معلومة

هل محتوى AT أو GC مهم في الرحلان الكهربائي؟


هل سيحدث فرقًا في سرعة التشغيل إذا قمنا بتشغيل عينات من نفس عدد القواعد ولكن محتوى AT - GC مختلف؟


إنه يحدث فرقًا في بولي أكريلاميد. A و C أسرع بينما G و T أبطأ.

صورة من النشر:

"المعايير" هي جزيئات AAA / TTT / GGG / CCC.


من الناحية العملية ، لم أر أي فرق من قبل ، لكن المواد الهلامية التي تستخدم عادة في المختبر لا تتمتع بأعلى دقة. هناك ورقة واحدة توضح أن الشكل (شكل A أو B) ومحتوى GC يلعبان دورًا لأن جزيئات الحمض النووي ذات المحتوى العالي من GC أقل مرونة وبالتالي تواجه مشكلات أكثر في الوصول إلى مصفوفة agarose. ورقة مثيرة للاهتمام ، ولكن ربما لا تكون ذات صلة كبيرة بالمختبر (يمكنك العثور على المزيد حول هذا الموضوع تحت عنوان "المنشورات ذات الصلة" على الجانب الأيمن من موقع PubMed):

ومع ذلك ، هناك تقنية تستخدم محتوى GC المختلفة لعينات الحمض النووي. يطلق عليه "تغيير طبيعة هلام التدرج الكهربائي" ويستخدم التدرجات (إما كيميائية أو درجة حرارة) لتغيير طبيعة الحمض النووي على الجل. اعتمادًا على محتوى GC ، يحدث هذا مبكرًا أو لاحقًا ، مما يؤثر على نمط الهجرة (الحمض النووي المشوه هو أكبر بكثير وأبطأ). انظر هنا لمزيد من التفاصيل.


DENATURING GRADIENT ELECTROPHORESIS (DGGE): نظرة عامة

تخيل سيناريو ، حيث يكون لديك مريض مصاب بعدوى تهدد الحياة. قد يحتاج مثل هذا المريض إلى علاج سريع بمضادات الميكروبات. ومع ذلك ، في علم الأحياء الدقيقة الإكلينيكي ، هناك هذا السباق المستمر مع الزمن في تحديد هذه الكائنات المسببة للأمراض بحيث يمكن توفير علاج فعال. في الواقع ، في كثير من الأحيان ، لا يتم تحديد الكائن الحي المسبب للمرض إلا بعد وفاة المريض. هذا في المقام الأول لأن طرق الاستزراع التقليدية يمكن أن تكون شاقة ، وفي حالة الثقافات المختلطة ، يلزم إجراء تحليلات أخرى لتحديد الكائنات الحية الدقيقة على مستوى الأنواع. مجتمعة ، يمكن أن تستغرق العملية بأكملها وقتًا طويلاً ، حيث يلزم أحيانًا أكثر من شهر لتحديد الكائن الحي المسبب للمرض بدقة (2).

لذلك من المهم إيجاد طرق لحل هذه المشكلات الموجودة في طرق الاستزراع المكثف ، ويعتبر PCR-DGGE (تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يفسد طبيعة هلام التدرج الكهربائي) أحد هذه الطرق. في جوهرها ، يتضمن PCR-DGGE تضخيم الحمض النووي بواسطة بادئات خاصة بالجنس تستهدف تسلسل 16S rDNA والتمايز اللاحق لهذا الحمض النووي على هلام DGGE (1-5).

الحمض النووي هو جزيء مسؤول عن الحفاظ على المعلومات الجينية عبر الأنواع وعبر الوقت. وهو يتألف من ترتيب هادف للمواد الكيميائية تسمى النيوكليوتيدات التي يرمز لها بـ "A" و "T" و "C" و "G." تخبرنا هذه الترتيبات قصة كل كائن حي أو فرد ، من حيث أن الكود الذي ينتجه ، يمثل كتاب تعليمات مفصل لهذا الكائن أو الفرد. يُطلق على أي تغيير يتم إدخاله في هذا التسلسل اسم طفرة ، وبينما تحدث الطفرات بشكل عشوائي ، يتحمل العديد منها عندما "يتأقلم" الكائن الحي مع بيئة جديدة. ومن ثم ، فإن مراقبة وفهم هذه الطفرات من شأنه بلا شك تحسين فهمنا للكائنات الحية المتبقية والعابرة في مجموعة متنوعة من البيئات عندما تكون الملاحظة صعبة. على سبيل المثال ، قد يكون هذا مفيدًا لرصد التجمعات الميكروبية ، حيث تقصر الأساليب المعتمدة على الثقافة.

تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج (DGGE) هو أسلوب يحاول القيام بذلك. نهج البيولوجيا الجزيئية هذا هو منهجية البصمات التي أدت إلى تغييرات ثورية في العديد من الإجراءات التقليدية المستخدمة في تقييم التجمعات الميكروبية (1). لذلك ، سوف تشرح هذه الورقة بإيجاز عددًا من التطبيقات التي تتضمن هذه التقنية وستدرس أيضًا كيفية عمل DGGE بشكل عام.

تطبيقات PCR-DGGE

تم تصنيف PCR-DGGE كجزء من النظام الجديد للإيكولوجيا الميكروبية الجزيئية (5). تهدف البيئة الميكروبية إلى دراسة التفاعلات بين الكائنات الحية الدقيقة وبين الكائنات الحية الدقيقة وبيئتها. وهذا ينطوي على دراسة طويلة الأجل ، والتي تشمل تحليل عينات بيئية متنوعة ومتعددة (5). ومع ذلك ، فإن طرق الاستنساخ والتهجين والثقافة التقليدية كما هو مذكور أعلاه ليست دائمًا عملية لمثل هذه التحقيقات. علاوة على ذلك ، لا توفر هذه التقنيات أي معلومات عن ديناميات المجموعات الميكروبية في النظم البيئية المعقدة والتأثيرات المحتملة للتغيرات البيئية على هذه المجموعات (4 ، 5 ، 6). والأهم من ذلك ، تتطلب هذه الأساليب معرفة موسعة بالكائنات الدقيقة لتطوير تحقيقات مكيفة تستهدف أفرادًا معينين من بين مجموعات سكانية متنوعة (5).

يتميز PCR-DGGE بأنه لا يتطلب معرفة مسبقة عن المجموعات الميكروبية. إنه نهج لبصمات الأصابع يمكن أن يولد نمطًا من التنوع الجيني في النظم البيئية الميكروبية المعقدة مثل المسالك المعدية المعوية ، والتربة ، والرواسب ، وأعماق البحار ، والأنهار ، والينابيع الساخنة ، والأغشية الحيوية (4 ، 5). تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في قدرتها على تحديد التغييرات التي تحدث في مجتمعات ميكروبية مختلفة ومراقبتها ، والتي تخضع لعلاجات أو تعديلات مختلفة. إنها تقنية فصل سريعة وفعالة من نفس طول تسلسل الحمض النووي (تضخيمها بواسطة PCR) ، والتي قد تختلف قليلاً مثل تعديل زوج أساسي واحد (4 ، 5 ، 6).

علاوة على ذلك ، تعد PCR-DGGE طريقة مرنة تسمح بمجموعة فريدة من الأساليب المختلفة لتحديد أكثر دقة ، على سبيل المثال ، الجينات الوظيفية الموجودة في مجموعات بكتيرية معينة أو أنواع بكتيرية معينة باستخدام التهجين أو تحقيقات خاصة بالأنواع (2 ، 4) ، 5). يمكن استخدام هذه المنهجية في مجالات متنوعة مثل علم الأحياء الدقيقة السريرية والبيئية وسلامة الأغذية.

PCR-DGGE في علم الأحياء الدقيقة السريرية

أمثلة على تطبيقات DGGE في علم الأحياء الدقيقة السريرية كثيرة. على سبيل المثال ، سمحت DGGE بتحديد هوية أكثر من 65 الميكوبلازما الأنواع ذات الأصول البشرية والبيطرية في أقل من 24 ساعة (7). الميكوبلازما هي كائنات حساسة تتطلب عدة أسابيع لزرعها واختبارات مصلية أخرى لتحديدها. تسبب الأمراض المختلفة المرتبطة بالالتهاب الرئوي والتهاب المفاصل والتهاب الملتحمة والعقم والإجهاض (7). يمكن أن يتيح تطبيق PCR-DGGE هذا توفيرًا كبيرًا في الوقت والعمر وتكاليف العلاج.

ومن الإنجازات المهمة الأخرى أن DGGE قد تم تأسيسها لتكون لديها إمكانات حقيقية في فحص عدد كبير من المرضى لتحديد سريع وموثوق للتغيرات الضارة في كل من جينات سرطان الثدي. BRCA1 و BRCA2. (8). ومن ثم سمح PCR-DGGE باكتشاف العديد من الطفرات وكشف عن وجود متغيرات غير مصنفة لم يتم الإبلاغ عنها من قبل (8). استطاعت هذه الطريقة أيضًا إثبات أن الحيوانات ، مثل تمساح النيل ، والبابون ، والباندا الأحمر ، والذئب ، وثعبان الجمال التايواني ، يمكن أن تصاب أيضًا بالعدوى. هيليكوباكتر أنواع البكتيريا المشتبه في أنها مسؤولة عن قرحة المعدة (9).

PCR-DGGE في علم الأحياء الدقيقة البيئي وسلامة الأغذية

تعد PCR-DGGE أيضًا أداة مفيدة في دراسة المجتمعات الميكروبية المعقدة مثل الجهاز الهضمي (GI) للحيوانات المنتجة للغذاء. الحيوانات المنتجة للغذاء هي حيوانات تربى لإنتاج الحليب واللحوم والبيض. يمكن لهذه الحيوانات أن تحمل الكائنات الحية المسببة للأمراض في الجهاز الهضمي طوال سلسلة الإنتاج إلى سوق التجزئة ومن سوق التجزئة إلى مائدة عشاء المستهلك (10). لذلك من المهم جدًا توضيح التجمعات الميكروبية الدقيقة للجهاز الهضمي للحيوانات المنتجة للغذاء. سيسمح هذا بتحكم أفضل في التخلص من سلالات البكتيريا القاتلة في السماد الذي يستخدم كسماد للمنتجات مثل الفواكه والخضروات.

إن انتشار بكتيريا الإشريكية القولونية على السبانخ في كاليفورنيا مؤخرًا هو تذكير مؤلم بأنه حتى النباتيين ليسوا في مأمن من الأضرار التي تسببها الحالة الصحية المتدهورة للحيوانات المنتجة للغذاء. إن الحاجة إلى طرق سريعة ودقيقة لفحص مجموع المجموعات الميكروبية في النظم البيئية المعقدة أصبحت أكثر وضوحًا من أي وقت مضى. أثبت PCR-DGGE أنه أداة قوية في تقييم إجمالي مجموعات الميكروبات في الأمعاء ، كما تم استخدامه للكشف عن أنواع البكتيريا غير المعروفة سابقًا في الجهاز الهضمي للحيوانات (1 ، 2 ، 9 ، 11). إن فهم العلاقة بين المضيف والكائنات المسببة للأمراض سيساعدنا بالتأكيد في تحديد تدابير فعالة للسيطرة على مسببات الأمراض. هذا ذو أهمية قصوى في سلامة الأغذية وتجهيز الأغذية حيث تتطلب برامج مراقبة الجودة والتأكيد طرقًا بارعة لوقف دورة انتقال الميكروبات التي تهدد الحياة.

أخيرًا وليس آخرًا ، تم استخدام PCR-DGGE لفحص النظم الإيكولوجية المعقدة مثل الأنهار والبحار والتربة والفتحات الحرارية المائية في أعماق البحار (4 ، 5 ، 12 ، 13). من المؤكد أن فهم المجموعات الميكروبية المعقدة سيساعدنا في اتخاذ القرار السريع فيما يتعلق بالعلاج المناسب والتدخلات الرئيسية الأخرى التي تهدف إلى جعل العالم مكانًا أفضل وأكثر أمانًا للعيش فيه.

أولاً ، يتم تضخيم شظايا الحمض النووي من عينة تحتوي على كائنات متعددة باستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (لمعرفة المزيد عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، انقر فوق الرابط التالي). تستلزم هذه المنتجات المكبرة بشكل عام تسلسلات محفوظة جيدًا من كائن حي إلى كائن حي - على سبيل المثال ، متواليات لـ 16S rDNA خيار شائع. ثم تخضع هذه المجموعة من الأجزاء لمكون DGGE للإجراء.

DGGE هو نوع خاص من الرحلان الكهربي للهلام حيث يتم استخدام حرارة ثابتة (حوالي 60 درجة مئوية) وتركيز متزايد من المواد الكيميائية التي تغير طبيعة الخلايا لإجبار جزيئات الحمض النووي على الاسترخاء. تخبرنا لمحة سريعة عن الرحلان الكهربائي أن هذه تقنية فصل تعتمد على الشحنة الكهربائية والشكل والوزن الجزيئي للجسيمات مثل الحمض النووي والبروتينات والحمض النووي الريبي (3). في DGGE ، ينجذب الحمض النووي ، وهو سالب الشحنة ، بواسطة القطب الموجب ويُجبر على الهجرة عبر مسام هلام بولي أكريلاميد. بمجرد وصوله إلى تركيز الكواشف التي تفسد عنده ، يقال إنه ذاب. يحدد هذا مجالات الانصهار (4 ، 5) ، والتي يتم تعريفها على أنها امتدادات من أزواج أساسية مع درجة حرارة انصهار متطابقة (4). بمعنى آخر ، أزواج القاعدة المكونة من النيوكليوتيدات A (الأدينين) و T (الثايمين) ، وتلك التي تكونت بواسطة C (السيتوزين) و G (الجوانين) يتم صهرها كيميائيًا. ما يحدث أساسًا هو أن الرابطة الهيدروجينية بين أزواج القاعدة تنكسر بسبب درجة الحرارة والتدرج المتزايد للمواد الكيميائية التي تغير طبيعة (اليوريا والفورماميد) (4 ، 5). سيؤدي أي اختلاف في تسلسل الحمض النووي داخل هذه المجالات إلى درجات حرارة انصهار مختلفة ، مما يتسبب في انتقال تسلسلات مختلفة في مواضع مختلفة في الهلام (4). يوفر هذا DGGE القدرة على التمييز بين تسلسل النوع المتحول والبرية دون معرفة مسبقة بماهية هذه التسلسلات ، مما يبرر سبب استخدام هذه الطريقة لاكتشاف الطفرات داخل الكائنات الحية وثيقة الصلة (1 ، 2).


الشكل 1: مثال على هلام DGGE يعرض تركيبات الفرقة لعينات سكانية مختلفة ، ممثلة للنظم الإيكولوجية الميكروبية المعقدة. يمثل كل نطاق في كل ممر منتجًا مضخمًا 16S ينتقل إلى موضع فريد في الهلام ، والذي يذوب بطريقة تعتمد على التسلسل.

يتم أيضًا مساعدة هذا الفصل بشكل كبير عندما يتم ربط تسلسل قصير من G و C (حوالي 40 نيوكليوتيد) ، غالبًا ما يسمى GC-clamp ، بنهاية واحدة من منتجات الحمض النووي المكبرة (4 ، 6). يمكن القيام بذلك عن طريق دمج تسلسل GC هذا في أحد البادئات المستخدمة لتضخيم شظايا 16S rDNA.

لا يمكن إنكار أن DGGE هو نهج قيم في فحص النظم البيئية المعقدة على نطاق واسع وفي تحليل العينات البيئية المختلفة في فترة زمنية أقل. باستخدام هذه التقنية ، يمكن أن يصبح تشخيص العدوى الناشئة أسهل وأسرع ، ويمكن الآن أيضًا تسهيل تحديد مسببات الأمراض غير القابلة للزراعة. على الرغم من وجود قيود ، فإن DGGE هو نهج مثير للاهتمام وفريد ​​من نوعه يربط العديد من أدوات البيولوجيا الجزيئية معًا ، وتعزى حدوده في المقام الأول إلى حقيقة أنه لا يزال أسلوبًا جديدًا نسبيًا. إذا تحسن ،

1. McAuliffe L ، Ellis RJ ، Lawes JR ، Ayling RD ، Nicholas RA. 2005. 16S rDNA PCR وتغيير طبيعة الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج اختبار عام واحد لاكتشاف وتمييز أنواع الميكوبلازما. J ميد ميكروبيول. 54 (بط 8): 731 - 9.

2. Walter J ، Tannock GW ، Tilsala-Timisjarvi A ، Rodtong S ، Loach DM ، Munro K ، Alatossava T. 2000. اكتشاف وتحديد أنواع العصيات اللبنية المعوية باستخدام تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج وبادئات PCR الخاصة بالأنواع. أبيل إنفيرون ميكروبيول. 66 (1): 297-303.

3. كريتون ، توماس سي. 1999. موسوعة البيولوجيا الجزيئية ، المجلدات 1-4. جون وايلي وأولاده # 038.

4. Muyzer G، de Waal EC، Uitterlinden AG. 1993. تحديد سمات المجموعات الميكروبية المعقدة عن طريق تغيير طبيعة تحليل الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج لترميز الجينات المتضخمة لتفاعل البوليميراز لـ 16S rRNA. أبيل إنفيرون ميكروبيول. 59 (3): 695-700.

5. مويزر جيرارد وسمولا كورنيليا. 1998. تطبيق تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج (DGGE) والرحلان الكهربائي للهلام بالتدرج في درجات الحرارة (TGGE) في علم البيئة الميكروبية. أنتوني فان ليفينهوك. 73: 127 - 141.

6. شيفيلد VC ، كوكس DR ، ليرمان LS ، مايرز آر إم. 1989. إرفاق تسلسل غني بـ 40 زوجًا من G + C (مشبك GC) بشظايا الحمض النووي الجيني عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل يؤدي إلى تحسين الكشف عن التغييرات أحادية القاعدة. بروك Natl Acad Sci U S A. 86 (1): 232-6.

7. ماكوليف لورا ، إليس ريتشارد جيه ، لوز جو آر ، أيلينج روجر دي ونيكولاس روبن إيه جيه. 2005. 16S rDNA PCR وتغيير طبيعة الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج اختبار عام واحد لاكتشاف وتمييز أنواع الميكوبلازما. J ميد ميكروبيول 54: 731-739.

8. van der Hout Annemarie H.، van den Ouweland Ans MW، van der Luijt Rob B.، Gille Hans JP، ¨lle Bodmer Danie، Bru¨ggenwirth Hennie، Mulder Inge M.، van der Vlies Pieter، Elfferich Peter، Huisman مارتن ت. ، عشرة بيرج أنيليس إم ، كروموسويتو جوان ، يانسن رومو بي إم ، فان زون باتريك إتش إيه ، فريسمان ثيرسا ، فنون نيلتجي ، بوتمي دي لانج ماجيلا ، أوسترويك جان سي ، مييرز-هيجيبور هان ،. Ausems Margreet GEM و Hoogerbrugge Nicoline و Verhoef Senno و Halley Dicky JJ و Vos Yvonne J. و Hogervorst Frans و Ligtenberg Marjolijn و Hofstra Robert MW. 2006. نظام DGGE للفحص الشامل لتحول BRCA1 و BRCA2: تطبيق في عيادة السرطان الهولندية ضبط. الطفرة البشرية. 27 (7): 654-666.

9. السعود وليد أبو ، بنيدسن مادس ، و. ستيفن إل أون ، أويس بن سينا ​​، فاندامي بيتر ، نيلسون هانز أولوف ، ليونج أوسا ، ودستروم توركل. تقييم PCR-DGGE لتحديد أنواع مختلفة من هيليكوباكتر ، وتطبيقها على عينات البراز من حيوانات حديقة الحيوان لتحديد انتشار هيليكوباكتر. J ميد ميكروبيول 52 (2003) ، 765-771

10. المجلس القومي للبحوث. لجنة تعاطي المخدرات في أغذية الحيوانات. حلقة نقاش حول صحة الحيوان وسلامة الأغذية والصحة العامة. مجلس الزراعة. مجلس الغذاء والتغذية. استخدام الأدوية في أغذية الحيوانات. الفوائد والمخاطر. واشنطن العاصمة: مطبعة الأكاديمية الوطنية 1999.

11. جونج جيانهوا ، فورستر روبرت جيه ، يو هاي ،. تشامبرز جيمس آر ، صبور بارفيز إم ، ويتكروفت روجر وتشن شو. 2002. التنوع والتحليل الوراثي للبكتيريا في الغشاء المخاطي لدجاج سيكا ومقارنتها مع البكتيريا في تجويف الأعور. رسائل علم الأحياء الدقيقة FEMS. 208 (1): 1-7.

12. ناكاتسو سيندي هـ. ، تورسفيك فيجديس وأوفريوس ليز. تحليل مجتمع التربة باستخدام DGGE لمنتجات تفاعل البوليميراز التسلسلي 16S rDNA. مجلة جمعية علوم التربة الأمريكية 64: 1382-1388.

13. Muyzer G، Teske A، Wirsen CO، Jannasch HW. 1995. العلاقات التطورية لأنواع Thiomicrospira وتحديدها في عينات التنفيس الحراري المائي في أعماق البحار عن طريق تغيير طبيعة الفصل الكهربائي للهلام المتدرج لشظايا الحمض النووي الريبي 16S. قوس ميكروبيول. 164 (3): 165-72.


المواد والأساليب

تعيين ملفات القراءة

تتكون مجموعة البيانات الرئيسية التي نستخدمها من عينتين من الحمض النووي لمريض سرطان المبيض: عينة واحدة من الورم وعينة أخرى طبيعية (من خلايا الدم البيضاء). تم تحويل كل عينة من عينات الحمض النووي هذه إلى مكتبتين منفصلتين للأجزاء ، تختلف في توزيع طول الجزء. تم تسلسل الأجزاء على كلا الطرفين - قراءة 75 نقطة أساس في كل طرف - وفقًا لإجراءات Illumina القياسية. ثم تم تعيين كل جزء مرة أخرى إلى الجينوم المرجعي البشري ، بناءً على قراءة 5. تم تعيين أزواج القراءة المتسلسلة هذه إلى مرجع باستخدام BWA (الإصدار 0.4.9 ، 15). تم تعيين الجينومات البشرية إلى NCBI build 36 الإصدار 3 (//ftp.ncbi.nih.gov/genomes). البيانات متاحة في NCBI Sequence Read Archive تحت أرقام الانضمام SRX011739 (ورم) و SRX011777 (عادي). ما لم يذكر خلاف ذلك ، فإن جميع المؤامرات مأخوذة من كروموسوم 1 (chr1) من Lib1 العادي. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتحليل عينة أخرى من خط خلايا ورم الثدي (الشكل 11) مكتبات جينوم صحية تم إنشاؤها بموجب بروتوكولات محسّنة (الشكلان التكميليان S5 و S6) ، وبيانات من تجربة تسلسل ChIP لأرابيدوبسيس (الشكلان التكميليان S7 و S8). لمزيد من التفاصيل انظر الجدول 1.

قائمة مجموعات البيانات التي تم تحليلها في هذه المقالة

اسم . نوع . تاريخ . معهد . شظايا (bp ± SD). يقرأ (بي بي).
TCGA-13-0723
ليب عادي 1 عادي المتطابق 4/09 اغسل يو 154 ± 17 75
ليب عادي 2 عادي المتطابق 4/09 اغسل يو 284 ± 38 75
الورم ليب 1 ورم المبيض 4/09 اغسل يو 173 ± 22 75
الورم ليب 2 ورم المبيض 4/09 اغسل يو 293 ± 31 75
HCC1569 ورم الثدي 1/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 507 ± 40 45
SRX040660 عادي المتطابق 9/10 واسع 172 ± 19 101
SRX040661 عادي المتطابق 9/10 واسع 173 ± 19 101
ممثل رقاقة 1 أرابيدوبسيس 7/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 100 ب 36
ممثل رقاقة 2 أرابيدوبسيس 7/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 100 ب 36
اسم . نوع . تاريخ . معهد . شظايا (bp ± SD). يقرأ (بي بي).
TCGA-13-0723
ليب عادي 1 عادي المتطابق 4/09 اغسل يو 154 ± 17 75
ليب عادي 2 عادي المتطابق 4/09 اغسل يو 284 ± 38 75
الورم ليب 1 ورم المبيض 4/09 اغسل يو 173 ± 22 75
الورم ليب 2 ورم المبيض 4/09 اغسل يو 293 ± 31 75
HCC1569 ورم الثدي 1/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 507 ± 40 45
SRX040660 عادي المتطابق 9/10 واسع 172 ± 19 101
SRX040661 عادي المتطابق 9/10 واسع 173 ± 19 101
ممثل رقاقة 1 أرابيدوبسيس 7/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 100 ب 36
ممثل رقاقة 2 أرابيدوبسيس 7/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 100 ب 36

Lib1 و Lib2 من نفس العينة.

يعتمد متوسط ​​و SD لطول الجزء على رسم الخرائط المزدوجة عند توفرها ، أو تقديرات إعداد المكتبة بغير ذلك.

قائمة مجموعات البيانات التي تم تحليلها في هذه المقالة

اسم . نوع . تاريخ . معهد . شظايا (bp ± SD). يقرأ (بي بي).
TCGA-13-0723
ليب عادي 1 عادي المتطابق 4/09 اغسل يو 154 ± 17 75
ليب عادي 2 عادي المتطابق 4/09 اغسل يو 284 ± 38 75
الورم ليب 1 ورم المبيض 4/09 اغسل يو 173 ± 22 75
الورم ليب 2 ورم المبيض 4/09 اغسل يو 293 ± 31 75
HCC1569 ورم الثدي 1/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 507 ± 40 45
SRX040660 عادي المتطابق 9/10 واسع 172 ± 19 101
SRX040661 عادي المتطابق 9/10 واسع 173 ± 19 101
ممثل رقاقة 1 أرابيدوبسيس 7/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 100 ب 36
ممثل رقاقة 2 أرابيدوبسيس 7/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 100 ب 36
اسم . نوع . تاريخ . معهد . شظايا (bp ± SD). يقرأ (بي بي).
TCGA-13-0723
ليب عادي 1 عادي المتطابق 4/09 اغسل يو 154 ± 17 75
ليب عادي 2 عادي المتطابق 4/09 اغسل يو 284 ± 38 75
الورم ليب 1 ورم المبيض 4/09 اغسل يو 173 ± 22 75
الورم ليب 2 ورم المبيض 4/09 اغسل يو 293 ± 31 75
HCC1569 ورم الثدي 1/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 507 ± 40 45
SRX040660 عادي المتطابق 9/10 واسع 172 ± 19 101
SRX040661 عادي المتطابق 9/10 واسع 173 ± 19 101
ممثل رقاقة 1 أرابيدوبسيس 7/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 100 ب 36
ممثل رقاقة 2 أرابيدوبسيس 7/09 جامعة كاليفورنيا في بيركلي 100 ب 36

Lib1 و Lib2 من نفس العينة.

يعتمد متوسط ​​و SD لطول الجزء على رسم الخرائط المزدوجة عند توفرها ، أو تقديرات إعداد المكتبة بغير ذلك.

لكل مكتبة ، نتج عن هذا الإجراء قائمة الأجزاء. يمكن وصف كل جزء من خلال موقع طرفه الخماسي (كروموسوم وموقع وخيط) وطوله. تم الاستدلال على الطول من تعيين الطرف 3′ ، بناءً على محاذاة النهاية المزدوجة لـ BWA. تم الاحتفاظ فقط بالأزواج التي تم فيها تعيين قراءة 5 بشكل فريد (العلم XT: A: U of BWA) ، لأن تخصيص القراءات المعينة لمواقع متعددة حساس جدًا لشمولية المرجع. ومع ذلك ، لم نتجاهل زوجًا عندما لم يتم تعيين 3 وبالتالي لمعظم هذا التحليل ، فإن مجموعة الأجزاء مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها من البيانات أحادية النهاية. فقط عندما تتم مناقشة طول الجزء بشكل صريح ، قمنا بإزالة الأجزاء عندما لم يتم تعيين 3 (∼1٪ من الأجزاء). لم يتم تطبيق أي ترشيح إضافي للجودة.

نموذج Loess

ركزت التحليلات السابقة لـ GC على العلاقة بين عدد الأجزاء وتكوين GC لأحجام حاوية معينة (انظر ، على سبيل المثال ، المرجع 6 ، 16). نسمي هذا "نموذج اللوس" ، ونصف بإيجاز كيف نعيد إنتاج مثل هذا التقدير. بالنسبة إلى حاوية معينة (فترة الجينوم) ، فإن GC هي جزء من قواعد G و C في تلك الحاوية وفقًا للجينوم المرجعي. عدد الحاويات هو العدد الإجمالي للأجزاء (الأمامية) ذات النهايات 5′ داخل الحاوية. لحساب تفرد التسلسلات ، يتم حساب مقياس قابلية التعيين لكل موضع (زوج أساسي) في الحاوية. يُطلق على الموقع اسم "قابل للتعيين" إذا كان ك - لا يتم تكرار الجينوم المرجعي الذي يبدأ من الموقع تمامًا في أي مكان آخر في الجينوم ، حيث ك هو طول القراءة [المحدد بواسطة نص Python باستخدام مخطط Bowtie (17)]. يتم إجراء جميع التحليلات اللاحقة في R (18). يتم تحديد منحنى تحيز GC عن طريق انحدار اللوس للعدد بواسطة GC (باستخدام حزمة "loess" R) على عينة عشوائية من 10000 حاوية عالية التعيين (& gt0.9). يجب ضبط معلمة نعومة اللوس لإنتاج منحنيات سلسة ولكنها لا تزال تلتقط الاتجاه الرئيسي في البيانات. نستخدم 0.3 كقيمة افتراضية. يتم تعيين المعدلات المقدرة لقيم GC مع عدد قليل جدًا من نقاط البيانات على 0.

نماذج الموقف الواحد

نسمي "نماذج الموضع الفردي" تلك النماذج التي تقدر "متوسط ​​عدد الأجزاء" ( معدل ) للمواقع الفردية بدلاً من الصناديق. نحن نعتبر عائلة من هذه النماذج تربط عدد الأجزاء بـ GC ، حيث يبدأ العدد المتوقع للأجزاء (5′-end) عند x يعتمد على عدد GC في النافذة التي تبدأ أ BP من x . يوضح الشكل 1 الحالة التي يتم فيها حساب GC من نافذة 4-bp تبدأ من الجزء 5′-end. يمكن أن يتميز كل نموذج من هذا القبيل بالتحول أ والطول ل من نافذة GC "القيادة". دبليوأ , ل يشير إلى النموذج الذي يبدأ فيه عدد الأجزاء x (5′-end) يعتمد على GC بين x + أ و x + أ + ل . (سوف نستخدم ملفات GC ( x + أ , ل ) لعدد GC من ل تبدأ نافذة bp في x + أ ). على سبيل المثال ، في دبليو 0, ص يتم تحديد عدد الأجزاء بواسطة GC للأول ص BP للجزء. الموديل دبليوأ , ل لديها ل + 1 معدل المعلمات ، λ 0 … λ ل ، الموافق النوافذ مع GC = 0,…, ل .

تقدير نموذج الموقف الفردي. ( أ ) يتم أخذ عينات عشوائية من المواضع القابلة للتعيين على طول الجينوم (⇓) ( ب ) يتم تقسيم هذه المواضع إلى طبقات بواسطة عدد GC في النافذة المنزلقة المقابلة (هنا أ = 0, ل = 4) ( ج ) يتم حساب عدد الأجزاء (→) مع 5′-end (○) في مواقع أخذ العينات ( د ) يتم تقدير متوسط ​​معدلات التجزئة لكل طبقة ، مع الأخذ في الاعتبار النسبة بين عدد الأجزاء والمواقع في الطبقة. هذه تشكل منحنى GC (هنا منحنى أ = 75, ل = 50 من الشكل 4 ج).

تقدير نموذج الموقف الفردي. ( أ ) يتم أخذ عينات عشوائية من المواضع القابلة للتعيين على طول الجينوم (⇓) ( ب ) يتم تقسيم هذه المواضع حسب عدد GC في النافذة المنزلقة المقابلة (هنا أ = 0, ل = 4) ( ج ) يتم حساب عدد الأجزاء (→) مع 5′-end (○) في مواقع أخذ العينات ( د ) يتم تقدير متوسط ​​معدلات التجزئة لكل طبقة ، مع الأخذ في الاعتبار النسبة بين عدد الأجزاء والمواقع في الطبقة. هذه تشكل منحنى GC (هنا منحنى أ = 75, ل = 50 من الشكل 4 ج).

فيما يلي وصف لطريقتنا في تقدير المعلمات لنموذج موقف واحد دبليوأ , ل . كبير ( ن ≈ 10 مليون) عينة عشوائية من المواقع القابلة للتخطيط مأخوذة من الجينوم. تمت إزالة المناطق الجينومية الكبيرة التي تحتوي إما على عدد أجزاء صفرية أو ذات أعداد عالية للغاية (& gt0.99 كمي + متوسط) من العينة. يتم تقسيم العينة (طبقية) وفقًا لـ GC للجينوم المرجعي: إذا GC = GC ( x + أ , ل ) ثم الموقف x يتم تعيينه للطبقة سGC . يترك نGC تشير إلى عدد من المناصب المخصصة لها سGC . لاحظ أن التخصيص للطبقات يعتمد فقط على خصائص النموذج والجينوم المرجعي ، وليس على بيانات التسلسل.

مقارنة النماذج

النتيجة (TV) أعلاه مرجحة إل1 المسافة من المتوسط ​​العالمي مقسومة على (لذلك ستكون بين 0 و 1). بمعنى آخر ، إنها مسافة التباين الإجمالية بين التوزيع التجريبي لجزء واحد (تحت فئات GC المحددة) وتوزيع موحد. وبالتالي ، فإنه يقيس نسبة الأجزاء المتأثرة بالتقسيم الطبقي ، ويمكن مقارنته عبر مجموعات البيانات. نحن نبحث عن تلفزيون عالي ، مما يعني أن الأعداد تعتمد بشدة على GC تحت تصنيف طبقي معين. قد يشير هذا إلى أن التصحيح لمثل هذا النموذج أفضل تصحيح لاعتماد GC.

نماذج طول الشظايا

المعدلات المتوقعة

من حيث الجوهر ، نقوم "بتنعيم" الجزء المرصود باستخدام دبليوأ , ل . أي أننا نقدر عدد الأجزاء في x تحت النموذج دبليوأ , ل ، بمتوسط ​​كل هذه الأرقام الموجودة في x بنفس القيمة GC ( x + أ , ل ) (في عينة المواقع القابلة للتعيين لدينا). لذلك ، عندما نرغب في الإزالة ، أي تصحيح لتحيز GC ، كما تم تقييمه بواسطة دبليوأ , ل في x ، فإننا نقسم العدد المرصود للأجزاء المنبثقة من أي x بواسطة ميكرومترx . من الناحية العملية ، نادرًا ما نستخدم التصحيح النهائي بدقة زوج الأساس الفردي ، ولكن عادةً بعد التجميع في صناديق ، انظر أدناه.

تقييم

مقارنات مع اختلاف بواسون

وبالتالي ، يقيس RV مدى جودة التقاط النموذج لمعلمات المعدل ، ولا يمكن أن يكون أقل من تباين Poisson النقي. قارنا RV لنموذج قابلية التعيين (MR) ، و RV لنموذج GC (GR) الجزئي ، بتقدير مستقل لتباين Poisson النقي (). أعداد عالية للغاية [ Fب & gt 0.99 مقياس + متوسط ​​( F )] تم إزالتها من هؤلاء.

على الرغم من قيامنا بإزالة الأعداد الكبيرة جدًا ، لا يزال من الممكن أن تتأثر التباينات بمجموعة صغيرة نسبيًا من الصناديق ذات الأعداد الكبيرة. نود مقارنة التباين المتبقي للنماذج المختلفة بطريقة أكثر قوة لتلك. بعد المرجع. (20) ، ننظر إلى المنحنيات الكمية التجريبية. بالنسبة إلى نموذج معين ، قمنا بتجميع الأعداد من حاويات 1 كيلوبايت وفقًا لتوقعاتهم). حسبنا لكل مجموعة الكميات المرصودة 0.1 و 0.9. برسم مقابل المعدل المقدر للمجموعة ، يشكل كل مستوى كمي منحنى. تعكس المسافة بين المنحنيات التباين حول الوسائل المتوقعة. عندما تكون هذه المسافة أكبر بكثير من تلك الموجودة في Poisson ، فهذا يشير إلى أنه تم تخصيص معدلات مختلفة لنفس القيمة المتوقعة ، مما يعني أن الكثير من التباين لا يزال غير مفسر بواسطة النموذج.

توافر البرامج والبيانات

GCcorrect عبارة عن حزمة R تنفذ أساليب التحليل الاستكشافي والتقدير والتصحيح لتأثيرات محتوى GC ، وهي متاحة للتنزيل من http://www.stat.berkeley.edu/


الرحلان الكهربائي: المعنى والتعريف والتصنيف (مع رسم بياني)

يصف مصطلح الرحلان الكهربي هجرة الجسيمات المشحونة تحت تأثير المجال الكهربائي (الجسيمات المشحونة بالكهرباء وحركة الرحلان). تمتلك العديد من الجزيئات البيولوجية والجزيئية المهمة مثل الأحماض الأمينية والببتيدات والبروتينات والنيوكليوتيدات والأحماض النووية مجموعات قابلة للتأين ، وبالتالي ، في أي درجة حموضة معينة ، توجد في محلول كأنواع مشحونة كهربائيًا إما كاتيونات أو أنيونات.

تحت شحنة المجال الكهربائي ، ستهاجر هذه الجسيمات المشحونة إما إلى الكاثود أو إلى & nbsp ؛ اعتمادًا على طبيعة شحنتها الصافية. هذه واحدة من أكثر العمليات الأساسية المستخدمة في جميع أنواع التجارب الجزيئية البيولوجية والشيوجية و RDT.

تعريف الرحلان الكهربائي:

الرحلان الكهربائي هو هجرة الجسيمات أو الجزيئات المشحونة في وسط تحت تأثير المجال الكهربائي المطبق.

يعتمد معدل هجرة الجزيئات والمول المشحونة على العوامل التالية:

(أ) قوة المجال الكهربائي والحجم والشكل.

(ب) الكراهية النسبية للعينة.

(ج) القوة الأيونية ودرجة حرارة المخزن المؤقت.

(د) الحجم الجزيئي للجزيء الحيوي المأخوذ.

(هـ) صافي كثافة الشحنة من الخلد الحيوي المأخوذ.

(و) شكل الجزيء الحيوي المأخوذ.

في عملية التفريد الكهربي ، تواجه الجزيئات الكبيرة والصغيرة صعوبة أكبر في التحرك عبر الوسط الداعم (أي الهلام) بينما الوسيط الأصغر لديه قدرة أكبر على الحركة من خلاله.

تصنيف الرحلان الكهربي:

جميع الأجهزة الحديثة للرحلان الكهربي مزودة بوسائط داعمة هذه الأيام. الوسط الداعم هو دعم مادي يتم من خلاله فصل الجزيئات المشحونة. لها وظيفتان أساسيتان - الامتصاص والغربلة الجزيئية للجزيئات المأخوذة والتي يتم فصلها عن بعضها البعض.

يطرح سؤال الآن لماذا نأخذ وسيطًا داعمًا ولماذا لا نتبع المبادئ الأساسية للكيمياء الكهربية والكتلة ، باستخدام خزان كهربائي به قطبين لفصل هذه الشامات المشحونة والكتل. هذا ما تم فعله في الأيام الخجولة.

العمل الرائد على elec & shytrophoresis بواسطة Tiselieus et al. في عام 1948 تم إجراؤها في حل مجاني فقط. ومع ذلك ، سرعان ما تم إدراك أن العديد من المشاكل المرتبطة بهذا النهج ، لا سيما الآثار الضارة لتيارات الحمل (التيار الناجم عن تمدد سائل أو صلب أو غاز مع ارتفاع درجة حرارته.

هذا يجعل الجزيئات المنفصلة مشوهة ومركبة للغاية ومرتبة بشكل خجول) ، ويمكن تصغيرها عن طريق sta & shybilizing من الوسط. تم تحقيق ذلك من خلال إجراء الرحلان الكهربي على دعامة مسامية و shychanical. نظرًا لزوجته (التي لا توجد في المحلول الحر) ، فإن الدعم الخاص بي والشيديا يخفضان تيارات الاتفاقية التي نحصل عليها من الجزيئات المنفصلة في مناطق حادة.

بعض وسائط الدعم والخجل المستخدمة بشكل متكرر هي النشا والأجار وبولي أكريلاميد والأغاروز. اعتمادًا على وجود أو عدم اكتراث الوسائط الداعمة ، يمكن تصنيف الرحلان الكهربي على أنه رحلان كهربائي حر ورحلان كهربائي للمنطقة.

أ. رحلان كهربائي مجاني:

في هذا النوع من الرحلان الكهربي ، يتم أخذ كهرباء وخجول حر بدلاً من الوسائط الداعمة. في الوقت الحاضر ، أصبح هذا النوع من الرحلان الكهربائي قديمًا ويستخدم في الغالب في التجارب غير البيولوجية.

يتكون في الغالب من نوعين - الرحلان الكهربائي الصغير الذي يستخدم في الغالب في حساب إمكانات زيتا (دعامة غروانية وخالية من الخلايا في وسط سائل) للخلايا والرحلان الكهربي المتحرك الذي تم استخدامه لسنوات عديدة للتحليل الكمي للمركب مخاليط من macromol و shyecules ، وخاصة البروتينات.

ب. منطقة الرحلان الكهربائي:

هذه هي تقنية الرحلان الكهربي الأكثر شيوعًا واللمعان في هذه الأيام. في هذا النوع من الرحلان الكهربائي والكهربائي ، تتم عملية الفصل على وسط استقرار كما نوقش أعلاه.

الرحلان الكهربائي للمنطقة هو من الأنواع التالية

(ب) الرحلان الكهربائي لخلات السليلوز

(ج) الرحلان الكهربائي الشعري

(د) الرحلان الكهربي للهلام & # 8211 الذي يتداخل أيضًا مع الرحلان الكهربائي لهلام Agarose و SDS PAGE و PFGE والكهرباء ثنائية الأبعاد والرحلان الشعاعي.

ج. الرحلان الكهربائي للورق:

في هذا النوع من الرحلان الكهربائي ، يتم استخدام ورق الترشيح (مثل ورق الكروماتوغرافيا) الذي يتمتع بقدرة امتصاص طفيفة وحجم مسام موحد كوسيط داعم لفصل العينات تحت تأثير المجال الكهربائي المطبق. أثناء تنفيذ الورق الكهربائي والرحلان الشعاعي ، يتم ترطيب شريط من ورق الترشيح بمخزن مؤقت ويتم غمر أطراف الشريط في الخزانات العازلة التي تحتوي على الأقطاب الكهربائية.

يتم رصد العينات في وسط الورقة ، ويتم تطبيق جهد عالي ، وتهاجر النقاط وفقًا لشحناتها. بعد الرحلان الكهربائي والكهربائي ، يمكن اكتشاف المكونات المنفصلة عن طريق مجموعة متنوعة من تقنيات التلوين ، اعتمادًا على هويتها الكيميائية.

(أ) يتم إجراء تحليل المصل لغرض التشخيص عن طريق الرحلان الكهربائي للورق.

(ب) تم تحليل بروتين العضلات (الميوسين) وبروتين البيض (al & shybumin) وبروتين الحليب (الكازين) وسموم الثعابين والحشرات بشكل مرض باستخدام الرحلان الكهربائي للورق.

يستغرق وقتا طويلا جدا. هناك حاجة إلى حوالي 14-16 ساعة لعملية الفصل الكامل.

د- الرحلان الكهربائي لخلات السليلوز:

إنها نسخة معدلة من الورق الكهربائي والحصى الذي تم تطويره بواسطة Kohn في عام 1958. في هذا النوع من الرحلان الكهربائي ، يتم استخدام فلاتر الأسيتات ومرشحات الأسيتات الجرثومية بدلاً من ورق chro & shymatography العادي.

فيما يلي مزايا شرائح أسيتات السليلوز على ورق الكروماتوغرافيا:

(أ) شرائط أسيتات السليلوز نقية كيميائيًا وخالية من اللجنين والهيميسليلوز وتعمل عمومًا كحواجز في الحركة الحرة والخجل من الجزيئات الكبيرة.

(ب) بسبب انخفاض محتوى شرائط أسيتات السليلوز الجلوكوز ، فإن Eire مناسبة للتجويف الكهربائي وتحلل السكريات.

(ج) أسيتات السليلوز ليست محبة للماء وهذا يحمل القليل جدًا من المخزن المؤقت مما يساعد أيضًا في الحصول على حل أفضل في وقت قصير.

يستخدم بشكل خاص في التحقيقات السريرية مثل فصل البروتينات السكرية والدهون والشايتين والهيموجلوبين عن الدم.

E. الكهربائي الشعري:

يتم استخدام الشعيرات الدموية لأنبوب التجويف الضيق لفصل العينات بناءً على حجمها: نسبة الشحن. يعتبر الرحلان الكهربي الشعري (CE) تقنية فصل جديدة نسبيًا مقارنة بالتقنيات التقليدية مثل الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز أو SDS-PAGE.

يوفر ميزات جذابة للغاية تجعله تنافسيًا وبديلًا جيدًا. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لـ CE على تقنيات الفصل الأخرى في القدرة على فصل كل من الجزيئات المشحونة وغير المشحونة. في CE ، يتم إجراء فصل أيونات التحليل في محلول إلكتروليت (إلكتروليت في الخلفية) موجود في شعيرات ضيقة من السيليكا المنصهرة.

يتم غمر نهايات الشعيرات الدموية في قوارير (مدخل ومخرج) مملوءة بمحلول إلكتروليت ، والتي تحتوي أيضًا على أقطاب كهربائية متصلة بمصدر جهد عالي (الشكل 3.12). يتم إدخال محلول العينة في الأنبوب الشعري على شكل سدادة صغيرة عن طريق الضغط على (الحقن الهيدروديناميكي) أو الجهد (الحركية الكهربية في الحقن والحشو).

مع تطبيق الجهد العالي (5 - 30 كيلو فولت) عبر الشعيرات الدموية ، تتشكل مناطق التحليل بسبب الحركات الكهربية والحركية المختلفة للأنواع الأيونية وتهاجر نحو جانب مخرج الشعيرات الدموية. في الواقع ، يمكن فصل الأيونات المختلفة عندما تختلف نسبة الشحن / الحجم. قبل الوصول إلى نهاية الشعيرات الدموية ، يتم الكشف عن نطاقات التحليل المنفصلة مباشرة من خلال الجدار الشعري والشيلاري.

(أ) كفاءة فصل عالية

(ج) انخفاض استهلاك العينة والإلكتروليت

بسبب قطر الأنبوب الشعري الصغير ، تتبدد الحرارة مما يؤدي إلى زيادة الانتشار. نتيجة لهذا القرار ليس دائما مناسبا.

يستخدم CE في التحليل التالي للمواد الغذائية والمنتجات الصيدلانية والملوثات البيئية.

F. الرحلان الكهربائي للهلام:

يتضمن الرحلان الكهربائي للهلام استخدام الهلام كوسائط داعمة لفصل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتينات تحت تأثير الشحنة الكهربائية. يتم إجراؤه عادةً لأغراض تحليلية ولكن يمكن استخدامه كطريقة تحضيرية لتنقية الجزيئات جزئيًا قبل استخدامها في طرق أخرى مثل مواصفات الكتلة وقياس الضغط ، و PCR ، والاستنساخ ، وتسلسل الحمض النووي ، والنشاف المناعي.

هذا هو الرحلان الكهربي الأكثر استخدامًا في مختبرات التكنولوجيا الحيوية ويستخدم تقريبًا لجميع أنواع التجارب السابقة والخطيرة في RD.

القوة الدافعة الكهربائية (EMF) المتولدة عبر الأقطاب الكهربائية تدفع أو تسحب الخلد والكتل (الأحماض النووية أو البروتينات) عبر مصفوفة الهلام. تتحرك الجزيئات نحو القطب الموجب إذا كانت سالبة الشحنة أو باتجاه القطب السالب إذا كانت موجبة الشحنة.

جهاز الرحلان الكهربائي للهلام من نوعين:

(أ) جهاز الجل العمودي:

يتم استخدامه لفصل البروتينات في SDS-PAGE.

(ب) جهاز الجل الأفقي:

يتم استخدامه في الرحلان الكهربي المناعي ، والتركيز الكهروضوئي والرحلان الكهربائي للحمض النووي والحمض النووي الريبي في هلام الاغاروز.

أنواع الرحلان الهلامي الكهربائي:

(أ) Agarose Gel الكهربائي:

إن وسيط sup & shyporting في هذا النوع من الرحلان الكهربائي والكهربائي هو هلام agarose. يستخدم هذا في الرحلان الكهربائي للأحماض النووية مثل DNA و RNA.

عندما يتم تطبيق فرق جهد عبر الأقطاب الكهربائية لخزان كهربي أفقي يحتوي على هلام agarose وجزيئات حيوية (مثل الأحماض النووية) ، يتم فصلها وفقًا لحجمها الجزيئي (الجزيئات الأكبر لها حجم جزيئي أكبر والجزيئات الأصغر لها جزيئات صغيرة الحجم) والانتقال إلى الأقطاب الكهربائية الخاصة بهم. هنا يعمل هلام الاغاروز كمنخل.

كما هو الحال في الغربال ، تبقى الجزيئات الكبيرة في الأعلى وتمر الجسيمات الأصغر من حجم المسام من خلاله ، وبالمثل في الهلام تبقى الجزيئات الأكبر حجماً والجزيئات الضخمة في الخلف بينما تتحرك الجزيئات الأصغر بشكل أسرع وبسرعة نحو الأقطاب الكهربائية الخاصة بها.

قد يتخيل هذا المحترف واللامبالاة وكأنه منافسة جارية. الشخص الذي يكون نحيفًا وله جسم مرن وخجول سيكون في نقطة النهاية في وقت أقرب من الشخص الذي يكون سمينًا وضخمًا.

وهذا يشمل الجسم المادي للإعداد التجريبي.

وهي من ثلاثة أنواع:

(أ) جهاز الكهربي:

تم تصميم نظام Hori & shyzontal الكهربائي للهلام الكهربائي للحصول على فجوة سريعة وواضحة للغاية وحيوية لشظايا تقييد الحمض النووي في مواد هلامية الاغاروز. أجهزة الجل تختلف حسب الشركة المصنعة. أبسط جهاز يسمى الأفق المسطح وجهاز shytal. يتكون هذا الجهاز من غرفتين عازلة ، وفتيل يتم سكبه من agarose ، وطبقة أفقية مسطحة من agarose حيث توجد آبار صغيرة لتحميل العينات.

بالنسبة للرحلان الكهربائي للهلام المعياري من نوع aga & shyrose ، يتم استخدام جهد 5 فولت لكل سم من الجل (قيمة cm هي المسافة بين القطبين ، وليس طول الهلام).

هذا صندوق ضوء فوق بنفسجي وخفيف يستخدم لرؤية الحمض النووي الملون ببروميد الإيثيديوم في المواد الهلامية.

2. المكونات الكيميائية:

وهذا يشمل جميع المكونات الكيميائية الموجودة في و shyvolved في الكهربائي للجزيء الحيوي.

Agarose هو عديد السكاريد المستخرج من البحر والأعشاب الضارة. وهو عبارة عن بوليمر خطي يتكون من أيزومرات متناوبة من السكر D- و L- الجالاكتوز. يذوب Agarose ap & sh تقريبًا عند 90 درجة مئوية والمواد الهلامية تقريبًا ولامعة عند 40 درجة مئوية (الشكل 3.14). ينتج عن هذا الجلاد والغطاء شبكة من القنوات بقطر يتراوح من 50 إلى 200 نانومتر. تحدد أقطار هذه القنوات المسامية النهائية للجيل وتعمل كمنخل.

باستخدام المواد الهلامية بتركيزات مختلفة من الأجار والشيوز ، يمكن للمرء حل أحجام مختلفة من شظايا الحمض النووي. تسهل التراكيز العالية والمغلفات من الاغاروز فصل الحمض النووي الصغير ، بينما يتم الحفاظ على انخفاض تركيز الاغاروز والتركيز أثناء فصل الحمض النووي ذي الوزن العضوي العالي والشيلي. يستخدم عادة بتركيزات من 0.5 إلى 2٪.

يتم غمر الجل داخل محلول رحلان كهربي يوفر الأيونات لحمل تيار ونوع من المخزن المؤقت للحفاظ على الرقم الهيدروجيني عند قيمة ثابتة. اعتمادًا على حجم الحمض النووي الكهربائي والتطبيق ، يمكن استخدام مخازن مختلفة ل agarose electrophore & shysis.

TAE buffer (أو Tris Acetate EDTA) هو أكثر محلول الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز شيوعًا. تمتلك TAE أقل سعة تخزين مؤقت للمخازن المؤقتة ، ومع ذلك ، تقدم TAE أفضل دقة للحمض النووي الأكبر. يتطلب TAE أيضًا جهدًا أقل ووقتًا أطول.

غالبًا ما يستخدم المخزن المؤقت TBE (Tris / Borate / EDTA) لشظايا الحمض النووي الأصغر (أي أقل من 500 نقطة أساس). بورات الصوديوم أو SB buffer عبارة عن مخزن مؤقت جديد ولكنه غير فعال لحل الشظايا والخدوش التي يزيد حجمها عن 5 كيلو بايت. SB لديها مزايا و shytages في الموصلية المنخفضة ، مما يسمح بجهد أعلى (حتى 35 فولت / سم). قد يسمح هذا بوقت تحليل أقصر للرحلان الكهربي الروتيني. يتم استخدام نوعين من المحاليل المعيارية في عملية الرحلان الكهربائي للأجا والشيروس.

العازلة الكهربائي:

يستخدم هذا النوع من العازلة لغسل الجل الموجود على الخزان الأفقي. عادة ما يتم أخذ Tris-ace- tate-EDTA (TAE) أو Tris-borate- EDTA (TBE) كمخزن مؤقت للتجويف الكهربائي.

يحتوي هذا على وسط كثيف (على سبيل المثال ، الجلسرين) للسماح للعينة بـ & # 8220 سقوط & # 8221 في آبار العينة ، وصبغة تتبع واحدة أو اثنتين ، والتي تهاجر في الهلام وتسمح بمراقبة vi & shysual لمدى elec & shytrophoresis.

هذا هو عامل التتبع الذي يهدف إلى تصور الحمض النووي المفصول بعد عملية الكهرباء والرحلان. في agarose gel electro & shyphoresis يستخدم إيثيديوم بروميد كصبغة. بروميد الإيثيديوم هو صبغة فلورية ورقيقة ترتبط بالحمض النووي وتتداخل وتتشابك بين القواعد المكدسة.

عندما يتم تشعيعها بضوء الأشعة فوق البنفسجية بطول موجة 302 نانومتر ، فإن إيثيديوم وإخوانه وشيميد سوف ينبعث منها ضوء مضان بطول موجة 590 نانومتر (برتقالي). بعد عملية التفريد الكهربائي ، يتم ملاحظة الهلام تحت شعاع ضوء الأشعة فوق البنفسجية الذي ينتجه المصباح العابر. تضاف الصبغة إلى الجل أثناء التحضير والخجل فقط.

بادئ ذي بدء ، يتم خلط مسحوق الاغاروز مع محلول الإلكت والرحلان الشعاعي إلى التركيز المطلوب ، ثم يتم تسخينه في فرن الميكروويف حتى يذوب ويذوب تمامًا. الأكثر شيوعًا ، يضاف إيثيديوم وإخوانه وشيميد إلى الجل (التركيز النهائي 0.5 مجم / مل) في هذه المرحلة لتسهيل رؤية وتكوين الحمض النووي بعد الرحلان الكهربي.

بعد تبريد المحلول وتقليصه إلى حوالي 60 درجة مئوية ، يُسكب في صينية صب تحتوي على عينة مشط ويترك ليتجمد في درجة حرارة الغرفة. بعد أن يصلب الجل ، تتم إزالة المشط ، مع الحرص على عدم تمزيق قاع الآبار.

يتم إدخال الجل ، الذي لا يزال في درجه البلاستيكي ، في حجرة الرحلان الكهربائي ويتم تغطيته فقط بعازل ، ثم يتم وضع عينات تحتوي على الحمض النووي ممزوجًا بمخزن التحميل في آبار العينة ، ويتم وضع الغطاء وأسلاك الطاقة على الجهاز ، و يتم تطبيق التيار.

يجب التأكد من أن التيار يتدفق من خلال مراقبة الفقاعات المنبعثة من الأقطاب الكهربائية. سوف يهاجر الحمض النووي نحو القطب الموجب ، وهو اللون الأحمر عادة وخجولًا. عند حدوث هجرة كافية ، تتأرجح شظايا الحمض النووي وتتأرجح عن طريق التلوين ببروميد الإيثيديوم.

تتداخل هذه الصبغة الفلورية بين قواعد DNA و RNA. غالبًا ما يتم دمجه وخجوله في الجل بحيث يحدث تلطيخ أثناء الرحلان الكهربائي الخجول ، ولكن يمكن أيضًا تلطيخ الجل بعد الرحلان الكهربي عن طريق النقع في محلول مخفف من بروميد الإيثيديوم.

لإظهار وإحباط الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، يتم وضع الجل على ul & shytraviolet trans-illuminator. يجب أن تدرك أن الحمض النووي سينتشر داخل الهلام بمرور الوقت ، ويجب أن يحدث exa & shymination أو التصوير بعد وقت قصير من توقف الرحلان الكهربائي.

تطبيق Agarose Gel Electrophore & shysis:

1. فصل إنزيم تقييد هضم الحمض النووي بما في ذلك الحمض النووي الجيني ، قبل نقل البقعة الجنوبية. غالبًا ما يستخدم لفصل الحمض النووي الريبي قبل النقل الشمالي.

2. تحليل منتجات PCR بعد تفاعل البلمرة المتسلسل لتقييم تضخيم الحمض النووي المستهدف.

3. السماح بتقدير حجم جزيئات الحمض النووي باستخدام علامة أو سلم DNA الذي يحتوي على أجزاء من الحمض النووي بأحجام مختلفة معروفة.

4. يسمح بتقدير تقريبي لـ DNA quan & shytity والجودة.

5. يتم تقييم الكمية باستخدام سلم DNA lambda الذي يحتوي على كميات محددة من الحمض النووي في نطاقات مختلفة.

6. يتم تقييم جودة الحمض النووي من خلال ملاحظة عدم وجود خطوط أو شظايا (أو تلوث عصابات الحمض النووي).

7. تقنيات أخرى تعتمد على agarose gel elec & shytrophoresis لفصل الحمض النووي بما في ذلك بصمة الحمض النووي.

مزايا وعيوب Agar & shyose Gel Electrophoresis:

المزايا هي أن الجل يُسكب بسهولة ولا يفسد العينات. يمكن أيضًا استرداد العينات.

تتمثل العيوب في أن المواد الهلامية يمكن أن تذوب أثناء الرحلان الكهربائي ، ويمكن أن يصبح المخزن المؤقت مستنفدًا ، وقد تعمل أشكال مختلفة من الوراثة والشيتيري في أشكال غير متوقعة.

يستخدم في الغالب بولي أكريلاميد هلام كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) لفصل البروتينات وفقًا للحجم. هذه واحدة من أقوى التقنيات لفصل البروتينات على أساس وزنها الجزيئي.

تستخدم هذه التقنية المنظفات الأنيونية Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) التي تفصل البروتينات إلى وحدات فرعية متعددة الببتيد وتعطي شحنة سالبة موحدة على طول كل بولي ببتيد مشوه. تؤدي SDS أيضًا مهمة أخرى مهمة.

إنه يجبر عديد الببتيدات على تمديد تطابقها لتحقيق شحنة simi & shylar: نسبة الكتلة. يزيل علاج SDS هناك & shyfore آثار الاختلافات في الشكل بحيث يكون طول السلسلة ، الذي يعكس كتلتها الجزيئية ، هو المحدد الوحيد لمعدل هجرة البروتينات في عملية elec & shytrophoresis.

عندما يتم تحميل هذه polypep & shytides المشوهة في نهاية الكاثود لخزان كهربائي و shytrophoretic به هلام بولي أكريلاميد (كوسائط داعمة) وتعرض لمجال كهربائي و shytric ، ثم نحصل على مجموعات واضحة من البروتينات مرتبة بترتيب تنازلي من كتلتها mo & shylecular من الكاثود إلى الأنود.

يتأثر معدل الحركة بحجم مسام الهلام وقوة المجال الكهربائي. في SDS- PAGE ، يتم استخدام جهاز الهلام العمودي في الغالب. على الرغم من استخدامه لفصل البروتينات على أساس روتيني ، يمكن أيضًا استخدام SDS-PAGE لفصل جزيئات DNA و RNA.

الأجهزة:

وهذا يشمل الجسم المادي للإعداد التجريبي. وهي من نوعين:

أ. جهاز الكهربي:

خزان أفقي عمودي مع إلكترودات ، علب جل وشرائح ، فواصل تفلون ، مشابك ، ماصة أو سيرينج ، مشط ، غطاء أكريليك.

مطلوب مصدر طاقة من 100-200 فولت. هذا مثالي للجري والخجل ونقل المواد الهلامية التي تحلل البروتين.

هذه هي الصواني التي يتم فيها تلطيخ المواد الهلامية وتتكون من البلاستيك الشفاف. هذه هي مقاومة لمعظم أو & & صبغات خجولة والفضة وغيرها من البقع.

وهذا يشمل ما يلي:

يتم استخدام مادة الأكريلاميد SDS-PAGE كوسيط داعم. إنه مسحوق بلوري أبيض ، عندما يذوب الأكريلاميد في الماء ، فإنه يخضع لتفاعل البلمرة لتشكيل بنية شبيهة بالشبكة تسمى بولي أكريلاميد. بولي أكري وشيلاميد عبارة عن بوليمر (CF2تشكونه2-) تتكون من وحدات فرعية من مادة الأكريلاميد التي يمكن أيضًا ربطها بسهولة.

يحتوي هذا النوع من الرحلان الكهربائي والكهربائي على نظام متقطع من الهلام ، أي لدينا نظامان مختلفان من المواد الهلامية الموجودة في الخزان الكهربي فيزيائيًا ويوضع أحدهما على الآخر.

ويسمى هذا أيضًا جل سيبا وشييراتينج أو جل الجري. يشكل جل الفصل حوالي ثلثي طول لوح الهلام ويتم تحضيره بنسبة 5-10٪ من مادة الأكريلاميد. تكون المسام الموجودة في هذا الجل (والتي تتشكل بعد ربط البولي أكريلاميد متصالبًا) عديدة وأصغر في القطر والشيمتر مما يؤثر على خاصية الغربلة لهذا الجل.

يُسكب جل التراص فوق الجل المُحلل ويتم إدخال مشط هلامي يشكل البئر. إنها الطبقة العلوية والخجولة من الجل وتشكل 1/3 من صفيحة الهلام. يتم اختيار النسبة المئوية للأكريلاميد اعتمادًا على حجم البروتين الذي يرغب المرء في تحديده أو فحصه في العينة.

كلما قل الوزن المعروف ، زادت النسبة التي يجب استخدامها. بشكل عام ، تكون نسبة مادة الأكريلاميد في جل التكديس 2-5٪. إنه مسامي للغاية وخالي من عمل الغربلة الجزيئي.

يتم استخدام نوعين من المخازن المؤقتة في SDS-PAGE. يحتوي الخزان السفلي (الذي يحتوي على مادة هلامية) على مخازن أمين. يتم ضبطه باستخدام حمض الهيدروكلوريك. يحتوي الخزان العلوي & shyservoir (الذي يحتوي على هلام التراص) أيضًا على مخازن أمين ولكن درجة الحموضة أعلى قليلاً من المخزن المؤقت للهلام ويتم ضبطه باستخدام الجلايسين بدلاً من حمض الهيدروكلوريك.

SDS هو عامل الفصل الأكثر شيوعًا المستخدم في dena & shyture البروتينات الأصلية إلى polypep و shytides الفردية. عندما يتم تسخين خليط البروتين إلى 100 درجة مئوية في وجود SDS ، يلتف الرادع والخجول حول ظهر البولي ببتيد وعظم القصبة.

يرتبط بالببتيدات بنسبة وزن ثابتة تبلغ 1.4 جم / جم من عديد الببتيد. في هذه العملية ، تصبح الشحنات الجوهرية لعديد الببتيدات ضئيلة عند مقارنتها بالشحنات السالبة التي يتم نقلها وإزالتها بواسطة SDS. وبالتالي ، تصبح عديد الببتيدات بعد العلاج بنية شبيهة بالقضيب ، وتقلل من كثافة الشحنة المنتظمة ، وهي نفس الشحنة السالبة الصافية لكل وحدة طول.

تُستخدم البقع لرؤية شرائط البروتينات المنفصلة بعد عملية الرحلان الكهربائي. Coomassie Bril & shyliant Blue R-250 (CBB) هو أكثر بقعة بروتين بوبو وشيلار. إنها صبغة أنيونية ، ترتبط بالبروتينات بشكل غير محدد.

يتم تثبيت Pro & shyteins في الجل عن طريق حمض الأسيتيك وتصبغ في وقت واحد. يمكن إزالة الصبغة الزائدة الموجودة في الجل عن طريق إزالة البقع بنفس المحلول ولكن بدون الصبغة. تم الكشف عن البروتينات على شكل شرائط زرقاء على خلفية صافية.

يتم أولاً خلط محلول البروتينات المراد تحليله مع SDS ، وهو منظف أنيوني ، ومنظف خجول ومُنظف يفسد البنية الثانوية. إلى جانب إضافة SDS ، يمكن غلي البروتينات اختياريًا في وجود عامل اختزال ، مثل Di-Thio-Threitol (DTT) أو 2-مركابتوإيثانول ، مما يؤدي إلى زيادة تأثير البروتينات عن طريق تقليل روابط ثاني كبريتيد ، وبالتالي التغلب على بعض أشكال البروتينات الثلاثية والشيتين. طي ، وتفتيت الهيكل الرباعي الموالي والشتاين (الوحدات الفرعية قليلة القسيمات).

يُعرف هذا باسم تقليل SDS-PAGE ، وهو الأكثر استخدامًا. يمكن استخدام SDS-PAGE غير المختزل (بدون غليان ولا عامل اختزال) عندما تكون البنية الأصلية مهمة في مزيد من التحليل (على سبيل المثال ، نشاط الإنزيم ، الذي يظهر من خلال استخدام zymograms). يتم بعد ذلك تحميل البروتينات المشوهة في آبار هلام التراص المغمورة بمخزن التراص.

هذه النهاية متصلة بالكاثود لمصدر الطاقة. ثم يتم تطبيق تيار كهربائي عبر الهلام ، مما يتسبب في انتقال البروتينات سالبة الشحنة عبر الهلام نحو القطب الموجب. بعد عبور هلام التراص ، تدخل البروتينات المشوهة إلى هلام الجري الذي يحتوي على نظام عازلة خاص به (عازلة تشغيل).

اعتمادًا على حجمها ، سيتحرك كل بروتين بشكل مختلف خلال مصفوفة الهلام: البروتينات القصيرة سوف تتلاءم بسهولة أكبر من خلال المسام في الهلام ، بينما ستواجه البروتينات الأكبر صعوبة أكبر.

بعد انقضاء sepa & shyration ، يتم إخراج الجل بلطف ونقله إلى صندوق التلوين ومعالجته بصبغة التلوين ، على سبيل المثال CBB R-250. تتم إزالة البقع الزائدة عن طريق إزالة البقع باستخدام محلول ace & shytic acid. يبدو أن العصابات ملطخة باللون الأزرق والتي يتم تحليلها بعد ذلك وفقًا لحاجة التجربة.

يحتوي SDS-PAGE على العديد من التطبيقات. يستخدم في الغالب للأغراض التالية:

1. تحديد حجم البروتين

3. تحديد نقاوة العينة

4. تحديد روابط ثاني كبريتيد

مزايا SDS-PAGE:

تتمتع SDS-PAGE بالمزايا التالية:

1. حركة الجزيئات عالية و sepa و shyration سريع.

2. جميع البروتينات مشحونة بشحنة سالبة ، وبالتالي تهاجر جميعها نحو الأنود.

3. البروتينات المعالجة بأصباغ SDS الثابتة أفضل من البروتينات الأصلية.

4. يذوب SDS جميع البروتينات ، بما في ذلك البروتينات شديدة الكراهية للماء وحتى البروتينات المشوهة.

(ج) الرحلان الكهربائي للهلام النبضي (PFGE):

يتم تنفيذ الطرق التقليدية للرحلان الكهربي للهلام عن طريق وضع عينات الحمض النووي في مصفوفة صلبة (الاغاروز أو بولي أكريلاميد) وتحفيز الجزيئات على الهجرة عبر الهلام تحت مجال كهربائي ثابت. عندما تكون جزيئات الحمض النووي تحت تأثير هذا المجال الكهربائي والقصير ، فإنها تستطيل وتتماشى مع المجال.

في الرحلان الكهربائي للحمض النووي بالطريقة القياسية ، ومع ذلك ، لا يمكن فصل جزيئات الحمض النووي التي يزيد حجمها عن 20 كيلو بايت عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز أو بواسطة SDS-PAGE. يتم ذلك عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام النبضي.

في هذه التقنية يتم إجراء التغيير الدوري لاتجاه المجال الكهربائي. يؤدي هذا إلى إجبار جزيء الحمض النووي الكبير والكرات الموجودة في الجل على الاسترخاء عند إزالة الأول واستطالة لتتماشى مع المجال الجديد.

(د) الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد:

هذه تقنية حساسة للغاية لتنقية خليط من عديد الببتيدات.

يتم تنفيذه في بعدين:

الفصل الأول البعد:

إنه المكان الذي ننفذ فيه عملية تسمى التركيز المتساوي الكهربي. صافي شحنة أي بروتين هو مجموع كل الشحنات الموجبة والسالبة فيه. يتم تحديد هذه الشحنات من خلال السلاسل الجانبية الحمضية والأساسية القابلة للتأين ومجموعات البروتينات الاصطناعية.

النقطة المعزولة (pi) من polypep & shytide هي قيمة الرقم الهيدروجيني التي يكون صافي شحنتها صفرًا. في هذه المرحلة ، لا يمكن أن تتحرك البولي ببتيدات في أي مكان في الهلام وتصنع العصابات هناك. التركيز الكهروضوئي هو إجراء يستخدم لتحديد النقطة المتساوية الكهربية (pi) للبروتين (الشكل 3.18).

يتم إنشاء تدرج الأس الهيدروجيني وإخراجه من خلال السماح لمزيج من الأحماض العضوية ذات الوزن الجزيئي المنخفض والقواعد التي تسمى الأمفوليت بتوزيع نفسها في مجال كهربائي و shytric يتم إنشاؤه عبر الهلام. عندما يتم وضع خليط pro & shytein ، يهاجر كل بروتين حتى يصل إلى الرقم الهيدروجيني الذي يطابق pi. وهكذا يتم توزيع البروتينات ذات النقاط المتساوية الكهربية المختلفة بشكل مختلف في جميع أنحاء الهلام.

الفصل الثاني البعد:

يتبع التركيز الكهروضوئي بـ SDS-PAGE كما هو موضح أعلاه. في هذه العملية ، ستنتقل البروتينات من القطب السالب إلى القطب الموجب بالترتيب التنازلي لكتلتها الجزيئية (Mص).


الرحلان الكهربائي الشعري & # 8211 التطبيقات والإجراءات

إنها طريقة تحليلية تستخدم لفصل الأيونات وفقًا لقدرتها على الحركة الكهربي باستخدام جهد مطبق. هناك العديد من العوامل التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على الحركة الكهربية مثل:

القاعدة الأساسية هي أنه كلما زادت قوة المجال زادت سرعة الحركة. هناك أنواع مختلفة من الرحلان الكهربي ، ولكن أكثرها انتشارًا هو الرحلان الكهربي الشعري لأنه يعطي نتائج أسرع ويوفر فصلًا عالي الدقة. (1 و 2 و 3 و 4)

الصورة 1: توضح الصورة أعلاه كيفية حدوث الرحلان الكهربائي الشعري.

مصدر الصورة:wikimedia.org

ما هو المبدأ الأساسي للرحلان الكهربائي؟

الرحلان الكهربائي هو طريقة يتحرك فيها أيون العينة من خلال تأثير الجهد المطبق. يتعلق الأمر بهجرة الأيونات المشحونة في المجال الكهربائي. في محلول معين ، يتدفق التيار الكهربائي بين الأقطاب الكهربائية وتحمله الأيونات.

بالنظر إلى المبدأ ، يتم وضع الجزيئات المشحونة في المجال الكهربائي وتهاجر نحو قطب الشحنة الموجبة أو السالبة. يحتوي الحمض النووي على شحنة سالبة ثابتة ينقلها العمود الفقري للفوسفات وينتقل نحو القطب الموجب. ومن ثم ، فإن القوة ستسرع من حركة البروتين نحو الكاثود أو الأنود اعتمادًا على شحنتها. (2 و 3 و 4)

لتلخيص العملية ، تمتلئ الشعيرات الدموية بسائل موصل بقيمة أس هيدروجيني محددة. سيعمل السائل الموصل كمحلول عازل يتم فيه فصل العينة. يتم وضع عينة في الشعيرات الدموية من خلال الحقن بالضغط أو من خلال الحقن الكهربي.

يتم وضع جهد عالي على الشعيرات الدموية مما سيمكن العينة من التحرك عبر الشعيرات الدموية بسرعات متفاوتة. تنتقل المكونات الموجبة إلى القطب السالب بينما تنتقل المكونات السالبة إلى القطب الموجب.

الصورة 2: مبدأ الرحلان الكهربي الشعري كما هو موضح في الصورة حيث تسمى الأيونات الموجبة الشحنة بالقطب الموجب وتسمى الأيونات سالبة الشحنة بالكاثود.

مصدر الصورة:ytimg.com

ما هي أهمية الرحلان الكهربائي؟

الرحلان الكهربائي هو طريقة يستخدمها علماء الأحياء الجزيئية. يتعلق الأمر بهجرة جزيء مشحون من خلال المصفوفة / الجل المقيّد المسحوبة بقوة كهربائية. من خلال الرحلان الكهربائي ، يمكن لمتخصصي المختبرات تحديد الجزيئات العضوية ودراستها للتحليل الطبي الحيوي. تتضمن أهمية الرحلان الكهربائي ما يلي: الصورة

اختبار المضادات الحيوية

يلعب الرحلان الكهربائي دورًا مهمًا في اختبار المضادات الحيوية. هناك حاجة للمضادات الحيوية للمساعدة في مكافحة الأمراض والالتهابات. ما يفعله الرحلان الكهربائي هو فصل الأجسام المضادة الموجودة في المضادات الحيوية عن أنواع مختلفة من الشوائب. من خلال الرحلان الكهربائي ، يمكن للباحثين التحقق من تركيز المضادات الحيوية التي تؤدي إلى جرعة دقيقة.

تحليل الحمض النووي

يُعرف الرحلان الكهربائي بفائدته في تحليل الحمض النووي. باستخدام الهلام كوسيط ، يمكن للباحث تقطيع الحمض النووي إلى أجزاء بمساعدة شحنة كهربائية والاحتفاظ بالجزيئات في مكانها لحظة إزالة الشحنة. من خلال الرحلان الكهربائي ، يمكن للباحثين فحص الجزيئات عالية الدقة. وبالتالي ، سيكون من السهل تحليل بنية الحمض النووي.

اختبار اللقاح

أصبح تطوير اللقاحات الحديثة ممكنًا بمساعدة الرحلان الكهربي. عملية الرحلان الكهربائي مفيدة في التحقق من نقاء اللقاحات وتركيزها. يتيح اختبار لقاحات مختلفة بأنواع ومستويات مختلفة من الأجسام المضادة. (5 و 6 و 7)

تحليل البروتين والأجسام المضادة

مع هذا النوع من الرحلان الكهربائي ، يتم استخدام عملية خاصة تسمى الرحلان الكهربي المناعي ، والتي تمكن الباحثين من التحقق من تفاعلات البروتينات والأجسام المضادة.من خلال الرحلان الكهربي المناعي ، يمكن اكتشاف أنواع مختلفة من الأمراض المناعية مثل الأمراض المرتبطة بالكلى والتصلب المتعدد.

كما أنه يساعد في اكتشاف تفاعل الأجسام المضادة مع البروتينات غير العادية التي قد تكون موجودة في العينات. وبالتالي ، التمكين من العثور على أفضل علاج وعلاج وعلاجات لأمراض المناعة الذاتية. (1 و 5 و 7)


إنهاء سلسلة الفلورسنت والرحلان الكهربي

الفلورسنت اللوني تستخدم لتسجيل إنهاء سلسلة النيوكليوتيدات. يتوافق اتساع كل قمة مع قوة أو يقين نداء النيوكليوتيدات. عادةً ما يتم توفير ملفات كروماتوجرام جنبًا إلى جنب مع ملف التسلسل بالامتداد * .ab1 بينما يتم توفير ملفات التسلسل كملف نصي في ملف فاستا صيغة. يمكن العثور على المزيد حول هذه الملفات هنا . تعتبر ملفات ab1 مهمة للغاية في التحليل عند وجود أخطاء غموض أو تسلسل. يمكن أيضًا استخدام ملفات ab1 هذه لإسناد نقاط جودة على المكالمة الأساسية.

عندما يكون هناك الكثير من الغموض في الإشارة بسبب القمم المتعددة ، ستجد غالبًا ملف ن بدلاً من أحد النيوكليوتيدات الأربعة (A ، T ، C ، G).

يوضح هذا الفيديو (المصدر: www.yourgenome.org CC-BY) آلية إنهاء سلسلة الفلورسنت والرحلان الكهربي.


الملاحظات والنتائج

الرحلان الكهربائي للبلاك بورد تم استخدامه من قبل المؤلف في ست دورات في الكيمياء الحيوية الجامعية لغير الماجيرين وفي محاضرتين توعية في المدارس الثانوية. تدعم الملاحظات والانطباعات التالية التأثير التعليمي الإيجابي للتمرين. أولاً ، وجد أنه سهل التنفيذ للغاية. نجح جميع الجماهير - الطلاب الجامعيين وطلاب المدارس الثانوية - في التنبؤ والمساهمة في المناقشات حول ملفات تعريف السبورة الكهربائية. بشكل عام ، علق الطلاب على أوجه التشابه بين الأنماط الرأسية للخطوط على السبورة مع ملفات تعريف الهلام الكهربائي في الكتب المدرسية أو في الوسائط. ثانيًا ، إن انطباعات المؤلف عن تأثير التمرين على تحفيز الطلاب والتعلم المفاهيمي إيجابية للغاية. كشفت العديد من تجارب التدريس للمؤلف أنه عند إغلاق فصل معمل التقييد التقليدي ، ظل العديد من الطلاب غير قادرين على وصف ما هو موجود في شريط هلام ، وكيف يعمل التقييد أو كيف يمكن أن تعكس ملفات تعريف الهلام الاختلافات في تسلسل عينات الحمض النووي. عند مقارنتها بمختبرات التقييد التقليدية ، فإن استخدام الكهربائي على السبورة يحقق تطويرًا أفضل للخبرات الأساسية لتفسير الملامح الكهربي التجريبية. يستطيع الطلاب التنبؤ ببعض مشكلات التعلم الصعبة ، مثل فهم أن نطاقًا واحدًا ، بغض النظر عن التسلسل ، يتوافق مع أجزاء من نفس الحجم أو أن شدة النطاقات مرتبطة بكمية الحمض النووي من نفس الحجم. فائدة مهمة للغاية هي أن التمرين يساعد كلاً من المدرب والطلاب في تشخيص صعوبات التعلم في الوقت المناسب التي يمكن معالجتها في الفصل. أخيرًا ، استكمال مختبرات التقييد الرطب بـ الكهربائي على السبورة يزيد من المشاركة الفردية في الفصل. في المناقشات العامة ، هناك مشاركة واسعة من الطلاب الذين يطرحون المزيد من الأسئلة على المستوى المفاهيمي مقارنة بسيناريوهات مختبرات التقييد التقليدية. تم وصف الآثار المفيدة لطرح الأسئلة على تعلم الكيمياء الحيوية [16 ، 17] ، والآثار الإيجابية على تحفيز الطلاب لطرق التدريس النشطة سابقًا [10-14].


محتوى GC كعامل رئيسي يشكل استخدام الأحماض الأمينية أثناء عملية التطور البكتيري

يعد فهم كيفية تطور البروتينات أمرًا مهمًا ، وتم العثور على ترتيب الأحماض الأمينية التي يتم تجنيدها في الكودونات الجينية كعامل مهم في تشكيل تكوين الأحماض الأمينية للبروتينات. يجعل العمل الأخير حول آخر سلف مشترك عالمي (LUCA) من الممكن تحديد العوامل المحتملة التي تشكل تركيبات الأحماض الأمينية أثناء التطور. تلك الجينات / البروتينات LUCA من Methanococcus maripaludis تم التحقيق في S2 ، وهو أحد LUCA المحتملة. ترتبط المعدلات التطورية لهذه الجينات بشكل إيجابي بمحتويات GC مع ص- قيمة أقل بكثير من 0.05 بالنسبة لـ 94٪ من الجينات المتجانسة. أظهرت نتائج الانحدار الخطي أن تركيبات الأحماض الأمينية المشفرة بواسطة الكودونات الغنية بالـ GC تساهم بشكل إيجابي في معدلات التطور ، بينما تميل هذه الأحماض الأمينية إلى اكتسابها في الكائنات الغنية بالـ GC وفقًا لنتائجنا. يرتبط المكون الرئيسي الأول بمحتوى GC بشكل جيد للغاية. ترتبط نسب الأحماض الأمينية لبروتينات LUCA المشفرة بواسطة الكودونات الغنية بالـ GC ارتباطًا إيجابيًا بمحتوى GC لجينومات البكتيريا المختلفة ، بينما ترتبط نسب الأحماض الأمينية المشفرة بواسطة أكواد AT الغنية ارتباطًا سلبيًا بزيادة محتوى GC للجينوم. بعد ذلك ، وجدنا أن أمر التوظيف لا يرتبط بتركيبات الأحماض الأمينية ، لكن الكسب والخسارة في الكودونات أظهرت أن الأحماض الأمينية المعينة حديثًا لا تزداد بشكل كبير مع التطور. وبالتالي ، نستنتج أن محتوى GC هو عامل أساسي في تشكيل تركيبات الأحماض الأمينية. يقوم محتوى GC بتشكيل تكوين الأحماض الأمينية لمقايضة تكلفة الأحماض الأمينية بالقواعد ، والتي يمكن أن تكون ناجمة عن كفاءة الطاقة.

الكلمات الدالة: محتوى GC لتكوين الأحماض الأمينية تكلفة الأحماض الأمينية معدل تطور البكتيريا آخر عالمي كفاءة الأيض سلف مشترك.

الأرقام

الجينات لها محتويات GC متحيزة ...

تحتوي الجينات على محتويات متحيزة من GC ومعدلات تطورية في الجينوم وفيما بينها. (أ)…

يساهم محتوى GC بشكل كبير في ...

يساهم محتوى GC بشكل كبير في تطور بروتين LUCA. (أ) معدل التطور (...

أمر تجنيد amino ...

يساهم ترتيب توظيف الأحماض الأمينية بشكل أقل في تطور بروتين LUCA ...

تركيبات الأحماض الأمينية لـ ...

تركيبات الأحماض الأمينية لكائنات LUCA المحتملة وجميع الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. المطثية ...


الاغاروز الكهربائي للهلام

يفصل الرحلان الكهربائي للهلام Agarose شظايا الحمض النووي وفقًا لحجمها. عادة ، يتم هضم جزيء الحمض النووي باستخدام إنزيمات تقييدية ، ويستخدم الاغاروز الكهربائي للهلام كأداة تشخيصية لتصور الأجزاء. يتم استخدام تيار كهربائي لتحريك جزيئات الحمض النووي عبر هلام الاغاروز ، وهو عبارة عن مصفوفة متعددة السكاريد تعمل كنوع من الغربال. تساعد المصفوفة على "التقاط" الجزيئات أثناء نقلها بواسطة التيار الكهربائي.

هذه التقنية لها الكثير من التطبيقات. بشكل عام ، يمكنك تحليل أجزاء الحمض النووي الناتجة عن هضم إنزيم لقطعة أكبر من الحمض النووي لتصور الأجزاء وتحديد أحجام الأجزاء.

بالإضافة إلى فائدتها في تقنيات البحث ، يعتبر الاغاروز الكهربائي للهلام من تقنيات الطب الشرعي الشائعة ويستخدم في بصمة الحمض النووي.

لا يمكنك صبغ فقط؟

بروميد الإيثيديوم هو صبغة تداخلية ، مما يعني أنه يدخل بين القواعد المكدسة في وسط حلزون الحمض النووي. يرتبط جزيء بروميد إيثيديوم بقاعدة واحدة. نظرًا لأن كل جزيء صبغ يرتبط بالقواعد ، يتم فك اللولب لاستيعاب إجهاد الصبغة.

الحمض النووي الدائري المغلق مقيد ولا يمكنه تحمل إجهاد التواء بقدر ما يمكن للحمض النووي الخطي ، لذلك لا يمكن للحمض النووي الدائر أن يربط الكثير من الصبغة مثل الحمض النووي الخطي.

يمكن أن يصل بروميد الإيثيديوم بسهولة إلى خلاياك. الحمض النووي البشري خطي ويلطخ بشكل جيد. هذا يعني أنه يمكن أن يدخل في الحمض النووي الخاص بك ويفكه. هذا ليس شيئًا جيدًا ، لذا تأكد من توخي الحذر والحماية عند استخدام بروميد الإيثيديوم.

هناك أيضًا بدائل أكثر أمانًا وأقل سمية قد تتمكن من استخدامها. GelRed و GelGreen هي بقع الحمض النووي التي لا يمكن أن تمر عبر أغشية الخلايا ، مما يجعلها أكثر أمانًا للاستخدام والتخلص منها.

التحرك من خلال المصفوفة

جزيئات الفوسفات التي تشكل العمود الفقري لجزيئات الحمض النووي لها شحنة سالبة عالية. عندما يتم وضع الحمض النووي في حقل به تيار كهربائي ، فإن جزيئات الحمض النووي سالبة الشحنة هذه تهاجر نحو النهاية الإيجابية للحقل ، والتي تكون في هذه الحالة عبارة عن هلام agarose مغمور في حمام عازل.

هلام الاغاروز عبارة عن مصفوفة متقاطعة تشبه إلى حد ما شبكة أو شاشة ثلاثية الأبعاد. يتم سحب جزيئات الحمض النووي إلى الطرف الموجب بواسطة التيار ، لكنها تواجه مقاومة من شبكة الاغاروز هذه. تستطيع الجزيئات الأصغر أن تتنقل في الشبكة أسرع من الجزيئات الأكبر ، لذا فإنها تجعلها أسفل الهلام أكثر من الجزيئات الأكبر. هذه هي الطريقة التي يفصل بها الرحلان الكهربائي عن طريق الاغاروز جزيئات الحمض النووي المختلفة وفقًا لحجمها. الجل ملطخ ببروميد إيثيديوم حتى تتمكن من تصور كيفية تحلل جزيئات الحمض النووي هذه في أشرطة على طول الهلام.

يمكن أيضًا استخدام النشاف الجنوبي كأسلوب مرئي لهلام الاغاروز.

عادةً ما يتم تشغيل عينات الحمض النووي غير المعروفة على نفس الهلام باستخدام "سلم". السلم هو عينة من الحمض النووي حيث تُعرف أحجام العصابات. لذلك بعد نفاد العينة ، يمكنك مقارنة الأجزاء غير المعروفة بأجزاء السلم وتحديد الحجم التقريبي لنطاقات الحمض النووي غير المعروفة من خلال كيفية مطابقتها مع نطاقات السلم المعروفة.

صور إضافية من ويكيميديا ​​عبر Jacopo Werther (آلة الرحلان الكهربائي) و Mnolf (الرحلان الكهربائي للهلام)


دواعي الإستعمال

عادة ما يتم إجراء الفصل الكهربي لبروتين المصل عند الاشتباه في وجود المايلوما المتعددة. يجب أيضًا مراعاة الفحص في حالات & # x201cred flag & # x201d الأخرى (الجدول 1) .2 & # x2013 4

مؤشرات الرحلان الكهربائي لبروتين الدم

المايلوما المتعددة المشتبه بها ، والدنستروم & # x2019s macroglobulinemia ، أو الداء النشواني الأولي ، أو الاضطراب ذي الصلة

اعتلال الأعصاب المحيطية غير المبرر (لا يُنسب إلى داء السكري لفترة طويلة ، والتعرض للسموم ، والعلاج الكيميائي ، وما إلى ذلك)

ظهور فقر الدم الجديد المرتبط بالفشل الكلوي أو القصور وآلام العظام

آلام الظهر التي يُشتبه فيها بوجود المايلوما المتعددة

يُعزى فرط كالسيوم الدم إلى الأورام الخبيثة المحتملة (على سبيل المثال ، فقدان الوزن المرتبط ، والتعب ، وآلام العظام ، والنزيف غير الطبيعي)

لوحظت تشكيلات رولو على مسحة الدم المحيطية

القصور الكلوي المصاحب لارتفاع بروتين المصل

الكسر المرضي غير المبرر أو الآفة التحليلية التي تم تحديدها في التصوير الشعاعي

معلومات من المراجع من 2 إلى 4.

مؤشرات الرحلان الكهربائي لبروتين الدم

المايلوما المتعددة المشتبه بها ، والدنستروم & # x2019s macroglobulinemia ، أو الداء النشواني الأولي ، أو الاضطراب ذي الصلة

اعتلال الأعصاب المحيطية غير المبرر (لا يُنسب إلى داء السكري لفترة طويلة ، والتعرض للسموم ، والعلاج الكيميائي ، وما إلى ذلك)

ظهور فقر الدم الجديد المرتبط بالفشل الكلوي أو القصور وآلام العظام

آلام الظهر التي يُشتبه فيها بوجود المايلوما المتعددة

يُعزى فرط كالسيوم الدم إلى الورم الخبيث المحتمل (على سبيل المثال ، فقدان الوزن المرتبط ، والتعب ، وآلام العظام ، والنزيف غير الطبيعي)

لوحظت تشكيلات رولو على مسحة الدم المحيطية

القصور الكلوي المصاحب لارتفاع بروتين المصل

الكسر المرضي غير المبرر أو الآفة التحليلية التي تم تحديدها في التصوير الشعاعي

معلومات من المراجع من 2 إلى 4.

إذا كان الفحص طبيعيًا ولكن المايلوما المتعددة ، والدنستروم و # x2019s macroglobulinemia ، أو الداء النشواني الأولي ، أو اضطراب ذي صلة لا يزال يشتبه فيه ، يجب أيضًا إجراء التثبيت المناعي لأن هذه التقنية قد تكون أكثر حساسية في تحديد بروتين صغير أحادي النسيلة (M).


بوليميراز لتطبيقات محددة

أعلى إخلاص

توفر بوليمرات PrimeSTAR دقة أفضل من Pfu بوليميراز DNA ، والذي يعتبر على نطاق واسع أنزيم عالي الدقة. يتمتع PrimeSTAR Max DNA Polymerase بأعلى دقة عند استخدام هذا الإنزيم لتضخيم البلازميد pUC119 بأكمله ، اكتشف تحليل التسلسل أربع طفرات فقط من أصل 370656 قاعدة متسلسلة (معدل خطأ 0.0010٪). بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع الإنزيمات الأخرى ، يقوم PrimeSTAR Max DNA Polymerase بتكرار تسلسل التكرار بدقة أفضل بشكل ملحوظ ويعرض معدلًا أقل لتبادل القوالب (تكوين جزيئات خيمرية) بتسلسلات مماثلة.

تسلسلات الهدف الغنية بالـ GC

ضع في اعتبارك الإنزيمات التالية:

    الاختيار الأول: PrimeSTAR GXL DNA Polymerase هو الإنزيم الأكثر فعالية للقوالب الغنية بالـ GC ، مثل الحمض النووي الجيني البكتيري. يسهل تضخيم الصوت عالي الدقة مع عدد قليل جدًا من الأخطاء. تم استخدام PrimeSTAR GXL DNA Polymerase بنجاح لتضخيم المنطقة باستخدام

بعيد المدى PCR

يوصى باستخدام PrimeSTAR GXL DNA Polymerase عندما يكون كل من الطول (& gt6 kb) والإخلاص عاملين. تم تضخيم منتجات بحجم 30 كيلو بايت من قوالب الحمض النووي الجينومي البشري باستخدام هذا الإنزيم. تاكارا لا طق يمكن أيضًا استخدام بوليميريز الحمض النووي في PCR بعيد المدى ، ويوصى بهذا الإنزيم عندما يكون الطول والتضخيم القوي من الأولويات.

PCR سريع

لدينا العديد من إنزيمات PCR التي يمكن استخدامها للتفاعلات السريعة.

  • السرعة والإخلاص و mdash يحتوي PrimeSTAR Max DNA Polymerase على عامل استطالة خاص ويظهر كفاءة فتيلة ممتازة ، مما يسمح بأوقات تمديد قصيرة تصل إلى 5 ثوانٍ / كيلو بايت ووقت تلدين لا يتجاوز 5 ثوانٍ. يوصى بهذا الإنزيم لدراسات الاستنساخ والتعبير.
  • تطبيقات عالية الإنتاجية ومستعمرة سريعة PCR و mdashSapphireAmp Fast PCR Master Mix هو خيار اقتصادي للمشاريع عالية الإنتاجية. يشتمل مزيج الإنزيم 2X هذا على بوليميراز عالي السرعة ومخزن مؤقت محسن ومزيج dNTP وصبغة تحميل هلامية (أزرق) وكاشف كثافة. نظرًا لأنه يتطلب وقت تمديد يبلغ 10 ثوانٍ / كيلو بايت فقط ، يمكن إكمال تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة في & lt1 hr لإدخال يصل إلى 1 كيلو بايت.
  • يعد التنميط الجيني SNP و PCR طويل المدى و mdashSpeedSTAR HS DNA Polymerase عالي الكفاءة ويمكنه أداء تضخيم PCR بشكل موثوق مع أوقات تمديد تتراوح بين 10 و 20 ثانية / كيلو بايت.

تسلسلات الهدف الغنية AT

TaKaRa السابق طق يعد DNA Polymerase و PrimeSTAR GXL DNA Polymerase فعالين في تضخيم التسلسلات المستهدفة الغنية بـ AT ، مثل الحمض النووي الجيني الذي يحتوي على إنترونات أو الحمض النووي المتقدري الغني بـ AT. نوصي باستخدام PrimeSTAR GXL DNA Polymerase لتضخيم القوالب الغنية بـ AT بدقة عالية. على عكس إنزيمات PCR الأخرى ، يمكن لـ PrimeSTAR GXL polymerase تضخيم الأهداف التي تحتوي على & gt60٪ محتوى AT باستخدام بروتوكول PCR القياسي ومخزن التفاعل المقدم.

ملحوظة: لا يمكن استخدام PrimeSTAR GXL DNA Polymerase لتضخيم الحمض النووي المعالج بالبيسلفيت أو القوالب الأخرى المحتوية على اليوراسيل. لهذا التطبيق ، جرب TaKaRa EpiTaq HS (للحمض النووي المعالج بثنائي كبريتيت).

DNA المعالج بيسلفيت

تتوفر عدة خيارات:

    مُحسَّن لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام قوالب الحمض النووي المعالجة بثنائي سلفيت والتي تحتوي على اليوراسيل. يشتمل هذا الإنزيم على جسم مضاد للبداية الساخنة وهو مصمم للاستخدام أثناء تحليل المثيلة ، بما في ذلك تحليلات تسلسل الكوبرا وثنائي كبريتيت.
  • تم تصميم مجموعة EpiScope MSP خصيصًا لمقايسات PCR (MSP) الخاصة بالميثيل. و تاكارا طق يمكن استخدام إصدار البداية الساخنة لبوليميراز DNA ، وكلاهما يفتقر إلى نشاط نوكلياز خارجي 3 'و rarr5' ، في بعض الحالات.

العوامل المثبطة لـ PCR

TaKaRa السابق طق بوليميراز DNA قوي بشكل استثنائي ، حتى في وجود مثبطات PCR مثل البوليفينول الموجود في مستخلصات الحمض النووي الخام من الأنسجة النباتية. يوصى باستخدام PrimeSTAR GXL DNA Polymerase عندما تكون الدقة العالية مطلوبة أيضًا. على الرغم من أن بوليميراز PrimeSTAR GXL ينتج بشكل عام نتائج مرضية مع البروتوكول القياسي ، إلا أن مضاعفة تركيز الإنزيم قد يحسن النتائج في حالة وجود تركيزات عالية جدًا من المثبطات.

بدلاً من ذلك ، يسمح Terra PCR Direct Polymerase Mix بالتضخيم المباشر من العينات الخام التي قد تحتوي على مستويات عالية من مثبطات PCR. يمكن أن يقوم Terra PCR Direct polymerase بتضخيم مجموعة واسعة من الأهداف بكفاءة ، بما في ذلك الأهداف الغنية بالـ GC و AT. يمكن أيضًا استخدام هذا الإنزيم لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر من عينات الدم.

في الحالات التي لا يمكن فيها إنتاج منتجات التضخيم بهذه الإنزيمات ، قد يكون من الضروري تنقية قالب DNA.

أقسام البارافين / FFPE

يمكن استخدام مجموعة Terra PCR Direct FFPE لتحضير الحمض النووي الخام وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر من أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين.

إذا كان من الضروري استخراج الحمض النووي من الأنسجة المضمنة في البارافين أولاً ، فإن TaKaRa DEXPAT Easy و TaKaRa DEXPAT Reagent يتيحان تحضير الحمض النووي بسرعة وفعالية ، حتى من الشرائح أو العينات التي تم تخزينها لسنوات.

الرحلان الكهربائي للهلام بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (على سبيل المثال ، شاشات التنميط الجيني)

نوصي باستخدام EmeraldAmp GT PCR Master Mix. يحتوي هذا المزيج الرئيسي من PCR على صبغة تحميل هلامية خضراء وكاشف كثافة ، مما يجعل من السهل تحضير مخاليط تفاعل PCR التي يمكن تحميلها مباشرة على هلام الاغاروز للرحلان الكهربي بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن لـ EmeraldAmp GT PCR Master Mix تضخيم الأهداف التي يصل طولها إلى 10 كيلو بايت ، بما في ذلك الأهداف الغنية بالـ GC أو AT. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام منتجات PCR التي تم إنشاؤها باستخدام EmeraldAmp GT PCR Master Mix مباشرة لتقييد إنزيم الهضم أو التسلسل أو استنساخ TA بدون تنقية.

مستعمرة PCR

نوصي SapphireAmp Fast PCR Master Mix للمستعمرة PCR. يمكن لهذا الإنزيم المسبق أن يتحمل وجودًا كبيرًا من الأحماض النووية البكتيرية. يتم تضمين صبغة التتبع وكاشف الكثافة في المزيج الرئيسي ، مما يسمح بتحميل نواتج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة على هلام الاغاروز للرحلان الكهربي.

أعلى حساسية

لأعلى حساسية ، نوصي باستخدام التيتانيوم طق بوليميريز DNA أو TaKaRa السابق طق بوليميريز الحمض النووي. تم استخدام كلا البوليميراز بنجاح في تطبيقات التنميط الجيني الحساسة للغاية.

التضخيم المباشر من الأنسجة

نوصي بـ Terra PCR Direct Polymerase Mix لتضخيم الأهداف من المستخلصات الخام أو مباشرة من الأنسجة. الكميات الموصى بها من الأنسجة المختلفة التي يجب استخدامها في تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر مذكورة أدناه:

  • الدم المعالج: & le5 & microl
  • ذيل الماوس: & le1 ملم
  • أذن الفأرة: 1.5 مم 2
  • أوراق النبات: 1.2 مم (القطر)
  • قسم الأنسجة المضمنة بالبارافين: & le1 & ndash1.5 سم 2

Multiplex PCR

نوصي تاكارا طق بوليميريز الحمض النووي أو التيتانيوم طق بوليميريز الحمض النووي لتعدد PCR. اطلع على المذكرة الفنية الخاصة بنا للحصول على مزيد من المعلومات حول استخدام التيتانيوم طق بوليميريز DNA في PCR متعدد الإرسال للتنميط الجيني عالي الإنتاجية.

Takara Bio USA، Inc.
الولايات المتحدة / كندا: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & Bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
لأغراض البحث فقط. ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص. & نسخ 2021 Takara Bio Inc. جميع الحقوق محفوظة. جميع العلامات التجارية مملوكة لشركة Takara Bio Inc. أو الشركات التابعة لها في الولايات المتحدة و / أو البلدان الأخرى أو أصحابها المعنيين. قد لا يتم تسجيل بعض العلامات التجارية في جميع الولايات القضائية. يتوفر المنتج الإضافي والملكية الفكرية ومعلومات الاستخدام المقيد على takarabio.com.

Takara Bio Europe عضو في Takara Bio Group ، وهي شركة رائدة في علوم الحياة ملتزمة بتحسين حالة الإنسان من خلال التكنولوجيا الحيوية. من خلال علاماتنا التجارية Takara و Clontech و Cellartis ، تتمثل مهمتنا في تطوير أدوات وخدمات مبتكرة عالية الجودة لتسريع الاكتشاف.


شاهد الفيديو: Gel Electrophoresis. الترحيل الكهربائي (كانون الثاني 2022).