معلومة

زراعة الإشريكية القولونية في درجة حرارة الغرفة؟


إذا كنت سأقوم باختيار أزرق / أبيض من المحول بكتريا قولونية على لوحات LB أجار الأمبيسلين في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) لمدة يومين و 18 ساعة ، هل سأواجه مشكلة مستعمرات الأقمار الصناعية أو أي قضايا أخرى؟


سوف تحصل بالتأكيد على مستعمرات الأقمار الصناعية. يتحلل الأمبيسلين بعد حوالي يوم ، خاصة عند تعرضه للضوء. Kan ، يبقى جيدًا في درجة حرارة الغرفة ، لكن هذا لا يجدي نفعا :)


نظرًا لأن الغربلة هي وسيلة للاختيار ، فأنت تريد أقصى ضغط اختيار. سيتم الحصول على هذا من خلال دمج جميع الظروف المثلى. ستعمل العديد من إنزيمات أوبرون اللاكوبونات بشكل أفضل في درجة الحرارة المثلى.

لماذا ستفعل هذا؟ إذا كان ذلك بسبب عدم قدرتك على الذهاب في اليوم التالي ، فمن الأفضل القيام بذلك عندما تكون متاحًا. ستشك فقط في نتائجك عندما تحصل عليها.


اسأل خبيرًا: تحضير لوحات الثقافة بشكل صحيح مع E. Coli

أقوم بتجربة تتضمن اختبار الخصائص المضادة للميكروبات لمركبات مختلفة ضد بكتيريا الإشريكية القولونية. لم تنجح بعض تجاربي الأولية كما توقعت لأنني لم أحصل على الكثير من البكتيريا لتنمو.

فيما يلي ملخص لما فعلته:
تم طلب E. coli strain K12 (على مائل أجار) من شركة Carolina Biological Supply Company
http://www.carolina.com/product/escherichia+coli+k12٪2C+living.do؟keyword=e.+coli&sortby=bestMatches
لوحات استزراع محضرة باستخدام أجار جوزي (بكميات قياسية)
تعقيم حلقة التلقيح 4 مم في موقد بنسن واستخدامها لحلقة واحدة إضافية من البكتيريا. ثم قمت بعد ذلك بنشره على سطح اللوحة ، وقلبته 120 درجة ، واستمر في الانتشار ، ثم قلبته 120 درجة مرة أخرى لنشر المزيد.
حضنت الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

كانت النتائج متقطعة للغاية وليست أرضية البكتيريا التي توقعتها. فكرت في مصادر الخطأ المحتملة. هل يمكن للآخرين التعليق على المصادر المحتملة لذلك عندما أعود إلى المدرسة ، يمكنني تعديل الإجراء الخاص بي لتنمو بكتيريا الإشريكية القولونية بنجاح؟

مصادر الخطأ المحتملة هي:
1. لقد استخدمت الإشريكية القولونية مباشرة من أنبوب الاختبار عندما ربما كان يجب أن أخفف البكتيريا لصنع نوع من المرق البكتيري. هل من الأفضل استخدام البكتيريا كمرق لزراعة أرضية من البكتيريا؟
2. لم أترك حلقة التلقيح تبرد لفترة كافية وقد أقوم بقتل البكتيريا حتى لا تنمو. هل أحتاج إلى ترك الحلقة تبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل إلصاقها بالمزرعة البكتيرية؟
3. لقد استخدمت حلقة واحدة من البكتيريا في طبق بتري بأكمله ، لذلك ربما لم يكن ذلك كافياً. بعد أن أجريت هذه التجربة ، وجدت بعض المراجع التي أوصت بأن أستخدم 3 حلقات من البكتيريا (على سبيل المثال ، حلقة واحدة كل 120 درجة من الدوران).
4. لقد استخدمت حلقة التلقيح بدلاً من أداة الانتشار. على الرغم من أنني رأيت بعض المراجع توصي بحلقة تلقيح لنشر البكتيريا حول الصفيحة ، إلا أنني وجدت لاحقًا مراجع أخرى توصي بأداة نشر للحصول على أرضية مستوية من البكتيريا على الطبق.
5. لقد استخدمت حلقة التلقيح بدلاً من ممسحة القطن المعقمة. أوصت مراجعي الأولية باستخدام حلقة incocating loop. اعتقدت أنني إذا استخدمت مسحة معقمة ، فلن أكون قادرًا على التأكد من أنني سأحصل على كمية دائمة من البكتيريا من صفيحة إلى أخرى. لكن هل توفر حلقة التلقيح تغطية كافية؟
6. قد لا تعمل الحاضنة بشكل صحيح. تعتبر أدوات التحكم في درجة الحرارة في الحاضنة حساسة بعض الشيء ، لذا من الصعب جعلها تعمل بدقة عند 37 درجة مئوية ، ومع ذلك ، أعتقد أنها تعمل بالقرب من 36 إلى 40 درجة مئوية. قرأت أن زراعة الإشريكية القولونية في درجات حرارة أقل من 37 درجة مئوية ، لكنني لا أعرف ما هي درجة الحرارة الساخنة جدًا لقتل البكتيريا في الحاضنة.

إنني أقدر أي اقتراحات من شأنها أن تساعدني في تحديد أخطائي وجعلني أنمو بكتيريا الإشريكية القولونية بنجاح.

رد: تحضير أطباق الثقافة بشكل صحيح مع E. Coli

نشر بواسطة رقصة & raquo الأحد 28 ديسمبر 2008 9:31 صباحًا

أعتقد أنك على الطريق الصحيح مع استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

1. عمل معلق للبكتيريا هو بالتأكيد خيار.

2. نعم هذا مهم! فقط اتركه يبرد لبضع ثوان بعد أن تشعله. يجب أن تعود إلى اللون الطبيعي ، وليس الأحمر الساخن ، عندما تلتصق بالثقافة.

3. ربما. إذا لم يكن هناك ما يكفي من البكتيريا ، فسوف يستغرق الأمر وقتًا أطول حتى تنمو وتنتشر عبر الطبق. على مدار 24 ساعة ، تصنع الإشريكية القولونية مستعمرات صغيرة جدًا ، ولكن إذا أعطيت مزيدًا من الوقت ، يجب أن تنتشر.

4. المزرعة السائلة أو الموزعة (مجرد أنبوب زجاجي مثني أو قضيب معقم) يجب أن يمنحك حشيشًا أكثر تكافؤًا للبكتيريا. أعتقد أن الأسلوب الذي استخدمته ، من وصفك ، هو الأكثر استخدامًا لخط المستعمرات المفردة - وهو عكس ما تريده هنا تمامًا.

5. يعتمد الأمر فقط على كمية البكتيريا التي تبدأ بها. أعتقد أن قطعة قطن ستنشرهم أكثر.

6. أعتقد أن النطاق 36-40 لا بأس به على الأرجح ، إلا إذا كان لديك سلالة حساسة لدرجة الحرارة بشكل خاص. ستنمو الإشريكية القولونية أيضًا في درجة حرارة الغرفة ، وتستغرق وقتًا أطول.

أعتقد أن فكرتك عن الثقافة السائلة هي الأفضل. إذا قمت بتلقيح سائل وتركته ينمو طوال الليل مع التحريض ، فيجب أن يكون لديك تعليق لطيف على اللوحة. (يمكنك أيضًا تخفيف كتلة من الخلايا في الوسائط السائلة ، ولكن بعد ذلك قد لا تتشتت النقطة تمامًا.) قد ترغب في تخفيفها قليلاً بوسائط معقمة. ثم خذ 100 ميكرولتر وانشرها على أطباقك بقضيب زجاجي مثني. اتركه على الجانب الأيمن لبضع دقائق حتى يمتص السائل في أجار. عندها فقط اقلبها رأسًا على عقب وضعها في الحاضنة.

إذا لم تكن راضيًا عن العشب الذي تراه في اليوم التالي ، فحاول تركه يمضي ليلة أخرى في الحاضنة أو البدء بمزيد من البكتيريا.

إذا كان لديك الوقت ، أعتقد أن أفضل شيء يمكنك القيام به هو تجربة تجريبية فقط لتحديد البروتوكول الذي يمنحك أفضل حديقة. جرب بعض الإجراءات المختلفة ثم اختر الإجراء الذي تفضله لتجربتك & quotreal & quot.


المقدمة

النمط المصلي O157: H7 من إنتاج السموم الإشريكية القولونية تم التعرف على (VTEC) لأول مرة كممرض بشري خطير في عام 1982. وقد تورط هذا الكائن كعامل يسبب التهاب القولون النزفي ، كما أنه يرتبط بمتلازمة انحلال الدم اليوريمي وفرفرية نقص الصفيحات التخثرية. معظم حالات تفشي المرض مرتبطة بالغذاء أو الماء وقد ارتبطت على وجه الخصوص باستهلاك لحم البقر المفروم غير المطبوخ جيدًا. الإشريكية القولونية O157: H7 هو في الواقع أحد مسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الأغذية والتي تشكل مصدر قلق رئيسي للصحة العامة في أمريكا الشمالية وأوروبا واليابان ، والتي تم تحديد ماشية الألبان الخاصة بها على أنها المستودع (6 4).

نظرا لشدة الامراض المصاحبة لها بكتريا قولونية O157: H7: من الضروري تزويد الصناعة الغذائية بإجراءات منع وجودها والسيطرة على نموها. تم دراسة حركية النمو للمصل O157: H7 تحت ظروف بيئية متغيرة (درجة حرارة الحضانة ، الأس الهيدروجيني الأولي ، محتوى كلوريد الصوديوم). وقد سمح ذلك بالتطور اللاحق للنماذج الرياضية التي تتنبأ بسلوكها في الأطعمة (2 1 14).

معرفة تيدقيقة (درجة الحرارة التي لم يعد يتم ملاحظة النمو تحتها) و تيالأعلى (درجة الحرارة التي فوقها لا يحدث نمو) بكتريا قولونية O157: H7 مهم بشكل خاص للحفاظ على الطعام واكتشاف هذه البكتيريا. تييختار، يقرر (درجة الحرارة التي عندها أقصى معدل نمو محدد ميكرومترالأعلى يساوي قيمتها المثلى) معلمة مهمة في علم الأحياء الدقيقة التنبئي. لوحظ وجود علاقة قوية بين درجات الحرارة الأساسية الثلاثة (تيدقيقة, تيالأعلى و تييختار، يقرر) على عدة سلالات من أنواع بكتيرية مختلفة (12). قيمهم لثلاثة غير O157 بكتريا قولونية تم تقييم السلالات بين 4-9 درجة مئوية و 11 2 درجة مئوية تيدقيقة، 47 ° 3 ° C و 48 ° 0 ° C لـ تيالأعلى و 40 درجة مئوية و 41 درجة مئوية 3 درجات مئوية تييختار، يقرر (12). عدم قدرة بكتريا قولونية O157: H7 لينمو بشكل جيد ، إذا كان على الإطلاق ، عند 44-45 · 5 درجة مئوية تم الإبلاغ عن مرق الصويا التربتيسيز (TSB) (7) ولوسيط إي كولاي (11). تم تفسير النتائج التي تم الحصول عليها في كل حالة بسلالة واحدة لاحقًا على أنها تعني أن درجات الحرارة الأساسية لهذا المصلي ستكون أقل. على عكس هذه النتائج ، لاحظ 10 أن معظم سلالات O157 نمت على مدى يتراوح من 8 إلى 10 درجات مئوية إلى 45 درجة مئوية على الأقل في ضخ قلب الدماغ (BHI). علاوة على ذلك ، تم وصف نمو عزلات O157: H7 بشكل مناسب بواسطة نموذج غير مُمْرِض بكتريا قولونية سلالات (13) ، وفي الوقت نفسه ، تم وصف نمو السلالات غير المسببة للأمراض بشكل كافٍ بواسطة نموذج للممرضات. بكتريا قولونية سلالات (14 1). يمكن تفسير هذه البيانات المتباينة من خلال التباين بين السلالات وظروف الثقافة. في الواقع ، لاحظ 8 أن قدرة بكتريا قولونية O157: H7 ينمو عند 45 درجة مئوية ويعتمد على الوسط وحجم اللقاح والسلالة. عند هذه الدرجة ، نمت ثلاث سلالات فقط من السلالات الـ18 التي تمت دراستها جيدًا في مرق EC ، بكثافة أولية قدرها 100 cfu ml1 ، بينما نمت جميع السلالات بكثافة أولية أعلى. في TSB ، كانت جميع السلالات قادرة على النمو حتى مع كثافة أولية قدرها 10 cfu ml −1.

أجريت هذه الدراسة لمقارنة تييختار، يقرر من serovar O157 مع الآخرين بكتريا قولونية الأنماط المصلية في وسط معمل معقد. في الواقع ، دقة تييختار، يقرر كانت القيم التجريبية أفضل من تلك الخاصة بـ تيدقيقة و تيالأعلى. تم تضمين العديد من السلالات لحساب التباين الموصوف بين العزلات (10 13).


نمو الإشريكية القولونية عند 4 درجات؟ - (15 سبتمبر 2010)

لقد أجريت مؤخرًا تجربة تحول مع بعض خلايا الإشريكية القولونية الأعلى 10 من Invitrogen ، ويبدو أن التحول لا يعمل بشكل جيد للغاية ولكن هذه قصة مختلفة.

قمت بحساب عدد المستعمرات على لوحات الأمباسيلين ووضعت نقاطًا سوداء صغيرة مقابل كل مستعمرة كما عدت ، ثم قمت بلف الأطباق في بارافيلم ووضعتها في الثلاجة. بعد أسبوع ، أخرجت بعض اللوحات مرة أخرى ورأيت عددًا من المستعمرات أكثر مما أحصيته في جميع أنحاء اللوحة وأكثر من المستعمرات المقابلة للنقاط السوداء ، وكانت هذه المستعمرات الصغيرة جدًا ، كانت تقريبًا بنفس حجم المستعمرات المستعمرات الأصلية.

هل يمكن للإشريكية القولونية أن تنمو مستعمرات عند 4 درجات مئوية؟ وإذا كان الأمر كذلك ، فكيف يمكنني تخزين اللوحات لفترات طويلة؟

يميل الأمبيسلين إلى التحلل بسهولة أكبر من المضادات الحيوية الأخرى. إذا كنت ترغب في تخزين الخلايا الخاصة بك ، فإنني أوصي بتقطيعها على طبق جديد ، وتنميتها بين عشية وضحاها ، ثم تخزينها في 4 درجات مئوية. ومع ذلك ، فأنت لا تريد تخزينها لأكثر من أسبوعين بهذه الطريقة دون إعادة تنظيف الأسنان.

قال Philman في الأربعاء 15 سبتمبر ، 12:31:16 2010:

لقد أجريت مؤخرًا تجربة تحول مع بعض خلايا الإشريكية القولونية الأعلى 10 من Invitrogen ، ويبدو أن التحول لا يعمل بشكل جيد للغاية ولكن هذه قصة مختلفة.

قمت بحساب عدد المستعمرات على لوحات الأمباسيلين ووضعت نقاطًا سوداء صغيرة مقابل كل مستعمرة كما عدت ، ثم قمت بلف الأطباق في بارافيلم ووضعتها في الثلاجة. بعد أسبوع ، أخرجت بعض اللوحات مرة أخرى ورأيت عددًا من المستعمرات أكثر مما أحصيته في جميع أنحاء اللوحة وأكثر من المستعمرات المقابلة للنقاط السوداء ، وكانت هذه المستعمرات الصغيرة جدًا ، كانت تقريبًا بنفس حجم المستعمرات المستعمرات الأصلية.

هل يمكن للإشريكية القولونية أن تنمو مستعمرات عند 4 درجات مئوية؟ وإذا كان الأمر كذلك ، فكيف يمكنني تخزين اللوحات لفترات طويلة؟

في ملاحظة مضحكة للغاية ، لديك عدد كبير جدًا من المستعمرات على طبقك.
كان لدينا غرفة 4 درجات مئوية في جامعتنا. وقد احتفظت باللوحات (المنسية) لمدة شهر دون أي نمو تقريبًا عليها. هل كانت الثلاجة تعمل بشكل جيد ، بينما كنت بعيدًا. أو هل لديك طالب جديد في مختبرك قد يكون قد أخرجهم وأعادهم في اليوم التالي.
أعلم أنه لا توجد مساعدة فنية مني ، لكن لا يمكنني التفكير في أي شيء لكلتا المشكلتين اللتين ذكرتهما هنا.

gt_ameya في الأربعاء 15 سبتمبر 12:55:58 2010 قال:

نعم ، أعلم أن لدي عددًا كبيرًا جدًا من المستعمرات ، لقد بالغت في تقدير عدد المحولات التي سأحصل عليها & # 33 أنا أعيد الطلاء اليوم بتخفيف أعلى & # 33 وكان يجب أن تعمل الثلاجة بشكل جيد ، لقد تركوا لمدة أسبوع فقط. قد ألصق مقياس حرارة هناك قليلاً لأرى كم هو بارد في الواقع ، إنها ثلاجة قديمة نوعًا ما.

وأنا الطالب الجديد ، ولا أتذكر تركهم

ونعم ، أعلم أن الأمبيسلين سيئ بعض الشيء ، لقد تركت لوحة التحكم السلبية في الحاضنة لمدة 5 أيام بدافع الفضول وخرجت مع مستعمرات عليها (على الرغم من عدم وجود أي منها في اليوم التالي للتحول ، لذلك كانت عناصر التحكم لا تزال قابلة للتطبيق )

ذهب النمل وضع مقياس حرارة في قارورة من السائل تم تخزينها هناك لفترة طويلة ، كانت الثلاجة عند 13 درجة فقط & # 33

لقد قلبت هذا الآن ، وآمل أن تقترب درجة الحرارة من 4 درجات بحلول يوم غد ، ولكن هناك طريقة مزعجة لمعرفة أن الجو كان دافئًا من أجل الخير يعرف كم من الوقت

قال Philman في الأربعاء 15 سبتمبر 15:13:43 2010:

ذهب النمل وضع مقياس حرارة في قارورة من السائل تم تخزينها هناك لفترة طويلة ، كانت الثلاجة عند 13 درجة فقط & # 33

لقد قلبت هذا الآن ، وآمل أن تقترب درجة الحرارة من 4 درجات بحلول يوم غد ، ولكن هناك طريقة مزعجة لمعرفة أن الجو كان دافئًا من أجل الخير يعرف كم من الوقت

هذا هو بالضبط سبب حاجتك إلى طلاب جدد كل صيف. تحدث أشياء غير عادية لتجاربهم وتكتشف ما يحدث بالفعل في مختبرك.

gt_ameya في الجمعة 17 سبتمبر 04:47:21 2010 قال:

قال Philman في الأربعاء 15 سبتمبر 15:13:43 2010:

ذهب النمل وضع مقياس حرارة في قارورة من السائل تم تخزينها هناك لفترة طويلة ، كانت الثلاجة عند 13 درجة فقط & # 33

لقد قلبت هذا الآن ، وآمل أن تقترب درجة الحرارة من 4 درجات بحلول يوم غد ، ولكن هناك طريقة مزعجة لمعرفة أن الجو كان دافئًا من أجل الخير يعرف كم من الوقت

هذا هو بالضبط سبب حاجتك إلى طلاب جدد كل صيف. تحدث أشياء غير عادية لتجاربهم وتكتشف ما يحدث بالفعل في مختبرك.


قللتُ الثلاجة إلى الحد الأدنى ، وانخفضت درجة الحرارة إلى 9 درجات فقط في اليوم التالي. لقد أصبحت مشبوهة بشأن جميع الثلاجات الموجودة في المختبر الآن ووضعنا أنبوبًا بحجم 15 مل من ماء الصنبور في كل واحدة أمس للتحقق من درجات الحرارة في وقت لاحق اليوم. يمكن أن يكون مشكلة.

لا علاقة لهذا & # 39t بالثلاجة - أنت & # 39 & # 39 ؛ ترى مستعمرات الأقمار الصناعية الناشئة على اللوحة.

عند وضع خليط تحويل ، فإنه يحتوي على العديد من الخلايا التي لم يتم تحويلها ، و (نأمل) بعض الخلايا التي تم تحويلها. في البداية ، لا تنمو هذه الخلايا التي لا تحتوي على بلازميد بسبب الأمبيسلين في الوسائط. ومع ذلك ، مع نمو الخلايا المحولة ، فإنها تفرز بيتا لاكتاماز (الإنزيم الذي يدمر الأمبيسيلين ويمنح مقاومة على المحولات). عندما يتراكم هذا الإنزيم في الوسائط وينتشر للخارج ، ينخفض ​​تركيز الأمبيسيلين ، لأن الإنزيم يدمر الأمبيسلين. الآن يمكن أن تنمو الخلايا غير المحولة ، حيث أن تركيز الأمبيسيلين المتبقي منخفض جدًا لإيقاف نموها.

لذا ، نعم - تنمو الإشريكية القولونية عند 4 درجات ، ويجب ألا تخزن لوحات التحويل الخاصة بك مباشرةً ، بدلاً من ذلك ، يجب عليك اختيار المحولات الخاصة بك إلى طبق جديد وتخزينها.

قال Philman في الأربعاء 15 سبتمبر ، 12:31:16 2010:

لقد أجريت مؤخرًا تجربة تحول مع بعض خلايا الإشريكية القولونية الأعلى 10 من Invitrogen ، ويبدو أن التحول لا يعمل بشكل جيد للغاية ولكن هذه قصة مختلفة.

قمت بحساب عدد المستعمرات على لوحات الأمباسيلين ووضعت نقاطًا سوداء صغيرة مقابل كل مستعمرة كما عدت ، ثم قمت بلف الأطباق في بارافيلم ووضعتها في الثلاجة. بعد أسبوع ، أخرجت بعض اللوحات مرة أخرى ورأيت عددًا من المستعمرات أكثر مما أحصيته في جميع أنحاء اللوحة وأكثر من المستعمرات المقابلة للنقاط السوداء ، وكانت هذه المستعمرات الصغيرة جدًا ، كانت تقريبًا بنفس حجم المستعمرات المستعمرات الأصلية.

هل يمكن للإشريكية القولونية أن تنمو مستعمرات عند 4 درجات مئوية؟ وإذا كان الأمر كذلك ، فكيف يمكنني تخزين اللوحات لفترات طويلة؟

عادة ، تظهر هذه المستعمرات فقط عند اختيار الأمبيسلين ، حيث يتدهور هذا تدريجيًا في الثلاجة.
أعتقد أن أفضل طريقة هي ببساطة إعادة تجميد مستعمراتك على طبق جديد مع الأمبيسلين وتخزين تلك اللوحات. بعد كل شيء ، لن تظهر المستعمرات أبدًا إذا قمت بطلائها هناك & # 33


معدل نمو الإشريكية القولونية.

يجب أن يكون من الممكن التنبؤ بمعدل نمو الإشريكية القولونية لنمط وراثي معين في بيئة محددة. إن الفكرة القائلة بأن معدل تخليق ATP يحدد معدل النمو وأن محصول ATP يحدد مردود النمو راسخ في علم وظائف الأعضاء البكتيري ، ومع ذلك فإن هذه الفكرة غير متوافقة مع النتائج التجريبية. في الحد الأدنى من الوسائط ، يختلف معدل النمو والمحصول باختلاف مصدر الكربون بطريقة مستقلة عن معدل تكوين وإنتاجية ATP. مع استخدام الأسيتات كمصدر للكربون ، فإن التفاعلات البنائية ، وليس تخليق ATP ، تحد من معدل النمو. بالنسبة للأسيتات وركائز تكوين السكر الأخرى ، يبدو أن الخطوة المحددة تتمثل في تكوين ثلاثي فوسفات. أستنتج أن معدل النمو يتحكم فيه معدل تكوين المستقلب السلائف ، وبالتالي ، المونومرات مثل الأحماض الأمينية المشتقة منه. يتم تنظيم نظام تصنيع البروتين وفقًا للطلب على تخليق البروتين. قمت بفحص التخمين بأن إشارة هذا التنظيم هي نسبة الحمض النووي الريبي غير المشحون إلى aminoacyl-tRNA ، وأن هذه الإشارة تتحكم في تركيز غوانوزين رباعي الفوسفات ، وأن تركيز غوانوزين رباعي الفوسفات يتحكم في نسخ جينات rrn. تم حل المعادلات التفاضلية التي تصف هذا النظام عدديًا لحالات النمو المستقرة ، وتتفق القيم المحسوبة للريبوسومات ورباعي فوسفات الجوانوزين ومعدل النمو الأقصى مع القيم التجريبية التي تم الحصول عليها من أدبيات السنوات الـ 35 الماضية. تم حل هذه المعادلات أيضًا للحالات الديناميكية المقابلة للتحولات التغذوية لأعلى ولأسفل.


ممرضة بكتريا قولونية: الجانب المظلم للميكروب الودود

بكتريا قولونيةإن وجودها في البيئة مدعاة للقلق لأن علاقتها بالبشر ليست حميدة تمامًا. في الواقع، بكتريا قولونية هو سبب رئيسي لأمراض الإسهال والتهاب الصفاق والتهاب القولون وتجرثم الدم ووفيات الأطفال والتهابات المسالك البولية التي تكلف في جميع أنحاء العالم مليارات الدولارات لعلاج وقتل ما يقرب من مليوني شخص كل عام (روسو وجونسون ، 2003 Kaper et al. ، 2004). قد تسبب بعض السلالات السرطان (آرثر وآخرون ، 2012). بعض الانتهازية بكتريا قولونية تحدث العدوى عن طريق سلالات غير ضارة أو مفيدة عادةً عند إدخالها إلى مضيف مريض أو أجزاء من جسم المضيف خارج القناة الهضمية (Kaper et al. ، 2004). ومع ذلك ، هناك أيضًا سلالات ممرضة تنتج عوامل ضراوة ويمكن أن تسبب المرض حتى في المضيف الأكثر صحة. يتم تصنيف هذه السلالات حسب مكان وكيفية تسببها في المرض إلى مجموعات تسمى أنواع الأمراض (انظر & # x02018 Glossary & # x02019) ، والتي تشمل التجميع المعوي ، والنزيف المعوي ، والممرض المعوي ، والتسمم المعوي ، والمرض البولي ، والمرتبط بالتهاب السحايا ، والتسمم الدموي. بكتريا قولونية (Kaper et al.، 2004 Leimbach et al.، 2013) (انظر & # x02018Glossary & # x02019).

الأكثر شهرة من هؤلاء هو بكتريا قولونية O157: H7 ، سلالة نزفية معوية تنتج الشيغا-مثل السم (جريفين وتاوكس ، 1991 روبنسون وآخرون ، 2006). يهاجم هذا السم (انظر & # x02018Glossary & # x02019) الأوعية الدموية الصغيرة ، ويقتل خلايا الأمعاء ، ويسبب إسهالًا دمويًا وآلامًا شديدة في البطن ، بالإضافة إلى متلازمة انحلال الدم اليوريمي (HUS) ، وهي حالة قاتلة يمكن أن تشمل جلطات منتشرة في الشعيرات الدموية و فقر الدم الانحلالي ونقص الصفيحات والفشل الكلوي (انظر & # x02018 Glossary & # x02019 Griffin et al. ، 1988 Kaper et al. ، 2004). قد يكون العلاج صعبًا لأن المضادات الحيوية تزيد من خطر الإصابة بمتلازمة انحلال الدم اليوريمية. نتيجة لذلك ، يقتصر العلاج بشكل عام على توفير السوائل والتغذية الكافية وأدوية الألم والحمى ونقل الدم عند الضرورة (Bitzan، 2009 Smith et al.، 2012).

O157: H7 خطير بشكل خاص لأنه يمكن أن يلوث بسهولة الإمدادات الغذائية البشرية. وهو يتواجد بدون أعراض في الماشية والماشية الأخرى ، ويمكن أن ينتقل إلى البشر عن طريق التلوث البرازي للحوم أثناء ذبحها وتعبئتها (Ferens and Hovde ، 2011). كما يمكن أن تلوث الخضروات عن طريق الأسمدة والمياه ، ومن خلال الاتصال بالطيور المرتبطة بالحيوانات الحية (Callaway et al. ، 2009 ، 2014). من خلال نقاط الدخول هذه إلى السلسلة الغذائية البشرية ، تسبب O157 في تفشي العديد من الأمراض (Frenzen et al. ، 2005 Rangel et al. ، 2005). في الولايات المتحدة وحدها ، أثرت مثل هذه الفاشيات سنويًا على & # x0223c63000 فرد ، مما أسفر عن مقتل 20 شخصًا ، وتكلف حوالي 405 مليون دولار في الرعاية الصحية والإنتاجية المفقودة (Mead et al. ، 1999 Scallan et al. ، 2011). متي بكتريا قولونية تحصل على ضغط سيئ ، O157: H7 هو الجاني دائمًا تقريبًا ، وهو محق في ذلك.


مقدمة في مرض الإسهال والإشريكية القولونية

الإشريكية القولونية هي بكتيريا صغيرة سالبة الجرام تعيش في أمعاء العديد من الثدييات بما في ذلك البشر. هذه البكتيريا لديها معدل نمو سريع. إذا أعطيت وسيلة غنية ، يمكن أن تتضاعف كل 20 دقيقة. كما أنه سهل النمو ولا يحتاج إلى مكملات غذائية خاصة. على الرغم من أنه ينمو جيدًا في درجة حرارة جسم الإنسان (حوالي 37 درجة مئوية) ، إلا أنه يمكن أن ينمو أيضًا في درجة حرارة الغرفة. إنها بكتيريا متعددة الاستخدامات ويمكن أن تستخدم العديد من الركائز للنمو. يمكن أن ينمو هوائيًا ولا هوائيًا (أي أنه لا هوائي اختياري ويمكن أن ينمو مع الأكسجين أو بدونه). تنمو البكتيريا جيدًا في الوسط السائل مع التهوية أو بدونها. كما أنها تنمو جيدًا على الأسطح الصلبة بما في ذلك وسط أجار المختبر المصنوع في أطباق بتري. تحتوي السلالة المختبرية من الإشريكية القولونية على جينات تشفر حوالي 4000 بروتين. البكتيريا مرنة وراثيا ويمكنها تبادل الحمض النووي عن طريق الاقتران. في المختبر ، يمكنهم أخذ الحمض النووي من البيئة إذا عولجوا بالكاتيونات ثنائية التكافؤ مثل المغنيسيوم والكالسيوم (التحول). هناك أدلة على أنه يمكنهم أيضًا تناول الحمض النووي الخارجي في بيئتهم الطبيعية في القناة الهضمية. هناك عدد من فيروسات الحمض النووي البكتيرية (العاثيات) التي يمكن أن تصيب الإشريكية القولونية. يمكن لهذه الفيروسات نقل الحمض النووي بين البكتيريا. إن التنوع الجيني وسهولة العمل مع الإشريكية القولونية جعلها كائنًا نموذجيًا في المختبر لأكثر من 80 عامًا. تم استخدامه في العديد من الدراسات في علم وظائف الأعضاء وعلم الوراثة البكتيرية. نظرًا لأنه مفهوم جيدًا ، فهو أيضًا كائن حي مفضل لاستخدامه كوسيلة لاستنساخ الحمض النووي.

سلالات الإشريكية القولونية

هناك عدد كبير من سلالات الإشريكية القولونية. تعتبر السلالات المختبرية غير نمطية إلى حد ما عند مقارنتها بالسلالات المعزولة من أمعاء الحيوانات أو البشر أو من البيئة. تحتوي السلالات الطبيعية على جينات أكثر من سلالات المختبر. حوالي 2000 جين يشكلون الجينوم الأساسي ، والذي يتكون من تلك الجينات التي يجب أن تعيش وتنمو أي سلالة من الإشريكية القولونية. تختلف بقية الجينات باختلاف السلالات (هناك أكثر من 15000 جينًا مختلفًا تم العثور عليها في سلالات مختلفة) 1. تشمل الجينات الموجودة في بعض السلالات فقط الجينات المشاركة في التسبب في المرض وفي البقاء على قيد الحياة في مضيف الثدييات. يعني هذا التركيب الجيني المتغير أن سلالات مختلفة من الإشريكية القولونية تسبب أمراضًا مختلفة. وبالتالي ، هناك نوع من أنواع الإسهال الإشريكية القولونية (DEC) والإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولي (UPEC) والإشريكية القولونية التي تسبب التهاب السحايا. في هذه المقالة ، سأركز على سلالات DEC.

سلالات الإشريكية القولونية المسببة للإسهال (DEC)

يعيش DEC في أحشاء العديد من الحيوانات ، بما في ذلك الأبقار والغزلان وحيوانات الرعي الأخرى. قد تكون العدوى بالسلالات التي تسبب المرض للإنسان عديمة الأعراض في الحيوانات. تعيش البكتيريا في الأمعاء وتخرج في البراز. يمكن أن تتلوث اللحوم في مصانع المعالجة بـ DEC بسبب تلوث اللحوم بالبكتيريا من أمعاء الحيوان. في البيئة الطبيعية ، يحتاج DEC الذي يفرز في البراز للبقاء على قيد الحياة والوصول إلى مضيف جديد. تتضمن إحدى استراتيجيات البقاء على قيد الحياة ارتباط البكتيريا بأسطح النباتات. عندما يؤكل النبات من قبل مضيف محتمل ، تدخل البكتيريا وتنمو في الجهاز الهضمي المضيف. يصاب البشر بـ DEC عن طريق تناول اللحوم أو النباتات الملوثة. في السنوات الخمس الماضية في الولايات المتحدة ، تم نقل DEC عن طريق براعم البرسيم ، والسلطة المفرومة ، والخس الروماني ، والدقيق ، ولحم البقر المفروم والبيسون ، وزبدة فول الصويا ، وبراعم البرسيم. أدى تفشي المرض الناتج إلى سحب المنتجات الملوثة كلما أمكن ذلك مما أدى إلى خسارة اقتصادية.

الحالات المقدرة لـ DEC ، مما أدى إلى دخول المستشفى ووفيات الأمبير في الولايات المتحدة الحالات المقدرة لـ DEC والنتيجة والوفيات في جميع أنحاء العالم 3

تم الإبلاغ عن المرض الناجم عن DEC من قبل مركز مكافحة الأمراض في الولايات المتحدة (CDC) في أربع فئات: السلالات التي تحمل جين ذيفان الشيغا (STEC) ، سلالة خبيثة بشكل خاص تحمل جين ذيفان الشيغا والعديد من جينات الفوعة الأخرى (O157: H7) ، السلالات التي تحمل جينات السموم الأخرى (ETEC) ، وسلالات DEC الأخرى. في البلدان النامية التي تعاني من ضعف أو عدم وجود أنظمة تنقية وصرف صحي ، يمكن أن ينتشر DEC بسهولة من شخص لآخر عبر طريق الفم والبراز ويسبب تفشي الأمراض على نطاق واسع. يتم عرض العدد التقديري للحالات والاستشفاء والوفيات التي تسببها كل مجموعة من السلالات سنويًا في الولايات المتحدة وفي جميع أنحاء العالم في الجداول. كما هو الحال مع جميع أمراض الإسهال ، تكون العدوى بـ DEC أكثر خطورة عند الأطفال وكبار السن.

أتطلع قدما

هذا هو الأول من سلسلة من المقالات. ستنظر المقالات المستقبلية في انتقال وتقليل DEC ، ومسح لمسببات الأمراض البشرية التي تنقلها النباتات.


نتائج

تقييم درجة حرارة ما قبل الحث

المؤتلف بكتريا قولونية تمت زراعة BL21 (DE3) Star ™ / pAE / LigB (131-645aa) عند 28 درجة مئوية و 37 درجة مئوية ، وتمت مراقبتها عن طريق الامتصاص عند 600 نانومتر كل 30 دقيقة بهدف الحصول على منحنيات النمو لدرجات الحرارة هذه وتقييم المحدد معدلات النمو في المرحلة الأسية. يمكن أن نرى من الشكل 2 (أ) وحسابات معدلات النمو المحددة في مراحل النمو الأسي أن معدل النمو الأقصى عند 28 درجة مئوية (μ)الأعلى = 0.62 ساعة -1) أقل بحوالي 40٪ من معدل النمو الذي تم الحصول عليه عند المستوى الأمثل بكتريا قولونية درجة حرارة النمو 37 درجة مئوية (μالأعلى = 1.05 ساعة -1). استغرق الأمر ساعة و 50 دقيقة للوصول إلى امتصاص 0.75 (المرحلة الأسية المبكرة) عند 37 درجة مئوية ، بينما استغرق الأمر 3 ساعات للوصول إلى نفس الامتصاص عند 28 درجة مئوية. عند 37 درجة مئوية ، نمت الخلية لمدة 4.5 ساعة حتى وصلت إلى الامتصاص عند 600 نانومتر من حوالي 4 ، بينما استغرق الأمر 6 ساعات للوصول إلى نمو الخلية عند 28 درجة مئوية ، كما هو موضح في الشكل 2 (أ). عند 37 درجة مئوية ، μالأعلى تم الحفاظ على 1.05 ساعة -1 حتى نمو 3 ساعات ، عند الامتصاص (يقاس عند 600 نانومتر) من حوالي 2 ، عندما تصل الخلايا إلى مرحلة النمو الأسي النهائية.

منحنيات النمو بكتريا قولونية BL21 (DE3) Star ™ / pAE / LigB (131-645aa). (أ) نمو الخلية عند 37 درجة مئوية و 28 درجة مئوية في السل عند 200 دورة في الدقيقة (تم قياس أخطاء الامتصاص عند 600 نانومتر بين 1 و 2٪). (ب) مقارنة بين النمو غير المستحث والناجم عن IPTG عند 28 درجة مئوية. تم إجراء الحث لمدة 4 ساعات بعد إضافة IPTG (أي ما يعادل 7 ساعات) عند القيمة المطلقةالهند = 0.75 (يشار إلى الوقت الذي تمت فيه إضافة 0.55 ملي مولار IPTG بواسطة سهم في عملية 3 ساعات). كما هو موضح في المقياس ، تم الوصول إلى تحريض لمدة ساعة بعد عملية 4 ساعات ، و 2 ساعة تحريض بعد عملية 5 ساعات ، و 3 ساعات تحريض بعد عملية 6 ساعات ، على التوالي.

في مرحلتين أخريين ، تمت زراعة البكتيريا عند 28 درجة مئوية و 37 درجة مئوية حتى وصلت الامتصاصية إلى 0.75 ، وعند هذه النقطة تمت إضافة IPTG للحث على التعبير عن البروتين المؤتلف LigB (131-645aa). في كلتا التجربتين ، تم الحفاظ على درجة حرارة ما بعد الحث عند 28 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، بينما تمت مراقبة الامتصاصية عند 600 نانومتر وتم فحص مستوى التعبير كل ساعة باستخدام SDS-PAGE. في التجربة التي أجريت عند 28 درجة مئوية (قبل وبعد التحريض باستخدام IPTG) ، تم تحديد انخفاض بنسبة تزيد عن 60 ٪ في معدل نمو البكتيريا بعد التحريض باستخدام IPTG (من 0.62 ساعة -1 إلى 0.24 ساعة -1) (الشكل 2 ب ). قد يكون انخفاض معدل النمو بعد الحث ناتجًا عن التأثير السام لـ IPTG و / أو العبء الأيضي المفروض على الخلايا بسبب التعبير الجيني غير المتجانسة أو سمية البروتين [19-24].

عندما تمت مقارنة حركيات التعبير LigB (131-645aa) عند 28 درجة مئوية للمقايسات باستخدام درجات حرارة مختلفة قبل الحث (28 درجة مئوية و 37 درجة مئوية) ، لم يكن هناك فرق كبير بين النمو المتحصل عليه تحت الاثنين. الظروف بعد الحث مع IPTG ، ولا بين مستويات التعبير التي تم الحصول عليها في 4 ساعات (الجدول 1).

نظرًا لأن معدل النمو المحدد خلال مرحلة ما قبل الحث كان أعلى عند 37 درجة مئوية ، فقد أجريت العملية مبدئيًا عند 37 درجة مئوية (درجة الحرارة المثلى لـ بكتريا قولونية النمو) ، وفقط في مرحلة الحث تم تخفيض درجة الحرارة إلى 28 درجة مئوية (درجة الحرارة المثلى لتعبير LigB (131-645aa) في بكتريا قولونية). لتقييم تأثير تحريض IPTG في المرحلة الأسية ، استغرقت الثقافة حوالي 3 ساعات عند 37 درجة مئوية للوصول إلى الامتصاص بالقرب من 2 (أعلى تركيز للخلية يكون فيه μالأعلى يبقى ثابتًا ، أي نهاية مرحلة النمو الأسي). استغرق نفس الامتصاص حوالي 5 ساعات مع نمو عند 28 درجة مئوية ، مما يقلل من إنتاجية العملية.

التعبير عن LigB المؤتلف باستخدام التصميم التجريبي لتقييم نمو الخلايا من أجل الاستقراء (Absالهند) وتركيز IPTG

تم اختبار ظروف تجريبية مختلفة لتغيير الامتصاص لتحريض تعبير LigB المؤتلف (131-645aa) وتركيز IPTG ، باستخدام التصميم المركب المركزي لمتغيرين. بكتريا قولونية تمت زراعة BL21 (DE3) Star ™ عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة حتى الوصول إلى المرحلة الأسية (Absالهند بين 0.75 و 2.0) ، عند هذه النقطة تمت إضافة IPTG (بين 0.1 مم و 1 مم) للتعبير عن LigB المؤتلف (131-645aa) عند 28 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.

تم تطبيع النطاقات الخاصة بمستخلص البروتين الكلي والجزء القابل للذوبان والجزء غير القابل للذوبان الذي تم تحليله في الهلام من خلال نمو الخلية المقاس بالامتصاص عند 600 نانومتر ، كما هو موضح في الطرق. تتشابه نطاقات SDS-PAGE مع جميع وحدات Absالهند تم اختبار تركيزات IPTG ، مما يشير إلى أن التعبير الذي تم تطبيعه بنمو الخلية لا يعتمد على هذه المتغيرات. في جميع الظروف التي تم اختبارها ، تم الحصول على LigB (131-645aa) في شكله القابل للذوبان في محلول التحلل (20 ملي مولار تريس ، 1 ملي مولار EDTA ، 0.1٪ تريتون X-100) مع حوالي 15٪ من إجمالي البروتين المعبر في حالته غير القابلة للذوبان الكسر في جميع الظروف التي تم اختبارها ، باستثناء المقايسة 4 (في عبسالهند 2.0 و 1 ملي IPTG) حيث كان الجزء غير القابل للذوبان أعلى ، بالقرب من 35 ٪ من إجمالي البروتين المعبر عنه. يتم عرض تحليلات SDS-PAGE التي تم إجراؤها لتقييم تعبير LigB (131-645aa) الذي تم تطبيعه من خلال نمو الخلية وقابلية الذوبان بواسطة قياس الكثافة في الشكل 3. وتظهر نتائج نمو الخلية وتعبير LigB (131-645aa) في الجزء القابل للذوبان في الجدول. 2.

SDS-PAGE مع غير المستحث والمستحث IPTG بكتريا قولونية BL21 (DE3) ستار / pAE/عينات LigB (131-645aa) طبيعية عن طريق الامتصاص عند 600 نانومتر من المقايسة 3 (عبس الهند = 2.0 و IPTG 0.1 ملي) ، مستخلص البروتين الكلي مفصول إلى أجزاء قابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان من البروتين المؤتلف في 20 ملي مولار تريس / 1 ملي EDTA / 0.1٪ تريتون X-100 (الرقم الهيدروجيني 8). Unind = غير المستحثة المستحثة = TE المستحثة = المستخلص الكلي.

في المقايسات 1 و 2 ، المستحثة في القيمة المطلقةالهند = 0.75 ، نمت الخلايا لمدة ساعة و 45 دقيقة و 1 ساعة و 50 دقيقة ، على التوالي ، عند 37 درجة مئوية قبل نمو الخلايا الحثية لمدة ساعتين و 45 دقيقة و 3 ساعات في المقايسات 3 و 4 (القيمة المطلقة).الهند = 2.0) ، على التوالي. في النقاط المركزية ، نمت الخلايا لمدة ساعتين و 15 دقيقة حتى تصل الامتصاصية إلى 1.4 لكل منها. تمت إضافة أوقات نمو الخلايا هذه في كل تجربة قبل إضافة المحرض إلى وقت الاستقراء لمدة 4 ساعات لحسابات الإنتاجية الموضحة في الجدول 2.

فيما يتعلق بنمو الخلايا الذي يتم فيه تحفيز LigB (131-645aa) ، فقد وجد أن هناك زيادة كبيرة في نمو الخلايا وتعبير البروتين المؤتلف عند Abs.الهند 0.75 was compared with 2.0, while the IPTG concentration was kept the same (Table 2). In assays 1 and 3, where induction was done at 0.75 and 2.0, respectively, and the IPTG concentration was the same (0.1 mM), cell growth of 0.95 and 1.6 g (dry cell)/L was obtained (respectively 3.75 and 6.33 in terms of absorbance at 600 nm) while 180 mg/L and 288 mg/L LigB (131-645aa) was expressed, representing around 70% higher cell growth and 60% higher protein expression. When assays 2 and 4 are compared, where induction with 1 mM IPTG was made at different absorbances, cell growth and LigB (131-645aa) expression were also found to be higher when the Absind was higher. When the concentration of inducer was varied, the comparison of assays 1 and 2 (Absind 0.75) and the comparison of assays 3 and 4 (Absind 2.0) show that cell growth and LigB (131-645aa) expression were both higher at 0.1 mM (Table 2), although the difference was lower than when the cell concentration was varied at induction. The productivity data (amount of expressed target protein per volume of bacterial culture per process time) indicated that at the lower concentration of IPTG (0.1 mM), expressing the target protein at Absind 2.0 was better.

In the analysis of the triplicate at the central point (Absind = 1.4 and 0.55 mM IPTG), the errors associated with each of the response variables were assessed by calculations of means and their respective standard deviations, resulting in 1.15 ± 0.05 g (dry cell)/L for cell growth (equivalent of 4.61 ± 0.20 measured by absorbance at 600 nm), and 207 ± 8 mg/L for the yield of soluble LigB (131-645aa) expressed, while productivity was found to be 33.2 ± 1.3 (mg/L)/h. The errors calculated for the intermediate Absind and IPTG conditions, in triplicate (Central Points 1-3), were lower than 5%. The errors in the data obtained from the densitometry analysis that were used to calculate protein expression were found to be around 8%.

There was no significant reduction in the pH at the end of the experiments, as they were buffered with potassium salts in the TB medium (Table 2). The final pH at the central points was measured at around 6.6 ± 0.1 (errors of less than 1%). The glucose uptake after the 4 h induction period was found to be 30-50% of the initial concentration (9-10 g/L confirmed by the enzyme colorimetric method used) (Table 2). This indicates that the initial glucose concentration could have been lower. The assessment of the central point indicated the error in the glucose measurements to be around 12%, averaging 5.8 ± 0.7 g/L. The experiments that resulted in the greatest drop in pH and the greatest glucose uptake were the ones that yielded the highest cell growth.

Experimental design techniques were developed so that the maximum of process information could be gathered using the smallest number of experiments. Experimental design techniques usually rely on empirical model structures in order to interpret experimental data and provide optimal process operation conditions [23]. The linear effects and the effect of the interaction between Absind and IPTG concentration (x1 و x2 for codified variables, respectively) on cell growth (in g (dry cell)/L), the yield of expressed soluble LigB (131-645aa) (mg/L) and productivity ((mg/L)/h) can be described by linear models obtained by the statistical analysis with 95% confidence level (ص < 0.05 for statistically significant parameters), according to the equations below (in terms of codified variables):

Experimental and model data for each experiment were compared in order to check if the models are realist (shown in Table 2). The relative errors confirmed the models were representative of the experimental data. The correlation coefficients (ص 2 ) obtained were around 0.98 and Fكال> > Fالتبويب في ال F-test analysis of variance (ANOVA), shown in Table 3, indicating that the models are statistically significant and predictive.

The models were evaluated by the correlation coefficients ص 2 and ANOVA, demonstrating that they represent the experimental data (good agreement between the experimental values and the values predicted by the models) as such, the response surfaces could be obtained from the models. The response surfaces for cell growth and soluble LigB (131-645aa) productivity can be seen in Figure 4, where the linear effects of Absind and IPTG and the effect of their interactions on the response variables can be assessed.

Model representation for the effects of Abs ind and IPTG on (a) cell growth measured at 600 nm (Abs 600nm ) and (b) LigB (131-645aa) productivity ((mg/L)/h) in بكتريا قولونية BL21 (DE3) Star™/pAE.

The models indicate that the growth of بكتريا قولونية BL21 (DE3) Star™/pAE/LigB (131-645aa) (measured by absorbance at 600 nm and converted to g (dry cell)/L), the yield of soluble protein (mg/L) at the end of 4 h induction and the productivity of the process taken as a whole, in (mg/L)/h, were influenced both by the cell growth at which protein expression was induced by IPTG, and by the concentration of the inducer. It was also found that the interaction between the two variables, Absind and IPTG, had a significant effect on soluble LigB (131-645aa) expression: the concentration of IPTG that yielded increased protein production depended on the cell growth when induction was begun. The interaction between these two variables did not have a statistically significant effect only on cell growth, since ص > 0.05 for this parameter. The statistical analysis for the densitometry values of the bands corresponding to the soluble fractions in SDS-PAGE (that means the soluble expression of LigB (131-645aa) normalized by cell growth) indicated that both Absind and IPTG concentration had no statistical influence on this response, as all the effects resulted in ص & GT 0.05.

The data on soluble LigB (131-645aa) expression indicated that productivity was improved when 0.1 mM IPTG was used (lower inducer concentration) and when the highest absorbances were reached for induction at the final exponential growth phase, keeping the maximum specific growth rates (Absind 2.0). Induction at Absind 2.0 resulted in a higher level of expression of the recombinant protein (positive effect of this parameter on soluble LigB (131-645aa) expression yield and productivity). Comparing with the assay when Absind was 0.75 (early exponential phase) and IPTG was 1 mM, cell growth increased by almost 100% while soluble LigB (131-645aa) expression rose by around 50%, even though the process time was increased because induction was done at a higher absorbance at the exponential phase. The IPTG concentration was reduced to the lowest value because had a negative effect on cell growth, the final yield of soluble LigB (131-645aa) obtained, and the overall productivity of the process. The data therefore indicated that the best concentration of IPTG for expression was 0.1 mM.

The condition that produced the higher yield and productivity of soluble LigB (131-645aa) in بكتريا قولونية BL21 (DE3) Star™/pAE was confirmed in shaking flasks by inducing protein expression at the final exponential growth phase using the minimum inducer concentration. The expression results for the triplicate in shaking flasks at Absind 2.0 and 0.1 mM IPTG (equivalent to assay 3 presented in Table 2), 28°C, for 4 h induction in TB medium were: 1.5 ± 0.1 g (dry cell)/L (equivalent to 5.9 ± 0.4 measured by absorbance at 600 nm) for cell growth, yield of 272 ± 6 mg/L for LigB (131-645aa) expression, and 40.4 ± 0.9 (mg/L)/h for productivity.

Correlation between cellular growth and protein expression yield

In order to check whether the expression of soluble LigB (131-645aa) was proportional to cell growth, a linear correlation was performed using the experimental design results (Figure 5). The equation: mg/L = 181 (g dry cell)/L, with a linear correlation coefficient (ص 2 ) of 0.9, was obtained, indicating that the soluble expressed LigB (131-645aa) was proportional to cell growth with a yield factor YP/X of 181 mg/g (dry cell). When it came to protein production in milligrams per liter of culture at Abs600nm of 1, the yield factor was 45.3 mg/L per absorbance measured at 600 nm, which indicates the same significance as the yield of product per unit of cell [25]. This finding indicates that the expression of soluble LigB (131-645aa) in the conditions tested in this work in terms of mg L −1 Abs −1 was similar in all the experiments, with an error of around 10%. That is, LigB (131-645aa) expression per cell in terms of mg L −1 Abs −1 obtained from the bands of the soluble fractions in the densitometry analysis was not statistically influenced by either of the variables (Absind and IPTG concentration), as already indicated before.

Correlation between soluble LigB (131-645aa) expression (mg/L) in بكتريا قولونية BL21 (DE3) Star™/pAE and cell growth measured at 600 nm (Abs 600nm). The linear correlation is mg/L = 181 (g dry cell)/L or mg/L = 45.3 Abs600nm, that is, (mg L -1 )/Abs600nm = 45.3 = YP/X.

Expression of LigB protein in microbioreactor and purification by IMAC

The condition for soluble LigB (131-645aa) expression at the end of exponential growth phase and 0.1 mM IPTG was also performed using Biopod microbioreactors. A cell growth curve was run in the Biopod microbioreactors at 37°C in TB medium without induction of بكتريا قولونية BL21 (DE3) Star™/pAE/LigB (131-645aa) and the exponential phase was reached after 1 h, corresponding to an absorbance at 600 nm of 6. The exponential growth phase was verified until the absorbance of 12 and the final absorbance was around 18 after 6.5 h. This growth was due to high rate of aeration caused by the dispersion of air through microbubbles [18].

The maximum specific growth rate at 37°C (μالأعلى de 0.69 h -1 ) was maintained until the bacteria reached absorbance 12. At this point, the cells were induced with 0.1 mM IPTG, as suggested by the experimental design performed in shaking flasks. The specific growth rate of the bacteria was found to be 0.3 h -1 after induction with IPTG at 28°C (25% improvement over the specific growth rate of 0.24 h -1 obtained in shaking flasks). Cell grew until 18.8 ± 1.2 (measured by absorbance at 600 nm) after 4 h induction. The results for densitometry of soluble protein bands showed a yield of 970 ± 174 mg/L and a final productivity of 157.4 ± 28.2 (mg/L)/h. The soluble fraction of the protein was around 77% of the total LigB (131-645aa) expressed in this condition. Cell growth, expression levels and productivities were greater than in shaking flasks due to more efficient aeration in the microbioreactor [18].

Protein purification was performed by IMAC and eluted with 300 mM imidazole, as shown in Figure 6. LigB (131-645aa) band evaluated by gel densitometry was equivalent to 25-27% of the total بكتريا قولونية protein lysate obtained in microbioreactor (Figure 6). Purified LigB (131-645aa) was obtained in a final concentration of 260 mg/L medium culture with 91% homogeneity (10% error).

SDS-PAGE results from protein purification obtained with 300 mM imidazole elution by IMAC. The lysate fraction contains 25-27% LigB (131-645aa) and flow-through contains proteins without binding, leading to enrichment of the protein of interest in the last gel lane.


Mechanisms of microbial growth

Microbial growth refers to an increase in number of cells rather than an increase in cell size. Many microbes (including Escherichia coli, Salmonella enterica, و Listeria monocytogenes) are unicellular, meaning they are made of only one cell. The size of any unicellular microbe is limited by the capacity for the essential components of the cell to support its survival. For example, the integrity of the cell wall is impaired when cells become too large. The solution to growing despite limits on cell size is for cells to divide or produce new cells from the original cell. Therefore, the population grows although the size of the individual members of the population remains stable.

Most commonly, a single-cellular microbe divides into two identical new cells during one growth cycle (Figure 3a). The original cell, called the parent cell, makes a copy of its DNA and generates enough material to build the membrane, wall, and molecular machines for two cells. The parent cell slightly increases in size to accommodate these additional materials. Then, the parent cell begins to contract at the middle and a new piece of cell wall is assembled at the site of contraction. This process continues until the parent cell is split into two cells with complete cell walls. The resulting cells are called the daughter cells. Because both daughter cells are identical, cell division is also called replication. Replication in this manner leads to a rapid increase in the number of cells as each daughter cell begins the cycle again by acting as a parent cell. Cell division can look slightly different for microbes with different shapes (Figure 3b), but the key principles remain the same.

As long as the conditions are favorable, one cell produces two new cells in a continuous cycle. Every cycle doubles the number of cells in the population. This is known as exponential growth. Depending on the conditions, the division cycle of بكتريا قولونية can be as short as 20 minutes. This rapid division leads to a rapid increase in the population size (Figure 3c). Eventually, the population is large enough to have an impact we can detect, such as formation of a physical structure. In a research lab, this might be a “colony,” a mound of bacteria on solid growth media. You might notice this as plaque on your teeth. It takes over a million bacteria to form a visible structure, but this can occur in only about eight hours when conditions are optimal for بكتريا قولونية.

Figure 3: The population increases exponentially as cells divide. Microbes with different shapes divide similarly.

Some microbes produce new cells asymmetrically. In this situation, one parent cell produces a single daughter cell by a process called budding. During budding the parent cell develops a small protrusion known as the bud. The materials necessary to support a new cell are sent into the bud, which eventually splits from the parent cell to form a new daughter cell. The parent cell continues to make buds, but the budded daughter cells do not divide. Buds can remain connected in a chain or separate into individual cells (Figure 4). Saccharomyces cerevisiae, a yeast used to make bread, is a budding yeast.

There are also multicellular microbes, like algae and the fungi that form molds. For these microbes, multiple cells work together to keep the organism alive. Each cell might perform slightly different functions for the organism. When a parent cell divides, each daughter cell begins to perform specific functions based on its surroundings. The entire organism grows as new cells form and take on new functions. This is similar to the way larger organisms, like animals, grow.

Figure 4: Some cells use budding to produce daughter cells. A parent cell produces small protrusions called buds.


Procedure

Part 1: Preparing Strain 4-1 and 4-2 for transformation

  1. In advance of lab today, a small patch of each strain was grown for you on an LB agar petri dish. A video of this procedure is here.Strain 4-1 is a K-12 type of E. coli. Strain 4-2 is a B-type strain.
  2. Label 2 small eppendorf tubes either "4-1" or "4-2".
  3. Pipet 200 ul of CaCl2 solution into each eppendorf and then place the tubes on ice.
  4. Use a sterile wooden dowel to scrape up one entire patch of cells (NOT including the agar that they're growing on!) labeled "4-1," and then swirl the cells into its tube of cold CaCl2. A small bit of agar can get transferred without consequence to your experiment, but remember you're trying to move the cells to the CaCl2, not the media they're growing on. If you have a vortex, you can resuspend the cells by vortexing very briefly. If no vortex is available, gently flick and invert the eppendorf tube, then return it to your icebucket.
  5. Repeat, using a different sterile wooden dowel to scrape up the patch of cells labeled "4-2." Vortex briefly if possible. It's OK for some clumps of cells to remain in this solution.
  6. Keep these competent cells on ice while you prepare the DNA for transformation.

Part 2: Transforming Strains 4-1 and 4-2 with pPRL and pGRN

The cells you've prepared will be enough to complete a total of 6 transformations. You will transform the purple-color generator into each strain, and also the green-color generator into each strain. You will also use the last bit of competent cells as negative controls for the transformation.
A video of this procedure is here.

  1. Retrieve 2 aliquots of each plasmid for a total of 4 samples (2x pPRL, 2x pGRN). Each aliquot has 5 ul of DNA in it. The DNA is at a concentration of 0.04 ug/ul. You will need these values when you calculate the transformation efficiency at the end of this experiment.
  2. Label one of the pPRL tubes "4-1." Label the other pPRL tube "4-2." Be sure that the labels are readable. Place the tubes in the ice bucket.
  3. Label one of the pGRN tubes "4-1." Label the other pGRN tube "4-2." Be sure that the labels are readable. Place the tubes in the ice bucket.
  4. Flick the tube with the competent 4-1 strain and then pipet 75 ul of the bacteria into the tube labeled "pPRL, 4-1" and an additional 75 ul into the tube labeled "pGRN, 4-1." Flick to mix the tubes and return them to the ice. Save the remaining small volume of the 4-1 strain on ice.
  5. Flick the tube with the competent 4-2 strain and then pipet 75 ul into the tube labeled "pPRL, 4-2" and an additional 75 ul into the tube labeled "pGRN, 4-2." Flick to mix and store them, as well as the remaining volume of competent cells, on ice.
  6. Let the DNA and the cells sit on ice for 5 minutes. Use a timer to count down the time.
  7. While your DNA and cells are incubating, you can label the bottoms (not the tops) of the 6 petri dishes you'll need. The label should indicate the strain you've used ("4-1" or "4-2") and the DNA you've transformed them with ("pPRL," "pGRN," or "no DNA control")
  8. Heat shock all of your DNA/cell samples by placing the tubes at 42° for 90 seconds exactly (use a timer). This step helps drive the DNA into the cells and closes the porous bacterial membranes of the bacteria.
  9. At the end of the 90 seconds, move the tubes to a rack at room temperature.
  10. Add 0.5 ml of room temperature LB to the tubes. Close the caps, and invert the tubes to mix the contents.
  11. Using a sterilized spreader or sterile beads, spread 250 ul of the transformation mixes onto the surface of LB+ampicillin agar petri dishes. A video of the procedure is here.
  12. If desired the remaining volumes of transformation mixes can be plated on LB plates to show the effect of antibiotic selection on the outcome.
  13. Incubate the petri dishes with the agar side up at 37° overnight, not more than 24 hours.

Next day

In your lab notebook, you will need to construct a data table as shown below. These may be provided. Also be sure to share your data with the BioBuilder community here.


شاهد الفيديو: نصائح مهمة جدا لو عايز زرعك يعيش بعد فصل الشتاء و البرد (كانون الثاني 2022).