معلومة

ما هو الفرق بين deoxyribonucleases والإنزيمات المقيدة؟


كل من ديوكسي ريبونوكلياز (DNases) والإنزيمات المقيدة هي نوكليازات داخلية (بعض DNases يمكن أن تكون نوكليازات خارجية).

كلاهما يكسر الروابط بين النيوكليوتيدات. إذن ما هو الفرق بين الاثنين؟

كان تفكيري الأصلي هو أن الإنزيمات المقيدة ، على عكس DNases ، تقطع تسلسلات معينة من الحمض النووي. ثم يثير هذا السؤال عما إذا كانت إنزيمات التقييد هي مجرد فئة من DNases ، لكنني لم أجد أي مصادر تدعم ذلك. أيضًا ، وفقًا لمقال Wikipedia هذا:

يوجد أكثر من 900 إنزيم مقيد ، بعضها محدد بالتسلسل والبعض الآخر ليس ...

يؤدي هذا إلى تآكل التمييز الذي أوجدته بين نوعي نوكلياز.


هذه الفقرة من Lehninger's مبادئ الكيمياء الحيوية (في رأيي أفضل كتاب مدرسي عن الكيمياء الحيوية) تعليمي للغاية:

يتحلل الحمض النووي بواسطة نوكليازات

لشرح إنزيمات تكرار الحمض النووي ، نقدم أولاً الإنزيمات التي تحلل الحمض النووي بدلاً من تصنيعه. تُعرف هذه الإنزيمات باسم نوكليازات، أو DNases إذا كانت خاصة بالحمض النووي بدلاً من الحمض النووي الريبي. تحتوي كل خلية على عدة نوكليازات مختلفة ، تنتمي إلى فئتين عريضتين: نوكليازات خارجية ونوكليازات داخلية. نوكليازات خارجية تحلل الأحماض النووية من أحد طرفي الجزيء. يعمل العديد منها في الاتجاه 5 '→ 3' أو 3 '→ 5' فقط ، مما يزيل النيوكليوتيدات فقط من الطرف 5 'أو 3' ، على التوالي ، من خيط واحد من حمض نووي مزدوج تقطعت به السبل أو من DNA أحادي الجديلة . نوكلياز يمكن أن تبدأ في التحلل في مواقع داخلية محددة في حبلا أو جزيء الحمض النووي ، مما يقلل من حجمها إلى أجزاء أصغر وأصغر. عدد قليل من نوكليازات ونوكليازات داخلية تحلل الحمض النووي أحادي الجديلة فقط. هناك عدد قليل من الفئات المهمة من نوكليازات داخلية تنقسم فقط في متواليات نيوكليوتيد محددة (مثل نوكليازات تقييد التي تعتبر مهمة جدًا في التكنولوجيا الحيوية ؛ انظر الفصل 9 ، الشكل 9-3).

يمكننا أن نستنتج أن نوكليازات التقييد (أو إنزيمات التقييد) هي نوع من نوكلياز داخلية ، وأن نوكليازات داخلية هي نوع من DNAse. لذا ، فإن جميع إنزيمات التقييد هي عبارة عن DNAs ، ولكن ليست كل DNAs هي إنزيمات تقييدية.

إلى جانب ذلك ، يمكننا أن نستنتج أن بيانك الأولي ("كل من deoxyribonucleases (DNases) والإنزيمات المقيدة هي نوكليازات داخلية") خطأ.

للحصول على جدول أكثر اكتمالا ، ألق نظرة على البيولوجيا الجزيئية للنوكليازات، الصفحة 18.

مصادر:

  • لينينجر ، أ ، نيلسون ، د. وكوكس ، م. (2000). مبادئ الكيمياء الحيوية. نيويورك: وورث للنشر.
  • ميشرا ، ن. (1995). البيولوجيا الجزيئية للنوكليازات. بوكا راتون [u.a.]: مطبعة CRC.

بنية الحمض النووي وخصائص الحمض النووي

23.6 تدهور الحمض النووي

نوكلياز

مجموعة متنوعة من الإنزيمات تكسر روابط الفوسفوديستر في الأحماض النووية ديوكسي ريبونوكلياز (DNases) تشق الحمض النووي و الريبونوكليازات (RNases) تشق الحمض النووي الريبي. عادة ما تكون DNases محددة للحمض النووي أحادي أو مزدوج السلسلة على الرغم من أن بعض DNases يمكن أن تشق كلاهما. يمكن أن تكون DNases بمثابة إكسونوcleases التي يزيلون فيها نوكليوتيد واحد في كل مرة من نهاية الشريط 3 & # x27 أو 5 & # x27. تعمل DNases الأخرى كـ نوكلياز وهي محددة للانشقاق بين أزواج معينة من القواعد.

أنزيمات التقييد

فئة مهمة من نوكليازات الحمض النووي هي تقييد الانزيمات (نوكليازات تقييدية) تتعرف على تسلسلات معينة من القواعد في الحمض النووي (موقع تقييد) وتقوم بعمل قطعتين ، واحدة في كل خيط تولد شظايا من الحمض النووي المزدوج الشريطة. تستخدم الكائنات الحية الدقيقة إنزيمات التقييد الخاصة بها لتحطيم أي DNA غريب قد يدخل الخلية في شكل فيروسات أو بلازميدات أو DNA عاري. تم عزل مئات من إنزيمات التقييد المختلفة من الكائنات الحية الدقيقة ، حيث تتعرف هذه الإنزيمات بشكل عام على متواليات من أربعة أو ستة أو ثمانية أو نادرًا أكثر من القواعد التي لها محور تناظر (الجدول 23-1). يتم استدعاء مواقع التقييد التي لها محور تناظر متناظرة ، مما يعني أنه يمكن تدوير موقع التقييد 180 درجة وسيظل تسلسل القواعد كما هو.

الجدول 23-1. بعض نوكليازات المقيدة ومواقع انشقاقها *

يمكن للأنزيمات المقيدة أن تقطع الحمض النووي بأي من الطريقتين. يمكن شق كل خيط على طول محور التناظر ، مما ينتج عنه أجزاء من الحمض النووي مزدوج الشريطة التي لها نهايات غير حادة (متدفقة). تولد التخفيضات المتناظرة المتداخلة حول محور التناظر شظايا من الحمض النووي مزدوج الشريطة التي لها نهايات متماسكة أحادية الجديلة (الشكل 23-11). شظايا الحمض النووي ذات النهايات المتماسكة مفيدة لبناء جزيئات DNA جديدة ، وهذا هو الهدف الحمض النووي المؤتلف (rDNA) تقنية.

الشكل 23-11. نوعان من التخفيضات بواسطة إنزيمات التقييد. تشير الأسهم إلى مواقع الانقسام. الخط المتقطع هو محور تناظر التسلسل.

نظرًا لأن إنزيم التقييد يتعرف على تسلسل فريد ، فإن عدد القطع وعدد شظايا الحمض النووي يعتمد على حجم الجزيء. بشكل عام ، ستحدث مواقع التقييد المكونة من أربع قواعد بشكل متكرر عن طريق الصدفة أكثر من المواقع المكونة من ست أو ثماني قواعد. وبالتالي ، فإن القواطع الأربعة ستنتج شظايا أكثر من ستة قواطع والتي بدورها ستولد شظايا أكثر من ثمانية قواطع.

يولد إنزيم تقييد معين عائلة فريدة من الشظايا لجزيء DNA معين.

يوضح الشكل 23-12 أ مواقع مواقع التقييد في DNA lambda (λ) لعاثيات البكتيريا لأنزيمات التقييد EcoRI و BamHI. يُعرف هذا الترتيب لمواقع التقييد باسم أ خريطة التقييد. يتم الكشف عن عائلة الشظايا الناتجة عن واحد أو أكثر من إنزيمات التقييد بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز الذي يفصل جزيئات الحمض النووي وفقًا لأوزانها الجزيئية (الشكل 23-12 ب).

الشكل 23-12. (أ) خرائط تقييد λ DNA لـ EcoRI و BamHI نوكليازات. تشير القضبان العمودية إلى مواقع القطع. تشير الأرقام العلوية إلى النسبة المئوية للطول الإجمالي للحمض النووي المقاس من الجين أ نهاية الجزيء. الأرقام السفلية هي أطوال كل جزء ، معبرًا عنها مرة أخرى كنسبة مئوية من الطول الإجمالي. (ب) الرسم الكهربائي للهلام لهضم إنزيم التقييد EcoRI و BamHI لـ λ DNA. تحتوي العصابات التي تحمل علامة "نهايات متماسكة" على جزيئات تتكون من جزأين طرفيتين ، متصلتين بنهايات متماسكة طبيعية لـ DNA. تشير الأرقام إلى الأجزاء بالترتيب من الأكبر 1 إلى الأصغر 6. لم يتم حل النطاقين 5 و 6 من ملخص BamHI.


إنزيمات التقييد: الأنواع & # 038 أمثلة

من أهم خطوات علم الأحياء الجزيئي ، وخاصة علم الوراثة الجزيئية والتحليل ، عزل الحمض النووي عن الجينوم البشري وعمل نسخ عديدة منه. الآن ، يمكن استخدام هذه النسخ لمزيد من التحليل من أي نوع.

كان أحد الأحداث الرئيسية في تطوير منهجية علم الوراثة الجزيئي هو اكتشاف إنزيمات التقييد ، والمعروفة أيضًا باسم نوكليازات تقييدية.

مقدمة

أ انزيم التقييد هو نوع من إنزيم نوكلياز القادر على شق الحمض النووي مزدوج الشريطة. قد تشق الإنزيمات الحمض النووي في تسلسلات عشوائية أو محددة يشار إليها باسم مواقع التقييد. تعتبر مواقع التعرف متجانسة في الأصل ، أي أنها التسلسلات التي تُقرأ بنفس الطريقة للأمام وللخلف.

يتم إنتاج إنزيمات التقييد بشكل طبيعي بواسطة البكتيريا. تستخدمه الأنواع البكتيرية كشكل من أشكال آلية الدفاع ضد الفيروسات. ومع ذلك ، في البكتيريا ، توجد إنزيمات تقييدية كجزء من نظام مشترك يسمى نظام تعديل التقييد. تعدل الأنواع البكتيرية الحمض النووي الخاص بها بمساعدة الإنزيمات التي تقوم بميثيلها. هذه العملية الخاصة لميثلة الحمض النووي البكتيري تحميها من الانقسام من نوكليازات التقييد الخاصة بها.

أنواع

يوجد نوعان مختلفان من إنزيمات التقييد:

  1. نوكليازات خارجية: نوكليازات التقييد هي المسؤولة بشكل أساسي عن التحلل المائي للنيوكليوتيدات الطرفية من نهاية جزيء الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي إما من 5 "إلى 3" أو اتجاه 3 "إلى 5" على سبيل المثال- نوكلياز خارجي I ، نوكلياز خارجي II ، إلخ.
  2. نوكلياز: تتعرف نوكليازات التقييد على تسلسلات أساسية معينة (مواقع التقييد) داخل جزيء الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي وتحفز انقسام رابطة الفوسفودايستر الداخلية لـ exEcoRI و Hind III و BamHI ، إلخ.

تاريخ

كان أول إنزيم تقييد تم اكتشافه هو Hind II في عام 1970. وفي عام 1978 ، مُنح دانيال ناثانز و Werner Arber و Hamilton O. Smith جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب.

تسمية إنزيم التقييد

يتكون اسم إنزيمات التقييد من ثلاثة أجزاء:

  1. اختصار للجنس وأنواع الكائن الحي إلى 3 أحرف ، على سبيل المثال- Eco لـ Escherichia coli المحدد بالحرف الأول ، E ، للجنس والحرفين الأولين ، co ، من الأنواع.
  2. يتبعه حرف أو رقم أو مزيج من كلاهما للدلالة على سلالة النوع.
  3. رقم روماني للإشارة إلى الترتيب الذي تم فيه العثور على أنظمة تعديل التقييد المختلفة في نفس الكائن الحي أو السلالة في حد ذاتها.

تصنيف نوكليازات تقييدية

بناءً على أنواع التسلسلات التي تم تحديدها ، وطبيعة القطع التي تم إجراؤها في الحمض النووي ، وهيكل الإنزيم ، هناك ثلاث فئات:

  1. النوع الأول من إنزيمات التقييد ،
  2. إنزيمات تقييد النوع الثاني ، و
  3. إنزيمات تقييد النوع الثالث.

أ. النوع الأول من إنزيمات التقييد

  • تمتلك إنزيمات التقييد من النوع الأول كلاً من أنشطة التقييد والتعديل. في هذه الحالة ، سيعتمد التقييد على حالة المثيلة لتسلسل الحمض النووي المستهدف.
  • يحدث الانقسام ما يقرب من 1000 زوج أساسي بعيدًا عن موقع التقييد.
  • هيكل موقع التعرف غير متماثل. تتكون من جزئين. يتكون أحد أجزاء موقع التعرف من 3-4 نيوكليوتيدات بينما يحتوي الجزء الآخر على 4-5 نيوكليوتيدات. يتم فصل الجزأين بواسطة فاصل غير محدد من حوالي 6-8 نيوكليوتيدات.
  • من أجل وظيفتها ، تتطلب إنزيمات التقييد من النوع الأول S- adenosylmethionine (SAM) و ATP و Mg 2+
  • وهي تتألف من 3 وحدات فرعية ، ووحدة فرعية خاصة تحدد موقع التعرف ، ووحدة فرعية للتقييد ، ووحدة فرعية للتعديل.

ب. النوع الثاني من إنزيمات التقييد

  • يتوسط إنزيمان منفصلان في التقييد والتعديل. من الآن فصاعدًا ، يمكن شق الحمض النووي في حالة عدم وجود إنزيمات معدلة. على الرغم من أن التسلسل المستهدف المحدد بواسطة الإنزيمين هو نفسه ، إلا أنه يمكن تنقيتهما بشكل منفصل عن بعضهما البعض.
  • النيوكليوتيدات مشقوقة في موقع التقييد فقط. تسلسل التعرف متماثل دورانيًا ، يسمى التسلسل المتناوب. يمكن أن يكون الموقع المتناوب المحدد إما مستمرًا (على سبيل المثال ، يحدد KpnI التسلسل 5´-GGTACC-3´) أو غير مستمر (على سبيل المثال ، يتعرف BstEII على التسلسل 5´-GGTNACC-3´ ، حيث يمكن أن يكون N أي نوكليوتيد)
  • هذه تتطلب Mg 2+ كعامل مساعد ولكن ليس ATP.
  • وهي مطلوبة في رسم الخرائط الجينية وإعادة بناء الحمض النووي في المختبر فقط لأنها تحدد مواقع معينة وتنقسم في تلك المواقع فقط.

كيف هؤلاء يعملون:

  • تقوم إنزيمات التقييد من النوع الثاني أولاً بإنشاء اتصال غير محدد مع الحمض النووي وترتبط بها في شكل مخفتات.
  • ثم يتم الكشف عن التسلسل المستهدف من خلال توليفة من عمليتين. إما أن ينتشر الإنزيم خطيًا / ينزلق على طول تسلسل الحمض النووي على مسافات قصيرة أو قفزات / يقفز على مسافات طويلة.
  • بمجرد تحديد التسلسل المستهدف ، تحدث تغييرات توافقية مختلفة في الإنزيم وكذلك الحمض النووي. هذه التغييرات التوافقية ، بدورها ، تنشط المركز التحفيزي.
  • يتم تحلل رابطة الفوسفوديستر ، ويتم تحرير المنتج.

تراكيب أشكال BamHI الحرة وغير النوعية والمحددة المرتبطة بالحمض النووي

C. النوع الثالث من إنزيم التقييد

  • تتعرف إنزيمات النوع الثالث على تسلسل الحمض النووي نفسه وميثيله. ومع ذلك ، فإنها تشق ما يقرب من 24-26 زوجًا قاعديًا بعيدًا.
  • وهي تتألف من وحدتين فرعيتين مختلفتين. يتم إجراء التعرف على الحمض النووي وتعديله بواسطة الوحدة الفرعية الأولى- & # 8216M & # 8217 ويتم تقديم نشاط نوكلياز بواسطة الوحدة الفرعية الأخرى "R".
  • يتم مساعدة انقسام الحمض النووي بواسطة ATP وكذلك Mg 2+ بينما SAM مسؤول عن تحفيز الانقسام.
  • يتم شق واحد فقط من خيوط الحمض النووي. ومع ذلك ، لكسر الحمض النووي مزدوج الشريطة ، يلزم وجود موقعين للتعرف في اتجاهين متعاكسين.

نشاط النجوم

بعض إنزيمات التقييد قادرة على شق مواقع التعرف التي تشبه تسلسل التعرف المحدد ولكنها غير متطابقة في ظل ظروف تفاعل غير قياسية (قوة أيونية منخفضة ، ودرجة حموضة عالية).

المتشيزومرات ، والنيوسكيزومرات ، والإيزوكودومرز

  • المتشيزومرات هي إنزيمات التقييد التي تتعرف وتلتصق في نفس موقع التعرف. على سبيل المثال ، SphI (CGTAC / G) و BbuI (CGTAC / G) هما متماثلان لبعضهما البعض.
  • Neoschizomers هي إنزيمات التقييد التي تتعرف على نفس الموقع ولها نمط انقسام مختلف. على سبيل المثال ، SmaI (GGG / CCC) و XmaI (G / GGCCC) عبارة عن مفككات جديدة لبعضها البعض.
  • Isocaudomers هي إنزيمات التقييد التي تتعرف على تسلسلات مختلفة قليلاً ولكنها تنتج نفس النهايات. على سبيل المثال ، يقدم كل من Sau3a و BamHI نهاية مثبتة 5’-GATC-3 على الرغم من أن كلاهما لهما تسلسل تمييز مختلف.

أنماط الانقسام

يتم وصف أنماط الانقسام من HindIII و SmaI و EcoRI و BamHI على النحو التالي. تتعرف معظم الإنزيمات على التسلسلات التي يتراوح طولها من 4 إلى 6 أزواج قاعدية. ومع ذلك ، يمكن أن يصل طولها أيضًا إلى 8 أزواج أساسية.

تتوج عملية انقسام الحمض النووي بواسطة إنزيم التقييد بتشكيل نهايات لزجة أو نهايات غير حادة.

يمكن ربط الأجزاء غير الحادة مع جزء الحمض النووي فقط بمساعدة الوصلات والمحولات.


ما هي إنزيمات التقييد؟

إنزيم التقييد ، الذي يشار إليه بشكل أكثر شيوعًا باسم نوكلياز مقيد ، لديه القدرة على شطر جزيئات الحمض النووي إلى أجزاء صغيرة. تحدث عملية الانقسام بالقرب أو في موقع التعرف الخاص على جزيء الحمض النووي يسمى موقع التقييد. يتكون موقع التعرف عادةً من 4-8 أزواج أساسية. اعتمادًا على موقع الانقسام ، يمكن أن تكون إنزيمات التقييد من أربعة (04) أنواع مختلفة: النوع الأول والنوع الثاني والنوع الثالث والنوع الرابع. بخلاف موقع الانقسام ، يتم أخذ عوامل مثل التركيب ومتطلبات العوامل المشتركة وحالة التسلسل المستهدف في الاعتبار عند تفريق إنزيمات التقييد إلى أربع مجموعات.

أثناء انقسام جزيئات الحمض النووي ، يمكن أن يكون موقع الانقسام إما في موقع التقييد نفسه أو على مسافة من موقع التقييد. تنشئ إنزيمات التقييد شقين من خلال كل من العمود الفقري للسكر والفوسفات في الحلزون المزدوج للحمض النووي.

الشكل 02: إنزيمات التقييد

تم العثور على إنزيمات التقييد بشكل رئيسي في Achaea والبكتيريا. يستخدمون هذه الإنزيمات كآلية دفاع ضد الفيروسات الغازية. إنزيمات التقييد تشق الحمض النووي الأجنبي (الممرض) ولكن ليس الحمض النووي الخاص بها. الحمض النووي الخاص بهم محمي بواسطة إنزيم يعرف باسم ميثيل ترانسفيراز ، والذي يقوم بإجراء تعديلات في الحمض النووي المضيف ويمنع الانقسام.

يمتلك إنزيم التقييد من النوع الأول موقع تشقق بعيدًا عن موقع التعرف. يتطلب عمل الإنزيم ATP والبروتين S-adenosyl-L-methionine. يعتبر إنزيم التقييد من النوع الأول متعدد الوظائف بسبب وجود كل من أنشطة التقييد والميثيلاز. تنقسم إنزيمات التقييد من النوع الثاني داخل موقع التعرف نفسه أو على مسافة أقرب منه. يتطلب فقط المغنيسيوم (Mg) لوظيفته. إن إنزيمات تقييد النوع الثاني لها وظيفة واحدة فقط وهي مستقلة عن الميثيلاز.


ما الفرق بين إنزيم التقييد و CRISPR؟

كريسبر كاس 9 هو إنزيم تقييد. هناك أنواع عديدة من إنزيمات التقييد ، وكل نوع يقطع الحمض النووي في مكان معين. CRISPR هو اسم عائلة من تسلسلات الحمض النووي الموجودة في الحمض النووي للعديد من بدائيات النوى والتي يمكن لـ CRISPR Cas9 أن تشقها ، مما يجعلها علامة مفيدة للعديد من الأشياء.

فكر في الحمض النووي كسلسلة مصنوعة من أقفال مختلفة. إنزيمات التقييد هي المفاتيح. يمكن لكل مفتاح فتح قفل واحد. CRISPR هي علامة تجارية للأقفال ، وهي علامة تجارية لها مفتاح رئيسي لجميع أقفالها يسمى CRISPR Cas9. في أي مكان على طول هذه السلسلة تجد فيه قفل CRISPR ، يمكنك استخدام بروتين Cas9 لفتحه.

هذه هي الإجابة الصحيحة الوحيدة. Cas9 هو إنزيم تقييد من النوع الخامس.

شكرًا جزيلاً ، لقد ساعدني هذا كثيرًا كنت أحاول العثور على الفرق على google وأثار تعليقك شكرًا لك

القصاصات التي لا يمكن السيطرة عليها والتي تبحث عن تسلسل محدد في أي مكان مقابل فاصل محكوم في نقطة تسلسل محددة باستخدام دليل.

يبحث إنزيم التقييد عن تسلسل معين ، متى وجده بغض النظر عن المكان الذي سيقصه من حوله ، لا شيء مضاف أو مُزال. نظرًا لأنه لا يمكنك التحكم في الأشياء التي لا تريد قصها ، يمكن أن تساعد المخازن المؤقتة ودرجة الحرارة هنا.

تعتمد كريسبر بدلاً من ذلك على تسلسل الحمض النووي الريبي (دليل الحمض النووي الريبي) المكمل للهدف ، عندما يقوم الدليل بربط كريسبر بقطع مزدوج ، مما يؤدي إلى حدوث أخطاء في التسلسل مثل عمليات الإدخال والحذف ، ومع ذلك يمكن حساب ذلك باستخدام خيط بديل.

آه حسنًا ، هذا ما يجعل كريسبر أفضل للتعديل الجيني ، أليس كذلك؟ إنه أكثر دقة

بشكل عام عندما نتحدث عن & # x27 إنزيمات التقييد & # x27 ، فإننا نشير إلى الأنزيمات التاريخية التي تتعرف على تسلسل واحد ، بشكل عام 6 أو 8 نيوكليوتيدات. إنها موصولة بأسلاك لقطع تسلسل واحد فقط (على الرغم من أن هذا التسلسل قد يظهر في العديد من الأماكن). إذا سمعت عن & quotEcoR1 & quot أو الهندسة الوراثية ، فمن المحتمل أن تسمع عن إنزيمات التقييد & # x27Type II & # x27.

سحر Cas9 هو أنه & # x27cassette قائم & # x27 - إذا قمت بتوفير RNA مصاحب (تم إنشاؤه وفقًا لقواعد قليلة ، ولكن بشكل أساسي يمكنه استهداف أي تسلسل على الإطلاق) إذن ايا كان يتطابق تسلسل الحمض النووي مع أن الحمض النووي الريبي سيتلقى قطعًا. علاوة على ذلك ، فإن & # x27matching target & # x27 لـ Cas9 كبير نسبيًا ، لدرجة أنه يمكنك استهداف جين واحد في مليار نيوكليوتيد للحمض النووي البشري. إنها ليست دائمًا مثالية ، ولكن هذه قصة أخرى.

بشكل عام ، اختار البشر تصنيفها على أنها نوع خاص من عائلة آلات قطع الحمض النووي الضخمة والمتنوعة ، ومن ثم قولها & # x27is & # x27 إنزيم التقييد صحيح أيضًا ولكنه & # x27s نوع مميز جدًا بخصائص وإمكانيات رائعة .

شكرا لتوضيح لول لقد تعلمت القليل عنها في المدرسة لكنهم لم يوضحوا أن cas9 كان أيضًا إنزيمًا مقيدًا. إنهم يعلمونه نوعًا ما كشيء منفصل تمامًا لول ولكن نعم هذا منطقي :))

يرمز Crispr إلى التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام. إنها تسلسلات الحمض النووي الموجودة في بدائيات النوى (البكتيريا) التي تحتوي على نفس التسلسلات الموجودة في الفيروسات التي تهاجم تلك البكتيريا. ستكتشف البكتيريا هذه التسلسلات المتجانسة في الفيروس الغازي & # x27s dna وتضيفها إلى الحمض النووي الخاص بها في هذه التسلسلات الواضحة. ثم تستخدمها البكتيريا كنوع من الفهرس ، ويستخدم بروتين Cas-9 (البروتين المرتبط crispr # 9) هذه التسلسلات للعثور على الحمض النووي الفيروسي وتقطيعه الذي يطابق تلك الموجودة في تسلسل crispr. إنه أمر رائع ، وهو نوع من الدفاع المناعي التكيفي لبكتيريا فردية. إذا نظرت في كيفية محاربة الحياة متعددة الخلايا والتكيف مع العدوى ، فهناك أوجه تشابه. قد يعتبر البعض هذا نوعًا من التطور المتقارب.

إنزيم التقييد هو أي إنزيم يقطع الحمض النووي الذي يعثر عليه. يستخدمون متواليات متناظرة لتحديد الأماكن التي يمكنهم العمل فيها. Cas-9 هو نوع من إنزيمات التقييد ، ولكن هناك الكثير. ومع ذلك ، فإن Cas-9 قوي للغاية ، حيث يمكن استخدامه لأي تسلسل متناوب معين.


ما هو DNA Ligase؟

الأطراف اللاصقة للشظايا التي تنتجها إنزيمات التقييد مفيدة في بيئة المختبر. يمكن استخدامها لضم أجزاء من الحمض النووي من مصادر مختلفة وكائنات مختلفة. يتم تثبيت الأجزاء معًا بواسطة روابط هيدروجينية. من منظور كيميائي ، تعتبر الروابط الهيدروجينية عوامل جذب ضعيفة وليست دائمة. باستخدام نوع آخر من الإنزيمات ، يمكن جعل الروابط دائمة.

يعد DNA ligase إنزيمًا مهمًا للغاية يعمل في كل من تكرار وإصلاح الحمض النووي للخلية. إنه يعمل من خلال المساعدة في الانضمام إلى خيوط الحمض النووي معًا. إنه يعمل عن طريق تحفيز رابطة الفوسفوديستر. هذه الرابطة هي رابطة تساهمية ، أقوى بكثير من الرابطة الهيدروجينية المذكورة أعلاه وقادرة على تجميع الأجزاء المختلفة معًا. عند استخدام مصادر مختلفة ، يكون للحمض النووي المؤتلف الناتج تركيبة جديدة من الجينات.


ما الفرق بين الهضم الفردي والهضم المزدوج عند مناقشة تقييد الإنزيمات؟

ملاحظة: في هذه الإجابة ، من أجل RE (الإنزيمات المقيدة) اقرأ نوكليازات داخلية.

NOTE2: أفترض أنك على دراية ببصمات الحمض النووي. إذا لم يكن كذلك ، انظر هنا وهنا.

تعتبر العناصر الديناميكية شديدة الخصوصية بالنسبة لتسلسل الحمض النووي الذي يتم لصقها: إنها تقريبًا تسلسل متناوب محدد سلفًا.
على سبيل المثال ، سيقوم Hin DIII فقط بإجراء قطع في التسلسل:

5 '# - & GT # A #color (أحمر) / # AGCTT # - & GT # 3'
3 '# larr # TTCGA #color (أحمر) / # A # larr # 5'

كمية القواعد في هذا palindorme هو 6.
لن أخوض في التحليل الإحصائي ، لكن من الآمن افتراض أن هذا سيؤدي إلى تخفيضات أقل من نشاط Sau3A على سبيل المثال:

5 '# - & gt # ---- # color (red) / # GATC ---- # - & gt # 3'
3 '# larr # ---- CTAG #color (أحمر) / # ---- # larr # 5'

إذا كان لديك كمية من الحمض النووي (النووي الكلي) ، على سبيل المثال ، من الإنسان من أجل "أخذ البصمات" ، فقد لا يؤدي هضمها (التضفير أو القطع) باستخدام Sau3A إلى النتيجة المرجوة: ستحصل على عدد كبير جدًا من الأجزاء الصغيرة مما يؤدي إلى "مسحة" غير مفهومة عبر لوح هلام الرحلان الكهربائي.

سيؤدي القطع باستخدام Hin DIII إلى ظهور عدد قليل من النطاقات الكبيرة التي يمكن أن تكون حكاية ، لكنك ترغب في الحصول على مزيد من اليقين.

لذلك ، التقطيع باستخدام اثنين من إنزيمات التقييد المختلفة ، مثل خليط من Hin DIII (5 '# - & gt # A #color (red) / # AGCTT # - & gt # 3') و EcoR1 (5 '# - & gt # G #color (أحمر) / # AATTC # - & gt # 3 ') قد يفي بالغرض.

ومع ذلك ، يمكنك أن تواجه مشكلة مع هذا: الحمض النووي خامل وقوي إلى حد ما ، لكن الحمض النووي ليس كذلك. نظرًا لأنه يتم استخلاصها من كائنات مختلفة (بكتيريا) ، فسيكون لكل بيئة متفاعلة بيئتها المثلى داخل الخلية المضيفة. لذلك ، سيكون لكل طاقة طاقة خليط عازل مثالي خاص بها (فكر في الرقم الهيدروجيني إذا لم يكن هناك شيء آخر) ، وهنا تكمن المشكلة.

على الرغم من أنه تم العثور في المختبر على أن معظم مصادر الطاقة المتجددة سعداء إلى حد ما بالمخازن المؤقتة المستندة إلى TRIS (Tris-HydroxyMethyl AminoMethane) ، مثل TBE (Tris / Borate / EDTA) ، ستحتاج كل RE إلى تعديل المخزن المؤقت المختار للنشاط الأمثل. يمكن أن يكون لعوامل أخرى ، مثل درجة الحرارة ، تأثير أيضًا.

لذلك ، إذا كان اثنان من REs متوافقين بشكل مؤقت ، فيمكنك إجراء هضم مزدوج دفعة واحدة ، ولكن اعتمادًا على توافق اثنين من RE التي تختارها ، قد تحتاج إلى القيام بذلك على مرحلتين: إيقاف رد فعل الهضم الأول (الحرارة) -صدمة) ، وتنقية هضم الحمض النووي ، ثم القيام بعملية الهضم الثانية.

ولكن بما أنه بحلول وقت كتابة هذا التقرير ، تم التعرف على أكثر من 3000 وحدة تعليمية ، وأكثر من 600 منها متوفرة تجاريًا ، فليس لي أن أقدم لك قائمة شاملة بالمجموعات.

في الثمانينيات ، حصلنا على معظم مصادر الطاقة المتجددة لدينا من أي منهما مختبرات بيثيسدا (الولايات المتحدة الأمريكية)، نيو انجلاند بيولابس (الولايات المتحدة الأمريكية) أو بورينجر إنجلهايم (ألمانيا) ، وقد يعطونك قائمة بالتفاعلات المتجددة المتوافقة ومخازنهم المؤقتة للهضم المزدوج.


ما هي إنزيمات التقييد من النوع الثاني؟

تحتوي إنزيمات التقييد من النوع الثاني على وحدتين فرعيتين متطابقتين داخل بنيتها. تتكون Homodimers من النوع الثاني من إنزيمات التقييد مع مواقع التعرف. عادة ما تكون مواقع التعرف متجانسة وغير مقسمة. يبلغ طوله 4-8 أزواج قاعدية. على عكس النوع الأول ، يوجد موقع انقسام إنزيم تقييد النوع الثاني في موقع التعرف أو موجود على مسافة قريبة من موقع التعرف.

الشكل 02: إنزيمات التقييد من النوع الثاني

إن إنزيمات التقييد هذه مهمة من الناحية الكيميائية الحيوية ومتاحة على نطاق واسع تجاريًا. لتفعيله ، لا يتطلب سوى Mg 2+. لا يحتوي على نشاط مثيلة ويوفر فقط وظيفة نشاط التقييد. ترتبط إنزيمات التقييد هذه بجزيئات الحمض النووي مثل المتجانسات ولديها القدرة على التعرف على تسلسل الحمض النووي المتماثل وكذلك التسلسلات غير المتماثلة.


ما هو الفرق بين النهايات اللاصقة والنهايات غير الحادة؟

تقطع إنزيمات التقييد الحمض النووي مزدوج الشريطة إلى النصف. اعتمادًا على إنزيم التقييد ، يمكن أن يؤدي القطع إلى أ نهاية لزجة أو أ نهاية حادة. نهايات لزجة أكثر فائدة في الاستنساخ الجزيئي لأنها تضمن إدخال جزء الحمض النووي البشري في البلازميد في الاتجاه الصحيح.

وبالمثل ، ما هي الأطراف الحادة المستخدمة؟ نهايات حادة ليس لديهم عبء. لا يمكن أن تتطابق على وجه التحديد مثل الحمض النووي مع المادة اللاصقة ينتهي ومع ذلك ، يمكن أن تكون مفيدة عندما تكون لزجة ينتهي لا يمكن أن يكون تستخدم. SmaI هو إنزيم التقييد الذي يصنع نهايات حادة.

يجب أن تعرف أيضًا ، ما هو الفرق بين النهايات الحادة والأطراف اللاصقة Quizlet؟

نهايات لزجة عندما تقوم الإنزيمات بعمل جروح متداخلة في ال خيوط. التخفيضات التي لا تتعارض مباشرة مع بعضها البعض. نهايات لزجة هي الأكثر فائدة في rDNA لأنه يمكن استخدامها للانضمام إلى اثنين مختلف قطع الحمض النووي التي تم قطعها بنفس إنزيم التقييد.

كيف يمكنك تحويل النهايات الحادة إلى نهايات لزجة؟

صريح و نهايات لزجة يمكن أن تكون مشتركة محولة إما عن طريق إضافة المواقع المعرفية المقيدة أو عن طريق إزالة بعضها. نهاية حادة نكون محولة إلى نهاية لزجة قبل الاستنساخ.


إنزيمات التقييد في الـ DNA: طريقة عملها وأنواعها

اقرأ هذه المقالة للتعرف على إنزيمات التقييد وطريقة عملها. ويصف أيضًا أنواعًا مختلفة من إنزيمات التقييد. الأنواع هي: (1) النوع الأول (2) النوع الثاني و (3) النوع الثالث.

إنزيمات التقييد هي إنزيمات تقطع الحمض النووي توجد في البكتيريا (ويتم حصادها منها للاستخدام). نظرًا لأنها تقطع داخل الجزيء ، فإنها غالبًا ما تسمى نوكليازات تقييدية.

يتعرف إنزيم التقييد على الحمض النووي ويقطعه فقط في تسلسل معين من النيوكليوتيدات. على سبيل المثال ، تُنتج بكتيريا Hemophilus aegypticus إنزيمًا يُدعى Haelll يقطع الحمض النووي أينما يواجه التسلسل

يتم إجراء القطع بين G و C المجاورين. يحدث هذا التسلسل المحدد في 11 مكانًا في جزيء DNA الدائري للفيروس phiX174. وهكذا ينتج عن معالجة هذا الحمض النووي بالإنزيم 11 شظية ، كل منها بطول محدد وتسلسل نيوكليوتيد. يمكن فصل هذه الأجزاء عن بعضها البعض وتحديد تسلسل كل منها. قام Haelll و Alul بقص اللولب المزدوج بشكل مستقيم لإنتاج نهايات # 8220 blunt & # 8221. ومع ذلك ، يتم قطع العديد من إنزيمات التقييد بطريقة تعويض.

تحتوي نهايات القطع على قطعة متدلية من الحمض النووي أحادي الجديلة. هذه تسمى & # 8220 نهايات لاصقة & # 8221 لأنها قادرة على تكوين أزواج قاعدية مع أي جزيء DNA يحتوي على الطرف اللزج التكميلي (الشكل 13.16). أي مصدر آخر للحمض النووي يعالج بنفس الإنزيم سينتج مثل هذه الجزيئات. مختلطة معًا ، يمكن أن تنضم هذه الجزيئات مع بعضها البعض عن طريق الاقتران الأساسي بين نهاياتها اللاصقة.

يمكن جعل الاتحاد دائمًا بواسطة إنزيم آخر ، DNA ligase الذي يشكل روابط تساهمية على طول العمود الفقري لكل حبلا. والنتيجة هي جزيء من الحمض النووي المؤتلف (rDNA). نظرًا لاختلاف تسلسلات التعرف ومواقع الانقسام بين إنزيمات التقييد ، يعتمد الطول والتسلسل الدقيق للنهاية اللاصقة & # 8220overhang & # 8221 ، وكذلك ما إذا كان الطرف 5 & # 8242 أو الطرف 3 & # 8242 الذي يتدلى ، يعتمد على أي إنزيم أنتجه. يتيح الاقتران الأساسي بين الأجزاء المتراكمة ذات التسلسلات التكميلية ضم جزأين أو & # 8220 مقسمة & # 8221 بواسطة ليجاس DNA.

يمكن ربط الجزء ذو النهاية اللاصقة ليس فقط بالجزء الذي تم انشقاقه منه في الأصل ، ولكن أيضًا بأي جزء آخر ذو نهاية لزجة متوافقة. تسمى النهاية اللاصقة أيضًا بالنهاية المتماسكة أو النهاية التكميلية في بعض المراجع.

إذا كان إنزيم التقييد يحتوي على متناوب غير متحلل (التسلسل على خصلة واحدة يقرأ نفس الاتجاه في نفس الاتجاه على الخيط التكميلي ، على سبيل المثال GTAATG ليس تسلسل DNA متناظرًا ، ولكن GTATAC هو ، GTATAC مكمل لـ CATATG) موقع الانقسام ، الكل النهايات التي تنتجها متوافقة. قد تكون النهايات التي تنتجها إنزيمات مختلفة متوافقة أيضًا.

تسمية:

يتم تسمية إنزيمات التقييد بناءً على البكتيريا التي يتم عزلها بالطريقة التالية:

حددت معرف الطلب لأول مرة & # 8217d في البكتيريا

أنماط قطع الحمض النووي بواسطة إنزيمات التقييد:

يقطع الإنزيم بشكل غير متماثل داخل موقع التعرف بحيث يمتد مقطع قصير واحد تقطعت به السبل من النهايات 5 & # 8242. BamHI يقطع بهذه الطريقة.

مرة أخرى ، نرى قطعًا غير متماثل داخل موقع التعرف ، لكن النتيجة عبارة عن تراكب أحادي الجديلة من طرفي 3 & # 8242. يقطع Kpnl بهذه الطريقة.

إن الإنزيمات التي تقطع في مواقع متقابلة تمامًا في شريطين من الحمض النووي تولد نهايات حادة دون بروزات. Smal هو مثال على إنزيم يولد نهايات حادة.

تسمى الأجزاء 5 & # 8242 أو 3 & # 8242 المتراكمة الناتجة عن الإنزيمات التي تقطع بشكل غير متماثل نهايات لاصقة أو نهايات متماسكة ، لأنها ستلتصق بسهولة أو تصلب مع شريكها عن طريق الاقتران الأساسي.

طريقة عمل:

إنزيم التقييد (أو نوكلياز مقيد) هو إنزيم يقطع الحمض النووي المزدوج الشريطة (الجدول 13.4). يقوم الإنزيم بعمل شقين ، أحدهما من خلال كل من العمود الفقري للسكر والفوسفات (أي كل خيط) للحلزون المزدوج دون الإضرار بالقواعد النيتروجينية.

يمكن إصلاح الروابط الكيميائية التي تشقها الإنزيمات بواسطة إنزيمات أخرى تُعرف باسم ligases ، بحيث يمكن تقطيع شظايا التقييد المنحوتة من كروموسومات أو جينات مختلفة معًا ، بشرط أن تكون نهاياتها مكملة.

تعتمد العديد من إجراءات البيولوجيا الجزيئية والهندسة الوراثية على الإنزيمات المقيدة. يأتي مصطلح تقييد المصطلح من حقيقة أن هذه الإنزيمات تم اكتشافها في سلالات الإشريكية القولونية التي يبدو أنها تقيد العدوى ببعض العاثيات.

لذلك يُعتقد أن الإنزيمات المقيدة هي آلية طورتها البكتيريا لمقاومة الهجوم الفيروسي وللمساعدة في إزالة التسلسلات الفيروسية. هم جزء مما يسمى نظام تعديل التقييد. مُنحت جائزة نوبل في الطب لعام 1978 إلى دانيال ناثانز وويرنر أربر وهاملتون سميث لاكتشافها نوكليازات مقيدة ، مما أدى إلى تطوير تقنية الحمض النووي المؤتلف.

كان أول استخدام عملي لعملهم هو معالجة بكتيريا الإشريكية القولونية لإنتاج الأنسولين البشري لمرضى السكر. القدرة على إنتاج جزيئات الحمض النووي المؤتلف لم تحدث ثورة في دراسة علم الوراثة فحسب ، بل أرست الأساس لكثير من صناعة التكنولوجيا الحيوية. أصبح توافر الأنسولين البشري (لمرضى السكر) والعامل البشري الثامن (للذكور المصابين بالهيموفيليا A) والبروتينات الأخرى المستخدمة في العلاج البشري ممكنًا بفضل الحمض النووي المؤتلف.

أنواع إنزيمات التقييد:

تصنف إنزيمات التقييد كيميائيا إلى ثلاثة أنواع. تم تصنيفها على أنها النوع الأول والنوع الثاني والنوع الثالث. يُشار أحيانًا إلى نوع رئيسي من إنزيمات النوع الثاني باسم إنزيمات النوع الرابع.

أنظمة النوع الأول والثالث ، يتم تنفيذ كل من أنشطة الميثيلاز والتقييد بواسطة مركب إنزيم كبير واحد. على الرغم من أن هذه الإنزيمات تتعرف على تسلسلات محددة من الحمض النووي ، إلا أن مواقع الانقسام الفعلي تقع على مسافات متغيرة من مواقع التعرف هذه ، ويمكن أن تكون على بعد مئات القواعد. كلاهما يتطلب ATP لوظيفتهما الصحيحة.

تنتج إنزيمات التقييد من النوع الأول انقسام الحمض النووي بعد انتقال الحمض النووي ، مما يجعلها محركات جزيئية مهمة. يبدو أن انقسام الحمض النووي يحدث بعد انسداد نشاط الإزاحة (غالبًا بعد الاصطدام مع إنزيم آخر من النوع R-M ، ولكن أيضًا بسبب عوامل أخرى).

These enzymes read the methylation status of their recognition sequence, compare the methylation status of two adenines within the recognition sequence, and if both adenines are un-methylated (a signal that the DNA is non-host DNA), the enzyme undergoes a conformational switch that turns the enzyme into a molecular motor and endonuclease.

However, if either one of the adenines is methylated (a signal that the DNA is host DNA) then the enzyme acts as a maintenance methylase and methylates the other adenine. In Type II systems, the restriction enzyme is independent of its methylase, and cleavage occurs at very specific sites that are within or close to the recognition sequence. The vast majority of known restriction enzymes are of type II, and it is these that find the most use as laboratory tools. They produce discrete bands during gel electrophoresis, and are useful for DNA analysis and gene cloning. The first to be discovered and utilized was EcoRI, which is staggered and its recognition sequence is 5′-GAATTC-3′.

Type II enzymes are further classified according to their recognition site. Most type II enzymes cut palindromic DNA sequences, while type IIa enzymes recognise non-palindromic sequences and cleave outside of the recognition site, and type lIb enzymes cut sequences twice at both sites outside the recognition sequence. Type lIs enzymes cleave the DNA at a considerable offset from the recognition sequence. The most common type II enzymes are those like HhaI, HindIII and NotI that cleave DNA within their recognition sequences.

Restriction enzymes usually occur in combination with one or two modification enzymes (DNA-methyltransferases) that protect the cell’s own DNA from cleavage by the restriction enzyme.

Modification enzymes recognize the same DNA sequence as the restriction enzyme that they accompany, but instead of cleaving the sequence, they methylate one of the bases in each of the DNA strands. The methyl groups protrude into the major groove of DNA at the binding site and prevent the restriction enzyme from acting upon it.

Together, a restriction enzyme and its “cognate” modification enzyme(s) form a restriction-modification (R-M) system. In some R-M systems the restriction enzyme and the modification enzyme(s) are separate proteins that act independently of each other. In other systems, the two activities occur as separate subunits, or as separate domains, of a larger, combined, restriction-and-modification enzyme.

Restriction Enzymes as Tools:

Recognition sequences typically are only four to twelve nucleotides long. Because there are only so many ways to arrange the four nucleotides—A,C,G and T–into a four or eight or twelve nucleotide sequence, recognition sequences tend to “crop up” by chance in any long sequence. Furthermore, restriction enzymes specific to hundreds of distinct sequences have been identified and synthesized for sale to laboratories.

As a result, potential “restriction sites” appear in almost any gene owr chromosome. Meanwhile, the sequences of some artificial plasmids include a “linker” that contains dozens of restriction enzyme recognition sequences within a very short segment of DNA. So no matter the context in which a gene naturally appears, there is probably a pair of restriction enzymes that can cut it out, and which will produce ends that enable the gene to be spliced into a “plasmid”.

Another use of restriction enzymes can be to find specific SNPs. If a restriction enzyme can be found such that it cuts only one possible allele of a section of DNA (that is, the alternate nucleotide of the SNP causes the restriction site to no longer exist within the section of DNA), this restriction enzyme can be used to genotype the sample without completely sequencing it. The sample is first run in a restriction digest to cut the DNA, and then gel electrophoresis is performed on this digest.

If the sample is homozygous for the common allele, the result will be two bands of DNA, because the cut will have occurred at the restriction site. If the sample is homozygous for the rarer allele, the sample will show only one band, because it will not have been cut. If the sample is heterozygous at that SNP, there will be three bands of DNA. This is an example of restriction mapping.


شاهد الفيديو: DNAse footprinting assay (كانون الثاني 2022).