معلومة

ما هي المشاكل في استخدام ssDNA أو mRNA للتعبير بدلا من استخدام البلازميد؟


لنفترض أنك تريد إجراء تجربة استنساخ الجينات. لديك ناقل تعبير فارغ (mRNA أو DNA) وتتطلع إلى استنساخ بعض الجين X فيه. لماذا يمكنك فقط شراء X بالفعل داخل ناقل (والذي يكون بدوره غالبًا داخل ناقل بكتيري)؟

ما هي مشكلة التعامل مع نيوكليوتيدات الرنا المرسال النقية للجين X؟ أو حتى sscDNA؟


ما هي مشكلة التعامل مع نيوكليوتيدات الرنا المرسال النقية للجين X؟ أو حتى sscDNA؟

مشاكل في التحويل المباشر لـ mRNA / ssDNA

يمكن نقل mRNAs إلى الخلايا ويتم إجراؤه بشكل متكرر. تكمن مشكلة تحويل mRNAs مباشرة في أن mRNA يتحلل قريبًا ولن يكون لديك تعبير مستدام. ومع ذلك ، يعد هذا مفيدًا جدًا في بعض الحالات مثل إنشاء الخلايا الجذعية ذات القدرة الجنبية المستحثة (iPSCs) حيث لا تريد للخلايا أن تعبر باستمرار عن عوامل Yamanaka (بعضها أيضًا من الجينات الورمية).

أيضًا ، فإن الحمض النووي الريبي في حد ذاته معرض تمامًا للتحلل. من الأسهل بكثير تحضير حلول الحمض النووي وتخزينها لفترة طويلة.

تنشأ مشاكل مماثلة مع ssDNA.

لماذا يمكنك فقط شراء X بالفعل داخل ناقل (والذي يكون بدوره غالبًا داخل ناقل بكتيري)؟

إحدى الميزات الرائعة لاستخدام البلازميدات هي أنه يمكنك نشر الجين الخاص بك إلى ما لا نهاية. إذا تم إعطاؤك كمية ثابتة من mRNA بدلاً من ذلك ، فسوف ينفد منك قريبًا. يمارس بعض البائعين مثل هذه السياسات الرأسمالية الجشعة: P

عندما تقوم بتضخيم الحمض النووي باستخدام PCR ، فإن الاستنساخ له مزايا إضافية:

  • يمكنك تسلسل الجين باستخدام بادئات قياسية جيدة (مثل T7)
  • يمكنك صنع بنيات يمكنها التعبير عن الجين بشروط

لديك ناقل تعبير فارغ (mRNA أو DNA) وتتطلع إلى استنساخ بعض الجين X فيه.

لا يمكنك استنساخ شيء ما بسهولة داخل الحمض النووي الريبي. أنت بحاجة إلى نوكليازات محددة من الحمض النووي الريبي. علاوة على ذلك ، فإن عملية الهضم المزدوجة ستكون كارثية في هذه الحالة.

لماذا لا يبيع البائعون بشكل عام إدراج dsDNA بل يقدمونه مستنسخًا في بلازميد

  • يكون dsDNA الدائري أكثر استقرارًا
  • يمكن للبائعين الاحتفاظ بمخزون الملحق للعملاء المستقبليين دون الحاجة إلى إجراء PCR مرة أخرى
  • يمكن تضخيم الإدخال المستنسخ عبر مزارع بكتيرية للحصول على كميات عالية جدًا (محضرات ماكسي / جيجا)

مشاكل الواجبات المنزلية - وحدة تعلم الأدب: عامل النسخ Ikaros يثبط بروتين فوسفاتيز 2A

  • بمساهمة هنري جاكوبوفسكي
  • أستاذ (كيمياء) بكلية القديس بنديكت / ش. جامعة جون

تحتوي هذه الصفحة على أسئلة التقييم / الاختبار باستخدام البيانات والأشكال والرسوم البيانية من المجلات البحثية مثل Journal of Biological Chemistry التي تسمح باستخدامها ، أو من المجلات مثل PLOS التي يمكن الوصول إليها تمامًا. فهم الطلاب للمفاهيم التأسيسية للجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية (ASBMB) وأهداف التعلم بالإضافة إلى المفاهيم والأهداف التأسيسية لـ MCAT2015. تتداخل هاتان المجموعتان من المعايير على نطاق واسع. يركز كل من ASBMB و MCAT2015 بشدة على مهارات البحث والاستدلال العلمي ، والتي ربما يتم تقييمها بشكل أفضل من خلال الأسئلة المفتوحة المستمدة من الأدبيات التي يجب على الطلاب فيها توظيف مهارات بلوم عالية المستوى في التطبيق والتحليل.

يمكن أيضًا استخدام هذه الأسئلة من قبل الطلاب الذين يبحثون عن المزيد من الفرص لممارسة تفسير نتائج المؤلفات البحثية. تعد القدرة على تطبيق المعلومات والمفاهيم وتحليلها وتقييمها في صميم البحث العلمي ومهارات التفكير المنطقية التي تعتبر أساسية لمعايير الكفاءة ASBMB و MCAT2015 الجديدة. تم تصميم الأسئلة في وحدة التعلم هذه لتقييم هذه الكفاءات باستخدام إجابات مفتوحة بدلاً من أسئلة الاختيار من متعدد. يمكن العثور على الإجابات على الرابط أسفل هذه الصفحة.


يشتمل إصدار Guide-it Long ssDNA Production System v2 على تحسينات تتيح معالجة أكثر كفاءة للقوالب الصعبة ، وتوفر عوائد أعلى من ssDNA ، وتسمح ببروتوكول أبسط مقارنة بمجموعات مجموعات ssDNA من الجيل الأول (Cat. # 632644 ، 632645). *

تم تحسين جيل ssDNA باستخدام الإصدار 2 من Guide-it Long ssDNA Production System. صورة جل تُظهر مادة بدء dsDNA (المسار 1) والحس (SS) أو منتجات ssDNA المضادة للتحسس (AS) للعديد من قوالب HDR التي تم إنشاؤها باستخدام الإصدارات الأصلية (v1) أو المحدثة (v2) من Guide-it Long ssDNA Production System ( حارة 2 وحارة 3 ، على التوالي). تم تحديد قوالب dsDNA المضمنة في هذا التحليل على أنها ركائز صعبة لتوليد ssDNA باستخدام مجموعة الدليل v1. تم تحليل dsDNA و ssDNA عبر الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز باستخدام بروميد الإيثيديوم كعامل تلطيخ. تعمل منتجات ssDNA بوزن جزيئي أصغر من ركائز dsDNA المقابلة. في جميع الحالات ، أنتج نظام الإنتاج Guide-it Long ssDNA v2 نطاقًا أنظف من ssDNA مقارنة بالإصدار السابق من المجموعة ، مما يشير إلى عملية هضم أكثر اكتمالًا وتوحيدًا.

* يرجى ملاحظة أنه مع إطلاق الإصدار 2 من Guide-it Long ssDNA Production System ، تم إيقاف مجموعات Guide-it ssDNA الأصلية (Cat. # 632644 ، 632645).

معلومات المنتج الإضافية

يرجى الاطلاع على شهادة تحليل المنتج للحصول على معلومات حول ظروف التخزين ومكونات المنتج والمواصفات الفنية. يرجى الاطلاع على قائمة مكونات المجموعة لتحديد مكونات المجموعة. توجد شهادات التحليل وقوائم مكونات الأدوات ضمن علامة التبويب "المستندات".


ناقل التعبير الجيني للفيروس القهقري MMLV

يُعد نظام ناقلات الفيروسات القهقرية MMLV وسيلة فعالة لإدخال الجينات بشكل دائم في خلايا الثدييات. أصبح شائعًا بشكل خاص كطريقة توصيل الجينات لصنع خلايا iPS.

تُشتق نواقل الفيروس القهقرية MMLV من فيروس ابيضاض الدم في الفئران المولوني ، وهو عضو في عائلة الفيروسات القهقرية. يحتوي فيروس Wildtype MMLV على جينوم RNA خطي زائد حبلا.

يتم إنشاء ناقلات الفيروس الارتجاعي MMLV أولاً كبلازميد في الإشريكية القولونية. ثم يتم نقله إلى خلايا التعبئة مع العديد من البلازميدات المساعدة. داخل خلايا التغليف ، يتم نسخ ناقل الحمض النووي الموجود بين التكررين الطرفيين الطويل (LTRs) إلى RNA ، والبروتينات الفيروسية التي يتم التعبير عنها بواسطة البلازميدات المساعدة تقوم بتجميع الحمض النووي الريبي في فيروس. ثم يتم إطلاق الفيروس الحي في المادة الطافية ، والتي يمكن استخدامها لإصابة الخلايا المستهدفة مباشرة أو بعد التركيز.

عند إضافة الفيروس إلى الخلايا المستهدفة ، يتم نقل شحنة الحمض النووي الريبي إلى الخلايا حيث يتم نسخها عكسيًا إلى الحمض النووي ويتم دمجها بشكل عشوائي في جينوم المضيف. يتم إدخال أي جين (جينات) تم وضعه بين اثنين من LTRs أثناء استنساخ ناقلات الأمراض بشكل دائم في الحمض النووي للمضيف جنبًا إلى جنب مع بقية الجينوم الفيروسي.

حسب التصميم ، تفتقر نواقل الفيروس القهقري MMLV إلى الجينات المطلوبة للتغليف والتحول الفيروسي (يتم نقل هذه الجينات بواسطة البلازميدات المساعدة أو دمجها في خلايا التعبئة بدلاً من ذلك). نتيجة لذلك ، تتمتع الفيروسات التي يتم إنتاجها من النواقل بخاصية الأمان المهمة المتمثلة في عدم كفاءة النسخ المتماثل (مما يعني أنها يمكن أن تنقل الخلايا المستهدفة ولكن لا يمكنها التكاثر فيها).

لمزيد من المعلومات حول نظام المتجهات هذا ، يرجى الرجوع إلى الأوراق أدناه.

مراجع عنوان
إكسب هيماتول. 31: 1007 (2003) إعادة النظر
ياء فيرول. 61: 1639 (1987) تزيد إشارة التعبئة الممتدة من عيار نواقل MMLV
الجين هناك. 7: 1063 (2000) يعتمد مدار نواقل MMLV على خطوط خلايا التعبئة
نات بروتوك. 6: 346 (2011) يعتمد مدار نواقل MMLV على بلازميدات التعبئة

تم تحسين ناقلنا من أجل تكرار عدد النسخ العالي في E. coli ، والتعبئة عالية العيار للفيروس الحي ، ونقل الفيروس الفعال لمجموعة واسعة من الخلايا ، والتكامل الفعال للناقل في جينوم المضيف ، والتعبير الجيني عالي المستوى.

التكامل الدائم للحمض النووي الناقل: ينتج عن تعداء العدوى التقليدية تسليم عابر للحمض النووي إلى الخلايا المضيفة بسبب فقدان الحمض النووي بمرور الوقت. هذه المشكلة بارزة بشكل خاص في الخلايا سريعة الانقسام. في المقابل ، يمكن أن تنقل الفيروسات القهقرية الجينات بشكل دائم إلى الخلايا المضيفة بسبب تكامل الناقل الفيروسي في جينوم المضيف.

مدارية واسعة: يضيف نظام التغليف الخاص بنا بروتين المغلف VSV-G إلى السطح الفيروسي. هذا البروتين له استوائية واسعة. نتيجة لذلك ، من الأنواع الشائعة الاستخدام للثدييات مثل الإنسان والفأر والفئران يمكن أن تنتقل. علاوة على ذلك ، يمكن نقل العديد من أنواع الخلايا ، على الرغم من أن ناقلنا يواجه صعوبة في تحويل الخلايا غير المنقسمة (انظر العيوب أدناه).

مساحة تخزين كبيرة: جينوم الفيروس القهقرى MMLV من النوع wildtype هو

8 كيلو بايت. في ناقلاتنا ، تشغل المكونات الضرورية للتغليف والتوصيل الفيروسي

5.5 كيلو بايت لاستيعاب الحمض النووي للفائدة للمستخدم. نظرًا لأن المتجه الخاص بنا مصمم لإدخال ORF فقط ، فإن مساحة الشحن هذه كافية لمعظم التطبيقات.

تعبير عالي المستوى: يحتوي 5 'LTR على مروج قوي في كل مكان يقود تعبيرًا عالي المستوى عن جين اهتمام المستخدم.

التوحيد النسبي لتسليم الجينات: بشكل عام ، يمكن للتنقل الفيروسي توصيل النواقل إلى الخلايا بطريقة موحدة نسبيًا. في المقابل ، يمكن أن يكون تعداء العدوى التقليدي لناقلات البلازميد غير منتظم إلى حد كبير ، حيث تتلقى بعض الخلايا الكثير من النسخ بينما تتلقى الخلايا الأخرى نسخًا قليلة أو لا تتلقى أي نسخ.

الفعالية في المختبر وفي الجسم الحي: في حين أن ناقلنا يستخدم في الغالب في نقل الخلايا المستنبتة في المختبر ، فإنه يمكن أيضًا استخدامه لنقل الخلايا في الحيوانات الحية.

أمان: يتم ضمان سلامة ناقلنا من خلال تقسيم الجينات المطلوبة للتغليف والتحول الفيروسي إلى عدة بلازميدات مساعدة أو دمجها في خلايا التعبئة. نتيجة لذلك ، فإن الفيروس الحي الناتج عن ناقلنا غير كفء في النسخ المتماثل.

سلبيات

الاعتماد على مروج 5 'LTR: إن التعبير عن الجين الذي يهمنا في ناقلنا يكون مدفوعًا بوظيفة المروج في كل مكان في 5 'LTR. هذا هو عيب واضح بالمقارنة مع ناقلات الفيروسة البطيئة لدينا والتي تسمح للمستخدم بوضع محفز خاص به لدفع الجينات التي تهمهم.

عيار فيروسي معتدل: العيار الفيروسي من وصول ناقلنا

10 7 TU / ml في المادة الطافية لخلايا التعبئة بدون تركيز إضافي. هذا يتعلق بترتيب حجم أقل من نواقل الفيروسة البطيئة.

صعوبة تحويل الخلايا غير المنقسمة: يواجه ناقلنا صعوبة في تحويل الخلايا غير المنقسمة.

التعقيد التقني: يتطلب استخدام ناقلات الفيروسات القهقرية MMLV إنتاج فيروس حي في خلايا التعبئة متبوعًا بقياس العيار الفيروسي. هذه الإجراءات تتطلب الكثير من الناحية الفنية وتستغرق وقتًا طويلاً مقارنةً بترنسفكأيشن البلازميد التقليدي.

المكونات الرئيسية

MMLV 5 'LTR: MMLV retrovirus 5 'تكرار المحطة الطرفية. في wildtype MMLV retrovirus ، 5 'LTR و 3' LTR متطابقة بشكل أساسي في التسلسل. يقيمون على طرفي الجينوم الفيروسي ويشيران في نفس الاتجاه. عند التكامل الفيروسي ، يتم نسخ تسلسل 3 'LTR إلى 5' LTR. تحمل LTRs كلاً من المروج ووظيفة polyadenylation ، بحيث تعمل 5 LTR كمحفز لدفع نسخ الجينوم الفيروسي ، بينما تعمل LTR 3 كإشارة polyadenylation لإنهاء نسخة المنبع.

& حزمة Psi plus 2: إشارة تعبئة الفيروسات القهقرية MMLV مطلوبة لتعبئة الحمض النووي الريبي الفيروسي في الفيروس.

كوزاك: تسلسل إجماع كوزاك. يتم وضعه أمام كودون البداية لـ ORF ذي الأهمية لأنه يُعتقد أنه يسهل بدء الترجمة في حقيقيات النوى.

ORF: يتم وضع إطار القراءة المفتوح للجين الذي يهمك هنا. إن تعبيرها مدفوع بوظيفة المروج في كل مكان في 5 'LTR.

MMLV 3 'LTR: MMLV retrovirus 3 'تكرار المحطة الطرفية. تعمل إشارة polyadenylation الموجودة في 3 'LTR على إنهاء النسخة من ORF المنبع.

PUC ori: أصل pUC للنسخ المتماثل. توجد البلازميدات التي تحمل هذا الأصل بأعداد نسخ عالية في الإشريكية القولونية.

الأمبيسلين: جين مقاومة الأمبيسلين. يسمح بالحفاظ على البلازميد عن طريق اختيار الأمبيسلين في الإشريكية القولونية.


يمكن علاج بعض طفرات CFTR بدون علاجات RNA

تقع معظم أهداف الجينات في مكان ما على طيف بين TTR ، وهو مثالي ، والسرطان غير المستقر وراثيًا ، وهو ليس مثاليًا. أحد الأمثلة على ذلك هو التليف الكيسي ، وهو مرض ناجم عن طفرات جسمية متنحية في CFTR، الموجود على الكروموسوم 7 (الشكل 1 أ). 21 في الولايات المتحدة ، تم تشخيص إصابة حوالي 1 من كل 2500 طفل من القوقاز بالمرض ، لوحظ انخفاض حالات الإصابة في كل من السكان الأمريكيين من أصل أفريقي والآسيويين. 22 تحسنت التوقعات بشكل ملحوظ منذ اكتشاف المرض بينما لا يزال أقل بكثير من الشخص المصاب بالتليف الكيسي ، ومتوسط ​​العمر المتوقع الآن يتجاوز 40 عامًا ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى تطوير العلاجات التي تدير الالتهابات البكتيرية ، وتحل محل إنزيمات البنكرياس ، وتعزز امتصاص المغذيات ، و تسهيل تطهير الصدر من المخاط السميك 23،24

هناك العديد CFTR الأنماط الجينية الطافرة مؤخرًا ، قدر العلماء أن أكثر من 1000 اختلاف جيني في CFTR يتم تمثيل الجين في أقل من خمسة مرضى لكل منهم في جميع أنحاء العالم. 25 ومع ذلك ، يمكن تجميع هذه المجموعة من الطفرات في ست فئات فقط ، وتتميز بالتأثير على بروتين CFTR والنمط الظاهري المصب داخل الخلية. 26 يمكن بالفعل معالجة بعض الطفرات داخل هذه الفئات بجزيئات صغيرة معتمدة من إدارة الغذاء والدواء. 25،26 الطفرات الأخرى لا يمكن ، وبالتالي قد تكون أكثر اعتمادًا على علاجات الرنا في المستقبل (الشكل 2).

الشكل 2. تندرج طفرات التليف الكيسي تحت ست فئات مختلفة. تتراوح هذه الفئات من توليد نُسخ CFTR mRNA المتحولة التي لا تُترجم إلى توليد بروتين CFTR المعيب ، والذي لا يسمح بتهريب أيونات كافية عبر غشاء الخلية. تم استخدام جزيئات صغيرة مختلفة لعلاج الفئات الست ، بما في ذلك القراءة من خلال الجزيئات الصغيرة ، والمصحح ، والعلاجات القائمة على القوة. CFTR قد تكون الطفرات التي من غير المرجح أن تعالج بواسطة الجزيئات الصغيرة الموجودة مرشحة بشكل أفضل للعلاجات الجينية للحمض النووي الريبي.

تؤدي طفرات الفئة الأولى مثل G542X أو W1282X أو R553X إلى كودون إيقاف سابق لأوانه ، مما يمنع تكوين البروتين الوظيفي. 27،28 لعلاج الطفرات من هذا النوع ، طور العلماء القراءة من خلال جزيئات صغيرة. تتجاوز هذه الجزيئات الصغيرة أكواد الإيقاف المبكرة لتشجيع النسخ. 26 تم اختبار القراءة من خلال جزيئات صغيرة في العديد من الدراسات والتجارب السريرية ، ولكن من غير المعروف ما إذا كانت ستتم الموافقة عليها من قبل إدارة الغذاء والدواء. 29 يمكن بدلاً من ذلك معالجة هذا النقص المحتمل في الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة لعلاج طفرات الفئة الأولى من خلال علاجات الرنا المرسال المصممة لتحل محل المفقودين CFTR الجين.

تخلق طفرات الفئة الثانية بروتينات غير مطوية غير قادرة على الوصول إلى غشاء الخلية. من بين هذه الطفرات المتغير ΔF508: طفرة ناتجة عن حذف ثلاثة أزواج أساسية في إكسون 10 تؤدي إلى عدم وجود بقايا فينيل ألانين من بروتين CFTR. 30 أكثر من 70٪ من العيب CFTR الأليلات تشمل هذه الطفرة ، مما يجعلها السبب الرئيسي للتليف الكيسي في الولايات المتحدة. نتيجة لذلك ، تم استثمار قدر هائل من الأبحاث في إيجاد علاجات للمرضى الذين يعانون من طفرة ΔF508 ، مما أدى إلى علاجات جزيئية صغيرة معتمدة.

على سبيل المثال ، تعمل تركيبة lumacaftor / ivacaftor العلاجية على استعادة وظيفة CFTR جزئيًا. على وجه التحديد ، lumacaftor هو مصحح CFTR يساعد أثناء عملية طي البروتين ، مما يسمح بنقل CFTR إلى سطح الخلية. 31 بمجرد وصول CFTR إلى سطح الخلية ، يعمل إيفاكافتور كمحفز ، مما يضمن أن CFTR يسمح بمرور أيونات الكلوريد. 32 بشكل ملحوظ ، في حالة ΔF508 ، لا يكون ivacaftor فعالًا من تلقاء نفسه ، لأنه يتطلب بروتين CFTR مطوي بشكل صحيح للعمل عليه. 32،33

تم أيضًا تطوير مصححات الجيل التالي للتعامل مع تشوهات المعالجة المختلفة ، بما في ذلك tezacaftor و elexacaftor. 25 على وجه التحديد ، يرتبط elexacaftor بجيب مختلف في بروتين CFTR ويؤدي إلى تحسين وظائف الرئة والعوامل الأخرى المرتبطة بالجهاز التنفسي عند تناوله مع تيزاكافتور وإيفاكافتور. 34 في الواقع ، وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية مؤخرًا على Trikafta ، وهو علاج مركب ثلاثي يجمع بين elexacaftor و ivacaftor و tezacaftor. تمت الموافقة على استخدام تريكافتا في المرضى الذين يعانون من طفرة ΔF508 واحدة على الأقل ، في حين أن العلاجات السابقة الفردية أو المركبة عالجت المرضى متماثلي اللواقح فقط من أجل طفرة ΔF508. 35،36 هذه العلاجات ذات الجزيئات الصغيرة تمثل نجاحًا كبيرًا لعلماء ومرضى التليف الكيسي. ستحتاج علاجات التليف الكيسي المستقبلية ، بما في ذلك علاجات الرنا المرسال ، إلى إظهار أمان وفعالية عالية بشكل غير عادي لتحل محل هذه الأدوية الموجودة.

لوحظ آخر CFTR تقع الطفرات ضمن الفئات من الثالث إلى السادس. تفتقر طفرة الفئة الثالثة إلى بوابة قناة أيونية وظيفية ، والفئة الرابعة بها توصيل أيوني معيب عبر قناة CFTR ، وينتج عن الفئة الخامسة وصول بروتين CFTR غير كافٍ إلى سطح الخلية ، والفئة السادسة لديها معدل دوران مرتفع في CFTR نتيجة لانخفاض البروتين الاستقرار في غشاء الخلية. 27 تمت الموافقة على Ivacaftor ، مُحسِّن CFTR ، من قِبل إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) لعلاج 38 نوعًا مختلفًا من CFTR الطفرات ، في الغالب داخل الفئة الثالثة ، ولكن المثير للاهتمام ، تظهر درجات متفاوتة من التحسن اعتمادًا على التركيب الوراثي للمريض. 25،37

فيما يتعلق بذلك ، هناك الكثير CFTR المتغيرات النادرة للغاية (أحيانًا تكون نادرة مثل شخص واحد). نتيجة لذلك ، قد يكون من الصعب الحصول على أدلة سريرية قوية بما يكفي لدعم الموافقة على الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة ، مما يترك هؤلاء المرضى في طي النسيان. حتى إذا كان هناك دليل سريري على أن طفرة نادرة أو لم يتم دراستها بعد يمكن معالجتها بواسطة جزيء صغير موجود ، فإن الوصول إلى هذه الأدوية "خارج التسمية" يمكن أن يكون مكلفًا ، مما يحول دون وصول المريض. 25 هناك جهود متضافرة لفهم الطفرات التي يمكن علاجها بعلاجات الجزيئات الصغيرة الحالية ، وكيفية تمييزها عن متغيرات الطفرات غير القابلة للعلاج. 25،27 فهم هذه الاختلافات والتحديات التي تشكلها لمرضى التليف الكيسي مهم لتحديد الطفرات التي قد تحتاج إلى معالجة باستخدام علاجات الحمض النووي الريبي.


التطبيقات

  • تدهور الحمض النووي أحادي الجديلة
  • إزالة شظايا ssDNA في خليط التفاعل
  • PCR هضم ما بعد التفاعل

ملحوظات

لا ينبغي استخدام نوكلياز خارجي I لنهاية الحمض النووي التي تقلل نهايات الحمض النووي القصيرة ليست ركيزة مناسبة لـ Exonuclease I. بالنسبة لتبييض نهاية الحمض النووي ، استخدم DNA Polymerase I أو Klenow Fragment (2140A ، 2140AK ، 2140B ، 2140BK) أو Mung Bean Nuclease (2420A ، 2420B) بدلاً من ذلك.

متعادل

مزود بـ 1 مل 10 Xonuclease I Buffer [670 ملي جلايسين- KOH ، درجة الحموضة 9.5 ، 10 ملي مولار DTT ، 67 ملي مولار MgCl2].

معلومات المنتج الإضافية

يرجى الاطلاع على شهادة تحليل المنتج للحصول على معلومات حول ظروف التخزين ومكونات المنتج والمواصفات الفنية. يرجى الاطلاع على قائمة مكونات المجموعة لتحديد مكونات المجموعة. توجد شهادات التحليل وقوائم مكونات الأدوات ضمن علامة التبويب "المستندات".

Takara Bio USA، Inc.
الولايات المتحدة / كندا: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & Bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
لأغراض البحث فقط. ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص. & نسخ 2021 Takara Bio Inc. جميع الحقوق محفوظة. جميع العلامات التجارية مملوكة لشركة Takara Bio Inc. أو الشركات التابعة لها في الولايات المتحدة و / أو البلدان الأخرى أو أصحابها المعنيين. قد لا يتم تسجيل بعض العلامات التجارية في جميع الولايات القضائية. يتوفر المنتج الإضافي والملكية الفكرية ومعلومات الاستخدام المقيد على takarabio.com.

Takara Bio Europe عضو في Takara Bio Group ، وهي شركة رائدة في علوم الحياة ملتزمة بتحسين حالة الإنسان من خلال التكنولوجيا الحيوية. من خلال علاماتنا التجارية Takara و Clontech و Cellartis ، تتمثل مهمتنا في تطوير أدوات وخدمات مبتكرة عالية الجودة لتسريع الاكتشاف.


Arber S ، Han B ، Mendelsohn M ، Smith M ، Jessell TM ، Sockanathan S (1999) متطلبات جين homobox Hb9 في توحيد هوية الخلايا العصبية الحركية. الخلايا العصبية 23 (4): 659-674

بدر م (2010) نماذج الفئران لأمراض القلب والأوعية الدموية. طرق Mol Biol 597: 403-414

Brenner M ، Kisseberth WC ، Su Y ، Besnard F ، Messing A (1994) يوجه مروج GFAP التعبير الخاص بالخلايا النجمية في الفئران المعدلة وراثيًا. J Neurosci 14: 1030-1037

Brown AJ و Fisher DA و Kouranova E و McCoy A و Forbes K و Wu Y و Henry R و Ji D و Chambers A و Warren J و Shu W و Weinstein E و Cui X (2013) خروج المغلوب للجين الشرطي الكامل للجرذ عن طريق تحرير الجينوم . طرق نات 10: 638-640

Chen J ، Li Y ، Wang L ، Lu M ، Zhang X ، Chopp M (2001) الفائدة العلاجية للإعطاء الوريدي لخلايا انسجة نخاع العظم بعد نقص التروية الدماغية في الفئران. السكتة الدماغية 32 (4): 1005-1011

Chou WC، Takeo M، Rabbani P، Hu H، Lee W، Chung YR، Carucci J، Overbeek P، Ito M (2013) تعتمد الهجرة المباشرة للخلايا الجذعية للخلايا الصباغية المسامية إلى البشرة بعد الإصابة أو تشعيع الأشعة فوق البنفسجية على إشارة Mc1r. نات ميد 19 (7): 924-929

Cong L، Ran FA، Cox D، Lin S، Barretto R، Habib N، Hsu PD، Wu X، Jiang W، Marraffini LA، Zhang F (2013) هندسة الجينوم المتعدد باستخدام أنظمة CRISPR / Cas. Science 339: 819

Fan X ، Petitt M ، Gamboa M ، Huang M ، Dhal S ، Druzin ML ، Wu JC ، Chen-Tsai Y ، Nayak NR (2012) تعبير جيني عابر ، محفز ، خاص بالمشيمة في الفئران. طب الغدد الصماء 153 (11): 5637-5644

Feil R ، Brocard J ، Mascrez B ، LeMeur M ، Metzger D ، Chambon P (1996) إعادة التركيب الخاص بالموقع المنشط بواسطة Ligand في الفئران. Proc Natl Acad Sci USA 93: 10887-10890

Feil R ، Wagner J ، Metzger D ، Chambon P (1997) تنظيم نشاط recombinase لـ Cre عن طريق مجالات ربط ligand لمستقبلات هرمون الاستروجين الطافرة. Biochem Biophys Res Commun 237: 752-757

Feil S ، Valtcheva N ، Feil R (2009) فئران Cre المحرضة. بروتوكول. بروتوكولات خروج المغلوب الجيني ، المجلد 530 من طرق التسلسل في البيولوجيا الجزيئية. ص 343 - 363

Flood DG ، Lin YG ، Lang DM ، Trusko SP ، Hirsch JD ، Savage MJ ، Scott RW ، Howland DS (2007) نموذج الفئران المعدلة وراثيًا لمرض الزهايمر مع ترسب Abeta خارج الخلية. الشيخوخة Neurobiol 30 (7): 1078-1090

Franz WM ، Mueller OJ ، Fleischmann M et al (1999) يوجه محفز الميوسين ذو السلسلة الثقيلة للعضلات الملساء 2.3 كيلو بايت التعبير الجيني إلى نظام الأوعية الدموية للفئران والأرانب المعدلة وراثيًا. Cardiovasc Res 43: 1040-1048

Groth AC ، Calos MP (2004) تكامل Phage: علم الأحياء والتطبيقات. جيه مول بيول 335 (3): 667-678

Guenther C، Tasic B، Luo L، Bedell M، Kingsley D (2014) أساس جزيئي للون الشعر الأشقر الكلاسيكي في الأوروبيين. نات جينيه. https://doi.org/10.1038/ng.2991

Jinek M، East A، Cheng A، Lin S، Ma E، Doudna J (2013) RNA برمجة تحرير الجينوم في الخلايا البشرية. eLife 2: e00471

Keravala A ، Groth AC ، Jarrahian S ، Thyagarajan B ، Hoyt JJ ، Kirby PJ ، Calos MP (2006) تتوسط مجموعة متنوعة من تكامل البكتيريا سيرين إعادة التركيب الخاصة بالموقع في خلايا الثدييات. مول جينوم 276: 135–146

Kobayashi T، Ebihara S، Ishii K، Kobayashi T، Nishijima M، Endo S، Takakub A، Sakagami H، Kondoe K، Tashirog F، Miyazakig J، Obata K، Tamura S، Yanagawa Y (2003) محفز الجينات الغلوتامات ديكاربوكسيلاز 67. Biochem Biophys Acta 1628 (2003): 156–168

Lakso M ، Sauer B ، Mosinger J ، Lee EJ ، Manning RW ، Yu SH ، Mulder KL ، Westphal H (1992) تنشيط الجينات الورمية المستهدفة عن طريق إعادة التركيب الخاص بالموقع في الفئران المعدلة وراثيًا. PNAS 89: 6232-6236

Lange A و Gegg M و Burtscher GM و Bengel D و Kremmer E و Lickert H (2012) Fltp (T2AiCre): خط فأر جديد لاستهداف الجينات الشرطية في أنسجة أحادية ومتعددة الميسليات متميزة. التمايز 83 (2): S105 – S113. https://doi.org/10.1016/j.diff.2011.11.003

Lewandoski M (2001) التحكم الشرطي في التعبير الجيني في الماوس. نات ريف جينيه 2: 743-755

Li J، Ishii T، Feinstein P، Mombaerts P (2004) يتم إعادة تعيين اختيار جين مستقبل الرائحة عن طريق النقل النووي من الخلايا العصبية الحسية الشمية للفأر. طبيعة 428 (6981): 393-399

Lobe CG ، Nagy A (1998) تغيير الجينوم الشرطي في الفئران. BioEssays 1998 (20): 200-208

Mali P ، Yang L ، Esvelt KM ، Aach J ، Guell M ، DiCarlo JE ، Norville JE ، Church GM (2013) هندسة الجينوم البشري الموجهة بواسطة RNA عبر Cas9. علم 39 (6121): 823-826. https://doi.org/10.1126/science.1232033

Meyer M ، de Angelis MH ، Wurst W ، Kühn R (2010) استهداف الجينات عن طريق إعادة التركيب المتماثل في الزيجوتات الملقحة للفأر بوساطة نوكليازات إصبع الزنك. Proc Natl Acad Sci USA 107 (34): 15022-15026

Meyer M ، Ortiz O ، Hrabé de Angelis M ، Wurst W ، Kühn R (2012) نمذجة طفرات المرض عن طريق استهداف الجينات في أجنة الفئران أحادية الخلية. Proc Natl Acad Sci USA 109 (24): 9354-9359

Minskaia E ، Ryan MD (2013) تعايش البروتين باستخدام FMDV2A: تأثير مخلفات "الرابط". بيوميد Res Int 2013: 291730. https://doi.org/10.1155/2013/291730

Nakano T ، Windrem M ، Zappavigna V ، Goldman SA (2005) تحديد 125 زوجًا أساسيًا من محسن Hb9 الذي يحدد التعبير الجيني للخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري. ديف بيول 283 (2): 474-485

Ohtsuki S ، Kamiya N ، Hori S ، Terasaki T (2005) تحريض الجين الانتقائي للبطانة الوعائية بواسطة محفز / محسن Tie2 في الدماغ وشبكية الفئران المعدلة وراثيًا. فارم ريس 22 (6): 852-857

Orban PC، Chui D، Marth JD (1992) إعادة تركيب الحمض النووي الخاص بالأنسجة والموقع في الفئران المعدلة وراثيًا. Proc Natl Acad Sci USA 89: 6861–6865

Overstreet DH (1993) فئران خط Flinders الحساسة: نموذج حيواني وراثي للاكتئاب. Neurosci Biobehav القس 17 (1): 51-68

Rasiman G، Li Y (2007) إصلاح المسارات العصبية بواسطة الخلايا المغلفة بحاسة الشم. نات ريف نيوروسسي 8 (4): 312-319

Rasmussen M و Kong L و Zhang GR و Liu M و Wang X و Szabo G و Curthoys NP و Geller AI (2007) Glutamatergic أو GABAergic الخاصة بالتعبير طويل المدى في الخلايا العصبية القشرية الحديثة من ناقلات HSV-1 المساعدة الخالية من الفيروسات والتي تحتوي على الجلوتاميناز المنشط بالفوسفات ، ناقل الغلوتامات الحويصلي -1 ، أو محفز ديكاربوكسيلاز حمض الغلوتاميك. Res الدماغ 1144: 19–32

Ruan J ، Li H ، Xu K ، Wu T ، Wei J ، Zhou R ، Liu Z ، Mu Y ، Yang S ، Ouyang H ، Chen-Tsai RY ، Li K (2015) تطرق الجينات المتحولة عالية الكفاءة CRISPR / Cas9 بوساطة في موضع H11 في الخنازير. ممثل العلوم 5: 14253. https://doi.org/10.1038/srep14253

Ryan MD ، King AM ، Thomas GP (1991) يتم التوسط في انشقاق البروتين البولي لفيروس مرض الحمى القلاعية عن طريق البقايا الموجودة داخل تسلسل الأحماض الأمينية 19. جي جين فيرول 72: 2727-2732

Sasahara M و Fries JW و Raines EW و gown AM و Westrum LE و Frosch MP و Bonthron DT و Ross R و Collins T (1991) PDGF B-chain في الخلايا العصبية للجهاز العصبي المركزي والغدة النخامية الخلفية وفي نموذج معدّل وراثيًا. الخلية 1: 217-227

Sauer B (1987) تعبير وظيفي لنظام إعادة التركيب الخاص بموقع Cre-Lox في الخميرة خميرة الخميرة. مول الخلية بيول 7: 2087-2096

Sauer B ، Henderson N (1988) إعادة تركيب الحمض النووي الخاص بالموقع في خلايا الثدييات بواسطة recombinase Cre من البكتيريا P1. Proc Natl Acad Sci USA 85: 5166-5170

Schlaeger TM ، Bartunkova S ، Lawitts JA ، Teichmann G ، Risau W ، Deutsch U ، Sato TN (1997) التعبير الجيني الموحد الخاص بالخلايا البطانية الوعائية في كل من الفئران المعدلة وراثيًا الجنين والبالغ. Proc Natl Acad Sci USA 94 (7): 3058-3063

Shaner NC ، Steinbach PA ، Tsien RY (2005) دليل لاختيار البروتينات الفلورية. طرق نات 2 (12): 905-909

سينغ بي ، شيمنتي جي سي ، بولكون-فيلاس إي (2015) دليل عملي لعالم وراثة الفئران لتطبيقات كريسبر. علم الوراثة 199 (1): 1-15

Tasic B ، Hippenmeyer S ، Wang C ، Gamboa M ، Zong H ، Chen-Tsai Y ، Luo L (2011) التكاثر بوساطة تكاملية خاصة بالموقع في الفئران عن طريق الحقن النووي. Proc Natl Acad Sci USA 108 (19): 7902-7907

Tasic B ، Miyamichi K ، Hippenmeyer S ، Dani VS ، Zeng H ، Joo W ، Zong H ، Chen-Tsai Y ، Luo L (2012) امتدادات MADM (تحليل الفسيفساء بعلامات مزدوجة) في الفئران. بلوس واحد 7 (3): e33332. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033332

Vassalli A و Rothman A و Feinstein P و Zapotocky MP (2002) ينقل Minigene توجيهًا محوريًا خاصًا بمستقبلات الرائحة في البصيلة الشمية. الخلايا العصبية 35: 681-695

Weber T ، Schönig K ، Tews B ، Bartsch D (2011) التلاعب الجيني المحرض في الخلايا العصبية السيروتونينية في الدماغ للفئران المعدلة وراثيا. بلوس واحد 6 (11): e28283

West AG، Gaszner M، Felsenfeld G (2002) العوازل: العديد من الوظائف ، العديد من الآليات. جينات ديف 16 (3): 271-288

Witten IB و Steinberg EE و Lee SY و Davidson TJ و Zalocusky KA و Brodsky M و Yizhar O و Cho SL و Gong S و Ramakrishnan C و Stuber GD و Tye KM و Janak PH و Deisseroth K (2011) خطوط الفئران Recombinase-driver: الأدوات والتقنيات والتطبيق البصري الوراثي على التعزيز بوساطة الدوبامين. الخلايا العصبية 72 (5): 721-733

Yang X ، Arber S ، William C ، Li L ، Tanabe Y ، Jessell TM ، Birchmeier C ، Burden SJ (2001) تشكيل التعبير الجيني لمستقبلات أستيل كولين العضلات في غياب التعصيب الحركي. الخلايا العصبية 30 (2): 399-410

Young JI et al (1998) تعبير أصيل خاص بالخلايا ومنظم تنمويًا عن شظايا الجينوم المؤيدة للأفيوميلانوكورتين في الخلايا العصبية تحت المهاد والخلفية للفئران المعدلة وراثيًا. ياء نيوروسسي 18: 6631 - 6640

Zhang J ، Zhang L ، Jiao H ، Zhang Q ، Zhang D ، Lou D ، Katz JL ، Xu M (2006) يسهل C-Fox اقتناء وانقراض التغييرات المستمرة التي يسببها الكوكايين. ياء نيوروسسي 26 (51): 13287-13296

Zhu F و Gamboa M و Farruggio AP و Hippenmeyer S و Tasic B و Shule B و Chen-Tsai Y و Calos MP (2013) Dice ، وهو نظام فعال للتحرير الجيني التكراري في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. الحمض النووي Res 42 (5): e34. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1290


تطوير التكنولوجيا

يهتم مختبرنا بتطوير تقنيات وراثية جديدة مع تطبيقات لاكتشاف الجينات وصحة الإنسان. بعض التقنيات التي نستكشفها حاليًا هي الفحص الجيني مع مكتبات RNAI و ORF ، واكتشاف الأجسام المضادة ، والطرق الجديدة لاكتشاف الأجسام المضادة. في الوقت الحالي ، نحن مهتمون بشكل خاص بأمراض المناعة الذاتية وتصميم اللقاحات. بعض أعمالنا مفصلة أدناه.

مكتبات shRNA

دبليوأنتج e ، جنبًا إلى جنب مع المتعاونين معنا في مختبر Greg Hannon ، مكتبات كبيرة من shRNAs التي تغطي كامل جينومات الإنسان والفأر (171, 183). تم تصميم المكتبات باستخدام خوارزميات التنبؤ shRNA وتم تصنيعها بطريقة موازية على نطاق واسع باستخدام مصفوفات Agilent الدقيقة. يتم تضخيم قليل النوكليوتيدات PCR واستنساخه في ناقلات الفيروسات القهقرية أو الفيروسية البطيئة. في هذه المرحلة يمكن استخدامها إما مباشرة أو التحقق من التسلسل وترتيبها. يحتوي كل ناقل أيضًا على رمز شريطي فريد مرتبط به لتفكيك ميكروأري للتجمعات. بهذه الطريقة يمكننا إنشاء مكتبات كبيرة من shRNAs للفحص الجيني (انظر قسم تطوير التكنولوجيا لمزيد من التفاصيل).

ناقلات جديدة shRNA ، ناقلات PRIME

تيأدى ظهور RNAi إلى القدرة على التدخل في التعبير الجيني وتوسيع قدرتنا بشكل كبير على إجراء الفحص الجيني في خلايا الثدييات. يمكن تشفير التعبير عن الحمض النووي الريبي قصير الشعر من محفزات البوليميراز الثالث في الجينات المحورة واستخدامه لإنتاج siRNAs التي تقلل من تنظيم جينات معينة. ومع ذلك ، اكتشفنا أن shRNAs المنسوخة من polymerase II تعرض ضربة قاضية فعالة جدًا للتعبير الجيني عندما يتم تضمين shRNA في سياق micro-RNA. (182). الأهم من ذلك ، أن نظام التعبير shRNA الخاص بنا (يسمى متجهات PRIME) يسمح بالنسخ المشترك المتعدد الجين لجين المراسل ، وبالتالي يسهل تتبع إنتاج shRNA في الخلايا الفردية. بناءً على هذا النظام ، قمنا بتطوير سلسلة من النواقل البطيئة التي تعرض الضربة القاضية المستجيبة للتتراسيكلين للتعبير الجيني في نسخة واحدة. سيؤدي الاختراق العالي لمتجهات PRIME هذه إلى تسهيل شاشات فقدان الوظيفة على مستوى الجينوم وهي خطوة مهمة نحو استخدام استراتيجيات الترميز الشريطي لمتابعة فقدان تسلسلات محددة في مجموعات سكانية معقدة.

لقد طورنا أيضًا سلسلة من نواقل PRIME التي تُظهر ضربة قاضية أفضل في خلايا الفئران الجذعية الجنينية والخلايا الأخرى حيث قد لا يكون محفز الفيروس المضخم للخلايا هو الأمثل. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير المزيد من النواقل المحفزة التي تستجيب للتيت والتي تقوم بتشفير منشط tet العكسي الخاص بها.

تقنيات الحمض النووي المؤتلف

السحر: طريقة وراثية في الجسم الحي لبناء سريع للحمض النووي المؤتلف

دبليوطور رواية هندسية عالية في الجسم الحي طريقة الاستنساخ ، MAGIC (التزاوج بمساعدة الاستنساخ المتكامل وراثيًا) ، التي تسهل البناء السريع لجزيئات الحمض النووي المؤتلف (180). تستخدم MAGIC التزاوج البكتيري ، في الجسم الحي انشقاق نوكلياز خاص بالموقع وإعادة التركيب المتماثل لتحفيز نقل جزء الحمض النووي بين ناقل متبرع في سلالة بكتيرية واحدة والبلازميد المتلقي في سلالة بكتيرية منفصلة. يتم اختيار أحداث إعادة التركيب وراثيًا وتؤدي إلى وضع الجين محل الاهتمام تحت سيطرة عناصر تنظيمية جديدة بكفاءة عالية. يلغي MAGIC الحاجة إلى إنزيمات التقييد ، و ligases DNA ، وإعداد الحمض النووي وكل شيء في المختبر التلاعبات المطلوبة للاستنساخ الفرعي وتسمح بالبناء السريع لتركيبات متعددة بأقل جهد. نظهر أن MAGIC يمكن أن تولد بنيات للتعبير في كائنات متعددة. نظرًا لأن هذه الطريقة الجديدة لا تتطلب سوى الخلط البسيط للسلالات البكتيرية ، فإنها تمثل تقدمًا كبيرًا في إنتاج الحمض النووي المؤتلف عالي الإنتاجية والذي سيوفر للباحثين قدرًا كبيرًا من الوقت والجهد والنفقات في دراسات الجينوم الوظيفي.

SLIC Cloning: a method for subcloning without restriction enzymes or DNA ligase

We developed a novel cloning method SLIC (Sequence and Ligation-Independent Cloning) that allows the assembly of multiple DNA fragments in a single reaction using في المختبر homologous recombination and single-strand annealing (195). SLIC mimics في الجسم الحي homologous recombination by relying on exonuclease generation of single strand DNA (ssDNA) overhangs on insert and vector fragments and the assembly of these fragments by recombination في المختبر. SLIC inserts can be prepared by incomplete PCR (أناPCR) or mixed PCR. SLIC allows efficient and reproducible assembly of recombinant DNA with as many as 5 and 10 fragments simultaneously. SLIC circumvents the sequence requirements of traditional methods and is much more sensitive when combined with RecA to catalyze homologous recombination. It also provides a new method for site-directed mutagenesis of a gene. This flexibility allows much greater versatility in the generation of recombinant DNA for the purposes of synthetic biology.

Enhanced display technologies for biomarker discovery – PhIP Seq

تيhe sensitive detection of circulating biomarkers represents a powerful approach to screening for early malignancy. However, current techniques are limited in their ability to distinguish normal from pathological states. This work aims to improve on current screening technology, utilizing novel principles in synthetic biology. In particular, we combine next generation DNA sequencing with the display of polypeptide libraries encoded by microarray-derived oligonucleotides. Using the T7 bacteriophage system, we are able to display the complete human peptidome and thereby seek to discover autoantigen biomarkers common to breast cancer patients. In parallel we are developing a fully defined, synthetic human single chain variable fragment (scFv) antibody library. This library will be used in ribosome display format for a scFv library-versus-peptide library screen in an effort to create a proteomic scale scFv set. Our hope is that development of these technologies will facilitate the identification of circulating cancer biomarkers, thereby enabling early diagnosis and treatment of the disease.

The pINDUCER lentiviral toolkit for inducible RNA interference in vitro and in vivo.

تيhe discovery of RNAi has revolutionized loss-of-function genetic studies in mammalian systems. However, significant challenges still remain to fully exploit RNAi for mammalian genetics. For instance, genetic screens and in vivo studies could be broadly improved by methods that allow inducible and uniform gene expression control. To achieve this, we built the lentiviral pINDUCER series of expression vehicles for inducible RNAi in vivo. Using a multicistronic design, pINDUCER vehicles enable tracking of viral transduction and shRNA or cDNA induction in a broad spectrum of mammalian cell types in vivo. They achieve this uniform temporal, dose-dependent, and reversible control of gene expression across heterogenous cell populations via fluorescence-based quantification of reverse tet-transactivator expression. This feature allows isolation of cell populations that exhibit a potent, inducible target knockdown in vitro and in vivo that can be used in human xenotransplantation models to examine cancer drug targets.

OLDER TECHNOLOGIES

Lambda YES cDNA Expression System

دبليوe have developed a multifunctional lambda expression vector system, lambda YES, designed to facilitate gene isolation from eukaryotes by complementation of E. coli and S. cerevisiae mutations (23). Lambda YES vectors have a selection for cDNA inserts using an oligo adaptor strategy and are capable of expressing genes in both E. coli and S. cerevisiae. They also allow conversion from phage l to plasmid clones using the cre-lox site-specific recombination system, referred to as automatic subcloning. Lambda YES vectors utilize an adaptor selection for inserts and can generate libraries with 109 recombinants per mg of cDNA insert. cDNA libraries constructed in these vectors have been used to isolate genes from humans by complementation of yeast. Using this technology we isolated the human Cdk2 gene (24) by complementation of a yeast cdc28 Ts mutation and the Cyclin F gene (40) as a suppressor of cdc4 Ts mutations which led to the discovery of F-box proteins (77).

UPS – the Univector Plasmid Fusion System: A method for rapid construction of recombinant DNA molecules without restriction enzymes

مodern biological research is highly dependent upon recombinant DNA technology. The functional analysis of a single gene requires the introduction of that gene into multiple vectors for different purposes. Conventional cloning methods are time-consuming and individual cloning events must be performed independently. To approach solving this problem, we sought to develop a systematic and uniform method with which to manipulate large sets of genes.

We developed a series of novel cloning methods that facilitate the rapid and systematic construction of recombinant DNA molecules (102). The central method is named the Univector Plasmid-fusion System (UPS). UPS employs cre-lox site-specific recombination to catalyze plasmid fusion between the Univector, a plasmid containing the gene of interest, and host vectors containing regulatory information. Fusion events are genetically selected and result in placement of the gene under the control of novel regulatory elements. A second UPS-related method allows for the precise transfer of coding sequences only from the Univector into a host vector. UPS eliminates the need for restriction enzymes, DNA ligases, and many في المختبر manipulations required for subcloning and allows the rapid construction of multiple constructs for expression in multiple organisms. We demonstrate that UPS can be used to transfer whole libraries into new vectors. New methods for directional cloning of PCR fragments and for the generation of epitope tags and other fusions at the 3′ end of genes using homologous recombination in بكتريا قولونية are described that facilitate cloning and manipulation of genes in the Univector.

Together, these recombination-based cloning methods constitute a new comprehensive approach for the rapid and efficient generation of recombinant DNA that can be used for parallel processing of large gene sets, an ability required for future genomic analysis. We are continuing to develop large-scale capabilities using UPS as an alternative to the expensive and limited GATEWAY system.

Advances in the Two-Hybrid System

تيhe two-hybrid cloning system is a powerful genetic method to identify genes via protein-protein interactions. We have made a number of improvements to this method which are designed to increase the number of potential protein-protein interactions detectable and to streamline the labor intensive process of authenticating clones identified in the primary screen. The first improvement was the design of genetic selections instead of screens to detect interacting proteins (32, 39). We developed the strain Y190 using HIS3 as a reporter and Y166 which employed a URA3 reporter for this purpose. A selection vastly increases the numbers of library clones that can be searched and is now built into all systems. Secondly, through the use of negative selections for plasmid loss coupled with a replica-mating strategy, we have developed a rapid method to distinguish between the genuinely interacting clones and the nonspecific background that is inherent to the system. Third, a lambda phage vector, lambda ACT2, was made that allows construction of highly complex, HA epitope-tagged, directional libraries of GAL4 activation domain-fused cDNAs that can be converted to plasmid form by in vivo cre-lox mediated site-specific recombination. We also introduced yeast mating of library clones to baits as a rapid way to both generate libraries and well as to counter screen against false positives. These methods have been incorporated into all current two-hybrid system kits. We used these methods to identify the human p21 and p57 Cdk inhibitors.

A Cytoplasmic Two Hybrid System, The SOS Recruitment System

أناn collaboration with Michael Karin’s lab, we have developed a novel two hybrid system for the cloning of genes involved in protein-protein interactions (84). This system, called the SOS Recruitment System, SRS, relies on the activation of the ras signalling pathway when a fusion protein to the ras guanine nucleotide exchange factor, SOS, is recruited to the inner surface of the plasma membrane by physical association with a second protein targeted to the same membrane by a myristylation sequence. When SOS is successfully recruited to the plasma membrane, it activates ras and bypasses the need for the endogenous exchange factor, Cdc25, an essential protein. This system allows protein-protein interactions to be detected in the cytoplasm. Furthermore, proteins that activate transcription can be used in this system giving it an advantage over the transcriptionally based two-hybrid system. We have developed a lambda-based expression vector, lambda MS-TRP for expression of myristylation-fused cDNA libraries an other useful vectors for this method. Visit our protocols page for more information


الاستنتاجات

In summary, a CRISPR/Cas9 toolbox was developed for efficient and comprehensive engineering of the industrial workhorse C. glutamicum. Markerless gene deletion, gene insertion, single-nucleotide editing and double-locus editing were achieved by using a customized two-plasmid-based CRISPR/Cas9 system and a simplified co-transformation strategy. This toolbox works well in several C. glutamicum strains and holds promise for renovating the genome editing of corynebacteria.


“Hacking the software of life”: Salesmanship versus cranks

It might be a bit harsh of me to say that the “mRNA vaccines are gene therapy” narrative by antivaxxers is a self-inflicted wound. However, it is not at all harsh to point out how Moderna scientists and executives selling their technology provided antivaxxers with language that they could easily weaponize against COVID-19 vaccines. In particular, Mercola makes a lot of this 2017 talk by Dr. Tal Zaks, chief medical officer of Moderna, in which he likened mRNA vaccines to “hacking the software of life”:

It gets worse, though, and Mercola gleefully takes advantage of Moderna’s loose analogies:

Zaks’ analogy to a prowler doesn’t even make a lot of sense biologically or as an analogy. He seems to be likening the RNA from a vaccine to being a “prowler” compared to the “prowler” of the virus outside of the cell. It’s no wonder that antivaxxers can so easily turn such language against COVID-19 vaccines, as it Zaks seems to be implying that the body is more alarmed by RNA in its cells than it is from foreign protein circulating in the body. As for “information therapy”, my only thought reading that dates back to the early 1980s: Gag me with a spoon.

Seriously, I wish Moderna would lose this particular analogy. It’s done (and continues to do) so much harm. I understand why it is attractive to view mRNA as “software”, but in reality it’s not. If you really wanted to pursue the analogy, I’d say that DNA is the software, mRNA is the compilation of that software, and the protein is the output, but even that’s a strained analogy. However you look at that analogy, though, it allows Mercola to pull off a favorite old antivaccine trope, one that was resurrected for COVID-19 vaccines, namely that vaccines are “transhumanism“, a claim by antivaxxers that I first noticed in 2012.

Seriously, look at Mercola run with this:

And, of course, according to Mercola, transhumanism due to COVID-19 vaccines is part and parcel of the “Great Reset”, a conspiracy theory claiming that the pandemic was engineered by the global elites to allow for a “reset” in which they take control of the world economy. I can’t help but note that “the Great Reset” is another example of how poorly chosen words basically give conspiracy theorists a gift. “The Great Reset” really is a plan first proposed by the World Economic Forum exploring how countries might recover from the COVID-19 pandemic. I mean, seriously? Who thought of this term? Who at Moderna thought it would be a good idea to present their treatments as “hacking the software of life”, given all the negative connotations of hacking?

Again, words matter. While I can’t be too hard on Moderna for being cautious in its SEC filing and using language that reflected regulatory uncertainties of the time, I can blame Tal Zaks and the leadership of Moderna for using such easily weaponized analogies, such as “hacking the software of life” to sell its product to investors. I can blame the World Economic Forum for coming up with a term like the “Great Reset”. These words matter, and these words have been a gift to COVID-19 conspiracy theorists and a burden to those trying to counter disinformation.


شاهد الفيديو: Plasmid DNA isolationطرق عزل البلازميد من البكتريا (كانون الثاني 2022).