معلومة

زيادة / تقليل شدة الإشارة في النشاف الغربي


لذلك كنت في الفصل وكان أستاذي يشرح النشاف الغربي. يبدو أن هناك أكثر من طريقة لزيادة أو تقليل كثافة الإشارة. لقد قدم لنا التحدي لاكتشاف الطرق المختلفة التي يمكن أن يحدث بها ذلك. بقدر ما أبحث عن كل ما يمكنني أن أجده على الإنترنت أو حتى في جوجل الباحث هو مجرد مواد كيميائية معينة مثل "محسن الإشارة" وهذا كل شيء ، لا شيء محدد عن بعد. من الناحية القانونية ، لا أقترح هذا كواجب منزلي حقيقي ، في الواقع إنه مجرد فضول لدي. لذلك أسأل المجتمع العلمي ، إن وجدت ، ما هي الظروف التي يمكن للمرء أن يزيد أو يقلل من شدة الإشارة في النشاف الغربي؟ أنا أفهم ما هو النشاف الغربي ، يمكن لأي شخص أن يجد هذا على ويكيبيديا ، لكن الظروف التي يمكن أن تزيد أو تقلل من كثافة الإشارة؟


هناك عدة أماكن مختلفة في بروتوكول النشاف الغربي النموذجي حيث يمكن تغيير الظروف لتعديل شدة الإشارة. الأول هو كمية البروتين المحملة - فالمزيد من البروتين سيعطي إشارة أقوى ، والأقل سيعطي إشارة أضعف. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي الكثير من البروتين إلى نطاقات غير واضحة ، وزيادة الخلفية ، وتشويه الممر ، وغيرها من المشكلات.

الشرط التالي للتغيير هو مقدار الجسم المضاد الأولي ومخزن الحضانة. قد يؤدي المزيد من المعلومات الأولية إلى زيادة الإشارة ، ولكن قد يؤدي الإفراط في استخدامها إلى توفير خلفية أعلى. تعطي بعض الأجسام المضادة إشارة أفضل عند تخفيفها في مساحة سطح الجسم والبعض الآخر عند تخفيفها في حليب جاف خالي الدسم. بشكل عام ، يمنحك الحليب بقعة أنظف ، ولكنه قد يقلل من الإشارة. يمكن أن يؤثر وقت الحضانة أيضًا على الخصوصية وشدة الإشارة - فبعض الأجسام المضادة ترتبط تمامًا بحضانة لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، بينما تتطلب أخرى حضانة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

الشرط الثالث الذي يجب تغييره هو كمية ونوع الجسم المضاد الثانوي. قد تؤدي زيادة مقدار الثانوية إلى زيادة الإشارة ، ولكن مرة أخرى قد يؤدي إلى زيادة الخلفية. هناك أيضًا أنواع مختلفة من الثانوية ، اعتمادًا على نظام الكشف الخاص بك - HRP للكشف عن الإشعاع الكيميائي ، و AP للعلامات اللونية ، وعلامات الفلورسنت لأنظمة التصوير ، وما إلى ذلك. بروتوكول.

أخيرًا ، يمكن أن يؤثر نوع نظام الكشف على الحساسية. على سبيل المثال ، عند استخدام ثانويات قياسية مقترنة من HRP ، هناك العديد من ركائز ECL المختلفة بحساسيات متفاوتة على نطاق واسع. فيما يلي قائمة بالأنظمة المختلفة المتاحة من Thermo / Pierce ، والتي تتراوح من ECL القياسي إلى Femto.

لذلك ، بينما يبدو النشاف الغربي إجراءً بسيطًا إلى حد ما ، هناك العديد من الأماكن لتحسين الظروف للحصول على النتائج التي تبحث عنها.


الشيء الوحيد الذي لم يذكره الآخرون حتى الآن هو أن وقت الغسيل يمكن أن يؤثر على الإشارة. إذا تم غسلها لفترة أطول من الغسل لمدة 5 دقائق المطلوبة عادةً ، فقد ينتج عن ذلك إشارة منخفضة (منخفضة).

المرجع: http://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp؟id=western-trouble


بالإضافة إلى النقاط الواردة في الإجابة التي قدمهاmattdmo ، من الممكن إثراء البروتين المفضل قبل تشغيل الجل. يمكن القيام بذلك إما عن طريق استخدام البروتينات الموسومة (ربما مع انشقاق العلامة قبل التحميل) أو عن طريق إجراء ترسيب مناعي للبروتين الخاص بك. يكون الأمر الأخير ممتعًا عندما يكون لديك تركيزات منخفضة من البروتين الموجود في الخلية. ما تفعله أساسًا هو ربط الجسم المضاد بالبروتين ، وربط معقد البروتين والجسم المضاد بعمود أو خرز ، ثم غسله بعيدًا (نظريًا ، أنت لا تحصل على جميع البروتينات الأخرى بعيدًا) ثم تحميل العينة. اعتمادًا على التخصيب ، ستتمكن من رؤية الفرقة ، حيث لا يكون ذلك ممكنًا بدون الترسيب المناعي.

ثم يلعب غسل البقعة ومنعها دورًا مهمًا. عادة ما تستخدم الحليب المجفف لتحضير محلول الحجب ، لأن هذا رخيص جدًا ويعمل بشكل جيد. ولكن يمكن أن يعطي خلفية عالية إلى حد ما ويحدث مشاكل مع البروتينات الفوسفورية (ولكن ليس بالضرورة). في بعض الأحيان يكون من الأفضل استخدام حلول أكثر تكلفة مثل BSA لسد الغشاء. يعتبر الغسيل أيضًا أمرًا بالغ الأهمية ، اعتمادًا على مدى صرامة الغسل ، ستفقد الإشارة وتؤثر على الخلفية. هنا يمكنك اللعب بتركيزات مختلفة من المنظفات وكذلك باستخدام المنظفات المختلفة.

بالإضافة إلى أنه يمكنك الحصول على الكثير من الإشارات المختلفة في عملية الكشف. بالنسبة للاكتشاف القائم على اللمعان الكيميائي ، يمكنك إما استخدام أفلام الأشعة السينية (غير الحساسة إلى حد ما) وتواجه مشاكل مع العصابات القوية التي تتفوق على الأشرطة الضعيفة المجاورة. كما أنه من الصعب تحديدها كميًا ، حيث إن النطاق الخطي الذي تقابل فيه كثافة أكبر مع إشارة أكثر محدود. باستخدام اللمعان الكيميائي ، يمكنك أيضًا استخدام كاميرات CCD خاصة شديدة الحساسية (والتي تكون أكثر حساسية ولديها نطاق كشف خطي أعلى بكثير) أو لوحات تصوير فوسفوري (لوحات خاصة ، تخزن إشارة اللمعة الكيميائية على لوحة حساسة للضوء والتي يتم قراءتها مع ماسح ضوئي خاص).

أحدث التطورات في تقنية الكشف هي الماسحات الضوئية التي تعمل بالأشعة تحت الحمراء والتي تستخدم فيها أجسامًا مضادة ثانوية مقترنة بصبغة تتألق في الطول الموجي للأشعة تحت الحمراء. هذه الماسحات الضوئية حساسة للغاية وتسمح أيضًا باستخدام اثنين من الأجسام المضادة الثانوية ذات العلامات المختلفة في نفس الوقت ، والتي يمكن أن تكون مفيدة جدًا في تحليل تفاعلات البروتين. ستحتاج إلى أجسام مضادة أولية من أنواع مختلفة. تتمتع تقنيات الكشف الحديثة أيضًا بميزة تسليم الملفات الرقمية ، بينما تحتاج الأفلام إلى مسح ضوئي قبل استخدامها مرة أخرى في المنشورات.


Western Blot Doctor & # 153 - مشاكل قوة الإشارة

02/28/23 09:33 صباحًا AE، AI، AL، AM، AR، AT، AU، AZ، ​​BA، BD، BE، BF، BG، BH، BN، BO، BR، BW، CA، CH، CL ، CM، CN، CO، CR، CY، CZ، DE، DK، DO، DZ، EC، EE، EG، EH، ER، ES، ET، FI، FM، FO، FR، GA، GE، GF، GH ، GP ، GR ، GT ، GU ، HK ، HN ، HR ، HT ، HU ، ID ، IE ، IL ، IN ، IS ، IT ، JM ، JO ، JP ، KE ، KH ، KR ، KW ، KZ ، LB ، LI ، LK ، LT ، LU ، LV ، MA ، MD ، MG ، MK ، ML ، MO ، MQ ، MS ، MT ، MU ، MX ، MY ، NG ، NI ، NL ، NO ، NP ، NZ ، OM ، PA ، PE ، PF ، PG ، PH ، PK ، PL ، PR ، PS ، PT ، PW ، PY ، QA ، RO ، RS ، RU ، SA ، SB ، SE ، SG ، SI ، SK ، SN ، ST ، SV ، TG ، TH ، TN ، TO ، TR ، TT ، TW ، TZ ، UA ، UG ، المملكة المتحدة ، الولايات المتحدة ، UY ، UZ ، VA ، VE ، VU ، XK ، YE ، ZA ، VN en LSR / LSR / Technologies / Western_Blotting N 0

Western Blot Doctor هو دليل للمساعدة الذاتية يمكّنك من استكشاف مشكلات النشاف الغربي وإصلاحها. في هذا القسم ، يمكنك إيجاد حلول لمشاكل اكتشاف إشارة البقعة.

أقسام أخرى في وسترن بلوت دكتور:

المشاكل والحلول

انقر فوق الصورة المصغرة الأكثر تمثيلاً لطختك لاكتشاف الأسباب المحتملة وإيجاد حلول محددة للمشكلة.

المشكلة: إشارة غير متساوية عبر لطخة

يبدو أن بعض أجزاء البقعة تحتوي على نسبة أقل من البروتين.
الأسباب المحتملة: حلول:
الغشاء غير مبلل بشكل موحد قبل النقل
  • تأكد من أن الأغشية مبللة بشكل موحد قبل النقل
  • عند استخدام غشاء PVDF الطارد للماء ، يجب نقعه بالكامل في الميثانول قبل الموازنة في محلول النقل المائي. غشاء PVDF الرطب تمامًا له مظهر رمادي وشفاف
  • تولد طرق النقل عالية الكثافة أو السريعة حرارة قد تتسبب في جفاف الغشاء أثناء التعامل معه. تأكد من عدم السماح للأغشية الدافئة بالجفاف بعد النقل عن طريق تقصير وقت المناولة
  • ملء خزان النقل بالكامل مع المخزن المؤقت. يجب أن يحتوي خزان النقل على مخزن مؤقت كافٍ لتغطية منطقة البقعة بالكامل
  • تأكد من غمر الغشاء بالكامل وتحريكه خلال فترة الحضانة
  • استخدم شاكر لجميع الحضانات

المشكلة: إشارة النطاق المشبعة

  • تقليل البروتين الكلي المحمّل بالهلام
  • لتحسين تحميل العينة ، راجع تحديد تحميل العينة المناسب لبروتوكول ويسترن بلوتس
  • تقليل تركيز الأجسام المضادة الأولية و / أو الثانوية
  • قم بتحسين تركيزات الأجسام المضادة الأولية و / أو الثانوية باستخدام بروتوكول فحص رقعة الشطرنج
  • استخدم تعريض ضوئي أقصر
  • استخدام ميزة الاستحواذ المتعدد في برامج الحصول على البيانات
  • تقليل وقت الحضانة باستخدام ركيزة الكشف
  • استخدم ركيزة كشف أقل حساسية

المشكلة: نطاقات باهتة عالية ميجاوات

  • وقت النقل قصير جدًا
  • نقل الطاقة غير كافٍ
  • صياغة عازلة النقل
  • انظر أدناه أسفل كفاءة التحويل المنخفضة للحصول على تفاصيل حول شروط النقل
  • للحصول على أفضل نقل للبروتينات الكبيرة ، استخدم هلام منخفض النسبة ، على سبيل المثال ، 7.5٪ أو 4 & ndash15٪ هلام متدرج ، وأضف 0.05٪ SDS إلى المخزن المؤقت للنقل
  • اكتشف أي بروتين متبقي متبقي في الهلام عن طريق تلطيخ وتصوير الجل بعد النقل ، أو استخدم تقنية خالية من البقع لتصوير البروتين الكلي على كل من الجل واللطخة قبل الكشف المناعي. يمكّنك Bio-Rad & rsquos V3 Western Workflow & trade من تصور عملية فصل البروتين ونقله والتحقق منها والتحقق منها في كل خطوة من إجراءات الفصل الكهربائي وإجراء النشاف

المشكلة: نطاقات خافتة ، إشارة ضعيفة أو معدومة

نقل البروتين أو القضايا الملزمة
  • تحقق من تركيز عينات البروتين (على سبيل المثال ، باستخدام مقايسات بروتين برادفورد أو لوري)
  • زيادة كمية المواد المصدر
  • تجزئة أو تركيز العينة باستخدام واحد أو أكثر من هذه التقنيات:
  • تأكيد النقل باستخدام تلطيخ Ponceau S.
  • قم بتأكيد النقل باستخدام تقنية التصوير الخالي من البقع Bio-Rad & rsquos
  • تحسين ظروف النقل لحجم البروتين المستهدف
  • انخفاض نسبة هلام الأكريلاميد
  • زيادة وقت التحويل
  • تحسين المخازن المؤقتة لنقل الميثانول وتركيزات SDS
  • زيادة وقت النقل (تتطلب المواد الهلامية السميكة أوقات نقل أطول)
  • تحقق من التيار في بداية التشغيل ، فقد يكون منخفضًا جدًا بالنسبة لإعداد جهد معين ، مما يشير إلى تكوين عازلة غير صحيح. راجع إرشادات الطاقة لتطبيقات محددة في الجدول 4.1 من دليل تنشيف البروتين (النشرة 2895)
  • استخدم أجهزة تنشيف عالية الكثافة ، مثل أنظمة التنشيف شبه الجافة والسريعة مثل Trans-Blot & reg SD أو Trans-Blot & reg Turbo & trade Systems
  • استخدم مصدر طاقة بحد تيار مرتفع مثل PowerPac وتداول HC Power Supply. إذا تم استخدام مصدر طاقة غير صحيح ، فقد لا يصل إلى الجهد المحدد إذا كان تيار مصدر الطاقة عند الحد الأقصى
  • يمكن نقل البروتينات منخفضة ميغاواط بالكامل عبر الغشاء
  • قد تظهر البروتينات & lt15 كيلو دالتون انخفاضًا في الارتباط بأغشية 0.45 ميكروم
  • تقليل وقت النقل
  • قم بتقليل الجهد ، خاصة إذا كنت تستخدم جهاز نقل عالي الكثافة ، على سبيل المثال ، أنظمة التنشيف شبه الجافة والسريعة مثل Trans-Blot SD أو Trans-Blot Turbo Systems
  • ضع غشاءًا إضافيًا في شطيرة الهلام لاكتشاف أي بروتينات منخفضة ميغاواط تنتقل عبر الغشاء
  • استخدم PVDF أو 0.2 ميكروم نيتروسليلوز (حجم مسام أصغر)
  • تحقق من قدرة خرج مصدر الطاقة لضمان توافق الجهد والإخراج الحالي مع احتياجات أداة النشاف. إذا كان لا يتناسب مع احتياجاتك ، فاحصل على مصدر طاقة بسعة حالية أعلى مثل PowerPac واستبدل مصدر طاقة HC
  • تحقق من المصهر
  • تأكد من تجميع شطيرة الهلام / الغشاء بالترتيب الصحيح
    • تجميع الساندوتش لنشاف الخزان: النشرة 6213
    • تجميع الساندوتش للتنشيف شبه الجاف: النشرة 6214
    • استخدم عازلة نقل أكثر أساسية أو حمضية لزيادة حركة البروتين. سينتقل البروتين بالقرب من نقطته الكهربية (pI) بشكل سيئ (يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني العازل أعلى أو أقل من pI للبروتين المعني لتحقيق كفاءة النقل المثلى)
    • تركيز عالي من البروتين
    • ذوبان منخفض
    • الطي الجزئي / التجميع
    • استخدم SDS في المخزن المؤقت للنقل. يمكن أن تزيد SDS من كفاءة النقل ولكنها يمكن أن تقلل أيضًا من كفاءة الارتباط بالنيتروسيليلوز وتؤثر على تفاعل بعض البروتينات مع الأجسام المضادة
    • قلل أو تخلص من الكحول في مخزن النقل المؤقت
    • قم بتقليل٪ T (إجمالي المونومر) أو٪ C (رابط متشابك) لزيادة حجم مسام الهلام وزيادة كفاءة النقل. ينتج عن استخدام 5٪ C (مع ثنائي أكريلاميد كوصلة متشابكة) أصغر حجم للمسام
    • على سبيل المثال ، تحتوي المواد الهلامية بشكل عام على حوالي 29: 1 أكريلاميد إلى مكرر أكريلاميد. إذا كنت تستخدم 19: 1 ، يجب أن تجرب 29: 1. إذا كنت تفحص مجمعًا كبيرًا وتستخدم 29: 1 ، فقد ترغب في تجربة 37.5: 1 أو تجربة نسب أعلى. ينتج عن ارتفاع نسبة الأكريلاميد إلى مكرر مادة هلامية ذات مسام أكبر
    • قم بإعداد مخزن نقل مؤقت جديد (للحصول على أفضل النتائج ، لا تقم أبدًا بإعادة استخدام المخزن المؤقت للنقل)
    • قلل من كمية الميثانول. قد يؤدي ذلك إلى تحسين كفاءة نقل البروتينات من الهلام ولكنه قد يقلل أيضًا من الارتباط بأغشية النيتروسليلوز. 20٪ ميثانول مثالي بشكل عام لربط البروتين
    قضايا الكشف
    • كرر باستخدام تركيز أعلى من الأجسام المضادة
    • تحسين تركيز الجسم المضاد باستخدام البقع النقطية
    • بروتوكولات فحص رقعة الشطرنج
    • قلل عدد خطوات الغسيل إلى الحد الأدنى
    • تقليل صرامة الغسيل
    • زيادة تركيز الجسم المضاد 2 & ndash4 أضعاف أعلى من تخفيف البدء الموصى به
    • بروتوكولات فحص رقعة الشطرنج
    • أعد اللطخة لأن المستضد قد يكون قد تم تجريده أو إتلافه عن طريق عملية التجريد
    • اختبر أوقات التعرض المختلفة
    • ضع في اعتبارك التبديل إلى نظام تصوير رقمي مثل Bio-Rad & rsquos ChemiDoc & trade Imaging Systems
    • تقليل نسبة (وزن / حجم) الحليب في محاليل الحجب والأجسام المضادة
    • جرب حلول الحجب البديلة (مثل الألبومين أو الجيلاتين أو BSA)
    • زيادة كمية البروتين المطبق
    • تركيز العينة قبل التحميل
    • استخدم نظام فحص أكثر حساسية
      • إذا كنت تستخدم الكشف اللوني ، فحاول استخدام ركيزة كيميائية محسنة (ECL) مثل Bio-Rad & rsquos Clarity & trade ركيزة ECL
      • في حالة استخدام متقارن الفوسفاتيز القلوي (AP) ، جرب متقارن بيروكسيداز الفجل (HRP) بدلاً من ذلك (انظر اختيارنا من HRP و AP Conjugates)
      • إذا كنت تستخدم ركيزة ECL عامة ، فجرب ركيزة ECL عالية الحساسية
      • قلل عدد مرات الغسيل أو قلل من صرامة ظروف الغسيل أثناء خطوات الفحص اللاحقة
        • قلل وقت كل خطوة غسيل
        • خفض درجة حرارة الغسيل
        • قلل تركيز المنظف (عادة توين 20) في المخزن المؤقت للغسيل ، أو قم بإزالته بالكامل من مخزن الغسيل المؤقت
        • قلل تركيز الملح في المخزن المؤقت
        • قم بتلطيخ البقعة بعد النقل أو استخدم معايير محددة لتقييم كفاءة النقل. بدلاً من ذلك ، استخدم تقنية خالية من البقع لتقييم العينة على البقعة.
        • راجع القسم السابق للحصول على اقتراحات حول تحسين المشكلات المتعلقة بالنقل
        • قد لا تتعرف الأجسام المضادة ، وخاصة أحادية النسيلة ، على المستضدات المشوهة. إذا كانت هذه هي الحالة ، فقم بالكهرباء ونقل البروتينات في ظل الظروف الأصلية ، على سبيل المثال ، PAGE الأصلي الأزرق. استخدم ملف تبريد وحوض إعادة تدوير مبرد لنقل البروتينات الحساسة للحرارة
        • تتداخل بعض بقع البروتين الكلية (مثل الذهب الأسود والذهبي الغروي) مع التعرف على الأجسام المضادة للمستضد. جرب بقعة مختلفة (على سبيل المثال ، Ponceau S) أو تقنية Bio-Rad & rsquos الخالية من البقع
        • قم بتخزين الكواشف في الظروف الموصى بها في قسامات صغيرة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة والملوثات البكتيرية وتعطيل الحرارة
        • قد تؤثر المنظفات على ارتباط بعض الأجسام المضادة. قم بإزالتها من الفحص ، باستثناء الغسيل بعد الحجب
        • إذا كان عيار الجسم المضاد منخفضًا جدًا ، فقم بتحسين التركيزات باستخدام تجربة لطخة نقطية (انظر دليل تنشيف البروتين: الترشيح الدقيق)
        • تحسين تركيزات الجسم المضاد باستخدام بروتوكول رقعة الشطرنج.
        • زيادة أوقات حضانة الجسم المضاد
        • اختبر فعالية محلول الجسم المضاد الأول. استخدم اختبار ELISA أو RID أو Ouchterlony المناعي أو اختبار الترسيب لتحديد تفاعل الجسم المضاد مع المستضد. إذا كان ذلك ممكنًا ، كرر إجراء الفحص باستخدام محلول جسم مضاد أولي أكثر تركيزًا
        • اختبر فعالية محلول تطوير اللون عن طريق الجمع بين 1.0 مل من محلول تطوير اللون مع 10 وماكرول من الجسم المضاد الثانوي المتقارن بكامل القوة. يجب أن يحدث تفاعل اللون على الفور. إذا فشل اللون في التطور في غضون بضع دقائق ، فإن حل تطوير اللون يكون غير نشط. قم بإعداد حل عمل جديد وكرر فحص تطور اللون
        • اختبر فعالية المحلول المتقارن عن طريق الجمع بين 1.0 مل من محلول تطوير اللون الذي تم اختباره أعلاه و 1.0 مل من محلول التخفيف المتقارن 1: 3000. يجب أن تظهر مسحة زرقاء فاتحة في غضون 15 دقيقة. إذا فشل اللون في التطور في غضون 25 دقيقة ، فإن المحلول المتقارن مشكوك فيه. كرر الإجراء مع التخفيف الطازج من المتقارن
        • قم بتخزين الكواشف في الظروف الموصى بها. تجنب دورات التجميد-الذوبان المتكررة ، والملوثات البكتيرية ، وتثبيط الحرارة
        • أزيد الصوديوم يثبط نشاط بيروكسيداز الفجل. استخدم مبيدًا بيولوجيًا مختلفًا مثل كبريتات الجنتاميسين بدلاً من ذلك
        • قد يتسبب الماء غير المقطر في تعطيل عمل الإنزيم. استخدم فقط الماء المقطر منزوع الأيونات
        • إذا كان تركيز المُقارن منخفضًا جدًا ، فقم بالتحسين باستخدام تجربة النقطة (انظر Bio-Dot & reg و Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus)
        • تحسين تركيزات الجسم المضاد باستخدام بروتوكول رقعة الشطرنج

        02/28/23 09:33 صباحًا AE، AI، AL، AM، AR، AT، AU، AZ، ​​BA، BD، BE، BF، BG، BH، BN، BO، BR، BW، CA، CH، CL ، CM، CN، CO، CR، CY، CZ، DE، DK، DO، DZ، EC، EE، EG، EH، ER، ES، ET، FI، FM، FO، FR، GA، GE، GF، GH ، GP ، GR ، GT ، GU ، HK ، HN ، HR ، HT ، HU ، ID ، IE ، IL ، IN ، IS ، IT ، JM ، JO ، JP ، KE ، KH ، KR ، KW ، KZ ، LB ، LI ، LK ، LT ، LU ، LV ، MA ، MD ، MG ، MK ، ML ، MO ، MQ ، MS ، MT ، MU ، MX ، MY ، NG ، NI ، NL ، NO ، NP ، NZ ، OM ، PA ، PE ، PF ، PG ، PH ، PK ، PL ، PR ، PS ، PT ، PW ، PY ، QA ، RO ، RS ، RU ، SA ، SB ، SE ، SG ، SI ، SK ، SN ، ST ، SV ، TG ، TH ، TN ، TO ، TR ، TT ، TW ، TZ ، UA ، UG ، المملكة المتحدة ، الولايات المتحدة ، UY ، UZ ، VA ، VE ، VU ، XK ، YE ، ZA ، VN en LSR / LSR / Technologies / Western_Blotting N 0


        7 نصائح لتحسين تجارب التنشيف الغربية

        النشاف الغربي ليس علمًا دقيقًا: الحصول على نتائج مثالية جاهزة للنشر على الفور ليس هو القاعدة بالضبط. ومع ذلك ، هناك خطوات يمكنك اتخاذها لتحسين تجاربك النشاف والتأكد من أنها تبدأ بأفضل بداية ممكنة. تُعرف عملية الضبط الدقيق هذه باسم التحسين ، ويمكن أن تخضع لها عدة مراحل من بروتوكول النشاف الغربي.

        1. SDS-PAGE

        تبدأ تجارب النشاف الغربي قبل وقت طويل من بدء العمل بالغشاء. يمكننا الرجوع إلى الوراء مثل تحضير العينة ، ولكن لصالح الفضاء ، فلنبدأ بالعينة انفصال. مع هذا ، تحصل على ما وضعته - بدون هلام SDS-PAGE جيد لن تحصل على غشاء جيد ، وسوف ينهار كل شيء من هناك. إذا قمت بصب المواد الهلامية الخاصة بك ، فاحرص على ضمان التماثل في مكياجها. حدد النسبة المئوية الصحيحة من مادة الأكريلاميد (راجع بروتوكول لطخة ويسترن من Proteintech [PDF]). تجنب تأثير "الابتسام" للجبهة الصبغية من خلال مقاومة إغراء تشغيل المواد الهلامية بجهد كهربائي عالي وملء الآبار الفارغة بحجم مكافئ من 1x عينة عازلة.

        قبل كل شيء ، قم بتحميل كمية موحدة من البروتين وحدد تركيز البروتين عن طريق الفحص وكن مستعدًا لتقليل كمية التحميل إذا حصلت على بقع "معرق". وجد مختبر التحقق من Proteintech أن 30 ميكروغرامًا من البروتين لكل ممر يعطي عادةً نطاقات خالية من الخطوط ومنفصلة جيدًا.

        2. غشاء

        يمكن أن يُحدث اختيارك للغشاء فرقًا كبيرًا في نتائج تجاربك الغربية.النوعان الرئيسيان من الأغشية هما PVDF و nitrocellulose ، ولكن هناك الآن عدة إصدارات لكل منهما في سوق المواد الاستهلاكية ، بما في ذلك ، على سبيل المثال ، الأغشية المُحسَّنة للكشف المناعي المستند إلى التألق أو البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي.

        يتم تقدير PVDF لصلابته واستقراره ومقاومته لمعظم الأحماض والقلويات (مما يعني أنه الغشاء المفضل لمن يرغبون في تجريد البقع وإعادة فحصها). توفر أغشية PVDF أيضًا احتباسًا أفضل للبروتين من النيتروسليلوز.

        يتم حظر أغشية النيتروسليلوز بسهولة وتوفر عمومًا نسب إشارة إلى ضوضاء عالية. على الرغم من ذلك ، لن تكون قادرًا على تجريدها وإعادة فحصها ، وكذلك الانتباه إلى حجم مسام غشاء النيتروسليلوز.

        أخيرًا ، كلمة عن تقليد المختبر: لا تخف من تغيير أنواع الأغشية بسبب معايير المختبر. قد تكون تجربة شيء مختلف هو مفتاح لطخة ويسترن المثلى.

        3. تركيز الجسم المضاد

        بافتراض أنك بذلت الجهد المطلوب لاختيار الجسم المضاد الخاص بك ، يجب أن تكون خطوتك التالية هي تحديد التركيز الأمثل للجسم المضاد.

        يتأثر معدل الارتباط بين الجسم المضاد والمستضد (ثابت التقارب) بتركيزاتهما النسبية في المحلول (من بين متغيرات أخرى ، مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة). عادةً ما يتم تثبيت كميات المستضد في النشاف الغربي (أي أن البروتين الخاص بك مثبت في الغشاء) ، لذلك ستحتاج غالبًا إلى تعديل تركيز الجسم المضاد للحصول على بقع أفضل. القيام بذلك بطريقة منظمة - اختبار عدة تخفيفات للجسم المضاد مع الحفاظ على ثبات جميع المعلمات الأخرى - سيساعدك على تحديد تركيز الجسم المضاد الأمثل لتجاربك.

        تسمى هذه الخطوة معايرة الجسم المضاد ، ويجب إجراؤها في كل مرة تستخدم فيها جسمًا مضادًا جديدًا أو مجموعة من الشروط التجريبية. يجب أن يتم ذلك أيضًا إذا لاحظت يومًا أن مجموعة جديدة من الأجسام المضادة متعددة الأضداد لا تؤدي نفس أداء المجموعة الأخيرة.

        كيفية معايرة الجسم المضاد

        تقدم العديد من الشركات تخفيفات موصى بها على أوراق بيانات الجسم المضاد ، وعادة ما تكون هذه أرقامًا جيدة لتبدأ بها ، ومع ذلك ، لا يزال من المستحسن قياس الأجسام المضادة ، حيث أن الشروط المستخدمة للحصول على تلك التخفيفات الموصى بها قد تكون مختلفة تمامًا عن تلك التي تستخدمها. إعادة استخدام. إذا اقترحت ورقة بيانات المنتج استخدام تخفيف 1: 1000 ، فجرّب سلسلة من 1: 250 ، 1: 500 ، 1: 1000 ، 1: 2000 و 1: 4000.

        بشكل عام ، إذا قمت بوضع التخفيف الموصى به بين قوسين بمضاعفته ونصفه (وتخفيف واحد بينهما) ، فيجب أن تكون على المسار الصحيح. إذا لم يكن هناك تخفيف موصى به لتبدأ ، فجرّب 1 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد النقي كنقطة البداية (يجب أن تكون التركيزات في ورقة البيانات) وانطلق من هناك. تذكر الاحتفاظ بجميع معلمات البروتوكول الأخرى كما هي ، مثل نوع العينة وأوقات الحضانة وأوقات الغسيل ودرجات الحرارة.

        ملاحظة عن الأجسام المضادة الثانوية

        قد يكون عليك تجربة تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة الثانوية أيضًا - خاصة في حالة الكشف عن الإشعاع الكيميائي. يؤثر تركيز الجسم المضاد الثانوي المسمى HRP بشكل مباشر على مظهر العصابات. إن القليل جدًا من إنزيم HRP سينتج عنه إشارة منخفضة الإشعاع الكيميائي ونطاقات ضوئية أو مفقودة. من ناحية أخرى ، فإن التركيز المرتفع للغاية سينتج عصابات "محترقة". يحدث هذا بسبب النضوب السريع للركيزة في مركز العصابات. طول حضانة الكاشف الكيميائي سيحدث فرقًا أيضًا (انظر # 6 ، الكشف ، أدناه).

        4. شروط المنع

        تتوفر العديد من مخازن الحجب المؤقتة ولا تعمل جميعها في كل موقف. من المهم تجربة العديد من المحاليل الوقائية لكل زوج من الأجسام المضادة والمستضد. تذكر أن مخازن الحجب القائمة على الحليب تحتوي على أشياء مثل البيوتين الداخلي ، والبروتينات السكرية والإنزيمات التي قد تتداخل مع الإشارة. تحتوي المحاليل التي تحتوي على الحليب ، على سبيل المثال ، على الفوسفاتيز النشط الذي من شأنه أن يخرب اكتشافك للبروتينات الفسفورية في هذه الحالات ، جرب بدائل مثل حاصرات الألبومين في مصل الأبقار.

        5. الغسل

        بالنسبة للجزء الأكبر ، كلما كانت لدي إشارة خلفية عالية ، أثبتت مراجعة خطوات الغسيل في الجولة التالية أنها مفيدة. عادة ، قمت بذلك عن طريق زيادة تركيز توين -20 من 0.05٪ إلى 0.1٪. يمكنك أيضًا تغيير شدة الغسيل باستخدام أي من الأساليب التالية: زيادة أوقات وحجم الغسيل ، أو إجراء تغييرات إضافية في المخزن المؤقت أو استخدام منظفات أقوى (على سبيل المثال ، SDS بدلاً من Tween 20). فقط لا تطرف.

        6. الكشف

        تعد مرحلة الكشف جزءًا لا يتجزأ من الحصول على إشارة لطخة غربية جيدة. هناك العديد من الكواشف المتوهجة كيميائيًا - وبدائل الإضاءة الكيميائية ، مثل اكتشاف الفلورسنت - لذلك هناك الكثير من الخيارات إذا كانت طريقة الكشف الحالية لديك لا تفي بمعايير المختبر. يمكنك اختيار الكواشف الأكثر حساسية أو تلك التي تنتج إشارة تدوم طويلاً ، على سبيل المثال. سيؤدي الاختيار الأخير إلى زيادة قابلية استنساخ البقع بشكل لا يقاس.

        على مستوى أبسط ، يمكن تحسين اكتشاف اللمعان الكيميائي مع أوقات تعرض الفيلم. ربما تكون هذه هي خطوة التحسين التي يتم إجراؤها بشكل متكرر ، لأنها سريعة وسهلة. قم دائمًا بتعريض البقع لمجموعة من النقاط الزمنية الفردية (ولكن تذكر أنه بعد حوالي 10 إلى 15 دقيقة ، سيتم استخدام كل ركيزة HRP). اختيارك للفيلم سيحدث فرقًا أيضًا. لطالما وجدت أن الأفلام المصممة خصيصًا للكشف عن الإشعاع الكيميائي - بدلاً من أي فيلم قياسي حساس للإشعاع - هو الخيار الأمثل.

        7. قطع خطوة!

        من المنطقي أنه إذا كان لديك عدد أقل من الخطوات لتنفيذها ، فهناك عدد أقل يمكن أن يحدث بشكل خاطئ في تجربتك ، وهناك خطوات أقل للتحسين في المقام الأول. يمكن أن تساعد هنا التطورات التكنولوجية والتعديلات البسيطة في الكاشف ، مثل التصوير الفلوري والكواشف المقترنة بـ HRP ، على التوالي.

        على الرغم من أن أنظمة التصوير الفلوري قد لا تكون متاحة بعد لكل مختبر فردي ، فقد تكون هناك مرافق أساسية أو مركزية في مؤسستك تقدم هذه التقنية. تتمثل الميزة الفورية لأنظمة الكشف القائمة على التألق في أنها تتيح الكشف عن أكثر من جسم مضاد واحد في وقت واحد ، مما يلغي الحاجة إلى تجريد البقع وإعادة فحصها. (ومع ذلك ، نوصي بشدة بعدم إجراء محاولاتك الأولية في لطخة ويسترن باستخدام أجسام مضادة أولية متعددة في نفس الحضانة - خاصةً إذا كان التصوير الفلوري غير متوفر وكنت تختار استخدام اكتشاف اللمعان الكيميائي. إذا كنت تريد القيام بذلك في النهاية ، اتركه حتى تعرف البروتينات والأجسام المضادة بشكل أفضل.)

        بدلاً من ذلك ، يمكنك تخطي الاكتشاف الثانوي للأجسام المضادة الأولية تمامًا ، وتبسيط بروتوكول النشاف الغربي ، باستخدام الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بـ HRP. من المسلم به أن هذه ليست متاحة لكل هدف بروتين ، ومع ذلك ، فإن أولئك الذين يتعرفون على ضوابط التحميل الشائعة وعلامات البروتين يمكن أن يوفروا لك الكثير من الوقت ويمكن أن يكون استثمارًا جيدًا. لدى Proteintech العديد من هذه!

        في تلخيص

        تتمثل الأهداف الرئيسية للتحسين في زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء لنطاقات محددة وتقليل النطاقات غير المحددة (إن وجدت). من المسلم به ، إذا اخترت تحسين جميع المتغيرات المذكورة أعلاه ، فسوف يستغرق الأمر وقتًا طويلاً ، ومع ذلك ، حتى تعديل واحد أو اثنين قد يحدث فرقًا ويوفر لك الوقت على المدى الطويل. على العموم ، أنا أعتبر التحسين مهمة جديرة بالاهتمام للغاية - واستراتيجية ضرورية إذا كنت ترغب في تحقيق لطخات غربية بجودة النشر.


        1 المقدمة

        لطخة ويسترن هي طريقة تجريبية شائعة الاستخدام لتحديد التعبير النسبي للبروتين في العينات البيولوجية المعقدة. [1-4] يتم إجراؤه عن طريق فصل البروتينات عن الخلايا أو الأنسجة عن طريق الرحلان الكهربائي ، ونقل البروتينات إلى الطور الصلب الذي يدعم غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) ، ويتم التعرف على البروتينات بواسطة جسم مضاد أولي محدد ، ثم يتم تضخيم الإشارات بواسطة الإنزيم- إلى جانب الجسم المضاد الثانوي ، وأخيراً يضاف مؤشر اللومينول التجاري على الغشاء ، متبوعًا بالتصوير على الفور (الشكل 1 أ). [5 ، 6] ومع ذلك ، فإن أكثر مؤشرات التوهج الكيميائي شيوعًا استخدامًا يكون أحيانًا أقل من أداء في الكشف الدقيق عن التعبير عن البروتينات بسبب الضعف المتأصل في النطاق الخطي الضيق والتكاثر الكمي غير المستقر (الشكل 1 ب). [7-13] نظرًا لأن الفلوروفور الذي يتم تطعيمه مباشرة بالأجسام المضادة الأولية أو الثانوية ، فإن مؤشر التألق الذي تم الإبلاغ عنه مؤخرًا للتحليل الكمي للبروتينات منخفض جدًا في التركيز لتتبع البروتينات. [14-18] علاوة على ذلك ، فإن ظاهرة التبريد الناتج عن التجميع (ACQ) تضيق بشكل كبير النطاق الكمي الخطي. [19-26]

        هنا ، تم تصميم وبناء مؤشر التألق الناجم عن الانبعاث الناجم عن التجميع (AIE) القائم على الإنزيم القابل للتنشيط من خلال إدخال ركيزة الفوسفاتيز القلوية (ALP) ، مجموعة الفوسفات المحبة للماء ، في لبنة بناء AIE الراسخة من الكينولين-مالونونيتريل (QM). يعرض هذا "amphiphilic" AIEgen DQM-ALP مضانًا أوليًا "متوقفًا" بسبب التشتت الفائق في كل من البيئات المائية والدهنية ، في حين أنه يمكن شقها لتحرير QM-OH الكارهة للماء لتجميع وإصدار تلألؤ قوي عند التعريض لـ ALP-coupled الأجسام المضادة الثانوية على غشاء PVDF (الشكل 1C). يمنح مؤشر التألق ALP القابل للتنشيط الميزات التالية: (1) ضمان ارتفاع إشارة إلى ضوضاء (س/ن) نسبة ال البرمائيات DQM-ALP من خلال التشتت الممتاز في كل من البيئات المائية / المحبة للدهون لتوليد إشارة مضان أولية ضئيلة (2) تمكين انتقائية عالية بسبب التعرف المحدد بين الجسم المضاد الثانوي المرتبط بـ ALP ومجموعة الفوسفات (3) توسيع نطاق القياس الكمي الخطي بمساعدة من AIEgens يتغلب على التبريد الناتج عن التركيز العالي للإضاءة (4) معالجة التكاثر الكمي المستقر نتيجة الثبات الضوئي الممتاز لـ AIEgens. كل هذه المزايا تمكن مؤشر DQM-ALP "amphiphilic" من تحديد البروتينات بإشارة مستقرة قابلة للتكرار ونطاق خطي عريض ، وبالتالي توفير بديل عملي للكروموجينيك المتوفر تجارياً في اختبار لطخة ويسترن المعتمد على التألق. [27-32]


        نتائج ومناقشة

        طريقة المقايسة المناعية المجهرية

        في طرق المقايسة المناعية السطحية ، يكون انتشار الجسم المضاد هو المعدل الذي يحدد خطوة الفحص نتيجة لذلك ، يتم استخدام أوقات حضانة طويلة لتحقيق أقصى حساسية للكشف. 25 & # x0201332 آليات النقل الجماعي للتحليلات في محلول يتفاعل مع أهداف الربط السطحي تشمل الانتشار بناءً على تدرج التركيز ، والانتشار في تدرج درجة الحرارة (حراري) ، والانتشار في تدرج ضغط ، والانتشار بمساعدة قوى خارجية تعمل على مادة كيميائية الأنواع / التحليلات بما في ذلك الحمل الحراري الحر والقسري. 51 & # x0201353 استخدمنا ترسيب التدفق لتحقيق النقل الحراري وتقليل مسافة الانتشار مما أدى إلى نطاقات زمنية أقصر لربط الجسم المضاد. يوضح الشكل 1 تركيب الأنبوب المطبوع ثلاثي الأبعاد ومرحلة الفراغ التي تم استخدامها لأداء المقايسات المناعية السريعة. يتم وضع الغشاء في مرحلة الفراغ ويحدث ترسيب تدفق محاليل المقايسة المناعية من خلال حقنة متصلة بالأنابيب كما هو موضح في الشكل 2.

        لقد طورنا شروطًا للمقايسة من خلال إجراء لطخات نقطية من 3.3 & # x003bcg / مل أكتين مذاب في الماء وظروف مختلفة لترسب محلول المقايسة المناعية. وجدنا أن ترسيب الجسم المضاد الأولي عند 20 & # x003bcL / min بسرعة مرحلة 4 مم / دقيقة أعطى كثافة إشارة مماثلة لطريقة المقايسة المناعية التقليدية بين عشية وضحاها (الشكل S1). كان إجمالي وقت ربط الجسم المضاد الأولي 25 دقيقة وكان إجمالي الجسم المضاد الأولي المستخدم 175 نانوغرام ، واختزال بمقدار 40 ضعفًا و 30 ضعفًا على التوالي عبر الطريقة التقليدية.

        قمنا بعد ذلك بفحص خطوة ترسب الأجسام المضادة الثانوية. أدى ترسب التدفق عند 20 & # x003bcL / min بسرعات المرحلة من 2 & # x020138 مم / دقيقة ، إلى ضعف الإشارة وخلفية عالية ومستويات ضوضاء. على وجه التحديد ، في ظل هذه الظروف ، لاحظنا تكوين بقع فلورية كبيرة على غشاء الربط لا يمكن إزالتها بسهولة. تم تحديد أن استخدام معدلات تدفق منخفضة (3.5 & # x020137.5 & # x003bcL / دقيقة) بينما تتحرك المرحلة ذهابًا وإيابًا بسرعة 70 مم / دقيقة بحيث تمر عينات الغشاء والبروتين عبر الجسم المضاد الثانوي عدة مرات ، مما أدى إلى أقل بكثير من تشكيل هذه البقع الخلفية وحساسية مماثلة للمقايسات المناعية التقليدية (الشكل S2). باستخدام 5 & # x003bcL / min ، كان إجمالي وقت ترسيب الجسم المضاد الثانوي 15 دقيقة وكان إجمالي الجسم المضاد الثانوي المستخدم 75 نانوغرام ، وتقليل 4 أضعاف و 27 ضعفًا على التوالي على الطريقة التقليدية.

        من غير الواضح سبب الحاجة إلى شروط مختلفة لترسيب الجسم المضاد الأولي والثانوي ، ومع ذلك ، تظهر الاختلافات أيضًا في طريقة المقايسة المناعية التقليدية التي يبدو أنها مرتبطة بملاحظاتنا. عادة ما تكون أوقات حضانة الأجسام المضادة الثانوية أقصر بكثير (ساعة واحدة) من الأجسام المضادة الأولية (بين عشية وضحاها). تُستخدم الأجسام المضادة الثانوية الفلورية عادةً بتركيزات مخففة أكثر من الأجسام المضادة الأولية أيضًا. من المحتمل أن تساهم عدة عوامل في الاختلافات في ارتباط الجسم المضاد الأولي والثانوي. قد تختلف حركيات الربط الخاصة بالجسم المضاد الأولي عن تلك الخاصة بالجسم المضاد الأولي إلى المستضد المرتبط بالسطح. يوفر وجود علامات الفلورسنت مجموعات كارهة للماء على الجسم المضاد الثانوي والتي قد تؤثر أيضًا على إمكانية الارتباط والتجميع غير النوعيين لتغيير إشارات الخلفية.

        بغض النظر عن سبب الاختلافات ، باستخدام طرق الترسيب هذه ، والشطف بين كل ترسيب أثناء استخدام الفراغ لسحب المحاليل عبر الغشاء كما هو موضح في الشكل 2 ، يتم إكمال اختبار مناعي لطخة نقطية كاملة في ساعة واحدة (الجدول 1). نسب S / N التي تم الحصول عليها من خلال هذا الإجراء المختصر قابلة للمقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام وقت تحليل 20 ساعة (الشكل 3).

        مقارنة بين 20 ساعة ، مناعية تقليدية (أ) والمقايسة المناعية السريعة المطورة 1 ساعة (ب) لبقع نقطية تبلغ 3.3 & # x003bcg / مل أكتين. يتم عرض قيم S / N (c) ، والإشارة (d) ، والضوضاء (e) المحسوبة والمخططة مع n = 3 نقاط بروتين تظهر اكتشافًا مشابهًا بين طريقتين للمقايسة المناعية. تم إجراء إحصائيات اختبار الطالب ثنائية الذيل & # x02019s غير المزاوجة باستخدام p & # x0003c 0.01 لمقارنة S / N (c) لنتائج المقايسة المناعية التقليدية والتدفق التي لا تختلف فيها مجموعتي البيانات اختلافًا كبيرًا.

        الجدول 1.

        مقارنة بين أوقات تحليل طريقة المقايسة المناعية التقليدية والسريعة واستهلاك الأجسام المضادة لأغشية النشاف النقطي.

        المقايسة المناعية التقليديةالتدفق المناعي
        الوقت لكل خطوة
        & # x02003 & # x02003 حظر1 ح15 دقيقة
        & # x02003 & # x02003 الجسم المضاد الأساسي17 ساعة25 دقيقة
        & # x02003 & # x02003 الغسيل20 دقيقة2.5 دقيقة
        & # x02003 & # x02003Secondary Antibody1 ح15 دقيقة
        & # x02003 & # x02003 الغسيل20 دقيقة2.5 دقيقة
        الوقت الكلي20 ساعة1 ح
        استهلاك الجسم المضاد
        & # x02003 & # x02003 الجسم المضاد الأساسي5 & ​​# x003bcg175 نانوغرام
        & # x02003 & # x02003Secondary Antibody2 & # x003bcg75 نانوغرام

        تستند هذه القيم إلى أثر غشاء يبلغ طوله 7 سم.

        النشاف الغربي ذو الرقاقة الدقيقة بالمقايسة المناعية للترسيب المباشر

        تم بعد ذلك تطبيق طريقة المقايسة المناعية للتدفق على البروتينات المودعة بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام الدقيق. يعرض الشكل 4 مخططًا وصورة للرقاقة الغربية النشاف. يتم إدخال العينة باستخدام حقنة مسورة موقوتة ، وبعد ذلك تهاجر البروتينات عبر قناة الفصل. في هذا العمل ، يتم استخدام مجموعة خارجية من تدفق الغمد لتأريض نهاية قناة الفصل بينما تُستخدم قنوات تدفق الغلاف الداخلي لإيداع البروتينات المنفصلة على شريط غشاء النيتروسليلوز. أدت التجارب التجريبية باستخدام هذا النظام لإيداع الأكتين على عضو بشكل غير متوقع إلى انخفاض أو عدم وجود إشارة عند استخدام المقايسة المناعية السريعة الموصوفة أعلاه. لتحديد سبب هذا الخسارة في الإشارة ، أجرينا عملية التدفق لجميع الخطوات باستثناء إضافة الأجسام المضادة الثانوية ، والتي تم إجراؤها على شاكر لمدة ساعة واحدة. سمحت طريقة التدفق المعدلة هذه باكتشاف البروتينات من النشاف الغربي للرقاقة الدقيقة ولكن مع انخفاض S / N مقارنة بالمقايسة المناعية التقليدية 20 ساعة (الشكل S3). تشير هذه النتائج إلى أن البروتين لم يتم التقاطه بشكل فعال مع نظام ترسيب التدفق في وجود الهلام وافترض أنه يرجع إلى تأثير الجل على تفاعلات البروتينات مع غشاء الربط. لاختبار هذه الفرضية ، أجريت تجارب مقارنة لطخات نقطية من البروتين المخفف في محلول الماء والهلام. أظهرت هذه التجارب شدة إشارة أقل للبقع النقطية الهلامية باستخدام نهج المقايسة المناعية السريعة (الشكل S4) الذي يدعم الفرضية القائلة بأن الهلام ساهم في فقدان الإشارة.

        لمعالجة فقدان البروتينات المتراكمة مع مصفوفة غربلة الهلام ، تم استخدام الجلوتارالدهيد لربط البروتينات من أجل تثبيت الغشاء ، وهي طريقة مستخدمة في بعض الحالات مع النشاف الغربي التقليدي. 41،42،45،46 يُعزى الارتباط المتقاطع لتحسين احتباس البروتين في أغشية الربط إلى ارتباطات متعددة النقاط للبروتينات المتشابكة. 43،46،48 في طرق اللطخة الغربية السابقة ، تم استخدام المعالجة بـ 0.5٪ (حجم / حجم) -2.5٪ (حجم / حجم) جلوتارالدهيد لمدة 15 & # × 0201360 دقيقة لتحسين احتباس البروتين على أغشية النشاف. 42،43،45،46 لقد استخدمنا مؤخرًا 40٪ (حجم / حجم) من الجلوتارالدهيد لتحقيق الارتباط المتبادل في 10 ثوانٍ لدراسات تفاعل البروتين والبروتين (PPI). 54 مستوحى من هذا النهج ، وجدنا أن تعريض البروتينات والغشاء المنقط إلى 40٪ (حجم / حجم) من الجلوتارالدهيد لمدة 10 ثوانٍ والشطف بالماء من أجل

        دقيقتان قبل إجراء المقايسة المناعية الدقيقة لقضايا فقدان البروتين المخففة بحيث تكون نتائج أغشية النشاف الغربية للرقاقة الدقيقة قابلة للمقارنة بين المقايسة المناعية التقليدية والتدفق (الشكل 5). يقارن الشكل S3 مستوى S / N الأولي الذي تم تحقيقه بمقايسة مناعية معدلة (1.75 ساعة) ، مع طريقة غير مرتبطة (1 ساعة) ، وطريقة تدفق متصالبة (1 ساعة) مع طريقة تقليدية (20 ساعة) تظهر المقايسة المناعية أن الارتباط المتبادل للجلوتارالدهيد فعال في منع فقدان البروتينات من أثر الهلام في النشاف الغربي للرقاقة الدقيقة.

        مقارنة بين المقايسة المناعية التقليدية (أ) والمقايسة المناعية للتدفق المتصالب (رابط X) (ب) من أجل النشاف الغربي للرقاقة الدقيقة لـ 3.3 & # x003bcg / mL أكتين. يتم عرض صور الغشاء ومسح الخط من ImageJ (تتبع أسود) ، حيث يتم تراكب مسح خط سلم بروتين FITC (تتبع أحمر). تم تقسيم الوحدات التعسفية لشدة إشارة سلم البروتين FITC بمقدار 250 لتوسيع سلم المؤامرة أعلاه. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للبروتين المكتشفة بواسطة طرق المقايسة المناعية المختلفة للحقن المتكرر ، والفصل ، وترسبات عينة البروتين من الرقاقة. يتم عرض قيم S / N (c) والإشارة (d) والضوضاء (e) المحسوبة والمخططة مع n = 3 قمم البروتين المحقونة والمكتشفة والتي تُظهر اكتشافًا مشابهًا بين طريقتين للمقايسة المناعية. تعطي العلاقة بين S / N وتركيز الأكتين للمقايسة المناعية التقليدية والمقايسة المناعية للتدفق X-link R2 يساوي 0.9995 و 0.996 ، على التوالي (f).تم حساب حدود الكشف في حساب الحد من الفراغ مع LOD من 2 نانومتر للمقايسة المناعية التقليدية و LOD من 7 نانومتر للمقايسة المناعية لتدفق X-link. تم إجراء إحصائيات اختبار الطالب ثنائية الذيل & # x02019s غير المزاوجة باستخدام p & # x0003c 0.01 لمقارنة S / N (c) لنتائج المقايسة المناعية التقليدية والتدفق التي لا تختلف فيها مجموعتي البيانات اختلافًا كبيرًا.

        يعطي منحنى معايرة النشاف الغربي للرقاقة الدقيقة للأكتين بواسطة المقايسات المناعية التقليدية والمتصالبة استجابة خطية (الشكل 5). من هذه البيانات ، تم حساب حدود تركيز الكشف (LODs) على أنها 2 نانومتر للمقايسة المناعية التقليدية و 7 نانومتر للمقايسة المناعية للتدفق المتقاطع. نظرًا لأننا نقدر أن 4.5 nL تم حقنها ، فإن هذا التركيز يتوافق مع LOD كتلة من 9 amol أو 400 fg للمقايسة المناعية التقليدية و 30 amol أو 1 بيكوغرام للمقايسة المناعية للتدفق المتصالب. بالطبع ، تم استخدام 20 & # x003bcL لملء الخزان ، لذلك تم استخدام المزيد من العينات للمقايسة. ستكون هناك حاجة إلى طرق تحضير وتحميل عينة مصغرة للاستفادة الكاملة من LOD الشامل الممكن.

        يلخص الجدول 2 طريقة المقايسة المناعية المتقاطعة المتقاطعة. كشفت تجارب أخرى أنه إذا كان من الممكن التضحية ببعض السرعة ، فيمكن تعديل خطوات المعالجة التي تؤثر على فقد البروتين من انخفاض التزام البروتينات من تتبع هلام ترسيب الرقائق الدقيقة بحيث يتم استخدام طريقة المقايسة المناعية لمدة ساعتين للكشف عن البروتين دون الارتباط المتبادل ، كما تم تلخيصه في الجدول 2. في هذه الحالة ، يتم تحضين الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز مماثل للمقايسة المناعية التقليدية. تسمح طرق المقايسة المناعية المختلفة للتدفق بالمرونة إما باستخدام خطوة الارتباط المتبادل قبل المقايسة المناعية أو لا. يمكن أن تكون الطريقة غير المترابطة مفيدة إذا كان الارتباط المتقاطع يثبط ارتباط الجسم المضاد ، على الرغم من أن هذا لم يتم رؤيته أو الإبلاغ عنه مسبقًا بواسطة تقنيات غربية أخرى للربط المتبادل. 48 & # x0201355

        الجدول 2.

        مقارنة بين أوقات تحليل طرق المقايسة المناعية التقليدية والمعدلة الدقيقة والسريعة واستهلاك الأجسام المضادة لأغشية النشاف الغربية للرقاقة الدقيقة.

        المقايسة المناعية التقليديةتعديل التدفق المناعيX-link Flow المقايسة المناعية
        الوقت لكل خطوة
        & # x02003 & # x02003 الربط المتقاطع--10 ق
        & # x02003 & # x02003Rinsing--110 ق
        & # x02003 & # x02003 حظر1 ح15 دقيقة15 دقيقة
        & # x02003 & # x02003 الجسم المضاد الأساسي17 ساعة25 دقيقة25 دقيقة
        & # x02003 & # x02003 الغسيل20 دقيقة10 دقائق2.5 دقيقة
        & # x02003 & # x02003Secondary Antibody1 ح1 ح15 دقيقة
        & # x02003 & # x02003 الغسيل20 دقيقة10 دقائق2.5 دقيقة
        الوقت الكلي20 ساعة2 ح1 ساعة 2 دقيقة
        استهلاك الجسم المضاد
        & # x02003 & # x02003 الجسم المضاد الأساسي5 & ​​# x003bcg175 نانوغرام175 نانوغرام
        & # x02003 & # x02003Secondary Antibody2 & # x003bcg10 & # x003bcg75 نانوغرام

        تستند هذه القيم إلى أثر غشاء يبلغ طوله 7 سم.

        اختبرنا الطريقة أيضًا على بروتينات مختلفة. مقارنة بين اللطخات الغربية ذات الرقاقة الدقيقة للكشف عن GAPDH من محللة الخلية A431 باستخدام المقايسة المناعية التقليدية (20 ساعة) والمقايسة المناعية الدقيقة غير المتصالبة (ساعتان) والمقايسة المناعية المتصالبة (ساعة واحدة). هو مبين في الشكل 6. كما هو موضح ، يتم تحقيق نسبة S / N قابلة للمقارنة لجميع الطرق ولكن طريقة التدفق المتصالب تقلل من وقت الفحص بمقدار 20 ضعفًا واستخدام الكاشف عن طريق

        30 ضعفًا. قمنا أيضًا بمقارنة النتائج بطريقة المقايسة المناعية لمدة 20 ساعة للكشف عن & # x003b2-Tubulin في محللة الخلية A431 (الشكل 7). كما هو موضح ، تم الحصول على نتائج مماثلة لهذه البروتينات من المحللة أيضًا. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام طريقة التدفق بشكل موثوق لبروتينات مختلفة مع الحد الأدنى من تطوير الطريقة.

        تم إجراء النشاف الغربي للرقاقة الدقيقة لـ 100 & # x003bcg / mL بروتين الخلية A431 الكلي للكشف عن GAPDH. يتم عرض مقارنة بين المقايسة المناعية التقليدية (أ) والمقايسة المناعية المعدلة للتدفق (ب) والمقايسة المناعية للتدفق المتصالب (رابط X) (ج) للكشف عن GAPDH. يتم عرض صور الغشاء ومسح الخط من ImageJ (تتبع أسود) ، حيث يتم تراكب مسح خط سلم بروتين FITC (تتبع أحمر). تم تقسيم الوحدات التعسفية لشدة إشارة سلم البروتين FITC بمقدار 2500 لتوسيع نطاق سلم المؤامرة أعلاه. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للبروتين المكتشفة بواسطة طرق المقايسة المناعية المختلفة للحقن المتكرر ، والفصل ، وترسبات عينة البروتين من الرقاقة. تسميات وزن جزيء سلم البروتين FITC 1 & # x020137: 11 و 21 و 32 و 40 و 63 و 96 و 155 كيلو دالتون. يتم عرض قيم S / N (d) والإشارة (e) والضوضاء (f) المحسوبة والمخططة مع n = 3 قمم البروتين المحقونة والمكتشفة والتي تُظهر اكتشافًا مشابهًا بين طريقتين للمقايسة المناعية. تم إجراء إحصائيات اختبار الطالب ثنائية الذيل & # x02019s غير المزاوجة باستخدام p & # x0003c 0.01 لمقارنة S / N (d) لنتائج المقايسة المناعية التقليدية والتدفق التي لا تختلف فيها مجموعات البيانات 20 ساعة و 1 ساعة بشكل كبير.

        تم إجراء النشاف الغربي للرقاقة الدقيقة لـ 100 & # x003bcg / mL بروتين الخلية A431 الكلي للكشف عن & # x003b2-Tubulin. يتم عرض مقارنة بين المقايسة المناعية التقليدية (أ) والمقايسة المناعية المعدلة للتدفق (ب) والمقايسة المناعية للتدفق المتصالب (رابط X) (ج) للكشف عن & # x003b2-Tubulin. يتم عرض صور الغشاء ومسح الخط من ImageJ (تتبع أسود) ، حيث يتم تراكب مسح خط سلم بروتين FITC (تتبع أحمر). تم تقسيم الوحدات التعسفية لشدة إشارة سلم البروتين FITC بمقدار 2500 لتوسيع نطاق سلم المؤامرة أعلاه. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للبروتين المكتشفة بواسطة طرق المقايسة المناعية المختلفة للحقن المتكرر ، والفصل ، وترسبات عينة البروتين من الرقاقة. ملصقات وزن جزيء سلم البروتين FITC 1 & # x020137 تمثل: 11 و 21 و 32 و 40 و 63 و 96 و 155 كيلو دالتون. يتم عرض قيم S / N (c) والإشارة (d) والضوضاء (e) المحسوبة والمخططة مع n = 3 قمم البروتين المحقونة والمكتشفة والتي تُظهر اكتشافًا مشابهًا بين طريقتين للمقايسة المناعية. تم إجراء إحصائيات اختبار الطالب ثنائية الذيل & # x02019s غير المزاوجة باستخدام p & # x0003c 0.01 لمقارنة S / N (c) لنتائج المقايسة المناعية التقليدية والتدفق التي لا تختلف فيها مجموعتي البيانات اختلافًا كبيرًا.


        تحليل LC3 في لطخة ويسترن

        تعتبر السلسلة الخفيفة 3 من البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة (LC3) واحدة من العلامات المحددة للالتهام الذاتي ، واستخدامها منتشر في المختبرات في جميع أنحاء العالم. على الرغم من شعبيتها ، هناك عدة اعتبارات عند استخدام الأجسام المضادة LC3 في المقايسات المناعية ، وخاصة البقع الغربية.

        يتم التعبير عن LC3 على شكل بروبيبتيد ويتم شق LC3 لاحقًا لتشكيل LC3-I. يؤدي بدء الالتهام الذاتي إلى تحويل LC3-I إلى LC3-II عن طريق إضافة مجموعة فوسفاتيد إيثانول أمين (PE) إلى الطرف C. تزيد مجموعة PE من معدل ترحيل النطاق في هلام SDS-PAGE ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى طبيعتها الكارهة للماء ، يظهر هذا التعديل عادةً على أنه مظهر مزدوج في لطخة غربية. يسهل الطابع المحب للدهون لمجموعة PE أيضًا إدخال LC3-II في أغشية البلعوم الذاتي ، ونتيجة لذلك ، يتحلل LC3-II عندما يتم قلب البلعوم الذاتي. تعتبر الزيادة في شدة نطاق LC3-II وانخفاض في تعبير LC3-I السمة المميزة للالتهام الذاتي ولكن الزيادات في LC3-II يمكن أن تكون ناجمة عن تخليق البلعمة الذاتية المعزز أو تقليل إعادة تدوير البلعمة الذاتية ، مما يجعل تفسير تلطيخ LC3 مضللًا.

        التحقق من صحة خروج المغلوب LC3B باستخدام لطخة ويسترن: الجسم المضاد LC3B [NB100-2220] - LC3B / MAP1 [NB100-2220] - الكشف عن LC3 في محللات خلايا الماوس ES. Atg5 - / - خلايا ES من Dr. Noboru Mizushima [Mizushima، N. et al. J. خلية بيول. 152 (2001)] حقوق الصورة للدكتور بيث ليفين ، المركز الطبي UT SW.

        يزداد تعقيد تحليل البقع الغربية LC3 بسبب الاختلاف في تقاربات الأجسام المضادة لـ LC3-I و LC3-II والاختلاف الملحوظ في تعبير LC3 في أنواع الخلايا والأنسجة المختلفة. بسبب هذه العوامل ، ظهر إجماع على أن المبلغ الإجمالي لـ LC3-II يجب فقط تقييمه ومقارنته بعنصر تحكم التحميل كوسيلة لتقييم الالتهام الذاتي. بالإضافة إلى ذلك ، قام العديد من الباحثين بتضمين مقتطفات تحكم تم جمعها من الخلايا المعالجة بمثبطات مختلفة من أجل تحديد كفاءة التدفق الذاتي في عيناتهم التجريبية. يشير نمط تعبير LC3 في عناصر التحكم هذه بشكل مثالي إلى سبب تراكم LC3-II (أو غيابه) اعتمادًا على نوع المثبط المستخدم. الاعتبار الأخير هو قياس التدفق الذاتي على مدى فترة زمنية بدلاً من حصاد المستخلصات من نقطة ثابتة واحدة. على سبيل المثال ، على الرغم من أن التحول من LC3-I إلى LC3-II واضح بعد فترات قصيرة من الإجهاد ، تختفي إشارة LC3 بعد جوع ممتد في العديد من أنواع الخلايا.

        للحصول على نصائح حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها والإجابات التقنية العلمية لـ LC3 لأكثر من 25 سؤالًا متكررًا (FAQs) حول أبحاث الالتهام الذاتي ، اقرأ الأسئلة الشائعة - Autophagy و LC3.


        المواد والأساليب

        المواد

        تم شراء كواشف اليوريا و DTT والكواشف العازلة من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على يوبيكويتين المنقى (BML-UW8795) ، وسلاسل يوبيكويتين (BML-UW0825) ، و MG-132 (BML-PI102) من Enzo Life Sciences (نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية).

        زراعة الخلايا

        نمت خلايا قلب الفئران H9c2 (ATCC ، CRL-1446) في DMEM (Invitrogen ، Carlsbad ، CA) في وجود 5 ٪ FBS و 0.5 ٪ بنسلين / ستربتومايسين (Invitrogen) في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون.2. تمت إضافة مثبط البروتوزوم MG132 (التركيز النهائي 10 ميكرومتر) إلى وسط النمو وتم جمع العينات بعد 36 ساعة من العلاج.

        إعداد عينة

        تم التخلص من ذكور الفئران في عمر 3 أشهر عن طريق استنشاق 3 ٪ من الأيزوفلورين وخلع عنق الرحم اللاحق. تمت إزالة القلوب وغسلها في برنامج تلفزيوني بارد ووزنها وتجميدها. وقد ثبت أن هذه الطريقة ممتازة للتحقيق عن طريق النشاف الغربي [16]. تم تصنيف ذكور الجرذان فيشر 344-براون النرويجية (صغيرة (10 أشهر) وأعمار (30 شهرًا)) في واحدة من مجموعتين تجريبيتين: المجموعات العادية أو ذات الأطراف الخلفية. لقد ثبت سابقًا أن 14 يومًا من التعليق الخلفي تزيد من استعداد الفئران للإصابة باضطراب النظم القلبي ، في حين أن 21 يومًا من التعليق الخلفي تقلل بشكل كبير من معدلات دوران بروتينات عضلة القلب [17 ، 18]. من الممكن أن يتأثر ISGylation في قلوب الحيوانات المعلقة ذات الأطراف الخلفية لأن بعض الإنزيمات التي تعزز ISGylation تشارك أيضًا في اقتران اليوبيكويتين [19]. لتحديد ما إذا كانت مستويات البروتينات ISGylated (البروتينات المرتبطة تساهميًا بـ ISG15) في القلوب قد تأثرت بتفريغ عضلات الأطراف السفلية ، تم استخدام نموذج تعليق الذيل غير الغازي [20]. تم الحفاظ على الفئران في وضع الإمالة رأسًا لأسفل مع تعليق أطرافها الخلفية لمدة 14 يومًا. تم جمع القلوب بعد تخدير الفئران بغاز الأيزوفلورين. بعد الانتهاء من إزالة الأنسجة ، تم قتل الفئران عن طريق الاستنزاف. تم وزن القلوب وتجميدها في نيتروجين سائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية لتحليلها لاحقًا. تم إجراء هذا التحقيق وفقًا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الخاصة بالحيوانات من قبل جامعة كاليفورنيا ، لجنة ديفيس المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه وبُذلت كل الجهود لتقليل المعاناة.

        تحضير البروتينات بوليوبيكويتينتيد المنقى والليزات بدون بروتينات يوبيكوايتيد

        تعرضت خلايا الفئران القلبية H9c2 لـ 10 ميكرومتر MG-132 (مثبط البروتيازوم) لمدة 36 ساعة لزيادة مستويات البروتينات المكوّنة بشكل كبير. تم بعد ذلك صوت العينات في 50 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 0.15 مولار كلوريد الصوديوم ، و 1 ملي مولار EDTA ، و 1٪ NP-40 ، و 10٪ من الجلسرين ، ومثبطات الأنزيم البروتيني (P2714 ، Sigma) عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي (14000xg) لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، تم تحضين المادة الطافية مع كيانات ربط Tandem Ubiquitin (TUBEs) المرتبطة بـ agarose (TUBE2-agarose) (UM402 ، تم الحصول عليها من LifeSensors ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تعرض الأنابيب الأنبوبية زيادة كبيرة في تقارب شقوق بوليوبيكويتين (حتى 1000 ضعف) على المجال المرتبط بربط يوبيكويتين الفردي (UBA) [21]. لكل مجم من البروتين الكلي ، تم استخدام 25 ميكرولتر من الراتنج واحتضانها لمدة ساعة عند 4 درجات مئوية مع التأرجح. تم جمع TUBE-agarose بواسطة الطرد المركزي منخفض السرعة (1000xg ، 4 ° C) لمدة دقيقتين. تم غسل الحبيبات بمحلول ملحي Tris-buffered يحتوي على 0.05 ٪ توين -20 (TBST) وتم جمعه عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة. تم تكرار الغسل ثلاث مرات وتم التصفية من البروتينات متعددة الأوبك مع 0.2 M glycine HCl ، ودرجة الحموضة 2.5 (3X الحجم الكلي للراتنج الحبيبي) لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. تمت إزالة الخرزات بالطرد المركزي عند 10000xg لمدة 5 دقائق. تم قياس كمية البروتينات المتعددة المكوّنة المزالة ، وخلطها مع محلول عينة Laemmli وتسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

        تحضير متجانسات القلب والكبد العصاري الخلوي

        تم تجانس قلب الفئران المسحوق أو قلب الفأر المفروم أو أنسجة كبد الفئران في مخزن مؤقت للتجانس البارد (50 ملي مولار تريس ، 1 ملي مولار EDTA ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار كلوريد الصوديوم2، 0.5 ملي مولار DTT ، الرقم الهيدروجيني 7.5) مع الخالط الزجاجي (25 ضربة) ، وتم طرد المتجانسات عند 12000xg و 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. تمت إزالة المواد الطافية ، وتم تخفيفها إلى تركيزات متساوية من البروتين ، جنبًا إلى جنب مع محلول 4X لعينة SDS (8٪ SDS ، و 40٪ جلسرين ، و 0.4٪ بروموفينول أزرق ، و 5٪ β-مركابتوإيثانول ، و 240 ملي مولار تريس ، ودرجة الحموضة 6.8) ، وغليها 4 دقائق عند 95 درجة مئوية.

        تحديد تركيز البروتين

        تم تحديد تركيزات البروتين لمتجانسات القلب العصاري الخلوي باستخدام Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). إن Nanodrop هي الطريقة المفضلة لتحديد تركيزات الكسور الخلوية لأن تلوث الحمض النووي ، الذي يؤثر على قيم الامتصاص في Nanodrop ، عادة ما يكون غائبًا في هذه العينات.

        تحليل لطخة غربية

        تم فصل عينات البروتين (20 ميكروغرام / بئر) وسلالم بوزن جزيئي مزدوج زائد (# 161–0374 ، مختبرات Bio-Rad ، Hercules ، كاليفورنيا) بواسطة SDS-PAGE على المواد الهلامية الجاهزة التقليدية الخالية من البقع مع 4-15٪ التدرج (Bio-Rad) لحوالي 60 دقيقة عند 150 فولت في تشغيل المخزن المؤقت (25 ملي مولار قاعدة تريس ، 192 ملي جليكاين ، 1٪ SDS ، درجة الحموضة 8.3). تم تنشيط المواد الهلامية الخالية من البقع عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقة واحدة. تم نقل البروتينات إلى أغشية النيتروسليلوز (# 170-4159 ، Bio-Rad) باستخدام نظام نقل التوربو Bio-Rad Trans-Blot لمدة 7 دقائق. تم الكشف عن البروتينات الكلية على الأغشية باستخدام طريقة خالية من البقع [22 ، 23] أو مع تلطيخ بونسو S. تم تنفيذ جميع إجراءات النشاف الغربي في درجة حرارة الغرفة مع التقليب ما لم ينص على خلاف ذلك. تم حظر الأغشية باستخدام حليب خالٍ من الدسم بنسبة 3٪ (# 170-6404 بيو راد) في TBST (20 ملي مولار تريس ، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم ، تحتوي على 0.05٪ توين -20 ، درجة الحموضة 7.4) أو PBST (10 ملي فوسفات ، 137 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي بوكل ، تحتوي على 0.05٪ توين -20 ، الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 60 دقيقة. تم تحضين الأغشية بعد ذلك بأجسام مضادة أولية (انظر الجدول 1) في TBST أو PBST مع حليب خالي الدسم بنسبة 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل. تم إجراء إزالة الجسم المضاد الأولي الزائد عن طريق غسل الأغشية في TBST أو PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. الجسم المضاد الثانوي (مضاد للفأر مترافق مع بيروكسيداز ، أو مضاد للماعز ، أو جسم مضاد ثانوي IgG مضاد للأرنب (مضاد للفأر Cat. # A9044 ، مضاد للماعز # A5420 ، مضاد للأرنب القط. # A0545 ، Sigma-Aldrich ، St Louis ، MO ، USA)) المخفف 1: 5000 مع الغشاء في TBST أو PBST مع 1٪ حليب جاف خالي الدسم لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تمت إزالة الجسم المضاد الثانوي الزائد عن طريق غسل الأغشية في TBST أو PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. تم تعريض الأغشية إلى كاشف لمعان كيميائي محسن من Clarity (Cat. # 170-5061 ، Bio-Rad) لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة وتم تصورها باستخدام ChemiDoc MP (Cat. # 170–8280 ، Bio-Rad). تم إجراء الكشف عن شدة النطاق وتقديرها باستخدام برنامج Image Lab 5.0 (Bio-Rad). تم تطبيع العصابات إلى البروتين الكلي عن طريق قسمة شدة النطاق على شدة البروتين الكلي من نفس العينة على نفس اللطخة. تم إجراء تصحيح الخلفية كما وصفه Taylor et al. [24]. تم استخدام ما لا يقل عن ثلاث مكررات بيولوجية لدراسات الفئران الصغيرة والكبيرة بينما تم استخدام ثلاث مكررات تقنية على الأقل لمقارنات القلب والكبد.

        إحصائيات

        تظهر النتائج على أنها تعني ± الانحراف المعياري (SD). تم تحديد الدلالة الإحصائية بواسطة اختبار t للطالب أو ANOVA أحادي الاتجاه. المقارنات التي أسفرت عن قيمة p & lt 0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية.


        الاستنتاجات

        هنا ، ولأول مرة ، أظهرنا وجود رابط مباشر بين METTL3 و ADAR1. في الواقع ، يزيد METTL3 من مستوى بروتين ADAR1 (بشكل مستقل عن mRNA الخاص به). يرتبط مستوى البروتين المرتفع ADAR1 ببقاء مريض الورم الأرومي الدبقي ويزيد من تكاثر الخلايا. لقد أثبتنا أن ADAR1 هو أحد الأهداف الرئيسية لـ ن 6 -methyladenosine METTL3 الذي يتحكم في تكاثر الخلايا في الورم الأرومي الدبقي وتقليله في خلفية METLL3-overexpressing يمنع نمو الورم الأرومي الدبقي في الجسم الحي. الأهم من ذلك ، لقد أثبتنا أن ADAR1 يعمل كبروتين مؤيد للورم بشكل مستقل عن مجال نزع الأمين النشط. أظهرت العديد من الدراسات وجود صلة مهمة بين السرطان وقدرة ADAR1 على إنتاج الإينوزين ، مما يشير إلى تحديد الجزيئات القادرة على تثبيط النشاط الأنزيمي ADAR1 كعلاجات مضادة للسرطان. تشير دراستنا إلى أنه بالنسبة للعلاج المضاد للسرطان بوساطة ADAR ، يمكن أن يكون استهداف بروتين ADAR1 أكثر كفاءة من نشاطه في إنزيم ديميناز.


        مناقشة

        في هذه الدراسة ، تم دمج ببتيد إشارة الإفراز المتوقع لـ Cry1Ia (Iasp) في الطرف N من eGFP و mCherry لإنتاج بروتينات فلورية جديدة ، IeGFP و ImCherry. لم يتم إنشاء بروتينات الانصهار الفلورية هذه للانتقال عبر الغشاء بعد التعبير ، ولكن لتحديد التأثير الإيجابي لـ Iasp على التعبير البروتيني في سيتوبلازم الخلايا بدائية النواة.

        يمكن لـ Iasp تحسين مستوى التعبير عن eGFP وتعزيز إشارة الفلورسنت للخلايا بدائية النواة المختبرة بالتتابع. بموجب لائحة صأ المروج ، كانت شدة الفلورسنت لسلالة TAc-IeGFP أعلى بكثير من سلالة TAc-eGFP وكذلك سلالات Bt المقابلة. في بكتريا قولونية الخلايا التي تم اختبارها ، يتم تنظيم التعبير عن البروتينات الفلورية بواسطة صأ لا يمكن تحديده بسهولة عن طريق تحليل SDS-PAGE الذي اقترح نشاطًا أضعف لـ صأ من ال T7 المروجين. لكنها كانت كافية لتغيير لون الخلايا المضيفة. وبالمثل ، يمكن لـ Iasp أيضًا تحسين مستوى التعبير عن mCherry في البكتيريا المختبرة وشدة الفلورسنت للخلايا المضيفة. أشارت هذه النتائج إلى أن Iasp يمكن أن يحسن مستوى التعبير عن البروتينات الفلورية. يمكن أن تتراكم بروتينات الانصهار الفلورية ، مثل IeGFP و ImCherry التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة ، داخل الخلايا المضيفة ، وبالتالي يمكن استخدامها كمتغيرات بروتينية مشعة جديدة.

        يمكن أن يؤثر تسلسل تشفير Iasp على استقرار mRNA و / أو تحسين كفاءة الترجمة. المستويات العالية التي لوحظت من نصوص Iegfp ربما كان الجين مسؤولاً عن مستوى التعبير المحسن لـ IeGFP. بالإضافة إلى ذلك ، Kudla et al.[27] ذكرت أن بنية التسلسل 5-قيادات من الرنا المرسال المستهدف لعبت دورًا مهمًا في التأثير على كفاءة الترجمة ، وخاصة النيوكليوتيدات بالقرب من الكودون الأولي (- 4 إلى + 37). قام المؤلفون بدمج تسلسل قائد مكون من 28 كودون مع بنية ثانوية منخفضة في 5 من متواليات تشفير GFP المختلفة. أنتجت جينات الاندماج هذه مستويات عالية من التعبير بشكل موحد. يشير الارتباط القوي بين طاقة طي mRNA ومستوى التعبير إلى أن الرسائل المطوية بإحكام تعيق بدء الترجمة وبالتالي تقلل من تخليق البروتين [27 ، 48]. وفقًا لنتائج التنبؤ الخاصة ببرنامج RNAstructure [47] ، أدت مشاركة تسلسل تشفير Iasp إلى تقليل الاستقرار الديناميكي الحراري للهيكل الثانوي بالقرب من الكودون الأولي (- 4 إلى + 37). ومن المثير للاهتمام ، في تقرير Kudla ، أن gfp أظهرت المتغيرات الجينية الناتجة عن شدة الفلورسنت العالية مستوى طاقة الطي المماثل مع egfp البناء المستخدم في هذه الدراسة (حوالي - 5.0 كيلو كالوري / مول). يشير هذا إلى أن تسلسل تشفير Iasp يمكن أن يحسن البنية الثانوية لهذه المنطقة بشكل أكبر ويحسن بشكل متتابع كفاءة الترجمة. كانت النتيجة متوافقة أيضًا مع تقرير Boël G et al. [49]. من خلال تحليل التعبير البروتيني عالي الإنتاجية ، وجد المؤلفون أن العديد من العوامل ، بما في ذلك طي رأس mRNA واستخدام الكودون بالقرب من هذه المنطقة ، أثرت على كفاءة الترجمة في بكتريا قولونية. لا ينظم استخدام الكودون لتسلسل الترميز 5 ′ (CDS) البنية الثانوية للـ mRNA فحسب ، بل يؤثر أيضًا على الالتحام الفعال للريبوسوم. لذلك ، يمكن أيضًا استخدام Iasp كعلامة اندماج لتحسين مستوى التعبير عن البروتينات المؤتلفة الأخرى ، مثل البروتينين الصعب التعبير عنهما MMP13 و GDF8 اللذين تم اختبارهما في هذه الدراسة.

        من شأن التفاعلات بين الببتيد الناشئ والمرافقين أن تخفف من ميل التجميع للببتيدات المعبر عنها بشدة وتوفر لهم المزيد من الفرص أو تساعدهم بشكل مباشر في الانطواء في الهيكل ثلاثي الأبعاد الصحيح. على سبيل المثال ، يمكن للتعبير المشترك لبعض المرافقين والمرافقين أن يمنع اختلال البروتينات حقيقية النواة في نظام بدائيات النواة [50 ، 51]. تشانغ وآخرون. [25] ذكرت أن الجمع بين DnaK و DnaJ و GrpE (K / J / E) ساعد في طي الببتيد الناشئ N-terminal وحسن قابلية ذوبان شريك GFP في بروتين الاندماج. وبالتالي ، تم تحسين مضان بروتين الانصهار في بكتريا قولونية. يمكن استخدام مرافقين آخرين ، مثل رواية Spy [26] ، أو البروتينات الشريكة المتفاعلة ، مثل MBP الكلاسيكي و NusA [17] ، في بروتينات الاندماج لتعزيز قابليتها للذوبان. بالنسبة للبروتينات الإفرازية ، تتفاعل ببتيدات الإشارة أيضًا مع المرافقين المناظرين الذين لا ينقلون الببتيدات الوليدة إلى آلية الانتقال فحسب ، بل يمنع أيضًا التجميع. لقد ثبت أن ببتيدات الإشارة المتناوبة أو التعديل المناسب يحسن من كفاءة التعبير والإفراز للبروتينات المؤتلفة في وقت واحد [52 ، 53]. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن بعض الببتيدات الإشارة التي تستخدم SecYEG translocon ، والتي تنقل فقط الببتيدات المكشوفة ، لتؤثر سلبًا على استقرار البروتينات المستهدفة وطيها. على سبيل المثال ، أدى ببتيد الإشارة لـ MBP (malE) و pelB إلى زعزعة الاستقرار الديناميكي الحراري لـ MBP الناضج C-terminal أو thioredoxin (Trx) بسبب التفاعلات الكارهة للماء بين ببتيدات الإشارة والببتيدات غير المطوية. كان يعتقد أن التفاعلات ضرورية للحفاظ على الحالة غير المكشوفة قبل الانتقال [54،55،56،57]. على الرغم من أن المسار الإفرازي المرتبط بـ Cry1Ia غير واضح ولا تزال المكونات المشاركة في الآلية مكشوفة ، إلا أن Iasp سيتفاعل مع المرافق (المرافقين) المقابل في مساره الإفرازي. في هذه الدراسة ، ينظم التعبير القابل للذوبان عن IeGFP بواسطة T7 تمت ملاحظة المروج وكان إنتاج الجزء القابل للذوبان أعلى من إنتاج eGFP. كان التأثير المعزز للذوبان لـ Iasp على eGFP مشابهًا لعلامات الاندماج المعروفة NusA و MBP و Trx. ومع ذلك ، تم التعبير عن كل من Iasp أو Trx المنصهر MMP13 (I-MMP13 أو T-MMP13) و GDF8 (I-GDF8 أو T-GDF8) في شكل غير قابل للذوبان. كانت نتيجة التعبير عن T-MMP13 و T-GDF8 متوافقة مع التقرير السابق [19]. لذلك ، يجب إجراء مزيد من التحقيق في ملاءمة تأثير تعزيز قابلية الذوبان لـ Iasp على البروتينات المؤتلفة المتنوعة. تم اقتراح العديد من الفرضيات لشرح آليات تعزيز القابلية للذوبان عن طريق علامات الاندماج ، بما في ذلك تكوين هياكل شبيهة بالميسيل ، وجذب المرافقين ، وممارسة نشاط جوهري شبيه بالمرافق أو شبكة مشحونة (تمت مراجعتها في [17]). كببتيد إشارة ، يُفترض تفاعل Iasp مع المرافق (المرافقين) المقابل وقد توفر طفرة الحذف على بروتينها الأصلي Cry1Ia دليلًا. بعد إزالة Iasp ، تراكمت بروتينات Cry1Ia المقتطعة (Cry1IaD44) داخل خلايا Bt وأظهرت ملف تعريف تدهور مختلفًا مقارنةً بـ Cry1Ia السليم. ومن المثير للاهتمام ، في بكتريا قولونية سلالة BL21-star (DE3) ، لم يلاحظ أي فرق واضح بينهما من خلال تحليل SDS-PAGE بالإضافة إلى النطاقات المتوقعة من Cry1Ia و Cry1Ia44 و Cry1Ia73. قد تنسب النتيجة إلى دستور البروتياز المختلف بينهما بكتريا قولونية وخلايا Bt ، والظاهرة تدل على تأثير Iasp على منع بروتين Cry1Ia من مهاجمة بعض البروتياز بشكل مباشر أو غير مباشر.

        لا يمكن لـ Iasp نقل eGFP بكفاءة في بكتريا قولونية. عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، تراكمت معظم بروتينات IeGFP في العصارة الخلوية في بكتريا قولونية الخلايا التي كانت متوافقة مع تحليل اللطخة الغربية. وفقًا للتقارير السابقة ، أدى تشبع المسار الإفرازي المقابل إلى تراكم البروتينات المؤتلفة في العصارة الخلوية [41 ، 42]. على الرغم من أن جزءًا من جزيئات IeGFP تم اكتشافه على أنه نطاق أصغر ربما يمثل الجزيئات التي تم نقلها إلى بيريبلازم ، لم يتم التقاط أي إشارة فلورية في هذا الموقع بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. وبالمثل ، تم الكشف عن تعبير pelB-eGFP عن طريق تحليل اللطخة الغربية ولكن لم تتم ملاحظة أي إشارة فلورية سواء في السيتوبلازم أو الفضاء المحيط بالبلازما. أظهر تحليل اللطخة الغربية أن جميع بروتينات pelB-eGFP المعبر عنها تقريبًا قد تم هضمها في نطاق 27 كيلو دالتون يساوي eGFP المعبر عنها بشكل فردي. لذلك ، انتهينا من النقل الفعال لـ eGFP مسترشدًا بببتيد إشارة pelB الذي ينظمه صأ. ومع ذلك ، فإن كفاءة النقل العالية لـ pelB-eGFP ستزيد من تحميل SecYEG-translocon وتؤدي إلى تأخر نمو سلالة TAc-pelBeGFP. من بين متغيرات GFP المعروفة ، فإن sfGFP هو الوحيد الذي يمكن طيه في شكله الفلوري عند النقل عبر SecYEG-translocon [15 ، 29 ، 30]. ربما كانت آلية طي ما بعد النقل مسؤولة عن المراقبة بكتريا قولونية معربا عن pelB-eGFP. سيوجه Iasp بعض ببتيد eGFP إلى بيريبلازم عبر مسار مشابه إلى جانب أن معظم الببتيدات IeGFP لا يمكن التقاطها بواسطة المرافق (المرافقين) المقابل في مسارهم الإفرازي لأسباب غير معروفة ، ثم يتم طيها في الشكل الفلوري في السيتوبلازم. يمكن الكشف عن إشارة الفلورسنت الخاصة بـ torA-eGFP وإن كانت ضعيفة. يمكن لببتيد إشارة torA نقل البروتينات المستهدفة إلى بيريبلازم بواسطة نظام Tat. على عكس SecYEG-translocon ، فإن نظام Tat يوجه فقط نقل البروتينات المدمجة بالكامل و / أو العامل المشترك [31 ، 32]. أوضحت آلية النقل المختلفة هذه القدرة الفلورية المعاكسة تمامًا لكل من pelB-eGFP و torA-eGFP في الجسم الحي. أشار استقطاب تألق torA-eGFP الذي لوحظ بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر إلى توطين محيط البلازما والظاهرة الناتجة عن تحلل البلازما بكتريا قولونية الخلايا استجابةً للصدمة التناضحية عند تعليقها في محلول PBS المؤقت [33]. بالإضافة إلى ذلك ، عندما كان Iasp موجودًا في المحطة C لـ eGFP (eGFP-I) ، فقد كل من وظيفة النقل وتأثيراته على تعزيز إشارة الفلورسنت.

        في خلايا Bt ، لا يمكن نقل IeGFP خارج الخلايا أو بكفاءة منخفضة لأن طقطته المناعية أو إشارة الفلورسنت ظهرت في نفس النقطة الزمنية مثل eGFP. أشارت النتيجة إلى أن البروتينات المستهدفة لن يتم إطلاقها فقط من خلال المسار الإفرازي المقابل ولكن أيضًا عن طريق تحلل الخلايا الأم. Kostichka et al. [40] ذكرت أن بروتين Cry1Ia في العائل الطبيعي AB88 لم يتم اكتشافه في عينات بلورية نقية معزولة من مزرعة مدتها 52 ساعة ولكن تم اكتشافه في 26 كريات من الخلايا. لذلك ، توقعنا أن بعض بروتينات Cry1Ia القابلة للذوبان بقيت في الخلايا الأم لسلالة Bt قد تنطلق مباشرة إلى مادة طافية أثناء نضوج البوغ. سيكون إطلاق المكونات القابلة للذوبان أيضًا أحد العوامل التي تؤدي إلى انخفاض شدة الفلورسنت للرواسب المعلقة لمزارع الخلايا BAc-eGFP و BAc-IeGFP خلال آخر 12 ساعة ، خاصة في 72 ساعة بعد التلقيح. زيادة شدة الفلورسنت بشكل كبير لمدة 72 ساعة طاف لكل من BAc-eGFP و BAc-IeGFP يمكن أن تدعم أيضًا التكهنات. علاوة على ذلك ، خلال فترة التبويض ، فإن صأ يمكن للمحفز تسريع تخليق البروتينات المؤتلفة التي من شأنها أن تحفز تكوين أجسام متضمنة غير قابلة للذوبان. في هذه الدراسة ، تمت الإشارة إلى التراكمات السريعة لـ eGFP و IeGFP بعد فترة الحضانة لمدة 48 ساعة من خلال تحليل اللطخة المناعية. لذلك ، فإن تكوين أجسام التضمين سيكون العامل الثاني المؤدي إلى التناقض بين الانخفاض الكبير في كثافة الفلورسنت والتراكم السريع لمنتجات البروتين. سيكون العامل الثالث هو تذبذب الأس الهيدروجيني في الخلايا Bt في مرحلة التبويض الأخيرة. في العصوية الرقيقة، تم إضعاف شدة الفلورسنت لبروتينات الاندماج β-GFP ، بما في ذلك الوحدة الفرعية β لبوليميراز الحمض النووي الريبي بدائية النواة الموجودة في الطرف N من GFP ، بشكل كبير أثناء مرحلة التبويض V-VI عن طريق انخفاض درجة الحموضة داخل الخلايا الأم [58]. تمثل الفترة آخر مرة قبل إطلاق البوغ الناضج. يعتبر mCherry أكثر تسامحًا مع انخفاض درجة الحموضة [58]. ومع ذلك ، فإن شدة الفلورسنت لخلايا BAc-IeGFP المعلقة أبقت 3.5 إلى 4.1 ضعفًا لتلك الموجودة في BAc-eGFP خلال فترة الثقافة بأكملها باستثناء أول 9 ساعات ، والتي كانت أعلى من الاختلافات بين TAc-IeGFP و TAc -IeGFP (1.5- إلى 2.4 ضعف).

        لاحظنا أيضًا تدهور بروتينات eGFP و IeGFP في سلالات Bt. في الخلايا في 9 أو 12 ساعة بعد الحضانة ، لوحظت بروتينات IeGFP أو eGFP سليمة. ولكن خلال 12 إلى 36 ساعة بعد التلقيح ، تم هضم جزء منهم بواسطة بروتياز (بروتياز) غير معروف. بعد 48 ساعة ، تراكمت البروتينات المؤتلفة بسرعة وتمت معالجة نصفها تقريبًا بواسطة هذه البروتينات. الجنس عصية يمكن أن تنتج بروتياز متنوعة و Bt هي أيضًا مصدر ممتاز للبروتياز [59]. بشكل عام ، يتبع نشاط البروتياز الكلي لسلالات Bt زيادة بطيئة في الـ 12 ساعة الأولى ثم يزداد تدريجياً إلى الذروة عند حوالي 30 ساعة بعد التلقيح [59]. سيكون تباين نشاط الأنزيم البروتيني مسؤولاً جزئيًا عن عملية تدهور eGFP و IeGFP المحتجزة في خلايا Bt.

        في المادة الطافية للثقافة الخلوية لسلالات Bt المقابلة ، كان الجزء 26 كيلو دالتون ، أصغر قليلاً من eGFP السليم (27.9 كيلو دالتون) ، هو المنتج الرئيسي. كشف تحليل N-terminal أن الجزء 26 كيلو دالتون بدأ بالأحماض الأمينية GKGEELFT وبالتالي فإن موقع (مواقع) الانقسام الآخر سيحدد موقعه في الطرف C لبروتين eGFP. سيؤدي نقص المحطة C لبروتينات eGFP جزئيًا إلى ضعف كثافة الفلورسنت لكل من eGFP و IeGFP في المادة الطافية مقارنة بالخلايا التي تم جمعها. مثال Fox ، مع فقدان الأحماض الأمينية C-terminal 11 ، كان المجلد الفائق المعبر عنه GFP 1-10 غير قابل للذوبان ولا يمكن أن يتألق [60]. بالإضافة إلى ذلك ، كانت الإشارات المناعية لبروتين ImCherry في المادة الطافية للثقافة الخلوية وداخل الخلايا Bt مختلفة في الوزن الجزيئي. أثبتت النتيجة وجود بروتياز مختلفة تستجيب لتدهور ImCherry و IeGFP داخل وخارج خلية Bt. كانت بروتينات ImCherry السليمة التي تم التعبير عنها بواسطة الخلايا بدائية النواة المختبرة أكبر قليلاً من الوزن الجزيئي المحسوب (33.0 كيلو دالتون). قد يُعزى هذا إلى التعديل (التعديلات) غير المعروفة اللاحقة للترجمة.

        في الوقت الحاضر ، تم إيلاء القليل من الاهتمام لاستخدام SPs ذات كفاءة نقل منخفضة لإنتاج البروتين المؤتلف. تم إثبات أن تسلسل إشارة torA يوجه التعبير عن البروتينات المؤتلفة في الأجسام المتضمنة حتى لو كان الهدف عبارة عن بروتين جيد الذوبان في بكتريا قولونية [34]. يمكن أن تساعد علامة الجسم المتضمنة الصغيرة هذه في التعبير عن البروتينات المؤتلفة السامة أو غير المستقرة. لكن ببتيد إشارة torA و Iasp سينتميان إلى مسارات إفرازية مختلفة لأن تسلسل إشارة نظام Tat يشترك في التسلسل المحاور الكلاسيكي (S / T-RRXFLK) ، لا سيما نموذج الأرجينين المزدوج ، الذي لم يكن موجودًا في Iasp [43 ، 44،45]. الأهم من ذلك ، يمكن أن يوجه Iasp التعبير عن eGFP عند مستوى أعلى من ببتيد إشارة torA تحت السيطرة صأ المروج في هذه الدراسة.

        في الختام ، حددنا قدرة SP لبروتين Cry1Ia (Iasp) في تحسين التعبير عن بروتينات eGFP و mCherry في بكتريا قولونية و Bt الخلايا. أدى إدخال تسلسل ترميز Iasp إلى تحسين البنية الثانوية بالقرب من الكودون الأولي ومن ثم تسهيل إرساء الريبوسوم. إن التوظيف الأكثر كفاءة للريبوسوم من شأنه أن يفسر استقرار الرنا المرسال والتوليف السريع لبروتينات الانصهار الفلورية. وفي الوقت نفسه ، يمكن لـ Iasp الاحتفاظ بجزء كبير من بروتينات الانصهار الفلورية القابلة للذوبان داخل الخلايا التي تضمن الطي الصحيح للبروتينات الفلورية. لذلك ، أدى الإنتاج العالي لـ IeGFP القابل للذوبان و ImCherry إلى توليد إشارة الفلورسنت الأكثر كثافة داخل الخلايا البكتيرية ويمكن استخدام بروتينات الاندماج هذه كمرشحين مثاليين لمتغيرات البروتين الفلوري. علاوة على ذلك ، يجب أيضًا تسليط الضوء على وظيفة Iasp في تحسين التعبير عن البروتينات المؤتلفة وتستحق مزيدًا من البحث. أشارت هذه الدراسة أيضًا إلى تعدد استخدامات بعض ببتيدات الإشارة.


        خيارات التصوير للكشف عن اللمعان الكيميائي الغربي

        يطبع التعرض للضوء صورة على فيلم الأشعة السينية. تحدد كمية الضوء التي تصل إلى الفيلم الصورة ، مع إضاءة أكثر إشراقًا وشدة لإنتاج صورة أقوى. في النشاف الغربي ، يأتي هذا الضوء من وسم البروتينات بإشارات كيميائية أو مشعة. في وضع العلامات المضيئة كيميائيًا ، تتفاعل الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بالفجل الحار (HRP) مع كواشف التلألؤ الكيميائي المعزز (ECL) لإصدار الضوء. تتناسب شدة البصمة على فيلم الأشعة السينية مع الإشارة. في المقابل ، تتعلق هذه الإشارة بكمية البروتين الموجودة على غشاء اللطخة الغربية ، مما يسمح بالحساب الكمي.

        التصوير بكاميرا CCD مناسب للكشف عن اللمعان الكيميائي والفلورة. تستخدم هذه التقنية مصدرًا للضوء لإضاءة الغشاء ، عند الحاجة ، أو إثارة الفلوروفورات عند أطوال موجية محددة. تقوم العدسات بجمع الضوء الناتج من مجال التصوير ، مع التركيز على مجموعة CCD ثنائية الأبعاد. الصورة الرقمية الناتجة هي في الأساس نمط شحنة يتناسب مع الضوء من تفاعل اللمعان الكيميائي أو الأصباغ الفلورية. تتناسب شدة الصورة مع كمية الضوء المنتجة ، مما يشير إلى كمية البروتين.

        بالإضافة إلى ذلك ، تقدم شركة Sino Biological مجموعة من الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بإنزيمات HRP. يمكن استخدام هذه الأجسام المضادة الثانوية في الكشف عن اللطخة الغربية بالتلألؤ الكيميائي.


        شاهد الفيديو: Western Blot Visual Protocol: Phase 2: Protein Electrophoresis SDS-PAGE (كانون الثاني 2022).