحمض النووي الجيني عالي الإنتاجية ، 96-well Wizard & reg SV 96 Genomic DNA Purification System (Cat. # A2370 ، A2371) وأنظمة السيليكا المغناطيسية المؤتمتة بسهولة. كل هذه الأنظمة تنقي الحمض النووي الجيني القابل للاستخدام في العديد من التطبيقات النهائية.

إن مجموعة أدوات تنقية DNA الجينومية Wizard & reg (Cat. # A1120 ، A1125 ، A1620) هي نظام متعدد الاستخدامات وقابل للتطوير لعزل الحمض النووي الجيني باستخدام طريقة تعتمد على الترسيب. مع هذا النظام وحده ، يمكن عزل الحمض النووي الصبغي من الدم الكامل (5) ، أوراق النبات (6) ، البكتيريا موجبة الجرام (7) والبكتيريا سالبة الجرام (8) ، ذيل الفأر (9) والخميرة (10). كما تم استخدام أنواع عينات إضافية مثل الفطريات (11) وأنسجة الضفادع المصابة المضمنة في البارافين (12) واللعاب (13) وخنافس الدقيق (14) بنجاح.

لا ينجح نظام تنقية الجينوم هذا مع العديد من أنواع العينات فحسب ، بل يمكن أيضًا تحجيمه بسهولة من أجل كمية مواد البدء عن طريق ضبط أحجام الكاشف لتلائم احتياجاتك.

الأنظمة المستندة إلى العمود

الأنظمة التقليدية القائمة على الأعمدة

للعزل أحادي العمود ، يوفر نظام Wizard® SV Genomic DNA Purification System تقنية سريعة وبسيطة لتحضير الحمض النووي المنقى والسليم من ذيول الفأر والأنسجة والخلايا المستنبتة في أقل من 20 دقيقة ، اعتمادًا على عدد العينات المعالجة (حتى 24 عن طريق الطرد المركزي ، اعتمادًا على حجم الدوار ، أو حتى 20 عن طريق التفريغ). يتم استخدام مشعب فراغ أو جهاز طرد مركزي صغير لمعالجة العينات. مع بعض التعديلات ، يمكن أيضًا استخدام الدم الكامل مع نظام العزل هذا (15). هذا نظام قائم على غشاء السيليكا ، مما يعني أن هناك قيودًا على كمية المواد التي يمكن تحميلها على عمود SV واحد يصل إلى 20 مجم من الأنسجة (ذيل فأر أو نسيج حيواني) أو بين 1 × 10 4 و 5 × 10 6 يمكن معالجة خلايا زراعة الأنسجة لكل عملية تنقية. مع المزيد من العينة ، قد تحتاج المحللة المعدة إلى تقسيمها بين عمودين أو أكثر لتجنب الانسداد.

الشكل 2. تضخيم الحمض النووي المعزول من مصادر الأنسجة المختلفة باستخدام Wizard & reg SV Genomic DNA DNA Purification System. تم تضخيم ميكروليتر واحد من الحمض النووي الجيني المنقى باستخدام PCR Master Mix (Cat. # M7502) وأشعال IL-1 و beta الخاصة بالماوس (منتج 1.2 كيلوبايت). تم إجراء التفاعلات مع DNA الجينوم الماوس (Cat. # G3091 + C) وبدون DNA (& ndashC) كعناصر تحكم إيجابية وسلبية ، على التوالي. كانت ظروف التدوير الحراري: دورة واحدة مدتها 3 دقائق عند 95 درجة مئوية تليها 30 دورة: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 70 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة و 30 ثانية تمديد نهائي عند 70 درجة مئوية لمدة 7 دقائق 4 درجة مئوية ونقعها. احتوت جميع الممرات على 10 ميكرول من منتج التفاعل مفصولة على هلام الاغاروز 1٪. تم تصور منتجات PCR بواسطة تلطيخ بروميد الإيثيديوم.تشير التعيينات & ldquoSpin & rdquo و & ldquoVacuum & rdquo إلى البروتوكول المستخدم لعزل الحمض النووي الجيني.

الحمض النووي الجينومي المعزول بنظام تنقية DNA الجينومي Wizard® SV ذو جودة عالية ويعمل بشكل جيد في تحليل هلام الاغاروز وهضم إنزيمات التقييد وتحليل PCR كما هو موضح في الشكل 2. يقدم الجدول 1 حصائل نموذجية من الحمض النووي الجيني المنقى من مجموعة متنوعة مصادر.

الجدول 1. إنتاجية الحمض النووي الجينومي النموذجي من أنسجة مختلفة باستخدام نظام Wizard® SV Genomic DNA Purification System.

عينة كمية متوسط ​​العائد
قص الذيل 20 ملغ 20 ميكروغرام
كبد 20 ملغ 15 ميكروغرام
قلب 20 ملغ 10 ميكروغرام
مخ 20 ملغ 6 ميكروغرام
خلايا CHO 1 × 10 6 5 ميكروغرام
خلايا NIH / 3T3 1 × 10 6 9 ميكروغرام
293 خلية 1 × 10 6 8 ميكروغرام

استخدم الباحثون هذا النظام البسيط والسريع للعديد من أنواع العينات الإضافية والتطبيقات بما في ذلك البعوض (16) ، والخلايا الجذعية للثدي (17) ، العصوية الرقيقة (18), الإشريكية القولونية (19) ، شكل اليرقات من البلهارسيا المنسونية طفيلي (20) والحمض النووي الفيروسي من خلايا BC3 المصابة بفيروس Kaposi & rsquos sarcoma (21).

للحصول على عزل عالي الإنتاجية ، 96 بئرًا ، يتوفر نظام Wizard & reg SV 96 Genomic DNA Purification System. يمكن عزل الحمض النووي الجيني القابل للتضخيم من 5 مرات أو 10 6 خلايا ، أو 20 مجم من الأنسجة أو ما يصل إلى 1.2 سم من طرف ذيل الفأر دون الطرد المركزي للمحلول قبل التنقية.

يتطلب نظام مولتيويل هذا مشعب فراغ (Vac-Man & reg 96 Vacuum Manifold، Cat. # A2291) ومضخة تفريغ قادرة على توليد 15 & ndash20 بوصة من الزئبق أو ما يعادلها. تم عزل الحمض النووي الجينومي من ثلاثة أنواع مختلفة من المصادر ثم استخدم في PCR أحادي الاتجاه وتشغيله على هلام agarose كما هو موضح في الشكل 3. الشكل 4 يقارن العائد من ثلاثة أساليب Wizard & reg SV الجينومية لتنقية الحمض النووي (لوحة 96 بئر ، فراغ وطرد مركزي ).

الشكل 3. الرحلان الكهربي لهلام Agarose من منتجات PCR تضخيم من 1 & microl من ذيل الفأر وخلايا CHO وعينة أوراق الطماطم المعزولة الحمض النووي الجيني باستخدام Wizard & reg SV 96 Genomic DNA Purification System. يتم عرض إجمالي 10 ميكرول من منتج PCR على هلام agarose 1.5٪ ملطخ ببروميد الإيثيديوم. اللوحة أ. تضخيم IL-1 و beta (1.2 كيلو بايت) من ذيل الفأر. اللوحة B. & بيتا أكتين (250 نقطة أساس) تضخيمًا من خلايا CHO. لوحة C. تم تضخيم الحمض النووي للبلاستيدات الخضراء (600 نقطة أساس) من أوراق الطماطم. Lane M ، 1 كيلوبايت DNA Ladder (Cat. # G5711).

الشكل 4. مقارنة غلات الحمض النووي باستخدام Wizard & reg SV و SV 96 Genomic DNA Purification Systems. متوسط ​​إنتاج الحمض النووي الجيني بالميكروغرام المنقى من قصاصات ذيل الفأر 20 ملغ. متوسط ​​أ260280 النسب هي: SV 96 ، 1.7 & plusmn 0.08 SV طريقة فراغ ، 1.7 & plusmn 0.14 SV طريقة الدوران ، 1.7 & plusmn 0.14.

أنظمة قائمة على الأعمدة عالية الأداء

نحن نقدم نوعين مختلفين من أنظمة ReliaPrep & trade gDNA Miniprep التي تنقي الحمض النووي الجيني باستخدام طريقة قائمة على عمود السليلوز: نظام ReliaPrep & trade Blood gDNA Miniprep (Cat. # A5081، A5082) و ReliaPrep & trade gDNA Tissue Miniprep System (Cat. # A2051، A2052). كلاهما نظامان جاهزان للاستخدام يحصلان على الحمض النووي الجيني السليم دون استخدام غسولات الإيثانول أو الترسبات. يعالج نظام ReliaPrep & trade Blood gDNA Miniprep 200 & مول من الدم أو سوائل الجسم ، سواء كانت طازجة أو مجمدة ، في أقل من 40 دقيقة. المحصول من الدم عادة 4 & ndash10 & mug ، وهذا يتوقف على عدد خلايا الدم البيضاء. يمكن معالجة ما يصل إلى 25 مجم من الأنسجة ، أو مسحة من الخد (الخد) أو ذيل فأر 1 سم باستخدام نظام Miniprep للأنسجة ReliaPrep & trade gDNA والحمض النووي الذي تم استعادته في 30 دقيقة أو أقل. يمكن استخلاص الحمض النووي المنقى في أقل من 50 ومايكرول ومناسب للاستخدام في تطبيقات المصب مثل RT-qPCR.

الشكل 5. إنتاجية الحمض النووي الجيني من نظام ReliaPrep & trade Blood gDNA Miniprep يختلف باختلاف عدد خلايا الدم البيضاء. تم الحصول على دم كامل من عدة أفراد ، وتم تحديد تعداد خلايا الدم البيضاء باستخدام مقياس الكريات. تم استخدام مائتي ميكرولتر من الدم لتنقية الحمض النووي الجيني (ن = 3 أو 4) ، وتم تحديد كمية gDNA المعزول بواسطة التحليل الطيفي للامتصاص.

الشكل 6. مقارنة حجم الشطف مع التركيز والمحصول والنقاء. تمت معالجة قسامات الدم (200 & mul) باستخدام نظام ReliaPrep & trade Blood gDNA Miniprep (ن = 4) وتم التصفية منه باستخدام 30 & ndash200 & mul من المياه الخالية من نوكلياز. تركيز (لوحة أ) ، إجمالي العائد (لوحة ب) والنقاء (لوحة ج) باستخدام التحليل الطيفي الامتصاصية. انخفض المحصول بشكل طفيف مع انخفاض في حجم الشطف ، بينما زاد التركيز. ظلت النقاء المقاسة بنسب الكثافة الضوئية ثابتة.

الأنظمة الآلية لتنقية الحمض النووي

بينما تحاول المختبرات تحسين الإنتاجية للبحث والتشخيص والاختبار التطبيقي ، ازدادت الحاجة إلى أتمتة عمليات التنقية سهلة الاستخدام ومنخفضة إلى متوسطة الإنتاجية. تقضي الأتمتة على الوقت العملي والعمل في التنقية اليدوية ، مما يمنحك المزيد من الوقت والطاقة للتركيز على بحثك.

الأنظمة المعتمدة على الخرطوشة

تقليديا ، تشير الأتمتة إلى استخدام معدات كبيرة ومتخصصة ومكلفة تتطلب تدريبًا مكثفًا للتشغيل والصيانة. طورت Promega أنظمة Maxwell® ، التي توفر بدائل مرنة وموثوقة ومضغوطة وسهلة الاستخدام للأنظمة الآلية التقليدية.

تم تصميم أنظمة Maxwell® للتنقية المؤتمتة والفعالة من مجموعة واسعة من أنواع العينات (انظر الجدول 2). يتم تزويد أجهزة Maxwell® بطرق تنقية آلية مبرمجة مسبقًا ، ويمكنها معالجة ما يصل إلى 48 عينة في أقل من 30-40 دقيقة (حسب الأداة ونوع العينة والطريقة). الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المركز المنقى بجودة عالية وعائد مرتفع ، مما يجعلها متوافقة مع العديد من التطبيقات النهائية الشائعة ، بما في ذلك qPCR و ddPCR والتنميط الجيني والتسلسل و NGS.

الشكل 7. Maxwell® RSC (يسار) و Maxwell® RSC 48 (يمين).

الجدول 2. العائد الحمض النووي من أنواع العينات المختلفة بعد التنقية باستخدام Maxwell & reg RSC Instrument and DNA Purification Kits.

ما يصل إلى 50 ملغ من أنسجة الكبد
ما يصل إلى 50 ملغ من أنسجة الرئة

تقدم Maxwell & reg Kits خراطيش كاشف معدة مسبقًا لتنقية الحمض النووي الجيني والحمض النووي الريبي والحمض النووي الكلي. مجموعات التطبيقات والعينات التي تركز على نوع العينة تجعل من Maxwell & reg Instruments أداة استخراج متعددة الاستخدامات للمختبرات التي قد تعمل مع واحد أو كل هذه التطبيقات المختلفة.

الشكل 8. تبدأ طرق استخراج Maxwell® RSC DNA أو RNA بخراطيش مملوءة مسبقًا بكواشف تنقية وجزيئات مغناطيسية جاهزة لعيناتك. بعد إضافة العينة ، يحرك Maxwell® RSC الجسيمات البارامغناطيسية والأحماض النووية المرتبطة بها من خلال خطوات متعددة ينتج عنها في النهاية RNA أو DNA عالي النقاء في 30-100 ميكرولتر.

تعمل أنظمة Maxwell & reg على تنقية العينات باستخدام الجسيمات شبه المغناطيسية (PMPs) ، والتي توفر مرحلة صلبة متحركة تعمل على تحسين التقاط العينات وغسلها وشطف الحمض النووي. تعد Maxwell & reg Instruments أدوات معالجة الجسيمات المغناطيسية التي تربط الأحماض النووية بكفاءة بالجسيمات البارامغناطيسية في البئر الأول لخرطوشة مملوءة مسبقًا. تتم معالجة العينات من خلال سلسلة من الغسل قبل التصفية من الحمض النووي. تتجنب المنهجية القائمة على الجسيمات المغناطيسية المنتظمة المستخدمة من قبل Maxwell & reg Instruments المشكلات الشائعة المرتبطة بأنظمة التنقية القائمة على معالجات السوائل الآلية ، مثل الأطراف المسدودة أو عمليات النقل الجزئية للكواشف ، والتي يمكن أن تؤدي إلى معالجة تنقية دون المستوى الأمثل.

إن أدوات Maxwell & reg المدمجة التي توضع فوق الطاولة سهلة الإعداد ولا تتطلب تدريبًا خاصًا للاستخدام. يتم تحميل الطرق المؤتمتة المُحسَّنة مسبقًا ، ويتم قطع خراطيش الكاشف المعبأة مسبقًا في مكانها ، وتضاف عينتك وتختار "ابدأ" لبدء الطريقة المناسبة. تتوفر قائمة كاملة بمجموعات استخلاص الأحماض النووية هنا.

تتوفر العديد من مجموعات كاشفات أجهزة Maxwell & reg وتسمح بالاستخراج الأمثل من مجموعة متنوعة من أنواع العينات ، بما في ذلك الدم والمصل والبلازما والأنسجة الثابتة بالفورمالين والمدمجة بالبارافين (FFPE) والبكتيريا والنباتات والأغذية والأنسجة الحيوانية.

تسمح أنظمة Maxwell & reg HT بتنقية الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي على نطاق واسع على أي معالج سائل في المختبر بتنسيق SLAS 24 أو 96 جيدًا. تستخدم كيمياء تنقية Maxwell & reg حلولًا جديدة قائمة على الجسيمات المغناطيسية تقلل بشكل طبيعي من انتقال التلوث.

بالإضافة إلى الكيمياء الموثوقة ، تحصل على دعم الخبراء لبدء التشغيل الآلي أو تحسين سير عمل HT الحالي. يمكن لفريق خبراء الأتمتة لدينا تقديم المساعدة مع معظم مزودي أتمتة المعامل الرائدين في العالم ومساعدتك في تطوير وتنفيذ حل آلي لتنقية الحمض النووي مخصص لاحتياجات مختبرك.

أطقم استخراج الحمض النووي الجينومي

هل تبحث عن خيارات الاستخراج حسب مقياس العينة أو النوع؟ استكشف مجموعة استخراج الحمض النووي الخاصة بنا لاكتشاف الحل المناسب لاحتياجات التنقية لديك.

حلول أتمتة قابلة للتطوير

توفر أجهزة Maxwell® RSC منصة مدمجة ومؤتمتة لتنقية الحمض النووي تعالج ما يصل إلى 16 عينة (Maxwell ® RSC) أو ما يصل إلى 48 عينة (Maxwell ® RSC 48) في وقت واحد.

كيمياء التنقية عالية الإنتاجية ودعم الأتمتة

تسمح كيمياء Maxwell® HT بأتمتة تنقية الحمض النووي على معالجات السوائل. يقدم فريق خبراء الأتمتة لدينا المساعدة للمساعدة في تطوير وتنفيذ حل آلي لتنقية الحمض النووي مخصص لاحتياجات مختبرك.

أنظمة عالية الإنتاجية لعزل الحمض النووي الجيني

تقدم Promega العديد من الخيارات الآلية عالية الإنتاجية لعزل عزل الحمض النووي الجيني من عينات الدم. بعض المختبرات ، مثل البنوك الحيوية ، لديها رغبة في عزل الحمض النووي من كميات كبيرة من المواد الأولية (على سبيل المثال ، 10 مل من الدم). يوفر نظام عزل ReliaPrep & trade HT gDNA الكبير الحجم (Cat. # A2751) وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الجيني المشتق من أجزاء الدم المشتقة من عينات 2.5 و ndash10ml من الدم الكامل. يمكن أتمتة هذه الكيمياء على معالجات السوائل باستخدام جهاز Promega HSM ، والذي يتيح معالجة تفاعلات التنقية في أنابيب مخروطية سعة 50 مل.

يعمل برنامج استشعار مستوى السائل وتشغيل الأجهزة على قياس الكيمياء لأخذ عينات من حجم المدخلات لكل عينة فردية ، مما يقلل من نفايات الكاشف والمصاريف. يمكن للنظام الآلي أيضًا معالجة العينة في أنابيب 14 مل باستخدام محول الحجم المنخفض XAT1020 (LVA والطرق) الذي يتيح معالجة العينات من 0.25 و ndash3ml.

لا توجد خطوات طرد مركزي مملة أو مواد كيميائية خطرة ، والتي تتعامل بطبيعتها مع محطة العمل ، وتقدم تنقية سريعة للحمض النووي الجيني من الدم الكامل ، بغض النظر عن ظروف تخزين العينات أو الشحن.

الشكل 9. تم عزل الحمض النووي من الدم الكامل عبر ثلاث طرق ، تم فصلها عن طريق الفصل الكهربائي للهلام CHEF وتم تصورها بواسطة تلطيخ بروميد الإيثيديوم. الحمض النووي المعزول باستخدام نظام عزل HT gDNA كبير الحجم من ReliaPrep & trade زود الحمض النووي بنطاق حجم من 20 إلى 125 كيلو بايت تنقية تعتمد على الترسيب معزولة للحمض النووي بنطاق حجم من 20 إلى 200 كيلو بايت بينما أظهرت الطرق القائمة على العمود جدنا بحجم 20-75 كيلو بايت.

هناك خيار لعزل إنتاجية منخفضة لـ gDNA من ما يصل إلى 32 عينة في وقت واحد عند استخدام Heater Shaker Magnet Instrument (HSM 2.0 Cat. # A2715) على مقعد مقابل مدمج في معالج سائل حيث يقوم المستخدم بالتوزيع والنفط الكواشف من العينات حسب توجيهات البرنامج على شاشة الكمبيوتر. تتحكم الطرق المبرمجة مسبقًا في التسخين والرج والمغنطة وتوقيت الخطوات المطلوبة للتنقية شبه الآلية.

بالإضافة إلى الدم الكامل ، يمكن أيضًا معالجة مجموعة متنوعة من أنواع العينات الأخرى ، بما في ذلك اللعاب المستقر ، وعينات غسيل الخد ، وكسور الدم ، والمعاطف المغطاة بالدم ، وكريات الخلايا الحمراء وجميع كريات الخلايا. للتنقية المؤتمتة بالكامل ، يمكن دمج جهاز HSM 2.0 مع محطة عمل آلية لمعالجة السوائل.

تتطلب أتمتة الكواشف على الأجهزة نهجًا مخططًا ومنفذًا بعناية. يتيح لك التعاون مع Promega الوصول إلى العلماء الذين صمموا تنقية آلية لمئات من المعامل ، عبر مجموعة واسعة من أنواع العينات.

تتطلب أتمتة الكواشف على الأجهزة نهجًا مخططًا ومنفذًا بعناية. يتيح لك التعاون مع Promega الوصول إلى العلماء الذين صمموا تنقية آلية لمئات من المعامل ، عبر مجموعة واسعة من أنواع العينات.

الشكل 10. غلات الحمض النووي الآلي لكسور الدم. يكون إنتاج الحمض النووي خطيًا فيما يتعلق بأحجام الدم الأصلية. لوحة أ. غلة الحمض النووي كما هو محدد بواسطة مقياس الطيف الضوئي NanoDrop. لوحة ب. غلة الحمض النووي كما هو محدد باستخدام نظام QuantiFluor & trade dsDNA. تم تحضير جميع العينات من متبرع واحد. تمت معالجة العينات اليدوية باستخدام Wizard & reg Genomic DNA Purification Kit. كل نقطة هي متوسط ​​n = 4 قيم مع أشرطة خطأ لانحراف معياري واحد.

تنقية الحمض النووي HT المخصص

قد يكون تنفيذ تقنيات تنقية الحمض النووي المؤتمتة على سير العمل عالي الإنتاجية تحديًا ويستغرق وقتًا طويلاً. يمكن لعلماء الدعم الميداني لدينا تقديم الدعم الذي تحتاجه للبدء.

مجموعات تنقية الحمض النووي المحددة حسب نوع العينة

تعرف على المزيد حول بعض مجموعاتنا المتخصصة أدناه ، واستكشف اتساع نطاق محفظتنا وقارن مجموعات استخراج الحمض النووي لدينا بمساعدة صفحة مقارنة منتجاتنا لاكتشاف الحل المناسب لاحتياجات تنقية الحمض النووي الخاصة بك.

عزل الحمض النووي الجيني للأنسجة الثابتة

يوفر MagneSil® Genomic، Fixed-Tissue System (Cat. # MD1490) تقنية سريعة وبسيطة لتحضير الحمض النووي الجيني من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين. بعد هضم بروتين K بين عشية وضحاها ، يمكن تنقية الحمض النووي الجيني يدويًا من أقسام الأنسجة الرقيقة FFPE في أقل من ساعة. يمكن عزل الحمض النووي الجيني المضخم من أقسام 10 ميكرومتر دون الطرد المركزي للمحلول قبل التنقية. يمكن معالجة ما يصل إلى 12 عينة بالتنسيق اليدوي باستخدام حامل الفصل المغناطيسي MagneSphere® Technology (Cat. # Z5332، Z5342).

الشكل 11. تحليل الحمض النووي المنقى من المقاطع الرقيقة 10 ميكرومتر المضمنة بالبارافين والمثبتة بالفورمالين باستخدام نظام الأنسجة الثابتة الجينومي MagneSil®. تم تضخيم الحمض النووي المنقى ، وتم تحليل منتجات التضخيم باستخدام محلل وراثي ABI PRISM® 310 أو 3100. لوحة أ. التضخيم مع مجموعة من 16 الاشعال المسمى الفلورسنت. تتراوح منتجات التضخيم في الحجم من 104 إلى 420 قاعدة. لوحة ب. تم تضخيم جزء من 972 قاعدة باستخدام مجموعة التمهيدي الأميلوجينين. لوحة ج. جزء بحجم 1.8 كيلو بايت تم تضخيمه من ملف داء السلائل القولونية الغدية (APC) الجين. قد تساعد زيادة وقت التمديد أثناء التضخيم في موازنة العوائد بين منتجات التضخيم الصغيرة والكبيرة وزيادة عوائد منتجات التضخيم الكبيرة. ستختلف النتائج اعتمادًا على درجة الارتباط المتبادل بسبب تثبيت الفورمالين.

تتمثل إحدى الميزات التي يتمتع بها هذا النظام على طرق التنقية الأخرى ، مثل استخراج الفينول: الكلوروفورم ، في قدرته على إزالة معظم مثبطات التضخيم ، بما في ذلك الأجزاء الصغيرة جدًا من الحمض النووي. قد تكون الأنسجة التي تم تخزينها في الفورمالين لفترات طويلة من الزمن متشابكة للغاية أو متدهورة للغاية بحيث لا تؤدي بشكل جيد كقالب للتضخيم. يوضح الشكل 11 تضخيمًا لـ 16 موقع تكرار ترادفي قصير (STR) ويوضح مدى جودة عمل الحمض النووي المعزول في PCR متعدد الإرسال باستخدام PowerPlex® 16 HS System (Cat. # DC2101، DC2100).

تعتبر مجموعة Maxwell® RSC FFPE Plus DNA Kit (Cat. # AS1720) طريقة آلية لتنقية ما يصل إلى 48 عينة من قسم واحد إلى عشرة أقسام بحجم 5 ميكرومتر من عينات الأنسجة FFPE على أداة Maxwell® RSC (Cat. # AS4500 1–16 خرطوشة لكل تشغيل) أو أداة Maxwell® RSC 48 (Cat. # AS8500 1-48 عينة لكل تشغيل). تم تصميم كيمياء FFPE Plus لتوفير إنتاجية عالية من الحمض النووي من FFPE عند قياسها بواسطة التحليل الطيفي المناسب لتطبيقات التضخيم بما في ذلك qPCR و multlex PCR و NGS. يوفر البروتوكول المرونة من خلال إزالة سريعة للكفاءات لمدة ساعة أو بروتوكول طوال الليل ليلائم احتياجات تدفق العمل لديك.

كيمياء Maxwell® RSC DNA FFPE هي أحدث تقنيات FFPE من Promega وقد تم تصميمها لتوفير DNA عالي التضخيم. وفر الوقت والعمالة من خلال استخدام كيمياء FFPE مع أدوات Maxwell® ، وتجنب التعرض للزيلين الخطير المستخدم في منتجات تنقية FFPE الأخرى. أظهر اختبار الجودة أيضًا عدم وجود مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل تقريبًا في عينات الحمض النووي المنقى ، مما يجعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والتطبيقات النهائية الأخرى في غاية السهولة.

باستخدام نفس الكيمياء مثل Maxwell® RSC FFPE DNA ، يوفر نظام عزل Maxwell® HT DNA FFPE (Cat. # A6372) طريقة بسيطة وموثوقة لعزل سريع وعالي الإنتاجية للحمض النووي الجيني من عينات الأنسجة FFPE. لا يتطلب النظام مذيبًا عضويًا ، مما يجعله آمنًا ومناسبًا للاستخدام ، ويمكن استخدام الحمض النووي المنقى مباشرة في مجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك PCR و NGS.

يعمل نظام عزل Maxwell® HT DNA FFPE على تنقية الحمض النووي باستخدام جزيئات مغناطيسية ، والتي توفر مرحلة صلبة متحركة لتحسين ربط وغسل وتنقية gDNA. إن استخدام الجسيمات البارامغناطيسية لعزل الحمض النووي يلغي الحاجة إلى الطرد المركزي أو المشعبات الفراغية ، مما يجعل النظام مناسبًا للأتمتة الكاملة.

نظرًا لأن عينات FFPE يمكن أن يكون لها جودة متفاوتة على نطاق واسع بسبب طبيعة تثبيت العينة وعملية التضمين ، يمكن أن تكون مراقبة الجودة للعينات جزءًا مهمًا من سير عمل FFPE.

الشكل 12. البيانات المقارنة للكيمياء Maxwell & reg RSC DNA FFPE مقابل كيمياء Maxwell & reg RSC FFPE Plus DNA. وقد لوحظ أن طريقة Maxwell & reg RSC FFPE Plus DNA تنتج المزيد من الغلة عن طريق الامتصاص والفلورة ، بينما تنتج طريقة Maxwell & reg RSC DNA FFPE المزيد من العائد بواسطة PCR.

قياس الطيف الضوئي طريقة شائعة لتقييم جودة استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي. تحتوي معظم المختبرات على مقياس الطيف الضوئي NanoDrop Microvolume (أو جهاز مشابه) وهي سهلة الاستخدام بشكل لا يصدق. ماصة 1-2 ميكرولتر من العينة ، حدد "تحليل" وتوفر الأداة قراءة من التركيز والنقاء عبر A260280 و أ260230 النسب في بضع ثوانٍ فقط. أحدثت هذه الأجهزة ثورة في تحديد كمية العينات الروتينية في المختبر ، ولكن هل هي أفضل طريقة لتقييم عينات FFPE؟ هناك نوعان من الاعتبارات الرئيسية عند استخدام NanoDrop: الحساسية والنزاهة. يمكن أن تحتوي عينات FFPE على عائد واسع النطاق من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي في كثير من الأحيان أقل من 10 نانوغرام أو أقل في حجم يتراوح من 10 ميكرولتر إلى 100 ميكرولتر من الاستخراج. يمكن أن يؤدي هذا إلى تركيزات عينة أقل من النطاق الخطي لـ NanoDrop. بالإضافة إلى ذلك ، كمقياس طيف ضوئي ، فإنه لا يفرق بين RNA أو DNA أو النيوكليوتيدات الحرة ، مما قد يؤدي إلى عدم دقة كبيرة في قياسات تركيز DNA / RNA. أخيرًا ، لا توجد طريقة لتحديد ما إذا كانت العينة يمكن الوصول إليها للمقايسات الأنزيمية النهائية لأنها لا تستطيع الكشف عن وجود أو عدم وجود روابط متقاطعة (أو أضرار أخرى) داخل العينة.

الكميات الصبغية مثل نظام Promega QuantiFluor® dsDNA (Cat. # E2670، E2671) ، يوفر طريقة سريعة وأكثر حساسية بشكل ملحوظ لتقدير dsDNA أو RNA مقارنةً بالتحليل الطيفي للامتصاص. توفر هذه الطريقة تقديرًا مفيدًا للتركيز. عند النظر في عينات FFPE ، من المهم ملاحظة أن القياس الكمي القائم على الصبغة لا يقدر سلامة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي أو مدى الارتباط المتبادل في العينة ، مما قد يؤثر على النجاح في فحوصات المصب.

فحوصات التحجيم (على سبيل المثال ، هلام الاغاروز ، محطة الشريط ، محلل الشظايا ، DV200) يمكن أن توفر تقديرًا للتركيز - والأهم من ذلك - معلومات عن توزيع حجم الأجزاء في العينة. يمكن أن يتم تجزئة الحمض النووي المشتق من FFPE ، بسبب عملية التثبيت ، بشكل كبير مقارنة بالحمض النووي من الأنسجة المجمدة حديثًا. يوجد أدناه تتبع محلل شظية (الشكل 13) وعشرات DV200 المرتبطة (الجدول 3) للحمض النووي المعزول من أقسام FFPE باستخدام خمس طرق تنقية مختلفة. في حين أن آثار التحجيم تقوم بتقييم توزيع حجم الحمض النووي المنقى ، فإنها لا تقيس درجة الارتباط المتبادل داخل العينة أو وجود مثبطات.

الشكل 13. تتبع محلل شظية الحمض النووي المعزول من أقسام FFPE باستخدام خمس طرق تنقية مختلفة.

الجدول 3. عشرات DV200 من الحمض النووي المعزولة من أقسام FFPE باستخدام خمس طرق تنقية مختلفة في تتبع محلل شظية (الشكل 13).

طريقة 1 (أخضر فاتح) 2 (أزرق) 3 (أحمر) 4 (برتقالي) 5 (أخضر)
DV200 71.8 69.9 70.1 58.7 80.5

على سبيل المثال ، عندما تم قياس نفس العينات بواسطة فحوصات qPCR لأهداف مختلفة وأحجام شظايا ، فإن العائد بواسطة qPCR لا يرتبط جيدًا بنتائج DV200. في الواقع ، في هذا المثال ، كان للعينات ذات الدرجات الأدنى من DV200 أكبر عائد بواسطة qPCR (الشكل 14).

الشكل 14. غلة qPCR من الحمض النووي المعزولة من أقسام FFPE. تم تحديد نفس عينات الحمض النووي المعزولة بخمس طرق تنقية مختلفة في تتبع محلل الشظايا وجدول DV200 أعلاه بواسطة فحوصات qPCR للأهداف المختلفة وأحجام الشظايا.

في حين أن هناك اتجاهات عامة ، لا ترتبط درجة DV200 بالضرورة بالنجاح في الاختبارات النهائية مثل qPCR.

qPCR له العديد من المزايا لتقدير عينات FFPE. أولاً ، يمكن أن يكون qPCR حساسًا للغاية ، ولا يتطلب سوى كمية صغيرة من العينة ويكشف عن كميات pg / & microl من الحمض النووي. من حيث الحساسية في الكشف عن الحمض النووي ، يتم تجاوزها فقط بواسطة ddPCR. يمكن أن يوفر qPCR أيضًا مقياسًا لمدى تدهور أو تشابك عينة DNA لأن الحمض النووي يجب أن يكون ركيزة مناسبة لبوليميراز DNA لتوليد إشارة. قد لا تمثل الامتصاصية العينة المناسبة للمقايسة النهائية لأنها ستكتشف الحمض النووي والحمض النووي المجزأ والنيوكليوتيدات. أخيرًا ، توفر معظم فحوصات qPCR QC ، مثل ProNex & reg DNA QC Assay (Cat. # NG1004 ، NG1005) ضوابط داخلية تُستخدم للكشف عن وجود مثبطات في العينة قبل محاولة اختبار أكثر تكلفة. يمكن أن يساعدك هذا في تقييم ليس فقط سلامة الأحماض النووية ، ولكن أيضًا احتمالية نجاح المقايسة القائمة على التضخيم.

NGS هو اختبار آخر تستخدمه بعض المعامل لمراقبة عيناتهم. هناك عدة أسباب لذلك. تحاول بعض المعامل الحصول على أكبر قدر ممكن من البيانات من عينات ثمينة جدًا ، وفي هذه الحالة قد تكون أي معلومات تسلسلية تستحق المصاريف ومخاطر عمليات تشغيل التسلسل الفاشلة. كاختبار لمراقبة الجودة ، قد يوفر NGS الكثير من المعلومات ، لكنه مكلف ويمكن أن يتطلب كميات كبيرة من العينة والوقت. تعمل بعض المعامل على تشغيل NGS بتمرير منخفض ، والذي يستخدم عينات متعددة الإرسال بشكل كبير لخفض تكلفة كل عينة لتحديد ما إذا كان الأمر يستحق الوقت والموارد للتسلسل بشكل أعمق. يوصي معظم موفري التسلسل والتنقية بإجراء فحوصات qPCR لتقدير الحمض النووي لـ FFPE ، حيث تعتمد جميع تدفقات عمل NGS بشكل أساسي على نجاح خطوات التضخيم الأنزيمي للحصول على DNA جاهز للتسلسل كجزء من خطوات إعداد المكتبة.

الجدول 4. إيجابيات وسلبيات المقارنة لمختلف فحوصات مراقبة الجودة.

طريقة سرعة حساسية كمي؟ قياس النقاء؟ تقييم حجم زمالة المدمنين المجهولين؟ كشف الروابط المتقاطعة؟ كلفة
قياس الطيف الضوئي (NanoDrop) +++ + شبه كمي + - - $
الكميات الصبغية +++ ++ ص - - - $
DV200 ++ + شبه كمي - +* - $$
هلام الكهربائي ++ +/- شبه كمي - +* - $
qPCR ++ +++ ص +* + + $
NGS + ص + ++ + $$$

عزل الحمض النووي الجينومي للنبات

تم تصميم نظام Wizard® Magnetic 96 DNA Plant (Cat. # FF3760 ، FF3761) من أجل تنقية 96 بئرًا يدويًا أو آليًا للحمض النووي من أوراق النبات وأنسجة البذور. تم التحقق من صحة نظام Wizard® Magnetic 96 DNA مع أوراق الذرة والطماطم وكذلك بذور الكانولا وعباد الشمس. يمكن استخدام الحمض النووي المنقى من هذه العينات في PCR والتطبيقات الأخرى الأكثر تطلبًا ، مثل تحليل RAPD. نظرًا لأن المواد النباتية يمكن أن تكون صعبة بشكل خاص عند العمل مع المناديل الصلبة أو الخشبية ، فإن المعدات الإضافية المطلوبة لا تشمل فقط المغناطيس (MagnaBot® FLEX 96 Magnetic Separation Device، Cat. # VA1920) ولكن أيضًا جهاز قادر على تفتيت البذور أو مادة الأوراق (على سبيل المثال ، Geno / Grinder® 2000 من SPEX CertiPrep، Inc.).

يعتمد المحصول على مادة المصدر ومدى جودة سحق البذور أو أقراص الأوراق قبل عزل الحمض النووي الجيني. قد تتراوح المحصول من 10-100 نانوغرام من خرامة ورقة واحدة 8 مم. لزيادة العائد من نظام Wizard® Magnetic 96 DNA Plant ، يمكن استخدام مقياس في الحجم يصل إلى 5 ثقوب أوراق [كما هو موضح في ملاحظات بروميغا 79]. التوسع المحتمل محدود بالحجم الموجود في صفيحة عميقة مكونة من 96 بئرًا.

هناك خيار آلي آخر لدينا لتلبية احتياجات استخراج الحمض النووي للنبات ، وهو Maxwell® RSC Plant DNA Kit (Cat. # AS1490). تُستخدم مجموعة Maxwell® RSC Plant DNA Kit مع أدوات Maxwell® RSC و RSC 48 لتوفير طريقة سهلة للتنقية الفعالة والآلية للحمض النووي الجيني (gDNA) من مجموعة من عينات الأنسجة النباتية ، بما في ذلك الذرة وفول الصويا و أرابيدوبسيس. يتم تزويد الأجهزة بطرق تنقية مبرمجة مسبقًا وتستخدم خراطيش كاشف معدة مسبقًا ، مما يزيد من البساطة والراحة.

باستخدام هذا النظام ، يمكن تنقية الحمض النووي من عينات النباتات في أقل من 60 دقيقة مع الحد الأدنى من المعالجة المسبقة وبدون عمليات الاستخراج العضوية. ينتج عن التنقية الآلية تنقية متسقة ، مع تنوع أقل من طرق استخراج الحمض النووي التقليدية مثل CTAB وأعمدة الدوران. الحمض النووي المنقى الناتج جاهز للاستخدام في التطبيقات النهائية ، بما في ذلك فحوصات التضخيم.

عزل الحمض النووي الجيني في المصل والبلازما

للحصول على حمض نووي خالٍ من الخلايا وعالي الجودة من عينات البلازما ، نقدم مجموعة البلازما Maxwell® RSC ccfDNA (Cat. # AS1480). باستخدام بروتوكول بسيط من ثلاث خطوات ، يمكن لأداة Maxwell® RSC معالجة 1 إلى 16 عينة ، ويمكن لجهاز Maxwell® RSC 48 معالجة 1 إلى 48 عينة. ما عليك سوى إضافة 0.2-1.0 مل من البلازما إلى الخراطيش المحضرة وتحديد Start ، ولا يلزم إجراء معالجة مسبقة للعينات. في حوالي 70 دقيقة ، سيكون لديك إنتاجية عالية من الحمض النووي القابل للتضخيم الجاهز للاستخدام في فحوصات المصب بما في ذلك qPCR و NGS و PCR الرقمي.

كمحرك للجسيمات المغناطيسية ، وليس معالجًا سائلًا ، يوفر Maxwell® RSC أيضًا العديد من المزايا على الأنظمة الآلية الأخرى. نظرًا لعدم حدوث تداول أو تناثر السوائل أثناء معالجة العينة ، فهناك حد أدنى من مخاطر تلوث العينة. كما أنه يزيل القلق من السدادات المحتملة والأعطال الحتمية للنظام التي تلي ذلك ، مما يضمن سير عمل سلسًا مع عدد أقل من الاضطرابات.

عزل الحمض النووي الجينومي البكتيري

إذا كنت بحاجة إلى اتخاذ قرارات سريعة بشأن تلوث الأغذية وفسادها المحتمل ، فإن Maxwell® RSC PureFood Pathogen Kit (Cat. # AS1660) توفر بروتوكولًا آليًا بسيطًا مع خطوات عملية بسيطة. تتخلص المجموعة بشكل فعال من خطوات المعالجة المسبقة للعينات الشاقة مثل المعالجة الإنزيمية ، حيث تعمل مع أنواع العينات المثبطة ولديها أيضًا القدرة على تحليل البكتيريا الجرام + أو الجرام.

من خلال ربط كيمياء Maxwell® عالية الأداء بأدوات Maxwell® RSC الموثوقة ، ستتمكن من تنقية الحمض النووي البكتيري بشكل فعال من ما يصل إلى 48 عينة طعام في أقل من 40 دقيقة. بمجرد استخلاصه ، يصبح الحمض النووي الناتج جاهزًا للتحليلات الجزيئية المتقدمة ، بما في ذلك التنميط المصلي ، و NGS وتحديد الكائنات الحية الفاسدة.

يمكن استخدام هذه الطريقة لكل من الأغذية الخام والمعالجة ، وقد تم استخدامها بنجاح لعزل الحمض النووي المُمْرِض من مجموعة متنوعة من عينات الطعام ، بما في ذلك بكتريا قولونية 0157: H7 من لحم البقر غير المطبوخ ، السالمونيلا المعوية من الدجاج غير المطبوخ و الليسترية المستوحدة من الحليب كامل الدسم. يوضح الشكل 15 أدناه مقارنة بين إجمالي الحمض النووي مقابل بكتريا قولونية 0157: H7 DNA المستخرج من عينات الكزبرة التي تم شدها باستخدام بكتريا قولونية 0157: بكتيريا H7.

الشكل 15. مقارنة مجموع الحمض النووي و بكتريا قولونية 0157: تم استخلاص الحمض النووي H7 من عينات الكزبرة بالكميات المشار إليها بكتريا قولونية 0157: بكتيريا H7. تم تقييم تركيز الحمض النووي الكلي باستخدام نظام QuantiFluor® ONE dsDNA.

عزل الحمض النووي الجينومي معطف بافي

توفر مجموعة Maxwell® RSC Buffy Coat DNA Kit (Cat. # AS1540) طريقة بسيطة ومؤتمتة لاستخراج الحمض النووي الجيني باستخدام تنسيق خرطوشة ملائم ومعبأ مسبقًا لجهاز Maxwell® RSC. تحتوي المجموعة على جميع الكواشف التي تحتاجها لاستخراج الحمض النووي بشكل مثالي ، وهي متوافقة مع الدم المخزن في مضادات التخثر EDTA والهيبارين والسترات. تجنب المتاعب الشاقة والمستهلكة للوقت لعينات المعالجة المسبقة ، ببساطة أضف 50-250 مايكرولتر من عينتك مباشرة في البئر رقم 1 من الخراطيش. الحمض النووي المنقى الخاص بك جاهز للتحليل في حوالي 50 دقيقة ، ويمكن استخدامه مباشرة في العديد من التطبيقات النهائية ، مثل الاغاروز الكهربائي للهلام.

عزل الحمض النووي الجيني الغذائي

غالبًا ما تمثل المواد الغذائية والنباتية التحدي الأكبر لتحلل الخلايا واستخراج الحمض النووي السليم ، نظرًا لظروف التحلل المطلوبة لتحرير الحمض النووي ومعالجة المواد النباتية إلى مواد قابلة للتحلل.

نظام آخر متخصص لعزل الحمض النووي هو Wizard® Magnetic DNA Purification System للأغذية (Cat. # FF3750، FF3751). تم تصميم هذا البروتوكول المريح للتنقية اليدوية للحمض النووي من مجموعة متنوعة من عينات الطعام بما في ذلك بذور الذرة ودقيق الذرة وفول الصويا ودقيق الصويا وحليب الصويا ، مما أدى إلى الحصول على نتائج في ثلث الوقت بالطرق التقليدية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تنقية الحمض النووي من الأطعمة المصنعة مثل رقائق الذرة والشوكولاتة والأطعمة المحتوية على الشوكولاتة والليسيثين والزيوت النباتية إذا تم استخدامها مع البروتوكولات المحسنة المناسبة.

يمكن استخدام الحمض النووي المنقى من العديد من هذه العينات في الاختبار القائم على PCR لتسلسل الحمض النووي للكائنات المعدلة وراثيًا (GMO) ، مثل التحليل الكمي باستخدام مقايسات TaqMan. كما هو الحال مع جميع أنظمة العزل التي تستخدم MagneSil® PMPs ، هناك حاجة إلى حامل فصل مغناطيسي ويمكن معالجة ما يصل إلى 12 عينة لكل دفعة. مع العينات التي تحتوي على أغذية عالية المعالجة ، سيتم تجزئة الحمض النووي المعزول ويكون أكثر ملاءمة للتحليل باستخدام التضخيم بدلاً من لطخة جنوبية. سيختلف مردود الحمض النووي من هذا النظام اعتمادًا على نوع المصدر ومدى معالجة الطعام.

توفر Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication Kit (Cat. # AS1600) طريقة سهلة ومؤتمتة لتنقية الحمض النووي بطريقة فعالة للمصادقة على المواد الغذائية والمكونات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل. تُستخدم المجموعة مع أدوات Maxwell® RSC و RSC 48 ويمكنها تنقية الحمض النووي من عينات الأغذية الخام والمعالجة ، بما في ذلك الذرة وفول الصويا والكانولا ولحم البقر المفروم ولحم الخنزير المفروم.

يتطلب بروتوكول 100 دقيقة 30 دقيقة فقط من التدريب العملي ، مما يحقق نتائج أسرع ليس فقط من خلال التشغيل الآلي الفوري ، ولكن أيضًا يحرر موارد المختبر لأنشطة ذات قيمة أعلى. الحمض النووي المنقى المستخرج باستخدام PureFood Kit جاهز للاستخدام في العديد من التطبيقات ، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي والهلام الكهربائي للجيل التالي وتسلسل Sanger والمصفوفات الدقيقة.

بروتوكولات تنقية الحمض النووي لأنواع عينات النباتات والأغذية

استكشف مجموعتنا من البروتوكولات لاستخراج الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي اليدوي والآلي من مجموعة متنوعة من عينات الأغذية والنباتات.


مواصفات AQA الجديدة - بنية الحمض النووي وتخليق البروتين- B13.5

تم تصميم موارد الورق المقوى بالورق لضمان عدم المساس بالتعليم الجيد النوعية عن طريق قيود الطباعة أو تخزين مقاطع الفيديو مؤقتًا. تم إنشاء دروس تتضمن أوراق عمل للمدرسين لطباعة نسختين على الأقل على ورقة A4.

شارك هذا

تم إنشاء دروس بنية الحمض النووي وتخليق البروتين وفقًا لمواصفات NEW AQA (9-1). ملحوظة: علم الأحياء فقط. لقد قمت بتدريس هذا الموضوع في درسين لأنه موضوع مفهوم صعب ويمكن تدريسه بفعالية بدلاً من الاستعجال. تم تصميم هذا المورد لفئة ذات قدرة أعلى ، على الرغم من أنه يمكن تعديل المحتوى ليناسب أي قدرة. يتضمن: مقاطع فيديو وموقتات مضمنة ، ورسوم متحركة للشرائح ، وممارسة أسئلة مع إجابات على الشرائح ، وأوراق العمل ، واختبار تفاعلي.

رابط مواصفات AQA: 6.1.5
الفصل ذو الصلة: B13 علم الوراثة والتكاثر. الطبعة الثالثة من كتاب AQA Biology-Page 204-205.

يجب أن يكون الطلاب قادرين على وصف الحمض النووي على أنه بوليمر مصنوع من أربعة نيوكليوتيدات مختلفة. يتكون كل نوكليوتيد من مجموعة مشتركة من السكر والفوسفات مع واحدة من أربع قواعد مختلفة مرتبطة بالسكر. يحتوي الحمض النووي على أربع قواعد ، A و C و G و T. تسلسل من ثلاث قواعد هو رمز لحمض أميني معين. يتحكم ترتيب القواعد في الترتيب الذي يتم فيه تجميع الأحماض الأمينية
إنتاج بروتين معين.
تتكون الخيوط الطويلة من الحمض النووي من أقسام متناوبة من السكر والفوسفات. تعلق على كل سكر واحدة من أربع قواعد. يتكون بوليمر الحمض النووي من وحدات نيوكليوتيد متكررة.

(HT فقط) يجب أن يكون الطلاب قادرين على: • • تذكر وصف بسيط لتخليق البروتين • • شرح كيفية تأثير بنية الحمض النووي على البروتين المصنوع • • وصف كيفية تأثير المتغيرات الجينية على النمط الظاهري: أ) في تشفير الحمض النووي عن طريق تغيير نشاط البروتين: و ب) في الحمض النووي غير المشفر بواسطة
تغيير كيفية التعبير عن الجينات.
(HT فقط) في السلاسل التكميلية ، يرتبط C دائمًا بـ G على الشريط المقابل و T إلى A.
(HT فقط) لا يُتوقع من الطلاب معرفة أو فهم بنية mRNA أو tRNA أو التركيب التفصيلي للأحماض الأمينية أو البروتينات.
(HT فقط) يجب أن يكون الطلاب قادرين على شرح كيف أن التغيير في بنية الحمض النووي قد يؤدي إلى تغيير في البروتين الذي يتم تصنيعه بواسطة الجين.
(HT فقط) يتم تصنيع البروتينات على الريبوسومات ، وفقًا للقالب. تجلب الجزيئات الحاملة أحماض أمينية معينة لإضافتها إلى سلسلة البروتين النامية بالترتيب الصحيح.
(HT فقط) عند اكتمال سلسلة البروتين ، يتم طيها لتشكيل شكل فريد. يمكّن هذا الشكل الفريد البروتينات من أداء وظيفتها كإنزيمات أو هرمونات أو تراكيب في الجسم مثل الكولاجين.

احصل على هذا المورد كجزء من حزمة ووفر ما يصل إلى 42٪

الحزمة عبارة عن حزمة من الموارد مجمعة معًا لتدريس موضوع معين ، أو سلسلة من الدروس ، في مكان واحد.

AQA Biology- موضوعات منفصلة ، ورقة 2 فقط

علوم منفصلة B10.4 و B10.5 و amp B10.6 B11.9 و amp B11.10 B12.1 و B12.2 و B12.3 و B12.4. B12.5 B13.4، B13.5 & amp B13.6 B14.5 & amp B14.6 B15.1، B15،2، B15.3 & amp B15.4

المواصفات الجديدة AQA- حزمة التكاثر B13- علم الأحياء / علم منفصل

نظرًا للطلب الشائع ، قمت بتحميل حزمة B13. تحتوي هذه الحزمة على محتوى لطلاب علم الأحياء / العلوم المنفصلة. يتضمن كل الموارد التي تحتاجها لتدريس موضوع B13 Reproduction. إذا كنت تقوم بتدريس هذا الموضوع (B12) لطلاب العلوم المشتركين ، فقد قمت بتحميل حزمة منفصلة له. تم عمل الدروس وفقًا لمتطلبات المواصفات. مقاطع فيديو مضمنة لسهولة الاستخدام ، مرفقة بالموارد الورقية. ابحث في الدروس الفردية لمزيد من المعلومات حول محتوى الدرس. وفر 42٪ بشراء هذه الباقة. وشملت الموضوعات العليا. إجمالي 11 درسًا + حزمة أسئلة ورقية سابقة حول الانقسام والانقسام الاختزالي. L1 = أنواع التكاثر L2 = انقسام الخلايا والتكاثر الجنسي L3 = أفضل ما في العالمين L4 = الحمض النووي والجينوم L5a = بنية الحمض النووي L5b = تخليق البروتين L6 = التعبير الجيني والطفرة L7 = الوراثة في الإجراء L8 = المزيد حول علم الوراثة L9 = الاضطرابات الموروثة L10 = فحص الاضطرابات الوراثية


استنتاج

هناك حاجة إلى جهود التسلسل البيئي المحددة التي تعالج بشكل أكثر تحديدًا بيكواريوتيس ، مع تركيز أقل على بدائيات النوى. وهذا من شأنه أن يتيح تغطية أفضل ، وبالتالي ، مجموعات أكبر من الجينومات حقيقية النواة. كان الهدف من التسلسل البيئي لبحر سارجاسو هو الحصول على متواليات بدائية النواة وقد تم ذلك باستخدام مسامية مرشح صغيرة جدًا ، وغربلة الكائنات الحية بين 0.22 و 0.8 ميكرومتر. إن أبسط طريقة لتحسين تمثيل picoeukaryotes في ميتاجينوم هو تحويل نطاق الترشيح إلى ما بين 0.5 و 2 ميكرومتر وزيادة جهد التسلسل إلى ما لا يقل عن مليون قراءة. سيؤدي ذلك إلى القضاء على جزء كبير من بدائيات النوى وسيزيد من نسبة بيكو النواة الموجودة في عينة الماء.


يوفر مرفق الحمض النووي التابع لمكتب التكنولوجيا الحيوية بجامعة ولاية أيوا خدمات دعم الأبحاث للمحققين داخل الأوساط الأكاديمية والصناعة والحكومة. يلتزم مرفق الحمض النووي بجامعة ولاية آيوا بتقديم خدمة عالية الجودة بطريقة سريعة ويمكن الاعتماد عليها واقتصادية باستمرار.

يسمح نظام OnCore للطلبات والتتبع عبر الإنترنت التابع لمرفق DNA بجامعة Iowa State University للعملاء بتقديم الطلبات وتتبع تقدم الطلبات وتلقي النتائج من خادم المنشأة على مدار 24 ساعة في اليوم. بمجرد تقديم طلبك ، ما عليك سوى طباعة نسخة من رقم التتبع الخاص بك وإرسالها بالبريد مع عيناتك إلى منشأتنا. عندما تتم معالجة العينات الخاصة بك ، ستتلقى رسالة بريد إلكتروني لإعلامك بأن بياناتك جاهزة للتنزيل. يكون التحول المعتاد لمعظم خدماتنا في غضون يومي عمل.

يقع مرفق الحمض النووي بجامعة ولاية آيوا في الطابق الأرضي (الغرفة 1190) من مبنى البيولوجيا الجزيئية في الحرم الجامعي المركزي لجامعة ولاية آيوا. نحن منفتحون من الاثنين إلى الجمعة من الساعة 7:30 صباحًا إلى 5 مساءً للإجابة على أي أسئلة قد تكون لديكم بشأن طلبك.

مرفق الاتصال

ديفيد رايت ، دكتوراه.
مدير منشأة
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-5415

كيفن كافالين
تسلسل سانجر أحادي الأنبوب
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-9585

ديان شوجرن
تسلسل عالي الإنتاجية
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-9731

مايكل بيكر ، دكتوراه.
مكتبات الكروم
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-4705

تانيا مورثا
الشبكة ، MiSeq ، DNA ، QuantSeq ،
مكتبات 16S / 18S وأمبير sRNA

بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-1813

ديان شوجرين
مكتبات HiSeq و amp RNA
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-9731

أماندا بروكمان
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-9837

ديان شوجرن
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-9731

ديان شوجرن
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-9731

كيفن كافالين
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-9585

كيفن كافالين
Bioanalyzer والاتصال أمبير Qubit
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-9585

تانيا مورثا
جهة اتصال محلل شظية
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-1813

كيفن كافالين
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-9585

تانيا مورثا
استخراج الحمض النووي الجيني HMW
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-1813

تانيا مورثا
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-1813

كيفن كافالين
بريد الالكتروني:
الهاتف: (515) 294-9585


تصحيح أخطاء SynXII

تم التغلب على العديد من العقبات أثناء تجميع synXII. نما أول synXII في البداية بشكل أبطأ من النوع البري ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى الإزالة الكاملة لجميع جينات الحمض النووي الريبي (tRNA) على الكروموسوم ، وعلى وجه الخصوص إزالة اثنين من ثلاثة tL (UAG) L الجينات (الشكل 2 والشكل S8). ولوحظت ظاهرة مماثلة أثناء تخليق synX ، حيث تم حذف tR (CCU) J، الحمض الريبي النووي النقال أرجينين الوحيد مع أنتي كودون CCU ، أدى إلى خلل شديد في النمو في وسط YPGE (10) (الشكل S17). ثانيًا ، تم تصميم موقع العلامات الانتقائية في كل ضخم لمقاطعة الجين غير الضروري ، ولكن في كثير من الحالات أدى ذلك إلى ضعف شديد في وظيفة الميتوكوندريا أو مقاومة الإجهاد. من الناحية النظرية ، كان يجب استعادة الخلل بمجرد دمج العملاق التالي (شكل S18). ومع ذلك ، فإن عيوب الميتوكوندريا أدت عادة إلى معدل نمو أبطأ بشكل كبير ، مما أدى إلى إطالة دورة الاستبدال بشكل كبير (الشكل S16A). ثالثًا ، إن إعادة الترميز المرادف داخل إطار قراءة مفتوح أمر جيد التحمل بشكل عام. وجدنا حالة واحدة على الأقل أثناء عملية استبدال megachunk E ، حيث تكون وظيفة MMM1 نتيجة لإعادة الترميز لتوليد PCRTag (YLL006W.1F) (9, 10). رابعًا ، حذف intron افتراضي داخل 5 ′ UTR من ثاني أكسيد الكربون COQ9 أدى إلى كتلة النسخ (الشكل S16). نظرًا لأننا أولينا اهتمامًا وثيقًا لنمو الخلايا في وسط YPGE طوال عملية التجميع ، فإن معظم العيوب المكتشفة مرتبطة بوظيفة الميتوكوندريا. قد تكون هناك عيوب طفيفة أخرى في الجينوم الاصطناعي ، والتي لم يتم ملاحظتها في ظل هذه الظروف. ومع ذلك ، نظرًا لأن السلالات النهائية تعرض لياقة من النوع البري تقريبًا بمجرد توفير الحمض النووي الريبي ، فإن synXII هو أكبر كروموسوم خطي اصطناعي تم تصنيعه وهو يعمل بكامل طاقته.

يحتوي SynXII على موضع rDNA عالي البلاستيك لا يمكن نقله فقط إلى مواقع صبغية أخرى ، ولكن يمكن أيضًا تغييره في منطقة ITS الخاصة به للتنكر كنوع متميز كما هو محدد بواسطة "تشفير DNA الشريطي" المستخدم على نطاق واسع في التصنيف. من المفترض أن القدرة على أداء "تحويل الأنواع" المذكورة هنا تعكس درجة المرونة التطورية التي تتغير بها مناطق أنظمة النقل الذكية. ومع ذلك ، من الواضح أن منطقة الرمز الشريطي هذه ليست مرنة بشكل لا نهائي ، حيث تم التسامح مع التغييرات القاعدية المتواضعة نسبيًا فقط. لم تؤد الفروق الجينية الأكثر شدة في تسلسل ITS إلى rDNAs وظيفية ، ربما بسبب خلل في معالجة الرنا الريباسي. إن القدرة على تصميم ، وبناء ، وتصحيح كروموسوم بحجم قاعدة ميغا مع المرونة في موضع موضع rDNA ، يتحدث عن المرونة الشاملة الملحوظة لجينوم الخميرة.


الإنتاج البيولوجي للحمض النووي أحادي الجديلة النقي على نطاق كيلوباز

إن الإنتاج القابل للتطوير من الحمض النووي أحادي الجديلة (ssDNA) مع التحكم في التسلسل له تطبيقات في العلاجات ، والتوليف الجيني والتسلسل ، وأوريغامي الحمض النووي ، وتخزين ذاكرة الحمض النووي الأرشيفية. الإنتاج البيولوجي لـ ssDNA الدائري (cssDNA) باستخدام M13 يلبي هذه الاحتياجات بتكلفة منخفضة. ومع ذلك ، فإن أحد الأهداف التي لم يتم تحقيقها هو تقليل مناطق ترميز البروتين الأساسية للحمض النووي المُصدَّر مع الحفاظ على قابليته للعدوى ونقاء الإنتاج لإنتاج تسلسلات يقل طولها عن 3000 نانومتر ، ذات صلة بالتطبيقات العلاجية وعلوم المواد. لتحقيق هذه الغاية ، يوفر miniphage الاصطناعي مع إدخالات من التسلسل والحجم المخصصين توليفة قابلة للتطوير ومنخفضة التكلفة لـ cssDNA بمقاييس ملليغرام وأعلى. هنا ، نقوم بتحسين ظروف النمو باستخدام سلالة E. coli المساعدة جنبًا إلى جنب مع جينوم miniphage يحمل فقط أصل f1 وجين مقاومة المضادات الحيوية β-lactamase (bla) ، مما يتيح عزل cssDNA النقي مع الحد الأدنى لطول جينومي التسلسل 1،676 NT ، دون الحاجة إلى تنقية إضافية من تلوث الحمض النووي. تم توضيح قابلية التوسع منخفضة التكلفة لـ cssDNA متساوي المنشأ وذات الطول المخصص لتسلسل 2520 nt باستخدام مفاعل حيوي ، تمت تنقيته بمستويات منخفضة من الذيفان الداخلي (& lt5 E.U./ml). نقوم بتطبيق cssDNAs المقاومة للنوكلياز الخارجية على التجميع الذاتي لكائنات اوريغامي DNA ذات الإطار الشبكي ولتشفير المعلومات الرقمية على جينوم miniphage للتضخيم البيولوجي.

بيان تضارب المصالح

T.R.S.، R.R.D. و M.B. هم مخترعون على براءة اختراع معلقة (62 / 584،664) لبعض الطرق التي تم الكشف عنها هنا.

الأرقام

إنتاج عاثيات قابلة للتطوير من متساوي التكاثر ...

إنتاج عاثيات قابلة للتطوير لـ cssDNA متساوي المنشأ. ( أ ) تم تجميع Miniphage phPB52 ...

إنتاج شاكر دورق نقي ...

إنتاج دورق شاكر من cssDNA النقي. ( أ ) نمو دورق شاكر ...

إنتاج دفعة تخمير نقية ...

إنتاج دفعة التخمر من نقي cssDNA. ( أ ) إنتاج قابل للتطوير في ...

تطبيقات صغيرة قابلة للتطوير ومتساوية المنشأ ...

تطبيقات إنتاج miniphage قابل للتطوير ومتساوي المنشأ. ( أ ) خماسي البيبراميد من 52 نقطة أساس ...


التمويل الداخلي من NEB و Ginkgo Bioworks. تمويل رسوم الوصول المفتوح: New England Biolabs.

بيان تضارب المصالح. فلاديمير بوتابوف ، جينيفر إل أونج ، برادلي دبليو لانجورست ، كاثرينا بيلوتي ، توماس سي إيفانز جونيور ، جريجوري ج. Lohman موظف في New England Biolabs ، الشركة المصنعة والموردة لكواشف البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك ligases DNA. لا يؤثر هذا الانتماء على حياد المؤلفين أو التزامهم بمعايير المجلة وسياساتها أو توفر البيانات.

دان كاهون ، باري كانتون ، وتوماس إف نايت موظفون في شركة Ginkgo Bioworks، Inc. ، وهي شركة تستخدم الإنزيمات والكواشف لتخليق الجينات في سياق تطوير الميكروبات المهندسة. لا يؤثر هذا الانتماء على حياد المؤلفين أو التزامهم بمعايير المجلة وسياساتها أو توفر البيانات.


شاهد الفيديو: From DNA to protein - 3D (كانون الثاني 2022).