معلومة

6.4: خيوط وسيطة - علم الأحياء


تتكون الخيوط الوسيطة من عدة خيوط من البروتينات الليفية يتم لفها معًا (الشكل 1). تحصل عناصر الهيكل الخلوي على اسمها من حقيقة أن قطرها ، من 8 إلى 10 نانومتر ، يقع بين تلك الموجودة في الألياف الدقيقة والأنابيب الدقيقة.

الخيوط الوسيطة ليس لها دور في حركة الخلية. وظيفتها هيكلية بحتة. إنها تتحمل التوتر ، وبالتالي تحافظ على شكل الخلية ، وتثبت النواة والعضيات الأخرى في مكانها. يوضح الشكل 2 كيف تنشئ الخيوط الوسيطة سقالات داعمة داخل الخلية.

الخيوط الوسيطة هي المجموعة الأكثر تنوعًا من عناصر الهيكل الخلوي. توجد عدة أنواع من البروتينات الليفية في الخيوط الوسيطة. ربما تكون أكثر دراية بالكيراتين ، وهو البروتين الليفي الذي يقوي شعرك وأظافرك وبشرة الجلد.


تقوم mRNAs المتعددة بترميز peripherin ، وهو بروتين خيطي عصبي وسيط.

تم عزل ثلاثة مستنسخات (كدنا) من 1.6 (3u) و 1.2 (5 جم) و 0.6 (5 ب) كيلو بايت ، خاصة بـ peripherin ، وهو بروتين خيطي عصبي وسيط (IFP) ، من مكتبة خلية ورم أرومي عصبي lambda gt11 عن طريق الفحص المناعي باستخدام مضاد محيطي. تتعرف الأجسام المضادة المستخرجة من بروتينات الاندماج التي تنتجها الحيوانات المستنسخة 3 ش و 5 جم على البقع المحيطية على الطبطات المناعية. حيث تتداخل الثلاثة cDNAs لها تسلسلات متطابقة. يعرض (كدنا 5g) أقرب تجانس إلى النوع الثالث (كدنا) IFP. cDNA 3u مطابق للمنطقة المقابلة لـ cDNA 5g ، باستثناء إدخال جزء 96 نقطة أساس في موضع يقابل تقاطع exons 4 و 5 في النوع III IFP cDNAs. cDNA 5b مطابق أيضًا للمنطقة المقابلة لـ cDNA 5g ، باستثناء حذف جزء 62 نقطة أساس عند تقاطع exons 8 و 9 في النوع III IFP cDNAs. تُظهر تجارب رسم الخرائط S1 التي تم إجراؤها باستخدام تحقيقات تغطي النهاية 3 لمنطقتين غير متوقعتين أن ثلاثة mRNAs متميزة تتوافق مع cDNAs الثلاثة. علاوة على ذلك ، يتم ملاحظة ثلاثة منتجات محيطية ، وهما منتجان ثانويان 61 و 56 كيلو دالتون بالإضافة إلى المحيط الرئيسي 58 كيلو دالتون ، عندما يتم ترجمة بولي (A) + RNA في المختبر ، ويتم ترجمة المحيط 61 كيلو دالتون من الحمض النووي الريبي المختار 3u. تنشأ الرناوات الثلاثة من التضفير البديل لجين محيطي فريد ، وبالتالي تولد تعدد الأشكال للمحيط.


الوصول إلى المستند

  • APA
  • مؤلف
  • BIBTEX
  • هارفارد
  • اساسي
  • RIS
  • فانكوفر

في: الاتجاهات في بيولوجيا الخلية ، المجلد. 6 ، رقم 4 ، 01.01 1996 ، ص. 123-126.

مخرجات البحث: مساهمة في المجلة ›تعليق / مناظرة› مراجعة الزملاء

T1 - الفتيل المُخرَّز لعدسة العين

T2 - مفتاح غير متوقع لبنية ووظيفة الفتيل الوسيط

N2 - في عام 1959 ، تم وصف بوليمر خيطي غير عادي ، يسمى الآن الشعيرة الخرزية ، في عدسة العين. كانت البروتينات المكونة وخصائص التجميع ووظائف خيوط الخرز بعيدة المنال. يشير النشر الأخير لتسلسلات اثنين من بروتينات خيوط العدسة الرئيسية (CP49 و filensin) وإعادة التشكيل في المختبر لهياكل تشبه إلى حد كبير خيوط الخرز ، إلى أن الخيوط المخرزة مرتبطة هيكليًا بالخيوط الوسيطة (Ifs). يساهم ارتباط المرافقات العدسية ، بلورات ألفا ، مع الخيوط في التشكل الخرزي المميز ، بالإضافة إلى إعطاء أدلة مهمة لوظيفة هذا الفتيل غير المعتاد في العدسة. هذه النتائج الأخيرة لها العديد من الآثار المترتبة على وظيفة IF والتجميع.

AB - في عام 1959 ، تم وصف بوليمر خيطي غير عادي ، يسمى الآن الشعيرة الخرزية ، في عدسة العين. كانت البروتينات المكونة وخصائص التجميع ووظائف خيوط الخرز بعيدة المنال. يشير النشر الأخير لتسلسلات اثنين من بروتينات خيوط العدسة الرئيسية (CP49 و filensin) وإعادة التشكيل في المختبر لهياكل تشبه إلى حد كبير خيوط الخرز ، إلى أن الخيوط المخرزة مرتبطة هيكليًا بالخيوط الوسيطة (Ifs). يساهم ارتباط المرافقات العدسية ، بلورات ألفا ، مع الخيوط في التشكل الخرزي المميز ، بالإضافة إلى إعطاء أدلة مهمة لوظيفة هذا الفتيل غير المعتاد في العدسة. هذه النتائج الأخيرة لها العديد من الآثار المترتبة على وظيفة IF والتجميع.


بيولوجيا الخلية في الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال: من العلوم الأساسية إلى التشخيص والعلاج

تم وصفه لأول مرة في القرن التاسع عشر ، الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM) ، وهو ورم من الدرجة الرابعة مع تمايز نجمي ، وفقًا لتصنيف منظمة الصحة العالمية المنقح لعام 2016 لأورام الجهاز العصبي المركزي (CNS) هو الورم الخبيث الأكثر شيوعًا في الجهاز العصبي المركزي. يحتوي GBM على مجموعة واسعة جدًا من التعديلات ، سواء الوراثية أو اللاجينية ، والتي تنتج عددًا كبيرًا من المجموعات الفرعية للطفرات ، والتي يلعب بعضها دورًا ثابتًا في بقاء المريض المستقل والاستجابة للعلاج. لا تمثل كل هذه المكونات دورة مغلقة فحسب ، بل إنها ذات صلة أيضًا بالسلوك البيولوجي للورم ومقاومة العلاج لأنها تشكل السلوك البيولوجي المرضي والمسار السريري. إن وجود طفرات محفزة مختلفة على خلفية وجود الطفرات الرئيسية في الخلايا الجذعية لـ GBM (GBMsc) يفصل أيضًا GBM باعتباره جديدًا ناشئًا من سلائف الخلايا الجذعية العصبية التي تتطور إلى GBMsc والثانوية ، عن طريق الطفرات المجمعة. يمكن ملاحظة بعض التغييرات في البيولوجيا الخلوية في ورم أرومي الدبقي عبر المجهر الضوئي لأنها تشكل السمات المميزة للخلية والأنسجة للحالة. تؤدي التغييرات في المعلومات الوراثية ، التي تؤدي إلى التغيير والقمع والتعبير عن الجينات مقارنة بمستوياتها الفسيولوجية في الخلايا النجمية السليمة إلى إعادة تنظيم المصفوفة خارج الخلية ليس فقط. تؤدي هذه التغييرات إلى عدد متعدد الأشكال من الأشكال المجهرية والأشكال المناعية / البيوكيميائية البحتة. لذلك ، في القرن الحادي والعشرين ، اكتسب مصطلح multiforme ، الذي كان منبوذًا سابقًا من التسميات ، شعبية جديدة على خلفية التنوع الجيني في هذا الإدخال الورمي.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


الوصول إلى المستند

  • APA
  • مؤلف
  • BIBTEX
  • هارفارد
  • اساسي
  • RIS
  • فانكوفر

مخرجات البحث: المساهمة في المجلة ›المقال› مراجعة الأقران

T1 - العلاقة بين الخيوط الوسيطة والألياف الدقيقة في الخلايا الليفية المستنبتة

T2 - دليل على البؤر المشتركة أثناء انتشار الخلية

N2 - تم فحص انتشار الخلايا الليفية لجنين الدجاج (CEF) وانتشارها بالكامل بواسطة الفحص المجهري الفلوري مزدوج التسمية باستخدام مسبار الأكتين المحدد من رودامين phalloidin وجسم مضاد موجه ضد خيوط CEF الوسيطة (IF). أثناء الانتشار ، أصبحت علاقة ملفتة للنظر ملحوظة: أظهر التحليل الإحصائي أن ما يقرب من نصف عدد الخلايا أظهر واحدًا أو أكثر من عقيدات ربط الطور - كثيفة ، phalloidin - التي بدت وكأنها تعمل كبؤر تباعدت منها IF. إن التطابق بين الهياكل المحتوية على الأكتين و IF لم يقتصر على هذه المراكز ، يمكن أيضًا رؤية IF بشكل متكرر يعمل في مصفوفات متوازية قريبة مع ألياف إجهاد. أكد تحليل البنية التحتية وجود جيوب خارجية غير مرتبطة بالغشاء على طول ألياف الضغط التي تباعد منها 10 نانومتر IF. اختلفت هذه الهياكل في الحجم والشكل ، وعرضت مظهرًا ليفيًا كثيفًا ودقيقًا. تميزت IF والألياف الدقيقة (MF) بالحجم وزخرفة MF مع جزء فرعي من الميوسين ‐ 1. شوهدت تفاعلات IF MF أخرى في الخلايا في جميع المراحل: لوحظ IF وهي تدور عبر ألياف الإجهاد ، في أغلب الأحيان عند هوامش الخلية. في الخلايا المعالجة بالكولشيسين ، تمت إعادة توزيع IF في الكابلات التي غالبًا ما كانت متوازية ويبدو أنها تندمج مع ألياف الإجهاد. أظهر Cytochalasin D ، CEF المعالج بـ CEF مجاميع فضفاضة من المواد المحتوية على الأكتين والتي يبدو أنها مرتبطة بـ IF. تشير هذه النتائج إلى إمكانية حدوث تفاعل بين الهياكل المحتوية على الأكتين و IF ، خاصة أثناء انتشار الخلايا في الخلايا الليفية المستزرعة.

AB - تم فحص الخلايا الليفية لجنين الكتاكيت المنتشر والانتشار بالكامل (CEF) بواسطة الفحص المجهري الفلوري مزدوج التسمية باستخدام مسبار رودامين phalloidin الخاص بالأكتين وجسم مضاد موجه ضد خيوط CEF الوسيطة (IF). أثناء الانتشار ، أصبحت علاقة ملفتة للنظر ملحوظة: أظهر التحليل الإحصائي أن ما يقرب من نصف عدد الخلايا أظهر واحدًا أو أكثر من عقيدات ربط الطور - كثيفة ، phalloidin - التي بدت وكأنها تعمل كبؤر تباعدت منها IF. إن التطابق بين الهياكل المحتوية على الأكتين و IF لم يقتصر على هذه المراكز ، يمكن أيضًا رؤية IF بشكل متكرر يعمل في مصفوفات متوازية قريبة مع ألياف إجهاد. أكد تحليل البنية التحتية وجود جيوب خارجية غير مرتبطة بالغشاء على طول ألياف الضغط التي تباعد منها 10 نانومتر IF. اختلفت هذه الهياكل في الحجم والشكل ، وعرضت مظهرًا ليفيًا كثيفًا ودقيقًا. تميزت IF والألياف الدقيقة (MF) بالحجم وزخرفة MF مع جزء فرعي من الميوسين ‐ 1. شوهدت تفاعلات IF MF أخرى في الخلايا من جميع المراحل: لوحظ أن IF تتنقل عبر ألياف الإجهاد ، في أغلب الأحيان عند هوامش الخلية. في الخلايا المعالجة بالكولشيسين ، تمت إعادة توزيع IF في الكابلات التي غالبًا ما كانت متوازية ويبدو أنها تندمج مع ألياف الإجهاد. أظهر Cytochalasin D ، CEF المعالج بـ CEF مجاميع فضفاضة من المواد المحتوية على الأكتين والتي يبدو أنها مرتبطة بـ IF. تشير هذه النتائج إلى إمكانية حدوث تفاعل بين الهياكل المحتوية على الأكتين و IF ، خاصة أثناء انتشار الخلايا في الخلايا الليفية المستزرعة.


مقدمة

في البشر ، تضم عائلة الجينات التي تشفر البروتينات الهيكلية للخيوط الوسيطة السيتوبلازمية (IFs) أكثر من 60 عضوًا وهي واحدة من أكبر 100 عائلة متعددة الجينات (Hesse et al. ، 2001). تحدد مستويات هوية تسلسل بروتينات IF ، وتنظيم الجينات المقابلة وأنماط تعبيرها عدة أنواع فرعية من IF (Fuchs and Weber ، 1994 Herrmann and Aebi ، 2000 Coulombe et al. ، 2001). النوع الأول والنوع الثاني من الكيراتين هما أكبر الفصائل الفرعية. إنها تؤدي إلى نشوء خيوط الكيراتين الظهارية التي تعتمد على لفائف ملفوفة مزدوجة الشريطة غير متجانسة مكونة من النوع الأول والنوع الثاني من الكيراتين. يتضمن النوع الثالث أربعة بروتينات يمكن أن تشكل IFs متجانسة. تُظهر جينات البروتينات السبعة من النوع الرابع نمط intron مختلفًا تمامًا عن جينات النوع الأول والثالث. لديهم فقط اثنين إلى ثلاثة إنترونات مرتبطة بمجال القضيب المركزي للبروتينات وتحدث هذه الإنترونات في مواضع غير مرئية في جينات النوع الأول والثالث. تشكل اللامينات النووية النوع الخامس ، بينما تشكل بروتينات عدسة العين الفيلسين والفاكينين مجموعة منفصلة (BF ، للخيوط المحببة). أظهر مسح لمسودة تسلسل الجينوم البشري (الاتحاد الدولي لتسلسل الجينوم البشري ، 2001) أن ترميز الجينات لبروتينات IF غير الكيراتينية لا يتم تجميعها (Hesse et al. ، 2001). على النقيض من ذلك ، فإن جميع جينات الكيراتين من النوع الأول باستثناء K18 تشكل كتلة كثيفة على الكروموسوم 17q21 ، بينما تشكل جميع جينات الكيراتين من النوع الثاني و K18 مجموعة مماثلة على الكروموسوم 12q13 (Waseem et al. ، 1990).

ترتبط الطفرات النقطية في عدد لا يزال يتزايد من جينات IF بالأمراض البشرية. تسبب الطفرات في 14 جينًا على الأقل من جينات الكيراتين في البشرة متلازمات هشاشة في الجلد (Irvine and McLean ، 1999) والطفرات المماثلة في الجين من النوع III desmin المرتبطة بالاعتلال العضلي للقلب والعضلات الهيكلية (Goldfarb et al. ، 1998) ، بينما الطفرات في تم العثور على جين GFAP في مرض الإسكندر (Brenner et al. ، 2001 Li et al. ، 2002). أخيرًا ، في أنواع معينة انيقة، أربعة على الأقل من 11 جينات IF ضرورية لتطوير الديدان الخيطية (Karabinos et al. ، 2001). لا تقتصر جينات النوع الأول والثالث على الفقاريات ولكن تم توثيقها أيضًا في الحبليات المبكرة ، والتي يبدو أنها تفتقر إلى جينات النوع الرابع (تمت مراجعتها في Karabinos et al. ، 2002 Wang et al. ، 2002).

تم توثيق بعض الجينات لبروتينات IF السيتوبلازمية من النوع I-IV من الأسماك سابقًا عن طريق استنساخ cDNA على وجه الخصوص في الأسماك الذهبية وتراوت قوس قزح (Markl and Schechter ، 1998 Schaffeld et al. ، 2002a ، b) ، وتم تحليل اللامينات النووية في الأسماك الذهبية (Yamaguchi وآخرون ، 2001) وسمك الزرد (Hofemeister et al. ، 2002). ومع ذلك ، فقط الجينوم الناشئ لأسماك teleost فوغو روبريبس (Aparicio et al. ، 2002) يسمح بمقارنة مفصلة لتنظيم الجين IF وتعقيده في الإنسان والفقاريات السفلى. هنا ، نُبلغ عن بعض الاختلافات غير المتوقعة بين جينات IF في F. rubripes والثدييات.


الخواص الميكانيكية للخيوط الوسيطة الرطبة: رؤى من خيوط الوحل لسمك الهاg

تنقل الخيوط الوسيطة (IFs) التكامل الميكانيكي للخلايا ، ومع ذلك فإن ميكانيكا IF غير مفهومة جيدًا. من المفترض أن IFs في الخلايا صلبة مثل الكيراتين ألفا الصلب والأكتين والأنابيب الدقيقة ، لكن مرونة الانحناء العالية لـ IFs والصلابة المنخفضة لـ IFs الناعمة تشير إلى أن IFs الرطبة قد تكون ناعمة جدًا. لاختبار هذه الفرضية ، قمنا بقياس ميكانيكا الشد للخيوط الشبيهة بالكيراتين من طين سمك الهاg ، والتي تعد نموذجًا مثاليًا لاستكشاف آليات حزم IF و IFs لأنها تتكون من IFs معبأة بإحكام ومتوافقة. تشير اختبارات الشد إلى أن حزم IF المميهة تمتلك صلابة أولية منخفضة (E (i) = 6.4 ميجا باسكال) ومرونة ملحوظة (تصل إلى سلالات 0.34) ، والتي نعزوها إلى المجالات الطرفية لبروتين IF المرنة في سلسلة مع ملفات ملفوفة أكثر صلابة. تدعم قوة الشد العالية (180 ميجا باسكال) والصلابة (130 ميجا جول / م (3)) لحزم IF فكرة أن IFs تضفي التكامل الميكانيكي للخلايا. تشير مرونتها طويلة المدى إلى أن IFs قد تسمح أيضًا للخلايا بالتعافي من التشوهات الكبيرة. يشير حيود الأشعة السينية والتلطيخ باللون الأحمر إلى أن تشوه ما بعد العائد يؤدي إلى انتقال توافقي لا رجعة فيه ألفا و gtbeta في IFs ، مما يؤدي إلى تشوه البلاستيك ، ويمكن أن تستخدمه الخلايا كإشارة ميكانيكية حسية.

الأرقام

( أ ) SEM لخلية خيط الغدة الناضجة (بدون بلازماها ...

جهاز اختبار ميكانيكي دقيق يستخدم في ...

جهاز اختبار ميكانيكي دقيق يستخدم لقياس خصائص الشد لأطوال معزولة من ...

منحنيات الإجهاد والانفعال للثمانية ...

منحنيات الإجهاد والانفعال لخيوط سمك الهاg الثمانية المستخدمة لقياس الشد الأولي ...

سلوك الشد النهائي لسمكة الهاg ...

سلوك الشد النهائي لخيوط أسماك الهاg في مياه البحر. ( أ ) إجهاد - إجهاد نموذجي ...

سلوك الاسترداد لخيوط سمك الهاg ...

سلوك استعادة خيوط أسماك الهاg في مياه البحر. ( أ ) دورة تحميل نموذجية ...

تلطيخ CR لخيوط سمك الهاg ...

تلطيخ CR لخيوط سمك الهاg بعد إجهادها في مياه البحر. ( أ ) غير مقيد ...

أنماط حيود الأشعة السينية لأسماك الهاg ...

أنماط حيود الأشعة السينية لحزم خيوط سمك الهاg المتوترة في مياه البحر. ( أ )…

تأثير انزلاق الشعيرات الفرعية ...

تأثير انزلاق الخيوط الفرعية على طول ثبات IFs بافتراض ...

السلوك الميكانيكي المقترح لـ IF ...

السلوك الميكانيكي المقترح لثنائيات IF في المنطقة الميكانيكية I. افتراضات ...

السلوك الميكانيكي المقترح لـ IF ...

السلوك الميكانيكي المقترح لثنائيات IF في المناطق من الأول إلى الثالث. في المنطقة الأولى ، تشوه ...


العمارة الجزيئية للخيوط الوسيطة للصلب α- الكيراتين بناءً على بيانات الشبكة الفائقة التي تم الحصول عليها من دراسة الثدييات باستخدام حيود الألياف السنكروترونية

دراسات حيود الأشعة السينية ذات الزاوية العالية والمنخفضة للصلب αتمت دراسة الكيراتين ، وتم اقتراح نماذج مختلفة على مدار السبعين عامًا الماضية. اقتصرت معظم هذه الدراسات على شكل واحد أو شكلين من أشكال ألفا كيراتين. تعمل دراسة حيود الألياف السنكروترونية ذات الزاوية المرتفعة والمنخفضة على توسيع نطاق الدراسة لتشمل جميع البيانات المتاحة لجميع الأشكال المعروفة للألياف الصلبة. α- الكيراتين بما في ذلك الشعر ، والأظافر ، والحوافر ، والقرن ، والريشات من الثدييات ، والجرابيات ، والمونوتريم ، ويؤكد أن النموذج المقترح مقبول عالميًا لجميع الثدييات. تحقق تحليل Bragg الكامل لأنماط الحيود الزوالي ، بما في ذلك التعريضات المتعددة الأوقات للتحقق من أي انعكاسات ضعيفة ، من وجود شبكة فائقة تتكون من شبكتين لانهايتين وثلاثة شبكات محدودة. يحدد تحليل الأنماط الاستوائية أنصاف أقطار المستويات قليلة القسيمات للثنائيات ، والرباعية ، والخيوط الوسيطة (IFs) جنبًا إلى جنب مع المركز إلى مسافة المركز لـ IFs ، وبالتالي تأكيد الحلزونات المقترحة داخل الهندسة الجزيئية الحلزونية للصلابة α- كيراتين. تتحقق النتائج من أن الهيكل الذي اقترحه Feughelman و James يفي بمعايير الصلاحية α- هيكل الكيراتين.

1 المقدمة

على الرغم من 70 عامًا من التحقيقات في التنظيم الداخلي والخارجي للخيوط الوسيطة (IFs) من α-كيراتين ، لا يزال هناك تباين كبير في الآراء المنشورة في مجموعة واسعة من المجلات فيما يتعلق بهندسة هذه IFs. يتم عادةً تركيب عينات لتجارب حيود الألياف بحيث تكون حزمة الأشعة السينية متعامدة مع اتجاه نمو العينة. ستساهم جميع المشابك الخطية داخل العينة ، المحاذاة في هذا الاتجاه أو قادرة على الإسقاط عليها ، في نمط الانعراج الزوالي الذي تم الحصول عليه [1] ، مما يوفر تباعد الشبكة ضمن دقة الجهاز. دورية شعرية

لكل شبكة يمكن تحديدها بموجب قانون براج.

في عام 1983 وفي الأوراق اللاحقة [2-4] اقترح فريزر وماكراي أنه يمكن تحديد كل من الشبكة المحدودة البالغة 19.79 نانومتر والشبكة غير المنتهية المخلوعة البالغة 47.00 نانومتر من حيود الأشعة السينية. ومع ذلك ، أفاد لورانس [5] أن هذا لم يستوف جميع البيانات المعروفة. تمت إضافة المزيد من المشابك 19.8 نانومتر و 27.2 نانومتر و 12.2 نانومتر و 7.8 نانومتر بواسطة Wilk et al. [6] وجيمس وآخرون. [7]. ومع ذلك ، لا يزال هناك 4 انعكاسات كبيرة جدًا غير محسوبة والتي تبين لاحقًا أنها تزيد في شدة الشعر من البشر المصابين بمرض السكري المعتمد على الأنسولين (IDDM) والبابون IDDM ، جيمس وآخرون. [8]. نتيجة لذلك ، تم تأكيد وجود شبكة لا نهائية أخرى تبلغ 62.6 نانومتر ، مما أدى إلى وصول إجمالي المشابك المرئية إلى شبكتين غير متناهيتين و 3 شبكات محدودة مع شبكتين محتملتين إضافيتين (7.8 نانومتر و 15.6 نانومتر) مغمورة. تم اقتراح تجميع جزيئي محتمل لكل هذه المشابك لشعر الإنسان بواسطة Feughelman و James [9] لإيكيدنا كويل وصوف لنكولن وشعر الحصان. امتد هذا إلى شعر الإنسان بواسطة جيمس وأميمية [10] ولعينات الشعر المرضية [8 ، 11]. أكد التأكيد الرياضي جنبًا إلى جنب مع نتائج الخواص الميكانيكية هذا الهيكل المقترح [12].

تظهر هذه الحلزونات داخل نموذج الحلزونات في الشكل 1 كنتيجة نهائية لولبيين من الكيراتين غير المتجانسين يلتفان معًا لتشكيل ثنائي ضيق (الشكل 1 (أ)) ، نصف قطرها ضعف نصف قطر الحلزونات المفردة. ثم يلف اثنان من هذه الثنائيات معًا لتشكيل رباعي ، باستخدام حشوة كريك "مقبض في حفرة" ، [13] ، (الشكل 1 (ب)). ثم تنحرف ثمانية رباعيات في مصفوفة متداخلة حول سطح الخيوط الوسيطة. مسافة التكرار البالغة 62.6 نانومتر ، هي الإسقاط على اتجاه ألياف رباعي التربيع الكامل وهو إسقاط مجموع أطوال المقاطع الحلزونية وغير الحلزونية للرباعي ، على سبيل المثال ، التيار المتردد ، حيث تلتف عبر 120 °. يوضح الشكل 1 (ج) المجموعة النهائية من المشابك.


(أ)
(ب)
(ج)
(د)
(أ)
(ب)
(ج)
(د) (أ) يوضح هذا الشكل لف اثنين من ليفات الكيراتين غير المتجانسة معًا لتشكيل ثنائى. (ب) يوضح هذا الشكل لف اثنين من ثنائيات الثنائيات معًا في عبوة Crick "مقبض في حفرة". (ج) يوضح هذا الشكل المشابك التي تتراكب على نمط الانعراج مما يؤدي إلى الشبكة الفائقة الناتجة عن تراكب المشابك السبعة التي تمت مناقشتها أدناه. ترتبط الشبكة 47 نانومتر بالمسافة بين بداية القسم الحلزوني لرباعي واحد وبداية القسم الحلزوني للرباعي التالي ولكن واحد ، على سبيل المثال ، AB ، BD ، وبالتالي إنشاء شبكة شعرية غير محدودة ومستمرة واضحة في اتجاه الشعر. تم تسجيل المشابك المحدودة (19.8 نانومتر ، 272 نانومتر ، 12.4 نانومتر) ، بواسطة Wilk et al. [6] ، جيمس وآخرون. [7] ، Feughelman et al. [12] ، وجيمس [11] هي مجموعات فرعية من الإسقاطات للشبكة 47 نانومتر كونها إسقاط للقسم 200 نانومتر للقسم الحلزوني [15] زائد وناقص القسم غير الحلزوني [8 ، 11 ، 12]. جميع الانعكاسات من الشبكتين الأخريين 7.8 نانومتر و 15.6 نانومتر تمثل طرفي C و N غير ملفوفين ومجموعهما [15] مدفون تحت انعكاسات المشابك الأخرى. مسافة التكرار البالغة 62.6 نانومتر هي الإسقاط على اتجاه ألياف الرباعي الكامل ، أي إسقاط مجموع أطوال المقاطع الحلزونية وغير الحلزونية للرباعي ، على سبيل المثال ، التيار المتردد ، أثناء مروره من خلاله 120 درجة. بالنظر إلى الخط الذي يدخل عند A ويغادر عند C ، فإن وجود شبكة لا نهائية بمسافة 62.6 نانومتر ليس واضحًا جدًا. كما يوضح التحليل الهندسي [10] فمن الممكن رياضيًا لشرط واحد فقط ، وهو أن المسافة بين IFs تساوي ثلاثة أضعاف نصف قطر IF. هذا موضح في الشكل 2 حيث A و B و C و D و E هي نقاط متتالية على طول الشبكة. يفصل بينهما

بالنظر إلى الخط الذي يدخل عند A ويغادر عند C ، فإن وجود شبكة لا نهائية بمسافة 62.6 نانومتر ليس واضحًا جدًا ، خاصة مع التعبئة السداسية المعروفة. كما يُظهر التحليل الهندسي [10] هذا ممكن رياضيًا لشرط واحد فقط ، وهو أن المسافة بين IFs تساوي ثلاثة أضعاف نصف قطر IF. هذا موضح في الشكل 1 (د) حيث A و B و C و D و E هي نقاط متتالية على طول الشبكة. يفصل بينهما

63.1 نانومتر الذي يبرز في اتجاه الشعر مثل 62.6 نانومتر. الإدخال عبارة عن عرض رأسيًا لأسفل يوضح سلسلة من النقاط الشبكية لهذه الشبكة اللانهائية التي تمر عبر المصفوفة السداسية أثناء تقدمها على طول الشعر.

تستند المناقشة التالية إلى الفرضية القائلة بأن هذا الترتيب المعماري ليس صالحًا فقط لهذه العينات ولكنه ينطبق أيضًا عالميًا عبر طيف واسع من أنسجة كيراتين ألفا الصلبة.

2. المواد والأساليب

2.1. عينات

إنسان واحد ، حصان ، بقرة ، ماعز ، كلب ، قطة ، فيل (إليفاس مكسيموس) ، بابون (بابيو hamadryas) و orangutan (Pongo pygmaeus abelii) تم قص الشعر من بالقرب من الجلد وتم تحليله دون أي تحضير كيميائي خاص باستثناء التنظيف القصير بالماء المقطر قبل التركيب في الخلايا المصممة خصيصًا لإبقاء الشعر مشدودًا دون شد. تم تضمين سلسلة عمرية من الشعر من الأبقار مع الشعر المأخوذ من الذيل وكذلك من الأذن. حزم من 20 أو أكثر من ألياف الفراء مقطوعة بالقرب من جلد الولب الصخري (بتروجال الوحشي) ، كوال شمالي (بتروجال الوحشي) ، كنغر رمادي غربي (Macropus fuliginosus) والكنغر الأحمر (ماكروبوس روفوس) جنبًا إلى جنب مع حزم من صوف الألبكة تم محاذاة بعناية في مصفوفات متوازية ، وربطها معًا في النهايات ، وتركيبها في الخلايا المصممة خصيصًا بحيث يكون كل شعر في الحزمة مشدودًا وغير ممتد. أقسام صغيرة من قرن وحيد القرن (وحيد القرن) ، حافر الحصان ، والأظافر تم قطع حوالي 3 مم × 0.9 مم في الاتجاه الموازي لنمو α-هيليس. تم إدخال هذه المقاطع وتثبيتها في نهايات الشعيرات الدموية الزجاجية بقطر داخلي يبلغ حوالي 1 مم بحيث تكون العينة المراد فحصها بارزة من النهايات. ريشات النيص (النيص هيستريكس إنديكا) وريشات إيكيدنا (Tachyglossus aculeatus) تم تثبيتها أيضًا في نهايات الشعيرات الدموية الزجاجية بحيث تكون أطرافها بارزة للإشعاع بالأشعة السينية. تم وضع هذه الشعيرات الدموية في مكانها في لوحات مخددة بشكل خاص أثناء جمع البيانات. تم أخذ الصوف المتسق للغاية الذي تم اختياره للتحليل من خراف لينكولن التي تم تغطيتها وتغذيتها في ظل ظروف خاضعة للرقابة من أجل توحيد النمو وتعيينها SW 296 [14]. نظرًا لوجود اختلاف إحصائي ضئيل أو عدم وجود اختلاف إحصائي على طول هذا الصوف ، يمكن استخدام ألياف مفردة لهذه الدراسة.

تم جمع جميع العينات وفقًا للسياسات الأخلاقية لحدائق الحيوان المعنية والتجارب التي تم إجراؤها وفقًا لسياسات الأخلاقيات والسلامة الخاصة بالمختبرات والمختبرات البحثية ذات الصلة. تمت الموافقة على النقل والتصدير والتجريب مع جميع المدن والعينات الأسترالية الأصلية من قبل وزارة البيئة والموارد المائية التابعة للحكومة الأسترالية. تمت الموافقة على استيراد العينات إلى الولايات المتحدة من قبل إدارة أمن المواصلات في الولايات المتحدة الأمريكية.

2.2. إعداد نثر الأشعة السينية وجمع البيانات

تم الحصول على أنماط حيود الأشعة السينية ثنائية الأبعاد باستخدام مصدر الأشعة السينية السنكروترون في مصدر الفوتون المتقدم (مختبر أرجون الوطني) على كل من خطوط الأشعة BioCAT و ChemMatCARS. على خط إشعاع BioCAT ، كانت طاقة الأشعة السينية 120 كيلو فولت ، وهي مسافة العينة إلى كاشف MAR165 بناءً على حلقة الانعراج من الدرجة الثانية في نمط التشتت من الفضة Behenate

كان 1048.5 ملم. تم أيضًا استخدام لوحات التصوير Fuji Bas III ، الموجودة بشكل عمودي على شعاع الحادث وأمام الكاشف في خط حزمة BioCAT. كان حجم البكسل للوحات الصورة

مم. تم فحص ثلاث عينات أو أكثر من كل نوع على كل من هذه الحزم. كان حجم الشعاع 100 ميكرومترم في الاتجاه الأفقي و 50 ميكرومترم في الاتجاه العمودي لذلك تم تركيب جميع العينات مع اتجاه نمو α- الكيراتين في الاتجاه الأفقي والعينة متمركزة في الشعاع. تم نقل العينات للخلف وللأمام على طول أطوالها حيث أنه من المهم تحديد الموضع الأمثل على طول العينة ثم تحريكها لأعلى ولأسفل للتأكد من أن الحزمة تقع مركزيًا داخل العينة. كان هذا مهمًا بشكل خاص للقرن والحوافر والمسامير والريش وللفراء الجرابي حيث كانت أنماط الشعر الفردي أضعف من أن تكون ذات معنى ولذلك كان لا بد من استخدام حزم من الألياف المتوازية. يتم إعطاء أمثلة نموذجية لنمط الحيود كما تم الحصول عليها في BioCAT للقرون والريشات في الشكل 2 (أ) ولحزم الفراء الجرابي في الشكل 2 (ب).


(أ)
(ب)
(أ)
(ب) (أ) أنماط الحيود النموذجية التي تم الحصول عليها من أقسام صغيرة من قرن وحيد القرن ومن أطراف النيص وريش النمل باستخدام شعاع يقع مركزياً على العينة في مرفق BioCAT. (ب) أنماط الحيود النموذجية التي تم الحصول عليها في مرفق BioCAT لحزم ألياف الفراء المتوازية من جرابيات أسترالية. تم العثور على هذه العينات لتكون حيودًا ضعيفًا وتتطلب ثلاثين أو أكثر من الخيوط المتوازية ليتم تشعيعها لإعطاء نتائج موثوقة.

نظرًا للقيود على حجم المخرجات التي تفرضها أبعاد أجهزة الكشف أو لوحات التصوير وأنبوب الطيران المفرغ ، فإن الأخير ضروري لإزالة امتصاص الحزمة الضعيفة المنعرجة ، فقد تم تفويت انعكاس الزوال القوي جدًا 5.15. للسماح برؤية ممتدة ، بعد الحصول على أنماط الحيود المماثلة لتلك المذكورة أعلاه ، تم نقل الكاشف الموجود في ChemMatCARS بعيدًا عن المركز وتم أخذ أنماط الحيود الأوسع مرة أخرى في هذا الموضع. يتم عرض بعض الأمثلة على خلفية الشعر والشعيرات التي تمت إزالتها بواسطة SAX15ID في الشكل 3.


أنماط الحيود النموذجية خارج المركز لخمسة ثدييات مأخوذة على ChemMatCARS تظهر انعكاسات زوال تمتد إلى ما بعد انعكاس 5.15 نانومتر ، الترتيب 91 للشبكة 46.7 نانومتر. تعكس هذه الأنماط ثروة الانعراج من عينات الكيراتين هذه.

تم تحقيق تجانس البيانات وإزالة الخلفية باستخدام مجموعات من عدد من التقنيات المختلفة ، FIT2D و SAX15ID و MATLAB و ProcessFITS و IRAF و SAO. استخدم الأول والثالث عملية إزالة الخلفية المصممة في مختبري باعتبارها الطريقة الأكثر فاعلية في تحليل الكيراتين ، وفقًا لتقرير Wilk et al. [6]. في هذا الإجراء ، يتم تنعيم البيانات كما في الشكل 6.

تمت إزالة الخلفية باستخدام مزيج من MATLAB و Process عن طريق أخذ 20 نقطة أو أكثر على طول المنحنى وإيجاد أفضل ملاءمة كثيرة الحدود لهذه النقاط. كانت النتائج متشابهة جدًا لجميع الأنماط التي تم تحليلها لتلك التي تم الحصول عليها من حزم IRAF و SAO. تم الحصول أيضًا على مخططات الكثافة من شرائح 10 مم على جانبي المحاور الرأسية والأفقية باستخدام IRAF وتم قراءة وتسجيل مواضع وشدة جميع القمم من كل من هذه المؤامرات.

3. النتائج

3.1. نمط الزوال

ال الزوال نمط أي نمط حيود ليفي هو تراكب أنماط الحيود لجميع المشابك المنتهية واللانهائية في الاتجاه على طول الألياف مما يؤدي إلى ظهور شبكة فائقة عند وجود أكثر من شبكة واحدة. في أي شبكة فائقة ، شدة النقاط المختلفة على طول الشبكة هي إضافات مساهمات الموجة لجميع المشابك أو الناتجة عن كل من المراحل والشدة. يمكن تقليل الشدة الناتجة إلى قيم منخفضة جدًا خاصةً إذا كانت عوامل التشتت متشابهة أو كانت اختلافات الطور π راديان خارج المرحلة. تكون الشدة كبيرة فقط إذا تزامنت كل الحدود القصوى عند تلك النقطة. نمط الزوال من الصعب α-الكيراتين له انعكاسات قوية قليلة جدًا. أقوى القمم ذات الزاوية المنخفضة هو 67. هذه الذروة هي نتيجة الترتيب السابع الأقصى للشبكة 46.7 نانومتر ، الترتيب الثالث الأقصى للشبكة 19.67 نانومتر ، الترتيب الثاني للشبكة 12.4 نانومتر ، والرتبة الرابعة القصوى 27.2 نانومتر مع الترتيب التاسع كحد أقصى الشبكة 62.6 نانومتر بالقرب من قاعدة القمة الأقرب إلى مركز النمط مما تسبب في انتفاخ في القمة. الانعكاس عالي الكثافة 5.15 هو أيضًا مزيج من الحد الأقصى لكل هذه المشابك بما في ذلك الترتيب 91 للشبكة 46.7 نانومتر ، والحد الأقصى 39 من الرتبة 19.67 nm شعرية ، الترتيب 26 من 12.4 nm شعرية و 52nd - ترتيب الحد الأقصى من 27.2 نانومتر مع الحد الأقصى من الترتيب 121 للشبكة 62.6 نانومتر بالقرب من قاعدة الذروة على حافة الزاوية السفلية. ومع ذلك ، فإن النقاط 14 و 18 و 22 و 47 من الشبكة 62.6 نانومتر فريدة وقوية للغاية في جميع الأنماط.

معظم القمم المتبقية ضعيفة جدًا ولكن هناك أوامر فريدة من نوعها متوسطة الكثافة كافية لكل شبكة للتحقق بسرعة من وجود الشبكة. عند البحث عن الطلبات الضعيفة التي كانت موجودة ، كان من الضروري التمييز بين القمم الحقيقية والضوضاء. لهذا الغرض ، تم أخذ الأنماط لنفس العينة في نفس الموضع لمدة 10 ثوانٍ و 20 ثانية و 30 ثانية وتم رسمها على نفس الرسم البياني. إذا كان الانعكاس نقطة شعرية حقيقية ، فيجب أن تزداد الكثافة مع زيادة وقت التعرض. إذا لم يحدث ذلك فيجب اعتباره ضوضاء. باستخدام هذا المعيار لاختيار نقاط الشبكة الحقيقية ، تم تحديد موضع جميع القمم لجميع العينات. يتم تسجيل إجمالي عدد الطلبات الموجودة للشبكة 46.7 نانومتر والشبكة 62.6 نانومتر في الجدول 1.

تظهر بعض الانعكاسات الفردية الإضافية في مجموعات مختلفة من الحيوانات مثل الجرابيات والشعيرات ، لكن هذه الانعكاسات متراكبة على بنية الكيراتين وقد تتعلق بعينات أو استخدامات أخرى للشعيرات. لم تناقش هذه هنا.

3.2 النمط الاستوائي

قطعة من توزيع الكثافة في استوائي الاتجاه بعد إزالة الخلفية ، باستخدام قطع بعرض 1 مم على جانبي المحور من أجل catwhisker موضح في الشكل 4 (أ) مع تفاصيل المركز الواردة في الشكل 4 (ب) وتفاصيل الذروة 9.5 Å الواسعة في الشكل 4 (ج). These postbackground correction X-ray equatorial profiles (perpendicular to the length of the hair) were very well resolved for all samples including the area of the broad 9.5 Å peak. As can be seen from Figures 4(a) and 4(c) this broad peak is the resultant of three diffuse peaks and one sharp arc. This sharp arc is present in all samples and has been regarded by all investigators as the result of interference between the tightly coiled α-keratin polypeptide chains verifying the centre to centre distance between the α-keratin helices is approximately equal to the diameters of the individual helices [6, 17–19].


(أ)
(ب)
(ج)
(أ)
(ب)
(ج) These three patterns are background-corrected equatorial plots, taken over 1 mm on either side of the meridional axis. (a) shows the complete plot showing sets of “spots” and arcs. There were usually 9 spots, the one nearest the centre illustrated in (b) giving the centre to centre distance between the IFs. The other “spots” are the various orders of the Bessel functions from which the IF and tetramer (protofibril) radii can be calculated. In most cases there were six orders available to determine the IF radii and 2 for the tetramer radii. For most samples there were 8 arcs which index onto a spacing of

As can be seen from the corresponding diffraction pattern in Figure 3, the maxima in Figure 4 correspond to the series of dots and arcs in the diffraction pattern. Up to 8 orders of the arcs are present in the samples examined. These arcs, which index onto a spacing of

45 Å, were initially attributed to crystallised lipids but later identified more precisely as soaps (Briki et al. [16]). Since the arcs are not related to the α-keratin architecture, they fall outside the scope of this study.

The positions of the six to nine clearly visible spots on the equatorial intensity plots were recorded for each sample. The radii of the IFs, the tetramers, and the centre to centre spacings of the IFs were determined assuming sets of solid cylinders using a Bessel function analysis [6, 20–22]. The results obtained for each of these parameters for all samples are given in Table 2. The graphs of the Bessel function calculations of the IF radius and the tetramer radius for the fine hair of the 50-year-old elephant are given in Figures 5(a) and 5(b), respectively. In these graphs the Bessel function (

, is the pixel value of the relevant peak,

nm, = pixel value for 46.7 nm spacing. Figure 5(a) is the graph for the calculation of the IF radius and Figure 5(b) is the graph for the calculation of the tetramer radius. The slope of the graph gives the required radius in each case and


(أ)
(ب)
(أ)
(ب) These are typical examples of the first-order Bessel function graphs used to determine the radii of the IFs (a) and the tetramers (b). ال

-axis represent the Bessel functions, the

is the pixel value of the relevant peak,

= pixel value for 46.7 nm spacing. The slope of the line of best fit for each graph gives the required radius whilst


4. Discussion and Conclusion

The results in Table 1 confirm the presence of the two infinite lattices of the superlattice for all samples. For samples mounted centrally, although the fourth order was the first order resolvable,

orders of the 46.7 nm lattice and orders of the 62.6 nm lattice were present for all samples studied at APS, 50 orders of the 46.7 nm and 72 orders of the 62.6 nm for samples studied at the Photon Factory. When the samples were positioned off centre on ChemMatCARS so as to record higher orders, 119 orders of the 46.7 nm lattice and 158 orders of the 62.6 nm lattice were recorded. The peaks for these lattices were identified in series of plots along the meridional axes. The 4 : 3 relationships between these two lattice parameters give some superposition of these reflections but three quarters of the 62.6 nm peaks were unique to this lattice and resolvable. These results verify absolutely the presence of a 62.6 nm infinite lattice for all samples.

The results obtained from the Bessel function analysis of the equatorial intensity distribution are listed in Table 2. These results indicate very accurate values for the IF radii, the tetramer radius, and the distance apart of the helices. Other lattices also appeared in the mouse and cat whisker samples but were not common to other samples, so, have not been included in this analysis. The results verify that the required relationship between the radius of the intermediate filaments and the distance apart of the intermediate filaments required to validate the proposed architecture of the α-keratin also holds. The average value obtained for this ratio for the 27 samples was 3.0, standard deviation 0.04. These results verify the second requirement for this structure.

Since all results that are present in the fibre diffraction patterns must relate to any proposed architectural arrangement for the α-keratin intermediate filaments, the presence of the 62.6 nm lattice and the fact that the distance apart of the IFs is 3-times the IF radius must be explicable by any proposed structure in addition to the accepted 46.7 nm lattice and subsets of this lattice. The results presented here indicate that the model proposed by Feughelman and James in 1998 based on mechanical experimental results and fibre diffraction results certainly meets these criteria.

شكر وتقدير

The author would like to thank Dr. Helen Robertson of the Perth Zoo for providing me with the samples of the Australian marsupials, the orang-utans, and the 50-year-old elephant and her assistance with the Cites permits and Ms. Caroline Greentree, Taronga Zoo Sydney for providing me with the porcupine and echidna quill samples. I would like to acknowledge the financial support of the Whittington Hospital Postgraduate Research Fund, of The Courthouse Collection, WA, and of the Access to Major Research Facilities Program and the Australian Synchrotron research program, which are funded by the Commonwealth of Australia, for travel-related costs to enable the research at the various synchrotrons. The author would also like to acknowledge the generous support of the Photon Factory for use of Beamline BL15A, of the BioCAT and ChemMatCARS facilities (APS), Argonne National Laboratory, and for the assistance provided by the BioCAT director, professor T. Irvine, and the beamline staff of both facilities. The Advanced Photon Source is supported by the US Department of Energy, Basic Energy Sciences, Office of Science under Contract no. W-31-109-ENG-38 W-31-109-Eng-38. BioCAT is a National Institute of Health-supported research centre RR-08630. I am deeply grateful to associate professor David Miller and Dr. Marlene Read (UNSW, Australia) and Dr. Murugesan (Whittington Hospital, UK) for their efficient help in the data collection at APS.

مراجع

  1. A. Guinier, “X-ray diffraction,” in Crystals, Imperfect Crystals, and Amorphous Bodies, W. H. Freeman and Company, Eds., chapter 8, pp. 254–257, Paris, France, 1956. View at: Google Scholar
  2. R. D. B. Fraser and T. P. MacRae, “Surface lattice in α-keratin filaments,” International Journal of Biological Macromolecules، المجلد. 10 ، لا. 3, pp. 178–184, 1988. View at: Google Scholar
  3. R. D. B. Fraser and T. P. MacRae, “Intermediate filament structure,” Bioscience Reports، المجلد. 5 ، لا. 7, pp. 573–579, 1985. View at: Google Scholar
  4. R. D. B. Fraser and T. P. MacRae, “The structure of the α-keratin microfibril,” Bioscience Reports، المجلد. 3 ، لا. 6, pp. 517–525, 1983. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  5. M. C. Lawrence, “Modelling the surface lattice of α-keratin filaments,” International Journal of Biological Macromolecules، المجلد. 11 ، لا. 5, pp. 285–289, 1989. View at: Google Scholar
  6. K. E. Wilk, V. J. James, and Y. Amemiya, “The intermediate filament structure of human hair,” Biochimica et Biophysica Acta، المجلد. 1245, no. 3, pp. 392–396, 1995. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  7. V. J. James, K. E. Wilk, J. F. McConnell, E. P. Baranov, and Y. Amemiya, “Intermediate filament structure of α-keratin in baboon hair,” International Journal of Biological Macromolecules، المجلد. 17 ، لا. 2, pp. 99–104, 1995. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  8. V. J. James, L. Delbridge, S. V. McLennan, and D. K. Yue, “Changes in the molecular structure of hair in insulin dependent diabetes,” Biochemical and Biophysical Research Communications، المجلد. 233, pp. 76–80, 1997. View at: Google Scholar
  9. M. Feughelman and V. James, “Hexagonal packing of intermediate filaments (microfibrils) in α-keratin fibers,” مجلة بحوث النسيج، المجلد. 68 ، لا. 2, pp. 110–114, 1998. View at: Google Scholar
  10. V. J. James and Y. Amemiya, “Intermediate filament packing in α-keratin of echidna quill,” مجلة بحوث النسيج، المجلد. 68 ، لا. 3, pp. 167–170, 1998. View at: Google Scholar
  11. V. J. James, “Fibre diffraction from a single hair can provide an early non-invasive test for colon cancer,” Medical Science Monitor، المجلد. 9 ، لا. 8, pp. MT79–MT84, 2003. View at: Google Scholar
  12. M. Feughelman, B. Willis, and V. James, “The Tetrameric Structure of the Intermediate Filaments of Alpha-Keratin Fibres,” in Proceedings of the 11th International Wool Research Conference، المجلد. 65Fi, Fibres, 2005. View at: Google Scholar
  13. F. H. C. Crick, “The Packing of the alpha-helices: simple coiled coils,” Acta Crystallographica، المجلد. 6, pp. 689–697, 1953. View at: Google Scholar
  14. M. Feughelman, “Mechanical hysteresis in wool Keratin fibres,” Journal of Macromolecular Science: Physics B، المجلد. 7 ، لا. 3, pp. 569–582. عرض على: الباحث العلمي من Google
  15. L. M. Dowling, W.G. Crewther, and D. A. D. Parry, “Secondary structure of component 8c-1 of alpha-Keratin,” Biochem J.، المجلد. 236, no. 3, pp. 705–712, 1986. View at: Google Scholar
  16. F. Briki, C. Mérigoux, F. Sarrot-Reynauld et al., “Evidence for calcium soaps in human hair shaft revealed by sub-micrometer X-ray fluorescence,” Journal De Physique. رابعا، المجلد. 104, pp. 337–340, 2003. View at: Google Scholar
  17. R. D. Fraser, T. P. MacRae, and A. Miller, “The Fourier transform of the coiled-coil model for α-keratin,” Acta crystallographica، المجلد. 17, pp. 813–816, 1964. View at: Google Scholar
  18. R. D. Fraser, T. P. MacRae, A. Miller, and E. Suzuki, “The quantitative analysis of fibril packing from electron micrographs,” مجلة البيولوجيا الجزيئية، المجلد. 9, pp. 250–252, 1964. View at: Google Scholar
  19. M. E. Rafik, J. Doucet, and F. Briki, “The intermediate filament architecture as determined by X-ray diffraction modeling of hard α-keratin,” Biophysical Journal، المجلد. 86, no. 6, pp. 3893–3904, 2004. View at: Publisher Site | منحة جوجل
  20. G. Oster and D. P. Riley, “Scattering from cylindrically symmetric systems,” Acta Crystallographica، المجلد. 5, pp. 272–276, 1952. View at: Google Scholar
  21. R. D. B. Fraser and T. P. Macrae, “Structural implications of the equatorial X-ray diffraction pattern of α-keratin,” Biochimica et Biophysica Acta، المجلد. 29 ، لا. 2, pp. 229–240, 1958. View at: Google Scholar
  22. E. F. Eikenberry, B. Brodsky, and D. A. D. Parry, “Collagen fibril morphology in developing chick metatarsal tendons: I. X-ray diffraction studies,” International Journal of Biological Macromolecules، المجلد. 4 ، لا. 6, pp. 322–328, 1982. View at: Publisher Site | منحة جوجل

حقوق النشر

Copyright © 2011 Veronica James. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط الاستشهاد بالعمل الأصلي بشكل صحيح.


Identification of the major 68,000-dalton protein of microtubule preparations as a 10-nm filament protein and its effects on microtubule assembly in vitro

مشاهدات المقالات هي مجموع تنزيلات النصوص الكاملة للمقالات المتوافقة مع COUNTER منذ نوفمبر 2008 (بتنسيق PDF و HTML) عبر جميع المؤسسات والأفراد. يتم تحديث هذه المقاييس بانتظام لتعكس الاستخدام حتى الأيام القليلة الماضية.

الاقتباسات هي عدد المقالات الأخرى المقتبسة من هذه المقالة ، ويتم حسابها بواسطة Crossref ويتم تحديثها يوميًا. اعثر على مزيد من المعلومات حول عدد الاقتباسات من Crossref.

درجة الانتباه Altmetric هي مقياس كمي للانتباه الذي تلقته مقالة بحثية عبر الإنترنت. سيؤدي النقر فوق رمز الكعكة إلى تحميل صفحة على altmetric.com تحتوي على تفاصيل إضافية حول النتيجة ووجود وسائل التواصل الاجتماعي للمقالة المحددة. يمكنك العثور على مزيد من المعلومات حول "نقاط الانتباه البديلة" وكيفية احتساب النتيجة.

ملحوظة: بدلاً من الملخص ، هذه هي الصفحة الأولى للمقالة.


أساليب

Specimens of the collembolan species Isotomurus maculatus (Arthropoda, Schäffer 1986) were collected in the neighbourhood of Siena and dissected in phosphate buffered saline (PBS 171 mM NaCl, 6 mM Na phosphate, 3 mM KCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, pH 7.4). Midguts were then processed for electron microscopy, protein analysis, RNA extraction and immunomicroscopy as described below.

Cytoskeletal preparations

Midgut cytoskeletal insoluble fractions were obtained following the procedure described by Pruss وآخرون. [32]. Briefly, 300-500 midguts were homogenized in a volume of 1.5 mL of PBS added with a cocktail of protease inhibitors (P2714, Sigma, NY, USA) and centrifuged at 10,000 ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. The sediment was then extracted in 1.5 mL of PBS containing 0.6 M KCl and 0.5% Triton X-100 and centrifuged as above. The resulting pellet was washed twice in PBS and then either fixed for electron microscopy analysis or denatured for successive sodium dodecyl sulphate (SDS)-acrylamide gel electrophoresis.

Gel electrophoresis and immunoblot

Electrophoretic analysis of cytoskeletal fractions was carried out on 8% or 12% SDS-polyacrylamide gels according to the method used by Laemmli [33]. Gels were either stained using standard Coomassie blue staining procedures or transferred onto nitrocellulose for subsequent immunoblot analysis.

Electrophoretic transfer of proteins onto nitrocellulose was performed as described by Towbin وآخرون. [34], using a modified transfer buffer, consisting of 50 mM Tris, 38 mM glycine and 5% methanol. Transferred protein bands were immunostained using the affinity-purified anti-isomin polyclonal antibody (see below) and a peroxidase-labelled anti-rabbit secondary antibody (Cappel, PA, USA). Blots were then processed for ECL detection (GE Healthcare, NJ, USA), with exposure times from 5 s to 5 min.

Protein analysis by mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS)

Analysis by mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) of the main tryptic fragments obtained by digestion of the isomin band was performed by the Swiss-2D Service (Geneva, Switzerland) the obtained peptide aminoacid sequences are listed in Additional File 1, Table S1.

RNA preparation and RT-PCR

Total RNA was isolated from adults of I. maculatus frozen in liquid nitrogen and homogenized using a Polytron homogenizer (Kinematica AG, Littau, Switzerland) according to the method described by Chomczynski and Sacchi [35]. RNAs (1 μg) were converted to cDNAs with an oligo(dT)18 primer and SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, CA, USA) according to manufacturer's instructions. Forward and reverse degenerate primers were designed on the basis of three amino acid sequences obtained by mass spectrometry: (B1-B2) YEAEAAK, (C1-C2) ESTGDAE and (D1-D2) FGHADQEK. Their sequences are listed in Additional File 1, Table S1. A partial 360 bp fragment of the isomin protein was amplified by RT-PCR using the combination B2/D1 of degenerate primers. Reactions were performed using Expand High Fidelity PCR System (Roche, Basel, Switzerland) under the following conditions: 95°C for 10 min cycles 1-5: 94°C for 1 min, 35°C for 1 min, 72°C for 1 min cycles 6-46: 94°C for 1 min, 54°C for 1 min, 72°C for 1 min and 72°C for 10 min. PCR products were purified using Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, WI, USA), cloned into a TA cloning vector (Invitrogen) and sequenced using a CEQ 8000XL automated DNA Analysis System (Beckman Coulter, CA, USA) on both strands. The 360 bp deduced amino acid sequence showed the complete sequences used to design B2 and D1 degenerate primers plus an additional one corresponding to the mass spectrometry fragment 5 (Additional File 1, Table S1).

Cloning of full length cDNA by rapid amplification of the complementary DNA ends (RACE)

In order to obtain the full-length cDNA for isomin, a 5' and 3' RACE was performed on I. maculatus total RNA using a GeneRacer™ Kit (Invitrogen) and following manufacturer's instructions. Isomin specific primers - D1_FEcoRI, Iso112_for (3' nested primer Additional File 1, Table S1) used in 3' amplification, B2_RBamHI and iso577_rev (5' nested primer Additional File 1, Table S1) used in 5' amplification - were designed based on the partial 360 bp sequence mentioned above. Both nested PCR reactions gave a single product of ≈1200 bp and ≈ 500 bp, respectively. The 5' and 3' RACE products were purified, cloned and sequenced as described above. The complete isomin cDNA sequence has been deposited in GenBank under accession number FJ264504.

تحليل التسلسل

Homology searches for nucleotide and amino acid sequences were performed using the BLAST suite of programs (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Programs employed for the prediction of molecular domains implicated in coiled coils formation were Coils (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html) and Marcoil (http://bioinf.wehi.edu.au/folders/mauro/Marcoil/index.html) sequence alignments were obtained using ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Prediction of phosphorylated sites and of sumoylated residues was performed using NetPhos 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) and SUMOsp 2.0 (http://sumosp.biocuckoo.org/prediction.php), respectively. Distance analysis of protostome cytoplasmic IF sequences was carried out using the Protdist and Neighbor programs of the Phylip package (JTT matrix, 100 bootstrap replicates) available at the Pasteur Institute web server (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py).

Bacterial expression of recombinant protein

For the preparation of the glutathione S-transferase (GST) fusion constructs, either a portion (360 bp, coding the protein region from Phe11 to Lys131) or the whole isomin protein coding region (1236 bp) were amplified by PCR. Oligonucleotide pairs containing sites for in-frame directional cloning in the pGEX-6P-2 vector (GE Healthcare, NJ, USA) were: D1_FBamHI/B2_RSmaI for the 360 bp fragment and isoml_BamHI/isoml_SmaI for the 1236 bp one (Additional File 1, Table S1). PCR cycling, for the short fragment amplification, included an initial denaturation at 94°C for 5 min followed by 40 cycles of 94°C for 1 min, 52°C for 1 min, 72°C for 1 min and a final extension step at 72°C for 10 min. The 1236 bp region was amplified under the same PCR conditions but with an annealing temperature of 56°C. The PCR products were cloned into the BamHI and SmaI sites of the bacterial expression vector pGEX-6P-2 (GE Healthcare, NJ, USA) in frame with the upstream gene GST. Expression of the fusion protein was induced in بكتريا قولونية by addition of Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG see below).

Purification of the fusion protein and production of specific antibodies

Recombinant bacterial strains expressing the fusion protein - either the whole isomin molecule or its 120 aa fragment from Phe11 to Lys131 (see Additional File 2, Figure S1) - were grown at 37°C in 400 mL of Luria-Bertani (LB) medium added with 50 μg/mL of ampicillin, until an OD600 of about 0.6-0.8 is achieved. After the addition of IPTG to a final concentration of 0.1 mM, the culture was incubated at 37°C for 2 h under shaking. Cells were harvested by centrifugation at 3500 ز for 10 min, resuspended by vortexing in 25 mL of B-PER™ reagent (Pierce) and shaken at room temperature for 10 min soluble proteins were separated by insoluble material by centrifugation at 27000 ز لمدة 15 دقيقة.

Most part of the fusion protein was contained in inclusion bodies. Only in the case of the 120 aa fragment it was possible to recover an amount of soluble protein sufficient for the subsequent purification by affinity chromatography on Gluthatione Sepharose 4B (GE Healthcare, NJ, USA). This procedure was carried out according to manufacturer's instructions. Briefly, the recovered soluble fraction was added with 1 mL of a 50% slurry of resin and incubated for 1 h with gentle agitation. Resin was then collected by centrifugation at 500 ز for 5 min and washed twice in PBS. Protein bound to the resin was eluted with 10 mM glutathione in 50 mM Tris-HCl pH 8.0, dialyzed against 0.9% NaCl and used for rabbit immunization following standard procedures. The resulting polyclonal antibodies were blot-affinity purified according to Tang (36), using nitrocellulose membrane fragments containing the isomin 40 kDa protein band.

Isomin في المختبرreassembly

Recombinant isomin was essentially recovered in the insoluble inclusion bodies. For their purification, the insoluble pelleted material obtained from a 50 mL-culture after cell lysis was resuspended by vortexing in 5 mL B-PER™, added with 200 μg/mL lysozime and incubated at room temperature for 5 min. The suspension was then added with 15 mL of B-PER™ diluted 1:10 in 20 mM Tris pH 7.5 and centrifuged for 15 min at 27000 ز. Pelleted inclusion bodies were washed twice in B-PER™ diluted 1:10 in 20 mM Tris pH 7.5, then twice in 2% TRITON 10 mM EDTA. The final pellet essentially consisted of a band of about 66 kDa, corresponding to the recombinant protein (Additional File 5, Figure S4A). For cleavage of the GST moiety, pelleted inclusion bodies were thoroughly resuspended at about 75 μg/mL in a buffer consisting of 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.0, added with 10 U of PreScission Protease (GE Healthcare, NJ, USA) and incubated at 5°C for 20 h. After centrifugation at 8000 ز for 20 min, both supernatant and sediment fractions were analysed by SDS-page (Additional File 5, Figure S4B) most part of the recombinant protein was shown to be cleaved and still to be contained in the insoluble fraction, while the GST protein was recovered in the soluble fraction.

The insoluble pellet recovered after cleavage was dissolved in 10 mM Tris, 9.5 M urea, pH 7.0 and incubated for 1 h at room temperature. After centrifugation for 1 h at 150000 ز, analysis by SDS-page of the soluble and insoluble fractions revealed that urea treatment solubilised about 50% of the isomin protein (Additional File 5, Figure S4C). As described by Herrmann وآخرون. [24], urea-solubilized protein was then dialyzed against a series of solutions (1 h each) containing decreasing concentrations (8 M, 6 M, 4 M, 2 M) of urea dissolved in 5 mM Tris, 0.1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH8.4 and, finally, against the same buffer containing no urea. After dialysis, the sample was added with an appropriate volume of 10× reassembly buffer (0.2 M Tris, 0.5 M NaCl, pH 7.0), incubated for 1 h at room temperature and then centrifuged at 150000 ز لمدة 1 ساعة. Sediment and supernatant were analysed by both SDS-page and negative staining.

Immunomicroscopy

For immunofluorescence microscopy, midguts were fixed in absolute ethanol for 1 h at 4°C and then paraffin-embedded. After rehydration, sections were treated with 1% NaBH4 for 30 min to quench autofluorescence and washed twice for 5 min with PBS. Successively, sections were incubated for 1 h in PBS containing 3% bovine serum albumine and 0.5% Tween-20, and for 2-4 h in the affinity-purified primary antibody. After two 10-min washes in PBS containing 0.1% Tween-20, sections were incubated for 1 h in the secondary antibody (fluorescein-conjugated anti-rabbit antibodies, Cappel), washed again in PBS-T and finally mounted in 90% glycerol.

المجهر الإلكتروني

Whole midguts or midgut TRITON-resistant fractions were fixed with glutaraldehyde and tannic acid, post fixed with uranyl acetate and embedded in an Epon/Araldite mixture as previously described in [37]. Before observation by TEM, thin sections were routinely stained with uranyl acetate and lead citrate.

For post-embedding electron microscopy immunolocalization, whole midguts were fixed at 4°C for 2 h in 0.1 M phosphate buffer (PB) pH 7.2, containing 0.2% glutaraldehyde and 2% p-formaldehyde, rinsed overnight in PB, dehydrated at 4°C in a graded ethanol series and embedded in Lowicryl K4M as described in [38]. For immunogold staining, sections were saturated with 3% bovine serum albumin (BSA), 15% normal serum in PBS (2 h), treated with 20 mM glycine in PBS (20 min), and then incubated overnight at 4°C in the primary antibody diluted in PBS containing 0.2% BSA. After one 10-min wash with PBS containing 0.5% Tween 20 and five 10-min washes in PBS, sections were incubated for 1 h at room temperature in the secondary antibody (GAM IgG-G10, Biocell, Cardiff, Wales, UK). Grids were then washed 5 × 10 min in PBS and 5 × 10 min in distilled water, then counterstained as above reported. All the ultrathin sections were observed at a Philips CM10 EM operating at 80 kV.


شاهد الفيديو: الهيكل الخلوي - Cytoskeleton (كانون الثاني 2022).