معلومة

ما المقصود بـ 4-12٪ أو 8٪ SDS-PAGE؟


أقرأ مقالة في مجلة وأتطلع إلى قسم المواد والأساليب. فيما يتعلق بطريقة اللطخة الغربية في الورقة ، فقد صادفت العبارة التالية:

تم فصل البروتينات بنسبة 4-12٪ أو 8٪ SDS-PAGE وتم ترقيمها بالكهرباء إلى غشاء نقل النيتروسليلوز.

لست متأكدًا مما هو المقصود بـ "4-12٪ أو 8٪ SDS-PAGE" في البيان أعلاه. هل تشير قيم النسبة المئوية إلى نسبة مادة الأكريلاميد في الجل؟ هي موضع تقدير أي رؤى.


هل تشير قيم النسبة المئوية إلى نسبة مادة الأكريلاميد في الجل؟

نعم فعلا. جل 8٪ هو 8 جم أكريلاميد لكل 100 مل. الجل "4-12٪" عبارة عن هلام متدرج ، وهو مفيد لفصل البروتينات على نطاق واسع من الأحجام. اقرأ المزيد عن استخدامات وتركيبات المواد الهلامية المتدرجة هنا.


تتنبأ اللقطات السكانية بالتسلسل الهرمي المبكر للدم والكريات الحمر

يبدأ تكوين خلايا الدم الحمراء مع تمايز أسلاف المكونة للدم متعددة القدرات. تمثل إعادة بناء خطوات هذا التمايز تحديًا عامًا في بيولوجيا الخلايا الجذعية. استخدمنا هنا علم النسخ أحادية الخلية ومقايسات المصير ونظرية تسمح بالتنبؤ بمصير الخلية من لقطات السكان لإثبات أن أسلاف الفئران المكونة للدم تفرق من خلال بنية هرمية مستمرة إلى سبع سلالات دموية. اكتشفنا اقترانًا بين الكريات الحمر ومصائر الخلايا القاعدية أو الخلايا البدينة ، وهي استجابة عالمية مكونة للدم لإجهاد الكريات الحمر ومستقبلات عامل النمو الجديدة التي تنظم تكون الكريات الحمر. لقد حددنا استراتيجية فرز التدفق الخلوي لتنقية المراحل المبكرة من تمايز الكريات الحمر ، وعزل السلالات المكونة للانفجار وتشكيل المستعمرات المحددة بشكل كلاسيكي. وجدنا أيضًا أن دورة الخلية يتم إعادة تشكيلها تدريجياً أثناء تطور الكريات الحمر وأثناء التبديل النسخي الحاد الذي ينهي مرحلة السلف المكونة للمستعمرة وينشط التمايز النهائي. يعرض عملنا فائدة ربط البيانات النصية بنماذج المصير التنبؤية ، ويوفر رؤى حول تطور النسب في الجسم الحي.


المواد والأساليب

تستخدم خلايا الفئران الوليدية لدراسات حركية الاتصال

تم عزل خلايا عضلة القلب البطينية للجرذان حديثي الولادة والخلايا الليفية العضلية من جرذان Sprague-Dawley 1 & # x020132-d وفقًا لإرشادات قانون وزارة الداخلية للحيوانات (الإجراءات العلمية) لعام 1986 في المملكة المتحدة. تم عزل خلايا عضلة القلب والأرومات الليفية العضلية وتربيتها كما هو موضح سابقًا (31). تم زرع الزراعة الأحادية لخلايا عضلة القلب أو الخلايا الليفية العضلية في أطباق MatTek (13 سم 2 MatTek ، Ashland ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو أطباق بلاستيكية (35 مم ، CytoOne USA Scientific ، Ocala ، FL ، الولايات المتحدة الأمريكية). بالنسبة لتجارب الزراعة المزروعة ، تم أيضًا طلاء خلايا عضلة القلب في الأطباق ، مع زرع الخلايا الليفية العضلية في الأعلى في اليوم التالي. تم فصل الخلايا الليفية العضلية كما هو موصوف سابقًا (31) ، ونسجها ، وأعيد تعليقها في 1 مل HBSS لكل مليون خلية. ثم تم تصنيف الخلايا الليفية العضلية عن طريق الحضانة لمدة 20 دقيقة عند 37 & # x000b0C و 1 ٪ CO2 مع Vybrant DiI (الإثارة / الانبعاث: 549/565 نانومتر Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو WGA-488 (جرثومة القمح agglutinin-488 ، الإثارة / الانبعاث: 495/519 نانومتر Thermo Fisher Scientific) للتعرف عليها بعد ذلك. ثم تم زرع الخلايا الليفية العضلية مع خلايا عضلة القلب وتركت لعمل تقاطعات فجوة لمدة 24 ساعة قبل التصوير.

الخلايا الليفية الجرذان البالغة المستخدمة في دراسات حركية الاتصال

أجريت الدراسات التي شملت الفئران البالغة وفقًا لـ دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية [المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية]. بالنسبة لنموذج احتشاء عضلة القلب ، تم تخدير ذكور فئران سبراغ-داولي البالغة (250 & # x02013300 جم) وخضعت لربط الشريان التاجي القريب للحث على احتشاء عضلة القلب المزمن. تم السماح للجرذان بالتعافي لمدة 16 أسبوعًا للحث على قصور القلب. تم استخدام حيوانات التحكم المطابقة للوقت والتي لم تخضع لعملية جراحية كعنصر تحكم. بعد 16 أسبوعًا ، في الجسم الحي تم إجراء تحليل حجم الضغط & # x02013 قبل أن يتم استكشاف القلوب ووزنها وتحضيرها لعزل الخلية كما هو موضح سابقًا (32 & # x0201334). تم جمع الخلايا الليفية من طاف عزل خلية عضلة القلب. تم نسج خلايا عضلة القلب عند 400 ز لمدة 1 دقيقة ، وبعد ذلك تم جمع المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا الليفية. ثم تم نسج هذا الطاف عند 1000 ز لمدة 10 دقائق لتكوير الخلايا الليفية. تمت إزالة المادة الطافية ، وأعيد تعليق الحبيبات في DMEM التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ محلول مضاد حيوي / مضاد للفطريات ، و 1٪ l -جلوتامين. تم طلاء الخلايا الليفية العضلية في قوارير مقاس 25 سم 2 ونمت حتى الالتقاء.

تعديل تقاطعات الفجوة و Cx43

تم استخدام طرق مختلفة لتعديل تقاطعات الفجوة. تم تحقيق الإفراط في التعبير عن Cx43 المنصهر عند طرفه C إلى بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (eGFP) باستخدام ناقل من فيروسات غدية من الجيل الأول (Cx43 & # x02013eGFP) وتم تنفيذ ضربة قاضية (KD) باستخدام RNA صغير متداخل (siRNA) (199927 Thermo Fisher علمي ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو فيروس التهاب الفم الحويصلي G-protein-pseudotyped lentiviral vectors التي تشفر GFP و a سي اكس 43-الحمض النووي الريبي قصير الشعر المحدد (shRNA) (35 ، 36). تم تثبيط تعديل Cx43 بواسطة zonula occludens-1 (ZO-1) بواسطة مثبط الببتيد القابل للنفاذ بالغشاء الذي يحتوي على Cx43 C-terminal كثافة بعد المشبكية -95 / أقراص-كبيرة / مجال ربط ZO-1 (PDZ) (& # x003b1CT1 الببتيد) (37). تم تحضين الخلايا العضلية القلبية والخلايا الليفية العضلية ، بشكل منفصل أو في زراعة نباتية ، من أجل & # x0223c4 h باستخدام الببتيد & # x003b1CT1 (100 & # x003bcM). تم تحقيق زيادة في الاقتران الخلوي أيضًا باستخدام جزيء صغير ، 4PB (Calbiochem ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والذي تم نشره سابقًا ليكون بمثابة ناهض للربط بين الفجوات ، بالإضافة إلى زيادة تعبير Cx43 في خلايا عضلة القلب (38) . لذلك أضفنا 1 ملي مولار 4 بيتابايت إلى الخلايا الليفية العضلية وحدها أو كل من خلايا عضلة القلب والخلايا الليفية العضلية لمدة 48 ساعة عند 37 & # x000b0C. تم استخدام 1-Heptanol لفك تقاطعات الفجوة تمامًا (39). يؤدي نقص الأكسجة إلى استيعاب Cx43 (40). تم إحداث نقص الأكسجة عن طريق الحضانة عند 37 & # x000b0C ، 1 ٪ CO2، و 8٪ O2 بين عشية وضحاها (& # x0223c15 ساعة). تم زرع الشتلات الفردية قبل 24 ساعة على الأقل من نقص الأكسجة ، بينما في زراعة البذور ، تم زرع الخلايا الليفية العضلية في خلايا عضلة القلب 1 & # x020132-d & # x0223c4 ساعة قبل علاج نقص الأكسجة. بالنسبة لتجارب الديناميكية مع نقص الأكسجة ، عولجت الخلايا أولاً بنقص الأكسجة ، وبعد ذلك تم إخراج الطبق المغلق من الحاضنة ووضعه بسرعة في غرفة صغيرة قائمة بذاتها ضرورية للتسجيل. استخدمنا كل طبق لمدة ساعة واحدة كحد أقصى ولم نجد أي اختلافات في السرعة بين البداية والنهاية. تم قياس مستويات الأكسجين في نهاية الجلسة ووجد أنها لم تعد إلى نورموكسيا قبل نهاية مجموعة عمليات المسح. عولجت الزرع باستخدام latrunculin-B (100 مم) ، عند 37 & # x000b0C لمدة 24 ساعة من أجل تعطيل ألياف إجهاد الأكتين (41).

المسح المجهري للتوصيل الأيوني

تم استخدام الفحص المجهري للتوصيل الأيوني (SICM) لتصوير منطقة التلامس بين الخلايا ( رسم بياني 1أ ). باختصار ، يوفر SICM صورًا طبوغرافية مستمرة في وضع التنقل عبر مسح ضوئي بالماصات النانوية يتم التحكم فيه عن طريق التغذية الراجعة مع الحد الأدنى من الانجراف المكاني (بضعة نانومتر) (23). SICM هي طريقة لا تلامس تسمح بتصوير تضاريس الخلايا السليمة (23 ، 42 ، 43). تم الحصول على الصور الطبوغرافية السطحية للخلايا العضلية للقلب والخلايا الليفية العضلية بواسطة SICM عند 25 & # x000b0C في محلول فسيولوجي منخفض الكالسيوم (144 ملي مول كلوريد الصوديوم (ميليبور سيغما ، بيرلينجتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 5 ملي مولار كلوريد الصوديوم (MilliporeSigma) ، 1 ملي MgCl2 (MilliporeSigma) ، 10 ملي HEPES ، في 2 لتر درهم2O ، pH 7.4) أو في HBSS ، لتجنب الانكماش. تم إجراء مسح كبير (60 & # x02013100 & # x000d7 60 & # x02013100 & # x003bcm) لتحديد مناطق التلامس بين الخلايا. بعد ذلك ، تم إجراء مسح أصغر وأعلى دقة لـ & # x0223c15 & # x000d7 15 & # x003bcm من منطقة التلامس وتكررت لمدة ساعة واحدة (حلقة) لتصور التغييرات في منطقة التلامس بين خليتين (الشكل 1).أ, ج ). بعد ذلك ، تمت معالجة الصور (15 & # x000d7 15 & # x003bcm) بترتيب زمني باستخدام برنامج CellTrack (44) (http://bio.cse.ohio-state.edu/CellTrack/ رسم بياني 1أ, ج ). يقوم البرنامج بإرجاع متوسط ​​السرعة (بكسل لكل إطار) من النقاط المختارة عشوائيًا داخل منطقة التلامس المحددة (الشكل 1).ج ). من خلال معرفة وقت كل صورة تم الحصول عليها (hh: mm: ss) وعدد البكسل لكل صورة (512 & # x000d7 512 pixels) ، كان من الممكن تقييم متوسط ​​سرعة الحركة (& # x003bcm / min) من a المنطقة المختارة.

SICM وتحليل حركة الاتصال. أ) رسم تخطيطي لإعداد SICM (يسار) ، رسوم متحركة تمثل تكوينات الخلايا المختلفة المستخدمة هنا (أعلى اليمين) ، والتحليل باستخدام CellTrack (44) (أسفل اليمين). تحدد CellTrack (44) مجموعة من النقاط العشوائية (المربعات الصفراء) في منطقة الاتصال التي تم تحديدها (محاطة بدائرة) وتتبعها خلال عمليات المسح لحساب حركة جهة اتصال الخلية. ب) صور تمثيلية لجهة اتصال CM & # x02013MFB ، تم مسحها ضوئيًا أولاً باستخدام SICM (يسار) وبعد ذلك باستخدام متحد البؤر بالليزر (الأوسط) يظهر تراكب يُظهر التقاطع (مسح SICM) و GFP-Cx43 في التقاطع (أخضر) على اليمين . ج) مجموعة تمثيلية من عمليات المسح الملتفة في نقاط زمنية تمثيلية. يستغرق كل مسح 4 & # x020136 دقيقة ، وينتج ما بين 10 و 20 صورة ، على الرغم من أن بعضها قد لا يتم استخدامه لأن الحطام الموجود على الخلية قد يتداخل مع فحص SICM. ر، زمن ض، ارتفاع الخلية. د) صورة تمثيلية لتوزيع CM & # x02013CM و CM & # x02013MFB Cx43 في الخلية & # x02013cell Contacts. أحمر ، & # x003b2-كاتينين أخضر ، وردي Cx43 ، أزرق فيمينتين ، DAPI. تم التعبير عن Cx43 في واجهة CM & # x02013MFB. تشير الأسهم البيضاء إلى وجود Cx43 في الخلية & # x02013cell Contacts. أشرطة مقياس ، 10 & # x003bcm.

SICM بالاشتراك مع الفحص المجهري متحد البؤر

تم الحصول على الصور الطبوغرافية السطحية لخلايا عضلة القلب والخلايا الليفية العضلية بواسطة SICM عند 25 & # x000b0C في المخزن المؤقت منخفض الكالسيوم. لتصور Cx43 عند التقاطعات ، تم حضانة الخلايا لمدة 24 ساعة باستخدام الجيل الأول من ناقلات الفيروسات الغدية Cx43 & # x02013GFP (Adeno-X Expression System Takara ، كيوتو ، اليابان) عند تعدد الإصابة بـ 9. Cx43 & # x02013GFP كان متحمس عند 473 نانومتر باستخدام ليزر Stradus 473 (Vortran ، ساكرامنتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم عمل صور متحد البؤر عند التكبير & # x000d7100 باستخدام نظام كشف مضاعف ضوئي (PTI). باستخدام الإعداد SICM ، تمت محاذاة طرف الماصة مع شعاع الليزر. ثم تم مسح سطح الخلية كصورة SCIM تقليدية. تم مسح المنطقة نفسها بعد ذلك باستخدام الليزر لتصور Cx43. يمكن أن تتداخل الصور الناتجة مع صورة تضاريس السطح المقابلة (الشكل 1ب ).

الفحص المجهري المناعي

الفحص المجهري المناعي للفيمنتين (مضاد للدجاج PA1-16759 ، 1: 3000 Thermo Fisher Scientific) ، & # x003b1-SMA (مضاد للفأر <"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": " MA511547 "،" term_id ":" 1543530293 "،" term_text ":" MA511547 ">> MA511547 ، 1: 500 Thermo Fisher Scientific) ، Cx43 (مضاد للأرنب C6219 ، 1: 1000 MilliporeSigma) ، و DAPI (33342 ، 1: 1000 Thermo Fisher Scientific) لتقييم استيعاب Cx43 الداخلي بعد نقص الأكسجة وتأثير اللاترونكولين-ب على الاتصال الخلوي غير المتجانسة.

استخراج البروتين والبقع الغربية

تم تنفيذ اللطخات الغربية لبروتين الوصلة الفراغية ، Cx43 ، كما هو موصوف سابقًا (45) وتم استخدام # x003b2-actin كعنصر تحكم في التحميل. باختصار ، تم طلاء الخلايا في أطباق بحجم 35 مم (0.5 مليون خلية لكل بئر) وزُرعت لمدة 72 ساعة مع أو بدون علاج. تم بعد ذلك غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني بارد واستخراج البروتين باستخدام محلول تحلل يحتوي على مثبطات بروتين. تم صوتنة lysates المجمعة لمدة دقيقة واحدة عند 0 & # x000b0C ، وحضنت على شاكر لمدة 15 دقيقة على الجليد ، وطردها لمدة 15 دقيقة عند 4 & # x000b0C ، 14000 ز. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام اختبار بروتين BCA وفقًا للشركة المصنعة وبروتوكول # x02019s (بيرس ، روكفورد ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية). بالنسبة للنشاف الغربي ، تم تجزئة كل عينة بروتين في ظروف تغيير التشبع بواسطة الرحلان الكهربائي SDS & # x02013PAGE. تم استخدام نظام Trans-Blot Turbo System (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) لنقل البروتينات إلى الغشاء (Bio-Rad). تم حظر الأغشية لمدة ساعة واحدة في حليب 5 ٪ (MilliporeSigma) ثم حضنت طوال الليل عند 4 & # x000b0C في الجسم المضاد الأولي (Cx43 ، C6219 ، مضاد للأرنب 1: 1000 ، MilliporeSigma & # x003b2-actin ، A3854 ، مضاد للفأر 1: 50000 ميليبور سيجما) مخفف في حليب بنسبة 5٪. تم غسل الأغشية في اليوم التالي 3 مرات في محلول ملحي من نوع Tris مع Tween-20 (TBST 1 M Tris pH 8.0 ، كلوريد الصوديوم المخفف في الماء المقطر) وحضنت بأجسام مضادة ثانوية مترافقة مع الفجل الحار (HRP) (7074 ، حمار مضاد للأرانب 1: 1000 ، تقنية تشوير الخلية ، دانفرز ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 7076 ، تقنية تشوير خلايا الحمير 1: 1000 خلية) مخففة في TBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور البقع باستخدام ركيزة Luminata Forte Western HRP (MilliporeSigma). تم استخدام برنامج ImageJ (NIH) لتحديد النطاقات التي تم تطبيعها إلى & # x003b2-actin.

فحوصات المظلة

تم طلاء الخلايا الليفية العضلية على أطباق بحجم 35 ملم ، وعند الالتحام ، تم علاجها بالعلاجات المحددة. بالنسبة لتجارب 4PB ، عولجت الخلايا الليفية العضلية لمدة 48 ساعة لزيادة تعبير Cx43. ليحقق سي اكس 43 KD ، كانت الخلايا الليفية العضلية إما منقولة مع سي اكس 43- سيرنا محدد أو منقولة بجزيئات ناقلات الفيروسة البطيئة التي تعبر عن أ سي اكس 43shRNA محددة للصمت سي اكس 43 و eGFP للكشف عن الخلايا المنقولة ، قبل تلطيخ الصبغة.

تم تحضين الخلايا باستخدام 5 & # x000b5M Cell Tracker Orange / FarRed (Thermo Fisher Scientific) و 1 & # x000b5M Calcein / Calcein Orange (Thermo Fisher Scientific) لمدة 30 دقيقة عند 37 & # x000b0C ، تم تجريبها ومطليها على خلايا عضلة القلب في 1: 2 نسبة لتشكيل اتصالات الخلايا غير المتجانسة. تمت زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة. تم إجراء تصوير الخلايا الحية على مجهر المسح بالليزر زايس 780 متحد البؤر. تم حساب الخلايا التي كانت إيجابية كالسين فقط والتي كانت مجاورة مباشرة للخلايا الليفية المسمى ثنائيًا (الخلايا الناقلة).

قياس حدود الخلية

تم إجراء القياس الكمي للصور باستخدام برنامج رؤية كمبيوتر مصمم خصيصًا لتحديد اتصال الخلية & # x02013cell (بإذن من V. باختصار ، تم تحديد حدود الخلية بناءً على تلطيخ البروتين & # x003b1-SMA ومعايرته يدويًا. تم تعيين قياسات العتبة ودورة التمدد لمنطقة الواجهة لالتقاط Cx43 فقط معبرًا عنها عند حدود الخلية ، وتم الاحتفاظ بها ثابتة في جميع تحليلات الصور. تم تحديد تسمية Cx43 وحسابها على أنها كثافة في منطقة Cx43 (وحدات عشوائية / بكسل 2). يتم تقديم البيانات كوسائل & # x000b1 sem.

تحليل احصائي

تم إجراء تحليل إحصائي في Prism 7 (GraphPad ، لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) لجميع بيانات المسح والبقع الغربية. يتم تمثيل جميع البيانات كوسائل & # x000b1 sem. تم اختبار جميع البيانات من أجل الوضع الطبيعي قبل اختبار Kruskal & # x02013Wallis مع آخر مخصص الاختبارات (المسح ، النشاف الغربي) أو Student & # x02019s ر تم إجراء اختبار (فحوصات المظلة). لجميع بيانات المسح ، ن يمثل عدد مجموعات الفحص التي تم استخدامها لمدة ساعة واحدة. تم إجراء المزيد من مجموعات الصور ولكن ربما لم يتم استخدامها لأسباب مختلفة ، بما في ذلك الضوضاء في المسح بسبب الحطام الموجود على الخلية ، والذي يتداخل مع مسح الغشاء. تم إجراء جميع البيانات باستخدام طبق واحد على الأقل من أطباق الخلايا بعد تغيير مجموعات المسح 1 & # x020132 ، خاصة بالنسبة لعمل نقص الأكسجة ، حيث تم إجراء عمليات المسح عند توتر الأكسجين الطبيعي ، مما يعني أن التغييرات التي يسببها نقص الأكسجة قد تكون عادت إلى الوراء بعد 1 & # x020132 ح. أجريت معظم التجارب مع خلايا من عزلتين منفصلتين على الأقل (10 & # x0201315 جرو / عزلة).


ملخص النماذج

في بعض التجسيدات وفقًا للكشف الحالي ، يتم توجيه طريقة تنقية الفيروس إلى عملية متعددة المجموعات تشمل الحصاد من مادة فيروسية كائن مصدر تحتوي على فيروس واحد على الأقل يزيل الحطام الخلوي من فيروس واحد على الأقل وبالتالي توضيح بنية العنصر فيروس واحد على الأقل يركز الفيروس المنفصل والموضح والذي يتم في بعض النماذج باستخدام جهاز ترشيح يشتمل على غشاء ذي مسام بحجم لا يتجاوز حدًا محددًا مسبقًا كما هو محدد بواسطة المستخدم ومعالجة الفيروس المركز بإخضاعه لسلسلة إجراءات الفصل وجمع الفيروس بعد كل إجراء فصل ، حيث يتضمن إجراء فصل واحد على الأقل كروماتوجرافيا التبادل الأيوني لفصل ملوثات الخلية المضيفة عن الفيروس ، ويتضمن إجراء فصل واحد على الأقل كروماتوغرافيا متعددة الوسائط لفصل الشوائب المتبقية عن الفيروس على أساس الاختلافات في الحجم على الأقل بين viru s والشوائب ، والتفاعل الكيميائي الذي يحدث بين الشوائب وواحد أو أكثر من الروابط اللونية. في بعض النماذج ، يكون النبات هو الكائن المصدر الذي يخضع لتعبير تأشيب لفيروس ، مع نيكوتيانا بنتاميانا و يمنى طفيفة كأمثلة غير مقيدة. عندما يكون الكائن المصدر نباتًا ، فقد يشمل الحصاد إنتاج البذور وإنبات النبات مع تحفيز التعبير الجيني العابر من البروتين المطلوب ، كما هو موضح أدناه. بدلاً من ذلك ، يكون الكائن المصدر الذي يخضع للتعبير المؤتلف للفيروس هو مضيف غير نباتي مثل ، على سبيل المثال لا الحصر ، الكائنات البكتيرية أو الطحلبية أو الخميرة أو الحشرات أو الثدييات.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم توجيه جوانب مختلفة من التجسيدات المتعددة الموصوفة هنا لإنتاج أو تنقية ، أو كليهما ، مولد ضد يمكن أن يترافق مع فيروس. في بعض النماذج ، يكون النبات هو الكائن المصدر الذي يخضع للتعبير المؤتلف لمولد الضد بدلاً من ذلك ، الكائن المصدر الذي يخضع للتعبير المؤتلف لمولد الضد هو مضيف غير نباتي مثل ، على سبيل المثال لا الحصر ، الكائنات البكتيرية أو الطحلبية أو الخميرة أو الحشرات أو الثدييات.

بشكل مفيد ، تنتج عملية متعددة المجموعات يتم ممارستها وفقًا لنماذج مختلفة موصوفة هنا فيروسات عالية النقاء أو مولدات ضد مؤتلفة ، أو كليهما ، على نطاق تجاري. يتم استخدام خطوات مختلفة لتحسين عمليات التنقية الأولية ، مثل تخصيب فيروسات النبات. تستخدم بعض التجسيدات كروماتوجرافيا استبعاد الحجم ، بالإضافة إلى ميزات أخرى ، لإنتاج فيروسات مؤتلفة منقاة ومولدات المضادات المؤتلفة.وفقًا لذلك ، توفر النماذج المختلفة الموصوفة هنا فيروسًا واحدًا أو أكثر وواحدًا أو أكثر من مولدات الضد المناسبة لتحضير لقاح واحد أو أكثر من الفيروس المترافق ومولد الضد.

فيما يتعلق بالفيروسات ، من خلال ممارسة بعض تجسيدات منصة تنقية فيروسات مبتكرة موصوفة هنا ، تنقية فيروسات النباتات على شكل قضيب (مثل فيروسات التبغ الفسيفسائية ، أي "TMV") وفيروسات نبات عشري السطوح (مثل فسيفساء البرسيم الأحمر الفيروس). وفقًا لتجسيدات متعددة في هذه الوثيقة ، تم تحقيق تنقية TMV وفيروس فسيفساء البرسيم الأحمر ، مما يمثل فيروسين متنوعين هيكليًا من حيث الحجم والبنية. على سبيل المثال ، فيروس عشري السطوح الأصغر مثل فيروس فسيفساء البرسيم الأحمر له تناظر T = 3 ، أبعاد حوالي 31-34 نانومتر ، وحوالي 180 بروتين كابسيد. على العكس من ذلك ، يبلغ قطر TMV حوالي 18 نانومتر ، وطوله 300 نانومتر ويحتوي على 2160 بروتين كابسيد. في ضوء هذا التنوع ، عملت العملية الابتكارية على أساس نوعين مختلفين هيكليًا من الفيروسات للسماح بمرور الفيروس إلى المخلفات مع الاحتفاظ بالحطام الخلوي غير المرغوب فيه. أثناء الاستخدام ، يمكن التحكم في المعلمات التشغيلية بحيث تنتقل جميع أنواع الفيروسات إلى النفاذية ، بينما يتم الاحتفاظ بالكلوروفيل / الحطام الخلوي ، ويستمر نظام التدفق العرضي (TFF) في العمل بكفاءة دون حدوث عطل غير ملائم أو غير مناسب. تم تصميم خطوات TFF الإضافية للاحتفاظ بالفيروس مع السماح للبروتينات الأصغر بالمرور إلى المخترق ، ويتم التحكم في خطوات اللوني المزدوج لاستبعاد الفيروسات الكبيرة والصغيرة ، أثناء التقاط بروتينات الخلية المضيفة ، والحمض النووي للخلية المضيفة ، والسموم الداخلية ، ومركبات البوليفينول النباتية.

استنادًا إلى التنقية الناجحة لفيروس فسيفساء البرسيم الأحمر و TMV ، من المتوقع أن تتمكن منصة تنقية الفيروسات وفقًا لتجسيدات وبدائل متعددة من تنقية مجموعة واسعة من الفيروسات بما في ذلك: الفيروسات التي تشتمل على مجموعة من المواد الوراثية (على سبيل المثال ، المزدوجة والمفردة فيروسات الحمض النووي ، وفيروسات الحمض النووي الريبي (RNA) ، والهندسة (على سبيل المثال ، على شكل قضيب ، وقضبان مرنة ، وعشروني الوجوه) ، والعائلات (Caulimoviridae ، Geminiviridae ، Bromoviridae ، Closteroviridae ، Comoviridae ، Potyviridae ، Sequiviridae ، Tombusviridae).

تشمل الفيروسات غير المحدودة التي يُتوقع أن تنجح عليها النماذج الموصوفة هنا ، تلك الموجودة في الأجناس فيروس بادنا (على سبيل المثال فيروس التبقع الأصفر commelina) Caulimovirus (مثل فيروس موزاييك القرنبيط) فيروسات شبيهة بـ SbCMV (على سبيل المثال ، فيروسات شبيهة بفول الصويا الأخضر) فيروسات شبيهة بـ CsVMV (مثل فيروس فسيفساء الوريد الكسافا) الفيروسات الشبيهة بـ RTBV (مثل فيروس عصيات الأرز التونغرو) الفيروسات الشبيهة بوريد البطونية (مثل فيروس تطهير وريد البطونية) ماستريفيروس (المجموعة الفرعية I Geminivirus) (مثل فيروس خط الذرة) و كيرتوفيروس (Subgroup II Geminivirus) (مثل فيروس البنجر المجعد العلوي) و بيجوموفيروس (المجموعة الفرعية III Geminivirus) (مثل فيروس فسيفساء الفول الذهبي) ألفاموفيروس (مثل فيروس فسيفساء البرسيم) Ilarvirus (مثل فيروس خط التبغ) فيروس البروم (مثل فيروس بروم الفسيفساء) فيروس كوكوم (مثل فيروس موزاييك الخيار) كلوستيروفيروس (مثل فيروس اصفر البنجر) كرينيفيروس (مثل فيروس الخس الأصفر المعدي) كوموفيروس (مثل فيروس فسيفساء اللوبيا) فابافيروس (مثل فيروس ذبول الفاصوليا العريضة 1) نيبوفيروس (مثل فيروس عصابة التبغ) بوتيفيروس (مثل فيروس البطاطس Y) ريموفيروس (مثل فيروس ryegrass mosaic) بيموفيروس (مثل فيروس الفسيفساء الأصفر الشعير) Sequivirus (مثل فيروس البقعة الصفراء الجزر الأبيض) ويكافيروس (على سبيل المثال ، فيروس التونغرو الكروي للأرز) كارموفيروس (مثل فيروس قرنفل قرنفل) ديانثوفيروس (مثل فيروس قرنفل الحلق) ماكلوموفيروس (على سبيل المثال ، فيروس البقع الاخضر بالذرة) Necrovirus (مثل فيروس نخر التبغ) فيروس تومبوس (على سبيل المثال فيروس تقفز كثيف الطماطم) فيروس الشعيرات الدموية (مثل فيروس حفر جذع التفاح) Carlavirus (مثل الفيروس الكامن قرنفل) Enamovirus (على سبيل المثال ، فيروس فسيفساء البازلاء) فوروفيروس (مثل فيروس فسيفساء القمح المنقولة عن طريق التربة) Hordeivirus (مثل فيروس فسيفساء شريط الشعير) إديوفيروس (مثل فيروس قزم كثيف التوت) فيروس لوت (مثل فيروس القزم الأصفر للشعير) مارفيفيروس (مثل فيروس الذرة رايادو فينو) Potexvirus (مثل فيروس البطاطس X وفيروسات فسيفساء البرسيم) سوبموفيروس (مثل فيروس فسيفساء الفاصوليا الجنوبية) Tenuivirus (مثل فيروس شريط الأرز) توباموفيروس (مثل فيروس تبرقش التبغ) توبرافيروس (مثل فيروس حشرجة التبغ) Trichovirus (مثل فيروس بقع أوراق التفاح الاخضر) فيروس تيموفيروس (مثل فيروس الفسيفساء الأصفر اللفت) و أمبرافيروس (مثل فيروس تبقع الجزر).

تم إجراء تنقية ناجحة للفيروسات على المستوى التجاري ، وبطريقة تتوافق مع لوائح ممارسات التصنيع الجيدة. في بعض النماذج ، يكون الكائن المصدر عبارة عن نبات ، ولكن بينما تتضمن بعض الاختلافات في النماذج الحالية إنتاج فيروسات نباتية ، فإن النماذج الموصوفة هنا لا تقتصر على تصنيع أو تنقية الفيروسات في النباتات. في بعض التجسيدات ، تبدأ منصة تنقية الفيروسات من خلال زراعة النباتات في غرفة نمو مضبوطة ، وإصابة النباتات بتكاثر الفيروس ، واستعادة الفيروسات عن طريق تمزيق الخلايا باستخدام جهاز التفكك وإزالة الألياف النباتية من السائل عن طريق مكبس لولبي.

في بعض النماذج ، التي تشتمل على فيروسات نباتية وغير نباتية ، تشمل خطوات التنقية تركيز المستخلص الموضح باستخدام نظام التدفق العرضي ، حيث يتم التحكم في حجم مسام الكاسيت وضغط الغشاء وحمل المستخلص الموضح لكل متر مربع من مساحة سطح الغشاء . ضغط الغشاء (TMP) هو فرق الضغط بين جانبي المنبع والمصب لغشاء الفصل ويتم حسابه على أساس الصيغة التالية: ((ضغط التغذية + الضغط المحكم) / 2) − ضغط الطهي. لضمان مرور الفيروسات عبر السيراميك لتكوين مستخلص مصقول ، في بعض التجسيدات ، يتم التحكم في ضغط التغذية ، والضغط المتراكم ، وضغط النفاذية للحصول على TMP مناسب. يتركز المستخلص الموضح بشكل أكبر مع حجم عمود التبادل الأيوني ويتم غسله باستخدام محلول مؤقت لموازنة كروماتوغرافيا التبادل الأيوني. في بعض النماذج ، تتم معايرة عمود التبادل الأيوني CAPTO ™ Q وتحميل التغذية وتجميعها في جزء التدفق. ثم يتم غسل العمود إلى خط الأساس ويتم تجريد ملوثات الخلية المضيفة من العمود بملح عالٍ.

في بعض النماذج المصاحبة للفيروسات النباتية ، تتم إضافة محلول استخلاص قبل إزالة الكلوروفيل وغيره من المخلفات الخلوية الكبيرة مثل الألياف الجزيئية الكبيرة ، والعضيات ، والدهون ، وما إلى ذلك باستخدام ترشيح سيراميك التدفق العرضي. في بعض النماذج ، يعزز الترشيح الخزفي الاحتفاظ بالكلوروفيل من مضيفات النبات ، وبقايا الخلايا ، والشوائب الأخرى مع تحسين مرور الفيروس. سواء كان للفيروسات النباتية أو غير النباتية ، فإن هذا النهج - حيث تمر المادة المرغوبة (الفيروس أو المستضد) من خلاله على أنها تتخلل ويتم الاحتفاظ بالشوائب على أنها محتجزة - يعزز قابلية العملية للتوسع. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التحكم في جميع المعلمات مثل ضغط الغشاء وحجم المسام الخزفي والكتلة الحيوية المحملة لكل متر مربع لضمان مرور الفيروس عبر السيراميك لإنشاء خلاصة مصفاة. أنظمة TFF الخزفية قابلة للتطوير بدرجة كبيرة ويمكن تغيير حجم المعلمات مثل TMP وسرعة التدفق المتقاطع وحجم المسام ومساحة السطح بسهولة لقبول كميات أكبر من الكتلة الحيوية. يتم إضافة وحدات سيراميك إضافية بسهولة إلى النظام. يمكن أيضًا التحكم في ضغط التغذية والضغط والتخلل للحفاظ على سرعة التدفق المتقاطع الفعال مما يسمح بالقليل من تلوث النظام أو عدم وجوده. في بعض النماذج ، يتم ضبط السرعة المتقاطعة وفرق الضغط والتحكم فيهما لإنتاج TMP بحوالي 10-20 رطل / بوصة مربعة مما يسمح بمرور الفيروس بكفاءة على نطاقات أصغر وأكبر. أنظمة TFF الخزفية قابلة لاستخدام مواد كيميائية تنظيف عالية الكفاءة مثل حمض النيتريك والتبييض وهيدروكسيد الصوديوم مما يسمح بإجراء دراسات التنظيف لتلبية متطلبات GMP.

سواء كانت للفيروسات النباتية أو غير النباتية ، فإن طريقة تنقية وفقًا لتجسيدات وبدائل متعددة ، ومتسقة بطريقة أخرى مع تطوير طرق قابلة للتطوير وعالية الإنتاجية لتنقية الفيروسات ، تستخدم إجراء فصل واحدًا على الأقل باستخدام كروماتوغرافيا متعددة الوسائط فصل الشوائب المتبقية عن الفيروس على أساس الاختلافات في الحجم على الأقل بين الفيروس والشوائب ، والتفاعل الكيميائي الذي يحدث بين الشوائب ورابط كروماتوجرافي واحد أو أكثر. على سبيل المثال ، يتم تضمين إجراء فصل واحد على الأقل باستخدام راتينج كروماتوغرافيا CAPTO® Core 700 (GE Healthcare Bio-Sciences) ضمن نطاق النماذج. تشتمل "حبات" الكروماتوغرافيا CAPTO® Core 700 على بروابط أوكتيل أمين مصممة للحصول على خصائص مقاومة للماء وشحنة موجبة تحبس الجزيئات تحت حجم معين ، على سبيل المثال 700 كيلودالتون (kDA). نظرًا لأن بعض الفيروسات كبيرة إلى حد ما (على سبيل المثال أكبر من 700 كيلو داتا) ، وأن الأجزاء الخارجية للخرز غير نشطة ، فإن كروماتوغرافيا CAPTO® Core 700 تسمح بتنقية الفيروسات عن طريق استبعاد الحجم ، حيث تمر المادة المرغوبة (الفيروس أو المستضد) عبرها على أنها نفاذة وتكون الشوائب تم الاحتفاظ بها كمحتفظ بها.

في بعض النماذج ، مرة أخرى بالنسبة للفيروسات النباتية وغير النباتية على حد سواء ، قبل العمود اللوني متعدد الوسائط ، يتم إجراء الموازنة بخمسة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للتوازن. في بعض النماذج ، يتم تحميل أجزاء التدفق المتدفق والغسيل المجمعة من كروماتوغرافيا التبادل الأيوني CAPTO ™ Q على عمود كروماتوغرافيا متعدد الوسائط ويتم جمع الفيروس في الحجم الفارغ للعمود. يتم غسل العمود إلى خط الأساس وتجريده باستخدام هيدروكسيد الصوديوم عالي التوصيل. توفر جوانب بعض التجسيدات التحكم في نسبة التحميل ، وارتفاع طبقة العمود ، ووقت الإقامة ، ومخازن الكروماتوغرافيا أثناء هذه الخطوة.

يتم ترشيح الفيروس المنقى معقم ، على سبيل المثال بالترشيح ، وتخزينه.

فيما يتعلق بالمستضدات ، من خلال ممارسة بعض تجسيدات منصة تنقية مستضد مبتكرة موصوفة هنا ، المستضدات المؤتلفة H5 هيماجلوتينين (rHA) ، H7 rHA ، المجال الثالث من فيروس غرب النيل (WNV rDIII) ، وفيروس حمى اللاسا المؤتلف تم إنتاج البروتين 1/2 (LFV rGP1 / 2) وتنقيته. يمكن أن تكون المستضدات الخاصة بالتجسيدات المختلفة هنا من عدة مصادر ، ويمكن إنتاجها باستخدام استراتيجيات تصنيع البروتين المأشوب التقليدية ، بما في ذلك أساليب التعبير البكتيرية أو الخميرة أو الحشرات أو الثدييات أو المعتمد على النبات.

في بعض النماذج ، تبدأ منصة تصنيع مولد الضد بزراعة النباتات في غرفة نمو مضبوطة ، مما يؤدي إلى إصابة النباتات لتكاثر مولد الضد المؤتلف ، ثم استعادة مولد الضد باستخدام المفكك متبوعًا بإزالة الألياف من السائل المائي عبر مكبس لولبي. تمت إضافة محلول استخلاص للمساعدة في إزالة الكلوروفيل (في سياق النبات) والحطام الخلوي الكبير عن طريق الترشيح. سواء كان مستضدًا نباتيًا أو غير نباتي ، يتم التحكم في ضغط التغذية وحجم مسام الترشيح وعامل التصفية والكتلة الحيوية المحملة لكل متر مربع من سطح الغشاء) لتسهيل مرور المستضدات عبر المرشح. يتم التعبير عن وصف (على الرغم من عدم تقييده) للعديد من عناصر التحكم أثناء العملية المناسبة لتحقيق تنقية الفيروس ومستضد واسع النطاق بمزيد من التفصيل في قسم الأمثلة.

في بعض التجسيدات ، مستضدات نباتية وغير نباتية على حد سواء ، يتم تركيز المستخلص الموضح بعد ذلك باستخدام نظام تدفق مماسي. خلال هذه الخطوة الاختيارية ، يتم التحكم في العوامل بما في ذلك حجم مسام الكاسيت وضغط الغشاء وحمل المستخلص الموضح لكل متر مربع من سطح الغشاء. في بعض النماذج ، يتم تخطي الخطوة الاختيارية بالكامل. بعد ذلك ، يتم تركيز المستخلص الموضح بعد ذلك وغسله باستخدام محلول مؤقت لموازنة كروماتوغرافيا التبادل الأيوني. تتمثل إحدى طرق تنفيذ هذه الخطوة في تحميل التغذية على عمود التبادل الأيوني CAPTO ™ Q المتزن ، ثم الغسل باستخدام محلول موازنة وتصفية / نزع بالملح. يتم بعد ذلك جمع أجزاء المستضد في الشطف وتحضيرها للكروماتوغرافيا تقارب المعدن المثبت بالكوبالت (IMAC). تتم معايرة IMAC ، وتحميل التغذية ، ثم غسلها بمخزن موازنة والتصفية. يتم تخفيف جزء الشطف والتحقق من الأس الهيدروجيني ، ثم يتم تحميله على عمود كروماتوجرافيا سيراميك متعدد الوسائط هيدروكسيباتيت (CHT). تتم معايرة راتينج CHT بمخزن موازنة ويتم التصفية من المستضدات. تعد نسبة التحميل ، وارتفاع طبقة العمود ، ووقت الإقامة ، والمخازن المؤقتة للكروماتوغرافيا من بين العوامل التي يتم التحكم فيها. أخيرًا ، يتركز المستضد ويتم تصفيته باستخدام محلول ملحي. يتم ترشيح المستضد المؤتلف معقم ثم تخزينه.

علاوة على ذلك ، وفقًا للنماذج المختلفة التي تم الكشف عنها هنا ، H7 rHA و TMV ، و H1N1 (الأنفلونزا A / ميشيغان) إلى TMV ، و H3N2 (الأنفلونزا A / سنغافورة) إلى TMV ، و TMV إلى فيروسي الإنفلونزا B (B / Colorado و B / Phuket) بنجاح. في بعض التجسيدات ، يتكون البروتين من أي نوع من العوامل العلاجية القادرة على الاقتران بفيروس لتكوين لقاح ، ثم يتم توصيله إلى الكائن المصدر لإنتاج استجابة مناعية وفقًا لنماذج وبدائل متعددة. وفقًا لذلك ، توفر عمليات الكشف في هذه الوثيقة تركيبات تشتمل على مجموعة من اتحادات البروتين-الفيروس ، بما في ذلك اتحادات مولد الضد الفيروسي. في بعض النماذج ، يكون الفيروس المختار هو TMV ، أو أي عدد من الفيروسات المحددة و / أو المشار إليها في التعاليم هنا. بالإضافة إلى ذلك ، في بعض النماذج ، يمكن أن يكون البروتين مستضدًا ، مثل على سبيل المثال لا الحصر مستضد هيماجلوتينين الإنفلونزا (HA) ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تلك المدرجة في هذه الفقرة. في بعض النماذج ، يُظهر HA على الأقل حوالي 50٪ تشكيل ثلاثي. HAs مهمة سريريًا لأنها تميل إلى التعرف عليها من خلال بعض الأجسام المضادة التي ينتجها الكائن الحي ، مما يوفر الدافع الرئيسي للحماية ضد عدوى الأنفلونزا المختلفة. نظرًا لأن مستضد HA وبالتالي مناعة HA مرتبطان بالتشكيل ، فمن المعروف أن تقليم HA مفيد على الشكل الأحادي من حيث إثارة الاستجابات المناعية.

في بعض النماذج ، يبدأ الاقتران بتركيز و diafiltering مستضد وفيروس نقي إلى مخزن مؤقت حمضي قليلاً. ثم يتم الجمع بين المستضد والفيروس بناءً على المولارية والخلط. يضاف إلى الخليط كربوديميد طازج قابل للذوبان في الماء ، مثل 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (المعروف أيضًا باسم EDC) أثناء الخلط على أساس المولارية. يُضاف بعد ذلك كاشف كيميائي لتحويل مجموعات الكربوكسيل إلى استرات أمينية متفاعلة N-hydroxysulfosuccinimide ، مثل ThermoFisher's Sulfo-NHS ، بناءً على المولارية. يستمر التفاعل حتى وقت التوقف المحدد مسبقًا. يتم بعد ذلك إخماد التفاعل ، مع نموذج واحد يتضمن إضافة مجموعة أمين (على سبيل المثال ، سائل يحتوي على أمين حر) ويتم إزالة أي رابط (روابط) كيميائية مستخدمة في تسهيل التفاعل (على سبيل المثال ، EDC ، Sulfo-NHS) من خلال - خطوة الكروماتوغرافيا النموذجية أو الترشيح ، مع تخفيف الخليط بعد ذلك إلى التركيز المستهدف. في بعض النماذج ، يمكن استخدام جسيمات الفيروس المترافقة والمنقاة المزينة بالبروتينات والمستضدات في اللقاحات و / أو أدوات التشخيص. يمكن استخدام هذه الجسيمات كأدوات تشخيصية بسبب قدرتها على تتبع المستضدات في الكائن الحي المضيف.

في بعض النماذج ، يمكن اشتقاق انصهار مولد ضد الفيروس المنقى من الاندماج الجيني ، بالإضافة إلى النماذج المختلفة التي تم الكشف عنها هنا. تشكل البروتينات الهيكلية للمستضد والفيروسات (الموجودة في الغلاف) إطار قراءة مفتوحًا واحدًا مستمرًا. في بعض النماذج ، ينتج إطار القراءة بروتين غلاف مستضد في نبات بحيث يتجمع بروتين الغلاف ذاتيًا في جسيمات فيروسية. بعد ذلك ، يتم حصاد المواد النباتية وتنقية جزيئات الفيروس وفقًا للنماذج الموضحة هنا. يمكن بعد ذلك استخدام جزيئات الفيروس المزينة ببروتينات الغلاف الاندماجي كلقاح و / أو أداة تشخيص وفقًا للتجسيدات المختلفة التي تم الكشف عنها.

تتضخم بعض الفيروسات (مثل فيروسات الإيكوساهدرا كمثال غير محدود) تحت ظروف أس هيدروجيني معينة وفي بعض النماذج يمكن استخدام هذا "التورم" للاقتران. وفقًا لنماذج وبدائل متعددة ، يمكن اقتران الفيروس المنقى بعامل علاجي عن طريق تعريض بنية الفيروس لظروف الأس الهيدروجيني الحمضية التي تتسبب في "انتفاخ" الفيروس. من خلال معالجة بنية الفيروس مع ظروف الأس الهيدروجيني المحايدة ، يرتاح هيكل الفيروس ويخلق مسامًا بين البنتامير أو الوحدات الفرعية الهيكلية الأخرى للفيروس. بعد ذلك ، يُضاف عامل علاجي (مثل عامل العلاج الكيميائي) إلى المخزن المؤقت ويُسمح له بالانتشار في جسيم الفيروس المريح. عن طريق تغيير الأس الهيدروجيني مرة أخرى ، تشد جزيئات الفيروس وتزيل الهياكل المسامية التي تغلف الخماسي أو الخواص الهيكلية معًا بحيث يتم منع الانتشار الكيميائي داخل أو خارج جسيم الفيروس. بعد ذلك ، يتم حصاد المواد النباتية ، وتنقية جزيئات الفيروس ، واستخدام جزيئات الفيروس المحتوية على عامل علاجي لتوصيل الدواء ، وفقًا للنماذج التي تم الكشف عنها هنا.

وفقًا لذلك ، تشتمل النماذج والبدائل المتعددة على إنتاج واحد أو أكثر من الفيروسات عالية النقاء. علاوة على ذلك ، تشتمل النماذج والبدائل المتعددة على إنتاج أو تنقية أو كليهما لمولد ضد مؤتلف. علاوة على ذلك ، تشتمل النماذج والبدائل المتعددة على اقتران المستضدات والفيروسات المنقاة لاستخدامها كلقاحات. يمكن إجراء تنقية الفيروسات بمفردها وفقًا للتجسيدات الحالية. وبالمثل ، يمكن ممارسة إنتاج أو تنقية المستضدات المؤتلفة وحدها وفقًا للتجسيدات الحالية. اختياريًا ، أيضًا ، يمكن دمج جوانب مختلفة من هذه التجسيدات المتعددة ، حيث تتضمن التجسيدات المجمعة ، من بين طرق أخرى لممارسة هذه التجسيدات ، بدءًا من واحد أو أكثر من الكائنات المصدر ، والتي ينتج منها فيروس واحد أو أكثر وفيروس واحد أو أكثر المستضدات ، ثم تنقية هذه الفيروسات والمستضدات ، ثم تكوين لقاحات تترافق بين مستضد واحد على الأقل وفيروس واحد على الأقل.


نتائج

تحديد عزر تكرار بيريميدين في mRNAs ترميز بروتينات إفراز الخميرة

أكواد الحمض النووي الريبي (RNA) للمخلفات الكارهة للماء (ه.ز. فالين ، إيزولوسين ، ليسين ، ميثيونين ، وفينيل ألانين) مخصب في اليوراسيل في موضعهم الثاني [31] ، على الرغم من أن البعض الآخر مثل البرولين ، والألانين ، والسيرين ، والثريونين ، والتي يمكن العثور عليها أيضًا في اضطرابات المفصل الفكي الصدغي ، تحتوي على السيتوزين في هذا الموضع. لذلك ، توقعنا أن يتكرر الشكل الثلاثي ، نيويورك (أين N = أي نوكليوتيد و ص = بيريميدين - U أو C) ، قد يكون شائعًا للبروتينات الموجهة للترجمة في ER (أنا.ه. البروتينات المفرزة والغشائية). لقد توقعنا كذلك أن التكرار غير المنقطع من هذا النوع قد يكون مؤشراً على فكرة توطين الحمض النووي الريبي التي يمكن أن توجد في أي إطار. وهكذا ، قمنا بفحص mRNAs المشفر لبروتينات إفراز الخميرة لوجود تكرارات بيريميدين متتالية كل نوكليوتيد ثالث (أنا.ه. YNN, نيويورك، أو نيويورك) في منطقتي التشفير و UTR باستخدام التحليل الحسابي.

لقد حددنا أولاً عدد توائم النوكليوتيدات التكرارية التي قد تفرق أفضل mSMPs من non-mSMP (أنا.ه. mRNAs الأخرى المشفرة نوويًا). لذلك ، تم تسجيل عدد التكرارات الثلاثية المتتالية على طول نسخة mRNA وفقًا لعتبة محددة (ه.ز. 5 و 7 و 10 و 12 و 15 يكرر). بالنسبة لعنصر عشوائي ، توقعنا أن نرى ارتباطًا خطيًا بين احتمال ظهوره (ظهوره) في جين بطول الجين ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. قمنا بفحص أطوال SECReTE بين 5 و 15 (ه.ز. أطوال النوكليوتيدات الثلاثية 5،7،10،12 و 15) ولاحظت بالفعل وجود علاقة مباشرة بين عدد SECReTE وطول الجين لـ SECReTE5 و SECReTE7 (الشكل 1A). ومع ذلك ، فإن الاعتماد على طول الجين يصبح ضعيفًا بشكل كبير بالنسبة لـ SECReTE10 وما فوق ، حيث يرتبط حدوث الحافز عند ≥10 ثلاثة توائم بشكل سيئ مع طول الجين (الشكل 1 أ). هذا يعني أن وجود 10 تكرارات متتالية ليس ظاهرة عشوائية وقد يكون مهمًا.

(أ) الارتباط بين عدد SECReTE وطول النص. تم حساب إجمالي عدد SECReTE لمنطقة الترميز لكل جين خميرة (تم تسجيل 5904 جينًا) عن طريق حساب عدد الجينات المتتالية نيويورك يكرر الموجود في تسلسل النص وفقًا للعتبة المشار إليها وفي جميع الإطارات الثلاثة. تمثل مخططات التبعثر الارتباط بين عدد SECReTE وطول الجين. لا يرتبط تعداد SECReTE بأطوال الجينات فوق عتبة 10 نيويورك يعيد (SECReTE10). ص يمثل معامل ارتباط بيرسون. (ب) أشكال SECReTE أكثر وفرة في ترميز mRNAs للبروتينات الإفرازية من البروتينات غير الإفرازية. تم حساب وجود SECReTE ، وفقًا للعتبة المشار إليها ، في ترميز mRNAs للبروتينات الإفرازية (الزرقاء) والبروتينات غير المفرزة (الرمادية). تمثل الأشرطة جزء النصوص الإيجابية لـ SECReTE عند الحد المشار إليه. تكون وفرة SECReTE أعلى بشكل ملحوظ في mRNAs الإفرازية. *ص ≤ 2.28E-13 ، اختبار كاي تربيع. (ج) يزيد SECReTE10 من القدرة على التمييز بين النصوص السرية. تم رسم منحنيات ROC لكل من العتبات المشار إليها. تم استخدام النصوص السرية كمجموعة "إيجابية حقيقية" ، بينما تم استخدام النصوص غير السرية كمجموعة "سلبية حقيقية". كانت AUC (المنطقة الواقعة تحت المنحنى) لـ SECReTE10 هي الأعلى.

إذا كرر SECReTE 10 (ه.ز. يُطلق عليها هنا "SECReTE10") دورًا في إفراز البروتين ، ونتوقع أن تكون أكثر وفرة في mRNAs التي تشفر بروتينات الإفراز ، على النحو المحدد وفقًا لـ Ast وآخرون. [19]. لاختبار هذا الاحتمال ، قمنا بتقسيم جينوم الخميرة الكامل إلى مجموعتين من الجينات: secretome و non-secretome ، وقمنا بحساب جزء النسخ التي تحتوي على مثيل واحد على الأقل من SECReTE لكل جين في كل مجموعة جينية. وجدنا أن ترميز النصوص لبروتينات الإفراز مخصب بزخارف SECReTE بطول و gt7 (الشكل 1 ب) ، مقارنة بالنصوص التي تشفر البروتينات غير المفرزة. لاختبار طول النموذج الذي يعطي الفصل الأكثر أهمية بين النصوص الإفرازية وغير السرية ، قمنا بتقييم العتبات المختلفة لقدرتها على تصنيف mSMPs باستخدام تحليل خصائص مشغل المستقبِل (ROC). حسن النية تم استخدام نصوص ترميز البروتين المفرز كمجموعة إيجابية حقيقية وتم تعريف نصوص ترميز البروتين غير المفرز على أنها سلبيات حقيقية. كما رأينا (الشكل 1 ج) ، الزخارف مع تكرار 10 (أنا.ه. SECReTE10 وما فوق) متباينة إلى أقصى حد (من حيث منطقة ROC تحت المنحنى) نصوص إفرازية من نصوص غير سرية. نظرًا لأن حدوث SECReTE10 لم يُظهر اعتمادًا على طول الجين وأعطى الفصل الأكثر أهمية بين النصوص الإفرازية والنسخ غير السرية ، فقد استخدمناها كعتبة لتحديد وجود الحافز في التحليلات اللاحقة. استخدمت الدراسات السابقة تحليلات عالية الإنتاجية لتحديد مستوى إثراء النصوص على الريبوسومات والأغشية ER المرتبطة بالخميرة [22،23]. من خلال مقارنة التوزيع التراكمي لقيمة تخصيب ER للنصوص المحتوية على SECReTE10 مع النصوص التي تفتقر إلى SECReTE10 ، يمكننا التحقق من أن جزءًا أكبر من النصوص المحتوية على SECReTE10 مخصب بالفعل على الريبوسومات المرتبطة بـ ER (S1A و S1B الشكل) وأغشية ER ( الشكل S1C). في المقابل ، لا يتم إثراء النصوص المحتوية على SECReTE10 على ريبوسومات الميتوكوندريا ، مقارنة بالنصوص التي تفتقر إلى SECReTE (الشكل S1D).

وفرة السرية في mSMPs لا تعتمد على وجود TMD

للتأكد مما إذا كان تخصيب SECReTE في mSMPs لا يرجع فقط إلى وجوده في TMDs المشفرة ، فقد حددنا في أي موضع للنيوكليوتيدات الثلاثية في عناصر SECReTE10 هو بيريميدين (ص) يقع: أنا.ه. أول (YNN) ثانيا (نيويورك) أو الثالث (نيويورك). حسبنا وفرة SECReTE10 بشكل منفصل لكل موضع باستخدام تسلسلات الترميز فقط (أنا.ه. من كود البداية إلى إيقاف كودون CDS) وبدون UTRs. أثناء وجود الإشارة في الموضع الثاني (الشكل 2 أ نيويورك) ، كما هو متوقع ، فهو متوفر أيضًا في الموضع الثالث من الكودون (الشكل 2 أ نيويورك). في المقابل ، يتم تمثيل عنصر SECReTE10 بشكل سيئ في الموضع الأول ، YNN (الشكل 2 أ). الأهم من ذلك ، وفرة NNY-تشير الأشكال القائمة على أن TMD ربما ليس العنصر الوحيد الذي يمنح الإثراء السري في تسلسل تشفير الخميرة mSMPs. قائمة بجميع أشكال SECReTE (أنا.ه. ≥10 يعيد إما نيويورك- أو NNY-أساس) الموجودة في تسلسل ترميز جينوم الخميرة وموضعها داخل mRNA مدرج في جدول S3.

(A) SECReTE متوفرة بكثرة في الموضع الثاني من الكودون. تم حساب وفرة SECReTE لكل موضع كودون على حدة. تعد وفرة SECReTE في mSMP أكثر أهمية في موضع الكود الثاني (نيويورك) ، ولكن تم اكتشاف فروق ذات دلالة إحصائية أيضًا في المركز الثالث (نيويورك). *ص≤ 9.9E-10 ، اختبار مربع كاي. (ب) SECReTE هي أيضًا وفيرة للغاية في mRNAs التي ترميز بروتينات إفراز قابلة للذوبان. تم فحص وجود SECReTE10 بشكل منفصل للبروتينات المحتوية على TMD والبروتينات القابلة للذوبان. يحتوي جزء أكبر من ترميز mRNAs للبروتينات المفرزة القابلة للذوبان (Secretome بدون سماوي TMD) على SECReTE مقارنة بالنصوص غير الإفرازية ، إما مع أو بدون TMD (غير مفرز مع TMD رمادي غامق ، غير سري بدون TMD رمادي فاتح). في موقع الكودون الثالث (نيويورك) ، فإن جزء البروتينات المفرزة القابلة للذوبان أكبر من البروتينات المفرزة المحتوية على TMD وهي مهمة. *ص≤3.03E-3 ، اختبار كاي تربيع. (C) SECReTE متوفرة بكثرة في الموضع الثالث بعد إزالة تسلسل TMD. تم تسجيل وجود SECReTE10 في ترميز mRNAs لبروتينات الغشاء بعد إزالة TMD المشفر. SECReTE10 أكثر وفرة بشكل ملحوظ في المركز الثالث (نيويورك) في mRNAs التي تشفر بروتينات إفرازية (زرقاء) من البروتينات غير الإفرازية (باللون الرمادي) ، حتى بعد إزالة تسلسل TMD. *ص = 0.01 ، اختبار كاي تربيع. (D) SECReTE متوفرة بكثرة في mSMPs بعد إزالة تسلسل SSCR. تم تسجيل وجود SECReTE10 في المواقف المختلفة بعد إزالة ببتيدات إشارة ترميز المناطق. على غرار النتائج المعروضة في ب، يتم إثراء ترميز mRNAs للبروتينات المفرزة القابلة للذوبان (السماوي) بـ SECReTE ، مقارنة بالنصوص غير الإفرازية التي لا تحتوي على TMD (رمادي فاتح). في موقع الكودون الثالث (نيويورك) ، فإن جزء البروتينات المفرزة القابلة للذوبان أكبر من جزء البروتينات المفرزة المحتوية على TMD وهو مهم. *ص≤5.93E-3 ، اختبار مربع تشي.

بعد ذلك ، تحققنا من وجود SECReTE10 في ترميز mRNAs للبروتينات المحتوية على TMD والبروتينات القابلة للذوبان المفرزة بشكل منفصل. كما هو متوقع ، تحتوي المزيد من النصوص التي تشفر بروتينات إفراز TMD المحتوية على TMD على SECReTE10 (أنا.ه. ≥1 SECReTE10) في المركز الثاني (نيويورك) من النصوص التي تشفر البروتينات المفرزة القابلة للذوبان (الشكل 2 ب). ومع ذلك ، فإن جزء ترميز النصوص للبروتينات المفرزة القابلة للذوبان والتي تحتوي على SECReTE واحد على الأقل في الموضع الثالث (نيويورك) أعلى من ذلك. يوفر هذا دليلًا مقنعًا على إثراء SECReTE10 في النصوص المستقلة عن مناطق TMD المشفرة. في المقابل ، عندما أزلنا تسلسلات TMD من بروتينات الغشاء المشفرة للـ mRNA ، وجدنا أن هذه النسخ لم تعد مخصبة باستخدام نيويورك- شكل قائم على SECReTE10 (الشكل 2 ج). في المقابل ، بقي SECReTE10 وفيرًا في المركز الثالث ، نيويورك، بعد إزالة TMD (الشكل 2C). وبالتالي ، فإن متواليات TMD تساهم في نيويورك-وفرة السرية. أخيرًا ، نلاحظ أن إزالة متواليات TMD من الجينات التي تشفر البروتينات السرطانية وغير السرطانية لم تغير الإثراء العام لـ SECReTE في تلك الرسائل السرية مقابل الرسائل غير السرية ، كما أنها لم تغير عتبة التمييز بين هذه المجموعات (S1E) تين).

امتدادات متجاورة من الكودونات للأحماض الأمينية الكارهة للماء (أنا.ه. TMDs) تعزز وفرة SECReTE ، لقد درسنا أيضًا ما إذا كانت إزالة مناطق تشفير تسلسل الإشارة (SSCRs) ، التي تشفر ببتيدات الإشارة ، من جينات الإفراز لها تأثير على التحليل الحسابي لدرجة SECReTE (الشكل 2D). ومع ذلك ، تشير النتائج إلى أنه لم يتم حدوث أي تغيير كبير في الجزء الكلي من جينات الإفراز التي تحمل SECReTE عند إزالة SSCR ولا يتم تغيير ذلك من خلال وجود TMD أو موضع التصميم (قارن الشكل 2D إلى 2B). وبالتالي ، فإن SSCRs لا تساهم بشكل كبير في وفرة SECReTE.

نظرًا لأن استنفاد SRP لا يمنع استهداف ER الترجمي المشترك لتشفير mRNAs المتوقع للبروتينات المستقلة عن SRP [24] ، قمنا بفحص ما إذا كانت النصوص المستقلة لـ SRP على الريبوسومات المرتبطة بالخميرة ER أكثر إثراءً بـ SECReTE10 من تلك المعتمدة على SRP (S2A- الشكل S2D). باستخدام مجموعة البيانات هذه [24] ، وجدنا أن كلاً من النصوص المعتمدة على SRP والمستقلة تحتوي على SECReTE10 (الشكل S2B). ومع ذلك ، تعتمد على SRP (أنا.ه. تحتوي النصوص التي تحتوي على TMD بشكل أساسي على ملفات نيويورك-عزر قائم ، في حين أن كليهما نيويورك- و NNY-تظهر الأشكال القائمة في النصوص المستقلة عن SRP (S2B و S2C Fig). علاوة على ذلك ، يبدو أن المجموعة الفرعية من mRNAs التي تظل مرتبطة بـ ER بعد استنفاد SRP كلها مخصبة في NNY-مقرها SECReTE (S2D Fig).

SECReTE هي الفكرة الرئيسية للتسلسل المتكرر في النصوص السرية

عناصر تسلسل النوكليوتيدات الثلاثية المتكررة [أنا.ه. NNX أين X = أي من خمسة تركيبات أخرى من ثنائي النوكليوتيدات: K (T / G) ، M (C / A) ، R (A / G) ، S (G / C) ، أو W (A / T)] بخلاف نيويورك قد توجد في نصوص سرية وتمييزها عن النصوص غير السرية. وبالتالي ، قمنا بفحص وجود 10 دون انقطاع NNX يتكرر في تسلسل الترميز للبروتينات الإفرازية وغير الإفرازية. لم يكشف فحص جينوم الخميرة عن أي تكرار مهم NNXيتكرر ثلاثي قائم على mSMPs ، باستثناء ما شوهد للبيريميدين (أنا.ه. نيويورك). علاوة على ذلك ، لم يتغير هذا عند إزالة تسلسلات TMD من التحليل ، مما يشير إلى أن تسلسل المناطق المحيطة بـ TMD لا ينتج عنه نماذج SECReTE من جديد (الشكل S3A و S3B). في المقابل ، وجدنا أن مكررات R (البيورين) و W مخصبة في الموضع الثالث لجزء كبير من النصوص غير السرية ، خاصة بعد إزالة TMD (S3A و S3B الشكل). يشير هذا إلى أن SECReTE هي الفكرة الرئيسية ، إن لم تكن الوحيدة ، النوكليوتيدات ثلاثية التكرارات ≥10 في جينات ترميز البروتين الإفرازي للخميرة ، على الرغم من التكرار. NNR يمكن تحديد الحافز في الموضع الثالث لمجموعة فرعية من الجينات غير السرية. لا توجد زخارف إضافية في الموضع الأول أو الثاني (أنا.ه. XNN, NXN) في الجينات غير السرية.

بعد ذلك ، قمنا بفحص توزيع SECReTE في مناطق مختلفة (أنا.ه. 5’UTR، CDS، 3’UTR) من جينات الخميرة. وجدنا أن الغالبية العظمى (& gt90٪) من أشكال SECReTE (8211 من 9003) موجودة في مناطق CDS (الشكل S4A ، يسار) ، ومع ذلك ، فإن التوزيع العام منحاز إلى 5 'و 3' UTRs ، عند تطبيعه. لمتوسط ​​طول هذه المناطق الأصغر (S4A الشكل ، يمين). نصوص Secretome (1144) الواردة

35 ٪ من إجمالي أشكال SECReTE ، وهي كمية أكبر نسبيًا من تلك الخاصة بالنصوص غير السرية (4760) ، على الرغم من أن النموذج يتم تمثيله بشكل متساوٍ إلى حد ما في كل من CDS ومناطق UTR المنفصلة بعد التطبيع للطول. كشف رسم خرائط توزيع الحافز على طول طول الجين بالكامل (بعد التطبيع) عن توزيع موحد في النصوص المحتوية على TMD ، ولكنه أظهر أيضًا أن عددًا من النصوص يشفر البروتينات القابلة للذوبان (

60) لديك تفضيل لـ SECReTE في نهاية 5 ، حيث يمكن التخلص من هذا التوزيع عند إزالة SSCR (S4B الشكل). وبالتالي ، على الرغم من حقيقة أن SSCRs لا تساهم بشكل كبير في وفرة SECReTE الإجمالية (الشكل 2D) ، فإن هذا لا يستبعد احتمال عدم وجود الحافز فيها. فحص كلاهما نيويورك- و NNY-أظهرت أشكال SECReTE المعتمدة في مناطق الترميز أن كلاهما يساهم في وجود العزر في نهاية 5 'من نفس المجموعة الفرعية من النصوص التي تشفر البروتينات المفرزة القابلة للذوبان (S4B الشكل).

عند مقارنة نماذج SECReTE الموجودة في CDS بتلك الموجودة في UTRs ، وجدنا أن أشكال CDS تميل إلى أن تتكون من RRY يكرر بدلاً من NNY-يكرر على أساس (S4C الشكل). من ناحية أخرى ، فإن الزخارف السرية التي تعيش في UTR هي إحصائيًا غنية بالبيريميدين ، وبالتالي فهي منحازة نحو نيويورك نمط التكرارات (S4C الشكل). بعد ذلك ، تحققنا مما إذا كانت UTRs للنصوص السرية غنية بالبيريميدين بشكل عام. في الواقع ، وجدنا أن النصوص السرية تحتوي على محتوى Y أعلى قليلاً في UTR (S4D الشكل) ، ومع ذلك ، يختفي هذا الإثراء بعد إزالة UTRs المحتوية على SECReTE من التحليل (ه.ز. 43 و 99 نسخة لـ 5 'و 3’UTRs ، على التوالي) (S4E الشكل). هذا يعني أن أشكال SECReTE تساهم في إثراء بيريميدين لـ UTRs في النصوص السرية.

وفرة SECReTE لا تعتمد على استخدام الكودون

هناك احتمال أن يكون إثراء SECReTE ناتجًا عن استخدام الكودون للنسخة. للتحقق من هذا الاحتمال ، أجرينا تحليل اختبار التقليب. في هذه الحالة ، تم خلط كل تسلسل جيني عشوائيًا (1000 مرة) ، بينما ظل استخدام الكودون ثابتًا. ثم حسبنا درجة Z (أنا.ه. عدد الانحرافات المعيارية عن المتوسط) لـ SECReTE10 لكل جين لتقييم احتمالية ظهور الإشارة بشكل عشوائي. من خلال النظر في توزيع نقاط Z في الجينات الإفرازية وغير السرية ، يمكن استنتاج أن إثراء SECReTE في mSMPs ليس نتيجة عشوائية لاستخدام الكودون (S5A الشكل). هذا الاستنتاج صالح لتشفير mSMPs كل من البروتينات الغشائية والقابلة للذوبان (S5B الشكل). أجرينا أيضًا التحليل لكل موضع نيوكليوتيدات في الكودون بشكل منفصل (أنا.ه. ل YNN, نيويورك، و نيويورك إصدارات من الحافز). لذلك ، قمنا بحساب جزء الجينات بدرجة Z كبيرة (≥1.96) لكل موضع على حدة. كان جزء الجينات ذات الدرجة Z المهمة أكبر في الجينات الإفرازية عنها في الجينات غير الإفرازية في كل من الموضعين الثاني والثالث من الكودون (S5C الشكل) ، مما يعزز فكرة أن SECReTE أكثر إثراء بشكل ملحوظ في تلك المواقف. لا تعتمد هذه النتيجة على وجود TMDs ، نظرًا لأن جزء الجينات التي لها درجة Z كبيرة كانت أكبر لكل من النصوص الإفرازية القابلة للذوبان والتي تحتوي على TMD ، بدلاً من النصوص غير القابلة للذوبان والمحتوية على TMD (الشكل S5D) .

يتم إثراء جدار الخلية وبروتينات الخميرة المحتوية على ببتيد الإشارة و TMD في الخميرة بـ SECReTE

لتحديد تلك الفئات الجينية التي تم تمثيلها بشكل كبير مع الجينات المحتوية على SECReTE ، تم إجراء تحليل تخصيب الجينات (GO). عندما تحتوي الجينات التي تحتوي على حدث واحد على الأقل من SECReTE10 في أي من YNN-, نيويورك- أو NNY-تم البحث عن النماذج القائمة على تخصيب GO (باستخدام جميع جينات الخميرة كخلفية) ، مما لا يثير الدهشة ، تم العثور على بروتينات الغشاء ذات درجة تخصيب عالية (تخصيب الطي = 1.67) (الشكل 3 أ). كانت فئة الجينات الأكثر تخصيبًا بـ SECReTE هي تلك التي تشتمل على بروتينات جدار الخلية (إثراء الطي = 1.8) (الشكل 3 أ). عندما 15 نيويورك التكرارات بمثابة عتبة ، زاد التخصيب المتغير لفئة بروتين جدار الخلية إلى 4.8 أضعاف (الشكل 3 ب). لمزيد من توصيف mRNAs المخصب بـ SECReTE ، قمنا بتقسيم Secretome و non-secretome إلى مجموعات فرعية وحساب جزء النصوص التي تحتوي على SECReTE10 في كل فئة. بالاتفاق مع تحليل GO ، تمتلك أكثر من 90 ٪ من ترميز mRNAs لبروتينات جدار الخلية أشكال SECReTE10 (وما فوق) وكانت بروتينات جدار الخلية هي الأكثر ثراءً بشكل عام في SECReTE (الشكل 3C). ومن المثير للاهتمام ، أن هذه المجموعة تضم أيضًا المجموعة الرئيسية من النصوص التي تظل مرتبطة بالريبوسومات المرتبطة بـ ER بعد استنفاد SRP (S2E و S2F الشكل). بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن 86 ٪ من mRNAs للبروتينات التي تشفر كلاً من TMD ومناطق تسلسل الإشارة (SS) ، وكذلك 84 ٪ من mRNAs التي ترميز TMD ، تحتوي على SECReTE10 (الشكل 3C). من بين هؤلاء ، تحتوي mRNAs التي تشفر البروتينات المرتكزة على الذيل (TA) على أقل عدد من النصوص مع SECReTE10 في الإفراز (الشكل 3C). من المعروف أن بروتينات TA تنتقل إلى ER من خلال مسار بديل (GET) بعد ترجمتها في العصارة الخلوية [32-34] ، ولا يتم إثراء نسخها على أغشية ER [22،23] سواء قبل أو بعد استنفاد SRP [24] ]. هذا يعني أن SECReTE أكثر وفرة في mRNAs التي تخضع للترجمة في ER. في المقابل ، نصوص البروتينات غير الإفرازية (أنا.ه. تمتلك الميتوكوندريا والنووية السيتونية) أقل وفرة من عناصر SECReTE (الشكل 3C).

(أ) تحليل علم الوجود المكون الخلوي للجينات التي تحتوي على SECReTE10. تُظهر الجينات التي تشفر بروتينات جدار الخلية ، وكذلك البروتينات الغشائية ، أعلى درجات الإثراء وأهمها. (ب) تحليل علم الوجود المكون الخلوي للجينات التي تحتوي على SECReTE15. الجينات التي تشفر بروتينات جدار الخلية هي الأكثر إثراءً بـ SECReTE. (ج) وفرة SECReTE10 في مجموعات مختلفة من الجينات. تحتوي أكثر من 90٪ من بروتينات mRNA المشفرة المشروحة لتوطين جدار الخلية على SECReTE. كما لوحظت وفرة عالية من SECReTE في مجموعات إفرازية أخرى باستثناء البروتينات المثبتة على الذيل (TA). mRNAs الميتوكوندريا (ميتو) لديها وفرة منخفضة SECReTE. تمثل الأرقام الموجودة فوق الأشرطة عدد الجينات في كل مجموعة. (د) تحليل MEME لنصوص جدار الخلية. تم الكشف عن فكرة مشابهة لـ SECReTE في نصوص جدار الخلية باستخدام MEME. أرقام على x يشير المحور إلى الرقم الأساسي.

نظرًا لأن SECReTE غنية جدًا بترميز mRNAs لبروتينات جدار الخلية ، أردنا التحقق مما إذا كان من الممكن اكتشافها باستخدام أداة بحث غير متحيزة. لذلك ، قمنا بتحليل تسلسل mRNA لبروتينات جدار الخلية باستخدام MEME لتحديد أشكال mRNA المخصبة. كانت النتيجة الأكثر أهمية التي تم الحصول عليها تشبه إلى حد كبير تكرار SECReTE10 إما مع U أو C (الشكل ثلاثي الأبعاد). الأهم من ذلك ، أننا لم نكتشف نموذجًا بروتينيًا ضمن نموذج mRNA هذا ، مما يلغي احتمال أن يكون عنصر SECReTE يعتمد على تسلسل بروتين معين.

يحدث الإثراء السري في النصوص السرية في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى الأعلى

غالبًا ما يكون الحفظ أو التقارب في التطور مؤشرات قوية على الأهمية الوظيفية. للتحقق مما إذا كان تخصيب SECReTE في mSMPs موجودًا في كائنات إضافية (ه.ز. البشر و ب. الرقيقة) قمنا بتحليل الجينومات الأخرى. في البشر ، كما في س. الخباز، أعطى SECReTE10 الفصل الأكثر أهمية بين تشفير RNAs للبروتينات الإفرازية والبروتينات غير الإفرازية ، بناءً على تحليل ROC (الشكل 4 أ). بعد التحقق من أن SECReTE10 لا ترتبط بطول الجين ، عمل SECReTE10 كحد أدنى لتحديد وجود نموذج SECReTE. كما هو الحال في الخميرة ، يتم إثراء SECReTE في موقعي الكودون الثاني والثالث لنصوص الإفراز ، مقارنة بالنصوص غير السرية (الشكل 4 ب). أيضًا ، يحتوي جزء أكبر من النصوص السرية التي تفتقر إلى TMDs على NNY-SECReTE مقرها ، مقارنة بالنصوص غير السرية التي تحمل TMDs (الشكل 4C). وبالتالي ، فإن عزر SECReTE موجود في الكائنات الحية الأعلى. ترد قائمة بجميع أشكال SECReTE10 والأعلى الموجودة في الجينات البشرية في الجدول S4. من المثير للاهتمام ، على عكس الخميرة ، وجدنا أن غالبية كبيرة بشكل غير متناسب من الأشكال (29753 من 52،047) موجودة في UTRs بدلاً من أن تكون في CDS ، خاصة بعد التطبيع للطول ، ويتم ملاحظة هذه الظاهرة لكل من secretome و non-secretome النصوص (S6A الشكل). لذلك ، على عكس الخميرة ، فإن UTRs وخاصةً 3’UTR هي مواقع مفضلة لموقع SECReTE في النصوص البشرية. مثل الخميرة ، RRY لوحظ التخصيب في أشكال SECReTE في مناطق CDS ، بينما لوحظ ارتفاع محتوى بيريميدين في UTRs (S6B الشكل). لذلك ، على الرغم من أن كلا من الخميرة والإنسان يشتركان في نفس أشكال SECReTE ، فإن توزيعهما على منطقة الجين يبدو مختلفًا. ومن المثير للاهتمام ، أن النصوص البشرية التي تشفر بروتينات glycophosphatidylinositol (GPI) المقيدة ، والتي تعادل بروتينات جدار الخلية ، وُجد أنها غنية جدًا بـ SECReTE. في الواقع ، تم عرض فكرة شبيهة بـ SECReTE سابقًا لمنح الترجمة المستقلة لنسخة ترميز البروتين البشري المرتبط بـ GPI ، الفوسفاتاز القلوي المشيمي ، إلى ER [35] في المقابل ، الجينات الراسخة ، بالإضافة إلى الميتوكوندريا والجينات النووية ، لها وفرة منخفضة من SECReTE كما يظهر في الخميرة (الشكل 4 د). أخيرًا ، اكتشفنا أيضًا وفرة عالية من SECReTE10 في الجينات التي تشفر البروتينات المفرزة من ب. الرقيقة، بالمقارنة مع تلك التي تشفر البروتينات غير الإفرازية (الشكل 4E). وبالتالي ، فإن أشكال SECReTE موجودة أيضًا في جينومات بدائية النواة.

(أ) يزيد SECReTE10 من القدرة على تصنيف جينات الإفراز في الإنسان. تم رسم منحنيات ROC لكل من العتبات المشار إليها. تم استخدام الجينات السرية كمجموعة إيجابية حقيقية والجينات غير الإفرازية كمجموعة سلبية حقيقية. كانت AUC (المنطقة الواقعة تحت المنحنى) لـ SECReTE10 هي الأعلى. B. SECReTE وفيرة للغاية في mRNAs لبروتينات إفراز الإنسان. تم حساب وفرة SECReTE10 لكل موضع كودون على حدة. تعد وفرة SECReTE في mSMPs البشرية أكثر أهمية في الموضع الثاني من الكودون ، ولكن تم اكتشاف اختلافات كبيرة أيضًا في الموضع الثالث. *ص≤ 3.73E-68 ، اختبار تشي مربع C. SECReTE وفير للغاية في ترميز mRNAs لبروتينات إفراز قابلة للذوبان في البشر. تم فحص وجود SECReTE10 بشكل منفصل للبروتينات المحتوية على TMD والبروتينات القابلة للذوبان. يحتوي جزء أكبر من ترميز mRNAs للبروتينات المفرزة القابلة للذوبان (Secretome بدون سماوي TMD) على SECReTE مقارنة بالنصوص غير الإفرازية التي لا تحتوي على TMD (رمادي فاتح). جزء البروتينات القابلة للذوبان التي تحتوي على SECReTE في الموضع الثالث أكبر من البروتينات غير المفرزة المحتوية على TMD (NNY) وهي مهمة. تمثل n عدد الجينات في كل مجموعة. *ص ≤ 3.49E-12 ، اختبار تشي مربع. (د) وفرة SECReTE10 في مجموعات مختلفة من الجينات البشرية. لوحظ وجود وفرة عالية من SECReTE لمجموعات البروتين الإفرازي الأخرى ، باستثناء البروتينات المثبتة على الذيل (TA). mRNAs الميتوكوندريا (ميتو) لديها وفرة منخفضة SECReTE. تمثل الأرقام الموجودة فوق الأشرطة عدد الجينات في كل مجموعة. (هـ) وفرة SECReTE10 في ب. الرقيقة. تم تسجيل وفرة SECReTE10 ولوحظ أنها أعلى في ترميز mRNA للجينات التي تشفر بروتينات الإفراز (أنا.ه. SS & ampTMD و TMD و SS) مقارنة بتلك التي تشفر البروتينات غير المفرزة (Non-Sec). تمثل الأرقام الموجودة أسفل الأعمدة عدد الجينات في كل مجموعة. (و) وفرة SECReTE10 في س. بومبي تم حساب وفرة SECReTE10 لكل موضع كودون بشكل منفصل للبروتينات المحتوية على TMD والبروتينات القابلة للذوبان. يحتوي جزء أكبر من ترميز mRNAs للبروتينات المفرزة القابلة للذوبان (Secretome بدون سماوي TMD) على SECReTE مقارنة بالنصوص غير الإفرازية ، إما مع أو بدون TMD (غير مفرز مع TMD رمادي غامق ، غير سري بدون TMD رمادي فاتح). جزء البروتينات القابلة للذوبان التي تحتوي على SECReTE في الموضع الثالث أكبر من البروتينات غير المفرزة المحتوية على TMD (NNY) وهي مهمة. تمثل n عدد الجينات في كل مجموعة. تمثل n عدد الجينات في كل مجموعة. * ص≤ 5.63E-3 ، اختبار كاي سكوير.

سألنا بعد ذلك عما إذا كان SECReTE محفوظًا تطوريًا عن طريق الوراثة. للتمييز بين الحفظ والتقارب المحتمل قمنا بتحليل جينوم الخميرة الانشطارية ، س. بومبي، من أجل حضور وموقع SECReTE في النصوص السرية وغير السرية. كما وجد ل س. الخباز، يتم إثراء SECReTE (في كليهما نيويورك- و NNY-النماذج القائمة) في جزء أكبر من س. بومبي mSMPs التي تفتقر إلى TMDs ، مقارنة بتلك التي تحتوي على TMDs أو النصوص غير السرية التي إما تحمل أو تفتقر إلى TMDs (الشكل 4F). بعد ذلك ، قمنا بمحاذاة الجينات المتعامدة التي تشفر البروتينات المفرزة من س. الخباز لأولئك من س. بومبي (إجمالي 457 جينًا) ، وفحص ما إذا كان SECReTE موجودًا في نفس (أنا.ه. محاذاة) داخل الجين. وجدنا أن إحداثيات الزخارف السرية في الغالبية العظمى (ه.ز. 393 من أصل 457) من أزواج تقويم العظام كانوا غير منحازين. قد يعني هذا أن غالبية أشكال SECReTE نشأت من خلال التطور المتقارب ، على الرغم من أننا لا نستطيع استبعاد انجراف الفكرة بعد اختلاف الأنواع. ومع ذلك ، فمن الواضح أن SECReTE موجودة في جميع الأنواع التي تم فحصها من قبلنا ، من بدائيات النوى إلى حقيقيات النوى ، بما في ذلك الخمائر والثدييات.

تصميم الطفرات في SECReTE لفحص التأثيرات على إفراز البروتين

لفهم أهمية SECReTE والتحقق من أهميتها في فسيولوجيا خلايا الخميرة ، قمنا بفحص مدى ملاءمتها من خلال رفع أو تقليل الإشارة في الجينات المختارة. تم اختيار ثلاثة جينات تمثيلية ، بناءً على طول الجينات القصير نسبيًا ، والنمط الظاهري القابل للاكتشاف عند حذفها ، ووظيفتها في مسارات فسيولوجية مختلفة. تضمنت هذه الجينات: SUC2، والذي يشفر إنزيمًا بيريبلازمي قابل للذوبان يفرز HSP150، الذي يشفر بروتين وسائط قابل للذوبان و CCW12، والذي يشفر بروتين جدار الخلية المرتبط بـ GPI. تمت زيادة إشارة SECReTE الإجمالية للجينات عن طريق استبدال أي A أو G موجود في موضع الكودون الثالث بـ T أو C ، على التوالي ، وبالتالي إثراء وجود SECReTE على طول الجين بأكمله [(+) SECReTE]. الاستبدال العكسي ، تحويل T إلى A أو C إلى G ، قلل من إجمالي إشارة SECReTE [(-) SECReTE]. نلاحظ أننا أضفنا أو أزلنا فقط NNY-الزخارف الثلاثية القائمة ، من أجل عدم تغيير تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين المشفر. يظهر عدد الأشكال الموجودة في كل جين قبل وبعد إضافة / تقليل SECReTE في جدول S5. وهكذا ، في حالة HSP150 العديد من نيويورك-تظل نماذج SECReTE القائمة في متحولة SECReTE (-). تم الاحتفاظ بالتغييرات في استقرار البنية الثانوية لـ mRNA (الطاقة الحرة) ومؤشر Codon Adaptation (CAI) [32] في نطاق مماثل (جدول S5). الطفرات السرية في SUC2, HSP150، و CCW12 تظهر بطول الجين ، باستخدام حد أدنى من العتبة 1 نيويورك يعيد أو 10 نيويورك يتكرر ، كما هو موضح في الشكل S7 (S7A-S7C الشكل العلوي والسفلي ، على التوالي).

الطفرات السرية في SUC2 يغير إفراز الانفرتيز

SUC2 رموز لأشكال مختلفة من الإنفرتيز مترجمة من رنا مرسال متميزين ، قصير وطويل ، يختلفان فقط في نهاياتهما الخمسة. في حين أن رموز mRNA الأطول للبروتين المفرز الذي يحتوي على تسلسل إشارة ، يتم حذف تسلسل الإشارة من الشكل الإسوي القصير ، والذي يرمز لبروتين حشوي. يتعرض تعبير Suc2 المفرز لقمع الجلوكوز ، ومع ذلك ، في ظل ظروف محرضة (أنا.ه. ، استنفاد الجلوكوز) ، يتم نقل Suc2 عبر المسار الإفرازي إلى الفضاء المحيط بالخلية. هناك ، يحفز التحلل المائي للسكروز إلى الجلوكوز والفركتوز ، وهذا النشاط الأنزيمي مسؤول عن قدرة الخميرة على استخدام السكروز كمصدر للكربون ويمكن قياسه عن طريق مقايسة كيميائية حيوية (أنا.ه. نشاط إنفرتيز) داخل وخارج الخلية. تم اختبار تأثير طفرات SECReTE على وظيفة Suc2 من خلال فحص قدرة الطفرات على النمو على الوسائط المحتوية على السكروز عن طريق اختبار السقوط. ومن المثير للاهتمام أن معدل نمو SUC2(-) تم تقليل السر على ألواح السكروز ، بينما انخفض مستوى السكر في الدم SUC2(+) أظهر متحور SECReTE نموًا أفضل مقارنة بخلايا WT (الشكل 5 أ) ، على الرغم من عدم اكتشاف أي تغيير في النمو على لوحات YPD. تشير هذه النتائج إلى أن قوة SECReTE تؤثر على إفراز Suc2. قد تنتج هذه التغييرات في إفراز Suc2 عن تغييرات في SUC2 النسخ ، وإنتاج Suc2 ، و / أو معدلات الإفراز المتغيرة. للتمييز بين الاحتمالات ، خلايا WT ، SUS2Δ، و SUC2 تم إخضاع طفرات SECReTE لفحوصات إنفرتيز. يتيح اختبار الانفرتيز قياس كمية Suc2 المفرز ، وكذلك Suc2 الداخلي ، عن طريق حساب كمية الجلوكوز المنتجة من السكروز. كما هو متوقع ، في ظل ظروف قمع الجلوكوز (ه.ز. 2 ٪ جلوكوز) كانت مستويات كل من Suc2 المفرز والداخلي منخفضة للغاية. عندما نمت الخلايا على وسط يحتوي على نسبة منخفضة من الجلوكوز (ه.ز. 0.05 ٪ جلوكوز) لتعزيز التعبير عن الإنزيم المفرز ، تم تغيير مستويات Suc2 المفرز بسبب التغيرات في SECReTE. بالتوافق مع نتائج اختبار السقوط (الشكل 5 أ) ، تم الكشف عن انخفاض كبير في الإنفرتيز المفرز مع SUC2(-) خلايا SECReTE ، بينما تم الكشف عن زيادة معنوية مع SUC2(+) الخلايا السرية ، مقارنة بخلايا WT (الشكل 5 ب). الأهم ، SUC2(+) تم العثور على خلايا SECReTE تفرز ما يقرب من ضعفين (92.2 ± 9.2٪ ، ع & لتر0.016) إنفرتيز أكثر من SUC2(-) الخلايا السرية ، بينما لم يتم الكشف عن إفراز Suc2 من SUS2Δ الخلايا (الشكل 5 ب ، تفرز). إذا كانت طفرات SECReTE تؤثر على كفاءة إفراز Suc2 ، ولكن ليس على تركيبه ، فيجب أن يتراكم Suc2 في SUC2(-) الخلايا السرية المقابلة للاختلاف المفرز من SUC2(+) خلايا سرية. ومع ذلك ، لم يكن هذا هو الحال حيث انخفضت الكمية الداخلية من Suc2 في SUC2(-) الخلايا السرية وزيادة طفيفة في SUC2(+) الخلايا السرية (الشكل 5 ب ، داخلي). تشير هذه النتائج إلى أن تعديلات SECReTE في SUC2 قد يؤثر على مستوى إنتاج البروتين. درسنا بعد ذلك معدل إفراز إنفرتيز لـ WT ، SUC2(+) SECReTE و SUC2(-) تحولت خلايا SECReTE إلى وسط منخفض الجلوكوز لفترات متفاوتة من الوقت (الشكل 5C). أظهرت النتائج أن متوسط ​​المعدل الأقصى للإفراز من SUC2(+) خلايا SECReTE أعلى قليلاً من خلايا WT (أنا.ه. 0.479 ± 0.016 مقابل 0.432 ± 0.013 وحدة لكل دقيقة لكل OD600 وحدة الخلايا ± الانحراف المعياري ، ن = 3 تجارب) ، وكانت بشكل ملحوظ (62.4 ± 7.8٪) ع & لتر0.0001) أعلى من SUC2(-) خلايا سرية (0.295 ± 0.022 وحدة / دقيقة لكل O.D.600 وحدة الخلايا ± الانحراف المعياري ، ن = 3 تجارب). في المقابل ، الوقت اللازم لتحقيق إفراز نصف الحد الأقصى بينهما SUC2(+) سر و SUC2(-) لم تتغير خلايا SECReTE نسبيًا في ظل الظروف التجريبية (أنا.ه.

74 دقيقة قيم R 2 = & GT94). وبالتالي ، فإن وجود SECReTE لا يؤثر فقط على إنتاج الإنفرتيز والإفراز الكلي ، ولكن أيضًا على معدل إفرازه من الخميرة.

(أ) السر يعزز القدرة على النمو على السكروز. قدرة WT ، SUS2Δ, SUC2(+) سر و SUC2(-) تم فحص الخميرة السرية للنمو على السكروز عن طريق اختبار السقوط. نمت الخلايا إلى منتصف السجل على وسط YPD المحتوي على الجلوكوز ، قبل التخفيف التسلسلي والطلاء على وسط صناعي يحتوي على السكروز أو YPD. نمت الخلايا لمدة يومين قبل توثيق الصور. ال SUC2(-) أظهر طفرة SECReTE نموًا أقل من خلايا WT ، بينما SUC2(+) أظهرت الخلايا السرية نموًا أفضل. SUS2Δ كانت الخلايا غير قادرة على النمو على وسط يحتوي على السكروز. (ب) السر يعزز إفراز الانفرتيز. السلالات المشار إليها من أ تم تحليلها باستخدام مقايسة إفراز الانفرتيز. تم قياس كل من نشاط إنفرتيز الداخلي والمفرز بوحدات (1 U = 1 ميكرومول من الجلوكوز تم إطلاقه / دقيقة لكل O.D.600 وحدة) بعد قمع الجلوكوز. تم تخفيض كلا النشاطين في SUC2(-) خلايا سرية ومرتفعة في SUC2(+) خلايا سرية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري من ثلاثة تكرارات تجريبية. *ص& lt0.0161 (اختبار t). (ج) وجود سر يعزز معدل إفراز الانفرتيز. السلالات المشار إليها من أ حضنت في وسط منخفض الجلوكوز لفترات متفاوتة (0-150 دقيقة) وتم تحليلها باستخدام مقايسة إفراز الإنفرتيز ، كما في ب. تم قياس نشاط الانفرتيز المفرز بالوحدات (1 U = 1 ميكرولتر جلوكوز تم إطلاقه / دقيقة لكل OD.600 وحدة) بعد قمع الجلوكوز. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري من ثلاثة تكرارات تجريبية. تم استخدام الانحدار الخطي للبيانات (الخطوط المنقطة) من المؤامرات العكسية المتبادلة لتحديد T1/2 للتراكم نصف الحد الأقصى وتشير علامة "x" على الخط إلى وقت التراكم النصف الأقصى. يتم تحسين معدل إفراز الانفرتيز في (+) خلايا SECReTE ويتم تقليله في (-) خلايا SECReTE بالنسبة إلى WT. (D) SECReTE يعزز القدرة على النمو على calcofluor الأبيض. قدرة WT ، hsp150Δ, HSP150(+) سر و HSP150(-) تم فحص خلايا SECReTE لتنمو على CFW عن طريق اختبار السقوط. نمت الخلايا إلى منتصف السجل على YPD ، قبل التخفيف التسلسلي والطلاء على YPD وحده أو لوحات YPD التي تحتوي على CFW ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية. نمت الخلايا لمدة يومين قبل التوثيق الضوئي. ال HSP150(-) أظهر متحولة SECReTE فرط الحساسية مقارنة بخلايا WT ، بينما HSP150(+) كانت الخلايا السرية أقل حساسية. hsp150Δ نمت الخلايا بشكل سيئ على وسط يحتوي على CFW. (ه) السر يعزز إفراز Hsp150. السلالات المشار إليها من د تم إخضاعهم لفحص إفراز Hsp150. نمت الخلايا إلى منتصف مرحلة السجل عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات وفحصها في محللات الخلية (داخلية) أو متوسطة (خارجية) عن طريق التحليل الغربي باستخدام الأجسام المضادة لـ Hsp150. تم تقليل Hsp150 الخارجي في HSP150(-) خلايا SECReTE مقارنةً بـ WT ، بينما تمت زيادتها في HSP150(+) سلالة سرية. تم تقليل Hsp150 الداخلي في HSP150(-) الخلايا السرية وأيضا قليلا في HSP150(+) خلايا SECReTE مقارنة بخلايا WT. لم يتم الكشف عن Hsp150 داخلي أو خارجي في المحللة أو الوسيط المشتق من hsp150Δ الخلايا ، على التوالي. تم قياس شدة النطاق باستخدام ImageJ وعرضها في الرسم البياني أدناه. تم عرض تجربة تمثيلية في اللوحات العلوية لإفراز Hsp150 الخارجي والداخلي. تمثل الرسوم البيانية أدناه نسبة كثافة جميع العينات بالنسبة إلى كثافة WT لثلاثة تكرارات بيولوجية ، *ص& lt0.05 (اختبار t). سيبسيشبيشسب. (F) SECReTE يعزز القدرة على النمو على hygromycin B. قدرة WT ، ccw12Δ، و CCW12(-) تم فحص خلايا SECReTE لتنمو على HB عن طريق اختبار السقوط. نمت الخلايا إلى منتصف السجل على وسط YPD المحتوي على الجلوكوز ، قبل التخفيف التسلسلي والطلاء على YPD المحتوي على HB أو YPD وحده. نمت الخلايا لمدة يومين قبل التوثيق الضوئي. ال CCW12(-) كانت سلالة SECReTE أكثر حساسية لإجهاد HB مقارنة بخلايا WT. ccw12Δ كانت الخلايا غير قادرة على النمو على وسط يحتوي على HB. (G) SECReTE يعزز إفراز البروتين الخارجي ، SSGAS1-GFP. نمت الخميرة التي تعبر عن SSGAS1-GFP-3'GAS1 UTR (+) SECReTE و SSGAS1-GFP و SSKAR2-GFP و GFP و SSGAS1-LacZ من البلازميدات إلى مرحلة منتصف السجل على وسط صناعي يحتوي على 2 ٪ رافينوز وتحول إلى 3 ٪ وسط يحتوي على الجالاكتوز لمدة 4 ساعات. تم ترسيب البروتينات المعبر عنها من السلالات المختلفة TCA من الوسط وتم حل الرواسب بواسطة SDS-PAGE. تم اكتشاف GFP بجسم مضاد لـ GFP ، بينما تم اكتشاف Hsp150 بجسم مضاد لـ Hsp150 واستخدم كعنصر تحكم في التحميل. تم قياس شدة النطاق باستخدام كثافة ImageJ وتم تسجيلها بالنسبة لإفراز SSGAS1-GFP. إضافة غاز 1 3’UTR تحور لاحتواء SECReTE يحسن إفراز SS-Gas1 وكان مشابهًا لإفراز SSKAR2-GFP. لم يتم إفراز GFP الذي يفتقر إلى تسلسل إشارة (GFP) وتم استخدام SSGAS1-LacZ كعنصر تحكم سلبي للكشف عن GFP.

تغير طفرات SECReTE إفراز Hsp150 واستقرار جدار الخلية

بعد ذلك ، أردنا دراسة أهمية SECReTE في HSP150. Hsp150 هو أحد مكونات جدار الخلية الخارجي ، وفي حين أن الوظيفة الدقيقة لـ Hsp150 غير معروفة ، إلا أنها مطلوبة لاستقرار جدار الخلية ومقاومة العوامل المسببة للاضطراب في جدار الخلية ، مثل Calcofluor White (CFW) و Congo Red (CR). في حين hsp150Δ الخلايا أكثر حساسية لإجهاد جدار الخلية ، والإفراط في إنتاج Hsp150 يزيد من تكامل جدار الخلية [36]. يتم إفراز Hsp150 بكفاءة في وسط النمو ويزداد تعبيره عند الصدمة الحرارية [37 ، 38]. أثر تعديل SECReTE في HSP150 تم فحصه عن طريق اختبار السقوط عن طريق اختبار حساسية HSP150(-) SECReTE و HSP150(+) الخلايا السرية لإضافة CFW مقارنة بـ WT و hsp150Δ الخلايا. كما يتضح من الشكل 5D في حين أن HSP150(-) كانت سلالة SECReTE أكثر حساسية لـ CFW مقارنة بخلايا WT ، و HSP150(+) كانت سلالة SECReTE أكثر مقاومة لـ CFW. كما هو متوقع، hsp150Δ الخلايا هي الأكثر عرضة لـ CFW (الشكل 5D). HSP150 كما خضعت سلالات لتحليل لطخة غربية لقياس مستويات البروتينات الطافرة. حيث HSP150 يرتفع الإفراز عند التعرض للصدمة الحرارية [37،38] ، وتحولت الخلايا إلى 37 درجة مئوية قبل استخلاص البروتين. تم استخلاص البروتين من كل من وسط النمو والخلايا للكشف عن مستويات البروتين الخارجية والداخلية على التوالي. تم تقليل كمية Hsp150 التي تم إفرازها إلى الوسط في HSP150(-) خلايا سرية ومرتفعة في HSP150(+) خلايا SECReTE ، مقارنة بخلايا WT (الشكل 5E). على غرار Suc2 ، تم تقليل المقدار الداخلي لـ Hsp150 في HSP150(-) خلايا SECReTE ، نسبة إلى خلايا WT ، وأظهرت انخفاضًا أكبر من ذلك الذي يظهر في الشكل الخارجي (الشكل 5E) ، على الرغم من حقيقة أن العديد منها نيويورك-الزخارف القائمة تبقى في الجين. كمستوى داخلي لـ Hsp150 بوصة HSP150(+) كانت خلايا SECReTE ثابتة إلى حد ما بالنسبة لخلايا WT ، وخلصنا إلى أن تغيير SECReTE في HSP150 قد يؤثر أيضًا على إنتاج البروتين.

الطفرات السرية في CCW12 يغير استقرار جدار الخلية

CCW12 يقوم بترميز بروتين جدار خلوي مثبت بواسطة GPI والذي يتم توطينه في مناطق جدار الخلية المركب حديثًا ويحافظ على استقرار الجدار أثناء ظهور البراعم وتكوين shmoo. حذف CCW12 ثبت أنه يسبب فرط الحساسية لعوامل زعزعة استقرار جدار الخلية ، مثل hygromycin B (HB) [39،40]. نظرًا لأن درجة SECReTE عالية جدًا في CCW12، لم يكن من الممكن زيادة الإشارة. لذلك ، أنشأنا فقط CCW12(-) الخلايا السرية واختبرت قدرتها على النمو على الألواح المحتوية على HB. كما رأينا مع HSP150(-) SECReTE (الشكل 5 د) ، وجدنا أن ملف CCW12(-) جعلت طفرة SECReTE الخلايا حساسة لاضطراب جدار الخلية ، مقارنة بخلايا WT (الشكل 5F).

تؤثر إضافة SECReTE على إفراز بروتين خارجي ساذج

لن تكون قدرة إضافة SECReTE على تحسين إفراز البروتين الخارجي دليلاً جوهريًا على أهميته فحسب ، بل قد تكون أيضًا أداة صناعية مفيدة ومنخفضة التكلفة لتحسين إفراز البروتينات المؤتلفة دون تغيير تسلسل البروتين. لاختبار ذلك ، قمنا بتوظيف أ GFP بناء نسخة تحمل تسلسل الإشارة المشفرة (SS) للغاز 1 (SSGAS SSGas1) في نهاية 5. تتيح إضافة SSGas1 إفراز بروتين GFP إلى الوسط ، على الرغم من أن إفرازه لم يكن بنفس الكفاءة مقارنة ببروتينات GFP الأخرى المندمجة بـ SS ، مثل SSKar2 (الشكل 5G). يحتمل أن يحسن إفراز SSGAS-GFP، أضفنا سلسلة معدلة 3’UTR من غاز 1 التي تحتوي على السر [أنا.ه. حيث تم استبدال جميع A و G بـ T و C ، على التوالي SSGAS-GFP-GAS1 3’UTR (+) SECReTE]. ثم اختبرنا تأثير إضافة SECReTE على إفراز GFP في الوسائط. وجدنا أن إضافة SECReTE إلى 3’UTR من SSGAS-GFP حسّن إفراز GFP في الوسائط ، مقارنةً بـ SSGAS-GFP ، وكان مشابهًا لإفراز SSKar2-GFP (الشكل 5G). تعذر إفراز تعبير GFP بدون تسلسل الإشارة (الشكل 5G).

تأثير طفرات SECReTE على مستويات الرنا المرسال

نظرًا لأنه يمكن تغيير مستويات البروتين بواسطة طفرات (-) SECReTE و (+) SECReTE (الشكل 5B و 5E و 5G) ، فقد درسنا ما إذا كانت هناك تغييرات في نسخ الجينات أو استقرار mRNA. تم استخدام PCR في الوقت الحقيقي الكمي (qRT) للتحقق مما إذا كانت مستويات mRNA من SUC2, HSP150، و CCW12 تتأثر بقوة SECReTE. لقد وجدنا أن SUC2(-) كانت مستويات SECReTE mRNA أقل بنسبة 30٪ تقريبًا مما كانت عليه في SUC2 خلايا WT ، بينما SUC2(+) كانت مستويات SECReTE

50٪ أعلى من WT (S8A الشكل). قد يساهم هذا التغيير في مستويات الرنا المرسال في قدرة SUC2(+) متحولة SECReTE لزيادة إنتاج البروتين ، وبالتالي ، تنمو بشكل أفضل على الوسط المحتوي على السكروز (الشكل 5A-5C).

تأثير طفرة SECReTE على HSP150 كما تمت دراسة مستويات الرنا المرسال. وجدنا أن مستوى الرنا المرسال هو HSP150(-) كان SECReTE مشابهًا لـ WT ، بينما كان لـ HSP150(+) انخفض SECReTE قليلاً (S8B الشكل). وبالتالي ، فإن التغيير في مستويات بروتين Hsp150 وحساسية CFW بسبب تغيير SECReTE (الشكل 5D و 5E) لا يتم تفسيره بالكامل بالتغيرات في مستويات الرنا المرسال. الطفرات السرية في CCW12(-) لم يتسبب SECReTE في حدوث تغيير كبير في مستوى mRNA الخاص به (S8C الشكل) ، وبالتالي ، فإن الحساسية المتزايدة لـ CCW12(-) من المحتمل ألا يكون SECReTE to HB (الشكل 5F) بسبب انخفاض في CCW12 مرنا.

تؤدي إضافة أشكال SECReTE إلى زيادة توطين mRNA إلى ER

لاختبار ما إذا كان SECReTE له دور في إملاء توطين mRNA ، قمنا بتصور SUC2 و HSP150 mRNAs بواسطة FISH أحادي الجزيء (smFISH) باستخدام مجسات الفلورسنت المحددة واختبرت تأثير تغيير SECReTE على مستوى التوطين المشترك لـ mRNA مع ER. استخدمنا Sec63-GFP كعلامة ER وقمنا بحساب النسبة المئوية لحبيبات mRNA (البقع) لكل خلية تم توطينها مع ER القشري والنووي (cER و nER ، على التوالي) أو لم يتم ترجمتها إلى ER. نلاحظ أنه تم استخدام تحقيقات لتسلسل الجينات الأصلية لقياس مستوى توطين mRNA في خلايا WT وكذلك في (+) SECReTE أو (-) خلايا SECReTE. كان عدد نقاط FISH لكل خلية متغيرًا لكل من mRNAs ، مع (-) خلايا SECReTE بها بقع أقل من خلايا WT ، بينما (+) خلايا SECReTE بها نقاط أكثر لكل خلية من خلايا WT (S9A الشكل). يعكس هذا إلى حد كبير النتائج التي تم الحصول عليها بواسطة qRT-PCR لـ SUC2 (S8A Fig) ، ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد احتمال أن تقلل تعديلات SECReTE من مستوى تهجين mRNA مع مجموعة المسبار ، وبالتالي ، التقليل من توطين الحمض النووي الريبي إلى حد ما.

وجدنا أن مستوى التوطين المشترك بين SUC2(-) كانت حبيبات SECReTE mRNA و Sec63-GFP أقل بكثير مقارنةً بـ SUC2(+) حبيبات مرنا SECReTE (ه.ز. 56.7 ± 1.5٪ مقابل 74.1 ± 1.7٪ التوطين المشترك ، على التوالي ع = 2.0E-13) (الأشكال 6 أ ، 6 ب ، S9B) ، بينما تكون مشابهة للشكل الأصلي SUC2 (ه.ز. 56.3 ± 2.4٪ التعريب المشترك ER). تشير هذه النتيجة إلى أن عدد أشكال SECReTE يؤثر على توطين mRNA في ER ، بالإضافة إلى تعزيز الإفراز. وجدنا أيضًا أن هناك عددًا أقل من الحبيبات الموجودة في SUC2(-) خلايا سرية مما لوحظ في أي منهما SUC2(+) خلايا SECReTE أو WT (الشكل S9A) ، والتي تتوافق مع نتائج qRT-PCR (الشكل S8A). أخيرًا ، نلاحظ أنه لا يوجد مجال فرعي محدد ER (أنا.ه. تم تصنيف cER أو nER) بشكل تفضيلي عند الزيادة في أشكال SECReTE (الشكل 6 ب).

(أ) التصور من المعبر عنها داخليا SUC2(+) سر و SUC2(-) mRNAs السرية باستخدام smFISH. الخميرة الذاتية معربا عن WT SUC2, SUC2(+) SECReTE أو SUC2(-) تم زراعة SECReTE و Sec63-GFP من البلازميد إلى مرحلة منتصف السجل على وسط SC يحتوي على 2 ٪ من الجلوكوز قبل تحويل الخلايا إلى وسط منخفض يحتوي على الجلوكوز (0.05 ٪ جلوكوز) للحث SUC2 التعبير. تمت معالجة الخلايا لوضع العلامات على smFISH باستخدام مجسات FISH غير متداخلة تحمل علامة TAMRA مكملة لـ SUC2، قبل وضع العلامات باستخدام DAPI (كما هو موضح في دمج). يتم عرض الصور التمثيلية. الخط = 1 ميكرومتر. B. القياس الكمي SUC2 و HSP150 (+) SECReTE و (-) توطين SECReTE mRNA إلى ER. تم إجراء تسجيل الحبيبات mRNA باستخدام خوارزمية FISH-quant وتم إجراء التوطين المشترك للحبيبات في ER (على حد سواء cER و nER) (انظر المواد والطرق). تم تسجيل النسبة المئوية للحبيبات التي تم توطينها أو لم تتم ترجمتها مع Sec63-GFP المسمى cER أو nER لكل خلية. يظهر الرسم البياني متوسط ​​الدرجات على الأقل

فحص 250 حبة لكل سلالة. SUC2 ص القيم: (+) SECReTE مقابل (-) SECReTE ، ص & lt 3.1E-8 WT مقابل (+) SECReTE ، ص & lt 8.1E-10 HSP150 (+) SECReTE مقابل (-) SECReTE ، ص & lt 0.008 (اختبار t). جيم تحليل SUC2 توطين mRNA باستخدام تجزئة الخلية و qRT-PCR. WT SUC2, SUC2(+) SECReTE أو SUC2(-) تم تجزئة خلايا الخميرة السرية إلى كسور الغشاء والعصارة الخلوية. تم استخراج الحمض النووي الريبي من كلا الكسور وإخضاعها لتحليل qRT-PCR لتحديد مستويات SUC2 مرنا في كل جزء. تم استخدام مواد أولية لتضخيم النص الطويل لـ SUC2، الذي يشفر البروتين المفرز. تم استخدام مواد التمهيدي للأكتين للتطبيع. SUC2(-) عرضت الخلايا السرية أقل SUC2 مستويات mRNA في كلا الكسرين من WT و SUC2(+) SECReTE ، مما يشير إلى فقدان الاستقرار وكذلك الترجمة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لثلاثة تكرارات بيولوجية.

قمنا بعد ذلك بفحص مستوى HSP150 توطين mRNA إلى ER بتنسيق HSP150(+) SECReTE أو HSP150(-) خلايا سرية. وجدنا ذلك كما هو الحال مع SUC2أدت إضافة أشكال SECReTE إلى زيادة مستوى توطين ER (الشكل 6B و S9C الشكل) من 63.7 ± 2.0٪ إلى 77.9 ± 1.6٪ على المستوى الأصلي HSP150 الموقع (ع = 7.0E-8). في المقابل ، لا تغيير في مستوى HSP150(-) لوحظ توطين مشترك لـ SECReTE mRNA (ه.ز. 64.0 ± 1.6٪) ، مما قد يعكس وجود نيويورك-الزخارف القائمة التي لا يمكن أن تتحور دون تغيير تسلسل الأحماض الأمينية. بشكل عام ، ومع ذلك ، تظهر كلا مجموعتي النتائج أن إضافة SECReTE إلى mRNA يزيد من نمط توطين ER. لإثبات نتائج smFISH لـ SUC2، أجرينا أيضًا التجزئة الخلوية للخلايا التي تعبر عن أصلية SUC2, SUC2(-) SECReTE أو SUC2(+) SECReTE للحصول على غشاء خام (يحتوي على ER) وكسور خلوية وتحديد كمية توزيع mRNA باستخدام qRT-PCR (الشكل 6C). بعد التطبيع باستخدام أكتين مرنا كعنصر تحكم ، أشارت النتائج إلى ذلك SUC2(-) SECReTE mRNA أقل وفرة بشكل عام (كما لوحظ أعلاه في الشكل S8A والشكل S9A) ويبدو أنه أقل ارتباطًا بالغشاء من أي منهما الأصلي أو SUC2(+) SECReTE mRNA بواسطة

40٪. بشكل إجمالي ، تشير نتائجنا إلى أن وجود / إضافة SECReTE يعمل على استقرار إفراز الرنا المرسال ، ويزيد من توطين الرنا المرسال إلى ER ، ويعزز إنتاج البروتين وإفرازه.

تحديد البروتينات المحتملة المرتبطة بـ SECReTE

لمزيد من توضيح دور SECReTE ، من الضروري تحديد شركائها الملزمين ، ومن المفترض أن الممارسات التجارية التقييدية. تم استخدام المقاربات واسعة النطاق سابقًا لتحديد mRNAs المرتبطة بـ RBPs المعروفة بـ gt40 في الخميرة [41-43]. للحصول على قائمة بالبروتينات المحتملة المرتبطة بـ SECReTE (SBPs) ، بحثنا في مجموعات البيانات عن RBPs التي تربط mRNAs عالية التخصيب بـ SECReTE. لكل RBP ، قمنا بحساب الكسر من نصوصه المرتبطة التي تحتوي على SECReTE10. تم العثور على RBPs لربط أجزاء كبيرة من mRNAs المحتوية على SECReTE10 بما في ذلك Bfr1 و Whi3 و Puf1 و Puf2 و Scp160 و Khd1 (الشكل 7A) ، وقد تم عرضها سابقًا لربط mSMPs [41-43]. لاختبار أي من هؤلاء المرشحين يربط SECReTE ، تم حذف كل من الجينات هذه RBPs في WT أو HSP150(+) خلايا سرية. افترضنا أن حذف SBP حقيقي قد يمنح فرط الحساسية لـ CFW ويزيل فروق معدل النمو بين WT و HSP150(+) الخلايا السرية التي لوحظت على اللوحات المحتوية على CFW (الشكل 5 د). متي PUF1, PUF2، أو SHE2 تم حذفها وجدنا ذلك HSP150(+) كانت سلالة SECReTE أكثر مقاومة لـ CFW من خلايا WT (الشكل S10). أحد التفسيرات المحتملة لهذا النقص في التأثير هو أن الممارسات التجارية التقييدية هذه إما غير ملزمة HSP150 أو أنها زائدة عن الحاجة مع SBPs الأخرى. ومع ذلك ، وجدنا أن حذف أي منهما WHI3 أو دينار كويتي 1 يقضي على الاختلافات بين WT و HSP150(+) سلالات SECReTE على لوحات تحتوي على CFW (الشكل 7 ب). يشير هذا إلى ارتباط Whi3 و Khd1 HSP150 تم جعل mRNA وربما mRNAs الأخرى ، وحتى خلايا WT وحدها أكثر حساسية لـ CFW في غيابها (الشكل 7 ب).

(أ) تحديد النصوص المحتوية على SECReTE10 في الدراسات المنسدلة للبروتين الملزمة للحمض النووي الريبي. يتم عرض عدد وجزء mRNAs المحتوية على SECReTE10 من إجمالي mRNAs المرتبطة بـ RBPs المشار إليها. تم نشر بيانات تحليل المصفوفة الدقيقة المستخدمة في إنشاء المدرج التكراري في المراجع [41-43]. (ب) تحديد الشركاء الملزمين المحتملين لـ SECReTE. خلايا WT وإما WT أو HSP150(+) تم حذف خلايا SECReTE للجينات التي تشفر RBPs المشار إليها (ه.ز. Whi3 و Khd1) إلى منتصف مرحلة السجل على YPD عند 30 درجة مئوية ، قبل التخفيف التسلسلي والطلاء على وسط YPD الصلب أو YPD المحتوي على CFW. نمت الخميرة قبل يومين من التوثيق الضوئي.


مناقشة

على حد علمنا ، هذه هي الدراسة الأولى التي تتناول تنشيط CB2 يسبب الهجرة الموجهة للبلاعم الفئران الأولية. باستخدام قياسات في الوقت الفعلي لكل من مورفولوجيا الخلية والهجرة ، أظهرنا أن مجموعة فرعية فقط من CB2 تعمل المنبهات كجاذبات كيميائية للبلاعم الفأرية الأولية. علاوة على ذلك ، وجدنا أنه على الرغم من أن CB2 كان الانجذاب الكيميائي الناجم عن الناهض حساسًا لـ PTX أو تثبيطًا دوائيًا أو استئصالًا وراثيًا لـ CB2 لم يكن له تأثير على الإشارات الخلوية أو هجرة البلاعم. لذلك ، يوفر هذا أول دليل على استخدام CB على نطاق واسع2 منبهات JWH133 و HU308 و L-759،656 و L-759،633 لها تأثيرات بعيدة عن الهدف في غير CB1/ سي بي2 جيأنا / س- اقترن GPCR وهو اكتشاف له آثار واسعة النطاق على حقل القنب بأكمله. أخيرًا ، تُظهر بياناتنا بشكل قاطع أن CB2 ليس مستقبلات جاذب كيميائي بلعم.

نحن واثقون من أننا طوال الدراسة كنا نقيس الانجذاب الكيميائي للبلاعم ، على الرغم من حقيقة أن الهلام الحيوي الناتج عن PECs كان يتكون في الغالب من العدلات. بدون التخصيب 4 × 10 5 تم استخدام PECs المستخرج من PECs لكل بئر انجذاب كيميائي وإشارات CI لذروة JWH133 و HU308 عند 0.4 تقريبًا. بعد إثراء البلاعم للهلام الحيوي الناتج عن PECs ، يتم استخدام 2 × 10 5 خلايا فقط لكل بئر ، ومع ذلك فإن JWH133 و HU308 يصلان إلى ذروة CIs بحوالي 0.8 ويحتفظان بملفات حركية مماثلة للهلام الحيوي الطبيعي الناتج عن PECs. علاوة على ذلك ، أثار ثيوجليكولات الضامة المستخدمة في 2 × 10 5 خلايا لكل بئر تعرض حركية المحور الكيميائي وإشارات CI الذروة المشابهة للخلايا الضامة المخصبة. الأهم من ذلك ، أن الضامة الناتجة عن الثيوجليكولات لا تحتوي على العدلات. أخيرًا ، فإن العدلات المعزولة من نخاع العظم تثير فقط إشارة CI ضعيفة في الانجذاب الكيميائي في الوقت الحقيقي عند الهجرة نحو العدلة الكيميائية القوية C5a. لذلك ، في PECs التي تم الحصول عليها من الجل الحيوي ، من المحتمل أن تساهم العدلات في مكون ضئيل فقط في إشارة CI المرصودة لأنها لا تسجل في نظام الانجذاب الكيميائي في الوقت الفعلي.

في البداية افترضنا أن قدرة مجموعة فرعية فقط من CB2 منبهات للحث على الانجذاب الكيميائي للبلاعم كان بسبب الانتقائية الوظيفية. هذه الظاهرة ، حيث يمكن للروابط الموجودة في نفس المستقبلات أن تنشط مسارات إشارة مميزة في اتجاه مجرى النهر 18 ، موثقة جيدًا بالنسبة لـ CB2 منبهات تعمل في CB2 19،20 والدراسات السابقة التي توضح أن 2-AG تعمل كعامل جذب كيميائي ، وجدت أيضًا أن مادة CB الاصطناعية2 منبهات WIN55،212-2 و CP55،940 فشلت في الحصول على أي استجابة هجرة 14،17. ومع ذلك ، ثبت أن هذه الفرضية غير صحيحة مثل CB2 لم يتأثر الانجذاب الكيميائي للبلاعم الناجم عن ناهض بالتثبيط الدوائي أو الحذف الجيني لـ CB2. بدلا من ذلك تظهر نتائجنا أن CB الاصطناعية2 منبهات JWH133 و HU308 و L-759،656 و L-759،633 تقوم بتنشيط G واحد على الأقلأنا / س- مستقبلات مزدوجة متميزة عن CB2لاستنباط الهجرة الخلوية الموجهة. هذه النتيجة لا تخلو من سابقة ، باعتبارها غير CB1/ سي بي2 تم تورط المستقبل في التنظيم السلبي للإنجذاب الكيميائي الناجم عن fMLP بواسطة endo و phytocannabinoids 27. ملف تعريف المستقبل الذي حدده McHugh وآخرون لا يتطابق مع GPCR المفترض من دراستنا ، إلا أن ملاحظتهم توضح أن المستقبلات الجديدة المشاركة في تعديل الانجذاب الكيميائي بواسطة القنب قد تكون أكثر عددًا مما يُعتقد حاليًا.

يوفر التحليل الكيميائي للمنبهات المستخدمة في هذه الدراسة مزيدًا من الدعم لأن JWH133 و HU308 و L-759،656 و L-759،633 لها آلية محددة في موقع خارج الهدف. ترتبط جميع المركبات الإيجابية بالتركيز الكيميائي من الناحية الهيكلية ، حيث تستند إلى phytocannabinoid Δ9-THC ولها أيضًا قيم cLogP تزيد عن 6.7 (الشكل التكميلي S1). نظرًا لأن المركبات المماثلة لها نشاط بيولوجي مماثل في العادة 43 ، فإن هذا يعني أنها تشترك في طريقة عمل مشتركة. ومع ذلك ، نظرًا لأن CP 55،940 ، الذي له بنية مماثلة وميل للدهون للمركبات الإيجابية للانجذاب الكيميائي ، لم يكن قادرًا على إحداث الهجرة الموجهة ، فمن غير المحتمل أن تكون قدرة بعض CB فقط.2 تعتمد الترابطات للحث على الانجذاب الكيميائي فقط على خواصها الفيزيائية والكيميائية. بدلاً من ذلك ، نستنتج أن CP55،940 من المحتمل أن ينتهك القيود الصارمة للموقع غير المستهدف مما يجعله غير نشط وغير قادر على إحداث الهجرة الموجهة.

حاليا هوية المستقبل المسؤول عن CB2 لا يزال الانجذاب الكيميائي الناجم عن ناهض غير معروف ، لكننا استبعدنا في البداية CB1 نظرًا لأنه لم يتم التعبير عنه على الضامة المستحثة بالجيل الحيوي ولم يكن لـ SR141617A أي تأثير على CB2 انجذاب كيميائي الناجم عن ناهض. ركزنا بعد ذلك على GPR55 و GPR18 كمرشحين محتملين ، حيث يربط كلاهما العديد من مركبات القنب 37،39،40 وقد ثبت أنهما يتوسطان في الهجرة الخلوية الموجهة 38،41،42. لقد اخترنا استخدام قياس المعاوقة الكهربائية لتغيرات مورفولوجيا الخلية حيث أن هذا النظام يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالتركيز الكيميائي ويسمح أيضًا باختبار العديد من المستقبلات والمنبهات في وقت واحد. ومع ذلك ، لم يتمكن JWH133 و HU308 من إحداث إعادة ترتيب الهيكل الخلوي في خلايا CHO التي تعبر عن GPR18 أو GPR55. علاوة على ذلك ، لم ينتج JWH133 تجنيد بيتا في أي من المستقبلات. وبالتالي ، تم استبعاد كلاهما باعتباره GPCR المعني.

من المهم ملاحظة أن النتيجة السلبية من شاشة-stopin لا تثبت بشكل قاطع أن أياً من 241 GPCRs المختبرة مسؤولة عن التأثيرات غير المستهدفة للـ CB الاصطناعية2 منبهات ويجب النظر إليها فيما يتعلق بالمحاذير التالية.أولاً ، قد تعني الانتقائية الوظيفية أن JWH133 لا يتسبب في إيقاف β في التوظيف في هذا GPCR المعين. ثانيًا ، نظرًا لاستخدام GPCRs البشرية للشاشة (نظرًا لعدم توفر إصدارات الفئران) ، اختلافات الأنواع بين CB2 علم العقاقير ، والتي تم توثيقها جيدًا في المختبر 44،45،46 ، يمكن أن يفسر النتيجة السلبية. ومع ذلك ، نظرًا لأن JWH133 قد ثبت بالفعل أنه يعمل كعامل جذب كيميائي للخلايا الأحادية البشرية ، بنفس التركيزات المستخدمة في هذه الدراسة ، فقد افترضنا أن هذا لن يكون على الأرجح مشكلة 13. أخيرًا ، أظهر العمل الأخير أن إنشاء CB2 يمكن أن تتصرف الروابط بشكل مختلف في الأنسجة الأولية على عكس الأنظمة الخلوية المؤتلفة كما هو الحال في طحال الإنسان والجرذان والفأر ، يتصرف AM1241 كمحفز ، بينما في خلايا CHO تُفرط في التعبير عن CB البشري.2 يعمل بمثابة ناهض معكوس 47. لذلك على الرغم من أن CB2 تعمل الترابطات كمنبهات لـ GPCR الجديدة في الضامة الأولية للفأر ، وقد تعرض علمًا صيدلانيًا مختلفًا في في المختبر النظام المستخدم لشاشة-الحجز.

بغض النظر عن الطبيعة الدقيقة للمستقبل ، نعتقد أن اكتشافنا أن JWH133 و HU308 و L-759،656 و L-759،633 أكثر اختلاطًا مما كان يعتقد حاليًا له آثار واسعة النطاق على مجال القنب ككل. لقد ثبت أن العديد من القنب المشتق من النباتات والداخلية ينشط العديد من المستقبلات بخلاف CB1 أو سي بي2، ومع ذلك ، على حد علمنا ، هذا هو التقرير الأول الذي يشير إلى أن هذه الناهضات الاصطناعية لها تأثيرات غير مستهدفة من النتائج الوظيفية في الخلايا الأولية ذات الصلة بالمرض. هذا مهم لأن JWH133 و HU308 هما من بين الناهضات الأكثر استخدامًا لتقييم التنشيط الانتقائي لـ CB2 2. لكن سمعتها كمنبهات انتقائية ، معززة بالتوصيف التاريخي المركب لـ CB1/ سي بي2 النشاط في أنظمة الخلايا المنقولة عن طريق الإفراط في التعبير عن أي من مستقبلات القنب ، يعني أن العديد من الدراسات لا تستخدم ضوابط صارمة عند استخدام هذه الروابط. وجد بحث سريع في الأدبيات أمثلة متعددة على JWH133 و HU308 المستخدمة في كل من فحوصات الخلايا الأولية و في الجسم الحي نماذج المرض دون عداء المستقبل أو CB2 الحذف لتأكيد CB2 التبعية 48،49،50،51،52،53،54،55،56،57. قد تعني التأثيرات غير المستهدفة لـ JWH133 و HU308 أن النتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسات قد نُسبت خطأً فقط إلى تنشيط CB2. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي العديد من النماذج المذكورة أعلاه على مكون التهابي قوي ، وبما أن البلاعم تلعب دورًا رئيسيًا في أثناء الالتهاب 58،59 ، فمن المحتمل أن تكون GPCR المترجمة المتورطة في هذه الدراسة قد أربكت النتائج المرصودة. في الواقع ، قد يفسر هذا المستقبل النتائج الحالية في الأدبيات. على سبيل المثال ، لم يتم التأكد من قدرة JWH133 المذكورة سابقًا على أن تكون جاذبًا كيميائيًا للوحدات البشرية الأحادية على الاعتماد التام على CB.2 13. في ضوء بياناتنا ، نتوقع ذلك ، بدلاً من CB2، قد يكون المستقبِل الجديد المتورط في دراستنا مسؤولاً عن الانجذاب الكيميائي بوساطة JWH133 للخلايا الوحيدة البشرية.

باختصار ، يؤكد عملنا على أهمية استخدام الخلايا الأولية حيثما كان ذلك ممكنًا ، كما لو كان في المختبر أثبتت أنظمة الخلايا بلا شك أنها حاسمة لفهمنا لـ CB1 و CB2 علم العقاقير ، بحكم طبيعتهم ، لن يوضحوا أهداف CB وعلم الصيدلة2 منبهات في البيئات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان استخدام الضربة القاضية الجينية جنبًا إلى جنب مع الحصار الدوائي حيثما أمكن ذلك عند البحث عن دليل على CB2 تأثير محدد باستخدام الخلايا الأولية أو الأنسجة أو في الجسم الحي نماذج المرض.


الاستنتاجات

في الختام ، يعد الاسترداد الأولي للبروتينات المؤتلفة من الوسائط غير الموضحة تقنية معالجة جذابة مع إمكانية تحسين كفاءة العملية بشكل كبير. توضح هذه الدراسة الالتقاط الأولي لـ CEA شديد الجليكوزيلات ، الذي يحمل علاماته باستخدام كروماتوجراف Ni-IMAC ذو التدفق الشعاعي الكبير بدون تأثير ضار على حيوية الخلية. يمكن تطبيق نهجنا على استعادة العديد من البروتينات المختلفة من تيارات تغذية الثدييات باستخدام أنماط أخرى من التفاعلات الكروماتوجرافية مثل التقارب وكروماتوجرافيا التبادل الأيوني.

تم دعم هذه الدراسة من قبل صندوق Debbie و UCL Cancer Institute Research Trust ومركز KCL و UCL الشامل لتصوير السرطان (CCIC) بتمويل من أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (CRUK) ومجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية (EPSRC) بالتعاون مع مجلس البحوث الطبية (MRC) ووزارة الصحة (إنجلترا) ، مركز طب السرطان التجريبي التابع لوزارة الصحة و CR-المملكة المتحدة (ECMC) ، البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7) ، مشروع DARTRIX و IMAGINT والمعهد الوطني للصحة مركز البحوث الطبية بجامعة كوليدج بلندن (NIHR BRC).

لم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.


نتائج

اختيار الإنزيم المستهدف وكيمياء تدبيس البروتين.

تم اختيار محفز حيوي للزراعة الحلقي تم الإبلاغ عنه مؤخرًا مشتق من ميغابايت ، ميغابايت (H64V ، V68A) (29) ، ليكون قاع الاختبار لتطوير R-GPS. مقارنةً بالميغا بايت من النوع البري ، يحمل Mb (H64V ، V68A) طفرتين نشيطتين في الموقع تمنحان نشاطًا محفزًا محسّنًا بالإضافة إلى انحراف عالٍ وانتقائية ضوئية (& gt90-99٪ دي و ه) في cyclopropanation من ستيرين وفينيلارين مع إيثيل ألفا ديازواسيتات كمانح كاربين (29). من ناحية ، كان تثبيت Mb (H64V ، V68A) مرغوبًا لتعزيز متانته للتطبيقات الاصطناعية ، والتي تشمل تخليق الأدوية المحتوية على السيكلوبروبان وتفاعلات نقل الكاربين الأخرى (30 ، 31). من ناحية أخرى ، تم تصور الانتقائية الفراغية العالية لـ Mb (H64V ، V68A) لتوفير مسبار حساس لتقييم تأثير المواد الغذائية التساهمية المصممة حسابيًا على الخصائص الوظيفية الدقيقة مثل الحث المجسم. في الواقع ، أشارت الدراسات السابقة إلى أن الانتقائية الفراغية لمحفزات الزراعة الحلقية المستندة إلى ميغابايت شديدة الحساسية للتغيرات الهيكلية الصغيرة في مواقعها النشطة (30).

تم اختيار تفاعل تشكيل رابطة thioether بين السيستين و O-2-bromoethyl-tyrosine (O2beY) القابل للتشفير وراثيًا (28 ، 32) كاستراتيجية الارتباط المتبادل للبروتين (الشكل 1).أ). بناءً على هذه الدراسات السابقة ، كان من المتوقع أن يقدم تفاعل O2beY / Cys العديد من الميزات الواعدة لغرض تدبيس البروتين ، وهي:أنا) القدرة على التوسط في التكوين التلقائي للرابط المتقاطع للثيوثير على مستوى ما بعد الترجمة ، (ثانيا) انتقائية كيميائية عالية لـ O2beY تجاه الألكلة بوساطة السيستين في وجود بقايا محبة للنواة الأخرى (على سبيل المثال ، Lys and His) ، و (ثالثا) تفاعلية "يتم التحكم فيها مكانيًا" ، حيث يخضع O2beY و Cys لتفاعل الاستبدال المحب للنيوكليوفيليا فقط عندما يقع على مسافة قريبة.

نهج التصميم الحسابي. (أ) تفاعل تدبيس بين الأحماض الأمينية غير الكنسية ا-2-برومو إيثيل التيروزين والسيستين مما يؤدي إلى رابطة ثيويثير مستقرة كيميائيًا. (ب) هيكل ميغابايت (رمز معرف بنك بيانات البروتين 1JP9) يبرز الحلزونات A – H (اليسار). تظهر مجموعة الهيم في الموقع النشط وبقايا الهيستيدين المنسقة للمعادن كعصي. المجموعة التوافقية لوصلة الأثير النمذجة المستخدمة للعثور على مواقع متوافقة للتدبيس (حق). (ج) نماذج توضح مواقع الدبابيس التساهمية بين الحلزونات A - H و B - G في التصاميم sMb1 إلى sMb9.

التصميم الحسابي لمتغيرات تدبيس (H64V ، V68A) ميغابايت باستخدام R-GPS.

كمبدأ تصميم أولي ، فقد استنتجنا أن بقايا الربط المتصالب البعيدة في التسلسل الأساسي ولكنها قريبة في الفضاء في الحالة المطوية ستزيد من التثبيت الحراري عن طريق تقليل التكلفة الحتمية التسلسلية للطي (33 ⇓ –36). كمعيار ثانٍ ، تصورنا الحاجة إلى تحديد مواضع العمود الفقري المتوافقة لوضع مجموعات السلاسل الجانبية هالو ألكان (O2beY) وثيول (Cys) بحيث يتم استيعاب الارتباط المتقاطع في تكوين خالٍ من الإجهاد مع إجراء تفاعلات مواتية بقوة مع مجموعته. المخلفات المحيطة (33). باتباع هذه المبادئ التوجيهية ، تم اختيار حلزونات N-terminal A و B وحلزون C-terminal G و H من الإنزيم المستهدف ، Mb (H64V ، V68A) ، كمناطق مستهدفة لتركيب جسور الأثير (الشكل. 1ب) ، نظرًا لأن الروابط المتقاطعة بين هذه العناصر الهيكلية ستحمل أعلى ترتيب اتصال. تم بعد ذلك تطبيق خوارزمية RosettaMatch (37) لتحديد المواضع التي يمكن فيها استيعاب بقايا O2beY و Cys لتشكيل مادة الأثير الثنائي. بمجرد الحصول على مواضع العمود الفقري الممكنة هندسيًا لبقايا الربط المتقاطع (الشكل 1ب) ، تم إجراء RosettaDesign (38) لتحديد تغييرات تسلسل إضافية لتقليل الاشتباكات الساكنة مع العنصر الأساسي النموذجي. لتقييم الطريقة ، اخترنا للتوصيف التجريبي مجموعة متنوعة من تسعة تصميمات بناءً على (أنا) إمكانية الوصول إلى المذيب للمادة الأساسية في بنية البروتين ، (ثانيا) العدد الإجمالي لبدائل الأحماض الأمينية ، و (ثالثا) طاقات رشيد (الجدول 1). تم تسمية هذه التصميمات بـ sMb1 إلى sMb9 وكان لها اختلافات في الدرجات بالنسبة للبروتين الأصلي Mb (H64V ، V68A) تتراوح من −6.7 (sMb1) إلى +16.6 (sMb9) وحدات طاقة Rosetta (Reu) ، وأطوال مقطع متداخلة تتراوح من 73 (sMb2) إلى 121 (sMb5) من المخلفات. تتميز سبعة من المتغيرات المصممة بوصلة ثيوثير مكشوفة السطح ، بينما بالنسبة للاثنين المتبقيين (sMb6 و sMb8) ، يتم دفن الوصلة المتقاطعة (الشكل 1).ج). تراوح عدد بدائل الأحماض الأمينية المصممة ، باستثناء مخلفات Cys و O2beY ، من صفر (sMb2 و sMb5) إلى اثنين (sMb3 و sMb6 و sMb7 و sMb8 و sMb9).

القيم الحسابية والتجريبية للميجابايت (H64V ، V64A) ​​ومتغيراتها

التعبير عن تصاميم sMb وتوصيفها.

يمكن التعبير عن جميع المتغيرات المستمدة من Mb (H64V ، V68A) المصممة في شكل قابل للذوبان من الإشريكية القولونية الخلايا التي تحتوي على مركب aminoacyl-tRNA synthetase / tRNACUA زوج لتأسيس O2beY (28) عبر قمع كودون إيقاف العنبر (39). بالإضافة إلى ذلك ، كانت جميع التركيبات قادرة على ربط الهيم والطي بشكل صحيح ، كما يتضح من شريط Soret المميز (∼410 نانومتر) في الأطياف المرئية للأشعة فوق البنفسجية المقابلة (الملحق SI، الشكل S4).

كشف تحليل SDS / PAGE عن زيادة في التنقل الكهربي لخمسة من أصل تسعة تركيبات بروتينية ، وهي sMb2 و sMb3 و sMb4 و sMb5 و sMb7 ، مقارنةً بـ Mb (H64V ، V68A) (الشكل 2).أ و الملحق SI، الشكل S5). يشير هذا السلوك إلى بنية أكثر إحكاما للبروتين في ظل ظروف تغيير الطبيعة والاختزال (SDS + DTT) ، وهو ما يتوافق مع وجود الارتباط المتبادل للثيوثير غير القابل للاختزال (O2beY / Cys). تم تأكيد هذه الاستنتاجات بواسطة MALDI-TOF MS (الشكل 2ب و الملحق SI، الشكل S6) ، والذي أظهر إشارة واحدة مقابلة للكتلة المتوقعة لهذه البروتينات ناقص 82 Da ، المستمدة من فقدان HBr نتيجة تفاعل الارتباط المتبادل O2beY / Cys. بالنسبة لـ sMb4 ، اثنان م/ض أشارت الإشارات المتوافقة مع الشكل المدبس وغير المدبس للبروتين إلى أن تفاعل الارتباط المتبادل O2beY / cysteine ​​قد حدث جزئيًا فقط. بالنسبة للتصاميم المتبقية ، تتوافق الأنواع الوحيدة التي يمكن ملاحظتها في أطياف MS مع البروتين المحتوي على O2beY الذي يفتقر إلى الارتباط المتقاطع الثيوثير. والجدير بالذكر أن سلامة بقايا O2beY في هذه التركيبات غير المدبسة توضح عدم وجود تفاعل غير مرغوب فيه تجاه التحلل المائي أو المستقلبات داخل الخلايا المحتوية على الثيول مثل الجلوتاثيون. تُظهر هذه النتائج أيضًا كيف أن وضع زوج O2beY / Cys على مقربة مكانية قريبة في سياق البروتين المطوي هو شرط ضروري ولكنه غير كافٍ للتدبيس المنتج. يمكن تبرير الاعتماد الموضعي لتفاعل التدبيس بناءً على تحليل الدوارات الخاصة بمخلفات Cys و O2beY (الشكل 1).ب) في نماذج بنيات sMb بأشكالها غير المدبسة. على وجه الخصوص ، تم العثور على اتفاق جيد بين النتائج التجريبية وإمكانية الوصول إلى المطابقات القريبة من الهجوم (NACs) المتوافقة مع تفاعل الاستبدال ثنائي الجزيء nucleophilic بين مجموعة thiol من cysteine ​​ومجموعة alkyl bromide في O2beY (انظر الملحق SI لمزيد من المناقشة).

توصيف متغيرات تدبيس Mb (H64V ، V68A) (متغيرات sMb). (أ و ب) جل SDS / PAGE (أ) وطيف MALDI-TOF MS (ب) من ميغابايت (H64V ، V68A) ومتغيرات sMb التمثيلية. ج ، متشابك ج (2 ×) ، مرتبط بشكل مضاعف nc ، غير متقاطع. الكتل المحسوبة: Mb (H64V، V68A): 18474 Da sMb2 (c): 18،500 Da sMb4 (c): 18،472 Da sMb5 (c): 18،594 Da sMb10 [c (2 ×)]: 18621 Da sMb13 [c (2 × )]: 18612 دا. (ج) منحنيات التمسخ الحراري لـ Mb (H64V ، V68A) والمتغيرات المحددة المدبسة كما تم قياسها عبر القرص المضغوط عند 220 نانومتر (تيم عزم). (د) منحنيات التعطيل بفعل الحرارة (فقدان الهيم) لنفس البروتينات كما هو محدد بانخفاض إشارة نطاق Soret (408 نانومتر) بعد الحضانة (10 دقائق) عند درجات حرارة متغيرة (تي50 عزم). ارى الملحق SI، تين. S5 – S7 للحصول على بيانات إضافية. (ه و F) النشاط التحفيزي (ه) والانتقائية الضوئية (F) من Mb (H64V ، V68A) والمتغيرات المدببة في تفاعلات الستايرين cyclopropanation مع EDA في المخزن المؤقت فقط وفي وجود 30٪ حجم / حجم إيثانول. تشير الأنشطة النسبية إلى التحولات الحفازة الطبيعية (TON) بالنسبة إلى TON المقاسة بـ Mb (H64V ، V68A) في تفاعلات المخزن المؤقت فقط. ارى الملحق SI، تين. S10 - S12 للبيانات ذات الصلة بالمذيبات العضوية الأخرى. Rel Int ، الكثافة النسبية.

ثبات تصاميم sMb بالحرارة.

تم فحص الثبات الحراري لمتغيرات Mb من خلال قياس درجات حرارة انصهارها (تيم) باستخدام القرص المضغوط (الملحق SI، الشكل S7). تم العثور على ميغابايت (H64 ، V68A) لعرض واضح تيم 66.0 درجة مئوية (الشكل 2ج) ، وهو أقل بنحو 14 درجة مئوية من مثيله في البرية من النوع ميغابايت. والجدير بالذكر أن جميع تركيبات sMb التي تحتوي على عنصر thioether الأساسي أظهرت زيادة في الثبات الحراري مقارنة بالبروتين الأصلي ، مع Δتيم تتراوح القيم من 3.9 درجة مئوية إلى 10 درجة مئوية (الجدول 1). لوحظ أكبر تأثير للتثبيت الحراري بالنسبة لـ sMb5 (Δتيم: +10.0 درجة مئوية) ، متبوعًا بـ sMb2 (Δتيم: +7.2 درجة مئوية). في المقابل ، فإن متغيرات sMb التي تفتقر إلى الارتباط المتقاطع تظهر قابلة للمقارنة (sMb1 و sMb9) أو أقل تيم القيم (sMb4 و sMb6 و sMb8) مقارنة بالميغا بايت (H64V ، V68A) (Δتيم: +1.5 إلى -16.8 درجة مئوية الجدول 1). لمزيد من فحص تأثير عنصر thioether الأساسي ، تم تحضير نظائر اثنين من المتغيرات sMb الأكثر استقرارًا ، sMb2 و sMb5 ، عن طريق استبدال O2beY بـ O-propargyl-tyrosine (OpgY) (40). OpgY هو isostere لـ O2beY ولكنه غير قادر على التفاعل مع cysteine ​​لتكوين رابط thioether المتقاطع ، كما أكده SDS / PAGE (الشكل 2)أ) وتحليلات MALDI-TOF MS (الملحق SI، الشكل S6). تم عرض المتغيرات الناتجة المحتوية على OpgY ، sMb2 (OpgY) و sMb5 (OpgY) ، بشكل أقل بكثير تيم قيم من نظرائهم تدبيس (Δتيم: -12.2 ° C و -11.9 ° C ، على التوالي) ، مما يؤكد تأثير التثبيت للوصلة المتقاطعة thioether ، كما هو مشفر في التصميم الحسابي.

كمقياس ثانٍ للثبات الحراري ، درجات حرارة تمسخ نصف الحد الأقصى (تي50) من خلال مراقبة خسارة الهيم (λالأعلى408 نانومتر) عند حضانة البروتينات الدموية (10 دقائق) عند درجات حرارة متغيرة (الشكل 2)د). هذا اختبار أكثر صرامة للاستقرار الحراري لأنه يراقب قدرة متغيرات sMb على أن تظل مرتبطة بالعامل المساعد للهيم ، وهو أمر ضروري لنشاطها كمحفزات حيوية للزراعة الحلزونية. نظرًا لأن التمسخ الحراري للهولوميوغلوبين لا رجوع فيه ، فإن الزيادة في تي50 هو أيضًا مقياس للاستقرار الحركي عند الارتباط المتقاطع. في هذا الاختبار ، أظهر Mb (H64V ، V68A) أ تي50 قيمة 62.3 درجة مئوية (الجدول 1). بينما أظهر sMb3 و sMb7 انخفاضًا تي50 القيم مقارنةً بـ Mb (H64V ، V64A) ​​(الجدول 1) ، أظهر كل من sMb5 و sMb2 استقرارًا حراريًا محسنًا مقارنة بالبروتين الأصلي (Δتي50: +9.2 درجة مئوية و +1.5 درجة مئوية ، على التوالي شكل 2ج). توضح هذه النتائج أن تأثير التثبيت الحراري الناجم عن الروابط المتقاطعة O2beY / Cys في كل من sMb2 و sMb5 لا يقتصر على البنية الثانوية للبروتين ، على النحو الذي تحدده منحنيات انصهار القرص المضغوط ، ولكنه يمتد إلى الهيم المرتبط ("هولو") أشكال هذه البروتينات.

تصميم وتوصيف متغيرات ميغابايت ذات التدبيس المزدوج.

ثم تمت متابعة المزيد من الاستقرار لـ Mb (H64V ، V68A) من خلال الجمع بين المواد الأساسية التساهمية من أكثر المتغيرين الواعدين ، وهما sMb2 و sMb5 ، مما أدى إلى تصميم sMb10. عند الإنتاج في بكتريا قولونية، أكد تحليل MS التكوين الناجح لكل من الروابط المتقاطعة داخل هذا البروتين (الشكل 2ب). أظهر التوصيف الإضافي لـ sMb10 تأثيرًا إضافيًا تقريبًا للمركبين thioether نحو زيادة الثبات الحراري للبروتين الدموي من حيث كليهما. تيم و تي50تيم: +16.8 درجة مئوية Δتي50: +10.7 درجة مئوية الجدول 1). كشفت مقارنة أطياف القرص المضغوط المقابلة لـ sMb5 و sMb10 و Mb (H64V ، V68A) عن عدم وجود تغييرات كبيرة في البنية الثانوية للبروتين نتيجة لوجود عنصر واحد (sMb5) ومزدوج التيلة (sMb10) (الملحق SI، الشكل S8).

ثم تمت متابعة التقييم والمزيد من الاستقرار لـ sMb10 من خلال الطفرات النقطية الموجهة بالهيكل. أكد التحقيق في استبدال F106A في sMb11 الأهمية النشطة للتفاعل المحسوب π π التراص بين بقايا O2beY في الموضع 36 وحلقة فينيل لـ Phe106 (انظر الملحق SI لمزيد من المناقشة). بعد ذلك ، لاحظنا أن تركيب الوصلة المتقاطعة 36-109 (من sMb2) و5-126 عبر الوصلة (من sMb5) يستبدل في كل حالة بقايا سالبة الشحنة معرضة للمذيبات (أي Glu109 و Asp126 ، على التوالي) العنصر الأساسي O2beY / Cys الأقل قطبية. وفقًا لذلك ، تم تصميم بنائين إضافيين (sMb12 و sMb13) لدمج بدائل الأحماض الأمينية "المعادلة" المحايدة إلى السالبة الشحنة (على سبيل المثال ، G129E و H113E ، على التوالي) في موضع متوافق بالقرب من كل عنصر أساسي. في حين أظهر sMb12 انخفاضًا في ثبات الحرارة (تي50) مقارنة مع sMb10 ، وجد أن sMb13 يظهر أعلى تيمتيم: +1.2 درجة مئوية) بالإضافة إلى زيادة الاستقرار بشكل ملحوظ ضد فقدان الهيم الناتج عن درجة الحرارة (Δتي50: +5.3 درجة مئوية) مقارنة بـ sMb10. تم تأكيد وجود اثنين من الروابط المتقاطعة O2beY / Cys في sMb13 من خلال تحليل MS ، والذي كشف أيضًا عن وجود جزء صغير من البروتين المفرد (الشكل 2).ب). تم العثور على أطياف القرص المضغوط لـ sMb13 و sMb10 لتكون قابلة للتركيب ، مما يشير إلى أن طفرة "تعويض الشحنة" H113E كان لها تأثير ضئيل على بنية البروتين (الملحق SI، الشكل S8). وهكذا ، كنتيجة لخمسة طفرات فقط تعرضت للمذيبات في sMb13 ، فإن الثبات الحراري (تيم) من المحفز الحيوي الأصلي Mb (H64V، V64A) ​​يمكن زيادته بمقدار +18 درجة مئوية.تُرجمت هذه التعديلات أيضًا إلى زيادة كبيرة في الاستقرار الحراري لشكل البروتين المرتبط بالهيم (Δتي50: +16 درجة مئوية).

النشاط التحفيزي والانتقائية لمتغيرات ميغابايت (H64V ، V68A) المدبسة في تفاعلات التبويض العضلي.

في غياب الضغط الانتقائي للحفاظ على الوظيفة ، غالبًا ما يصاحب التثبيت الحراري عبر هندسة البروتين انخفاض في الكفاءة التحفيزية و / أو انتقائية الإنزيم المستهدف (41 –43). لتقييم تأثير دبابيس thioether على الخصائص التحفيزية والانتقائية الفراغية لمتغيرات sMb المستقرة حرارياً ، تم اختبار هذه المحفزات الحيوية في تفاعل نموذجي للبروبان الحلقي مع الستايرين (1) و α-diazoacetate (EDA ، 2) (الجدول 2). في ظل الظروف المطبقة [10 ملي ستايرين ، 20 ملي مولار EDA ، متغير 2 ميكرومتر ميغا بايت (0.02 مول ٪)] تم العثور على ميجا بايت (H64V ، V68A) لإنتاج (1س,2س) -إيثيل 2- فينيل سيكلوبروبانيكاربوكسيلات (3 أ) في عائد 94٪ (4،710 دوران أو طن) و diastereomeric عالية (99.4٪ دي) وفائض تصويري (99.1٪) ه) (الإدخال 1 ، الجدول 2). في ظل ظروف مماثلة ، كان كل من sMb10 و sMb13 قادرين على تحفيز تكوين 3 أ ذات نشاط تحفيزي مرتفع بنفس القدر (92-94٪ ينتج 4.710-4.615 طنًا) والانتقائية الفراغية (& gt99٪ دي و ه إدخالات 4-5 ، الجدول 2). أشارت هذه البيانات بوضوح إلى أن التثبيت الحراري الناجم عن إجراء التدبيس لم يكن له تأثير سلبي على تفاعل نقل الكاربين لهذه البروتينات الدموية ، كما أنه لم يزعج البيئة غير المتماثلة التي يوفرها جيب الهيم البعيد ، وهو أمر بالغ الأهمية لتحفيز (1).س,2س) -الانتقائية المضادة أثناء تفاعل cyclopropanation (29).

النشاط التحفيزي والانتقائية لـ Mb (H64V ، V68A) ومتغيراته المدببة من أجل cyclopropanation للستايرين (1 أ) وخماسي فلوروسترين (1 ب) مع إيثيل 2-ديازو أسيتات (2) في غياب وفي وجود المذيبات العضوية

زيادة الاستقرار ضد التمسخ الكيميائي.

المتانة المعززة للتمسخ الكيميائي والمذيبات العضوية هي سمة مرغوبة للغاية من الإنزيمات لاستخدامها في التطبيقات الاصطناعية (44 ، 45). لفحص هذا الجانب ، تعرضت تركيبات sMb الواعدة (sMb5 و sMb10 و sMb13) لتجارب تمسخ في وجود كلوريد الجوانيدينيوم (Gnd · HCl) (الملحق SI، الشكل S9). يعكس الاتجاه الناشئ عن فحوصات الثبات الحراري ، لوحظت زيادة ثباتية تدريجية في وجود عامل Chaotropic الانتقال من sMb5 المدبّس منفردًا (جم: 1.79 م) إلى sMb10 و sMb13 (جم: 2.01 م و 2.08 م على التوالي) ، مقارنة بالإنزيم الأصلي (جم: 1.55 م).

بعد ذلك ، درسنا تأثير المواد الغذائية الأساسية نحو تحسين أداء متغيرات sMb في المذيبات العضوية. في وجود 30 ٪ (حجم / حجم) من الإيثانول ، يحفز Mb (H64V ، V68A) البروبان الحلقي للستايرين مع انخفاض النشاط (48 ٪ العائد 2420 طنًا من النشاط النسبي 51 ٪) وانتقائية ضوئية أقل (92 ٪) ه) مقارنة بنفس رد الفعل في المخزن المؤقت (الشكل 2 ه و F إدخال 6 مقابل 1 ، الجدول 2). بالمقارنة مع Mb (H64V ، V68A) ، يتحمل كل من sMb10 و sMb13 بشكل أفضل وجود المذيب العضوي ، مما يوفر منتج cyclopropanation 3 أ في الغلات الأعلى (78-82٪ 3900-4.100 طن إدخال 7 ، الجدول 2) ومع ارتفاع diastereo- (1: 400 مقابل 1: 130 نسبة دياستيريومير ل عبر: رابطة الدول المستقلة) والانتقائية الضوئية (97٪ مقابل 92٪ ه) (الإدخال 7 مقابل 6 ، الشكل 2F والجدول 2). نظرًا لأن الانتقائية الفراغية حساسة للغاية للاضطراب الهيكلي داخل الموقع النشط لهذه المحفزات الحيوية (30) ، فإن هذه النتائج تشير إلى أن تثبيت سقالة Mb بواسطة التدبيس التساهمي يقلل من التأثيرات التخريبية التي يسببها المذيب العضوي. ولوحظ اتجاه مماثل عند مقارنة نشاط وانتقائية sMb5 و sMb10 و sMb13 مع تلك الخاصة بـ Mb (H64V ، V68A) في تفاعلات البروبان الحلقي في وجود تركيزات عالية (30٪ حجم / حجم) من المذيبات العضوية الأخرى مثل الميثانول ، ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) ، و DMSO (الملحق SI، تين. S10 – S12). في المقارنة ، تم تحمل رباعي هيدرو الفوران (THF) جيدًا على قدم المساواة من قبل كل من البروتين الأصلي والمتغيرات المدبسة (الإدخال 9 ، الجدول 2). في وجود هذه المذيبات العضوية ، يمكن إنتاج كل من sMb10 و sMb13 3 أ في الإنتاجية العالية (64-88٪ 3،200-4،440 طن) والانتقائية الفراغية العالية (99.5-99.8٪) دي 99.2–99.6% ه) (مداخل 8-10 ، جدول 2). علاوة على ذلك ، يحافظ sMb10 و sMb13 على نشاط تحفيزي جيد (1،080-1،990 طنًا) بالإضافة إلى انتقائية ستيريو ممتازة (& gt99٪ دي 97–98.5% ه) حتى في وجود مزيج 1: 1 تقريبًا (45٪ حجم / حجم) من المخزن المؤقت مع DMF أو DMSO (الإدخال 11 ، الجدول 2 و الملحق SI، تين. S11 و S12). هذه النتائج ملحوظة بالنظر إلى أن معظم الإنزيمات المعتمدة على الهيم يتم تعطيلها بسهولة عن طريق التركيزات المنخفضة (& gt5-10٪ حجم / حجم) من هذه المذيبات العضوية (46 ، 47). نظرًا لأدائها المحسن بتركيزات عالية من DMSO ، يمكن تطبيق sMb10 و sMb13 لتوفير البروبان الحلقي لركيزة غير قابلة للذوبان في الماء ، أي خماسي فلوروستيرين (1 ب) ، بكفاءة أعلى من الممكن باستخدام متغير ميغابايت الأصلي (الجدول 2 ، المدخلات 13 و 14 مقابل 12). إجمالاً ، توضح هذه النتائج قيمة R-GPS نحو تعزيز متانة وأداء المحفز الحيوي في وجود المميزات الكيميائية والمذيبات العضوية.


الوبائيات الجزيئية لميكوبلازما جاليسبتيكوم في أنواع مختلفة من الدجاج.

تم إجراء الوبائيات الجزيئية لميكوبلازما جاليسبتيكوم Mycoplasma gallisepticum في الدواجن التجارية والفناء الخلفي في أجزاء مختلفة من باكستان وآزاد جامو وكشمير. تم التعرف الجزيئي على العزلات باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). تم تحديد 142 عزلة من M. gallisepticum من 573 أسراب. تم تمييز العزلات أيضًا على أساس SDS-PAGE. كان معدل الانتشار التراكمي لنوع M. gallisepticum في دجاج التسمين ومربي الدجاج اللاحم والطبقات التجارية ومربي الطبقات بما في ذلك الدواجن المنزلية / الريفية 14.62 و 29.33 و 23.16 و 42.85٪ على التوالي ، مما يشير إلى انتشار معنوي في جميع أنواع الطيور مع قيمة مربع كاي X2 = 7.81. يشير الاختلاف الموسمي الكبير (X2 = 3.84) إلى ارتفاع معدل الانتشار بنسبة 56.34٪ في الشتاء مقارنة بـ 43.66٪ في الصيف. أشارت نتائج SDS-PAGE إلى أن 71.43٪ من العزلات المختبرة أثبتت أنها مسببة للأمراض بوجود 74 كيلو دالتون أشرطة بروتين لاصقة تمثل سلالة M. gallisepticum F.

تمثل العزلات المتبقية أقل ضراوة أو بقع متنوعة. يتطلب الانتشار المرتفع لـ M. gallisepticum في عدوى الجهاز التنفسي للدواجن في باكستان تأطير السياسة الوطنية من خلال المراقبة والسيطرة على المرض. (ج) 2014 Friends Science Publishers

الكلمات المفتاحية: الميكوبلازما الجزيئية الوبائية الدجاج

عدوى Mycoplasma gallisepticum (MG) التي تسبب مرضًا تنفسيًا مزمنًا (CRD) بالاشتراك مع مسببات الأمراض الأخرى التي يُقال إنها تتسبب باستمرار في خسائر اقتصادية لقطاع تربية الدواجن. تشكل الخسائر المتكبدة نفوقًا ، وانخفاض كفاءة الأعلاف ، وانخفاض إنتاج كل من اللحوم والبيض جنبًا إلى جنب مع إدانة جودة اللحوم. وتزيد تكلفة الإجراءات الوقائية والعلاجية من الخسائر (Evans et al.، 2005). تم الإبلاغ عن عمليات نقل عدوى MG أفقياً وعمودياً. يكون الانتقال الرأسي إما في البويضات أو عبر المبيض وقد ثبت حدوثه من خلال العدوى المستحثة تجريبياً (Lin and Kleven ، 1982 Glisson and Kleven ، 1984 1985 Ortiz et al. ، 1995 Siddique et al. ، 2012). بفضل هذه التهديدات المحتملة ، يعتبر MG بين الميكوبلازما المسببة للأمراض الطيور هو العامل الممرض الوحيد الذي يسبب العدوى وهو مرض يمكن الإبلاغ عنه من قبل منظمة OIE (OIE ، 2004).

الميكوبلازما بشكل عام هي بدائيات النوى الصغيرة التي يبلغ قطرها 300-800 نانومتر وخالية من جدار الخلية ولكن يحدها غشاء بلازما ثلاثي الطبقات. يبلغ حجم الجينوم الميكوبلازما 600-1350 كيلو بايت مع محتوى DNA G + C بنسبة 23-40 ٪ ، ومتطلبات النمو الانتقائي في المختبر تجعلها كائنات حساسة (Razin et al. ، 1998 Mukhtar et al. ، 2012 Mustafa et al. ، 2013). مع اكتشاف الطابع الغازي للخلية الجديدة للميكوبلازما الممرضة ، M. gallisepticum ، ينتمي إلى مجموعة M. pneumoniae ، يظهر أيضًا أنه يغزو خلايا Hela وخلايا ليفية الدجاج في المختبر وغيرها من الخلايا nonphagocytic. تلعب هذه الشخصية الغازية للخلية دورًا في الانتشار الجهازي للعدوى (Citti et al. ، 2005 Gunther et al. ، 2008 Zhang et al. ، 2013). توفر هذه النتائج نظرة ثاقبة جديدة في الآلية المرضية لـ MG وقد يكون لها آثار على تطوير استراتيجية وقائية.

في باكستان ، من الناحية السريرية ، تنتشر مشاكل أمراض الجهاز التنفسي بشكل كبير وتشكل تهديدات كبيرة لقطاع الدواجن ولكن في ضوء المعلومات الشحيحة المتوفرة بشأن الانتشار الحقيقي للأمراض في البلاد ، هناك حاجة لتحديد وتمييز عدوى MG بين تلك الأمراض التنفسية. في السيناريو الحالي ، تتطلب طبيعة العامل الممرض إجراء مسح على نطاق واسع للتأكد من الانتشار الحقيقي لعدوى MG بناءً على تقنيات جزيئية أكثر حساسية ومحددة قبل صياغة السياسة الوطنية لاتخاذ تدابير المكافحة.

الفحص السريري وتسجيل الحالة

المعلومات مع مجموعة العينات

تم دراسة عدد 171 من قطعان الدجاج اللاحم و 208 من قطعان الدجاج اللاحم و 145 من قطعان البياض و 49 من القطعان التي تمثل البياض. تم تصنيف مخزونات تربية الفيومي ورود أيرلندا الأحمر (RIR) والطيور المتقاطعة من الفيومي و RIR والطيور غير الوصفية أو المرغوبة لتكاثر الدواجن الريفية جنبًا إلى جنب مع دواجن الفناء الخلفي كمخزونات تكاثر طبقة أثناء الدراسة.

تم تضمين الطيور السليمة والمرضية التي تظهر ضائقة تنفسية مع تلك التي تظهر نتائج إيجابية مصلية في الدراسة. تم فحص الطيور النافقة والمرضية لمعرفة النتائج السريرية والآفات المرضية. تم تضمين الجثث التي تظهر العلامات والأعراض والآفات النموذجية لمزيد من التحقيقات المعملية مع تسجيل جميع معلومات القطيع ذات الصلة.

تم حصاد المصادر المفضلة للعينات على النحو المشار إليه بواسطة Kleven (1998) وحفظها لمزيد من الإجراءات المختبرية. في الحالات الحادة تم أخذ عينات من الشق المشقوق والقصبة الهوائية والرئتين. في حين تم تضمين آفات نموذجية لالتهاب الحويصلات الهوائية في العينات في المراحل المزمنة.

العزلة البكتيرية والتعرف عليها

بالنسبة للعزل والتعريف الأولي ، تم اتباع الإجراءات القياسية على النحو المفصل من قبل Kleven (1998). خلال هذه الإجراءات ، تم تشكيل مرق وأجار PPLO وفقًا لصيغة Frey et al. (1968). تعرضت العزلات التي تظهر المستعمرات المجهرية النموذجية للميكوبلازما لتفاعلات كيميائية حيوية بما في ذلك تخمير الجلوكوز ، وإنتاج الفوسفاتيز ، واختزال التترازوليوم وفحص الفيلم والبقع (Aloutta et al. ، 1970 Thomas and Barber ، 1971 Edward and Moore، 1975 Kreig and Holt، 1984 ). تم تحديد العزلات على أساس المعلمات الثقافية والمورفولوجية والكيميائية الحيوية كما ورد في Kreig and Holt (1984) بالمقارنة مع ثقافة MG القياسية (الجدول 1).

استخراج وعزل الحمض النووي: تم استخلاص الحمض النووي من مزارع الميكوبلازما من خلال طريقة الأنزيمية / المجموعة. تم طرد واحد مل من مزرعة الميكوبلازما عند 13000 × جم لمدة 6 دقائق. تم غسل الحبيبات مرتين باستخدام محلول ملحي فوسفات 1 مل (PBS) وإعادة تعليقه في 100 ميكروليتر من PBS. بعد الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، تم استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي البكتيري (Vivantis ، S. ، Coast Highway Suite 1 ، Oceanside CA 92054 ، 1012 ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتنقية الحمض النووي من خلال إجراء محدد (Dvorakova et al. ، 2005). اختيار التمهيدي لـ M. gallisepticum: تم اختيار متواليات زوج التمهيدي لـ MG من المنطقة المتغيرة. تم تحضير هذه المعلمات من Gene Link ، (Hawthorne ، NY. ، الولايات المتحدة الأمريكية): MG FP 5'- CTTTCCCATCTCGACCAGGAGAAAA-3 'كان تسلسل MG RP التمهيدي العكسي: 5'- GGATCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3' من 732 نقطة أساس (وانج وآخرون ، 1997).

تفاعل التضخيم لـ PCR: تم إجراء تفاعلات التضخيم للحمض النووي المعزول من عينات العينة في 50 وحدة تخزين UL. احتوت كل من مخاليط PCR على مزيج رئيسي (Vivantis، S.، Coast Highway Suite 1، Oceanside CA 92054، 1012، USA) 15 uL. التمهيدي الأمامي 1 uL (330 نانوغرام / uL (Gene Link NY ، الولايات المتحدة الأمريكية). التمهيدي العكسي 1 uL (330 نانوغرام / uL (Gene Link NY ، الولايات المتحدة الأمريكية). الماء شديد النقاء 28 ميكرولتر. تم أيضًا تضمين عناصر تحكم مختلفة مثل: مواد أولية بدون قالب DNA و DNA قالب بدون أي تمهيدي.

تم إجراء تضخمات الحمض النووي في جهاز تدوير حراري (نموذج Peqlab 2s Primus ، ألمانيا). باتباع ظروف التشغيل المثلى كما وصفها Wang et al. (1997) في البرنامج الرقمي للدوران الحراري الذي تضمن درجة حرارة تمسخ أولية لخليط التفاعل عند 5 دقائق. كانت أعداد دورات تشغيل PCR 35 مع الإعداد التالي في كل دورة. درجة حرارة التمسخ الأولية = 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، والتلميع عند 50 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

الرحلان الكهربائي للهلام والتصور: تعرض منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتضخم للرحلان الكهربي لهلام الاغاروز مع 2٪ agarose ، 1٪ TBE buffer و 0.5 ميكروغرام / مل بروميد إيثيديوم. تم تحميل كل من المنتجات المضخمة بـ 5 ميكرولتر في الآبار الفردية للجيل. تم تحميل علامة الجينات / دفتر الأستاذ لصف البئر الأول 100 نقطة أساس (Vivantis ، S. ، Coast Highway Suite 1 ، Oceanside CA 92054 ، 1012 ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تطبيق التيار الكهربائي بمقدار 100 فولت لمدة 30 دقيقة. تم تصور النطاقات الناتجة تحت نظام توثيق هلام Ultra Violet Trans-illuminator (WealTec ، الولايات المتحدة الأمريكية).

الرحلان الكهربائي جل دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE)

تم إجراء توصيف إضافي للعزلات لحل تباين السلالات. تم إخضاع جميع المعلقات المزروعة المعيارية من خلال التقدير المسبق للبروتين (برادفورد ، 1976) لـ SDS-PAGE (Laemmli ، 1970). تم استخدام سلم الوزن الجزيئي للبروتين الملون مسبقًا SM0441 (Fermentas) كمعيار في SDS-PAGE. يتكون السلم من 6 نطاقات أي 20 ، 25 ، 35 ، 50 ، 85 وآخر 120 كيلو دالتون. تم تشغيل هلام SDS بجهد ثابت يبلغ 100 فولت. تم إيقاف PAGE عند الوصول إلى جبهة صبغة التتبع في الجزء السفلي من الجل. تم غسل الجل بالماء بعد التلوين لتحسين شدة العصابات (Coughlan ، 1988). تم تصور العصابات المتكونة بالعين المجردة وتصويرها.

خضعت البيانات للتحليل الإحصائي باستخدام اختبار Chi-Square (SPSS للويندوز ، الإصدار 16). تم قبول P أقل من 0.05 على أنها ذات دلالة إحصائية أو معتمدة ، واعتبر P أكبر من 0.05 غير مهم أو مستقل.

تضمنت السمات المعتادة الخشخشة ، وإفرازات الأنف ، والعطس ، والسعال ، وانتفاخ العينين مع معدل وفيات متغير بحد أقصى يصل إلى 50٪ اعتمادًا على مدى تعقيد الحالة إلى جانب انخفاض الوزن والإنتاج. لوحظ وجود ريش مكشكش بشكل أكثر شيوعًا في الطيور الأصغر سنًا. ومن أبرز الآفات في المرحلة الحادة: النضح النزلي في الممرات الهوائية مثل القصبة الهوائية والشعب الهوائية مع الاحتقان والنزيف في جدران القصبة الهوائية والشعب الهوائية. في الحالات المزمنة وتحت الحاد ، كانت النتائج المتكررة هي الخرز الجبني في الممرات الهوائية المصابة. كانت الحالات المعقدة بشكل عام مصحوبة بمصاحبة عدوى الإشريكية القولونية التي تظهر بشكل متكرر التهاب الأوعية الدموية. كان تراكم المادة الجبنية في الأكياس الهوائية الصدرية والرئتين من خصوصية المرحلة المزمنة من المرض.

العزلة والتحديد والتوصيف الكيميائي الحيوي

تم اختيار الثقافات الأولية التي تعطي تفاعلات نموذجية لتغيير لون مرق PPLO في الأنابيب الملقحة إلى عكر وأصفر خلال مدة محددة ، لمزيد من الإجراءات بدءًا من تلقيح صفيحة أجار PPLO. تم التخلص من البقية. تم أخذ المظهر النموذجي على لوحات أجار PPLO المحتضنة مع المستعمرات الشفافة الصغيرة في الاعتبار. تشير المستعمرات التي تعطي مظهر البيض المقلي عند فحصها مجهريًا تحت 10x إلى نمو الميكوبلازما. تم تحديد ما مجموعه 142 عزلة ثقافية مقارنةً بثقافة MG القياسية على أساس ملف التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تم حصادها من أعضاء مختلفة والتي تُظهر معارض سريرية ومرضية نموذجية بما في ذلك 45 من القصبة الهوائية ، و 38 من الرئتين ، و 24 من الأكياس الهوائية ، و 35 من مسحات فموية في أنواع مختلفة من الطيور (الجدول 1).

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

تعرضت العينات التي تم تحديدها على أنها MG من خلال النمو والشخصيات الكيميائية الحيوية لـ PCR وتم تسجيل النتائج بعد الرحلان الكهربائي لمنتجات PCR المضخمة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV).

تم الحصول على منتج 732 نقطة أساس بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (اللوحة 1).

جل الصوديوم دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد

أظهرت معظم عزلات MG (71.43٪) التي تم تحديدها من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل عند تعرضها لـ SDS-PAGE تماثلًا في عرض نطاقات البروتين. اختلفت العزلات المتبقية المختبرة (28.57٪) في نقص البروتين في نطاق 74 كيلو دالتون (kDa) (اللوحة 2).

انتشار عدوى M. gallisepticum

تم تسجيل الانتشار التراكمي لكل من M. gallisepticum في دجاج التسمين ومربي الدجاج اللاحم والطبقات التجارية ومربي الطبقات بنسبة 14.62٪ و 29.32٪ و 23.17٪ و 42.86٪ مع الانتشار الكلي 24.78٪ (الشكل 1).

لوحظ أن الانتشار الموسمي لـ MG خلال الدراسة كان 56.34٪ في الشتاء مقارنة بـ 43.66٪ في فصل الصيف (الشكل 2). أظهر التحليل الإحصائي أن الإصابة بالـ MG تسود معنويا (p أقل من 0.05) في جميع أنواع الدجاج المشمولة في الدراسة بأرقام متغيرة. علاوة على ذلك وجد أن الإصابة بالـ MG مرتبطة معنويا (p أقل من 0.05) بالموسم. سجل معدل انتشار الوهن العضلي الوبائي في الدجاج اللاحم أعلى 27.3٪ خلال عمر 14-21 يومًا تليها 18.5٪ و 18٪ و 16.7٪ في الفئات العمرية 29-36 يومًا و 35-43 يومًا و22-28 يومًا ، على التوالى. في أمهات الدجاج اللاحم سجلت نسبة انتشار MG أعلى 37.50٪ خلال عمر 9-13 أسبوعًا تليها 36.4٪ خلال عمر 4-8 أسابيع و 41-60 أسبوعًا و 33.3٪ ، 31.8٪ ، 27.8٪ ، 23.8٪ و 6.3٪ في الفئات العمرية 14-20 أسبوعًا ، وأكثر من 60 أسبوعًا ، و21-30 أسبوعًا ، و31-40 أسبوعًا ، و1-3 أسابيع على التوالي.

في الطبقة التجارية ، سجلت أعلى نسبة انتشار للـ MG 30٪ خلال عمر 4-8 أسابيع تليها 28.6٪ ، 25٪ ، 23.6٪ ، 20٪ و 16.7٪ في الفئات العمرية 14-20 أسبوعًا ، 21-30 أسبوعًا. ، 31-40 أسبوعًا ، 41-60 أسبوعًا و9-13 أسبوعًا على التوالي. كانت نسبة 60٪ أعلى نسبة انتشار للـ MG خلال عمر 4-8 أسابيع ، تليها 57.9٪ ، 50٪ و 25٪ في الفئات العمرية من 41-60 أسبوعًا ، 14-30 أسبوعًا وأكثر من 60 أسابيع على التوالي.

تؤكد الدراسة ارتفاع معدل الانتشار (X2 = 7.81) لعدوى MG في قطاع الدواجن التجارية التي أبلغ عنها أحمد (1998). علاوة على ذلك ، تضمنت الدراسة الحالية المرة الأولى التي تضمنت قطعان الدجاج اللاحم وقطاع الدواجن في الريف / الفناء الخلفي للتحقق من انتشار عدوى MG في باكستان.

تظهر أعلى نسبة انتشار للـ MG في الدجاج اللاحم خلال عمر 14-21 يومًا دون عزلة واحدة خلال الأسبوعين الأولين من العمر. يشير هذا إلى العدوى عبر القوارض الناتجة عن الانتشار المرتفع للغاية لـ MG في قطعان الأمهات. وفي الوقت نفسه ، يمكن أن يكون سبب عدم عزل MG خلال الأسبوعين الأولين من العمر هو تسويق كتاكيت اللاحم بعمر اليوم بوعي مع العلاج السابق بالمضادات الحيوية مما يؤدي إلى قمع عدوى الميكوبلازما مؤقتًا. تعتبر المشكلة المعقدة في شكل CRD مع ارتباط ساحق للإشريكية القولونية مهمة جدًا ومعرضًا معتادًا في دجاج التسمين. يظهر الاتجاه الأخير مع انتشار أقل قليلاً من MG في الدجاج اللاحم التدابير العلاجية المتخذة على مستوى المزرعة بما في ذلك الاستخدام المكثف للمضادات الحيوية ، وفي الوقت نفسه مع حالة الأمن الحيوي السيئة. فيما يتعلق بالأرقام التراكمية لـ MG في أنواع مختلفة من الدجاج ، فإن أقل انتشار كما هو مسجل في دجاج التسمين هو معتمد من قبل Osman et al. (2009) وآخرون.

السبب هو أن دجاج التسمين موجود في الحقل لفترة زمنية قصيرة لجميع فئات الطيور ، وبالتالي فإن مدة التحدي لـ MG بالنسبة للفروج منخفضة جدًا. علاوة على ذلك ، تعد كثافة التخزين متغيرًا وبائيًا مهمًا يؤثر على معدل انتشار MG (McMartin et al. ، 1987) حيث أن قطعان الدجاج اللاحم في العراء.

الجدول 1: التحديد المبدئي لـ Mycoplasma gallisepticum المستعاد من أنسجة مختلفة

نوع العينات مجموع العينات ### تخمر الجلوكوز ### إنتاج الفوسفاتاز ### تقليل التيرازوليوم ### بقعة الفيلم Assey

الشكل 1: الانتشار التراكمي لعدوى Mycoplasma gallisepticum في أنواع مختلفة من الطيور. (قيمة Chi- المربع لـ X2 = 7.81 عند 5٪)

الشكل 2: الانتشار الموسمي للفطر Mycoplasma gallisepticum بما في ذلك جميع أنواع الطيور ذات قيمة Chi-Square X2 = 3.84 في ظروف بيئية 5٪ يتم تربيتها في كثافة طيور منخفضة مقارنة بالقطعان البياضة.

معدل الانتشار التراكمي لـ MG في الطبقة التجارية (23.17٪) كما هو مسجل في 145 قطيعًا أثناء الدراسة يختلف تمامًا عن النتائج التي توصل إليها مختار وآخرون. (2012) (8.64٪) تم تسجيلها في 18 طبقة فقط من مسح القطعان ، بينما الغرايبة والروسان (2008) وفيبيروي وآخرون. (2005) على التوالي تبلغ 31.6٪ و 33٪ من انتشار MG في قطعان الطبقة. حتى معدل الانتشار الأعلى (62.96٪) هو

اللوحة 1: صورة حرارية توضح اكتشاف MG مع منتج 732 bps من خلال تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

حارة 2 و 3 و 4 و 6 تظهر عينات إيجابية

المسار 8: إظهار التحكم + iv MG Lane 5 و 7: التحكم السلبي الذي أبلغ عنه Heleili et al. (2011). ولكن في جميع هذه المراجع ، تم تضمين عدد أقل نسبيًا من الطيور في الدراسات. يمكن أن تلعب بعض العوامل الأخرى مثل الحالة الصحية السريرية المتعلقة بعدوى MG للقطيع جنبًا إلى جنب مع أخذ العينات دورًا مع نتائج متغيرة. يعكس الانتشار الحكيم للـ MG في أمهات الدجاج اللاحم وطيور البياض تحديات حقلية عالية مع زيادة وقت التعرض وتدابير الأمن الحيوي الضعيفة على مستوى المزرعة. عمومًا ، تشير أعلى نسبة انتشار في عمر 4-20 أسبوعًا إلى بعض العوامل المثبطة للمناعة المتزامنة عندما تكون الطيور أكثر عرضة للإصابة بمرض Gumboro جنبًا إلى جنب مع دور بعض مستويات السموم الفطرية في العلف. الكوكسيديا مرض آخر مثبط للمناعة ينتشر بشكل شائع خاصة خلال تلك الفترة العمرية. إن بدء وضع العمر (18-20 أسبوعًا) بحد ذاته هو عامل مؤثر آخر يهيئ الطيور للتحدي الميداني لعدوى MG.

حتى خطر الإصابة بعدوى عبر الرحم لا يمكن تجاهله. عثمان وآخرون (2009) يؤكد الانتشار العام لـ MG في لوحة دجاج التسمين 2: البولي أكريلاميد الكهربائي للهلام الذي يشير إلى L1 كعلامات للوزن الجزيئي. تظهر العينات L2 و L3 و L4 و L5 و L6 منتج نطاق SDS-PAGE النموذجي يبلغ 74 كيلو دالتون مما يشير إلى عزلات مسببة للأمراض تمتلك أشرطة لاصقة أو هيماجلوتينين. وجدت العينات L7 و L8 سلبية للأشرطة اللاصقة كونها عزلات غير مسببة للأمراض من مربي Mycoplasma gallisepticum والطبقة التجارية كما تم تسجيلها أثناء الدراسة. ومع ذلك ، فإن الإجراءات العلاجية في كل من قطعان الدجاج اللاحم والدجاج البياض قد تساهم في خفض معدل الانتشار. علاوة على ذلك ، فإن الدور الحالي للقاحات MG خاصة في قطعان التربية يبدو مشكوكًا فيه ويستدعي مزيدًا من التحقيق للتأكد من دورها في السيطرة على مشكلة MG.

من المثير للدهشة أن الدواجن الريفية أظهرت أعلى معدل لانتشار MG في قطاع الدواجن في باكستان ، ولا شك أن عددًا أقل من مخزون الدواجن الريفية تم تضمينه في المراقبة كما هو مطلوب في الدراسة. ومع ذلك ، فإن حالة MG الحالية في أنواع مختلفة من الطيور تعكس أن كل من مخزون الدواجن التجارية والريفية يخدم بشكل متبادل كمصدر للترام في MG. علاوة على ذلك ، فإن القطيع متعدد الطبقات والقطيع المتكاثر الذي يتم الاحتفاظ به على اتصال وثيق يمكن أن يكون السبب الرئيسي لاستمرار عدوى MG. تقارير هوفمان وآخرون. (1997) و Jaganathan (2006) يتماشيان تمامًا مع الانتشار المسجل لهذه الدراسة. قد يعكس عدم وجود تدابير للسيطرة على المرض في قطاع الدواجن الريفية وخاصة ضد MG مثل هذا الانتشار الكبير للمشكلة في القطاع الريفي.

بشكل عام ، لوحظ انتشار MG أعلى في الطيور الأصغر مقارنة بالطيور الأكبر سنًا. العديد من العمال مثل حسين وآخرون. (2010) ومختار وآخرون. (2012) يؤيد هذه النتيجة. من المحتمل أن يكون الانتقال الرأسي (Ortiz et al. ، 1995) وبالتالي التدابير العلاجية والتحكمية على مستوى المزرعة هو السبب في هذا الاختلاف المرتبط بالعمر في الانتشار. علاوة على ذلك ، فإن العدد الأصغر من القطعان التي يبلغ عمرها 60 عامًا أو أكثر ذات القوة الرفيعة للغاية الخارجة في الحقل تفسر هذه الظاهرة بشكل أكبر.

أشارت الدراسة الحالية أيضًا إلى أن الإصابة بالـ MG سادت إلى مستوى أعلى بكثير (X2 = 3.84) في الشتاء مقارنة بالصيف في جميع أنواع الطيور. قد تساهم الضغوط الموسمية مثل درجة الحرارة البيئية المنخفضة للغاية وبالتالي ضعف تدابير التحكم في درجة الحرارة (Shikra et al. ، 2005 Hossain et al. ، 2010 Heleili et al. ، 2011) وغيرها من الممارسات الإدارية الضعيفة في هذا الاختلاف الموسمي (Ahmad، 1998 Mukhtar et آل ، 2012).

أدى التطبيق الواسع النطاق للتقنيات الجزيئية المتقدمة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في تشخيص مسببات أمراض الطيور إلى تطوير مجموعات تجارية تعتمد على الحمض النووي وفي الوقت نفسه زيادة تكلفة التشخيص. تم تأسيس موثوقية PCR في جميع أنحاء العالم. أثناء الدراسة ، أثبت تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أنه محدد وحساس وموثوق حقًا لأن الدراسات المختلفة تؤيد هذه النتائج مقارنة بطرق العزل وتحديد الهوية التقليدية ربما بسبب الاستخدام المفرط للمضادات الحيوية في القطعان التجارية مما تسبب في قمع مؤقت يؤدي إلى فشل عزل MG (Jaganathan ، 2006 ).

تمت الإشارة إلى الكشف الجزيئي عن الأنواع المسببة للأمراض من MG من خلال SDS-PAGE من خلال وجود نطاقات محددة من البروتين الدهني 74 كيلو دالتون في 71.43٪ من العزلات ، وهي خاصية مهمة لسلالة MG F (Jaganathan ، 2006). وقد وُصِفت هذه على أنها التصاقات سائدة مناعية أو هيماجلوتينين واعتبرت عوامل خبيثة مهمة وقد تلعب المستضدات التي تحمل خواص الالتصاق الخلوي دورًا رئيسيًا في التسبب في الكائن الحي الغازي عن طريق الارتباط بمواقع المستقبل على الخلايا الظهارية المضيفة من خلال بقايا حمض السياليك مما يؤدي إلى الاستعمار والعدوى. وبالتالي بدء الاستجابة المناعية (Avakian and Ley ، 1993). تتميز بروتينات الغشاء والبروتينات الدهنية بما في ذلك PvpA و pMGA وثلاثة أخرى بأنها أشكال متغيرة للطور تحدث بتردد عالٍ وتمنح تباينًا مستضديًا وإمراضية متفاوتة لـ MG (Boguslavsky et al. ، 2000 Papazisi et al. ، 2003).

قد تضيف الطبيعة الغازية للخلايا المضيفة المكتشفة حديثًا لـ MG إلى تعقيد قدرة مسببات المرض على التسبب في المرض (Citti et al. ، 2005 Gunther et al. ، 2008). قد يؤدي التفاعل المشترك لهذه العوامل إلى ظهور شكل مزمن من المرض (Benicina ، 2002).

ومن المتوقع كذلك أن العزلات الأخرى الأقل مسببة للأمراض أو التي قد تكون غير مسببة للأمراض من MG (28.57٪) كما تم اكتشافها أثناء الدراسة قد تلعب دورها في إعاقة النتائج الصحيحة لاختبارات تراص لوحة المصل (Jaganathan ، 2006).

ومع ذلك ، قد يصلون إلى نفس الطبيعة المسببة للمرض بالاشتراك مع الكائنات المسببة للأمراض الأخرى مثل الإشريكية القولونية وفيروس التهاب الشعب الهوائية المعدية وفيروس مرض نيوكاسل مما يؤدي إلى ظهور مرض الجهاز التنفسي المزمن (CRD). لذلك هناك حاجة لفرز تلك العزلات في التأكد من مدى دورها في العملية المسببة للمرض وما يترتب على ذلك من خسائر مع تفاعلها تجاه مصل تراص الصفائح ضد المستضد القياسي.

في الختام ، تم العثور على انتشار مرتفع لعدوى MG في جميع أنواع الطيور في قطاع الدواجن في باكستان. PCR هي أداة تشخيصية فعالة لـ MG ، والتي يمكن استخدامها لمراقبة هذا المرض. تتطلب النتائج أيضًا صياغة سياسة وطنية لرصد الإدارة البيئية خاصة في أعقاب التوصيات المرتقبة لمنظمة التجارة العالمية.

أحمد ، أ. ، 1998. تشخيص ومقاومة عدوى الميكوبلازما جاليسبتيكوم في الدواجن. التقرير الفني النهائي. معهد بحوث الدواجن روالبندي باكستان

Aloutta ، B.B. ، R.G. ويتلر ، ك. ويليامز وجي إي فابر ، 1970. التقنيات البكتريولوجية الموحدة لتوصيف أنواع الميكوبلازما. كثافة العمليات J. Syst. باكتريو ، 20: 35-58

Avakian، A.P. and D.H. Ley، 1993. تثبيط نمو Mycoplasma gallisepticum وربط حلقات القصبة الهوائية بالأجسام المضادة لبروتين غشاء يحتوي على 64 كيلودالتون من Mycoplasma gallisepticum. ديس أفيان ، 37: 706-714

Benicina، D.، 2002. Haemagglutinins لميكوبلازما الطيور المسببة للأمراض. أفيان باثول ، 31: 535-547

Boguslavsky، S.، D. Menaker، I. Lysnyansky، T. Liu، S. Levisohn، R. Rosengarten، M. Garcia and D. Yogev، 2000. . تصيب. Immu. ، 68: 3956-3964

Bradford، M.M.، 1976. طريقة سريعة وحساسة لتقدير كميات ميكروغرام من البروتين باستخدام مبدأ ربط صبغة البروتين. شرجي. Biochem. ، 72: 248-254

سيتى ، سي ، ج. Browning and R. Rosengarten ، 2005. التنوع المظهري وغزو الخلية في تخريب العائل بواسطة الميكوبلازما المسببة للأمراض. في: الميكوبلازما: التسبب في الأمراض ، والبيولوجيا الجزيئية ، والاستراتيجيات الناشئة للتحكم ، ص: 439-483. بلانشارد ، أ. براوننج ، محرران. Horizon Bioscience ، Wymondham ، نورفولك ، المملكة المتحدة

Coughlan ، M.P. ، 1988. تقنيات التلوين لاكتشاف المكونات الفردية لنظام الإنزيم الخلوي. في طرق الإنزيم ، 160: 135-144

Dvorakova، H.، L. Valicek and M. Reighelova، 2005. الكشف عن تلوث الميكوبلازما في مزرعة الخلايا والأمصال البقري. دكتور بيطري. ميد. التشيكية ، 6: 262-268

إدوارد ، دي جي إف. و دبليو بي. مور ، 1975. طريقة لتحديد استخدام الغلوكوز بواسطة الميكوبلازما. جيه ميد. ميكروب ، 8: 451-454

إيفانز ، ج.د. ، س.لي ، س. برانتون ، S.D. كولير ، جي تي. فار وس.م.د. بيرسون ، 2005. Mycoplasma gallisepticum: الوسائل الحالية والمتطورة للسيطرة على مسببات الأمراض في الطيور. J. أبل. قطف. الدقة ، 14: 757-763

فيبيروي ، أ. ، د. مكيس ، ج. الذكاء ، على سبيل المثال. Hartman and A. Pijpers ، 2005. مقارنة بين الزرع ، PCR واختبارات مصلية مختلفة للكشف عن Mycoplasma gallisepticum و Mycoplasma synoviae. تصيب. Avian Dis. ، 49: 260-268

فراي ، إم إل ، آر بي هانسون ، دي. أندرسون ، 1968. وسيلة لعزل ميكوبلازما الطيور. عامر. J. البيطري. الدقة ، 29: 2163-2171

غرايبة ، س.م. الرسان ، 2008. استخدام التقنيات الجزيئية في عزل وتوصيف Mycoplasma gallisepticum من الدجاج التجاري في الأردن. كثافة العمليات J. بولت. علوم ، 7: 28-35

جليسون ، جيه آر ، إس إتش. Kleven، 1984. لقاح Mycoplasma gallisepticum: التأثيرات على انتقال البيض وإنتاج البيض. ديس الطيور ، 28: 406-415

جلسون جيه آر وإس. Kleven ، 1985. التطعيم Mycoplasma gallisepticum: مزيد من الدراسات حول انتقال البيض وإنتاج البيض. ديس الطيور ، 29: 408-415

غونتر ، ف ، أ.بلاكنر ، س زاثماري ، إل ستيبكوفيتس ، ر. روزنغارتن ، إم بي. Zostak ، 2008. Mycoplasma gallisepticum تغزو خلايا الدم الحمراء في الدجاج أثناء العدوى. تصيب. إيمون ، 76: 71-77

Heleili، N.، B.I. Mamache و A. Chelihi ، 2011. انتشار الميكوبلازما الطيور في منطقة باتا ، شرق الجزائر. دكتور بيطري. العالم ، 4: 101-105

هوفمان ، R.W. ، M.P. Luttrel، W.R. Davidson and D.H. Ley، 1997. Mycoplasmas في الديوك الرومية البرية التي تعيش مع الطيور الداجنة. J. Wildl. ديس ، 33: 525-535

حسين ، K.M.M. ، A. Godoy ، L.F. Andrade ، O. Colmenares ، M.Y. لي وم. حق ، 2007. الانتشار المصلي لعدوى الميكوبلازما غاليسبتيكوم في الدجاج في منطقة راجشاهي الكبرى في بنغلاديش. بانجل. الدقة. عمل. J. البيطري. متوسط ​​، 5: 9-14

حسين ، K.M.M. ، M.D.I. حسين وإي. ياماتو ، 2010. الانتشار المصلي لعدوى السالمونيلا والميكوبلازما غاليسيبتيكوم في الدجاج في راجشاهي والمناطق المحيطة في بنغلاديش. كثافة العمليات جي بيول ، 2: 74-80

Jaganathan، M.، 2006. انتشار الميكوبلازما gallisepticum في الدجاج المنزلي والطيور الطائرة الحرة والتوصيف الجزيئي للعزلات. أطروحة MVS ، جامعة بوترا ماليزيا

كليفن ، S.H. ، 1998. الميكوبلازما في مسببات مرض الجهاز التنفسي متعدد العوامل. علوم بولت ، 77: 1146-1149

كريج ، ن. و ج. هولت ، 1984. دليل بيرجي لعلم الجراثيم الجهازية ، الطبعة التاسعة ، المجلد. 1 ، ص: 74-793. وليامز وويلكينز ، لندن

Laemmli ، 1970. انقسام البروتين الهيكلي أثناء تجميع رأس العاثية T4. الطبيعة ، 70: 227-680

لين ، م. و S.H. كليفن ، 1982. انتقال بيض سلالتين من Mycoplsama gallisepticum في الدجاج. ديس الطيور ، 26: 487-495

McMartin، D.A.، M.I. خان ، ت. فارفير وج. كريستي ، 1987. تحديد الانتشار الجانبي لعدوى الميكوبلازما غاليسبتيكوم في الدجاج. Avian Dis.، 31: 814-819

مختار ، م. عويس ، م. Anwar، Z. Hussain، N. Bhatti and S. Ali، 2012. الانتشار المصلي للميكوبلازما gallisepticum بين الطبقات التجارية في فيصل أباد ، باكستان. J. الأساسية. تطبيق علوم ، 8: 183-186

Mustafa، R.، J. Qi، X. Ba، Y. Chen، C. Hu، X. Liu، L. Tu، Q. Peng، H.Chen and A. Guo، 2013. In vitro quinolones susceptivity analysis of Chinese يعزل Mycoplasma bovis وسيناريوهات النشوء والتطور الخاصة بهم بناءً على QRDRs من DNA topoisomerases التي تكشف عن انتقال فريد في ParC. باك. دكتور بيطري. J.، 33: 364-369

المنظمة العالمية لصحة الحيوان ، 2004. دليل الاختبارات التشخيصية واللقاحات للحيوانات الأرضية. داء المفطورات الطيور (Mycoplasma gallisepticum) الجزء الثاني ، ثانية. 2.7: الفصل 2.7.3

Ortiz ، A. ، R. Froyman and S.H. كليفن ، 1995. تقييم مادة إنروفلوكساسين ضد انتقال الميكوبلازما غاليسبتيكوم في البيض. Avian Dis. ، 39: 830-836

عثمان ، K.M. ، Z.M. علي م. أمين و ب. حسن ، 2009. Mycoplasma gallisepticum: تحدٍ ناشئ لصناعة الدواجن في مصر. القس علوم. التقنية ، 28: 1015-1023

بابازيسي ، ل. ، ت. جورتون ، ج.كوتيش ، ب. ماركهام ، ج. براوننج ، دي كيه نغوين ، إس. شوارتزل ، إيه مادان ، جي ماهايراس وس. جيرى ، 2003. تسلسل الجينوم الكامل لممرض الطيور Mycoplasma gallisepticum strain Rlow. علم الأحياء الدقيقة ، 149: 2307-2316

رازين ، إس ، د. يوجيف وي. ناوت ، 1998. البيولوجيا الجزيئية وإمراضية الميكوبلازما. مجهري. مول. بيول. القس ، 62: 1094-1156

شكرة ، S.K. ، M.B. الرحمن ، محمد هامان ، K.M.R. أمين ، M.F.R. خان وم. Rahman ، 2005. الانتشار المصلي لعدوى Mycoplasma gallisepticum في الدجاج في مزارع دواجن الأمهات النموذجية في بنغلاديش. كثافة العمليات J. بولت. علوم ، 4: 32-35

صديق ، A.B. ، S.U. رحمن ، حسن حسين وج. محمد ، 2012 ، التوزيع التكراري لمسببات أمراض الطيور الانتهازية في حالات الضائقة التنفسية لدى الدواجن. باك. دكتور بيطري. ج. ، 32: 386-389

Thomas، L. and FJ Barber، 1971. التعرف على الميكوبلازماتال: إجراءات التوصيف. تطبيق مايكرو ، 21: 600-605

وانغ ، هـ. ، أ. فضل وم. خان ، 1997. Multiplex PCR من أجل الميكوبلازما المسببة للأمراض للطيور. مول. مجسات الخلية ، 11: 211-216

تشانغ ، X. ، Y.F. تشو ، بي تشاو ، بي سي. Gao و Y. He و N. Wang و Z.X. لو ، 2013. توصيف عامل الاستطالة Tu للمفطورة البيضوي الرئوية. باك. دكتور بيطري. ج. ، 33: 515-519

1 قسم علوم الدواجن ، كلية العلوم البيطرية والحيوانية ، بير مهر علي شاه ، جامعة الزراعة الجافة ، روالبندي ، باكستان

2 معهد الأحياء الدقيقة ، جامعة الزراعة ، فيصل أباد -38040 ، باكستان


الارتباط بالجليكوزيل لزيوت التشحيم الزليلي البشري: الآثار المترتبة على دوره في الالتهاب

روبي بي إستريلا ، جون م. وايتلوك ، نيكول إتش باكر ، نيكلاس جي كارلسون الارتباط بالجليكوزيل من مادة التشحيم الزليلي البشري: الآثار المترتبة على دوره في الالتهاب. بيوكيم ي 15 يوليو 2010 429 (2): 359-367. دوى: https://doi.org/10.1042/BJ20100360

تم عزل البروتينات الحمضية من السائل الزليلي من اثنين من هشاشة العظام واثنين من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي وتم التعرف عليها بواسطة مرض التصلب العصبي المتعدد. وقد وجد أن البروتين الأكثر وفرة في جميع العينات هو بروتين التشحيم الذي يشبه الميوسين. أظهر التوصيف الإضافي للزيوت من المرضى المختلفين بواسطة LC (كروماتوغرافيا السائل) –MS للسكريات قليلة السكاريد التي تم إطلاقها أن السكريات قليلة الشحوم المرتبطة بالأكسجين NeuAcα2–3Galβ1–3GalNAc و NeuAcα2–3Galβ1–3 (NeuAcα2–6) GalNAc كانت هي المهيمنة. زيوت التشحيم. تم العثور على هذا الأخير ليكون أكثر انتشارًا في عينات التهاب المفاصل الروماتويدي ، مما يشير إلى أن السيالة يتم تنظيمها كجزء من الاستجابة الالتهابية. بالإضافة إلى هذه الهياكل المهيمنة ، تم العثور أيضًا على هياكل أساسية 2 بكميات منخفضة ، حيث كان أكبرها هو السكاريد السداسي المائي المطابق للتسلسل NeuAcα2–3Galβ1–3 (NeuAcα2–3Galβ1–3 / 4GlcNAcβ1–6) GalNAc. وقد وجد أيضًا أن نسبة صغيرة من السكريات قليلة النواة 2 تحمل كبريتات. إن قدرة مادة التشحيم على تقديم الارتباط بالجليكوزيل المعقد الذي يعكس حالة أنسجة المفصل تجعل مادة التشحيم مرشحة كحامل لقمم التهابات قليلة السكاريد الالتهابية. على وجه الخصوص ، تبين أن مادة التشحيم من الأنسجة الملتهبة قد تم التعرف عليها من قبل الجسم المضاد MECA-79 وبالتالي حمل الحاتمة الكبريتية المقترحة لتكون جزءًا من L-selectin ligand المسؤولة عن تجنيد الكريات البيض في المواقع الالتهابية.


شاهد الفيديو: SDS-PAGE, Sodium Dodecyl SulfatePolyAcrylamide Gel ElectrophoresisAnimation (كانون الثاني 2022).